CN112342154B - 用于预防和治疗女性生殖道炎症的益生菌 - Google Patents

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Abstract

用于预防和治疗女性生殖道炎症的益生菌。一种产乳酸和H2O2的乳杆菌、其菌体裂解成分或者代谢产物，所述乳杆菌选自卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)、格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)或唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)，其中所述卷曲乳杆菌的保藏编号为CGMCC No.19239；所述格氏乳杆菌的保藏编号为CGMCC No.19238；所述唾液乳杆菌的保藏编号为CGMCC No.19236。

Description

用于预防和治疗女性生殖道炎症的益生菌
技术领域
本发明涉及到用于预防和治疗女性生殖道炎症的益生菌，该益生菌能够调节阴道微环境，抑制阴道致病菌的生长，因此，可以预防和辅助治疗女性生殖道炎症。
背景技术
健康妇女阴道内存在多种微生物，它们与宿主、环境之间构成了相互制约、相互协调、动态平衡的阴道微生态系统。文献报道健康妇女的阴道菌群主要由乳杆菌构成，且某一种的乳杆菌占绝对优势。正常情况下乳杆菌对阴道可以起到保护作用，而以乳杆菌占优势的阴道微生态的紊乱则可以导致阴道炎。
细菌性阴道病(BV)的发生是由于阴道菌群失调，宿主自身的乳杆菌减少而导致其他条件性病原微生物如加德纳菌、各种厌氧菌、弯曲弧菌等大量繁殖。BV实际上是以加德纳菌为主的一种混合感染。BV与许多严重的妇产科合并症有直接关系，包括与盆腔炎、不孕、不育、流产、妇科和产科手术后感染、早产、胎膜早破、新生儿感染和产褥感染等的发生有关。有文献报道BV发病率约为5.3％，而在妊娠妇女中，BV发病率为20％左右。病患在使用甲硝唑治愈后4周内的复发率为15～25％，3个月内复发率为30％，9个月复发率高达80％。
抗生素是目前针对BV的首选治疗方法。BV治疗指南中首先推荐口服和/或阴道内甲硝唑用药治疗。虽然这些药物有效，但治疗1-3个月内约30％患者会有复发。由于副作用，例如胃肠不适、金属味、酒精不耐受和罕见的神经系统及其他器官系统不良反应，患者口服甲硝唑治疗常常耐受度较差。
甲硝唑可能的副作用在妊娠女性中特别引起关注，在需要重复和延长甲硝唑疗程的复发性疾病患者中更加明显。此外，应用抗生素治疗，虽然可暂时缓解BV的症状，但也使本已减少的乳杆菌进一步减少，加重阴道微生态失调，从而使BV反复复发。因此，如何控制复发、彻底根治细菌性阴道病是妇产科医生亟需解决的棘手问题。
目前，科学研究结果表明产乳酸、H2O2的乳杆菌是健康妇女阴道内的优势菌，是保护女性阴道免受病原体感染的重要因素。此外，这些优势乳杆菌还可以代谢产生一些有效抑制其他细菌特别是致病菌生长繁殖的细菌素。
健康妇女阴道内存在多种乳杆菌，不同人的阴道菌群中占优势的乳杆菌菌种具有个体差异性，且同一种乳杆菌各株间抗致病菌能力差异明显。选择乳杆菌益生菌时，需要综合考虑乳杆菌的种类、同种但不同菌株产乳酸和H2O2能力、与阴道上皮细胞黏附的能力，其中乳杆菌能否在阴道成功定殖，是乳杆菌持续作用的基础，也是乳杆菌发挥疗效的关键因素之一。
发明内容
因此，本申请所要解决的技术问题是为了克服现有技术中的乳杆菌产乳酸和H2O2能力弱、黏附能力低以及不能很好地抑制阴道病原菌的繁殖等缺陷。本申请的目的在于提供一种乳杆菌，其具有极强的产乳酸和H2O2能力和很好地黏附能力，并且体内和体外实验中均能够有效地抑制加德纳菌、白念珠菌等病原菌的繁殖。
本申请一方面提供了一种产乳酸和H2O2的乳杆菌、其菌体裂解成分或者代谢产物，所述乳杆菌选自卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)、格氏乳杆菌(Lactobacillusgasseri)或唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)，其中所述卷曲乳杆菌的保藏编号为CGMCC No.19239；所述格氏乳杆菌的保藏编号为CGMCC No.19238；所述唾液乳杆菌的保藏编号为CGMCC No.19236。
本申请还有一个方面提供了包含本申请所述乳杆菌、其菌体裂解成分或者代谢产物的组合物。
在本申请的一个实例中，所述组合物可用于治疗和/或预防阴道炎症相关疾病，所述阴道炎症相关的疾病包括细菌性阴道病、病毒性阴道病、酵母性阴道炎、阴道中的感染、诸如HIV和衣原体感染的性传播疾病、危及孕妇中胎儿的感染、早产和泌尿道感染等。
本申请还有一个方面提供了本申请所述乳杆菌、其菌体裂解成分或者代谢产物在制备治疗和/或预防阴道炎症相关疾病的药物中的用途。
在本申请的一个实例中，所述阴道炎症相关的疾病包括细菌性阴道病、病毒性阴道病、酵母性阴道炎、阴道中的感染、诸如HIV和衣原体感染的性传播疾病、危及孕妇中胎儿的感染、早产和泌尿道感染等。
在本申请的一个实例中，所述药物的剂型包括阴道用片剂、泡腾片、阴道用明胶胶囊、阴道用锭剂、乳膏、凝胶、软膏、洗剂等。
本申请还有一个方面提供了一种用于治疗和/或预防阴道炎症相关疾病的制品，所述制品包括本申请所述的乳杆菌、其菌体裂解成分或者代谢产物。
在本申请的一个实例中，所述制品包括棉塞、卫生巾、月经垫、尿布、肥皂、凝胶、软膏、乳膏、喷雾剂、避孕套和洗剂。
附图说明
图1为本发明的卷曲乳杆菌SIM-61的菌落形态照片
图2为本发明的卷曲乳杆菌SIM-61的革兰氏染色镜检照片
图3为本发明的唾液乳杆菌SIM-70的菌落形态照片
图4为本发明的唾液乳杆菌SIM-70的革兰氏染色镜检照片
图5为本发明的格氏乳杆菌SIM-77的菌落形态照片
