CN118542885A - 一种乳酸菌二联活菌制剂、其制备方法及应用 - Google Patents

一种乳酸菌二联活菌制剂、其制备方法及应用 Download PDF

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CN118542885A CN202410412627.1A CN202410412627A CN118542885A CN 118542885 A CN118542885 A CN 118542885A CN 202410412627 A CN202410412627 A CN 202410412627A CN 118542885 A CN118542885 A CN 118542885A
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张文杰
斯智萍
黄波
刘莹
孟璐
李晓崇
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Hangzhou Heli Xinjian Industrial Co ltd
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Abstract

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种乳酸菌二联活菌制剂、其制备方法及应用，本发明所述乳酸菌二联活菌制剂含卷曲乳杆菌菌株和加氏乳杆菌菌株。本发明所述活菌制剂能够抑制大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、加德纳菌、粪肠球菌、无乳链球菌和动弯杆菌等致病菌。本发明组合物能够在恒河猴阴道中定植，降低恒河猴阴道pH值，在预防和治疗细菌性阴道病以及相关阴道感染中具有一定的应用前景。

Description

一种乳酸菌二联活菌制剂、其制备方法及应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种乳酸菌二联活菌制剂、其制备方法及应用。
背景技术
细菌性阴道病(BV)的发生是由于菌群失调，乳酸杆菌减少而导致其他病原如加德纳菌、各种厌氧菌、弯曲弧菌等的大量繁殖，BV实际上是以加德纳菌为主的一种混合感染。应用抗生素治疗可暂时缓解BV的症状，但也使本已减少的乳杆菌进一步减少，加重阴道微生态失调，从而使BV反复复发。如何控制复发、根治细菌性阴道病是妇产科医生亟需解决的棘手问题。
非抗生素疗法势在必行，目前妇女生殖道用微生态制剂的研发、生产和应用跟不上临床的需求，市场上仅有2款产品应用于临床均为单一菌种的制剂，不能发挥二联菌种的协同作用。另外，据调查，目前用于治疗细菌性阴道病的微生态制品所选菌种并不是正常妇女体内的优势菌种，所以在临床方面的应用比较有限。
健康妇女阴道中存在着一些优势菌群，这些优势菌群对维持阴道正常菌群的平衡起着关键的作用。优势菌群通过分泌乳酸、过氧化氢、细菌素等物质起到杀灭致病菌的作用。同时，在阴道粘膜上皮细胞的竞争黏附作用起到生物屏障的作用，阻止了致病菌在阴道的繁殖。
通过外源介入阴道优势益生菌来恢复阴道乳杆菌优势，从而达到正常阴道菌群的平衡状态是预防和/或治疗阴道炎症的一种有效手段。
发明内容
本发明旨在提供一种乳酸菌二联活菌制剂、其制备方法及应用，相对于已上市的单一菌株，该组合物能有效协同发挥作用，该组合物菌株来源于健康人体，具有活跃稳定的生物学特性，为抑菌能力强、细胞黏附能力强的卷曲乳杆菌和加氏乳杆菌的组合物。
本发明还证明了该菌株对阴道上皮细胞具有较强的粘附作用，能在恒河猴阴道中定植，降低恒河猴阴道pH值，同时还证实该菌具有较强的产生H2O2的能力，该菌制成的微生态制剂在存储期间能够维持较高的活性和存活能力，说明可以用于防治细菌性阴道病。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种乳酸菌二联活菌制剂，所述制剂中包含卷曲乳杆菌和加氏乳杆菌，质量比为1～20:1～20；
所述卷曲乳杆菌和加氏乳杆菌的活菌数均≥1.0×107CFU/g。
优选的，还包括药学上可用的辅料。
优选的，所述药学上可用的辅料为无水乳糖、微晶纤维素、二氧化硅和硬酯酸镁中的至少一种。
本发明还提供了所述乳酸菌二联活菌制剂的制备方法，包括如下步骤：
1)将卷曲乳杆菌和加氏乳杆菌分别发酵、离心后，取离心后的菌泥与冻干保护剂混合后真空冷冻干燥制得各菌株的冻干菌粉；
2)将制得的冻干菌粉与药学上可用的辅料混合即得本发明所述乳酸菌二联活菌制剂。
优选的，所述步骤1)中菌泥与冻干保护剂的重量比为0.5～2:2～6。
