CN111088178B

CN111088178B - 一种产乳酸和h2o2的乳杆菌及其应用

Info

Publication number: CN111088178B
Application number: CN201811239086.8A
Authority: CN
Inventors: 徐晓芬; 付美红; 王莎莎; 高远; 尹培军; 朱刚刚; 王苒君; 于鸿晶; 孙宁云; 文彬
Original assignee: Sph Sine Pharmaceutical Laboratories Co ltd
Current assignee: Sph Sine Pharmaceutical Laboratories Co ltd
Priority date: 2018-10-23
Filing date: 2018-10-23
Publication date: 2022-11-22
Anticipated expiration: 2038-10-23
Also published as: CN111088178A

Abstract

本发明公开了一种产乳酸和H₂O₂的乳杆菌及其应用。所述的乳杆菌为格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)或卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)，所述格氏乳杆菌的保藏编号为CGMCC No.15815或者CGMCC No.15816；所述卷曲乳杆菌的保藏编号为CGMCC No.15813或者CGMCC No.15814。本发明的格氏乳杆菌、卷曲乳杆菌能够具有极强的产乳酸和H₂O₂能力、具有很好地黏附阴道上皮细胞的能力，并且体内和体外实验中均能够有效地抑制加德纳菌、白念珠菌等病原菌的繁殖。

Description

一种产乳酸和H2O2的乳杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体涉及一种产乳酸和H₂O₂的乳杆菌及其应用。

背景技术

健康妇女阴道内存在多种微生物，它们与宿主、环境之间构成了相互制约、相互协调、动态平衡的阴道微生态系统。文献报道健康妇女的阴道菌群主要由乳杆菌构成，且某一种的乳杆菌占绝对优势，根据阴道菌群中占绝对优势乳杆菌菌种的不同可以将女性分为5类：(1)卷曲乳杆菌占优势的女性， (2)格氏乳杆菌(也可称为加氏乳杆菌)占优势的女性，(3)詹氏乳杆菌占优势的女性，(4)惰性乳杆菌占优势的女性，(5)阴道菌群组成多样化的女性。正常情况下乳杆菌对阴道可以起到保护作用，而以乳杆菌占优势的阴道微生态的紊乱则可以导致阴道炎。

细菌性阴道病(BV)的发生是由于阴道菌群失调，宿主自身的乳杆菌减少而导致其他条件性病原微生物如加德纳菌、各种厌氧菌、弯曲弧菌等大量繁殖，BV实际上是以加德纳菌为主的一种混合感染。BV与许多严重的妇产科合并症有直接关系，包括与盆腔炎、不孕、不育、流产、妇科和产科手术后感染、早产、胎膜早破、新生儿感染和产褥感染等的发生有关。有文献报道BV发病率约为5.3％，而在妊娠妇女中，BV发病率为20％左右。病患在使用甲硝唑治愈后4周内的复发率为15～25％，3个月内复发率为30％，9 个月复发率高达80％。

抗生素是目前针对BV的首选治疗方法。BV治疗指南中首先推荐口服和/或阴道内甲硝唑用药治疗。虽然这些药物有效，但治疗1-3个月内约30％患者会有复发。由于副作用，例如胃肠不适、金属味、酒精不耐受和罕见的神经系统及其他器官系统不良反应，患者口服甲硝唑治疗常常耐受度较差。甲硝唑可能的副作用在妊娠女性中特别引起关注，在需要重复和延长甲硝唑疗程的复发性疾病患者中更加明显。此外，应用抗生素治疗，虽然可暂时缓解BV的症状，但也使本已减少的乳杆菌进一步减少，加重阴道微生态失调，从而使BV反复复发。因此，如何控制复发、彻底根治细菌性阴道病是妇产科医生亟需解决的棘手问题。

目前，科学研究结果表明产乳酸、H₂O₂的乳杆菌是健康妇女阴道内的优势菌，是保护女性阴道免受病原体感染的重要因素，此外，这些优势乳杆菌还可以代谢产生一些有效抑制其他细菌特别是致病菌生长繁殖的细菌素。

健康妇女阴道内存在多种乳杆菌，不同人的阴道菌群中占优势的乳杆菌菌种具有个体差异性，且同一种乳杆菌各株间抗致病菌能力差异明显。选择乳杆菌益生菌时，需要综合考虑乳杆菌的种类、同种但不同菌株产乳酸和 H₂O₂能力、与阴道上皮细胞黏附的能力，其中乳杆菌能否在阴道成功定殖，是乳杆菌持续作用的基础，也是乳杆菌发挥疗效的关键因素之一。

目前市面上大部分已有制品中的活菌均不是筛选自我国健康育龄期女性阴道内的优势菌群，且活菌量低，不能满足妇科临床的需求。已有部分专利申请涉及到优势菌卷曲乳杆菌或者格氏乳杆菌(CN201310002838.X)，但其所保护的菌株产乳酸的能力以及对阴道上皮细胞的黏附能力过低，而后者直接关系到卷曲乳杆菌或者格氏乳杆菌能否在阴道成功定殖，如上所述：后者是乳杆菌持续作用的基础，也是乳杆菌发挥疗效的关键因素之一。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中的格氏乳杆菌和卷曲乳杆菌产乳酸和H₂O₂能力弱、黏附能力低以及不能很好地抑制阴道病原菌的繁殖等缺陷提供一种产乳酸和H₂O₂的乳杆菌及其应用。本发明的乳杆菌具有极强的产乳酸和H₂O₂能力和很好地黏附能力，并且体内和体外实验中均能够有效地加德纳菌、白念珠菌等病原菌的繁殖。

本发明主要通过以下技术手段解决上述技术问题：

本发明的技术方案之一是：一种产乳酸和H₂O₂的乳杆菌，所述的乳杆菌为格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)或卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)，所述格氏乳杆菌的保藏编号为CGMCC No.15815或者CGMCC No.15816；所述卷曲乳杆菌的保藏编号为CGMCCNo.15813或者CGMCC No.15814。

较佳地，所述保藏编号为CGMCC No.15815的所述格氏乳杆菌的16S rRNA序列如序列表中SEQ ID NO.1所示；所述保藏编号为CGMCC No.15816的所述格氏乳杆菌的16S rRNA序列如序列表中SEQ ID NO.2所示；所述保藏编号为CGMCC No.15813的所述卷曲乳杆菌的16S rRNA序列如序列表中SEQ ID NO.3所示；所述保藏编号为CGMCC No.15814的所述卷曲乳杆菌的16S rRNA序列如序列表中SEQ ID NO.4所示。

本发明的技术方案之二是：一种培养上述乳杆菌的方法，其包括如下步骤：在培养基中培养所述乳杆菌即可。

较佳地，所述的培养基为MRS液体培养基；所述的培养为厌氧培养。

本发明的技术方案之三是：一种菌剂，其活性成分包括至少一种上述的乳杆菌，即：上述的保藏编号为CGMCC No.15815的格氏乳杆菌、保藏编号为CGMCC No.15816的格氏乳杆菌、保藏编号为CGMCC No.15813的卷曲乳杆菌以及保藏编号为CGMCC No.15814的卷曲乳杆菌中的一种或多种。