图6为本发明的格氏乳杆菌SIM-77的革兰氏染色镜检照片
具体实施方式
在本发明中，如果没有特别的说明，百分数(％)或者份都指相对于组合物的重量百分数或者重量份。
在本发明中，如果没有特别的说明，所涉及的各组分或其优选组分可以相互组合形成新的技术方案。
在本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有实施方式以及优选实施方式可以相互组合形成新的技术方案。
在本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有技术特征以及优选特征可以相互组合形成新的技术方案。
在本发明中，如果没有相反的说明，组合物中各组分的含量之和为100％。
在本发明中，如果没有相反的说明，组合物中各组分的份数之和可以为100重量份。
在本发明中，除非有其他说明，数值范围“a-b”表示a到b之间的任意实数组合的缩略表示，其中a和b都是实数。例如数值范围“0-5”表示本文中已经全部列出了“0-5”之间的全部实数，“0-5”只是这些数值组合的缩略表示。
在本发明中，除非有其他说明，整数数值范围“a-b”表示a到b之间的任意整数组合的缩略表示，其中a和b都是整数。例如整数数值范围“1-N”表示1、2……N，其中N是整数。
在本发明中，除非有其他说明，“其组合”表示所述各元件的多组分混合物，例如两种、三种、四种以及直到最大可能的多组分混合物。
如果没有特别指出，本说明书所用的术语“一种”指“至少一种”。
如果没有特别指出，本发明所述的百分数(包括重量百分数)的基准都是所述组合物的总重量。
本文所公开的“范围”以下限和上限的形式。可以分别为一个或多个下限，和一个或多个上限。给定范围是通过选定一个下限和一个上限进行限定的。选定的下限和上限限定了特别范围的边界。所有可以这种方式进行限定的范围是包含和可组合的，即任何下限可以与任何上限组合形成一个范围。例如，针对特定参数列出了60－120和80－110的范围，理解为60－110和80－120的范围也是预料到的。此外，如果列出的最小范围值1和2，和如果列出了最大范围值3，4和5，则下面的范围可全部预料到：1－3、1－4、1－5、2－3、2－4、和2－5。
在本文中，除非另有说明，各组分的比例或者重量都指干重。
在本文中，除非另有说明，“不变”表示变化在±10％以内，较好在±5％以内，更好在±2％以内，最后在±1％。
本申请一方面提供了一种乳酸和H2O2的乳杆菌、其菌体裂解成分或者代谢产物，所述乳杆菌选自卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)、格氏乳杆菌(Lactobacillusgasseri)或唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)，其中所述卷曲乳杆菌的保藏编号为CGMCC No.19239；所述格氏乳杆菌的保藏编号为CGMCC No.19238；所述唾液乳杆菌的保藏编号为CGMCC No.19236。
生物材料保藏信息
本申请的卷曲乳杆菌SIM-61，已于2019年12月25日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏编号为：CGMCC No.19239，培养物名称是卷曲乳杆菌61，分类命名是卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)。
本申请的格氏乳杆菌SIM-77，均已于2019年12月25日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏编号为：CGMCC No.19238，培养物名称分别是格氏乳杆菌77分类命名是格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)。
本发明的唾液乳杆菌SIM-70，均已于2019年12月25日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏编号为：CGMCC No.19236，培养物名称是唾液乳杆菌70，分类命名是唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)。
本申请另一方面提供了包含本申请所述乳杆菌、其菌体裂解成分或者代谢产物的组合物。
在本申请的一个优选实例中，所述包含乳杆菌的组合物可用于治疗和/或预防阴道炎症相关疾病。在本申请的一个优选实例中，所述阴道炎症相关的疾病包括但不限于细菌性阴道病、病毒性阴道病、酵母性阴道炎、阴道中的感染、诸如HIV和衣原体感染的性传播疾病、危及孕妇中胎儿的感染、早产和泌尿道感染等。
本申请还有一个方面提供了本申请所述乳杆菌、其菌体裂解成分或者代谢产物在制备治疗和/或预防阴道炎症相关疾病的药物中的用途。在本申请的一个优选实例中，所述阴道炎症相关的疾病包括但不限于细菌性阴道病、病毒性阴道病、酵母性阴道炎、阴道中的感染、诸如HIV和衣原体感染的性传播疾病、危及孕妇中胎儿的感染、早产和泌尿道感染等。
在本申请的一个优选实例中，所述药物的剂型包括但不限于阴道用片剂、阴道用明胶胶囊、阴道用锭剂、泡腾片、乳膏、凝胶、软膏、洗剂等
本申请还有一个方面提供了一种用于治疗和/或预防阴道炎症相关疾病的制品，所述制品包括本申请所述乳杆菌、其菌体裂解成分或者代谢产物。在本申请的一个优选实例中，所述制品包括但不限于棉塞、卫生巾、月经垫、尿布、肥皂、凝胶、软膏、乳膏、喷雾剂、避孕套和洗剂。
下述实施例中所用的实验方法无特殊说明，均为常规方法；所用材料、试剂等，无特殊说明，均可从商业途径得到。
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1：培养基的配制
1.乳杆菌选择性培养基(Rogosa SL Agar)配制：
