CN110982726A

CN110982726A - 一种卷曲乳杆菌及其应用

Info

Publication number: CN110982726A
Application number: CN201910732778.4A
Authority: CN
Inventors: 承磊; 刘瑶; 王琼; 曾婉秋
Original assignee: Sichuan Anaerobic Biotechnology Co ltd
Current assignee: Sichuan Anaerobic Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-08-09
Filing date: 2019-08-09
Publication date: 2020-04-10
Anticipated expiration: 2039-08-09
Also published as: WO2021027742A1; CN110982726B

Abstract

本发明公开了一种卷曲乳杆菌Lcris‑2，利用且属于我国女性阴道的优势菌株、利用该优势菌株能够应用在阴道微生态制剂中的应用技术，有利于提高细菌性阴道炎治愈率和降低细菌性阴道炎复发率。该菌株已于2019年6月保藏于中国典型培养物保藏中心，该菌株保藏号为：CCTCC No.M2019427。

Description

一种卷曲乳杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体涉及卷曲乳杆菌及其应用。

背景技术

从期刊实用妇科杂志公开的文献《阴道微生态的研究进展及临床意义》、期刊中国微生态学杂志公开的文献《乳杆菌在阴道微生态中生存状态的研究进展》等各方研究报告，可知人体阴道内有300多种微生物共生，它们彼此制约、相互制衡，形成动态平衡，多种阴道炎的发生和阴道微生态环境失衡有关。

健康的育龄女性阴道是一个以乳杆菌为优势菌群的微环境，它们可以产乳酸、H₂O₂、细菌素，并竞争性黏附于阴道上皮、占据结合位、消耗阴道内营养等方式获得其在阴道内的优势地位，抑制其他菌的过度增殖。近十多年的研究发现，人类阴道内乳杆菌多样性非常丰富，从阴道微环境分离出的乳杆菌已超过20种，不同地域和人群中的乳杆菌类型不同。在北美地区，女性阴道生态菌群可分为5种类型，有4种分别以卷曲乳杆菌（Lactobacillus crispatus）、惰性乳杆菌（Lactobacillus iners）、詹氏乳杆菌（Lactobacillus jensenii）和格氏乳杆菌（Lactobacillus gasseri）为优势菌，第5种是其他乳酸菌和厌氧菌；在欧洲地区，女性阴道生态菌群主要以卷曲乳杆菌、格氏乳杆菌、詹氏乳杆菌、约氏乳杆菌等为优势菌群；在中国，健康女性阴道最常见的优势乳杆菌有卷曲乳杆菌、格氏乳杆菌、詹氏乳杆菌、约氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌、惰性乳杆菌等。由此可知，虽然人类阴道内乳杆菌多样性非常丰富，卷曲乳杆菌是最常见的阴道优势乳杆菌之一。

当环境因素或者外界干预打破了阴道微生态平衡，会使阴道微生态环境进入一个脆弱的状态，不容易抵御致病菌的繁殖、侵犯，出现各种阴道炎症。细菌性阴道炎（bacterial vaginosis，以下简称“BV”），是一种常见的妇科疾病，感染率在15%-52%，是以阴道加德纳菌和其他厌氧菌为主过度繁殖取代乳杆菌，造成阴道内菌群失调而出现的临床症候群的一种阴道感染性疾病，据资料报道，BV是导致组织性绒毛膜炎、羊水感染、剖腹产后子宫内膜炎及其他妊娠不良和妊娠并发症的危险因素。

针对BV，临床治疗方法是采用甲硝唑或克林霉素，甲硝唑是一种前体药，在无氧环境中，细菌胞内酶促还原将甲硝唑的硝基还原成氨基，从而将抗生素转化为活性形式，然后通过与DNA共价结合破坏其螺旋结构并导致单链和双链断裂，进而使DNA降解和病原体死亡；克林霉素能够与细菌核糖体上的50S核糖体亚基结合，阻止肽链的延长，从而抑制细菌细胞的蛋白质合成，导致细菌死亡。采用抗生素治疗虽然见效快，但也存在很大缺陷，有以下两方面：（1）对阴道微环境中所有抗生素敏感微生物均有抑制作用，因此，治疗后阴道微生态没有恢复到一个健康的、能抵御致病菌侵袭的平衡状态，被抑制或杀灭的病原微生物或者外来的病原微生物还会再度繁殖甚至致病而出现复发或新的阴道炎症；（2）微生物产生耐药性、且抗生素无法使得阴道微生态环境平衡，导致了难治性BV。因而，抗生素治疗虽然见效快，但复发率高，3月内复发率高达30%。