本发明的技术方案之四是：一种上述的乳杆菌的冻干粉，较佳地，所述的冻干粉通过如下步骤制得：

(1)将上述的乳杆菌与冻干保护剂混合得混合物；

(2)将所述混合物冷冻干燥即得。

其中，步骤(1)中所述乳杆菌的与所述冻干保护剂的相对用量可为本领域常规的、进行冻干粉制备时的相对用量。

为进一步提高所述乳杆菌的冻干存活率和增强所述冻干菌粉的稳定性, 进而延长所述冻干菌粉的有效期，发明人创造性地对所述步骤(1)中的所述冻干保护剂以及步骤(2)中所述冷冻干燥的条件进行了优化。其中：

所述的冻干保护剂较佳地包括如下组分：脱脂奶粉6～12％、谷氨酸钠2～4％以及海藻糖1～6％，以水补足至100％，所述的百分比为质量百分比；更佳地包括如下组分：脱脂奶粉7％、谷氨酸钠2％以及海藻糖3％，以水补足至100％，所述的百分比为质量百分比。

所述冷冻干燥的条件较佳地为：-52～-48℃预冻2～5小时，然后在-47～- 43℃下真空干燥2～48小时，再在26～30℃解析干燥10～40小时；更佳地为- 50℃预冻4小时，然后在-45℃下真空干燥24小时，再在28℃解析干燥20 小时。

本发明的技术方案之五是：上述乳杆菌、上述菌剂，或者上述冻干粉在制备调节阴道菌群平衡或用于防治阴道疾病的食品、卫生用品、或者药物中的用途；较佳地，所述的阴道疾病为加德纳菌(Gardnerella vaginalis)、阿托波菌(Atopobium vaginae)、白色念珠菌(Candida albicans)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、铜绿假单胞菌(Pseudomona aeruginosa)和沙门氏菌(Salmonellasp)中的一种或多种引发的阴道疾病；更佳地，所述的阴道疾病为阴道炎症性疾病；进一步更佳地，所述的阴道炎症性疾病包括细菌性阴道炎、念珠菌性阴道炎、滴虫性阴道炎、幼儿性阴道炎、月经性阴道炎、老年性阴道炎和混合感染性阴道炎。

需知：本发明所述的保藏编号为CGMCC No.15815或者CGMCC No.15816的格氏乳杆菌，保藏编号为CGMCC No.15813或者CGMCC No.15814的卷曲乳杆菌或者不仅限于四株乳杆菌本身，还包括四株乳杆菌的变种或者其片段或者级分。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：

本发明筛选得到的4株乳杆菌具有极强的产乳酸(菌株B3、B7、A1和 A3在MRS培养基中发酵48小时后发酵液中乳酸的总含量可分别高达16.42、 14.23、12.22和13.76g/L)和H₂O₂能力，因此可帮助快速恢复阴道微环境并维持阴道微生态的平衡；在体外实验中，本发明的乳杆菌能够很好地抑制阴道加德纳菌、阿托波菌、白色念珠菌以及金黄色葡萄球菌等病原菌的生长；在小鼠阴道加德纳菌和白念珠菌等不同模型的体内测试中发现本发明的菌株B3、B7、A1和A3均能很好地定殖在阴道内并将阴道内乳杆菌数量恢复到正常水平以上，同时可以稳定地抑制阴道加德纳菌以及白念珠菌的繁殖；另外，本发明的乳杆菌还具有很好的黏附能力，其中：对于人类阴道上皮细胞Vk2/E6E7，B3、B7、A1和A3黏附4小时后的黏附率分别高达77.3％、 66.4％、48.2％和57.6％；对于人子宫颈癌上皮细胞HeLa，B3、B7、A1和A3黏附4小时后的黏附率分别高达56.9％、59.8％、74.8％和69.5％。最后，利用所述菌株制备得到的冻干粉在储存过程中具有很好的稳定性，6个月后活菌率仍在90％以上。

生物材料保藏信息

本发明的格氏乳杆菌B3和格氏乳杆菌B7，均已于2018年05月25日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏编号分别为： CGMCC No.15815和CGMCC No.15816，培养物名称分别是格氏乳杆菌B3 和格氏乳杆菌B7，分类命名是格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)。

本发明的卷曲乳杆菌A1和卷曲乳杆菌A3，均已于2018年05月25日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏编号分别为： CGMCC No.15813和CGMCC No.15814，培养物名称分别是卷曲乳杆菌A1 和卷曲乳杆菌A3，分类命名是卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)。

附图说明

图1A、B为本发明的格氏乳杆菌B3和B7的菌落形态照片。

图2A、B为本发明的格氏乳杆菌B3和B7的革兰氏染色镜检照片。

图3A、B为本发明的卷曲乳杆菌A1和A3的菌落形态照片。

图4A、B是本发明的卷曲乳杆菌A1和A3的革兰氏染色镜检照片。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例1 培养基的配制

1.乳杆菌选择性培养基(Rogosa SL Agar)配制：

(1)称取22.5g Rogosa SL Agar培养基粉末放入500mL锥形瓶中，加入300mL去离子水，磁力搅拌充分，然后快速搅拌下加热煮沸1min，密封瓶口；

(2)将上述封口好的锥形瓶放入生物安全柜，紫外线照射20min以上；

(3)待培养基温度降到50～60℃，打开瓶口，加入396μL冰醋酸，再放入微波炉煮沸2～3min，紫外线照射20min以上；

(4)待培养基温度降至室温后倒入培养皿，根据培养皿大小每个皿倒约10～20mL培养基，待冷却凝固后，标记培养基名称及配制日期，放于4℃冰箱待用。

2.MRS固体培养基配制

(1)称取20.46g MRS Agar培养基粉末放入500mL锥形瓶中，再加入 300mL去离子水，搅拌溶解，用半透膜封口；

(2)放入高压锅，115℃，灭菌30min；

(3)待培养基温度降至室温后倒入培养皿，根据培养皿大小每个皿倒约10～20mL培养基，待冷却凝固后，标记培养基名称及配制日期，放于4℃冰箱待用；

3.MRS液体培养基配制

(1)称取15.66g MRS培养基粉末放入500mL锥形瓶中，再加入300 mL去离子水，搅拌溶解，用半透膜封口；

(2)放入高压锅，115℃，灭菌30min；

(3)待培养基温度降至室温后倒入培养皿，根据培养皿大小每个皿倒约10～20mL培养基，待冷却凝固后，标记培养基名称及配制日期，放于4℃冰箱待用。

4.过氧化氢(H₂O₂)半定量培养基配制

(1)同MRS固体培养基配制步骤(1)、(2)；

(2)待高压锅无压力后取出放入生物安全柜，稍冷却(70～80℃)，加入 TMB(终浓度0.25mg/mL)，摇匀，再冷却到40℃左右时加入HRP(终浓度 0.01mg/mL)，混匀，边摇边倒入培养皿，待培养基冷却凝固后，标记培养基名称及配制日期，用保鲜膜包裹后放入4℃冰箱待用。