(1)称取22.5g Rogosa SL Agar培养基粉末放入500mL锥形瓶中，加入300mL去离子水，磁力搅拌充分，然后快速搅拌下加热煮沸1min，密封瓶口；
(2)将上述封口好的锥形瓶放入生物安全柜，紫外线照射20min以上；
(3)待培养基温度降到50-60℃，打开瓶口，加入396μL冰醋酸，再放入微波炉煮沸2-3min，紫外线照射20min以上；
(4)待培养基温度降至室温后倒入培养皿，根据培养皿大小每个皿倒约10-20mL培养基，待冷却凝固后，标记培养基名称及配制日期，放于4℃冰箱待用。
2.MRS固体培养基配制
(1)称取20.46g MRS Agar培养基粉末放入500mL锥形瓶中，再加入300mL去离子水，搅拌溶解，用半透膜封口；
(2)放入高压锅，115℃，灭菌30min；
(3)待培养基温度降至室温后倒入培养皿，根据培养皿大小每个皿倒约10-20mL培养基，待冷却凝固后，标记培养基名称及配制日期，放于4℃冰箱待用；
3.MRS液体培养基配制
(1)称取15.66g MRS培养基粉末放入500mL锥形瓶中，再加入300mL去离子水，搅拌溶解，用半透膜封口；
(2)放入高压锅，115℃，灭菌30min；
(3)待培养基温度降至室温后倒入培养皿，根据培养皿大小每个皿倒约10-20mL培养基，待冷却凝固后，标记培养基名称及配制日期，放于4℃冰箱待用。
4.过氧化氢(H2O2)半定量培养基配制
(1)同MRS固体培养基配制步骤(1)、(2)；
(2)待高压锅无压力后取出放入生物安全柜，稍冷却(70-80℃)，加入TMB(终浓度0.25mg/mL)，摇匀，再冷却到40℃左右时加入辣根过氧化物酶(终浓度0.01mg/mL)，混匀，边摇边倒入培养皿，待培养基冷却凝固后，标记培养基名称及配制日期，用保鲜膜包裹后放入4℃冰箱待用。
实施例2：卷曲乳杆菌、格氏乳杆菌和唾液乳杆菌菌株的分离、纯化、增菌培养
1.乳杆菌菌株的分离、纯化和增菌培养
招募数名没有阴道感染或者任何肠道疾病的健康育龄期女性参与提供样品，参与者均通过了体检中心的健康检查，并通过调查问卷提供了关于她们的年龄(21-30)、月经周期以及其他健康行为等的信息。样品采集前2周开始，所有参与者避免所有类型的含有益生菌的配方，样品收集采用美国BD公司的Port.A-Cd系统，用两个无菌棉拭子采集受试者阴道侧壁1/3处的分泌物，放入无菌管中，迅速用冰袋运送到实验室生物安全柜中，用少量无菌PBS冲洗拭子后的菌悬液作为母液，然后用无菌PBS稀释到不同浓度，涂布于新鲜配置好的Rogosa SL固体培养基上，标记信息，将培养皿置于培养盒中，并放入厌氧产气袋，置于37℃培养箱，培养48-72小时。
从培养好的Rogosa SL平板上，用接种环分别挑取不同形态(表面、边缘、颜色、大小等)的单菌落，按八区划线法接种至新鲜配制的MRS固体培养基上，将培养皿置于培养盒中，并放入厌氧产气袋，置于37℃培养箱，培养24-72小时，获得纯化的单菌落，用接种环挑取单菌落接种至MRS液体培养基，置于37℃培养箱，厌氧培养24小时，得到多个新的乳杆菌菌株，即卷曲乳杆菌SIM-61、格氏乳杆菌SIM-77和唾液乳杆菌SIM-70。
从“1药网”上的“北京隆元康药房”购买了一盒“定君生”药品。在生物安全柜中打开包装盒，取一粒胶囊并打开胶囊壳，将胶囊壳内的菌粉倒入10mL无菌PBS溶液中，涡旋振荡混匀，记为10-1稀释度，然后继续进行10倍梯度稀释至10-4，从10-3、10-4稀释度各取100μL分别涂布MRS固体培养基平板，37℃，厌氧培养24-48小时；待MRS固体培养基上长出单菌落，用接种环挑取单菌落接种至MRS液体培养基，置于37℃培养箱，厌氧培养16-24小时；培养结束后，离心，去掉部分上清，将菌体重悬，再加入等体积20％甘油，涡旋振荡混匀，分装到冻存管中，-80℃保藏，即得对照菌株德氏乳杆菌DM8909。
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的两种阴道用益生菌保健品，其中一种含有鼠李糖乳杆菌PB01和格氏乳杆菌EB01，另外一种含有鼠李糖乳杆菌GR-1和发酵乳杆菌RC-14；菌株分离方法与德氏乳杆菌DM8909类似。待MRS固体培养基上长出单菌落，发现每种产品的MRS固体培养基上有两种不同的菌落形态，用接种环分别挑取不同形态的单菌落接种至MRS液体培养基，置于37℃培养箱，厌氧培养16-24小时；培养结束后，分别离心，去掉部分上清，将菌体重悬，再加入等体积20％甘油，涡旋振荡混匀，分装到冻存管中，-80℃保藏,从而获得鼠李糖乳杆菌GR-1和PB01。
2.乳杆菌的鉴定及保藏
(1)培养特性、染色镜检及形态学特征
针对上述卷曲乳杆菌SIM-61：培养后得到的乳杆菌菌落如图1，菌落呈灰白色圆形，中间饱满，周围弥散，不规则。取该菌纯培养物涂片进行革兰氏染色，结果见图2，呈现革兰氏阳性，短杆状，可连成长链，初步判定为乳杆菌属。
针对上述格氏乳杆菌SIM-77：培养后得到的乳杆菌菌落如图3，菌落呈灰白色圆形，取该菌纯培养物涂片进行革兰氏染色，结果见图4，呈现革兰氏阳性，短杆状，可连成长链，初步判定为乳杆菌属。
针对上述唾液乳杆菌SIM-70：培养后得到的乳杆菌菌落如图5，菌落呈乳白色圆形、饱满，取该菌纯培养物涂片进行革兰氏染色，结果见图6，呈现革兰氏阳性，短杆状，可连成长链，初步判定为乳杆菌属。
(2)16S rRNA基因序列鉴定
采用直接进行PCR扩增的试剂盒，引物采用27F(5'AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG3')和1492R(5'TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T 3')进行PCR扩增，取PCR产物进行凝胶电泳，确定16S rRNA基因片段，若凝胶电泳结果表明PCR成功，则将PCR样品送到基因测序公司进行16S rRNA测序。测序得到的序列与NCBI数据库中的数据进行BLAST序列相似性比较分析，根据最高同源性分值大于97％，确定所分离得到的菌株中有120株为乳杆菌属的卷曲乳杆菌，有113株为乳杆菌属的格氏乳杆菌，8株为乳杆菌属的唾液乳杆菌。
