CN117343876A - 一株抑菌、抗炎的贝莱斯芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种贝莱斯芽孢杆菌，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，其菌株号为BV‑J11，其在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为：CCTCC NO：M 20231502；所述贝莱斯芽孢杆菌的16S rRNA基因的核苷酸序列含有序列表中SEQ ID NO.1所示的DNA分子；或所述贝莱斯芽孢杆菌的gyrB基因的核苷酸序列含有序列表中SEQ ID NO.2所示的DNA分子，或所述贝莱斯芽孢杆菌的purH基因的核苷酸序列含有序列表中SEQ ID NO.3所示的DNA分子。本发明菌株的代谢产物具有显著的抑制肠道致病菌的能力，但对常见的肠道益生菌的生长没有抑制或抑制较弱；芽孢和代谢产物均对肉鸡肠道炎症具有显著的缓解效果。

Description

一株抑菌、抗炎的贝莱斯芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一株抑菌、抗炎的贝莱斯芽孢杆菌及其应用。
背景技术
家禽业是世界上最大的肉类产业之一。人类对禽类产品的巨大需求，使得家禽业产生了巨大的经济效益，这迫使家禽生产向着更高效和更高密度发展。在畜禽养殖过程中，通常采用高密度、集约化的养殖模式，使得肠道炎症成为高频出现的问题，反过来又影响了养殖效率，降低经济回报。过度的炎症反应，意味着过度的机体能量损耗，往往会造成畜禽的料比升高，增加养殖成本。
贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)以其优异的抑菌性能著称，广泛应用于植保生防、水产动保等领域。在畜禽养殖领域，关于贝莱斯芽孢杆菌通过对肠道致病菌的抑制作用，从而改善肠道健康的研究和报道越来越多。但是，鲜有利用贝莱斯芽孢杆菌及其代谢产物针对肠道炎症的缓解与改善的报道。
因此，本发明提供了一株抑菌、抗炎的贝莱斯芽孢杆菌BV-J11和应用。
该菌株从肉鸡肠道分离得到，于2023年8月17日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名为：贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，保藏编号为：CCTCC NO：M20231502，地址：中国湖北武汉武汉大学。
发明内容
本发明首先提供了一种贝莱斯芽孢杆菌，所述贝莱斯芽孢杆菌为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，其菌株号为BV-J11，其在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为：CCTCC NO：M 20231502。
优选的，所述贝莱斯芽孢杆菌的16S rRNA基因的核苷酸序列含有序列表中SEQ IDNO.1所示的DNA分子；
优选的，所述贝莱斯芽孢杆菌的gyrB基因的核苷酸序列含有序列表中SEQ IDNO.2所示的DNA分子；
优选的，或所述贝莱斯芽孢杆菌的purH基因的核苷酸序列含有序列表中SEQ IDNO.3所示的DNA分子。
本发明其次提供了上述贝莱斯芽孢杆菌的培养物，是上述的贝莱斯芽孢杆菌在微生物培养基中培养得到的物质。
本发明还提供了一种菌剂，所述菌剂含有上述的贝莱斯芽孢杆菌或/和上述的贝莱斯芽孢杆菌的代谢物或/和上述的培养物。
优选的，所述菌剂具有下述至少一种特性：
A1)刺激抗炎因子与肠道紧密连接蛋白的表达；
A2)降低促炎因子的表达；
A3)减轻炎症反应的程度；
A4)改善肠道健康；
A5)提高家禽生产性能和/或提高家禽体重；
A6)增强家禽空肠消化吸收能力；
A7)提高家禽机体抗氧化能力；
A8)抑制病原菌生长；
任选地，所述病原菌包括大肠杆菌K88、大肠杆菌K99、大肠杆菌O1、大肠杆菌O2、金黄色葡萄球、肠炎沙门氏菌和产气荚膜梭菌中的一种或多种；
