CN116948922B - 一种格氏乳杆菌vb247及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)VB247,于2023年02月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC No.26575。本发明的格氏乳杆菌VB247能够显著提高女性宫颈阴道上皮细胞中的AQP2 mRNA表达水平,其可用于预防和/或缓解和/或治疗由于围绝经期、卵巢早衰等原因导致的阴道润滑障碍;并且,本发明的格氏乳杆菌VB247在制备如药品、卫生用品等产品中具有巨大的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域,尤其是涉及一种能够显著提高女性宫颈阴道上皮细胞中的AQP2 mRNA表达水平的格氏乳杆菌VB247及其应用,更具体地,本发明涉及一种格氏乳杆菌VB247、发酵上清液、发酵液、微生物菌剂、药物或卫生用品及其它们的用途。
背景技术
女性性功能障碍(Female sexual dysfunction, FSD)会给女性的生殖健康带来诸多不良影响,如性交疼痛、受孕困难、焦虑抑郁情绪、影响伴侣性功能、家庭生活不和谐等。在我国FSD的发生率高达37.6%,全球发生率为25%-63%,其中阴道润滑障碍最为常见,发病率占总发病率的97.9%。目前,对于阴道润滑障碍的治疗,多是采用口服或阴道局部使用雌激素的方法,该方法可以有效缓解围绝经期、卵巢早衰等由于雌激素缺乏而引起的阴道润滑障碍。然而,摄入过多的雌激素,对身体会产生一定的副作用,如容易出现恶心、呕吐、头痛、以及月经量的改变,也有会发生乳腺癌的危险。
研究发现,水通道蛋白(aquaporin, AQP)是调节细胞内、细胞间及整个生物体内水分平衡的重要物质,在水通道蛋白家族中,水通道蛋白2(aquaporin2, AQP2)主要表达在阴道上皮细胞,健康女性在性兴奋时处于通道开放状态,而患有阴道润滑障碍的女性阴道上皮细胞的AQP2 mRNA表达量偏低。
因此,亟需开发一种在不影响阴道菌落环境的条件下,同时能够有效提高AQP2mRNA表达量的菌种。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此,本发明首次提供了一种格氏乳杆菌VB247,该格氏乳杆菌VB247来源于我国健康育龄女性阴道,具有耐低pH、高产乳酸、抵抗5种常见阴道致病菌、较强的阴道细胞粘附能力等优点,且能够显著提高女性宫颈阴道上皮细胞中的AQP2 mRNA表达水平,可用于预防和/或缓解和/或治疗由于围绝经期、卵巢早衰等原因导致的阴道润滑障碍。
基于此,本发明的第一个目的是提供了一种格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)VB247。根据本发明的实施例,所述格氏乳杆菌VB247保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC No.26575,保藏日期为2023年02月20日,保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。本发明的格氏乳杆菌VB247具有耐低pH、调节阴道pH环境、高产乳酸、抵抗5种常见阴道致病菌、较强的阴道细胞粘附能力等优点,且能够显著提高女性宫颈阴道上皮细胞中的AQP2mRNA表达水平。
本发明的第二个目的是提供一种发酵上清液,其包含:前述的格氏乳杆菌VB247;和/或前述的格氏乳杆菌VB247的代谢产物。
本发明的第三个目的是提供一种发酵液,所述发酵液包括前述的格氏乳杆菌VB247。
本发明的第四个目的是提供一种微生物菌剂,所述的微生物菌剂含有前述的格氏乳杆菌VB247,和/或前述的发酵上清液,和/或前述的发酵液。如前所述,格氏乳杆菌VB247具有耐低pH、调节阴道pH环境、高产乳酸、抵抗5种常见阴道致病菌、较强的阴道细胞粘附能力等优点,本发明的微生物菌剂也具有相同的优点,同时能够用于预防和/或缓解和/或治疗由于围绝经期、卵巢早衰等原因导致的阴道润滑障碍。
作为一种具体的实施方式,所述格氏乳杆菌VB247以活细胞和/或非活细胞的形式存在。
作为一种具体的实施方式,所述微生物菌剂中还可以含有药品和饲料中的至少之一可接受的菌株。
作为一种具体的实施方式,所述微生物菌剂进一步包括药学上可接受的辅料或载体。
本发明的第五个目的是提供一种卫生用品,其特征在于,包含前述的格氏乳杆菌VB247、前述的发酵上清液、前述的发酵液和前述的微生物菌剂中的至少一种。