卷曲乳杆菌SIM-61的16S rRNA序列为说明书所附的Seq.ID No.：1。
格氏乳杆菌SIM-77的16S rRNA序列为说明书所附的Seq.ID No.：2。
唾液乳杆菌SIM-70的16S rRNA序列为说明书所附的Seq.ID No.：3。
实施例3：卷曲乳杆菌、格氏乳杆菌和唾液乳杆菌的代谢产物测定
1.卷曲乳杆菌、格氏乳杆菌和唾液乳杆菌发酵液中的乳酸含量测定
对实施例2获得的乳杆菌进行耐氧、耐低温等抗逆性能初步测试，筛选获得5株卷曲乳杆菌、3株格氏乳杆菌和7株唾液乳杆菌。采用D-乳酸检测试剂盒(Sigma)和L-乳酸检测试剂盒(Sigma)测定分离到的5株卷曲乳杆菌、3株格氏乳杆菌、7株唾液乳杆菌和对照菌株德氏乳杆菌DM8909、鼠李糖乳杆菌PB01、鼠李糖乳杆菌GR-1、ATCC标准菌株33820(购自ATCC)在MRS培养基中发酵48小时后发酵液中乳酸的含量。测定结果显示：
(1)5株卷曲乳杆菌中，SIM-61的产乳酸能力最强，各对照商业菌株(德氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌PB01、鼠李糖乳杆菌GR-1)的乳酸产量如表1所示。
(2)3株格氏乳杆菌中，SIM-77的产乳酸能力最强，各对照商业菌株(德氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌PB01、鼠李糖乳杆菌GR-1和ATCC 33820)的乳酸产量如表1所示。
(3)7株唾液乳杆菌中，SIM-70的产乳酸能力最强，各对照商业菌株(德氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌PB01、鼠李糖乳杆菌GR-1和ATCC 33820)的乳酸产量如表1所示。
表1乳杆菌61、77、70和对照菌株发酵液中乳酸含量测定结果
样品 L-乳酸(g/L) D-乳酸(g/L) 乳酸总含量(g/L)
卷曲乳杆菌SIM-61 13.50 2.31 15.81
格氏乳杆菌SIM-77 7.18 7.51 14.69
唾液乳杆菌SIM-70 10.05 7.18 17.23
德氏乳杆菌 5.27 6.18 11.45
鼠李糖乳杆菌PB01 11.30 0.32 11.62
鼠李糖乳杆菌GR-1 13.40 0.21 13.61
ATCC 33820 6.31 4.28 10.59
2.卷曲乳杆菌、格氏乳杆菌和唾液乳杆菌产H2O2能力测定
根据Mcgroarty等的过氧化物酶法(具体参见McGroarty JA,Tomeczek L,PondDG,Reid G,Bruce AW.，"Hydrogen peroxide production by Lactobacillus species:correlation with susceptibility to the spermicidal compound nonoxynol-9",J.Infect Dis.1992；165:1142-1144)进行5株卷曲乳杆菌、3株格氏乳杆菌、7株唾液乳杆菌产H2O2能力的测定。将新鲜培养好的乳杆菌梯度稀释到一定菌浓，取100μL接种于H2O2鉴定平板上，即涂布于MRS-TMB-HP平板上，37℃，厌氧培养48-72小时，取出平板，在空气中暴露菌体。产H2O2的菌落将变为蓝色，而不产H2O2的菌落不变色，根据变色时间对产生的H2O2进行半定量。
半定量结果显示：
(1)卷曲乳杆菌SIM-61产H2O2的能力优于其它卷曲乳杆菌菌株，也优于ATCC标准菌株33820和商业菌株鼠李糖乳杆菌PB01、鼠李糖乳杆菌GR-1、德氏乳杆菌DM8909。卷曲乳杆菌SIM-61活菌的菌落在1-2min时开始出现微蓝色，3mim时菌落的蓝色进一步加深，5-7min时明显出现大量蓝色；ATCC标准菌株33820的菌落在7-8min时开始出现蓝色，11min时出现大量蓝色；德氏乳杆菌活菌的菌落在3-4min时开始出现蓝色，6-7min时蓝色更深，9-10min时出现大量蓝色；鼠李糖乳杆菌PB01和GR-1的菌落在空气中暴露30min仍然为乳白色。根据表2所示判定标准，卷曲乳杆菌SIM-61代谢产生过氧化氢的能力半定量为+++级，因此，在产H2O2能力方面，卷曲乳杆菌SIM-61强于ATCC标准菌株33820、商业菌株德氏乳杆菌DM8909、鼠李糖乳杆菌PB01和GR-1。
(2)格氏乳杆菌SIM-77产H2O2的能力优于其它格氏乳杆菌菌株，也优于商业菌株鼠李糖乳杆菌PB01、鼠李糖乳杆菌GR-1。格氏乳杆菌SIM-77活菌的菌落在3-4min时开始出现微蓝色，6mim时菌落的蓝色进一步加深，7-10min时明显出现大量蓝色；德氏乳杆菌菌落变蓝时间与SIM-77相当；鼠李糖乳杆菌PB01和GR-1的菌落在空气中暴露30min仍然为乳白色。根据表2所示判定标准，格氏乳杆菌SIM-77代谢产生过氧化氢的能力半定量为+++级，因此，在产H2O2能力方面，格氏乳杆菌SIM-77与德氏乳杆菌DM8909相当，但是强于商业菌株鼠李糖乳杆菌PB01和GR-1。
(3)唾液乳杆菌SIM-70产H2O2的能力优于其它唾液乳杆菌菌株，也优于商业菌株德氏乳杆菌DM8909、鼠李糖乳杆菌PB01、鼠李糖乳杆菌GR-1。唾液乳杆菌SIM-70活菌的菌落在2-3min时开始出现微蓝色，5mim时菌落的蓝色进一步加深，7-8min时明显出现大量蓝色；德氏乳杆菌DM8909活菌的菌落在3-4min时开始出现蓝色，6-7min时蓝色更深，9-10min时出现大量蓝色；鼠李糖乳杆菌PB01和GR-1的菌落在空气中暴露30min仍然为乳白色。根据表2所示判定标准，唾液乳杆菌SIM-70代谢产生过氧化氢的能力半定量为+++级，因此，在产H2O2能力方面，唾液乳杆菌SIM-70强于德氏乳杆菌DM8909、商业菌株鼠李糖乳杆菌PB01和GR-1。
