CN116769676B - 一种卷曲乳杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)VB250,于2023年02月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号为CGMCC No.26574。本发明的卷曲乳杆菌在低pH环境下具有较好的生长活力和多种致病菌抑制活性,其可用于预防和/或缓解和/或治疗阴道菌群紊乱引起的相关疾病,如细菌性阴道炎、霉菌性阴道炎、滴虫性阴道炎、好氧性阴道炎、老年性阴道炎和病毒感染引起的阴道炎;并且,该卷曲乳杆菌在制备如药品、卫生用品等产品中具有巨大的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域,尤其是涉及一种胃肠耐受性良好且具有多种致病菌抑制活性的卷曲乳杆菌及其应用,更具体地,本发明涉及一种卷曲乳杆菌、发酵上清液、微生物菌剂、药物或卫生用品及其它们的用途。
背景技术
阴道炎是一种妇科常见疾病,可由各种病原体感染引起,也与外部刺激、激素水平有关。尤其是对于更年期的妇女,由于她们的卵巢功能的衰退、雌激素水平下降,阴道壁出现萎缩,上皮细胞的糖原减少,阴道内的pH值升高,局部的抵抗力下降,易产生以需氧菌为主的其他的致病菌过多繁殖,从而引起阴道炎症。对于阴道炎的治疗方法多是采用局部使用抗生素抑制细菌的生长,提高抵抗力。然而,随着抗生素耐药性的不断增加,患者的复发率不断升高。因此,研究人员开始探索新的治疗方法,以提高由菌群紊乱引起的阴道炎的治疗效果。研究发现使用益生菌制剂来增加阴道内乳酸菌的数量,可以抑制致病微生物的生长,从而达到治疗阴道炎的效果。
因此,亟需开发一种可预防和治疗细菌性阴道炎的新菌种。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此,本发明提供了一种卷曲乳杆菌,该卷曲乳杆菌在低pH环境下具有较好的生长活力和多种致病菌抑制活性,可用于预防和/或缓解和/或治疗阴道菌群紊乱引起的相关疾病。
本发明是基于发明人的下列发现而完成的:
目前国内已有2款阴道微生态制剂,用于由菌群紊乱而引起的细菌性阴道病的治疗。一款为内蒙古双奇药业股份有限公司生产的“万泽双奇 定君生”阴道用乳杆菌活菌胶囊,其有效成分为德氏乳杆菌;另一款为西安正浩生物制药有限公司生产的“延华”乳酸菌阴道胶囊,其有效成分为活肠链球菌。然而这两个菌种都不是阴道的优势原驻菌种,不可用于预防。
然而,卷曲乳杆菌是我国女性阴道优势菌株之一,能够维护阴道内正常的pH值,预防细菌性阴道炎的发生。
基于此,本发明的第一个目的是提供了一种卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)VB250。根据本发明的实施例,所述卷曲乳杆菌的保藏编号为CGMCC No.26574,保藏日期为2023年2月20日。本发明的卷曲乳杆菌具有耐低pH、高产乳酸、抗菌、耐抗生素和较强地阴道细胞粘附能力等优点,并且该卷曲乳杆菌的生长启动时间短,活化率高,生长活力强。
本发明的第二个目的是提供一种发酵上清液,其包含:前述的卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)VB250;和/或前述的卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)VB250的代谢产物。本发明的卷曲乳杆菌具有耐低pH、高产乳酸、抗菌、耐抗生素和较强地阴道细胞粘附能力等优点,并且该卷曲乳杆菌的生长启动时间短,活化率高,生长活力强。
本发明的第三个目的是提供一种微生物菌剂,所述的微生物菌剂含有前述的卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)VB250,和/或前述的发酵上清液。本发明的微生物菌剂用于预防和/或治疗阴道菌群紊乱引起的相关疾病。
作为一种具体的实施方式,所述卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)VB250以活细胞和/或非活细胞的形式存在。
作为一种具体的实施方式,所述微生物菌剂进一步包括药学上可接受的辅料或载体。
本发明的第四个目的是提供一种前述的卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)VB250、前述的发酵上清液或前述的微生物菌剂在制备产品中的用途,所述产品用于预防和/或治疗阴道菌群紊乱引起的相关疾病。
作为一种具体的实施方式,所述阴道菌群紊乱引起的相关疾病为阴道炎。
作为一种具体的实施方式,所述阴道炎包括但不限于细菌性阴道炎、霉菌性阴道炎、滴虫性阴道炎、好氧性阴道炎、老年性阴道炎和病毒感染引起的阴道炎。
作为一种具体的实施方式,所述产品为药品或卫生用品。
有益效果