本发明的第六个目的是提供一种前述的格氏乳杆菌VB247、前述的发酵上清液、前述的发酵液或前述的微生物菌剂在制备药物中的用途,所述药物具有下列至少一种用途:用于预防和/或缓解和/或治疗由于围绝经期、卵巢早衰等原因导致的阴道润滑障碍;用于预防和/或缓解和/或治疗阴道致病菌感染或阴道致病菌感染引起的相关疾病;用于提高阴道上皮细胞AQP2 mRNA的表达量;用于调节阴道pH环境。
作为一种具体的实施方式,所述致病菌选自金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌、阴道加德纳氏菌和产气荚膜梭菌中的至少之一。
本发明的第七个目的是提供一种药物,所述药物包括前述的格氏乳杆菌VB247、前述的发酵上清液、前述的发酵液和前述的微生物菌剂中的至少一种。
作为一种具体的实施方式,所述药物进一步含有赋形剂和/或载体。
作为一种具体的实施方式,所述赋形剂包括选自粘合剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、稳定剂、填充剂、稀释剂、缓释剂中的至少之一。
作为一种具体的实施方式,所述载体包括选自糖类、纤维素及其衍生物、磷酸钙类、硬脂酸碱土金属盐、植物油类、非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、负离子表面活性剂、脂肪醇类、谷物水解固形物中的至少之一。
作为一种具体的实施方式,所述药物的剂型包括选自口服液、散剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂、滴丸剂中的至少之一。
有益效果:
(1)本发明筛选获得的格氏乳杆菌VB247相比其它格氏乳杆菌分离株,生长启动更快,在生长对数期的斜率更高,生长稳定期的OD600更高,表明其在低pH环境(pH=4.0)下生长启动更快,活化率更高,生长活力更强。
(2)本发明筛选获得的格氏乳杆菌VB247相比其它格氏乳杆菌分离株,发酵上清液中乳酸(L-乳酸和D-乳酸)含量更高,表明该菌株高产乳酸。
(3)本发明的格氏乳杆菌VB247相比其它格氏乳杆菌分离株,能够更快地降低pH,这表明该菌株具有更强的调节pH能力,能够创造并维持健康的阴道pH环境。
(4)本发明的格氏乳杆菌VB247具有多种致病菌的抑制活性,能抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、阴道加德纳氏菌和产气荚膜梭菌等阴道致病菌的生长,因此,可单独或与其他益生菌组合,应用于多种妇科疾病的辅助治疗,比如阴道炎,阴道润滑障碍等。
(5)本发明的格氏乳杆菌VB247具有较强的阴道细胞粘附能力,其更易在阴道中定植。
(6)本发明的格氏乳杆菌VB247能够显著提高女性宫颈阴道上皮细胞中的AQP2mRNA表达水平,从而改善阴道干涩,可用于预防和/或缓解和/或治疗由于围绝经期、卵巢早衰等原因导致的阴道润滑障碍。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出,部分将从下面的描述中变得明显,或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解,其中:
图1为本发明实施例1中格氏乳杆菌VB247的扫描电镜照片;
图2为本发明实施例2中格氏乳杆菌VB247与格氏乳杆菌分离株#86在pH=4.0时OD600随时间的变化曲线;
图3为本发明实施例4中格氏乳杆菌VB247与格氏乳杆菌分离株#86的发酵液pH值随时间的变化曲线;
图4为本发明实施例6中格氏乳杆菌VB247与格氏乳杆菌分离株#86对HeLa细胞的粘附性;
图5为本发明实施例7中格氏乳杆菌VB247与格氏乳杆菌分离株#86对VK2/E6E7人阴道上皮细胞中AQP2 mRNA表达的影响。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的,仅用于解释本发明,而不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是,术语“第一”、“第二”仅用于描述目的,而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此,限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地,在本发明的描述中,除非另有说明,“多个”的含义是两个或两个以上。