表2H2O2半定量判定标准
菌落变色时间 H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>半定量级别
<10分钟 +++
10-<20分钟 ++
20-30分钟 +
>30分钟或不变色 -
以上结果表明本发明筛选到的卷曲乳杆菌SIM-61、格氏乳杆菌SIM-77、唾液乳杆菌SIM-70都具有很强的产乳酸和H2O2能力，可帮助快速恢复阴道微环境并维持阴道微生态的平衡。
实施例4：卷曲乳杆菌、格氏乳杆菌和唾液乳杆菌的抑菌性能
1.卷曲乳杆菌、格氏乳杆菌、唾液乳杆菌和德氏乳杆菌体外抑制阴道加德纳菌的实验
卷曲乳杆菌SIM-61、格氏乳杆菌SIM-77、唾液乳杆菌SIM-70和德氏乳杆菌DM8909在37℃厌氧静置培养24小时，分别接种4个菌的菌液各10μL于MRS琼脂平板上，每个菌做三个重复平行，37℃，厌氧培养48小时。取一定量新鲜培养的阴道加德纳菌(购买自ATCC)种子液接种于5mL BHI液体培养基中，37℃，厌氧静置培养48小时；吸取100mL还未凝固的BHI固体培养基，加入5mL马血清及2mL加德纳菌液混合均匀后，吸取8mL，平铺于培养48小时后的乳杆菌MRS琼脂平板上，37℃，厌氧培养，直至乳杆菌周围出现抑菌圈。用游标卡尺测量抑菌圈的直径：
(1)卷曲乳杆菌SIM-61的抑菌圈是35.72±0.07mm，而德氏乳杆菌DM8909的抑菌圈是21.57±0.14mm，说明卷曲乳杆菌SIM-61抑制阴道加德纳菌生长的能力均强于德氏乳杆菌DM8909；
(2)格氏乳杆菌SIM-77的抑菌圈是34.85±0.07mm，而德氏乳杆菌DM8909的抑菌圈是21.57±0.14mm，说明格氏乳杆菌SIM-77抑制阴道加德纳菌生长的能力均强于德氏乳杆菌DM8909。
(3)唾液乳杆菌SIM-70的抑菌圈是37.16±0.13mm，而德氏乳杆菌DM8909的抑菌圈是21.57±0.14mm，说明唾液乳杆菌SIM-70抑制阴道加德纳菌生长的能力均强于德氏乳杆菌DM8909。
2.卷曲乳杆菌SIM-61、格氏乳杆菌SIM-77、唾液乳杆菌SIM-70和德氏乳杆菌DM8909体外抑制阿托波菌(购买自ATCC)的实验
卷曲乳杆菌SIM-61、格氏乳杆菌SIM-77、唾液乳杆菌SIM-70和德氏乳杆菌DM8909在37℃厌氧静置培养24小时，分别接种4个菌的菌液各10μL于MRS平板上，每个菌做三个重复平行，37℃，厌氧培养48小时；调整37℃厌氧培养好的阿托波菌浓度，使其OD600为0.3。蘸取此阿托波菌液，均匀涂布在整个哥伦比亚血平板表面；将培养好的卷曲乳杆菌SIM-61、格氏乳杆菌SIM-77、唾液乳杆菌SIM-70和德氏乳杆菌DM8909，按压打孔并用镊子将菌饼取出，倒置在涂布有阿托波菌的哥伦比亚血平板上，37℃，厌氧培养直至抑菌圈明显出现。用游标卡尺测量抑菌圈的直径：
(1)卷曲乳杆菌SIM-61的抑菌圈是30.79±0.08mm，而德氏乳杆菌DM8909的抑菌圈是19.56±0.12mm，说明卷曲乳杆菌SIM-61抑制阴道阿托波菌生长的能力均强于德氏乳杆菌DM8909；
(2)格氏乳杆菌SIM-77的抑菌圈是27.69±0.05mm，而德氏乳杆菌DM8909的抑菌圈是19.56±0.12mm，说明卷曲乳杆菌A1和A3抑制阴道阿托波菌生长的能力均强于德氏乳杆菌DM8909。
(3)唾液乳杆菌SIM-70的抑菌圈是28.94±0.04mm，而德氏乳杆菌DM8909的抑菌圈是19.56±0.12mm，说明卷曲乳杆菌A1和A3抑制阴道阿托波菌生长的能力均强于德氏乳杆菌DM8909。
3.卷曲乳杆菌SIM-61、格氏乳杆菌SIM-77、唾液乳杆菌SIM-70和德氏乳杆菌DM8909体外抑制白色念珠菌(购自ATCC)的实验
将10μL卷曲乳杆菌SIM-61、格氏乳杆菌SIM-77、唾液乳杆菌SIM-70和德氏乳杆菌DM8909新鲜菌液分别接种到MRS平板上，37℃，厌氧培养48小时；取100μL白色念珠菌新鲜菌液于5mL soft YM agar(0.4％琼脂，50℃水浴)中混合均匀，倾倒在已培养48小时的卷曲乳杆菌SIM-61、格氏乳杆菌SIM-77、唾液乳杆菌SIM-70和德氏乳杆菌DM8909的MRS平板上；待其凝固后，37℃，有氧培养，直至乳杆菌周围出现抑菌圈，用游标卡尺测量抑菌圈的直径：
(1)卷曲乳杆菌SIM-61的抑菌圈是38.21±0.05mm，而德氏乳杆菌DM8909的抑菌圈是24.43±0.14mm，说明卷曲乳杆菌SIM-61抑制阴道白色念珠菌生长的能力均强于德氏乳杆菌DM8909；
(2)格氏乳杆菌SIM-77的抑菌圈是36.68±0.08mm，而德氏乳杆菌DM8909的抑菌圈是24.43±0.14mm，说明格氏乳杆菌SIM-77抑制阴道白色念珠菌生长的能力均强于德氏乳杆菌DM8909。
(3)唾液乳杆菌SIM-70的抑菌圈是37.69±0.09mm，而德氏乳杆菌的抑菌圈是24.43±0.14mm，说明唾液乳杆菌SIM-70抑制阴道白色念珠菌生长的能力均强于德氏乳杆菌DM8909。
4.卷曲乳杆菌SIM-61、格氏乳杆菌SIM-77、唾液乳杆菌SIM-70和德氏乳杆菌DM8909体外对病原菌金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌和沙门氏菌的抑制作用