优选的，所述冻干保护剂中脱脂奶粉、一水乳糖、蔗糖、谷氨酸钠与维生素C的质量比为80～120：20～60：100～140：8～12：8～12。
优选的，所述步骤1)中真空冷冻干燥条件为在-50℃下冷冻3～5小时，然后在-10℃下真空干燥15～25小时，在0℃下真空干燥3～5小时，再在30℃下真空冷冻干燥5～12h，最后在30℃下干燥1～1.5h。
本发明还提供了所述乳酸菌二联活菌制剂在制备预防和/或治疗妇科疾病药物中的应用。
优选的，所述妇科疾病包括细菌性阴道病。
优选的，所述治疗妇科疾病药物包括调节阴道pH值或调节菌群平衡类药物。
本发明所述乳酸菌二联活菌制剂，其中的卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)菌株均从健康妇女阴道分泌物中筛选而来，经大量实验证明，具有较强的产酸、产H2O2能力与阴道上皮细胞粘附的能力，在恒河猴阴道中能显著改变阴道pH，且改善阴道中清洁度，且在给药后D1～D14天均可在恒河猴阴道内检出卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)。且与已上市的单一菌株相比，定植持续时间更长，定植后的乳杆菌占比高于已上市的单一菌株。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
1、卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)、加氏乳杆菌(Lactobacillusgasseri)可以独立并协同抵抗细菌性阴道病和各种阴道感染，包括白色念珠菌性阴道炎，淋病，病毒性阴道炎以及泌尿道感染等。
2、本发明的菌株直接采集于健康人体，具有活跃稳定的生物学特性，无需驯化，直接进入制剂工艺即可。
3、本发明的菌株具有抑制加德纳氏菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、粪肠球菌、无乳链球菌、动弯杆菌等作用，可有效形成阴道微生态，与目前市售制剂相比具有明显优势，植入时菌株定植能力强，定植时间长，有更明显的定植效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为实施例5中乳酸标样图谱；
图2为实施例5中1#菌1代的乳酸含量检测色谱图；
图3为实施例5中1#菌30代的乳酸含量测定色谱图；
图4为实施例5中2#菌1代的乳酸含量测定色谱图；
图5为实施例5中2#菌30代的乳酸含量测定色谱图；
图6为实施例6中过氧化氢实验结果图；其中，A为1#菌，B为2#菌；
图7为实施例7中乳杆菌对ATCC阴道上皮细胞的粘附结果；其中A为1#菌，B为2#菌；
图8为实施例9中不同时期各组恒河猴阴道内乳杆菌的变化；
图9为实施例10中甲硝唑处理前Shannon指数；其中，Normal_JB为辅料对照组，high_gJB为XLF-055高剂量组，low_gJB为XLF-055低剂量组，low_dJB为对照药低剂量组，high_dJB:对照药高剂量组；
图10为实施例10中甲硝唑处理后Shannon指数；其中，Normal_DB为辅料对照组；high_GDB为XLF-055高剂量组；low_GDB为XLF-055低剂量组；high_DDB为对照药高剂量组；low_DdB为对照药低剂量组；
图11为实施例10中甲硝唑处理前Simpson指数；其中，Normal_JB为辅料对照组，high_gJB为XLF-055高剂量组，low_gJB为XLF-055低剂量组，low_dJB为对照药低剂量组，high_dJB为对照药高剂量组；
图12为实施例10中甲硝唑处理后Simpson指数；其中，Normal_DB为辅料对照组；high_GDB为XLF-055高剂量组；low_GDB为XLF-055低剂量组；high_DDB为对照药高剂量组；low_DdB为对照药低剂量组；
图13为实施例10中不同时期恒河猴阴道内乳杆菌的变化。
生物保藏
卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)菌株，于2012年7月17日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)(保藏单位的缩写为CGMCC)，保藏编号为CGMCCNo.6360。