(1)本发明筛选获得的卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)VB250相比其它卷曲乳杆菌,生长启动更快,在生长对数期的斜率更高,生长稳定期的OD600更高,表明其在低pH环境(pH=4.0)下生长启动更快,活化率更高,生长活力更强。
(2)本发明筛选获得的卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)VB250相比其它卷曲乳杆菌产乳酸能力较强,将实施例1中培养48 h后的不同卷曲乳杆菌发酵液中培养48 h后的不同卷曲乳杆菌发酵液,相比其他卷曲乳杆菌,VB250的L-乳酸和D-乳酸产量菌更高,表明该菌株更有利于维护人体阴道健康。
(3)本发明的卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)VB250相比其它卷曲乳杆菌,有较好的消化道耐受能力,更有利于其经口服通过肠道迁移至阴道。
(4)本发明的卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)VB250相比其它卷曲乳杆菌,能够更快的降低pH,并在pH为4时达到酸碱平衡,这表明该菌株能够创造并维持健康的阴道pH环境,具有更强的调节pH能力。
(5)本发明的卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)VB250具有多种致病菌的抑制活性,能抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、阴道加德纳氏菌和产气荚膜梭菌等的生长,可保护胃肠道、女性阴道、乳腺组织或其他器官免受病原菌的侵扰,因此,可单独或与其他益生菌组合,应用于多种疾病的辅助治疗,比如妇科疾病、胃肠道疾病、乳腺炎等。
(6)本发明的卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)VB250对卡那霉素、氧氟沙星、制霉菌素、甲硝唑、诺氟沙星和氟康唑具有较高的耐药性,可与临床用药联用来治疗细菌性阴道炎和霉菌性阴道炎。
(7)本发明的卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)VB250具有较强地阴道细胞粘附能力,其更易在阴道中定植,可抑制致病微生物的生长,调节阴道中的菌群平衡。
(8)本发明的卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)VB250连续给药10天能够显著减少感染小鼠阴道内的金黄色葡萄球菌的数量,能降低血浆中炎症因子IL-6水平,具有治疗阴道炎的作用。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解,其中:
图1为本发明实施例1中卷曲乳杆菌VB250的扫描电镜照片;
图2为本发明实施例2中卷曲乳杆菌VB250与其它菌株在pH=4.0时OD600随时间的变化曲线;
图3为本发明实施例3中卷曲乳杆菌VB250与其它菌株的发酵液pH值随时间的变化曲线;
图4为本发明实施例8中卷曲乳杆菌VB250与其它菌株对HeLa细胞的粘附性。
实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的,仅用于解释本发明,而不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是,术语“第一”、“第二”仅用于描述目的,而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此,限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地,在本发明的描述中,除非另有说明,“多个”的含义是两个或两个以上。
在本文中,术语“含有”、“包含”或“包括”为开放式表达,即包括本发明所指明的内容,但并不排除其他方面的内容。
在本文中,术语“任选地”、“任选的”或“任选”通常是指随后所述的事件或状况可以但未必发生,并且该描述包括其中发生该事件或状况的情况,以及其中未发生该事件或状况的情况。
在本文中,“预防”和“防止”可互换使用。这些术语指获得有益的或期望的结果的方法,包括但不限于预防性益处。为了获得“预防性益处”,可将发酵粘液乳杆菌或含有其的产品给予有罹患特定疾病风险的受试者,或给予报告疾病的一种或多种生理症状的受试者,即使可能该疾病的诊断尚未作出。
在本文中,术语“治疗”和“缓解”均是指用于获得期望的药理学和/或生理学效果。所述效果就完全或部分预防疾病或其症状而言可以是预防性的,和/或就部分或完全治愈疾病和/或疾病导致的不良作用而言可以是治疗性的。本文使用的“治疗”涵盖哺乳动物、特别是人的疾病,包括:(a)在容易患病但是尚未确诊得病的个体中预防疾病或病症发生;(b)抑制疾病,例如阻滞疾病发展;或(c)缓解疾病,例如减轻与疾病相关的症状。本文使用的“治疗”涵盖将药物或化合物给予个体以治疗、治愈、缓解、改善、减轻或抑制个体的疾病的任何用药,包括但不限于将含本文所述化合物的药物给予有需要的个体。
