CN115873764A

CN115873764A - 乳杆菌及其应用

Info

Publication number: CN115873764A
Application number: CN202211589604.5A
Authority: CN
Inventors: 王梅; 崔鸿亮; 陈义都; 段昭宇
Original assignee: Guangdong Junwei Biotechnology Co ltd
Current assignee: Guangdong Junwei Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-12-12
Filing date: 2022-12-12
Publication date: 2023-03-31
Anticipated expiration: 2042-12-12
Also published as: CN115873764B

Abstract

本发明公开了命名为LSA‑52菌株的副格氏乳杆菌，保藏编号为GDMCC No.62778；命名为LSA‑894菌株的约氏乳杆菌，保藏编号为GDMCC No.62780。LSA‑52菌株和LSA‑894菌株均具有优异的产酸能力和定植能力，并且能够产出抑制有害菌的过氧化氢，对多种女性阴道炎病原菌有优异的抑菌效果，可以用于改善女性生殖健康，对人口优生优育以及家庭社会和谐稳定都具有非常重要的意义。

Description

乳杆菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物领域，具体涉及一株副格氏乳杆菌、一株约氏乳杆菌及其应用。

背景技术

妇科炎症是女性常见的一种疾病，其中常见的妇科炎症有尿道炎、盆腔炎、细菌性阴道炎、霉菌性阴道炎、宫颈炎等，临床医学研究显示，妇科炎症的主要促成因素为病原菌在女性生殖道的过度生长，这种过度生长，破坏了原有菌群的平衡，使人体出现感染症状。

以抗菌药物为主的传统疗法，在杀死致病菌的同时也破坏无数的有益菌，使阴道有益菌出现“空白期”，有害菌优先入驻，导致妇科炎症反复发作；此外，抗生素的长期使用，造成耐药菌株的出现，进而让炎症的治愈变得更加困难和反复。妇科炎症给女性带来的不仅是身体上的折磨，更是心理上的摧残，给女性的正常生活带来了极大的影响。

女性生殖道是开放的腔道，寄居着大量不同种类的微生物，乳酸杆菌是健康育龄妇女生殖道的主要菌群，通过分解阴道黏膜中糖原产生乳酸和过氧化氢来维持阴道的酸性环境，抑制厌氧菌、条件致病菌等侵入和繁殖，通过定植阴道、与致病菌竞争养分，抑制病原菌的生长，是生殖道的天然屏障，是潜在的可用于预防和治疗妇科炎症的新一代药物，抑制病原菌增长，恢复乳杆菌的优势位，优化阴道微生物菌群的防御特性，阻止妇科炎症的复发。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提供了一株副格氏乳杆菌(Lactobacillus paragasseri)和一株约氏乳杆菌(Lactobacillusjohnsonii)，并进一步提供了上述菌株的应用。

在本发明第一方面提出了一株菌株，所述菌株为副格氏乳杆菌，命名为LSA-52菌株，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.62778，保藏日期为2022年9月9日。所述LSA-52菌株产酸及过氧化氢能力优异，对多种女性阴道炎病原菌有优异的抑菌效果，并对人子宫颈癌上皮细胞(Hela细胞)具有较高粘附能力。

在本发明的一些实施方式中，所述LSA-52菌株具有序列如SEQ ID No:1所示的16SrDNA基因片段和序列如SEQ ID No:2所示的pheS基因片段。

在本发明第二方面提出了一株菌株，所述菌株为约氏乳杆菌，命名为LSA-894菌株，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNo.62780，保藏日期为2022年9月9日。所述LSA-894菌株产酸能力优异，还具有一定程度的产过氧化氢能力，对多种女性阴道炎病原菌有优异的抑菌效果，并对人子宫颈癌上皮细胞(Hela细胞)具有较高粘附能力。

在本发明的一些实施方式中，所述LSA-894菌株具有序列如SEQ ID No:3所示的16S rDNA基因片段和序列如SEQ ID No:4所示的pheS基因片段。