加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)菌株，于2012年7月17日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)(保藏单位的缩写为CGMCC)，保藏编号为CGMCCNo.6362。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。以下实施例中本发明所涉及菌株均为市售菌株；所用的试验试剂耗材，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；以下实施例中的％为质量百分含量。为方便表述以下：本文中1#菌指：加氏乳杆菌，2#菌指：卷曲乳杆菌。
以下实施例中所用到的细菌培养基，可以按如下方法配制：
MRS液体培养基配方为10g蛋白胨、5g酵母浸粉、10g牛肉膏、20g葡萄糖、5g乙酸钠、2g柠檬酸三铵、2g磷酸氢二钾、0.58g硫酸镁、0.25g硫酸锰及1ml吐温80，加水完全溶解并定容至1000ml后调节pH为6.2-6.4，并密封包装后经高压蒸汽灭菌后得到的培养基；
改良MRS液体培养基配方为10g蛋白胨、5g酵母浸粉、10g牛肉膏、20g蔗糖、5g乙酸钠、2g柠檬酸三铵、2g磷酸氢二钾、0.58g硫酸镁、0.25g硫酸锰及1ml吐温80，加水完全溶解并定容至1000ml后调节pH为6.2-6.4，并密封包装后经高压蒸汽灭菌后得到的培养基。
以下实施例中所涉及到的各致病菌分别为：
大肠埃希菌CMCC(B)44102、金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003，白色念珠菌ATCC10231，加德纳菌ATCC14018，粪肠球菌(北京大学第一医院妇幼医院妇科实验室提供)，无乳链球菌(CICC10465)，动弯杆菌ATCC43063。
实施例1卷曲乳杆菌冻干菌粉的制备
将卷曲乳杆菌在pH 6.3的MRS液体培养基中生长，使用300L规模的发酵罐发酵，厌氧培养。在平台期早期收集菌体，其活菌数达到约1.0×108CFU/ml以上。通过离心分离收集菌体，将离心后的菌泥与冻干保护剂以1:4的重量比混合后，将混合物置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥。所述混合物在-50℃下冷冻4小时，然后在-10℃下真空干燥15小时，在0℃下真空干燥3小时，再在30℃干燥5小时，最后在30℃下干燥1小时。冻干粉粉碎包装后，冷藏贮藏。将冻干粉进行活菌计数，活菌数在1.0×1010CFU/g以上。
所述冻干保护剂中脱脂奶粉、一水乳糖、蔗糖、谷氨酸钠与维生素C的质量比为100：50：120：10：10。
实施例2加氏乳杆菌冻干菌粉的制备
将加氏乳杆菌在pH 6.3的MRS液体培养基中生长，使用300L规模的发酵罐发酵，厌氧培养。在平台期早期收集菌体，其活菌数达到约1.0×108CFU/ml以上。通过离心分离收集菌体，将离心后的菌泥与实施例1所述的冻干保护剂以1:4的重量比混合后，将混合物置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥。所述混合物在-50℃下冷冻4小时，然后在-10℃下真空干燥15小时，在0℃下真空干燥3小时，再在30℃干燥5小时，最后在30℃下干燥1小时。冻干粉粉碎包装后，并冷藏贮藏，将冻干粉进行活菌计数，活菌数在1.0×1010CFU/g以上。
实施例3乳酸菌二联活菌制剂的制备
取100g实施例1制备的卷曲乳杆菌冻干菌粉、100g实施例2制备的加氏乳杆菌菌粉、2.3kg无水乳糖和15g硬脂酸镁混合，填充于2号硬胶囊，每个胶囊填充250mg±25mg，做成乳酸菌二联活菌胶囊，并6℃冷藏贮藏。
计数确认每个乳酸菌二联活菌胶囊中单一菌的活菌数均在1.0×107CFU/g以上。
实施例4乳酸菌二联活菌制剂的毒性考察
本实施例使用10只雌性SD大鼠，分为2组，每组5只，分别给予辅料对照组成品0.5g/只/天(0.25g/粒，每粒内含无水乳糖248.5mg+硬脂酸镁1.5mg，含有加氏乳杆菌及卷曲乳杆菌数均为0CFU/g)，实施例3所述乳酸菌二联活菌胶囊成品0.5g/只/天(0.25g/粒，每粒内含有加氏乳杆菌及卷曲乳杆菌数均不少于1.0×109CFU/g)；当日给药2次，每次每只动物1粒，第2次给药时间为第一次给药后8.5h。给药后连续观察14天。结果显示15天内所有动物临床观察、平均体重及平均体重增长以及大体解剖均未见明显与对照组相关的异常，未见与供试品相关的毒性改变。
实施例5 1#菌和2#菌的原始种子1代、30代乳酸含量测定
为证明1#、2#乳杆菌产酸，有利于恢复阴道酸性环境，本实施例将1#菌和2#菌菌株分别接种于MRS液体培养基中，置37℃厌氧培养36小时后，取培养液参照现行版中国药典规定方法采用高效液相色谱法分别测定乳酸含量。