在本文中,术语“含有”、“包含”或“包括”为开放式表达,即包括本发明所指明的内容,但并不排除其他方面的内容。
在本文中,术语“任选地”、“任选的”或“任选”通常是指随后所述的事件或状况可以但未必发生,并且该描述包括其中发生该事件或状况的情况,以及其中未发生该事件或状况的情况。
在本文中,“预防”和“防止”可互换使用。这些术语指获得有益的或期望的结果的方法,包括但不限于预防性益处。为了获得“预防性益处”,可将发酵粘液乳杆菌或含有其的产品给予有罹患特定疾病风险的受试者,或给予报告疾病的一种或多种生理症状的受试者,即使可能该疾病的诊断尚未作出。
在本文中,术语“治疗”和“缓解”均是指用于获得期望的药理学和/或生理学效果。所述效果就完全或部分预防疾病或其症状而言可以是预防性的,和/或就部分或完全治愈疾病和/或疾病导致的不良作用而言可以是治疗性的。本文使用的“治疗”涵盖哺乳动物、特别是人的疾病,包括:(a)在容易患病但是尚未确诊得病的个体中预防疾病或病症发生;(b)抑制疾病,例如阻滞疾病发展;或(c)缓解疾病,例如减轻与疾病相关的症状。本文使用的“治疗”涵盖将药物或化合物给予个体以治疗、治愈、缓解、改善、减轻或抑制个体的疾病的任何用药,包括但不限于将含本文所述化合物的药物给予有需要的个体。
本发明提出了一种格氏乳杆菌VB247、发酵上清液、发酵液、微生物菌剂、药物或卫生用品及其它们的用途,下面将分别对其进行详细描述。
菌种
在本发明的一个方面,本发明提出了一种格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)VB247。根据本发明的实施例,所述格氏乳杆菌VB247的保藏编号为CGMCC No.26575。本发明的格氏乳杆菌VB247具有耐低pH、调节阴道pH环境、高产乳酸、抵抗5种常见阴道致病菌、较强的阴道细胞粘附能力等优点,且能够显著提高女性宫颈阴道上皮细胞中的AQP2 mRNA表达水平。
在本文中,“格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)VB247”和“格氏乳杆菌VB247”同义。
发酵上清液
在本发明的另一方面,本发明提出了一种发酵上清液。根据本发明的实施例,所述发酵上清液包含:前述的格氏乳杆菌VB247;和/或前述的格氏乳杆菌VB247的代谢产物。
需要说明的是,“发酵上清液”是指发酵液经离心、过滤后的上层清液,其主要包含格氏乳杆菌VB247的代谢产物。
发酵液
在本发明的又一方面,本发明提出了一种发酵液。根据本发明的实施例,所述发酵液包括前述的格氏乳杆菌VB247。
需要说明的是,本发明所述的“发酵液”指的是将格氏乳杆菌VB247培养一段时间后得到的溶液。
微生物菌剂
在本发明的又一方面,本发明提出了一种微生物菌剂。根据本发明的实施例,所述的微生物菌剂含有前述的格氏乳杆菌VB247,和/或前述的发酵上清液,和/或前述的发酵液。本发明的微生物菌剂用于预防和/或治疗阴道菌群紊乱引起的相关疾病。
需要说明的是,本发明的微生物菌剂可为微生物液体菌剂,包括但不限于发酵液等;也可为微生物固体菌剂,包括但不限于冻干粉等。
根据本发明的实施例,所述格氏乳杆菌VB247以活细胞和/或非活细胞的形式存在。
在本文中,“活细胞”是指格氏乳杆菌VB247具有新陈代谢、繁殖或复制能力。
示例性地,所述活细胞可为固定化的细胞。本文中,“固定化的细胞”是指格氏乳杆菌VB247固定在载体上,可在一定的空间范围进行生长、发育、繁殖、遗传和新陈代谢等生命活动。
在本文中,“非活细胞”是指不具有新陈代谢、繁殖和复制能力的细胞,包括但不限于干菌体。示例性地,所述微生物菌剂为冻干粉。
作为一种具体的实施方式,所述格氏乳杆菌VB247是以活细胞、干菌体、固定化的细胞或者以其他任何形式存在的。
作为一种具体的实施方式,所述干菌体是所述格氏乳杆菌VB247经冷冻干燥处理获得的。
作为一种具体的实施方式,所述微生物菌剂中还可以含有药品和饲料中的至少之一可接受的菌株。
作为一种具体的实施方式,所述微生物菌剂进一步包括药学上可接受的辅料或载体。
在本文中,“药学上可接受的”是指物质或组合物必须与包含制剂的其它成分和/或用其治疗的哺乳动物化学上和/或毒理学上相容。优选地,本发明所述的“药学上可接受的”是指联邦监管机构或国家政府批准的或美国药典或其他一般认可药典上列举的在动物中、特别是人体中使用的。
在本文中,术语“药学上可接受的载体”包括任何溶剂,药物稳定剂,或其组合物,这些载体都是所属技术领域技术人员已知的。除了任意常规载体与活性成分不相容的情况外,涵盖其在治疗或药物组合物中的用途。