实施例2 格氏乳杆菌和卷曲乳杆菌菌株的分离、纯化、增菌培养

1.乳杆菌菌株的分离、纯化和增菌培养

招募数名没有阴道感染或者任何肠道疾病的健康育龄期女性参与提供样品，参与者均通过了体检中心的健康检查，并通过调查问卷提供了关于她们的年龄(21～30)、月经周期以及其他健康行为等的信息。样品采集前2周开始，所有参与者避免所有类型的含有益生菌的配方，样品收集采用美国BD 公司的Port.A-Cd系统，用两个无菌棉拭子采集受试者阴道侧壁1/3处的分泌物，放入无菌管中，迅速用冰袋运送到实验室生物安全柜中，用少量无菌 PBS冲洗拭子后的菌悬液作为母液，然后用无菌PBS稀释到不同浓度，涂布于新鲜配置好的Rogosa SL固体培养基上，标记信息，将培养皿置于培养盒中，并放入厌氧产气袋，置于37℃培养箱，培养48～72小时。

从培养好的Rogosa SL平板上，用接种环分别挑取不同形态(表面、边缘、颜色、大小等)的单菌落，按八区划线法接种至新鲜配制的MRS固体培养基上，将培养皿置于培养盒中，并放入厌氧产气袋，置于37℃培养箱，培养24～72小时，获得纯化的单菌落，用接种环挑取单菌落接种至MRS液体培养基，置于37℃培养箱，厌氧培养24小时，得到多个新的乳杆菌菌株。

从“1药网”上的“北京隆元康药房”购买了一盒“定君生”药品。在生物安全柜中打开包装盒，取一粒胶囊并打开胶囊壳，将胶囊壳内的菌粉倒入10mL无菌PBS溶液中，涡旋振荡混匀，记为10^-1稀释度，然后继续进行10倍梯度稀释至10^-4，从10^-3、10^-4稀释度各取100μL分别涂布MRS固体培养基平板，37℃，厌氧培养24～48小时；待MRS固体培养基上长出单菌落，用接种环挑取单菌落接种至MRS液体培养基，置于37℃培养箱，厌氧培养16～24小时；培养结束后，离心，去掉部分上清，将菌体重悬，再加入等体积20％甘油，涡旋振荡混匀，分装到冻存管中，-80℃保藏，即得对照菌株德氏乳杆菌DM8909(16S rRNA测序鉴定)。

从某淘宝代购店购买到

的两种阴道用益生菌保健品，其中一种含有鼠李糖乳杆菌PB01和格氏乳杆菌EB01，另外一种含有鼠李糖乳杆菌 GR-1和发酵乳杆菌RC-14；菌株分离方法与德氏乳杆菌DM8909类似，待 MRS固体培养基上长出单菌落，发现每种产品的MRS固体培养基上有两种不同的菌落形态，用接种环分别挑取不同形态的单菌落接种至MRS液体培养基，置于37℃培养箱，厌氧培养16-24小时；培养结束后，分别离心，去掉部分上清，将菌体重悬，再加入等体积20％甘油，涡旋振荡混匀，分装到冻存管中，-80℃保藏，同时送菌株样品进行16S rRNA测序，鉴定此4株菌, 从而获得鼠李糖乳杆菌GR-1和PB01。

2.乳杆菌的鉴定及保藏

(1)培养特性、染色镜检及形态学特征

针对本发明的格氏乳杆菌：培养后得到的乳杆菌菌落如图1A、B，菌落呈圆形，取该菌纯培养物涂片进行革兰氏染色，结果见图2A、B，呈现革兰氏阳性，短杆状，可连成长链，初步判定为乳杆菌属。

针对本发明的卷曲乳杆菌：培养后得到的乳杆菌菌落如图3A、B，菌落呈灰白色圆形，中间饱满，周围弥散，不规则。取该菌纯培养物涂片进行革兰氏染色，结果见图4A、B，呈现革兰氏阳性，短杆状，可连成长链，初步判定为乳杆菌属。

(2)16S rRNA基因序列鉴定

采用直接进行PCR扩增的试剂盒，引物采用27F(5'AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG3')和1492R(5'TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T 3')进行PCR扩增，取PCR产物进行凝胶电泳，确定16S rRNA基因片段，若凝胶电泳结果表明PCR成功，则将PCR样品送到基因测序公司进行16S rRNA 测序。测序得到的序列与NCBI数据库中的数据进行BLAST序列相似性比较分析，根据最高同源性分值大于97％，确定所分离得到的菌株中有7株为乳杆菌属的格氏乳杆菌，有7株为乳杆菌属的卷曲乳杆菌。

实施例3 格氏乳杆菌以及卷曲乳杆菌的代谢产物测定

1.格氏乳杆菌和卷曲乳杆菌发酵液中的乳酸含量测定

采用D-乳酸检测试剂盒(Sigma)和L-乳酸检测试剂盒(Sigma)测定分离到的7株格氏乳杆菌(或者7株卷曲乳杆菌)和对照菌株德氏乳杆菌DM8909、鼠李糖乳杆菌PB01、鼠李糖乳杆菌GR-1、ATCC标准菌株33820(购自ATCC) 在MRS培养基中发酵48小时后发酵液中乳酸的含量。测定结果显示：

(1)7株格氏乳杆菌中，B3的产乳酸能力最强，B7次之，B3、B7和各对照商业菌株(德氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌PB01、鼠李糖乳杆菌GR-1)的乳酸产量如表1所示。

(2)7株卷曲乳杆菌中，A3的产乳酸能力最强，A1次之，A1、A3和各对照商业菌株(德氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌PB01、鼠李糖乳杆菌GR-1和ATCC 33820)的乳酸产量如表1所示。

表1 乳杆菌B3、B7、A1、A3和对照菌株发酵液中乳酸含量测定结果

2.格氏乳杆菌产H₂O₂能力测定

根据Mcgroarty等的过氧化物酶法进行7株格氏乳杆菌(或者7株卷曲乳杆菌)产H₂O₂能力的测定。将新鲜培养好的格氏乳杆菌梯度稀释到一定菌浓，取100μL接种于H₂O₂鉴定平板上，即涂布于MRS-TMB-HP平板上，37℃，厌氧培养48～72小时，取出平板，在空气中暴露菌体。产H₂O₂的菌落将变为蓝色，而不产H₂O₂的菌落不变色，根据变色时间对产生的H₂O₂进行半定量。

半定量结果显示：

(1)格氏乳杆菌B3和B7产H₂O₂的能力优于其它格氏乳杆菌菌株，也优于商业菌株鼠李糖乳杆菌PB01、鼠李糖乳杆菌GR-1、德氏乳杆菌DM8909。 B3活菌的菌落在2-3min时开始出现微蓝色，5mim时菌落的蓝色进一步加深， 7～8min时明显出现大量蓝色；B7活菌的菌落在1～2min时开始出现蓝色，3min 时蓝色更深，5～7min时出现大量蓝色；德氏乳杆菌活菌的菌落在3～4min时开始出现蓝色，6～7min时蓝色更深，9～10min时出现大量蓝色；鼠李糖乳杆菌PB01和GR-1的菌落在空气中暴露30min仍然为乳白色。根据表2所示判定标准，格氏乳杆菌B3和B7代谢产生过氧化氢的能力都半定量为+++级，因此，在产H₂O₂能力方面，格氏乳杆菌B3、B7均强于商业菌株德氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌PB01和GR-1。

(2)卷曲乳杆菌A1和A3产H₂O₂的能力优于其它卷曲乳杆菌菌株，也优于ATCC标准菌株33820和商业菌株鼠李糖乳杆菌PB01、鼠李糖乳杆菌GR-1、德氏乳杆菌。A3活菌的菌落在2-3min时开始出现微蓝色，5mim时菌落的蓝色进一步加深，7～10min时明显出现大量蓝色；A1活菌的菌落在3～4min时开始出现蓝色，6～7min时蓝色更深，9～10min时出现大量蓝色；ATCC标准菌株 33820的菌落在7～8min时开始出现蓝色，11min时出现大量蓝色；德氏乳杆菌菌落变蓝时间与A1相当；鼠李糖乳杆菌PB01和GR-1的菌落在空气中暴露 30min仍然为乳白色。根据表2所示判定标准，卷曲乳杆菌A3和A1代谢产生过氧化氢的能力都半定量为+++级，因此，在产H₂O₂能力方面，卷曲乳杆菌 A1、A3均强于ATCC标准菌株33820、商业菌株鼠李糖乳杆菌PB01和GR-1。

表2 H₂O₂半定量判定标准

菌落变色时间	H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>半定量级别
		<10分钟	+++
10-<20分钟	++
		20-30分钟	+
>30分钟或不变色	-

以上结果表明本发明筛选到的格氏乳杆菌B3和B7、卷曲乳杆菌A1和A3 都具有较强的产乳酸和H₂O₂能力，可帮助快速恢复阴道微环境并维持阴道微生态的平衡。

实施例4 格氏乳杆菌菌株和卷曲乳杆菌的理化特性

1.格氏乳杆菌菌株B3和B7以及卷曲乳杆菌A1和A3的生理生化特征

通过七叶苷水解试验、甲基红试验(MR试验)、乙酰甲基甲醇试验(VP 试验)、靛基质试验、三糖铁试验、克氏双糖铁试验、尿素酶试验、苯丙氨酸脱氨酶试验、氨基酸脱竣酶试验、明胶液化试验、丙二酸纳试验、柠檬酸盐实验(枸橼酸盐实验)、硝酸盐还原试验、石蕊牛奶试验、细菌动力试验测定格氏乳杆菌菌株B3和B7以及卷曲乳杆菌菌株A1和A3的生理生化反应，结果如下：所分离得到的格氏乳杆菌菌株B3和B7以及卷曲乳杆菌菌株A1和A3均能够水解七叶苷生成葡萄糖和七叶素，MR试验为阳性，说明二者均可代谢葡萄糖产生有机酸；VP试验为阴性说明二者代谢葡萄糖不产生丙酮酸；靛基质试验试验结果表明二者不分解蛋白胨中的色氨酸而产生吲哚；三糖铁试验结果表明二者代谢乳糖葡萄糖均不产生H₂S；克氏双糖铁试验结果说明二者代谢乳糖均不产生H₂S；尿素酶试验、苯丙氨酸脱氨酶试验、氨基酸脱羧酶试验、明胶液化试验均为阴性，说明二者均不产生尿素酶、苯丙氨酸脱氨酶、氨基酸脱羧酶、明胶酶；丙二酸纳试验、柠檬酸盐实验(枸橼酸盐实验)、硝酸盐还原试验均为阴性，说明二者不利用丙二酸钠作为碳源，不利用枸橼酸盐作为氮源和碳源，不还原硝酸盐成亚硝酸盐；石蕊牛奶试验发现二者均可使牛奶发酵但不凝固，说明二者生长旺盛但不产凝乳酶；细菌动力试验为阴性。

采用梅里埃公司生产的API 50 CHL乳杆菌鉴定系统对格氏乳杆菌菌株 B3和B7以及卷曲乳杆菌菌株A1和A3进行生化鉴定，鉴定结果如下：在24小时、48小时时，B3、B7、A1和A3均可使半乳糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、 N-乙酰-葡糖胺、苦杏仁苷、熊果苷、七叶灵、柳醇、纤维二糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、淀粉发酵，反应呈阳性；但二者均不能利用甘油、赤藓醇、D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、核糖、D-木糖、L-木糖、阿东醇、β-甲基-D-木糖苷、山梨糖、鼠李糖、卫茅糖、肌醇、甘露醇、山梨醇、α-甲基-D-甘露糖苷、α- 甲基-D-葡萄糖苷、蜜二糖、菊糖、松三糖、木糖醇、拢牛儿糖、D-松二糖、 D-来苏糖、D-塔格糖、D-岩糖、L-岩糖、D-阿拉伯糖醇、L-阿拉伯糖醇、葡萄糖酸盐、2-酮基-葡萄糖酸盐、5-酮基-葡萄糖酸盐，反应呈阴性；二者均可微弱利用海藻糖、棉子糖、糖原作为碳源，反应呈弱阳性；底物空白时，反应均为阴性。

综上，判定菌株B3、B7符合格氏乳杆菌的生理生化特性；菌株A1和A3 符合卷曲乳杆菌的生理生化特性。

实施例5 格氏乳杆菌菌株B3和B7、卷曲乳杆菌A1和A3的抑菌性能

1.格氏乳杆菌B3、B7以及卷曲乳杆菌A1、A3和德氏乳杆菌体外抑制阴道加德纳菌的实验

格氏乳杆菌B3、B7(或者卷曲乳杆菌A1、A3)和德氏乳杆菌在37℃厌氧静置培养24小时，分别接种三个菌的菌液各10μL于MRS琼脂平板上，每个菌做三个重复平行，37℃，厌氧培养48小时；取一定量新鲜培养的阴道加德纳菌种子液接种于5mL BHI液体培养基中，37℃，厌氧静置培养 48小时；吸取100mL还未凝固的BHI固体培养基，加入5mL马血清及2 mL加德纳菌液混合均匀后，吸取8mL，平铺于培养48小时后的乳杆菌MRS 琼脂平板上，37℃，厌氧培养，直至乳杆菌周围出现抑菌圈。用游标卡尺测量抑菌圈的直径：

(1)B3的抑菌圈是32.96±0.05mm，B7的抑菌圈是31.57±0.14mm，而德氏乳杆菌的抑菌圈是21.47±0.23，说明格氏乳杆菌B3和B7抑制阴道加德纳菌生长的能力均强于德氏乳杆菌；

(2)A1的抑菌圈是33.36±0.17mm，A3的抑菌圈是31.83±0.18mm，而德氏乳杆菌的抑菌圈是21.47±0.23，说明卷曲乳杆菌A1和A3抑制阴道加德纳菌生长的能力均强于德氏乳杆菌。

2.格氏乳杆菌B3、B7以及卷曲乳杆菌A1、A3和德氏乳杆菌体外抑制阿托波菌的实验

格氏乳杆菌B3、B7(或者卷曲乳杆菌A1、A3)和德氏乳杆菌在37℃厌氧静置培养24小时，分别接种三个菌的菌液各10μL于MRS平板上，每个菌做三个重复平行，37℃，厌氧培养48小时；调整37℃厌氧培养好的阿托波菌浓度，使其OD600为0.3。蘸取此阿托波菌液，均匀涂布在整个哥伦比亚血平板表面；将培养好的格氏乳杆菌B3、B7(或者卷曲乳杆菌A1、A3)和德氏乳杆菌，按压打孔并用镊子将菌饼取出，倒置在涂布有阿托波菌的哥伦比亚血平板上，37℃，厌氧培养直至抑菌圈明显出现。用游标卡尺测量抑菌圈的直径：