CICC检测报告：乳酸纯度大于99％的乳酸标准样品色谱图(见图1)
1#菌1代：乳酸含量为9.4074mg/ml(见图2)
1#菌30代：乳酸含量测定：乳酸含量为8.5560mg/ml(见图3)
2#菌1代：乳酸含量为8.3866mg/ml(见图4)
2#菌30代：乳酸含量测定：乳酸含量为8.5927mg/ml(见图5)
结果如图1～5所示，1#、2#乳杆菌代谢产物中均含有乳酸，可保持阴道正常酸性环境。
实施例6过氧化氢试验
为检测1#、2#乳杆菌代谢产物中是否含有过氧化氢，以证明其是否具有杀菌能力，本实施例在无菌操作环境下，用一次性无菌接种环分别挑取1#菌或2#菌的菌落三区划线接种于过氧化氢检测平皿上，每个菌株接种两个平皿，接种完成后置37℃厌氧培养60h，培养结束后将平皿暴露于空气中持续观察2h，若菌落显示蓝色为过氧化氢阳性，否则为过氧化氢阴性(见图6)。结果显示1#菌或2#菌菌落均显示蓝色，表明本发明所述1#、2#乳杆菌代谢产物中均含有过氧化氢。
实施例7乳杆菌对阴道上皮细胞的粘附作用
1、实验材料
1)1#、2#乳杆菌悬液的制备：
将加氏乳杆菌1#和卷曲乳杆菌2#的甘油管中各取30μl加入到含13ml MRS液体培养基的离心管中，在37℃条件下培养12h，然后离心(5000r/min，5min)，使用RPMI1640培养基调整各乳杆菌的浓度为1×108CFU/ml，备用。
2)ATCC细胞培养板的制备：
分别吸取2mLATCC来源的阴道上皮细胞悬液加入到内置盖玻片的6孔培养板的各个孔中，37℃，5％ CO2孵育箱中培养18～24h，待细胞贴壁后，使用含10％ FBS的DMEM-F12培养液(不含抗生素)清洗3次，备用。
2、1#、2#乳杆菌对阴道上皮细胞的粘附能力检测
分别吸取2mL 1#、2#乳杆菌悬液加入制备好的ATCC细胞培养板的各个孔中(ATCC细胞终浓度为1×105个/mL，乳杆菌终浓度1×108CFU/mL)，在37℃，5％ CO2孵育箱中培养，于1h终止培养。取出盖玻片，PBS漂洗3次，自然干燥，然后甲醇固定30min，革兰染色，油镜下随机计数50个上皮细胞，推算出每个上皮细胞的平均粘附指数。
结果显示，1#、2#乳杆菌均能粘附于ATCC来源的阴道上皮细胞。它们的粘附指数是有差别的，粘附指数如表1所示，2#(乳杆菌)对阴道上皮细胞的粘附能力比1#(乳杆菌)强(见图7)。
表1
3、乳杆菌ATCC阴道上皮细胞粘附后细胞存活率的检测：
首先将细胞培养板中的DMEM-F12培养基吸出，然后用K-SFM培养基清洗未粘附的ATCC阴道上皮细胞。分别吸取2mL1#、2#乳杆菌悬液加入至ATCC阴道上皮细胞培养板中(各个孔中阴道上皮细胞终浓度为1×105个/ml，乳杆菌终浓度1×108CFU/ml)，在37℃，5％ CO2孵育箱中培养，同时设置不加乳杆菌悬液的对照组，24h后分别取出进行细胞存活率的检测。
使用胰酶消化细胞(37℃，5min)，再使用含有10％FBS的DMEM-F12培养基终止消化，用台盼蓝染色并计数器细胞总数和存活细胞数，换算成细胞存活率。
细胞存活率＝活细胞数/细胞总数×100％
存活细胞数＝(4个大方格活细胞总数)/4×10000
统计学方法:非参数检验中的2独立样本t检验；
结果在1#、2#乳杆菌粘附ATCC阴道上皮细胞24和48h后，ATCC细胞的活细胞数分别为如下表2所示：经统计学分析，1#、2#乳酸杆菌在24h和48h对照组差异均无显著性。在48h后，阴道上皮细胞和对照组相比存活率有下降，原因可能是细菌和细胞共同争抢有限的营养，同时细菌还会分泌一些小分子物质，例如分泌乳酸等导致pH值的下降影响细胞的生长。
表2乳杆菌粘附ATCC阴道上皮细胞24和48小时后细胞存活率
乳杆菌 24h细胞存活率 48h细胞存活率
1# (97.5±1.8)％ (85.8±7.1)％
2# (94.2±1.8)％ (83.3±1.8)％
对照组 (99.2±0)％ (94.2±5.3)％
综上结果显示：两种乳杆菌粘附阴道上皮细胞的能力是有差异的，其中2#菌粘附阴道上皮细胞的能力比1#菌强。另外，乳杆菌对阴道上皮细胞毒性反应小，其粘附阴道上皮细胞后，细胞存活率在48h内与对照组无统计学差异。
实施例8乳杆菌拮抗阴道常见致病菌的黏附作用：排斥、置换及竞争试验
1、实验材料
1#、2#乳杆菌悬液、ATCC细胞培养板的制备方法同实施例7，白色念珠菌悬液、大肠杆菌悬液、动弯杆菌悬液、粪肠球菌悬液、加德纳菌悬液、金黄色葡萄球菌悬液、无乳链球菌悬液均用MRS液体培养基制备。
2、排斥试验