阴道微生态失衡的治疗包括杀菌、黏膜修复、恢复阴道微生态平衡三步。杀菌是治疗阴道炎症的第一步，抑制或灭杀病原微生物，包括过度增殖的需氧菌和厌氧菌、芽生孢子或者菌丝、滴虫等。病原微生物被抑制或灭杀后，阴道黏膜的免疫修复和优势乳杆菌的恢复才是治疗阴道炎症的最终目标。在这期间，如果阴道黏膜的修复、乳杆菌的恢复过程被影响、阴道内理化环境未恢复至正常，被抑制的病原微生物或者外来的病原微生物还会再度繁殖甚至致病而出现复发或新的阴道炎症。而益生菌在阴道内可以迅速占据阴道上皮的受体，产生对阴道的保护作用，从而促使阴道恢复至正常微环境，减少阴道炎症的复发。因此，采用益生菌微生态制剂治疗BV是以现在的技术手段看来，最为优选的一种方式。

目前国内上市的阴道微生态制剂仅有2种，一种是西安正浩生物制药有限公司生产的商品名为“延华”的市售药品，包含一种肠链球菌（Streptococcus faecalis），该菌种不是阴道优势菌种，而且这个物种下的细菌具有条件致病性；另一种是内蒙古双奇药业股份有限公司生产的商品名为“万泽双奇”的市售药品，包含1种乳杆菌——德氏乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii），该菌种不属于我国妇女阴道优势菌种。

因此，寻找益生能力强的我国妇女阴道优势菌株，有利于对细菌性阴道病进行治疗。卷曲乳杆菌是我国女性阴道优势菌株之一，现有很多对从健康女性体内分离筛选的卷曲乳杆菌的研究，比如中国专利文件201811488762.5公开了一种卷曲乳杆菌制剂及其应用，比如中国专利文件201310002837.5公开了一种卷曲乳杆菌菌株及其应用，比如中国专利文件201710935239.1公开了一种卷曲乳杆菌及其应用。乳酸是乳杆菌抑制病原菌生长的主要抑菌物质之一，现有技术这些从健康女性阴道筛选出的卷曲乳杆菌产乳酸能力不够高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种卷曲乳杆菌Lcris-2(Lactobacillus crispatusLcris-2)，利用且属于我国女性阴道的优势菌株、利用该优势菌株能够应用在阴道微生态制剂中的应用技术。卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)Lcris-2于2019年6月4日保藏于中国典型培养物保藏中心，该菌株保藏中心保藏编号为：CCTCC No：M2019427，地址：湖北省武汉市武汉大学，邮编：430072，电话：027-68754052。

本发明人从我国健康女性阴道得到一株乳杆菌，证明该株乳杆菌具有优势的产乳酸能力和细胞黏附力，能抑制多种病原菌生长，并产过氧化氢。该菌株构成本发明的第一方面。

由于该菌株为我国妇女阴道优势菌株，能够用于应用在妇女卫生保健品或治疗阴道炎药品中，这构成了本发明的第二方面。妇女卫生保健品是指外用保健品。

本发明的第三方面在于提供以卷曲乳杆菌Lcris-2为活性成分的菌剂，菌剂可为菌悬浮液或冻干菌粉。

卷曲乳杆菌Lcris-2还能够应用在在制备外生殖器卫生用品中，比如卫生巾、卫生棉条或用于外生殖器的卫生护理液。

卷曲乳杆菌Lcris-2还能够应用在制备调节阴道菌群平衡的药品或卫生保健品中。

卷曲乳杆菌Lcris-2还能够应用在制备具有阴道上皮细胞粘附功能的药品或卫生保健品中。

卷曲乳杆菌Lcris-2还能够应用在制备具有预防、治疗阴道致病菌中的药品或卫生保健品中的用途。致病菌包括但不限于加德纳菌金黄色葡萄球菌、绿农假单胞菌、大肠杆菌能力、乙型副伤寒沙门氏菌能力和痢疾志贺菌中的任意一种或多种。

卷曲乳杆菌Lcris-2还能够应用在剖腹产婴儿外用护理品中的应用。由于剖腹产的婴儿未经过女性阴道，因此，在其生产过程中没有获得外源的益生菌，因此，可以将妇女阴道中筛选得到的益生菌做成外用护理品给婴儿身体涂抹或洗澡。