在本发明第三方面提出一种菌剂。所述菌剂含有所述LSA-52菌株和/或所述LSA-894菌株。

在本发明第四方面提出了一种产品。所述产品包括以下(1)至(4)中的至少一种：

(1)含有所述菌剂的活菌液；

(2)含有所述菌剂的死菌液；

(3)由所述菌剂经代谢途径获得的代谢产物；

(4)从所述菌剂提取获得的提取物。

在本发明的一些实施方式中，所述产品的剂型为粉剂、膏剂、凝胶、滴剂、栓剂、锭剂、颗粒、胶囊剂、喷雾、片、丸或溶液中的一种。

在本发明的一些实施方式中，所述产品为药品、医疗器械或卫生用品。

在本发明的一些实施方式中，所述药品含有药学上允许的载体；优选地，所述载体选自填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、润滑剂、矫味剂中的任一种或其组合。

在本发明的一些实施方式中，所述卫生用品包括卫生湿纸巾、阴道洗液、棉塞、卫生巾、月经垫、尿布、肥皂和避孕套中的至少一种。

在本发明第五方面提出了所述副格氏乳杆菌、所述约氏乳杆菌、所述菌剂或所述产品在制备预防、缓解、治疗女性常见妇科炎症的产品中的应用。

在本发明的一些实施方式中，所述女性常见妇科炎症由尿路致病性大肠杆菌、阴道加德纳菌、白假丝酵母、光滑假丝酵母、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、克里斯滕塞尼气球菌中的任意一种或多种引起。

附图说明

图1为本发明实施例1中所述LSA-52菌株的菌落形态；

图2为本发明实施例1中所述LSA-894菌株的菌落形态；

图3为本发明实施例1中所述LSA-52菌株经革兰氏染色后的形态图；

图4为本发明实施例1中所述LSA-894菌株经革兰氏染色后的形态图；

图5为本发明实施例2中所述LSA-52菌株耐酸实验结果图；

图6为本发明实施例2中所述LSA-894菌株耐酸实验结果图；

图7为本发明实施例2中所述德氏乳杆菌DM8909菌株耐酸实验结果图；

图8为本发明实施例4中所述菌株抑制白假丝酵母菌实验结果图；

图9为本发明实施例4中所述菌株抑制光滑假丝酵母菌实验结果图；

图10为本发明实施例6中所述LSA-52菌株的溶血性测定结果；

图11为本发明实施例6中所述LSA-894菌株的溶血性测定结果；

图12为本发明实施例6中所述LSA-52菌株的药敏试验结果；

图13为本发明实施例6中所述LSA-894菌株的药敏试验结果。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。

以下实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所有试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品；以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

以下实施例中所用到的细菌培养基成分及配制方法如下：

YPD液体培养基：称取YPD粉末17.50g，加入500mL去离子水，搅拌溶解后121℃高压灭菌20min，即得。

血琼脂平板：购自比克曼生物公司。

过氧化氢半定量测定培养基(TMB-HRP培养基)：100mL MRS琼脂培养基(pH 6.2±0.2)中加入0.5mL的TMB溶液(50mg/mL)，混匀，121℃灭菌15min，取出冷却至50至60℃后加入0.5mL过滤除菌后的HRP溶液(10mg/mL)，混匀，倒平板，制备TMB-HRP培养基，晾干后4℃保存备用。

实施例中涉及的16S rDNA基因和pheS基因鉴定所用的PCR引物及程序如下：

16S rDNA基因序列引物：

27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’(SEQ ID No:8)；

1492R：5’-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’(SEQ ID No:9)；

PCR条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，共35个循环；72℃延伸10min。

pheS基因序列引物：

pheS-21-F：5’-CAYCCNGCHCGYGAYATGC-3’(SEQ ID No:10)；

pheS-23-R：5’-GGRTGRACCATVCCNGCHCC-3’(SEQ ID No:11)；

PCR条件为：95℃预变性5min；95℃变性1min，46℃退火135s，72℃延伸75s，3个循环；95℃变性35s，46℃退火75s，72℃延伸75s，30个循环；72℃延伸7min。