在本文中,术语“药学上可接受的辅料”均可包括任何溶剂,适合于特有的目标剂型。除了任何常规的辅料与本公开的格氏乳杆菌VB247不相容的范围,例如所产生的任何不良的生物效应或与药学上可接受的组合物的任何其他组分以有害的方式产生的相互作用,它们的用途也是本公开所考虑的范围。
用途
在本发明的又一方面,本发明提出了一种前述的格氏乳杆菌VB247、前述的发酵上清液、前述的发酵液或前述的微生物菌剂在制备药物中的用途,所述药物具有下列至少一种用途:用于预防和/或缓解和/或治疗阴道润滑障碍;用于预防和/或缓解和/或治疗阴道致病菌感染或阴道致病菌感染引起的相关疾病;用于提高阴道上皮细胞AQP2 mRNA的表达量;用于调节阴道pH环境。
作为一种具体的实施方式,所述阴道润滑障碍包括但不限于围绝经期和卵巢早衰等由于雌激素缺乏而引起的阴道润滑障碍。
作为一种具体的实施方式,所述致病菌选自金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌、阴道加德纳氏菌和产气荚膜梭菌中的至少之一。
卫生用品
在本发明的又一方面,本发明提出了一种卫生用品,所述卫生用品包括前述的格氏乳杆菌VB247、前述的发酵上清液、前述的发酵液和前述的微生物菌剂中的至少一种。
药物
在本发明的又一方面,本发明提出了一种药物,所述药物包括前述的格氏乳杆菌VB247、前述的发酵上清液、前述的发酵液和前述的微生物菌剂中的至少一种。
作为一种具体的实施方式,所述药物进一步含有赋形剂和/或载体。
作为一种具体的实施方式,所述赋形剂包括选自粘合剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、稳定剂、填充剂、稀释剂、缓释剂中的至少之一。
作为一种具体的实施方式,所述载体包括选自糖类、纤维素及其衍生物、磷酸钙类、硬脂酸碱土金属盐、植物油类、非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、负离子表面活性剂、脂肪醇类、谷物水解固形物中的至少之一。
作为一种具体的实施方式,所述药物的剂型包括选自口服液、散剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂、滴丸剂中的至少之一。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解,下面的实施例仅用于说明本发明,而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的,按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1: 菌株采集与鉴定
使用一次性无菌棉拭子采集68名通过健康体检的育龄妇女(中国杭州)阴道分沁物样品,涂布于MRS固体培养基,37℃厌氧培养48 h后,挑取疑似乳杆菌的单菌落,通过细菌16S rDNA扩增及测序,并将测序结果BLAST对比,根据对比结果分析菌种并分别用甘油管保藏,得到共计157株格氏乳杆菌,编号为#1-#157。对上述157株格氏乳杆菌进行了低pH环境生长活力、产乳酸能力、调节pH能力、对五种阴道致病菌的拮抗能力、HeLa细胞粘附能力、和抗生素敏感性试验后,筛选得到性能最好的一株格氏乳杆菌#18,命名为格氏乳杆菌VB247,已于2023年02月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏编号为CGMCC NO. 26575。格氏乳杆菌VB247扫描电镜图如图1所示,可以看出该菌具有较好的外貌形态,均为圆柱状。
格氏乳杆菌VB247的16S rDNA测序结果如SEQ ID NO:1所示。
CTGCTATCACTCTTGGATGGACCTGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTAAGGTAACGGCTTACCAAGGCAATGATGCATAGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGCAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAGCTCTGTTGGTAGTGAAGAAAGATAGAGGTAGTAACTGGCCTTTATTTGACGGTAATTACTTAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGTGCAGGCGGTTCAATAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTCAACCGGAGAATTGCATCAGAAACTGTTGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGGAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCTCTGGTCTGCAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTGGGAGGTTTCCGCCTCTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCAGTGCAAACCTAAGAGATTAGGTGTTCCCTTCGGGGACGCTGAGACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCATTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGCACTCTAATGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAACGAGAAGCGAACCTGCGAAGGCAAGCGGATCTCTGAAAGCCGTTCTCAGTTCGGACTGTAGGCTGCAACTCGCCTACACGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTCTGTAACACCCAAAGCCGGTGGGATAACCTTTATAGGAGTCAGCCGTCTAAGCTGTCTCG(SEQ ID NO:1)。
格氏乳杆菌分离株#86的16S rDNA测序结果如SEQ ID NO:2所示。
ATTAGCTAGTTGGTAAGGTAACGGCTTACCGAGGCAATGATGCATAGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGCAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAGCTCTGTTGGTAGTGAAGAAAGATAGAGGTAGTAACTGGCCTTTATTTGACGGTAATTACTTAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGTGCAGGCGGTTCAATAAGTCTGATGTGAAAGCCTTTGGCTCAACCGGAGAATTGCATCAGAAACTGTTGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGGAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCTCTGGTCTGCAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTGGGAGGTTTCCGCCTCTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCAGTGCAAACCTAAGAGATTAGGTGTTCCCTTCGGGGACGCTGAGACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCATTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGCACTCTAATGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAACGAGAAGCGAACCTGCGAAGGCAAGCGGATCTCTGAAAGCCGTTCTCAGTTCGGACTGTAGGCTGCAACTCGCCTACACGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTCTGTAACACCCAAAGCCGGTGGGATAACCTTTATAGGAGTCAGCCGTCTATGTGATAG(SEQ ID NO:2)。
对格氏乳杆菌VB247以及格氏乳杆菌分离株#86进行生理生化特征分析,具体实验参照伯杰氏细菌鉴定手册进行,检测结果如表1所示,本实施例筛选获得的菌株VB247相比格氏乳杆菌分离株#86,可以利用牛奶,以及L-鼠李糖、甘露醇和山梨醇等多种碳水化合物。