将5μL卷曲乳杆菌SIM-61、格氏乳杆菌SIM-77、唾液乳杆菌SIM-70和德氏乳杆菌DM8909新鲜菌液分别接种到MRS平板上，37℃，厌氧培养48小时；分别取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、沙门氏菌和大肠埃希菌(沙门氏菌购自CMCC，其它三个购自ATCC)新鲜菌液100μL加到5mL的营养琼脂(0.4％琼脂，50℃水浴)中，混合均匀，然后倾倒在已经培养48小时的卷曲乳杆菌SIM-61、格氏乳杆菌SIM-77、唾液乳杆菌SIM-70和德氏乳杆菌的MRS平板上，待其凝固后，37℃，5％CO2培养，直至乳杆菌周围出现抑菌圈，用游标卡尺测量抑菌圈的直径，结果见表3。由表3可知，卷曲乳杆菌SIM-61、格氏乳杆菌SIM-77、唾液乳杆菌SIM-70对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠埃希氏菌的抑菌效果均优于德氏乳杆菌；三株格氏乳杆菌对铜绿假单胞菌的抑制作用最强，抑菌圈直径均大于95mm；三株卷曲乳杆菌对铜绿假单胞菌的抑制作用最强，抑菌圈直径均大于88mm。
表3抑菌圈直径(mm)
病原菌 SIM-61 SIM-77 SIM-70 德氏乳杆菌
金黄色葡萄球菌 48.89 45.59 50.78 38.84
大肠埃希氏菌 59.36 57.48 62.75 44.38
铜绿假单胞菌 >95 >95 >95 >95
沙门氏菌 57.39 60.42 58.12 46.64
实施例5：细胞黏附力实验
根据黏附在阴道上皮细胞单细胞层上的乳杆菌个数确定不同乳杆菌的黏附性能。具体方法如下：取人类阴道上皮细胞Vk2/E6E7和人子宫颈癌上皮细胞HeLa(购自ATCC)，将细胞以4.5×106cells/孔的密度接种于12孔板中，待培养48小时后Vk2/E6E7形成单细胞层。每孔以不同数量的CFU分别加入德氏乳杆菌DM8909和卷曲乳杆菌SIM-61、格氏乳杆菌SIM-77、唾液乳杆菌SIM-70，黏附4小时，黏附过程中在摇床上轻轻振荡，各组分别设有三个平行试验。黏附结束后，用1mL 0.05％tritonX-100裂解细胞，制成悬浮菌液，稀释，分别取100μL菌液均匀地涂布于MRS平板上；厌氧培养48小时后，统计每个平板的克隆数。结果显示：
(1)卷曲乳杆菌SIM-61的4小时黏附率分别为78.4％和60.1％，德氏乳杆菌菌株DM89094小时黏附率分别为30.3％和27.9％，卷曲乳杆菌SIM-61的粘附力高于德氏乳杆菌菌株DM8909；
(2)格氏乳杆菌SIM-77的4小时黏附率分别为80.5％和78.9％，德氏乳杆菌菌株DM89094小时黏附率分别为30.3％和27.9％，格氏乳杆菌SIM-77的粘附力高于德氏乳杆菌菌株DM8909。
(3)唾液乳杆菌SIM-70的4小时黏附率分别为68.2％和66.3％，德氏乳杆菌菌株DM89094小时黏附率分别为30.3％和27.9％，唾液乳杆菌SIM-70的粘附力高于德氏乳杆菌菌株DM8909。
实施例8：对小鼠阴道白念珠菌模型的影响
取SPF级6-8周的C57BL/6雌性小鼠50只，随机分为6组：健康对照组、感染对照组、克霉唑组、卷曲乳杆菌SIM-61、格氏乳杆菌SIM-77、唾液乳杆菌SIM-70，每组10只。除健康对照组外，其它各组用微量加样器取50μL一定浓度的盐酸林可霉素溶液进行小鼠阴道冲洗，每天1次，连续5天，之后用微量加样器取白色念珠菌(2.0×107CFU/mL)20μL接种小鼠阴道内，连续接种6天，每天1次，造成小鼠阴道白色念珠菌感染模型。正常组每天每次注入相同体积的生理盐水，连续11天。
将卷曲乳杆菌SIM-61、格氏乳杆菌SIM-77、唾液乳杆菌SIM-70从新鲜培养的MRS平板上挑取单菌落接种至MRS液体培养基中，37℃，静置厌氧培养24小时，离心，将菌泥用PBS液重悬，用流式细胞仪调整浓度为1×109CFU/mL。给卷曲乳杆菌SIM-61、格氏乳杆菌SIM-77、唾液乳杆菌SIM-70组小鼠的阴道分别灌注菌液20μL，连续3天，每天1次；克霉唑组小鼠阴道注入20μL克霉唑溶液，连续7天，每天1次；健康对照组和感染对照组的小鼠每天阴道给予相同体积的生理盐水，连续3天，每天1次。
1.小鼠阴道菌群的测定与分析
用微量加样器取50μL生理盐水，取部分小鼠分别于造模后给药前、给药结束后第1天、给药结束后第6天反复冲洗小鼠阴道5-6次，取30μL上述阴道灌洗液分别做白念珠菌和乳杆菌的菌落计数，结果见表5。
根据选择性培养基菌落形态，涂片染色镜检，进行初步鉴定。
表5各组灌洗液菌落计数结果
Figure BDA0002665323230000161
从上表可以看出：
卷曲乳杆菌SIM-61、格氏乳杆菌SIM-77、唾液乳杆菌SIM-70治疗组的小鼠在治疗后第一天，其阴道内白色念珠菌定殖的数量与感染对照组相比均降了约20倍，是克霉唑组小鼠阴道内白色念珠菌数量的2-5倍，但其阴道内乳杆菌的数量比克霉唑组均高出约3个数量级；治疗后第6天，经卷曲乳杆菌SIM-61、格氏乳杆菌SIM-77、唾液乳杆菌SIM-70治疗的小鼠阴道内定殖的白色念珠菌数量稍少于克霉唑组，远小于感染对照组，而小鼠阴道内乳杆菌的数量仍然高出克霉唑组和感染对照组约3个数量级；说明格卷曲乳杆菌SIM-61、格氏乳杆菌SIM-77、唾液乳杆菌SIM-70都能很好地定殖在阴道内。
2.治疗前后小鼠外阴观察
观察并记录各组小鼠外阴红肿、阴道分泌物多少的情况，并取各组典型小鼠做阴道灌洗液涂片(巴氏染色)。
表6治疗后小鼠外阴红肿及分泌物等炎症情况
组别 红肿 分泌物 阴道充血
健康对照组 - 不明显 -
感染对照组 +++ 多/块状 +++
克霉唑组 + 少量 +
SIM-61组 + 少量 +
SIM-77组 + 少量 +
SIM-70组 + 少量 +
表6显示了白色念珠菌定殖在小鼠阴道引起的炎症反应情况，感染对照组小鼠外阴出现较大程度的红肿、分泌物多且成块状、阴道充血严重等典型的念珠菌症状，表明造模成功；卷曲乳杆菌SIM-61、格氏乳杆菌SIM-77、唾液乳杆菌SIM-70菌液治疗后，两组小鼠外阴红肿、阴道充血和分泌物等症状均有明显减轻。