A9)不会对丁酸梭菌的生长有不良影响。
本发明还提供了一种上述贝莱斯芽孢杆菌的下述至少一种应用：
B1)上述贝莱斯芽孢杆菌在制备提高家禽生产性能和/或提高家禽体重的产品中的应用；
B2)上述贝莱斯芽孢杆菌在制备增强家禽空肠消化吸收能力的产品中的应用；
B3)上述贝莱斯芽孢杆菌在制备提高家禽机体抗氧化能力的产品中的应用；
B4)上述贝莱斯芽孢杆菌在制备提高家禽抗病原菌能力的产品中的应用；
B5)上述贝莱斯芽孢杆菌在制备缓解或改善肠道炎症的产品中的应用；
B6)上述贝莱斯芽孢杆菌在制备饲用微生物添加剂中的应用；
B7)上述贝莱斯芽孢杆菌在制备家禽饲料中的应用。
本发明最后提供了上述菌剂的下述至少一种应用：
C1)上述菌剂在制备提高家禽生产性能和/或提高家禽体重的产品中的应用；
C2)上述菌剂在制备增强家禽空肠消化吸收能力的产品中的应用；
C3)上述菌剂在制备提高家禽机体抗氧化能力的产品中的应用；
C4)上述菌剂在制备提高家禽抗病原菌能力的产品中的应用；
C5)上述菌剂在制备缓解或改善肠道炎症的产品中的应用；
C6)上述菌剂在制备饲用微生物添加剂中的应用；
C7)上述菌剂在制备家禽饲料中的应用。
优选的，所述家禽为鸡。
本发明与现有技术相比，至少具有如下有益效果：
1、代谢产物具有显著的抑制肠道致病菌的能力，但对常见的肠道益生菌的生长没有抑制或抑制较弱；菌株BV-J11的代谢产物对多种致病菌(大肠杆菌K88、大肠杆菌K99、大肠杆菌O1、大肠杆菌O2、金黄色葡萄球、肠炎沙门氏菌和产气荚膜梭菌)均有很强的抑制作用，对乳酸片球菌和植物乳杆菌的生长有极微弱的抑制，但是不会对丁酸梭菌的生长有不良影响。
2、芽孢和代谢产物均对肉鸡肠道炎症具有显著的缓解效果；LPS刺激能破坏肉鸡肠道屏障功能，打破其免疫稳态。日粮中添加10亿cfu/kg菌株BV-J11的芽孢，或者添加100mg/kg菌株BV-J11代谢产物可通过刺激抗炎因子与肠道紧密连接蛋白的表达、降低促炎因子的表达、提高抗氧化酶的活力，以减轻炎症反应从程度、改善肠道健康。
保藏说明
菌种名称：贝莱斯芽孢杆菌
拉丁名：Bacillus velezensis
菌株编号：BV-J11
保藏机构：中国典型培养物保藏中心保藏
保藏机构简称：CCTCC
地址：中国湖北武汉武汉大学
保藏日期：2023年8月17日
保藏中心登记入册编号：CCTCC NO：M 20231502；
附图说明
图1大肠杆菌K88抑菌圈；
图2大肠杆菌K99抑菌圈；
图3大肠杆菌O1抑菌圈；
图4大肠杆菌O2抑菌圈；
图5金黄色葡萄球菌抑菌圈；
图6肠炎沙门氏菌抑菌圈；
图7产气荚膜梭菌抑菌圈；
图8丁酸梭菌抑菌圈；
图9乳酸片球菌抑菌圈；
图10植物乳杆菌抑菌圈。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。
实施例1：贝莱斯芽孢杆菌BV-J11的分离与鉴定
(1)培养基配制：
固体培养基：成品LB培养基；液体培养基(YPD)：酵母浸粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL，pH 7.2±0.2，115℃，20min灭菌备用。
(2)菌株分离、纯化：
(2.1)采集刚屠宰的健康肉鸡的肠道内容物，用生理盐水制成悬浊液，置于85℃水浴10min杀死绝大多数非芽孢菌；10倍梯度稀释后，涂布于固体培养基，置于37℃恒温箱中培养20～24h。
(2.2)挑取单菌落，于固体培养基上经两次划线传代培养(37℃)，获得菌落形态一致的纯化菌种。
(3)菌株鉴定
按照业内熟知的通常方法，对所述筛选的菌株进行16S rDNA、gyrB基因和purH基因序列分析，通过与NCBI中已知的序列进行BLAST比对，本菌株的16S rDNA序列(SEQ IDNO.1)与贝莱斯芽孢杆菌同源性最高(99.79％同源性)，gyrB基因序列(SEQ ID NO.2)与贝莱斯芽孢杆菌同源性最高(99.91％同源性)，purH基因序列(SEQ ID NO.3)与贝莱斯芽孢杆菌同源性最高(99.67％同源性)。根据以上结果，所述菌株鉴定为贝莱斯芽孢杆菌，命名为BV-J11，于2023年8月17日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名为：贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，保藏编号为：CCTCC NO：M 20231502，地址：中国湖北武汉武汉大学。