卷曲乳杆菌Lcris-216SrRNA基因序列如序列表所示。

将卷曲乳杆菌Lcris-2的全基因组序列上传到EzBiocloud后，与其能链接到所有的同种的全基因组序列比较，得到的同源性比值（ANI）如下表1所示，证明其为新的乳杆菌株。

表1：Lcris-2与不同卷曲乳杆菌全基因组ANI比较

序列文件名	对比文件种属	对比文件名	ANI（%）
				Lcris-2.genomic.fasta	卷曲乳杆菌（<i>Lactobacillus crispatus</i>）	GCA_002861765.1_ASM286176v1_genomic.fna.gz	99.3638
Lcris-2.genomic.fasta	卷曲乳杆菌（<i>Lactobacillus crispatus</i>）	GCA_001546015.1_ASM154601v1_genomic.fna.gz	99.2264
				Lcris-2.genomic.fasta	卷曲乳杆菌（<i>Lactobacillus crispatus</i>）	GCA_000176975.2_ASM17697v2_genomic.fna.gz	99.2008
Lcris-2.genomic.fasta	卷曲乳杆菌（<i>Lactobacillus crispatus</i>）	GCA_001546025.1_ASM154602v1_genomic.fna.gz	99.1693
				Lcris-2.genomic.fasta	卷曲乳杆菌（<i>Lactobacillus crispatus</i>）	GCA_001541585.1_ASM154158v1_genomic.fna.gz	99.0587
Lcris-2.genomic.fasta	卷曲乳杆菌（<i>Lactobacillus crispatus</i>）	GCA_001541515.1_ASM154151v1_genomic.fna.gz	99.0447
				Lcris-2.genomic.fasta	卷曲乳杆菌（<i>Lactobacillus crispatus</i>）	GCA_000301135.1_Lact_cris_FB077-07_V1_genomic.fna.gz	99.0328
Lcris-2.genomic.fasta	卷曲乳杆菌（<i>Lactobacillus crispatus</i>）	GCA_002861775.1_ASM286177v1_genomic.fna.gz	99.0016
				Lcris-2.genomic.fasta	卷曲乳杆菌（<i>Lactobacillus crispatus</i>）	GCA_000466885.2_ASM46688v2_genomic.fna.gz	98.9705
Lcris-2.genomic.fasta	卷曲乳杆菌（<i>Lactobacillus crispatus</i>）	GCA_000301115.1_Lact_cris_FB049-03_V1_genomic.fna.gz	98.9698

本发明的有益效果为：

所筛选的卷曲乳杆菌具有遗传稳定性，对金黄色葡萄球菌、绿农假单胞菌、大肠杆菌、乙型副伤寒沙门氏菌和痢疾志贺菌表现出优秀的抑菌能力，具有良好的产乳酸能力及粘附Hela细胞能力。

附图说明

图1为卷曲乳杆菌Lcris-2菌落形态正面照片。

图2为卷曲乳杆菌Lcris-2革兰氏染色观察图片。

图3为卷曲乳杆菌Lcris-2扫描电镜观察图片。

具体实施方式

以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述，本发明的实施方式包括但不限于下列实施例。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试剂耗材，如无特殊说明，均为常规生化试剂。

以下实施例中所用到的细菌培养基成分及配制方法如下：

MRS肉汤制备：称量MRS成品培养基粉末52.0 g，溶解至1 L蒸馏水中；加热煮沸，凉至室温加入0.55 g半胱氨酸盐酸盐，搅拌溶解后调节pH值至6.5；装上定量分液器并通N₂，加热至沸腾，在微沸状态下煮20 min，冷却后分装至10 mL厌氧管中，118 ℃高温湿热灭菌20min，荫凉、避光存放、备用。

MRS固体培养基制备：称量MRS成品培养基粉末52.0 g，琼脂粉15.0 g，溶解至1 L蒸馏水中，加热煮沸，沸腾后加入0.55 g半胱氨酸盐酸盐，调节pH值至6.5，118 ℃高温湿热灭菌20 min，荫凉、避光存放、备用。

过氧化氢半定量培养基制备：称量MRS成品培养基粉末52.0 g，琼脂粉15.0 g，溶解至1 L蒸馏水中，调节pH值至6.5，118 ℃高温湿热灭菌20 min，灭菌结束后放入50 ℃水浴锅保温30分钟，加入TMB(使TMB终浓度为0.25 mg/mL)和HRP(使HRP终浓度为0.01 mg/mL)混匀；冷却凝固后，标记培养基名称及配制日期，放于4℃冰箱待用。