本发明提出了一种卷曲乳杆菌、发酵上清液、微生物菌剂、药物或卫生用品及其它们的用途,下面将分别对其进行详细描述。
菌种
在本发明的一个方面,本发明提出了一种卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)VB250。根据本发明的实施例,所述卷曲乳杆菌的保藏编号为CGMCC No.26574。本发明的卷曲乳杆菌具有耐低pH、高产乳酸、抗菌、耐抗生素和较强地阴道细胞粘附能力等优点,并且该卷曲乳杆菌的生长启动时间短,活化率高,生长活力强。
在本文中,“卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)VB250”和“卷曲乳杆菌VB250”同义。
发酵上清液
在本发明的另一方面,本发明提出了一种发酵上清液。根据本发明的实施例,所述发酵上清液包含:前述的卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)VB250;和/或前述的卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)VB250的代谢产物。本发明的卷曲乳杆菌具有耐低pH、高产乳酸、抗菌、耐抗生素和较强地阴道细胞粘附能力等优点,并且该卷曲乳杆菌的生长启动时间短,活化率高,生长活力强。
需要说明的是,“发酵上清液”是指发酵液经离心后的上层清液,其可能包含卷曲乳杆菌VB250、或卷曲乳杆菌VB250的代谢产物,或者同时包含卷曲乳杆菌VB250及其代谢产物。
微生物菌剂
在本发明的又一方面,本发明提出了一种微生物菌剂。根据本发明的实施例,所述的微生物菌剂含有前述的卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)VB250,和/或前述的发酵上清液。本发明的微生物菌剂用于预防和/或治疗阴道菌群紊乱引起的相关疾病。
需要说明的是,本发明的微生物菌剂可为微生物液体菌剂,包括但不限于发酵液等;也可为微生物固体菌剂,包括但不限于冻干粉等。
根据本发明的实施例,所述卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)VB250以活细胞和/或非活细胞的形式存在。
在本文中,“活细胞”是指是卷曲乳杆菌VB250具有新陈代谢、繁殖或复制能力。
示例性地,所述活细胞可为固定化的细胞。本文中,“固定化的细胞”是指卷曲乳杆菌VB250固定在载体上,可在一定的空间范围进行生长、发育、繁殖、遗传和新陈代谢等生命活动。
在本文中,“非活细胞”是指不具有新陈代谢、繁殖和复制能力的细胞,包括但不限于干菌体。示例性地,所述微生物菌剂为冻干粉。
作为一种具体的实施方式,所述卷曲乳杆菌VB250是以活细胞、干菌体、固定化的细胞或者以其他任何形式存在的。
作为一种具体的实施方式,所述干菌体是所述卷曲乳杆菌VB250经冷冻干燥处理获得的。
作为一种具体的实施方式,所述微生物菌剂进一步包括药学上可接受的辅料或载体。
在本文中,“药学上可接受的”是指物质或组合物必须与包含制剂的其它成分和/或用其治疗的哺乳动物化学上和/或毒理学上相容。优选地,本发明所述的“药学上可接受的”是指联邦监管机构或国家政府批准的或美国药典或其他一般认可药典上列举的在动物中、特别是人体中使用的。
在本文中,术语“药学上可接受的载体”包括任何溶剂,药物稳定剂,或其组合物,这些载体都是所属技术领域技术人员的已知的。除了任意常规载体与活性成分不相容的情况外,涵盖其在治疗或药物组合物中的用途。
在本文中,术语“药学上可接受的辅料”均可包括任何溶剂,适合于特有的目标剂型。除了任何常规的辅料与本公开的卷曲乳杆菌VB250不相容的范围,例如所产生的任何不良的生物效应或与药学上可接受的组合物的任何其他组分以有害的方式产生的相互作用,它们的用途也是本公开所考虑的范围。
用途
在本发明的又一方面,本发明提出了一种前述的卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)VB250、前述的发酵上清液或前述的微生物菌剂在制备产品中的用途,所述产品用于预防和/或治疗阴道菌群紊乱引起的相关疾病。
作为一种具体的实施方式,所述阴道菌群紊乱引起的相关疾病为阴道炎。
作为一种具体的实施方式,所述阴道炎包括但不限于细菌性阴道炎、霉菌性阴道炎、滴虫性阴道炎、好氧性阴道炎、老年性阴道炎和病毒感染引起的阴道炎。
作为一种具体的实施方式,所述产品为药品或卫生用品。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解,下面的实施例仅用于说明本发明,而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的,按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。