同时，阴道灌洗液PAS染色结果显示健康对照组的小鼠阴道上皮细胞占多数，白细胞数目较少，而白色念珠菌定殖的感染对照组小鼠阴道上皮细胞较少，白细胞数目较多，说明小鼠的阴道粘膜被严重破坏，经卷曲乳杆菌SIM-61、格氏乳杆菌SIM-77、唾液乳杆菌SIM-70菌液治疗后小鼠阴道的白细胞数目明显减少，并且上皮细胞占多数，说明小鼠阴道粘膜的破损已经得到了恢复。
以上结果表明，本发明中的卷曲乳杆菌SIM-61、格氏乳杆菌SIM-77、唾液乳杆菌SIM-70菌液治疗后具有调节阴道菌群、抑制阴道白色念珠菌生长和定殖的作用，可用于预防与治疗念珠菌性阴道炎。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海上药信谊药厂有限公司
<120> 用于预防和治疗女性生殖道炎症的益生菌
<130> 204175 1CNCN
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1447
<212> DNA
<213> 卷曲乳杆菌（Lactobacillus crispatus）
<400> 1
cggggccggg gtgcctatac atgcagtcga gcgagcggaa ctaacagatt tacttcggca 60
atgacgttag gaaagcgagc ggcggatggg tgagtaacac gtggggaacc tgccccatag 120
tctgggatac cacttggaaa caggtgctaa taccggataa gaaagcagat cgcatgatca 180
gcttttaaaa ggcggcgtaa gctgtcgcta tgggatggcc ccgcggtgca ttagctagtt 240
ggtaaggtaa aggcttacca aggcgatgat gcatagccga gttgagagac tgatcggcca 300
cattgggact gagacacggc ccaaactcct acgggaggca gcagtaggga atcttccaca 360
atggacgcaa gtctgatgga gcaacgccgc gtgagtgaag aaggttttcg gatcgtaaag 420
ctctgttgtt ggtgaagaag gatagaggta gtaactggcc tttatttgac ggtaatcaac 480
cagaaagtca cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggtg gcaagcgttg 540
tccggattta ttgggcgtaa agcgagcgca ggcggaagaa taagtctgat gtgaaagccc 600
tcggcttaac cgaggaactg catcggaaac tgtttttctt gagtgcagaa gaggagagtg 660
gaactccatg tgtagcggtg gaatgcgtag atatatggaa gaacaccagt ggcgaaggcg 720
gctctctggt ctgcaactga cgctgaggct cgaaagcatg ggtagcgaac aggattagat 780
accctggtag tccatgccgt aaacgatgag tgctaagtgt tgggaggttt ccgcctctca 840
gtgctgcagc taacgcatta agcactccgc ctggggagta cgaccgcaag gttgaaactc 900
aaaggaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc gaagcaacgc 960
gaagaacctt accaggtctt gacatctagt gccatttgta gagatacaaa gttcccttcg 1020
gggacgctaa gacaggtggt gcatggctgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta 1080
agtcccgcaa cgagcgcaac ccttgttatt agttgccagc attaagttgg gcactctaat 1140
gagactgccg gtgacaaacc ggaggaaggt ggggatgacg tcaagtcatc atgcccctta 1200
tgacctgggc tacacacgtg ctacaatggg cagtacaacg agaagcgagc ctgcgaaggc 1260
aagcgaatct ctgaaagctg ttctcagttc ggactgcagt ctgcaactcg actgcacgaa 1320
gctggaatcg ctagtaatcg cggatcagca cgccgcggtg aatacgttcc cgggccttgt 1380
acacaccgcc cgtcacacca tgggagtctg caatgcccaa agccggtggc ctaaccttcg 1440
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<210> 2
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<212> DNA
<213> 格氏乳杆菌（Lactobacillus gasseri）
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acgcatgtct agagtttaaa agatggttct gctatcactc ttggatggac ctgcggtgca 240