使用RPMI1640培养基清洗未粘附的阴道上皮细胞(ATCC-CRL-2616)。每孔分别加入1#、2#乳杆菌悬液1mL(1×108CFU/mL)，37℃，5％ CO2孵育箱中培养，同时设置不加乳杆菌悬液为对照组。1小时后，使用无菌PBS液体漂洗3次，去除未粘附的乳杆菌。每孔分别加入白色念珠菌悬液1mL(1×109CFU/mL)、大肠杆菌悬液1mL(1×109CFU/mL)、金黄色葡萄球菌悬液1mL(1×108CFU/mL)、加德纳菌悬液1mL(1×108CFU/mL)、动弯杆菌悬液1mL(1×109CFU/mL)、粪肠球菌悬液1mL(1×109CFU/mL)、无乳链球菌悬液1mL(1×108CFU/mL)，同时设置只加致病菌为对照组。37℃，5％CO2孵育箱中培养1小时。
3、置换试验
使用RPMI1640培养基清洗未粘附的阴道上皮细胞(ATCC-CRL-2616)。每孔分别加入白色念珠菌悬液1mL(1×109CFU/mL)、大肠杆菌悬液1mL(1×109CFU/mL)、金黄色葡萄球菌悬液1mL(1×108CFU/mL)、加德纳菌悬液1mL(1×108CFU/mL)、动弯杆菌悬液1mL(1×109CFU/mL)、粪肠球菌悬液1mL(1×109CFU/mL)、无乳链球菌悬液1mL(1×108CFU/mL)37℃，5％CO2孵育箱中培养。同时设置只加致病菌为对照组。1小时后，使用无菌PBS液体漂洗3次，去除未粘附的乳杆菌。每孔再分别加入1#、2#乳杆菌1mL(1×108CFU/mL)，37℃，5％CO2孵育箱中培养1小时。
4、竞争试验
使用RPMI1640培养基清洗未粘附的阴道上皮细胞(ATCC-CRL-2616)。每孔分别加入1#、2#乳杆菌悬液1mL(1×108CFU/mL)，同时分别加入白色念珠菌悬液1mL(1×109CFU/mL)、大肠杆菌悬液1mL(1×109CFU/mL)、金黄色葡萄球菌悬液1mL(1×108CFU/mL)、加德纳菌悬液1mL(1×108CFU/mL)、动弯杆菌悬液1mL(1×109CFU/mL)、粪肠球菌悬液1mL(1×109CFU/mL)、无乳链球菌悬液1mL(1×108CFU/mL)混匀，同时设置只加致病菌为对照组。37℃，5％CO2孵育箱中培养1小时。
5、计数方法：取出粘附阴道上皮细胞的盖玻片，PBS漂洗3次，自然干燥，甲醇固定30min，革兰染色，油镜下随机计数50个上皮细胞的粘附指数，推算出乳杆菌对致病菌粘附的粘附抑制率(计算致病菌的均数及标准差)。
粘附抑制率＝(对照组－试验组)/对照组×100％。
1#、2#乳杆菌对不同致病菌的粘附拮抗指数如表3～9所示。
表3乳杆菌对白色念珠菌的粘附拮抗指数(ATCC阴道上皮细胞)
表4乳杆菌对大肠杆菌的粘附拮抗指数(ATCC阴道上皮细胞)
表5乳杆菌对金黄色葡萄球菌的粘附拮抗指数(ATCC阴道上皮细胞)
表6乳杆菌对加德纳菌的粘附拮抗指数(ATCC阴道上皮细胞)
表7乳杆菌对动弯杆菌的粘附拮抗指数(ATCC阴道上皮细胞)
表8乳杆菌对粪肠球菌的粘附拮抗指数(ATCC阴道上皮细胞)
表9乳杆菌对无乳链球菌的粘附拮抗指数(ATCC阴道上皮细胞)
综上表3～9结果显示：1#菌和2#菌对不同致病菌粘附阴道上皮细胞都具有拮抗能力。
实施例9乳杆菌对正常雌性恒河猴阴道定植作用研究
1、分组、给药
1)选取菌群分析合格的恒河猴20只，体重3.13～4.55kg，随机分为辅料对照组、对照药胶囊低剂量组(德氏乳杆菌106CFU/只)、对照药胶囊高剂量组(德氏乳杆菌108CFU/只)、XLF-055低剂量组(1#：2#＝106：106CFU/只)、XLF-055高剂量组(1#：2#＝108：108CFU/只)，4只/组。对上述各分组进行ID编号，辅料对照组为1F01-1F04，对照药胶囊低剂量组为2F01-2F04，对照药胶囊高剂量组为3F01-3F04，XLF-055低剂量组为4F01-4F04、XLF-055高剂量组为5F01-5F04。
2)将各组分别给予相应剂量的受试物或对照品，每只1粒(0.25g/粒)，1次/天，连续5天，辅料对照组给予等量的含辅料的空白胶囊。所述XLF-055组为本发明实施例3所述的乳酸菌二联活菌胶囊，其中XLF-055低剂量组中1#和2#菌的活菌数均为106CFU，XLF-055高剂量组中1#和2#菌的活菌数均为108CFU。分别于给药前、给药结束后1、3、7、14天采用无菌棉签进行阴道分泌物的取样，并进行清洁度镜检、pH值测定以及乳杆菌定植情况分析(细菌16S rDNA检测)。
2、阴道分泌物的采集
分别于乳杆菌处理前和处理停药后第1、3、7、14天(以末次给药次日作为给药后第1天)采用无菌棉签进行阴道分泌物的取样，取材部位为恒河猴的宫颈口或宫颈后穹窿的分泌物处使用一次性无菌阴道拭子采集，圆周滚动5次，每只动物采集两份，一份置于盛有2mL的MRS培养液的阴道拭子管中，于-80℃冰箱中保存；另一份用于阴道涂片和pH值镜检。阴道分泌物的pH值检测采用0.1级精密pH试纸；同时进行阴道涂片，使用光镜评估阴道分泌物的清洁度。