通用PCR体系(25μL)：12.5μL Taq PCR Master Mix缓冲液(包含Taq DNA聚合酶、dNTP、MgCl₂、PCR缓冲液、PCR反应稳定剂、上样缓冲液和溴酚蓝染料)，10μmol/L的上游和下游引物各1μL，1μL DNA模板，用无核酸酶的水补充至25μL。

各实施例中所用到的各类菌株的分离获取方法如下：

德氏乳杆菌DM8909：从非常大药房门店购买“定君生”药品。在洁净工作区中用接种环蘸取菌粉于MRS肉汤培养基中，混匀，置于37℃培养箱厌氧培养24h。取菌液于MRS琼脂培养基上划线分离，37℃培养箱厌氧培养48h。培养结束后，挑取平板上单菌落进行增菌培养，37℃厌氧培养24h。取菌液进行16SrDNA序列鉴定，鉴定得到德氏乳杆菌DM8909，保藏菌液，于-80℃冰箱冻存。

白假丝酵母菌CGMCC 2.4159(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)；光滑假丝酵母菌LSJ-160(分离自VVC患者，由广州暨南大学第一附属医院检验科医生分离提供，序列如SEQ ID No:5)；阴道加德纳菌ATCC 14018(购自广东微生物菌种保藏中心)；大肠杆菌LSJ-85(分离自广州暨南大学自第一附属医院提供的BV患者样本，序列如SEQ ID No:6)；金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003(购自中国食品药品检定研究院)；铜绿假单胞菌LSJ-74(分离自广州暨南大学自第一附属医院提供的BV患者样本，序列如SEQ ID No:7)；尿路致病性大肠杆菌ATCC 700928(购自宁波明舟生物科技有限公司)。

实施例1乳杆菌的分离和鉴定

1.样本采集与菌株分离保存

分离样品均来自于健康女性的阴道分泌物，用阴道拭子采集通过健康体检的育龄期女性阴道分泌物样本，置于ESwab运输保存液(Copan公司)中，充分震荡混匀。取分泌物样本在无菌PBS溶液进行梯度稀释，分别涂布于MRS琼脂培养基上，置于37℃培养箱中厌氧培养48h。由于乳杆菌具有调节人体免疫功能、抑制致病菌感染等作用，其安全性被高度认可，所以挑取生长菌落形态呈白色圆边、表面有光泽等乳杆菌典型特征的菌株，分别于MRS平板上进行划线培养分离。其中两株分离得到的乳杆菌由于在初筛过程中在产乳酸能力、产过氧化氢能力、对泌尿生殖道致病菌抑制效等方面具有突出表现，因此保留进一步检测各菌株特性。这两株乳杆菌分别被命名为LSA-52菌株和LSA-894菌株。使用甘油作为保护剂(甘油终浓度为20～30％)，于-80℃超低温保存。

2.菌株形态观察

将活化的LSA-52菌株、LSA-894菌株划线至MRS平板上，37℃厌氧培养48h后观察菌落形态。挑取平板上单菌落进行革兰氏染色，用显微镜观察菌株特征，菌落形态如图1和2所示，菌株镜检形态如图3和4所示。

如图1所示，LSA-52菌株菌落白色，圆形，表面湿润，不透明，边缘整齐；如图2所示，LSA-894菌株菌落白色，圆形，表面湿润，不透明，边缘整齐。如图3所示：LSA-52菌株菌体呈现细长杆状，约为0.4-0.6μm×1.9-1.8μm，革兰氏染色为阳性，单个或成对排列；

如图4所示：LSA-894菌株菌体呈杆状，约为0.5-0.6μm×0.9-10.7μm，革兰氏阳性，单个或成对排列。

3.菌株的鉴定

取菌液提取DNA，并以其作为模板，采用16S rDNA基因和pheS基因序列引物进行PCR扩增，获得的扩增产物进行电泳检测及委外测序。

副格氏乳杆菌LSA-52的16S rDNA基因序列片段长度为1439bp，如SEQ IDNO：1所示；pheS基因序列长度为464bp，如SEQ ID NO：2所示：