无氧PBS的配制：称量磷酸二氢钾0.27 g，磷酸氢二钠1.42 g，氯化钠8 g，氯化钾0.2 g，溶解至1 L的蒸馏水中，加热煮沸，凉至室温加入0.55 g半胱氨酸盐酸盐，搅拌溶解后调节pH值至6.5，装上定量分液器并通 N₂，加热至沸腾，在微沸状态下煮30 min，冷却后分装至10 mL厌氧管中，121 ℃高温湿热灭菌30 min，荫凉、避光存放、备用。

无氧BHI液体培养基配制：称量BHI成品培养基粉末37.0 g，溶解至1 L蒸馏水中，加热煮沸，凉至室温加入0.55 g半胱氨酸盐酸盐，搅拌溶解后调节pH值至6.5，装上定量分液器并通 N₂，加热至沸腾，在微沸状态下煮20 min，冷却和分装过程中通入N₂和CO₂（1:1比例），分装至10 mL厌氧管中，118 ℃高温湿热灭菌20 min，荫凉、避光存放、备用。

无氧BHI半固体培养基配制：称量BHI成品培养基粉末37.0 g，溶解至1 L蒸馏水中；加热煮沸，凉至室温加入6 g琼脂粉，0.55 g半胱氨酸盐酸盐，搅拌溶解后调节pH值至6.5，装上定量分液器并通 N₂，加热至沸腾，在微沸状态下煮20 min，稍稍冷却，冷却和分装过程中通入N₂和CO₂（1:1比例），及时分装至10 mL厌氧管中，118 ℃高温湿热灭菌20 min，荫凉、避光存放。

营养肉汤液体培养基配制：称量蛋白胨10 g，牛肉粉3 g，氯化钠5 g溶解至1 L蒸馏水中，调节pH至7.2，加热煮沸，凉至室温后分装，每支10 mL；121 ℃高温湿热灭菌15min，荫凉、避光存放、备用。

营养肉汤固体培养基配制：称量蛋白胨10 g，牛肉粉3 g，氯化钠5 g，琼脂粉6 g溶解至1 L蒸馏水中，调节pH至7.2，稍稍冷却，及时分装至10 mL厌氧管中；121 ℃高温湿热灭菌15 min，荫凉、避光存放、备用。

实施例1

本发明所述的卷曲乳杆菌的分离方法包括以下步骤：

用阴道棉拭子采集20-40岁通过健康体检的中国女性的阴道分泌物样品；取2 mL无菌无氧的PBS缓冲液于装有上述棉拭子的厌氧管中，充分震荡混匀，并以其为原液连续十倍梯度稀释；取100 μL稀释10000倍的液体涂布于MRS固体培养基，置于厌氧培养箱中37 ℃培养，培养48 h后，挑取疑似乳杆菌单菌落在MRS肉汤培养基中培养24 h，并将培养后得到菌液的一部分转接继续培养，菌液的另一部分进行细菌DNA提取；通过细菌16S rRNA扩增及测序，并将测序结果BLAST对比，根据对比结果分析菌种并分别保藏，得到共计1336株乳杆菌。通过对上述保藏的1336株乳杆菌进行低pH培养环境活力试验、16S rRNA基因型筛选、抑制阴道加德纳菌试验、产乳酸试验、产过氧化氢试验、粘附Hela细胞试验筛选后，得到性能最好的一株卷曲乳杆菌，命名为Lcris-2。

本发明所述的卷曲乳杆菌的筛选方法包括以下步骤：

1.低pH培养环境中活力试验

1.1 活化：保藏乳杆菌在pH值6.5 的MRS肉汤活化，37 ℃过夜培养；

1.2转接：将活化菌液转接至pH值4-5的MRS肉汤培养中，每2-3 h测量一次OD₆₀₀值；

1.3比较OD₆₀₀值，筛选能够快速增殖或OD₆₀₀值较高的来自不同样品的菌株。

2.16S rRNA基因型筛选

分离自同一样品的相同种属的乳杆菌，若16S rRNA序列不同，表明其基因型不同，则其生理特性也可能有差异，因此对经过低pH培养活力比对筛选出的乳杆菌进行16S rRNA基因型筛选。