本发明的下述实施例中,卷曲乳杆菌ATCC55221购买于北京百欧博伟生物技术有限公司,其即为公开专利CN109234298A中的阴道卷曲乳杆菌。
实施例1: 菌株采集与鉴定
使用一次性无菌棉拭子采集68名通过健康体检的育龄妇女(中国杭州)阴道分沁物样品,涂布于MRS固体培养基,37℃厌氧培养48 h后,挑取疑似乳杆菌的单菌落,通过细菌16S rDNA扩增及测序,并将测序结果BLAST对比,根据对比结果分析菌种并分别用甘油管保藏,得到共计176株卷曲乳杆菌,编号为#1-#176。从北京百欧博伟生物技术有限公司购买一株卷曲乳杆菌ATCC55221作为对照株,与上述176株卷曲乳杆菌同时进行了生理生化鉴定、低pH环境生长活力、产乳酸能力、消化道稳定性、调节pH能力、对五种阴道致病菌的拮抗能力、HeLa细胞粘附能力、和抗生素敏感性试验后,筛选得到性能最好的一株卷曲乳杆菌#66,命名为VB250,已于2023年02月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏编号为CGMCC NO. 26574。
表1:不同卷曲乳杆菌的生理生化特性
注:+为阳性,-为阴性。
从表1可以看出,本实施例筛选获得的菌株VB250相比其它卷曲乳杆菌,可以分解利用牛奶,以及葡萄糖半固体、阿拉伯糖、棉子糖、D-核糖、松三糖、半乳糖、甘露糖、密二糖、松二糖等多种碳水化合物。
卷曲乳杆菌VB250的16S rDNA测序结果如SEQ ID NO:1所示。
CGGGCGGGGTGCCTATACATGCAGTCGAGCGAGCGGAACTAACAGATTTACTTCGGTAATGACGTTAGGAAAGCGAGCGGCGGATGGGTGAGTAACACGTGGGGAATCTGCCCCATAGTCTGGGATACCACTTGGAAACAGGTGCTAATACCGGATAAGAAAGCAGATCGCATGATCAGCTTTTAAAAGGCGGCGTAAGCTGTCGCTATGGGATGGCCCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTAAGGTAAAGGCTTACCAAGGCGATGATGCATAGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGCAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTGGTGAAGAAGGATAGAGGTAGTAACTGGCCTTTATTTGACGGTAATCAACCAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGAAGAATAAGTCTGATGTGAAAGCCCTCGGCTTAACCGAGGAACTGCATCGGAAACTGTTTTTCTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGGAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCTCTGGTCTGCAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTGGGAGGTTTCCGCCTCTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTAGTGCCATTTGTAGAGATACAAAGTTCCCTTCGGGGACGCTAAGACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTATTAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTAATGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGGCAGTACAACGAGAAGCGAGCCTGCGAAGGCAAGCGAATCTCTGAAAGCTGTTCTCAGTTCGGACTGCAGTCTGCAACTCGACTGCACGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTCTGCAATGCCCAAAGCCGGTGGCCTAACCTTCGGGAACGG (SEQ ID NO:1)。
实施例2:卷曲乳杆菌VB250在低pH环境下的生长活力实验
将不同卷曲乳杆菌活化后,分别以1%的接种量在pH=4.0的MRS肉汤培养基中37℃厌氧培养48 h,每隔4 h测量一次发酵液的OD600。图2为VB250与其它菌株在pH=4.0时OD600随时间的变化曲线,从图2中可以看出,培养4 h时,VB250的OD600相比初始值增加了44.8%,而菌株ATCC55221和#13仅分别增加15.5%和0%;培养8 h时,VB250的OD600相比初始值增加了137.5%,而菌株ATCC55221和#13仅分别增加56.0%和12.0%,且VB250在生长对数期的斜率更高,生长稳定期的OD600值更高,这都表明了菌株VB250在低pH环境中生长启动更快,活化率更高,生长活力更强。