(1)B3的抑菌圈是27.15±0.16mm，B7的抑菌圈是30.53±0.11mm，而德氏乳杆菌的抑菌圈是19.26±0.16，说明格氏乳杆菌B3和B7抑制阴道阿托波菌生长的能力均强于德氏乳杆菌；

(2)A1的抑菌圈是27.86±0.15mm，A3的抑菌圈是29.13±0.11mm，而德氏乳杆菌的抑菌圈是19.26±0.16，说明卷曲乳杆菌A1和A3抑制阴道阿托波菌生长的能力均强于德氏乳杆菌。

3.格氏乳杆菌B3、B7以及卷曲乳杆菌A1、A3以及和德氏乳杆菌体外抑制白色念珠菌的实验

将10μL格氏乳杆菌B3、B7(或者卷曲乳杆菌A1、A3)和德氏乳杆菌新鲜菌液分别接种到MRS平板上，37℃，厌氧培养48小时；取100μL白色念珠菌新鲜菌液于5mL soft YM agar(0.4％琼脂，50℃水浴)中混合均匀，倾倒在已培养48小时的B3、B7(或者卷曲乳杆菌A1、A3)和德氏乳杆菌的MRS平板上；待其凝固后，37℃，厌氧培养，直至乳杆菌周围出现抑菌圈，用游标卡尺测量抑菌圈的直径：

(1)B3的抑菌圈是35.17±0.14mm，B7的抑菌圈是37.68±0.24mm，而德氏乳杆菌的抑菌圈是24.72±0.26，说明格氏乳杆菌B3和B7抑制阴道白色念珠菌生长的能力均强于德氏乳杆菌；

(2)A1的抑菌圈是34.79±0.13mm，A3的抑菌圈是37.53±0.09mm，而德氏乳杆菌的抑菌圈是24.72±0.26，说明卷曲乳杆菌A1和A3抑制阴道白色念珠菌生长的能力均强于德氏乳杆菌。

4.格氏乳杆菌B3、B7以及卷曲乳杆菌A1、A3和德氏乳杆菌体外对病原菌金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌和沙门氏菌的抑制作用

将5μL格氏乳杆菌B3、B7(或者卷曲乳杆菌A1、A3)和德氏乳杆菌新鲜菌液分别接种到MRS平板上，37℃，厌氧培养48小时；分别取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、沙门氏菌和大肠埃希菌新鲜菌液100μL加到5mL 的营养琼脂(0.4％琼脂，50℃水浴)中，混合均匀，然后倾倒在已经培养48 小时的格氏乳杆菌B3、B7(或者卷曲乳杆菌A1、A3)和德氏乳杆菌的MRS平板上，待其凝固后，37℃，5％CO₂培养，直至乳杆菌周围出现抑菌圈，用游标卡尺测量抑菌圈的直径，结果见表3。由表3可知，格氏乳杆菌B3、B7 以及卷曲乳杆菌A1、A3对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠埃希氏菌的抑菌效果均优于德氏乳杆菌；三株格氏乳杆菌对铜绿假单胞菌的抑制作用最强，抑菌圈直径均大于95mm；三株卷曲乳杆菌对铜绿假单胞菌的抑制作用最强，抑菌圈直径均大于88mm。

表3 抑菌圈直径(mm)

病原菌	B3	B7	A1	A3	德氏乳杆菌
						金黄色葡萄球菌	47.67	43.37	48.54	42.69	38.64
大肠埃希氏菌	51.41	59.85	49.71	57.15	43.88
						铜绿假单胞菌	>95	>95	>93	>93	>95
沙门氏菌	54.75	55.41	53.62	59.49	47.79

实施例6 细胞黏附力实验

本发明根据黏附在阴道上皮细胞单细胞层上的乳杆菌个数确定不同乳杆菌的黏附性能。具体方法如下：取人类阴道上皮细胞Vk2/E6E7和人子宫颈癌上皮细胞HeLa(购自ATCC)，将细胞以4.5×10⁶cells/孔的密度接种于 12孔板中，待培养48小时后Vk2/E6E7形成单细胞层；每孔以不同数量的 CFU分别加入德氏乳杆菌和格氏乳杆菌B3、B7(或者卷曲乳杆菌A1、A3)，黏附4小时，黏附过程中在摇床上轻轻振荡，各组分别设有三个平行试验。黏附结束后，用1mL 0.05％tritonX-100裂解细胞，制成悬浮菌液，稀释，分别取100μL菌液均匀地涂布于MRS平板上；厌氧培养48小时后，统计每个平板的克隆数。结果显示：

(1)格氏乳杆菌B3的4小时黏附率分别为77.3％和56.9％，格氏乳杆菌B7的4小时黏附率分别为66.4％和59.8％，德氏乳杆菌菌株4小时黏附率分别为30.1％和28.7％，格氏乳杆菌B3、B7的粘附力均高于德氏乳杆菌菌株；

(2)卷曲乳杆菌A1的4小时黏附率分别为48.2％和74.8％，卷曲乳杆菌A3的4小时黏附率分别为57.6％和69.5％，德氏乳杆菌菌株4小时黏附率分别为30.1％和28.7％，卷曲乳杆菌A1、A3的粘附力均高于德氏乳杆菌菌株。

实施例7 格氏乳杆菌B3和B7以及卷曲乳杆菌A1和A3的冻干保存及冻干粉稳定性

将B3、B7、A1以及A3分别在MRS液体培养基中培养，使用FUS-5L 规模的发酵罐(上海国强生化工程装备有限公司)发酵。在稳定期早期收集菌体，其活菌数可达～2.0×10⁹CFU/mL，且流式细胞仪检测其活菌数>90％，离心，收集菌体，用磷酸缓冲液洗涤后，加入冻干保护剂(脱脂奶粉7％、谷氨酸钠2％以及海藻糖3％，以水补足至100％，所述的百分比为质量百分比) 并混匀。然后，将混合物置于Lyo-0.5L冷冻干燥机(上海东富龙科技股份有限公司)中冷冻干燥。混合好的样品放入冻干机，-50℃预冻4小时，然后在- 45℃下真空干燥24小时，再在28℃解析干燥20小时。冻干粉放入铝箔袋分装，并分别存储在4℃和30℃。在第0、30和180天通过平板计数测定活菌数，实验结果如表4和表5所示。由表4和表5可知，B3、B7、A1以及A3 的冻干粉在长达6个月的储存过程中均具有良好的稳定性，活菌率在90％以上，特别是在4℃下具有最佳的储存稳定性，6个月后，四者保留初始活菌数分别是94.3％、93.9％、93.6％和94.0％。

表4 格氏乳杆菌B3冻干粉6个月稳定性试验结果

表5 卷曲乳杆菌A3冻干粉6个月稳定性试验结果

实施例8 对小鼠阴道加德纳菌模型的影响

取SPF级4-6周ICR雌性小鼠70只，随机分为7组：健康对照组、感染对照组、甲硝唑组、格氏乳杆菌B3组和格氏乳杆菌B7组、卷曲乳杆菌 A1组和卷曲乳杆菌A3组，每组10只。定义感染当天为day 0、在day-3和 day 0给小鼠皮下注射一定浓度雌二醇，感染当天腹腔注射一定量盐酸氯胺酮麻醉小鼠，然后给小鼠阴道注入20μL阴道加德纳菌液(5×10⁷CFU/mL)，每天1次，连续接种3天，第4天用无菌拭子从小鼠阴道蘸取少量粘液，检测加德纳菌，确保每个小鼠阴道中都有德纳菌持续定殖，正常组每天每次注入相同体积的生理盐水。