3.抑制阴道加德纳菌试验

乳杆菌经活化后，取0.1 mL菌液与MRS固体培养基混匀，倾注入6 cm平皿内，完全凝固后37 ℃培养48 h，取出平皿，用内径6 mm的打孔器在琼脂培养基上打孔，获得菌饼；阴道加德纳菌经活化转接后，用无氧无菌PBS缓冲液以10倍梯度，将加德纳菌菌液稀释至100倍，分别取10^-1和10^-2稀释液0.5 mL与5.25 mL 含5%马血清的BHI固体培养基混匀，倾注入9 cm平皿内,完全凝固后，将乳酸菌菌饼轻放在BHI琼脂表面，每皿对称放4个菌饼，每株菌2个平行，平皿正置放入放有厌氧产气袋的厌氧密封罐中，37 ℃培养48 h，用游标卡尺测量抑菌圈大小。

4.产乳酸试验

乳杆菌经活化后，转接至MRS肉汤培养基中，2个平行，37 ℃条件下培养48 h，用pH0.5-5.0试纸测定并记录培养48 h的乳杆菌菌液pH值，按以下两个条件选择菌株进行液相色谱：条件一，pH值为2.5的菌株进行液相色谱；条件二，同种属的乳杆菌，挑取pH值较低的菌株进行液相色谱；确定液相色谱样品后，将上清液稀释5倍，加入浓硫酸进行前处理，上样前用 0.22um 针头滤器过滤。液相色谱相关参数如下：

仪器型号：Agilent，分析型液相色谱1200

色谱柱型号：伯乐，Aminex HPX-87H

流动相：0.005 M H₂SO₄，速度0.6 mL/min

检测器及检测波长：DAD,207 nm；RID,示差折光信号

进样量：20 μL。

5.产过氧化氢能力

乳杆菌经活化后，用移液器吸取2 μL菌液点种于含0.25 mg/mL的3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液及0.01 mg/mL的辣根过氧化物酶的MRS琼脂中，在24 h、48 h和72 h观察时间点设置2个平行并将相同观察时间点的平皿置于相同的放有厌氧产气袋的厌氧密封罐中，37 ℃培养，培养满相应时间后，取出相应平皿，暴露于空气中，30 min后观察显色反应并拍照记录：以德氏乳杆菌为阳性对照，比德氏乳杆菌产生的蓝色深计为4分，与德氏乳杆菌产生的蓝色相当计为3分，比德氏乳杆菌产生的蓝色浅计为2分，显蓝色非常弱计为1分（轻微显色反应），不变色的计0分。

6.粘附Hela细胞试验

乳杆菌经活化后，离心洗涤菌体2次，PBS重悬，吸取100 μL乳杆菌悬浮液于含Hela细胞的96孔细胞培养板，37 ℃静置孵育30 min，30 min后用无菌PBS洗涤2次以未洗去粘附乳杆菌，向含Hela细胞96孔细胞培养板每孔加入25 μL胰酶溶液，置于37 ℃恒温箱消化细胞，待Hela细胞消化变成球状后，每孔加入75 μL完全培养基，反复吹打均匀，完全消化后吸取20微升菌悬液，用无菌PBS 10倍梯度稀释，选择适当稀释梯度进行倾注法计数实验，37 ℃培养48 h后计数。

经常上述筛选，得到的本发明的卷曲乳杆菌Lcris-2的益生性能下表2所示。

表2 卷曲乳杆菌Lcris-2的益生性能

	乳酸含量（mg/L）	产过氧化氢得分	单细胞粘附数
				卷曲乳杆菌Lcris-2	16098.44	1	13.2
标准菌株	12964.12	3	7.7

实施例2

卷曲乳杆菌Lcris-2的生化鉴定结果如下：

通过甲基红试验（MR试验）、乙酰甲基甲醇试验（VP试验）、靛基质试验、七叶苷水解试验、三糖铁试验、克氏双糖铁试验、尿素酶试验、苯丙氨酸脱氨酶试验、氨基酸脱羧酶试验、明胶液化试验、丙二酸钠试验、柠檬酸盐实验（枸橼酸盐实验）、硝酸盐还原试验、石蕊牛奶试验、细菌动力试验，采用法国梅里埃公司生产的 API 50 CHL 乳杆菌鉴定系统对菌株进行生化鉴定，具体结果如下：