实施例3:产乳酸能力
将实施例2中培养48 h后的不同卷曲乳杆菌发酵液,离心过滤,使用生物过程分析仪检测发酵滤液中的L-乳酸含量,使用D-乳酸检测试剂盒测定D-乳酸含量,结果列于表2。
研究发现阴道内的乳杆菌代谢产生的乳酸可以抑制阴道病原菌的生长,从表2可以看出,本发明获得的卷曲乳杆菌VB250相比其他卷曲乳杆菌,L-乳酸和D-乳酸产量更高,表明本发明的卷曲乳杆菌VB250更有利于维护人体阴道健康。
表2:不同卷曲乳杆菌48 h发酵液中的乳酸含量
实施例4:胃肠道稳定性
将实施例2中培养48 h后的不同卷曲乳杆菌发酵液,离心过滤得到菌体,置于人工胃液和肠液中,每隔2 h测量一次活菌数。
表3:不同卷曲乳杆菌在人工胃液(pH=2.5)和肠液(pH=6.8)中的稳定性
从表3中可以看出,本发明筛选获得的菌株VB250在人工胃液(pH=2.5)和人工肠液(pH=6.8)中4 h的存活率均大约90%,远高于其他卷曲乳杆菌,表明该菌株有较好的消化道耐受能力,这将更有利于其经口服通过肠道迁移至阴道,维护阴道健康。
实施例5:调节pH能力
研究发现,正常女性阴道环境中pH值在3.8-4.4之间,阴道菌群紊乱时通常伴随着阴道pH升高,这是由于以需氧菌为主的其他致病菌过多繁殖导致。
将不同卷曲乳杆菌(本发明实施例1获得的卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)VB250、#13、ATCC55221)活化后,分别以1%的接种量在pH=6.5的MRS肉汤培养基中37℃厌氧培养48 h,每隔4 h测量一次发酵液的pH,检测结果参见图3。
因此,从图3可以看出,本发明获得的卷曲乳杆菌VB250相比其它卷曲乳杆菌,能够更快的降低pH,并在pH为4时达到酸碱平衡,这表明该菌株能够创造并维持健康的阴道pH环境。
实施例6:对五种常见阴道致病菌的拮抗能力
采用双层板法测定不同卷曲乳杆菌对五种常见阴道致病菌的抑菌活性,具体方法如下:
将不同卷曲乳杆菌(本发明实施例1获得的卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)VB250、#13、ATCC55221)活化后,分别取2 μL点种在MRS固体平板中,37℃厌氧培养48 h,备用。
分别将活化后的指示菌(金黄色葡萄球菌ATCC 6538、大肠杆菌8099、白色念珠菌ATCC 10231、阴道加德纳氏菌ATCC 14018和产气荚膜梭菌ATCC 13124)菌液与灭菌后冷却至40℃-45℃的熔化琼脂培养基按一定比例混合,指示菌浓度为106 CFU/mL,倾注于上述培养48 h后的卷曲乳杆菌的平皿里,置于指示菌适宜的环境里培养16-18 h,观察记录抑菌圈的大小来对比不同卷曲乳杆菌的抑菌活性,检测结果参见表4。
由表4可知,卷曲乳杆菌VB250对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、阴道加德纳氏菌和产气荚膜梭菌的抑菌环直径均大于7 mm,具有抑菌作用。
表4:不同卷曲乳杆菌对5种致病菌的抑菌环试验结果
实施例7:抗生素敏感性试验
采用微量肉汤稀释法测定不同卷曲乳杆菌(本发明实施例1获得的卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)VB250、#13、ATCC55221)对卡那霉素、庆大霉素、氯霉素、克林霉素、万古霉素、阿莫西林、头孢克洛、氧氟沙星、制霉菌素、甲硝唑、诺氟沙星、青霉素钠、阿奇霉素、氟康唑和亚胺培南的敏感性,检测结果参见表5。
由表5的结果可知,本发明筛选获得的卷曲乳杆菌VB250对卡那霉素、氧氟沙星、制霉菌素、甲硝唑、诺氟沙星和氟康唑具有较高的耐药性,表明卷曲乳杆菌VB250可与临床用药联用来治疗细菌性阴道炎和霉菌性阴道炎。
表5:不同卷曲乳杆菌的抗生素耐药性
实施例8:粘附HeLa细胞试验
将不同卷曲乳杆菌(本发明实施例1获得的卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)VB250、#13、ATCC55221)活化后,分别接种在pH值为6.5的MRS肉汤培养基中,37℃厌氧过夜培养,离心PBS洗涤菌体2次,PBS重悬至108 CFU/mL,吸取100 μL菌悬液于含HeLa细胞的六孔细胞培养板(3×105个/孔),37℃静置孵育2 h,用无菌PBS洗涤2次以洗去游离的乳杆菌,向含Hela细胞六孔细胞培养板每孔加入25 μL胰酶溶液,置于37℃恒温箱消化细胞,待HeLa细胞消化变成球状后,每孔加入75 μL完全培养基,反复吹打均匀,完全消化后吸取20 μL悬液,用无菌PBS十倍梯度稀释,选择适当稀释梯度涂布进行活菌计数,结果参见图4。