将格氏乳杆菌B3、B7以及卷曲乳杆菌A1、A3分别从新鲜培养的MRS 平板上挑取单菌落接种至MRS液体培养基中，37℃，静置厌氧培养24小时，离心，将菌泥用PBS液重悬，用流式细胞仪调整浓度为1×10⁹CFU/mL。感染后第1天，给格氏乳杆菌组小鼠阴道分别灌注新鲜制备的B3、B7以及卷曲乳杆菌A1、A3菌液20μL，连续3天，每天1次；甲硝唑组小鼠阴道注入20μL甲硝唑溶液，连续3天，每天1次；健康对照组和感染对照组的小鼠每天阴道给予相同体积的生理盐水，连续3天，每天1次。

1.小鼠阴道菌群的测定与分析

用微量加样器取50μL生理盐水，分别于造模后给药前、给药结束后第 1天、给药结束后第6天反复冲洗小鼠阴道5～6次，取30μL上述阴道灌洗液分别做阴道加德纳菌和乳杆菌的菌落计数，结果见表6。阴道加德纳菌的计数采用加有硫酸庆大霉素(4mg/L)、萘啶酮酸(30mg/L)、两性霉素B(2 mg/L)的哥伦比亚血平板。

依选择性培养基菌落形态，涂片染色镜检，进行初步鉴定。

表6 各组灌洗液菌落计数结果

由上表可知，格氏乳杆菌B3、B7治疗组的小鼠在治疗后第一天，其阴道内加德纳菌定殖的数量与感染对照组相比都降低了约25～30倍，卷曲乳杆菌A1、A3治疗组相比感染对照组降低了约20倍；而甲硝唑组加德纳菌的数量降低了约2个数量级，但B3、B7、A1、A3治疗组小鼠阴道内乳杆菌的数量比甲硝唑组和感染对照组高出约3个数量级；治疗后第6天格氏乳杆菌 B3、B7组的小鼠阴道内定殖的加德纳菌数量略高于甲硝唑组，但比感染对照组低200～300倍，A1和A3组定殖的加德纳菌数量比感染组低2个数量级，而B3、B7、A1、A3治疗组小鼠阴道内乳杆菌的数量仍然高出甲硝唑组和感染对照组约3个数量级；说明格氏乳杆菌B3、B7以及卷曲乳杆菌A1 和A3均能很好地定殖在阴道内并将阴道内乳杆菌数量恢复到正常水平以上，同时可以稳定地抑制阴道加德纳菌的繁殖。

2.治疗前后小鼠外阴观察

观察并记录各组小鼠外阴红肿、阴道分泌物多少的情况，并取各组典型小鼠做阴道灌洗液涂片(PAS染色)

表7 治疗后小鼠外阴红肿及分泌物等炎症情况

组别	水肿	分泌物
			健康对照组	-	不明显
感染对照组	+++	多/稀薄
			甲硝唑组	+	少量
格氏乳杆菌B3组	+	少量
			格氏乳杆菌B7组	+	少量
卷曲乳杆菌A3组	+	少量
			卷曲乳杆菌A1组	+	少量

表7显示了阴道加德纳菌定殖在小鼠阴道引起的炎症反应情况，感染对照组小鼠外阴出现大量的水肿、分泌物多且呈稀薄泡沫状，PAS染色结果显示阴道粘膜表层出现炎症细胞额致密浸润，表明造模成功；经过格氏乳杆菌 B3、B7、卷曲乳杆菌A1、A3菌液治疗后小鼠外阴水肿和分泌物多等症状均有明显缓减，阴道灌洗液PAS染色结果显示小鼠阴道分泌物中白细胞数目明显减少，大部分是阴道上皮细胞，说明小鼠阴道粘膜的损伤已经得到了很大程度地恢复。

上述结果表明，本发明中的格氏乳杆菌B3、B7、卷曲乳杆菌A1、A3均具有调节阴道菌群平衡、抑制阴道加德纳菌生长和定殖的作用，可用于预防与治疗细菌性阴道炎。

实施例9 对小鼠阴道白念珠菌模型的影响

取SPF级6～8周的C57BL/6雌性小鼠50只，随机分为5组：健康对照组、感染对照组、克霉唑组、格氏乳杆菌B3组、格氏乳杆菌B7组、卷曲乳杆菌A1组和A3组，每组10只。除健康对照组外，其它各组用微量加样器取50μL一定浓度的盐酸林可霉素溶液进行小鼠阴道冲洗，每天1次，连续 5天，之后用微量加样器取白色念珠菌(2.5×10⁷CFU/mL)20μL接种小鼠阴道内，连续接种6天，每天1次，造成小鼠阴道白色念珠菌感染模型，正常组每天每次注入相同体积的生理盐水，连续11天。

将格氏乳杆菌B3、B7以及卷曲乳杆菌A1、A3组从新鲜培养的MRS平板上挑取单菌落接种至MRS液体培养基中，37℃，静置厌氧培养24小时，离心，将菌泥用PBS液重悬，用流式细胞仪调整浓度为1×10⁹CFU/mL。给两组格氏乳杆菌组小鼠、两组卷曲乳杆菌组小鼠的阴道分别灌注B3、B7、 A1、A3菌液20μL，连续3天，每天1次；克霉唑组小鼠阴道注入20μL克霉唑溶液，连续3天，每天1次；健康对照组和感染对照组的小鼠每天阴道给予相同体积的生理盐水，连续3天，每天1次。

1.小鼠阴道菌群的测定与分析

用微量加样器取50μL生理盐水，取部分小鼠分别于造模后给药前、给药结束后第1天、给药结束后第6天反复冲洗小鼠阴道5-6次，取30μL上述阴道灌洗液分别做白念珠菌和乳杆菌的菌落计数，结果见表8。

依选择性培养基菌落形态，涂片染色镜检，进行初步鉴定。

表8 各组灌洗液菌落计数结果

从上表可以看出：

(1)格氏乳杆菌B3、B7治疗组的小鼠在治疗后第一天，其阴道内白色念珠菌定殖的数量与感染对照组相比均降了一个数量级，而克霉唑组小鼠阴道内白色念珠菌数量的3～4倍，但其阴道内乳杆菌的数量比克霉唑组均高出约3个数量级；治疗后第6天，经格氏乳杆菌B3、B7治疗的小鼠阴道内定殖的白色念珠菌数量均与克霉唑组相当，远小于感染对照组，而小鼠阴道内乳杆菌的数量仍然高出克霉唑组和感染对照组约3个数量级；说明格氏乳杆菌B3、B7都能很好地定殖在阴道内并将阴道内乳杆菌数量恢复到正常水平以上，同时可以稳定地抑制白色念珠菌的繁殖。