表1:不同格氏乳杆菌的生理生化特性
注:+为阳性,-为阴性。
实施例2:低pH环境下的生长活力实验
将不同格氏乳杆菌(本发明实施例1获得的格氏乳杆菌VB247和格氏乳杆菌分离株#86)活化后,分别以1%的接种量接种在pH=4.0的MRS肉汤培养基中37℃厌氧培养48 h,每隔4 h测量一次发酵液的OD600。图2为格氏乳杆菌VB247与格氏乳杆菌分离株#86在pH=4.0时OD600随时间的变化曲线,从图2中可以看出,培养4 h时,格氏乳杆菌VB247的OD600相比初始值增加了20.9%,而格氏乳杆菌分离株#86仅增加1.2%;培养8 h时,格氏乳杆菌VB247的OD600相比初始值增加了101.2%,而格氏乳杆菌分离株#86仅增加18.5%,且格氏乳杆菌VB247在生长对数期的斜率更高,生长稳定期的OD600值更高,这都表明了格氏乳杆菌VB247在低pH环境中生长启动更快,活化率更高,生长活力更强。
实施例3:产乳酸能力
将实施例2中培养48 h后的不同格氏乳杆菌(本发明实施例1获得的格氏乳杆菌VB247和格氏乳杆菌分离株#86)的发酵液,离心过滤得到发酵上清液,使用生物过程分析仪检测发酵上清液中的L-乳酸含量,使用D-乳酸检测试剂盒测定D-乳酸含量,结果列于表2。
研究发现阴道内的乳杆菌代谢产生的乳酸可以抑制阴道病原菌的生长,维护阴道健康,从表2可以看出,本发明获得的格氏乳杆菌VB247相比格氏乳杆菌分离株#86,其产生L-乳酸和D-乳酸的量是分离株#86的近两倍,格氏乳杆菌VB247能够产生更多的L-乳酸和D-乳酸,表明本发明的格氏乳杆菌VB247更有利于维护人体阴道健康。
表2:不同格氏乳杆菌48 h发酵液中的乳酸含量
实施例4:调节pH能力
研究发现,正常女性阴道环境中pH值在3.8-4.4之间,阴道菌群紊乱时通常伴随着阴道pH升高,这是由于以需氧菌为主的其他致病菌过多繁殖导致。
将不同格氏乳杆菌(本发明实施例1获得的格氏乳杆菌VB247和格氏乳杆菌分离株#86)活化后,分别以1%的接种量接种在pH=6.5的MRS肉汤培养基中37℃厌氧培养48 h,每隔4 h测量一次发酵液的pH,检测结果参见图3。
从图3可以看出,本发明获得的格氏乳杆菌VB247相比格氏乳杆菌分离株#86,能够更快地降低pH,并在pH为4时达到酸碱平衡,这表明该菌株能够创造并维持健康的阴道pH环境。
实施例5:对五种常见阴道致病菌的拮抗能力
采用双层板法测定不同格氏乳杆菌(本发明实施例1获得的格氏乳杆菌VB247和格氏乳杆菌分离株#86)对五种常见阴道致病菌的抑菌活性,具体方法如下:
将不同格氏乳杆菌(本发明实施例1获得的格氏乳杆菌VB247和格氏乳杆菌分离株#86)活化后,分别取2 μL点种在MRS固体平板中,37℃厌氧培养48 h,备用。
分别将活化后的指示菌(金黄色葡萄球菌ATCC 6538、大肠杆菌ATCC 8099、白色念珠菌ATCC 10231、阴道加德纳氏菌ATCC 14018和产气荚膜梭菌ATCC 13124)菌液与灭菌后冷却至40℃-45℃的熔化琼脂培养基按一定比例混合,指示菌浓度为106CFU/mL,倾注于上述培养48 h后的格氏乳杆菌的平皿里,置于指示菌适宜的环境里培养16-18 h,观察记录抑菌圈的大小来对比不同格氏乳杆菌的抑菌活性,检测结果参见表3。
由表3可知,格氏乳杆菌VB247对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、阴道加德纳氏菌和产气荚膜梭菌的抑菌环直径均大于7 mm,具有抑菌作用,且相比于格氏乳杆菌分离株#86,格氏乳杆菌VB247对五种菌均具有更强的抑菌效果。
表3:不同格氏乳杆菌对5种致病菌的抑菌环试验结果
实施例6:粘附HeLa细胞试验
将不同格氏乳杆菌(本发明实施例1获得的格氏乳杆菌VB247和格氏乳杆菌分离株#86)活化后,分别接种在pH值为6.5的MRS肉汤培养基中,37℃厌氧过夜培养,离心PBS洗涤菌体2次,PBS重悬至108CFU/mL,得到含有不同格氏乳杆菌的菌悬液,吸取100 μL含不同格氏乳杆菌的菌悬液于含HeLa细胞的六孔细胞培养板(3×105个/孔),37℃静置孵育2 h,用无菌PBS洗涤2次以洗去游离的乳杆菌,向含Hela细胞六孔细胞培养板每孔加入25 μL胰酶溶液,置于37℃恒温箱消化细胞,待HeLa细胞消化变成球状后,每孔加入75 μLDMEM培养基(含10%胎牛血清),反复吹打均匀,完全消化后吸取20 μL悬液,用无菌PBS十倍梯度稀释,选择适当稀释梯度涂布进行活菌计数,结果参见图4。