卷曲乳杆菌Lcris-2能够水解七叶苷生成葡萄糖和七叶素、MR试验呈阴性说明代谢葡萄糖产生的有机酸不足以使显色剂变色、VP 试验呈阴性说明代谢葡萄糖不产生丙酮酸、靛基质试验试验结果为该菌不分解蛋白胨中色氨酸而产生吲哚、三糖铁试验说明代谢葡萄糖乳糖蔗糖，不产硫化氢，克氏双糖铁试验说明代谢发酵葡萄糖乳糖，不产硫化氢，尿素酶试验、苯丙氨酸脱氨酶试验、氨基酸脱羧酶试验、明胶液化试验均呈阴性，说明该菌不产生尿素酶、苯丙氨酸脱氨酶、氨基酸脱羧酶、明胶酶，丙二酸钠试验、柠檬酸盐实验（枸橼酸盐实验）、硝酸盐还原试验均呈阴性，说明该菌不利用丙二酸钠作为碳源、不利用枸橼酸盐作为氮源和碳源、不还原硝酸盐成亚硝酸盐，石蕊牛奶试验发现该菌可使牛奶发酵但不凝固，说明该菌生在旺盛、不产凝乳酶，细菌动力试验呈阴性；卷曲乳杆菌能发酵半乳糖，水杨苷，葡萄糖，果糖，N-乙酰-葡糖胺，七叶灵，纤维二糖，麦芽糖，蔗糖，海藻糖，淀粉，不能发酵，甘油，赤癣醇，D-阿拉伯糖，甘露糖，L-阿拉伯糖，α-甲基-D-葡萄糖甙，苦杏仁甙，熊果甙，糖原，核糖，D-木糖，L-木糖，阿东醇，β-甲基-D-木糖甙，山梨糖，鼠李糖，卫茅醇，肌醇，甘露醇，山梨醇，α-甲基-D-甘露糖甙，蜜二糖，菊糖，松叁糖，木糖醇，D-松二糖，D-来苏糖，D-岩藻糖，L-岩藻糖，D-阿拉伯糖醇，L-阿拉伯糖醇，葡萄糖酸盐，2-酮基-葡萄糖酸盐，5-酮基-葡萄糖酸盐，乳糖，D-塔格糖，棉子糖，龙胆二糖。。

实施例3

卷曲乳杆菌Lcris-2的抗生素敏感试验。

按照 2015 年版药典第三部微生态活菌制品总论中抗生素敏感性试验的要求，采用琼脂扩散纸片法测定菌株对抗生素的敏感性，根据抑菌圈的大小判断菌株对抗生素敏感性级别。

活化及划线：卷曲乳杆菌Lcris-2在MRS肉汤培养基中活化，大肠杆菌于营养肉汤活化，37 ℃培养；乳酸菌经活化后，挑取一环菌液于MRS固体培养基上划线，将平皿放入放有厌氧产气袋的厌氧密封罐中，37 ℃培养；大肠杆菌经活化后，挑取一环菌液于营养肉汤固体培养基上划线，将平皿放入密封罐中，37 ℃培养。

从培养好的琼脂平板上挑取数个单个菌落直接接种到生理盐水制成菌悬液，调整悬液的浊度使其达到0.5麦氏浓度，调整好悬液的浊度后最好在15 min内将无菌棉签浸入悬液内，紧贴试管内壁在液体上方旋转拭子数次，这样能除去棉签上多余的液体。

用拭子划线整个琼脂表面，接种于表面干燥的平板，卷曲乳杆菌Lcris-2菌悬液接种于MRS琼脂平板，大肠杆菌菌悬液分别接种于MH琼脂平板和MRS琼脂平板；接种完成后，用药敏纸片分配器将药敏纸片分配放置在平板上，每个平板上放置6张药敏纸片，3平行，实验共计12种药敏纸片（均为OXOID），信息分别如下：