(2)卷曲乳杆菌A1、A3治疗组的小鼠在治疗后第一天，其阴道内白色念珠菌定殖的数量与感染对照组相比均降了一个数量级而稍高于克霉唑组，但其阴道内乳杆菌的数量比克霉唑组均高出约3个数量级；治疗后第6天，经卷曲乳杆菌A1、A3治疗的小鼠阴道内定殖的白色念珠菌数量均与克霉唑组相当，远小于感染对照组，而小鼠阴道内乳杆菌的数量仍然高出克霉唑组和感染对照组约3个数量级；说明卷曲乳杆菌A1、A3都能很好地定殖在阴道内并将阴道内乳杆菌数量恢复到正常水平以上，同时可以稳定地抑制白色念珠菌的繁殖。

2.治疗前后小鼠外阴观察

观察并记录各组小鼠外阴红肿、阴道分泌物多少的情况，并取各组典型小鼠做阴道灌洗液涂片(巴氏染色)

表9 治疗后小鼠外阴红肿及分泌物等炎症情况

组别	红肿	分泌物	阴道充血
				健康对照组	-	不明显	-
感染对照组	+++	多/块状	+++
				克霉唑组	+	少量	+
格氏乳杆菌B3组	+	少量	+
				格氏乳杆菌B7组	+	少量	+
卷曲乳杆菌A3组	+	少量	+
				卷曲乳杆菌A1组	+	少量	+

表9显示了白色念珠菌定殖在小鼠阴道引起的炎症反应情况，感染对照组小鼠外阴出现较大程度的红肿、分泌物多且成块状、阴道充血严重等典型的念珠菌症状，表明造模成功；经格氏乳杆菌B3菌液、B7菌液、或者卷曲乳杆菌A1菌液、A3菌液治疗后，两组小鼠外阴红肿、阴道充血和分泌物等症状均有明显减轻。

同时，阴道灌洗液PAS染色结果显示健康对照组的小鼠阴道上皮细胞占多数，白细胞数目较少，而白色念珠菌定殖的感染对照组小鼠阴道上皮细胞较少，白细胞数目较多，说明小鼠的阴道粘膜被严重破坏，经格氏乳杆菌B3 菌液、B7菌液、或者卷曲乳杆菌A1菌液、A3菌液治疗后小鼠阴道的白细胞数目明显减少，并且上皮细胞占多数，说明小鼠阴道粘膜的破损已经得到了恢复。

以上结果表明，本发明中的格氏乳杆菌B3、B7、卷曲乳杆菌A1、A3具有调节阴道菌群、抑制阴道白色念珠菌生长和定殖的作用，可用于预防与治疗念珠菌性阴道炎。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海上药信谊药厂有限公司