ttagctagtt ggtaaggtaa cggcttacca aggcaatgat gcatagccga gttgagagac 300
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<212> DNA
<213> 唾液乳杆菌（Lactobacillus salivarius）
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aaactctcat ggtgtgacgg gcggtgtgta caaggcccgg gaacgtattc accgcgacat 120
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tacgcatttc accgctacac atggagttcc actctcctct tctgcactca agtcttccag 840
tttccaatgc actactccgg ttaagccgaa ggctttcaca tcagacttaa aagaccgcct 900
gcgttccctt tacgcccaat aaatccggac aacgcttgcc acctacgtat taccgcggct 960
gctggcacgt agttagccgt gacttgctgg ttagataccg tcatcgaatg aacagttact 1020
ctcactcgtg ttcttctcta acaacagagt tttacgatcc gaagaccttc ttcactcacg 1080
cggcgttgct ccatcagact tgcgtccatt gtggaagatt ccctactgct gcctcccgta 1140
ggagtttggg ccgtgtctca gtcccaatgt ggccgatcaa cctctcagtt cggctacgta 1200
tcatcacctt ggtaggccgt taccccacca actagttaat acgccgcggg tccatctaaa 1260
agcgatagca gaaccatctt tcatctaagg atcatgcgat ccttagagat atacggtatt 1320
agcacctgtt tccaagtgtt atccccttct tttaggcagg ttacccacgt gttactcacc 1380
cgtccgccac tcaacttctt acggtgaatg caagcattcg gtgtaagaaa gtttcgttcg 1440
actgcatgta taggcacgcc cgcccgttcg 1470

Claims (11)

1.一种产乳酸和H2O2的乳杆菌，所述乳杆菌选自卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)或唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)，其中所述卷曲乳杆菌的保藏编号为CGMCC No.19239；所述唾液乳杆菌的保藏编号为CGMCC No.19236。
2.包含权利要求1所述乳杆菌的活菌组合物。
3.如权利要求2所述的组合物，其中，所述组合物包括卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)、格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)和唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)，其中所述卷曲乳杆菌的保藏编号为CGMCC No.19239；所述格氏乳杆菌的保藏编号为CGMCC No.19238；所述唾液乳杆菌的保藏编号为CGMCC No.19236。
4.如权利要求3所述的组合物，其中，所述组合物可用于治疗和/或预防阴道炎症相关疾病，所述阴道炎症相关的疾病包括细菌性阴道病和由白色念珠菌引起的阴道炎症相关疾病，所述细菌性阴道病是由阴道加德纳菌、阿托波菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌或沙门氏菌造成的。
5.权利要求1所述乳杆菌在制备治疗和/或预防阴道炎症相关疾病的药物中的用途，所述阴道炎症相关的疾病包括细菌性阴道病和由白色念珠菌引起的阴道炎症相关疾病，所述细菌性阴道病是由阴道加德纳菌、阿托波菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌或沙门氏菌造成的。
6.如权利要求5所述的用途，其中，所述药物的剂型包括阴道用片剂、阴道用明胶胶囊、阴道用锭剂、凝胶、软膏或洗剂。
7.如权利要求5所述的用途，其中，所述药物的剂型包括泡腾片或乳膏。
8.一种用于治疗和/或预防阴道炎症相关疾病的制品，所述制品包括权利要求1所述的乳杆菌。
9.如权利要求8所述的制品，其中，所述制品包括棉塞、卫生巾、月经垫、尿布、凝胶、软膏、喷雾剂、避孕套和洗剂。
10.如权利要求8所述的制品，其中，所述制品包括肥皂和乳膏。
11.如权利要求8所述的制品，其中，所述制品包括卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)、格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)和唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)，其中所述卷曲乳杆菌的保藏编号为CGMCC No.19239；所述格氏乳杆菌的保藏编号为CGMCC No.19238；所述唾液乳杆菌的保藏编号为CGMCC No.19236。
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