表3 抗生素对卷曲乳杆菌Lcris-2抑制能力

抗生素名称

含量

抑菌圈直径（mm）

耐药

中介

敏感

参考菌

氨苄西林

10 µg

25.39

≤18

19-21

≥22

嗜血杆菌属

红霉素

15 µg

34.53

≤15

16-20

≥21

肺炎链球菌

亚胺培南

10 µg

33.1

–

≥16

嗜血杆菌属

万古霉素

30 µg

24.98

–

≥17

肺炎链球菌

克林霉素

2 µg

30.12

≤15

16-18

≥19

肺炎链球菌

制霉菌素

100 units

6

–

抗真菌药，无参考细菌

甲硝唑

5 µg

6

–

无参考菌

哌拉西林/他唑巴坦

110 µg

37.17

≤17

18-20

≥21

肠杆菌科

头孢唑肟

30 µg

33.95

≤14

15-19

≥20

葡萄球菌属

氟康唑

25 µg

6

–

抗真菌药，无参考细菌

诺氟沙星

10 µg

6

≤12

13-16

≥17

肠杆菌科

庆大霉素

10 µg

6

≤12

13-15

≥15

肠杆菌科

结果：

（1）卷曲乳杆菌Lcris-2对氨苄西林、红霉素、亚胺培南、哌拉西林/他唑巴坦和头孢唑肟这五种抗生素敏感；

（2）卷曲乳杆菌Lcris-2对制霉菌素、甲硝唑、氟康唑和庆大霉素四种抗生素耐药；

（3）卷曲乳杆菌Lcris-2对万古霉素敏感；

（4）卷曲乳杆菌Lcris-2对克林霉素敏感；

（5）卷曲乳杆菌Lcris-2对诺氟沙星耐药。

实施例4

卷曲乳杆菌Lcris-2抑制金黄色葡萄球菌能力、抑制绿农假单胞菌能力、抑制大肠杆菌能力、抑制乙型副伤寒沙门氏菌能力和抑制痢疾志贺菌能力试验。

卷曲乳杆菌Lcris-2经活化后，取0.1 mL菌液与MRS固体培养基混匀，倾注入6 cm平皿内，完全凝固后37 ℃培养48 h，取出平皿，用内径6 mm的打孔器在琼脂培养基上打孔，获得菌饼；金黄色葡萄球菌、绿农假单胞菌、大肠杆菌、乙型副伤寒沙门氏菌和痢疾志贺菌经活化转接后，用0.9%生理盐水以10倍梯度，将病原菌菌液稀释至100倍，分别取10^-1和10^-2稀释液0.5 mL与5 mL 营养琼脂固体培养基混匀，倾注入9 cm平皿内,完全凝固后，将乳酸菌菌饼轻放在营养琼脂表面，每皿对称放4个菌饼，每株菌2个平行，平皿正置放入密封罐中，37 ℃培养24 h，用游标卡尺测量抑菌圈大小。

得到结果如下表所示：

抑菌圈直径（mm）	金黄色葡萄球菌	大肠杆菌）	痢疾志贺菌	绿农假单胞菌	乙型副伤寒沙门氏菌
						卷曲乳杆菌Lcris-2	12.61	10.51	12.41	13.74	12.01
标准菌株	11.28	9.32	11.93	13.09	12

实施例5

对卷曲乳杆菌Lcris-2的第 0代（T0）、第 30 代（T30）提取细菌基因组DNA ，并采用引物对27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' ），1492R（5'-TACCTTGTTACGACTT-3'）进行PCR，将T0、T30的 PCR 扩增产物测序，T0和T30测序结果一致，说明遗传稳定性。

实施例6 毒性试验

供试品：卷曲乳杆菌Lcris-2活菌胶囊：低剂量：2.0*10⁹CFU/粒；高剂量：1.0*10¹⁰CFU/粒。

给药途径：阴道给药

给药频率与期限：DAY1给药1次

给药方法：空白对照组给予空白胶囊，供试品低、高剂量组分别给予对应规格的供试品胶囊，均阴道给予1粒胶囊。

给药途径的选择理由：模拟临床拟用给药途径，选用阴道给药。

观察频率和时间：1~3组动物给药后笼旁观察急性毒性反应至少4小时，对未出现明显异常反应的动物，4小时后结束观察；对出现明显异常表现的动物，应进行详细临床观察，当天观察结束时间由专题负责人决定。

详细临床观察：1~3组动物接收时，给药前，给药开始后每周1次从饲养笼中取出进行详细临床观察，可根据需要增加观察频次。详细临床观察时间段可不进行一般临床观察的记录。观察内容包括但不限于行为活动、皮肤、被毛、眼、耳、鼻、腹部、外生殖器、肛门、四肢、足、呼吸。

体重：动物接收后，分组前，药后每周称重1次，所有动物发现死亡或濒死安乐死前也称重。

食量：给药后每周对1~3组动物进行1次摄食量（添加量/剩余量）测定，以“g/只/天”形式体现。动物禁食过夜前测定该笼动物剩余饲料量。

结果是，临床观察、体重、食量未见明显异常，证明无毒。

按照上述实施例，便可很好地实现本发明。值得说明的是，基于上述结构设计的前提下，为解决同样的技术问题，即使在本发明上做出的一些无实质性的改动或润色，所采用的技术方案的实质仍然与本发明一样，故其也应当在本发明的保护范围内。