<120> 一种产乳酸和H2O2的乳杆菌及其应用

<130> P180115573C

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1200

<212> DNA

<213> Lactobacillus gasseri

<400> 1

tggttacctt gttacgactt caccctaatc atctgtccta ccttagacgg ctgactccta 60

taaaggttat cccaccggct ttgggtgtta cagactctca tggtgtgacg ggcggtgtgt 120

acaaggcccg ggaacgtatt caccgcggcg tgctgatccg cgattactag cgattccagc 180

ttcgtgtagg cgagttgcag cctacagtcc gaactgagaa cggctttcag agatccgctt 240

gccttcgcag gttcgcttct cgttgtaccg tccattgtag cacgtgtgta gcccaggtca 300

taaggggcat gatgacttga cgtcatcccc accttcctcc ggtttgtcac cggcagtctc 360

attagagtgc ccaacttaat gatggcaact aatgacaagg gttgcgctcg ttgcgggact 420

taacccaaca tctcacgaca cgagctgacg acagccatgc accacctgtc tcagcgtccc 480

cgaagggaac tcctaatctc ttaggtttgc actggatgtc aagacctggt aaggttcttc 540

gcgttgcttc gaattaaacc acatgctcca ccgcttgtgc gggcccccgt caattccttt 600

gagtttcaac cttgcggtcg tactccccag gcggagtgct taatgcgtta gctgcagcac 660

tgagaggcgg aaacctccca acacttagca ctcatcgttt acggcatgga ctaccagggt 720

atctaatcct gttcgctgcc catgctttcg agcctcagcg tcagttgcag accagagagc 780

cgccttcgcc actggtgttc ttccatatat ctacgcattc caccgctaca catggagttc 840

cactctcctc ttctgcactc aagttcaaca gtttctgatg caattctccg gttgagccga 900

aaggctttca catcagactt attgaaccgc ctgcactcgc tttacgccca ataaatcccg 960

gacaacgctt gccacctacg tattaccgcg gctgctggca cgtagttagc cgtgactttc 1020

tagtattacg tcaaataaag ccagttacta cctctatctt tctcactaca acagagcttt 1080

acgagcggaa accctctcac tccacgcggc gttgctcatc agactgcgtc attggtgaga 1140

ttcgtactgc tgctcccgta ggagttggac cgcgttctct caagttccca aaggtgtggg 1200

<210> 2

<211> 1191

<212> DNA

<213> Lactobacillus gasseri

<400> 2

tggttacctt gttacgactt caccctaatc atctgtccta ccttagacgg ctgactccta 60

taaaggttat cccaccggct ttgggtgtta cagactctca tggtgtgacg ggcggtgtgt 120

acaaggcccg ggaacgtatt caccgcggcg tgctgatccg cgattactag cgattccagc 180

ttcgtgtagg cgagttgcag cctacagtcc gaactgagaa cggctttcag agatccgctt 240

gccttcgcag gttcgcttct cgttgtaccg tccattgtag cacgtgtgta gcccaggtca 300

taaggggcat gatgacttga cgtcatcccc accttcctcc ggtttgtcac cggcagtctc 360

attagagtgc ccaacttaat gatggcaact aatgacaagg gttgcgctcg ttgcgggact 420

taacccaaca tctcacgaca cgagctgacg acagccatgc accacctgtc tcagcgtccc 480

cgaagggaac tcctaatctc ttaggtttgc actggatgtc aagacctggt aaggttcttc 540

gcgttgcttc gaattaaacc acatgctcca ccgcttgtgc gggcccccgt caattccttt 600

gagtttcaac cttgcggtcg tactccccag gcggagtgct taatgcgtta gctgcagcac 660

tgagaggcgg aaacctccca acacttagca ctcatcgttt acggcatgga ctaccagggt 720

atctaatcct gttcgctgcc catgctttcg agcctcagcg tcagttgcag accagagagc 780

cgccttcgcc actggtgttc ttccatatat ctacgcattc caccgctaca catggagttc 840

cactctcctc ttctgcactc aagttcaaca gtttctgatg caattctccg ggttgagccg 900

aaaggctttc acatcagact tattgaaccg cctgcactcg ctttacgccc aataaatccg 960

ggacacgctt gccacctacg tattaccgcg gctgctgcac gtagttagcc gtgactttct 1020

aagtatacgt caaataaagg ccagttacta ctctatcttt tcttcactac aacagaagct 1080

ttacgagcga agccctcctc actccacgcg gcgtggctca atcgaacttg cgtctatggg 1140

agattctact gctgctccgt agagcttggc cggtgatcct cagtttccaa a 1191

<210> 3

<211> 1153

<212> DNA

<213> Lactobacillus crispatus

<400> 3

tagagtttga tcatggctca ggacgaacgc tggcggcgtg cctaatacat gcaagtcgag 60

cgagcggaac taacagattt acttcggtaa tgacgttagg aaagcgagcg gcggatgggt 120

gagtaacacg tggggaacct gccccatagt ctgggatacc acttggaaac aggtgctaat 180

accggataag aaagcagatc gcatgatcag cttttaaaag gcggcgtaag ctgtcgctat 240

gggatggccc cgcggtgcat tagctagttg gtaaggtaaa ggcttaccaa ggcgatgatg 300

catagccgag ttgagagact gatcggccac attgggactg agacacggcc caaactccta 360

cgggaggcag cagtagggaa tcttccacaa tggacgcaag tctgatggag caacgccgcg 420

tgagtgaaga aggttttcgg atcgtaaagc tctgttgttg gtgaagaagg atagaggtag 480

taactggcct ttatttgacg gtaatcaacc agaaagtcac ggctaactac gtgccagcag 540

ccgcggtaat acgtaggtgg caagcgttgt ccggatttat tgggcgtaaa gcgagcgcag 600

gcggaagaat aagtctgatg tgaaagccct cggcttaacc gaggaactgc atcggaaact 660

gtttttcttg agtgcagaag aggagagtgg aactccatgt gtagcggtgg aatgcgtaga 720

tatatggaag aacaccagtg gcgaaggcgg ctctctggtc tgcaactgac gctgagggct 780

cgaaagcatg ggtagcgaac aaggattaga taccctggta gtccatgccg taaacgatga 840

gtgctaagtg ttgggaggtt tccgcctctc agtgctgcag ctaacgcatt aagcactccg 900

cctggggagt acgaccgcaa ggttgaaact caaaggaatt gacggggggc cccgcacaag 960

cgtggaagca tgtgttttat ttcgagacag cggtagaacc ttaccagtct tgacatctag 1020

tggcatttgt tagagataca aagttccttt caggaagctt agacatgtgt gcatggcctg 1080

tcttcacttc tgtcctgaga tgttggataa gtccgcgacg aaacgccaac cgtggtatat 1140

gagttacgag cac 1153

<210> 4

<211> 1201

<212> DNA

<213> Lactobacillus crispatus

<400> 4

tggttacctt gttacgactt caccccagtc atctgccctg ccttagacgg ctccttcccg 60

aaggttaggc caccggcttt gggcattgca gactcccatg gtgtgacggg cggtgtgtac 120

aaggcccggg aacgtattca ccgcggcgtg ctgatccgcg attactagcg attccagctt 180

cgtgcagtcg agttgcagac tgcagtccga actgagaaca gctttcagag attcgcttgc 240

cttcgcaggc tcgcttctcg ttgtactgcc cattgtagca cgtgtgtagc ccaggtcata 300

aggggcatga tgacttgacg tcatccccac cttcctccgg tttgtcaccg gcagtctcat 360

tagagtgccc aacttaatgc tggcaactaa taacaagggt tgcgctcgtt gcgggactta 420

acccaacatc tcacgacacg agctgacgac agccatgcac cacctgtctt agcgtccccg 480

aagggaactt tgtatctcta caaatggcac tagatgtcaa gacctggtaa ggttcttcgc 540

gttgcttcga attaaaccac atgctccacc gcttgtgcgg gcccccgtca attcctttga 600

gtttcaacct tgcggtcgta ctccccaggc ggagtgctta atgcgttagc tgcagcactg 660

agaggcggaa acctcccaac acttagcact catcgtttac ggcatggact accagggtat 720

ctaatcctgt tcgctaccca tgctttcgag cctcagcgtc agttgcagac cagagagccg 780

ccttcgccac tggtgttctt ccatatatct acgcattcca ccgctacaca tggagttcca 840

ctctcctctt ctgcactcaa gaaaaacagt ttccgatgca gttcctcggt taagccgagg 900

gctttcacat cagacttatt cttccgccct gcgctcgctt tacgcccaat aaatccggga 960

caacgcttgc cacctacgta ttaccgcggc tgctggcacg gtatttagcc gtgactttct 1020

ggttgattac cgtcaaataa agggccagtt tactaccctc ctattccttc ttcgcaacaa 1080

ccaaagcttt accgatccgg aaaccgttct cacctcacgc cgagctgttg cctccatcag 1140

accttgcgtc ctattggtgg aagaaatttc ccctactggg ctggacctcc cggcaaggga 1200

t 1201

Claims

1.一种产乳酸和H₂O₂的乳杆菌，其特征在于，所述的乳杆菌为格氏乳杆菌（Lactobacillus gasseri）或卷曲乳杆菌（Lactobacilluscrispatus），所述格氏乳杆菌的保藏编号为CGMCC No.15815或者CGMCC No.15816；所述卷曲乳杆菌的保藏编号为CGMCCNo.15813或者CGMCC No.15814。

2.一种培养如权利要求1所述的乳杆菌的方法，其特征在于，其包括如下步骤：在培养基中培养所述的乳杆菌即可。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的培养基为MRS液体培养基；

和/或，所述的培养为厌氧培养。

4.一种菌剂，其活性成分包括至少一种如权利要求1中所述的乳杆菌。

5.一种包含如权利要求1所述的乳杆菌的冻干粉。

6.如权利要求5所述的冻干粉，其特征在于，其通过如下步骤制得：

（1）将权利要求1中所述的乳杆菌与冻干保护剂混合得混合物；

（2）将所述混合物冷冻干燥即得。

7.如权利要求6所述的冻干粉，其特征在于，步骤（1）所述的冻干保护剂包括如下百分比的组分：脱脂奶粉6~12%、谷氨酸钠2~4%以及海藻糖1~6%，以水补足至100%，所述的百分比为质量百分比。

8.如权利要求6所述的冻干粉，其特征在于，步骤（2）所述冷冻干燥的条件为：-52~-48℃预冻2~5小时，然后在-47~-43℃下真空干燥2~48小时，再在26~30℃解析干燥10~40小时。

9.如权利要求6-8任一项所述的冻干粉，其特征在于，步骤（1）中所述的冻干保护剂包括如下百分比的组分：脱脂奶粉7%、谷氨酸钠2%以及海藻糖3%，以水补足至100%，所述的百分比为质量百分比。

10.如权利要求6-8任一项所述的冻干粉，其特征在于，步骤（2）中所述的冷冻干燥的条件为-50℃预冻4小时，然后在-45℃下真空干燥24小时，再在28℃解析干燥20小时。

11. 如权利要求1所述的乳杆菌、如权利要求4所述的菌剂，或者如权利要求5~10任一项所述的冻干粉在制备调节阴道菌群平衡或用于防治阴道疾病的食品、卫生用品或药物中的用途，所述的阴道疾病为加德纳菌（Gardnerella vaginalis）、阿托波菌（Atopobium vaginae）、白色念珠菌（Candida albicans）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）、大肠埃希氏菌（Escherichia coli）、铜绿假单胞菌（Pseudomona aeruginosa）和沙门氏菌（Salmonella sp）中的一种或多种引发的阴道疾病。

12.如权利要求11所述的用途，其特征在于，所述的阴道疾病为阴道炎症性疾病。

13.如权利要求12所述的用途，其特征在于，所述的阴道炎症性疾病包括细菌性阴道炎、念珠菌性阴道炎、滴虫性阴道炎、幼儿性阴道炎、月经性阴道炎、老年性阴道炎和混合感染性阴道炎。