实施例2：贝莱斯芽孢杆菌BV-J11的抑菌性能
(1)发酵上清液制备：
挑取一环纯化单菌落接种于YPD液体培养基中，37℃条件下220rpm振荡培养24h，得到贝莱斯芽孢杆菌BV-J11的发酵液。4℃条件下10000rpm离心10min收集上清液，使用0.22μm无菌膜过滤，置于-20℃备用；使用前室温自然融化。
(2)指示菌菌液制备：
取25％甘油保存的指示菌在固体培养基划线培养，然后分别挑取复苏后的单菌落接种于相应的液体培养基中，培养至OD600为1.0～1.2。不同指示菌具体培养参数见下表1：
表1不同指示菌的培养条件
(3)抑菌能力测定：
分别将大肠杆菌K88、K99、大肠杆菌O1、大肠杆菌O2、金黄色葡萄球和肠炎沙门氏菌的菌液在无菌生理盐水中梯度稀释100倍，取100μL稀释菌液于无菌平板；倾倒20mL左右融化冷却至50℃的LB琼脂，轻微摇晃，分散菌液；待琼脂凝固后用无菌打孔器进行打孔，加入100μL贝莱斯芽孢杆菌BV-J11的发酵上清液；于培养箱中37℃正置培养14～18h后，测量抑菌圈直径。
分别将产气荚膜梭菌和丁酸梭菌的菌液在无菌生理盐水中梯度稀释100倍，取100μL稀释菌液于无菌平板；倾倒20mL左右融化冷却至50℃的TSC琼脂，轻微摇晃，分散菌液；待琼脂凝固后用无菌打孔器进行打孔，加入100μL贝莱斯芽孢杆菌BV-J11的发酵上清液；于厌氧工作站中37℃正置培养14-18h后，测量抑菌圈直径。
分别将乳酸片球菌和植物乳杆菌的菌液在无菌生理盐水中梯度稀释100倍，取100μL稀释菌液于无菌平板；倾倒20mL左右融化冷却至50℃的MRS琼脂，轻微摇晃，分散菌液；待琼脂凝固后用无菌打孔器进行打孔，加入100μL贝莱斯芽孢杆菌BV-J11的发酵上清液；于培养箱中37℃正置培养18～24h后，测量抑菌圈直径。
抑菌效果见表2和图1～图10：
表2BV-J11对不同指示菌的抑菌效果
由表2和图1～图10可知，贝莱斯芽孢杆菌BV-J11的代谢产物对多种致病菌均有很强的抑制作用，对乳酸片球菌和植物乳杆菌的生长有极微弱的抑制，但是不会对丁酸梭菌的生长有不良影响。
实施例3：贝莱斯芽孢杆菌BV-J11芽孢和代谢产物干粉的制备
(1)贝莱斯芽孢杆菌BV-J11芽孢干粉制备：
挑取一环纯化单菌落接种于YPD液体培养基中，37℃条件下220rpm振荡培养24～36h，镜检观察菌体形态，待芽孢完全成熟后收集发酵液；在发酵液中加入10％～20％的麦芽糊精，混合均匀；将发酵液进行喷雾干燥(上海雅程YC-015)，得到贝莱斯芽孢杆菌BV-J11的芽孢干粉。
(2)贝莱斯芽孢杆菌BV-J11代谢物干粉制备：
挑取一环纯化单菌落接种于YPD液体培养基中，37℃条件下220rpm振荡培养24～36h，收集发酵液；将发酵液倒入冻干盘，使液面高度为1～2cm，然后置于-80℃预冻6h；将预冻好的发酵液转移至真空冷冻干燥机(北京松源LGJ-30FD)，干燥36～60h，得到贝莱斯芽孢杆菌BV-H11C3的发酵液冻干粉。
取100g上述发酵液冻干粉，按1:60(w/v)加入乙酸乙酯，浸提三次，每次浸提24h，共收集18L代谢物的浸提液；将浸提液通过旋转蒸发仪进行浓缩获得6.2g样品。
将代谢浓缩物用麦芽糊精稀释100倍，即为贝莱斯芽孢杆菌BV-J11代谢产物干粉。
实施例4：贝莱斯芽孢杆菌BV-J11芽孢和代谢产物对LPS引起的急性肠炎的缓解
将30只1日龄体重均一、健康的AA+肉公雏平均分到4个处理组，每个处理4个重复，每个重复12只鸡。4个处理组分别为：对照组、LPS(大肠杆菌脂多糖)处理组、BV-J11芽孢+LPS处理组、BV-J11代谢产物+LPS处理组。其中对照组与LPS处理组肉鸡采食“玉米-豆粕”型基础日粮，日粮配方参照中国肉鸡的营养需要标准(NY/T33-2004)制定。BV-J11芽孢+LPS处理组的肉鸡采食的基础日粮中添加了10亿cfu/kg的贝莱斯芽孢杆菌BV-J11的芽孢。BV-J11代谢产物+LPS处理组的肉鸡采食的基础日粮中添加了100mg/kg贝莱斯芽孢杆菌BV-J11代谢产物。