序列表

<110> 四川厌氧生物科技有限责任公司

<120> 一种卷曲乳杆菌及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1425

<212> DNA

<213> 卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)

<400> 1

cttccgaagg ttaggccacc ggctttgggc attgcagact cccatggtgt gacgggcggt 60

gtgtacaagg cccgggaacg tattcaccgc ggcgtgctga tccgcgatta ctagcgattc 120

cagcttcgtg cagtcgagtt gcagactgca gtccgaactg agaacagctt tcagagattc 180

gcttgccttc gcaggctcgc ttctcgttgt actgcccatt gtagcacgtg tgtagcccag 240

gtcataaggg gcatgatgac ttgacgtcat ccccaccttc ctccggtttg tcaccggcag 300

tctcattaga gtgcccaact taatgctggc aactaataac aagggttgcg ctcgttgcgg 360

gacttaaccc aacatctcac gacacgagct gacgacagcc atgcaccacc tgtcttagcg 420

tccccgaagg gaactttgta tctctacaaa tggcactaga tgtcaagacc tggtaaggtt 480

cttcgcgttg cttcgaatta aaccacatgc tccaccgctt gtgcgggccc ccgtcaattc 540

ctttgagttt caaccttgcg gtcgtactcc ccaggcggag tgcttaatgc gttagctgca 600

gcactgagag gcggaaacct cccaacactt agcactcatc gtttacggca tggactacca 660

gggtatctaa tcctgttcgc tacccatgct ttcgagcctc agcgtcagtt gcagaccaga 720

gagccgcctt cgccactggt gttcttccat atatctacgc attccaccgc tacacatgga 780

gttccactct cctcttctgc actcaagaaa aacagtttcc gatgcagttc ctcggttaag 840

ccgagggctt tcacatcaga cttattcttc cgcctgcgct cgctttacgc ccaataaatc 900

cggacaacgc ttgccaccta cgtattaccg cggctgctgg cacgtagtta gccgtgactt 960

tctggttgat taccgtcaaa taaaggccag ttactacctc tatccttctt caccaacaac 1020

agagctttac gatccgaaaa ccttcttcac tcacgcggcg ttgctccatc agacttgcgt 1080

ccattgtgga agattcccta ctgctgcctc ccgtaggagt ttgggccgtg tctcagtccc 1140

aatgtggccg atcagtctct caactcggct atgcatcatc gccttggtaa gcctttacct 1200

taccaactag ctaatgcacc gcggggccat cccatagcga cagcttacgc cgccttttaa 1260

aagctgatca tgcgatctgc tttcttatcc ggtattagca cctgtttcca agtggtatcc 1320

cagactatgg ggcaggttcc ccacgtgtta ctcacccatc cgccgctcgc tttcctaacg 1380

tcattaccga agtaaatctg ttattccgct cgctcgactg cagtt 1425

Claims

1.一种卷曲乳杆菌，其特征在于，所述卷曲乳杆菌命名为卷曲乳杆菌（Lactobacilluscrispatus）Lcris-2，其保藏编号为：CCTCC No.M2019427。

2.根据权利要求1所述的一种卷曲乳杆菌在制备用于预防或治疗阴道炎的药物中的用途。

3.根据权利要求1所述的一种卷曲乳杆菌在制备用于预防阴道炎的妇女卫生保健品中的用途。

4.根据权利要求1所述的一种卷曲乳杆菌在制备外生殖器卫生用品中的用途。

5.根据权利要求1所述的一种卷曲乳杆菌在制备调节阴道菌群平衡的药品或卫生保健品中的用途。

6.根据权利要求1所述的一种卷曲乳杆菌在制备具有阴道上皮细胞粘附功能的药品或卫生保健品中得用途。

7.根据权利要求1所述的一种卷曲乳杆菌在制备具有预防、或治疗阴道致病菌中的药品或卫生保健品中的用途。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，致病菌包括但不限于阴道加德纳菌、金黄色葡萄球菌、绿农假单胞菌、大肠杆菌、乙型副伤寒沙门氏菌和痢疾志贺菌中的任意一种或多种。

9.根据权利要求1所述的一种卷曲乳杆菌在剖腹产婴儿外用护理品中的应用。