3、阴道分泌物检测
1)pH值测定
阴道分泌物的pH值检测采用0.1级精密pH试纸。
结果如下表10所示，给药前、给药结束后1、3、7、14天取样后的阴道分泌物的pH值测定结果显示，给药后各个阶段的对照药胶囊和XLF-055阴道pH值虽无统计学差异，但较辅料对照组均具有降低的趋势。XLF-055低剂量组与同期对照药胶囊低剂量组比较，降低pH的趋势基本一致；XLF-055高剂量组与对照药胶囊高剂量组比较，降低pH的趋势稍大些，且维持阴道pH酸度效果更好。对照药胶囊低剂量组于末次给药后D1、D3、D7阴道pH值较给药前显著降低，对照药胶囊高剂量组于末次给药后D7阴道pH值较给药前显著降低，XLF-055低、高剂量组于末次给药后D1、D7阴道pH值较给药前均显著降低，XLF-055高剂量组于末次给药后D14阴道pH值较给药前显著降低。
表10乳杆菌对恒河猴阴道pH的影响(x±s，n＝4)
注：与给药前比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
2)清洁度镜检结果
清洁度检查，按全国临床检验操作规程进行分级：I度：镜下以阴道杆菌为主，并可见大量上皮细胞；II度：有部分阴道杆菌，上皮细胞亦可见，也有部分脓细胞和杂菌；III度：只见少量阴道杆菌和上皮细胞，但有大量的脓细胞和其他杂菌；IV度：镜下无阴道杆菌，几乎全是脓细胞和大量杂菌。
各组于给药前、给药结束后1、3、7、14天取阴道分泌物检查，结果显示镜下观察均可见以阴道杆菌为主，上皮细胞亦可见，也有部分的杂菌。提示各组给药前后清洁度变化基本一致。
4、乳杆菌定植情况分析
将给药前、给药结束后1、3、7、14天取样后的阴道分泌物经总DNA提取后，利用细菌16SrDNA(V3+V4)区域引物：上游引物338F(如SEQ ID NO.1所示)：ACTCCTACGGGAGGCAGCAG；下游引物806R(如SEQ ID NO.2所示)：GGACTACHVGGGTWTCTAAT进行PCR扩增全基因组V3和V4片段，所述PCR反应体系为：5×FastPfu Buffer 4μL、2.5mM dNTPs 2μL、Forward Primer(5μM)0.8μL、Reverse Primer(5μM)0.8μL、FastPfu Polymerase 0.4μL、BSA 0.2μL、TemplateDNA 10ng、补ddH2O至20μL。所述PCR反应参数为：1×(3minutes at 95℃)；循环数×30secat 95℃；30sec at退火温度℃；45sec at 72℃)；10minutes at 72℃，10℃ until haltedby user。采用2％琼脂糖凝胶电泳检测，3μl上样检测电泳图。将扩增产物送测序公司进行测序，将测得的16SrDNA基因序列通过BLAST与NCBI数据库中的已知序列进行比对分析确定单一菌种，当同源性大于或等于99％，则鉴定为同一物种。
经细菌16S rDNA检测结果如图8及表11～15所示，辅料对照组阴道内的德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)均未检出，部分动物仅可见极少量检出。对照药胶囊低、高剂量组的阴道中Lactobacillus delbrueckii较给药前有一定的定植(4/4只)，但持续时间较短，且在恒河猴阴道内占比较低(小于1％)。XLF055低剂量组、高剂量组给药后D1～D14均可检出Lactobacillus crispatus，其中XLF055低、高剂量组给药后D1可检出Lactobacilluscrispatus，分别有4/4、1/4只动物定植成功，且其中各有1只动物阴道内Lactobacilluscrispatus持续时间长，但占比较低；XLF055低、高剂量组给药后D1～D14阴道中均可检出Lactobacillus gasseri，其中XLF055低、高剂量组Lactobacillus gasseri分别有4/4、4/4只动物定植成功，定植后的乳杆菌占比高于对照药胶囊(Lactobacillus gasseri vsLactobacillus delbrueckii)，且各只动物阴道内乳杆菌的定植持续时间较对照药胶囊更长(XLF055 vs对照药＝14天vs 3天)，具有的优势。
表11阴道分泌物乳杆菌百分比(％)个体数据
表12阴道分泌物乳杆菌百分比(％)个体数据(续表)