试验为期28天。第14天和第28天分别进行活体称重(BW)。第28天，LPS组、BV-J11芽孢+LPS处理组、BV-J11代谢产物+LPS处理组内所有肉鸡进行腹腔注射LPS(剂量：1mg/kg·BW)，对照组肉鸡注射等量生理盐水。2小时后，所有肉鸡灌服D-木糖溶液(剂量：1mg/kg·BW)，并于1小时后，采集所有肉鸡翅下静脉血并分离血清待测。此后于翅下静脉注射戊巴比妥钠(剂量为50mg/kg·BW)进行麻醉、屠宰，解剖取空肠、回肠等待测。
(1)BV-J11的芽孢和代谢产物对肉鸡生长性能的影响
因LPS在试验结束时注射，因此生长性能统计时将对照组与LPS组合并为一组。结果如表3所示：贝莱斯芽孢杆菌BV-J11的芽孢和代谢产物对14日龄和18日龄肉鸡的平均体重无显著影响。
表3BV-J11的芽孢和代谢产物对肉鸡生长性能的影响
(2)BV-J11的芽孢和代谢产物对LPS刺激肉鸡肠道吸收与屏障功能的影响
D-木糖可被肠道上皮细胞吸收并进入血液循环，但机体无法利用D-木糖，因此可通过血清中D-木糖的含量来评估肠道的吸收功能。二胺氧化酶(DAO)存在于肠道中，当机体肠道损伤时，DAO释放入血，因此常用血清中DAO的含量来评估肠道是否受损，以反映肠道物理屏障功能。
结果如表4所示：LPS的刺激影响了肠道对D-木糖的吸收，贝莱斯芽孢杆菌BV-J11芽孢或者代谢产物的添加能够改善肠道吸收功能；同时LPS显著上调了血清中DAO的含量，添加贝莱斯芽孢杆菌BV-J11芽孢或者代谢产物显著下调了血清中DAO的含量，说明两者可以增强肠道的物理屏障功能。
表4BV-J11的芽孢和代谢产物对LPS刺激的肉鸡肠道吸收与物理屏障功能的影响
(3)BV-J11的芽孢和代谢产物对血清中溶菌酶与抗氧化相关酶活力的影响
结果如表5所示：在LPS的刺激下，血清中溶菌酶、超氧化物歧化酶(SOD)的含量下调，丙二醛(MDA)的含量上调。贝莱斯芽孢杆菌BV-J11芽孢或者代谢产物可缓解LPS引起的血清中溶菌酶、SOD含量的降低与MDA含量的升高，提高机体的抗炎和抗氧化能力。
表5BV-J11的芽孢和代谢产物对血清中溶菌酶与抗氧化相关酶活力的影响
(4)BV-J11的芽孢和代谢产物对空肠抗氧化相关酶活力的影响
结果如表6所示：LPS刺激下调了空肠的总抗氧化能力；与LPS刺激组相比，贝莱斯芽孢杆菌BV-J11芽孢或者代谢产物显著上调了空肠的MDA含量，下调了T-AOC的含量，提高了空肠的总抗氧化能力。
表6BV-J11的芽孢和代谢产物对空肠抗氧化相关酶活力的影响
(5)BV-J11的芽孢和代谢产物对空肠基因转录水平的影响
结果如表7所示：LPS刺激下调了空肠绒毛蛋白(villin)、肠型脂肪酸结合蛋白(i-FABP)、黏蛋白(Mucin-2)基因的转录水平；上调干扰素-γ(IFN-γ)、IL-1β、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)基因的转录水平。与LPS处理组相比，贝莱斯芽孢杆菌BV-J11芽孢或者代谢产物均可显著上调Mucin-2，显著下调IFN-γ、IL-1β、TNF-α的转录水平；其中BV-J11代谢产物还能分别对villin和IL-10进行显著的上调和下调。说明两者均可提高空肠的物理屏障和免疫屏障功能，其中BV-J11代谢产物的效果更佳。
表7BV-J11的芽孢和代谢产物对空肠基因转录水平的影响
(6)BV-J11的芽孢和代谢产物对回肠基因转录水平的影响
结果如表8所示：LPS刺激下调回肠绒毛蛋白(villin)、肠型脂肪酸结合蛋白(i-FABP)、黏蛋白(Mucin-2)、紧密连接蛋白(Claudin-1)；上调干扰素-γ(IFN-γ)、IL-1β的转录水平；有下调IL-10转录水平的趋势。与LPS处理组相比，贝莱斯芽孢杆菌BV-J11芽孢或者代谢产物均可显著上调回肠Mucin-2和下调IFN-γ的转录水平；其中，BV-J11代谢产物还能显著上调回肠i-FABP、IL-10转录水平。说明两者均可提高回肠的物理屏障和免疫屏障功能，其中BV-J11代谢产物的效果更佳。