如图4所示,本发明筛选获得的卷曲乳杆菌VB250相比其它卷曲乳杆菌,单位HeLa细胞粘附的细菌数更高,这表明该菌株更易在阴道中定植。
实施例9:对小鼠细菌性阴道炎的治疗作用
细菌性阴道炎小鼠感染模型:选取50只ICR小鼠,皮下注射给予苯甲酸雌二醇溶液0.1 mL(1 mg/mL,PBS配置,0.22 μm滤器过滤除菌),每2天1次,共3次,造成小鼠发情;6天后,将无菌石蜡油涂抹5号头皮针硅胶管,随后缓慢插入小鼠阴道约1.5 cm处,采用无菌PBS溶液灌洗小鼠阴道3次;使用剪钝的20 μL加样枪头向阴道内接种大肠杆菌(1×109 CFU/mL)+金黄葡萄球菌(1×109 CFU/mL)混合菌液20 μL;接种4天后,当小鼠阴道明显充血、红肿并伴有大量脓性分泌物时,取分泌物涂片采集阴道分泌物涂片,进行革兰染色镜检,考察细菌感染程度;空白对照组(10只小鼠)采用同样的操作方法,并将混合菌液换成无菌PBS,空白对照组的小鼠应无阴道明显充血、红肿并伴有大量脓性分泌物的症状,如出现以上症状,说明造模有污染。
给药:选取感染成功的小鼠,按照体重随机分组,每组8只,分为model组、治疗组1和治疗组2,健康小鼠作为Control组。阴道内给药,每日一次,每次给药20 μL,连续10天。model组、治疗组1、治疗组2和Control组的给予的药物或溶剂的信息裁剪表6。
检测:给药结束后4天,腹腔注射10%乌来糖水溶液,使用5号头皮针硅胶管,阴道内灌注200 μL无菌PBS,取100 μL灌洗液稀释不同比例,涂布在葡萄球菌选择性培养基BAT,计算细菌量,检测结果参见表5;摘眼球取血,置于抗凝管,充分混合后,1500 rpm,4℃,15 min离心,取血浆,试剂盒检测血浆IL-6水平,检测结果参见表8。
由表7和表8的结果可知,卷曲乳杆菌VB250菌悬液(发酵液离心,留下底部菌渣,PBS洗涤两次,PBS重悬制得菌悬液,1×108 CFU/mL)阴道连续给药10天能够显著减少感染小鼠阴道内的金黄色葡萄球菌的数量,并降低血浆中炎症因子IL-6水平,表明卷曲乳杆菌VB250具有治疗细菌性阴道炎的作用。
表6:不同分组信息
表7:阴道灌洗液中金黄色葡萄球菌含量
表8:血浆中IL-6水平
在本说明书的描述中,参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、 “示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中,对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且,描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外,在不相互矛盾的情况下,本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例,可以理解的是,上述实施例是示例性的,不能理解为对本发明的限制,本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (7)
1.一种卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)VB250,其特征在于,所述卷曲乳杆菌在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏编号为CGMCC No.26574,保藏日期为2023年2月20日。
2.一种微生物菌剂,其特征在于,包括:
权利要求1所述的卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)VB250。
3.根据权利要求2所述的微生物菌剂,其特征在于,所述卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)VB250以活细胞的形式存在。
4.根据权利要求2或3所述的微生物菌剂,其特征在于,所述微生物菌剂进一步包括药学上可接受的辅料或载体。
5.一种药物或卫生用品,其特征在于,包括:
权利要求1所述的卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)VB250或权利要求2~4任一项所述的微生物菌剂。
6.权利要求1所述的卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)VB250或权利要求2~4任一项所述的微生物菌剂在制备产品中的用途,所述产品用于预防和/或治疗阴道菌群紊乱引起的相关疾病,所述阴道菌群紊乱引起的相关疾病为细菌性阴道炎和/或霉菌性阴道炎。
7.根据权利要求6所述的用途,其特征在于,所述产品为药物或者卫生用品。
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