表13正常恒河猴阴道乳杆菌Lactobacillus gasseri比例(％，n＝4)
表14正常恒河猴阴道乳杆菌Lactobacillus crispatus比例(％，n＝4)
表15正常恒河猴阴道乳杆菌Lactobacillus delbrueckii比例(％，n＝4)
实施例10乳杆菌对雌性恒河猴经甲硝唑处理后定植作用研究1、甲硝唑预处理与给药
将20只雌性、体重3～5kg的恒河猴经阴道给予甲硝唑栓(0.5g/只)，1次/日，连续5天，末次给药后采用0.9％氯化钠注射液冲洗阴道，停药5天后采用无菌棉签进行阴道分泌物的取样(阴道分泌物的取样方法同实施例9)。取阴道分泌物检测恒河猴阴道生物多样性，结果显示阴道微生物多样性明显降低，且未检出德氏乳杆菌(Lactobacillusdelbrueckii)或检出极少的加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)和卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)。选用20只雌性、体重3～5kg恒河猴，采用双交叉设计进行第二轮试验，第1组(编号1F01-1F04)给予辅料对照组，第2组(编号2F01-2F04)、第3组(编号3F01-3F04)分别给予XLF-055高剂量组(1#：2#＝108：108CFU/只)、XLF-055低剂量组(1#：2#＝106：106CFU/只)；第4组(编号4F01-4F04)、第5组(编号5F01-5F04)分别给予对照药胶囊高剂量组(德氏乳杆菌108CFU/只)、对照药胶囊低剂量组(德氏乳杆菌106CFU/只)，4只/组，每只1粒(0.25g/粒)，1次/天，连续5天。分别于甲硝唑处理前、给药前、给药结束后1、3、7、14天采用无菌棉签进行阴道分泌物的取样，并进行清洁度镜检、pH值测定以及乳杆菌定植情况分析(细菌16S rDNA检测)，所述阴道分泌物的取样、清洁度镜检、pH值测定方法以及乳杆菌定植情况分析方法同实施例9。
2、阴道分泌物微生物多样性
阴道微生物多样性检测结果如表16和图9～12可知，甲硝唑处理后较甲硝唑处理前的shannon指数明显减少，simpson指数明显增加。卷曲乳杆菌及德氏乳杆菌在甲硝唑处理前和处理后均未检出，在甲硝唑处理后检出少量的加氏乳杆菌和卷曲乳杆菌。
表16甲硝唑处理前和处理后生物多样性指数(n＝4)
3、阴道pH值测定
结果如下表17可知，对照药胶囊低剂量组pH值较给药前明显降低。XLF-055低剂量组降低pH趋势与同期对照药胶囊比较基本一致。对照药胶囊低剂量组于末次给药后D1、D7、D14阴道pH值较给药前均显著降低，对照药胶囊高剂量组于末次给药后D1、D7阴道pH值较给药前均显著降低，XLF-055低剂量组于末次给药后D1、D3、D7阴道pH值较给药前均显著降低，XLF-055高剂量组于末次给药后D7阴道pH值较给药前显著降低(见表17)。
表17阴道用乳杆菌二联活菌胶囊对恒河猴阴道pH的影响(x±s，n＝4)
注：与辅料对照组比较，+P＜0.05；与给药前比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
4、清洁度检查
结果如下表18可知，对照药胶囊高剂量组于末次给药后D1、D7阴道清洁度值较给药前显著增加，对照药胶囊低剂量组于末次给药后D1阴道清洁度值较给药前显著增加，D14阴道清洁度值较给药前显著降低，XLF-055高剂量组于末次给药后D7阴道清洁度值较给药前显著升高，XLF-055低剂量组于末次给药后D1～D14阴道清洁度较给药前均显著降低。
表18阴道用乳杆菌二联活菌胶囊对恒河猴阴道清洁度的影响(x±s，n＝4)
注：与辅料对照组比较，++P＜0.01；与给药前比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
5、阴道乳杆菌定植分析
乳杆菌定植情况分析过程同实施例9，采用2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，3μl上样检测电泳图，将扩增产物送测序公司进行测序，将测得的16SrDNA基因序列通过BLAST与NCBI数据库中的已知序列进行比对分析确定单一菌种，当同源性大于或等于99％，则鉴定为同一物种。