如图4所示,本发明筛选获得的格氏乳杆菌VB247相比格氏乳杆菌分离株#86,单位HeLa细胞粘附的细菌数更高,这表明该菌株更易在阴道中定植。
实施例7:对AQP2 mRNA在阴道上皮细胞中表达的影响
VK2/E6E7人阴道上皮细胞购买于上海雅吉生物科技有限公司,按产品说明书进行复苏、传代,种于3个6孔板内。然后在6孔板内分为三个组,每个组3个平行,其中两个孔中加入实施例2中培养48 h后的格氏乳杆菌VB247的发酵上清液100μL,培养24h和48h,收集细胞;两个孔中加入实施例2中培养48 h后的格氏乳杆菌分离株#86的发酵上清液100μL,培养24h和48h,收集细胞;两个孔中加入100μL孕酮至终浓度为10nmol/L,培养24h和48h,收集细胞作为阳性对照。其中,孕酮是一种雌激素,可以缓解绝经期阴道润滑障碍,有文献报道孕酮可以促进AQP2 mRNA的表达(张晶等.阴道微环境相关因素对水通道蛋白2mRNA在阴道上皮细胞中表达的影响[J].中国性科学, 2021, 30(4):4.)。采用Real Time PCR技术,观察AQP2 mRNA在阴道上皮细胞中表达,结果参见图5。
如图5所示,本发明筛选获得的格氏乳杆菌VB247相比格氏乳杆菌分离株#86,能够显著提高女性宫颈阴道上皮细胞中的AQP2 mRNA表达水平。
在本说明书的描述中,参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、 “示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中,对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且,描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外,在不相互矛盾的情况下,本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例,可以理解的是,上述实施例是示例性的,不能理解为对本发明的限制,本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (10)
1.一种格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)VB247,其特征在于,所述格氏乳杆菌VB247在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.26575,保藏日期为2023年02月20日。
2.一种发酵液,其特征在于,包括权利要求1所述的格氏乳杆菌VB247。
3.一种微生物菌剂,其特征在于,包含权利要求1所述的格氏乳杆菌VB247和权利要求2所述的发酵液中的至少之一。
4.根据权利要求3所述的微生物菌剂,其特征在于,所述格氏乳杆菌VB247以活细胞的形式存在。
5.根据权利要求3所述的微生物菌剂,其特征在于,进一步包括药学上可接受的辅料或载体。
6.权利要求1所述的格氏乳杆菌VB247、权利要求2所述的发酵液或权利要求3~5任一项所述的微生物菌剂在制备药物中的用途,所述药物具有下列至少一种用途:
预防和/或缓解和/或治疗阴道致病菌感染;
调节阴道pH环境;
所述致病菌选自金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌、阴道加德纳氏菌和产气荚膜梭菌中的至少之一。
7.一种药物,其特征在于,所述药物包括权利要求1所述的格氏乳杆菌VB247、权利要求2所述的发酵液和权利要求3~5任一项所述的微生物菌剂中的至少一种。
8.根据权利要求7所述的药物,其特征在于,所述药物进一步含有赋形剂和/或载体。
9.根据权利要求8所述的药物,其特征在于,所述赋形剂包括选自粘合剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、稳定剂、填充剂、稀释剂、缓释剂中的至少之一。
10.根据权利要求8所述的药物,其特征在于,所述载体包括选自糖类、纤维素及其衍生物、磷酸钙类、硬脂酸碱土金属盐、植物油类、非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、负离子表面活性剂、脂肪醇类、谷物水解固形物中的至少之一。
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