表8BV-J11的芽孢和代谢产物对回肠基因转录水平的影响
综上所述：LPS刺激破坏了肉鸡肠道屏障功能，打破其免疫稳态。日粮中添加10亿cfu/kg贝莱斯芽孢杆菌BV-J11，或者添加100mg/kg贝莱斯芽孢杆菌BV-J11代谢产物可能通过刺激抗炎因子与肠道紧密连接蛋白的表达、降低促炎因子的表达、提高抗氧化酶的活力，以改善肠道健康。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.贝莱斯芽孢杆菌，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)，其菌株号为BV-J11，其在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为：CCTCCNO：M 20231502。
2.根据权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌，其特征在于：所述贝莱斯芽孢杆菌的16SrRNA基因的核苷酸序列含有序列表中SEQ ID NO.1所示的DNA分子；
或所述贝莱斯芽孢杆菌的gyrB基因的核苷酸序列含有序列表中SEQ ID NO.2所示的DNA分子，或所述贝莱斯芽孢杆菌的purH基因的核苷酸序列含有序列表中SEQ ID NO.3所示的DNA分子。
3.权利要求1或2所述的贝莱斯芽孢杆菌的培养物，是将权利要求1或2所述的贝莱斯芽孢杆菌在微生物培养基中培养得到的物质。
4.一种菌剂，其特征在于：所述菌剂含有权利要求1或2所述的贝莱斯芽孢杆菌或/和权利要求1或2所述的贝莱斯芽孢杆菌的代谢物或/和权利要求3所述的培养物。
5.根据权利要求4所述的菌剂，其特征在于：所述菌剂具有下述至少一种特性：
A1)刺激抗炎因子与肠道紧密连接蛋白的表达；
A2)降低促炎因子的表达；
A3)减轻炎症反应的程度；
A4)改善肠道健康；
A5)提高家禽生产性能和/或提高家禽体重；
A6)增强家禽空肠消化吸收能力；
A7)提高家禽机体抗氧化能力；
A8)抑制病原菌生长；
任选地，所述病原菌包括大肠杆菌K88、大肠杆菌K99、大肠杆菌O1、大肠杆菌O2、金黄色葡萄球、肠炎沙门氏菌和产气荚膜梭菌中的一种或多种；
A9)不会对丁酸梭菌的生长有不良影响。
6.权利要求1或2所述的贝莱斯芽孢杆菌的下述至少一种应用：
B1)权利要求1或2中所述的贝莱斯芽孢杆菌在制备提高家禽生产性能和/或提高家禽体重的产品中的应用；
B2)权利要求1或2中所述的贝莱斯芽孢杆菌在制备增强家禽空肠消化吸收能力的产品中的应用；
B3)权利要求1或2中所述的贝莱斯芽孢杆菌在制备提高家禽机体抗氧化能力的产品中的应用；
B4)权利要求1或2中所述的贝莱斯芽孢杆菌在制备提高家禽抗病原菌能力的产品中的应用；
B5)权利要求1或2中所述的贝莱斯芽孢杆菌在制备缓解或改善肠道炎症的产品中的应用；
B6)权利要求1或2中所述的贝莱斯芽孢杆菌在制备饲用微生物添加剂中的应用；
B7)权利要求1或2中所述的贝莱斯芽孢杆菌在制备家禽饲料中的应用。
7.权利要求4或5所述菌剂的下述至少一种应用：
C1)权利要求4或5所述菌剂在制备提高家禽生产性能和/或提高家禽体重的产品中的应用；
C2)权利要求4或5所述菌剂在制备增强家禽空肠消化吸收能力的产品中的应用；
C3)权利要求4或5所述菌剂在制备提高家禽机体抗氧化能力的产品中的应用；
C4)权利要求4或5所述菌剂在制备提高家禽抗病原菌能力的产品中的应用；
C5)权利要求4或5中所述菌剂在制备缓解或改善肠道炎症的产品中的应用；
C6)权利要求4或5所述菌剂在制备饲用微生物添加剂中的应用；
C7)权利要求4或5所述菌剂在制备家禽饲料中的应用。
8.根据权利要求5所述的菌剂或权利要求6或7所述的应用，其特征在于：所述家禽为鸡。
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