经过16SrDNA检测，结果如图13及表19～23所示，显示辅料对照组阴道内的德氏乳杆菌未检出，部分动物仅可见极少量Lactobacillus gasseri和Lactobacilluscrispatus。其余组，对照药胶囊低、高剂量组的阴道中Lactobacillus delbrueckii较给药前有一定的定植(2/4只)，但持续时间较短，且占比均小于1％。XLF055低、高剂量组给药后D1～D14阴道中均可检出Lactobacillus gasseri，其中XLF055低、高剂量组Lactobacillusgasseri分别有4/4、4/4只动物定植成功，定植后的乳杆菌占比高于对照药胶囊(Lactobacillus delbrueckii)，其中高剂量(3只)和低剂量(2只)加氏乳杆菌占比大于1％，且各只动物阴道内乳杆菌的定植持续时间较对照药更长；XLF055低剂量组、高剂量组给药后D1～D14均可检出Lactobacillus crispatus，其中XLF055低、高剂量组Lactobacillus crispatus分别有4/4、4/4只动物定植成功，定植后的乳杆菌占比高于对照药胶囊(Lactobacillus delbrueckii)，其中高剂量(1只)和低剂量(3只)Lactobacilluscrispatus占比大于1％。
表19阴道分泌物乳杆菌百分比(％)个体数据
表20阴道分泌物乳杆菌百分比(％)个体数据(续表)
表21恒河猴(甲硝唑处理)阴道乳杆菌Lactobacillus gasseri比例(％，n＝4)
表22恒河猴(甲硝唑处理)阴道乳杆菌Lactobacillus delbrueckii比例(％，n＝4)
表23恒河猴(甲硝唑处理)阴道乳杆菌Lactobacillus crispatus比例(％，n＝4)
综上，通过PCR技术检测用药前后恒河猴(甲硝唑未处理和预处理)阴道菌群的变化情况及Lactobacillus crispatus和Lactobacillus gasseri在阴道的定植情况，结果显示XLF-055经阴道给药后Lactobacillus crispatus、Lactobacillus gasseri均能在阴道内定植成功，占比量较多，且维持时间长；对照药胶囊经阴道给药后Lactobacillusdelbrueckii能在阴道内定植成功，但持续时间均较短，且定植后的Lactobacillusdelbrueckii占比较低；XLF-055(Lactobacillus crispatus&Lactobacillus gasseri vsLactobacillus delbrueckii)定植量和维持时间较定君生胶囊均具有显著的优势。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种乳酸菌二联活菌制剂，其特征在于，所述制剂中包含卷曲乳杆菌和加氏乳杆菌，质量比为1～20:1～20；
所述卷曲乳杆菌和加氏乳杆菌的活菌数均≥1.0×107CFU/g。
2.根据权利要求1所述的乳酸菌二联活菌制剂，其特征在于，还包括药学上可用的辅料。
3.根据权利要求2所述的乳酸菌二联活菌制剂，其特征在于，所述药学上可用的辅料为无水乳糖、微晶纤维素、二氧化硅和硬酯酸镁中的至少一种。
4.权利要求1～3任一项所述乳酸菌二联活菌制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将卷曲乳杆菌和加氏乳杆菌分别发酵、离心后，取离心后的菌泥与冻干保护剂混合后真空冷冻干燥制得各菌株的冻干菌粉；
2)将制得的冻干菌粉与药学上可用的辅料混合即得本发明所述乳酸菌二联活菌制剂。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中菌泥与冻干保护剂的重量比为0.5～2:2～6。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述冻干保护剂包括脱脂奶粉、一水乳糖、蔗糖、谷氨酸钠与维生素C，质量比为80～120：20～60：100～140：8～12：8～12。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中真空冷冻干燥条件为在-50℃下冷冻3～5小时，然后在-10℃下真空干燥15～25小时，再在0℃下真空干燥3～5小时，再在30℃下真空冷冻干燥5～12h，最后在30℃下干燥1～1.5h。
8.一种权利要求1～3任一项所述乳酸菌二联活菌制剂在制备预防和/或治疗妇科疾病药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述妇科疾病包括细菌性阴道病。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述治疗妇科疾病药物包括调节阴道pH值或调节菌群平衡类药物。
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