约氏乳杆菌LSA-894的16S rDNA基因序列片段长度为1454bp，如SEQ IDNO：3所示；pheS基因序列长度为465bp，序列如SEQ ID NO：4所示：

经过上述序列鉴定后，LSA-52菌株确定为副格氏乳杆菌，其分类命名为副格氏乳杆菌(Lactobacillus paragasseri)；LSA-894菌株确定为约氏乳杆菌，其分类命名为约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)。菌株于2022年09月09日保藏于广州微生物菌种保藏中心(简称GDMCC，地址:广东省广州市越秀区先烈中路100号大院实验大楼5楼)，副格氏乳杆菌LSA-52的保藏编号为GDMCCNo.62778；约氏乳杆菌LSA-894的保藏编号为GDMCCNo.62780。

实施例2乳杆菌特征检测

1.生理生化特征

分别取LSA-52菌株、LSA-894菌株进行传代孵育，离心后弃上清将菌体分别重悬于生理盐水中制备为3麦氏标准菌悬液，采用梅里埃厌氧菌及棒状杆菌鉴定卡片(VITEKANC)，对各菌株分别进行碳水化合物测定，结果如表1所示。

表1各菌株生理生化特征

符号说明：“+”，阳性；“w”，弱阳性；“-”，阴性。

2.菌株耐酸能力检测

用浓盐酸将MRS液体培养基的pH调节成6.2、4.7、4.2、3.7等四个梯度。将活化的LSA-52菌株、LSA-894菌株及参考菌株DM8909分别离心，弃上清，用PBS溶液将菌体重悬调至浊度(～10⁸CFU/mL)，接种至不同pH梯度的MRS液体培养基中(接种量为5％v/v)。接种后充分混匀，取200μL接菌后的不同pH的MRS培养基至96孔板上，将96孔板放置酶标仪中检测各菌株的耐酸情况。酶标仪设置条件：37℃，厌氧，每隔30min测量一次OD₆₀₀处吸光度，共持续检测30h。

实验结果如图5至7所示：在pH为6.2液体环境下，各乳杆菌生长能力强，在pH为4.7液体环境下时，LSA-52菌株、LSA-894菌株均生长较好，基本不受抑制，当pH为4.2时，LSA-52菌株仍能生长，但生长情况受到一定抑制，稳定期OD₆₀₀处吸光度达到0.6左右，当pH为3.7时，LSA-52菌株生长受到抑制，停止生长；LSA-894菌株在pH为4.2和3.7的液体环境中基本停止生长，而参考菌株德氏乳杆菌DM8909在pH≤4.7液体环境下生长明显受到抑制，基本没有生长。

综上所述，LSA-52菌株和LSA-894菌株都具有一定的耐酸能力，且耐受能力明显优于参考菌株，能够良好地适应女性阴道内的酸性环境。

实施例3：菌株产乳酸、过氧化氢及发酵能力检测

1.菌株产乳酸(D-乳酸&L-乳酸)能力检测

将德式乳杆菌DM8909作为参照菌株。

分别活化LSA-52菌株、LSA-894菌株和德式乳杆菌DM8909，离心，弃上清，重悬菌体并将液体浊度调至适宜浊度(～10⁸CFU/mL)，取菌悬液接种至MRS液体培养基中(接种量5％v/v)，将培养的菌液离心，取上清液，使用高效液相法检测上清液中D-乳酸、L-乳酸的含量，具体的色谱条件如表2所示。

表2高效液相法检测乳杆菌发酵液乳酸含量测定的色谱条件

表3单菌和复合乳杆菌产乳酸能力发酵液中乳酸含量

样品	D-乳酸含量(mg/mL)	L-乳酸含量(mg/mL)	总乳酸含量(mg/mL)
				LSA-52	7.14	12.70	19.84
LSA-894	8.85	10.92	19.77
				DM8909	15.79	ND	15.79

注：“ND”表示不产该型乳酸

乳酸含量的测定结果如表3所示，从表中可以看出，本发明的LSA-52菌株和LSA-894菌株均可以同时产生D-乳酸和L-乳酸，且产乳酸能力均高于德氏乳杆菌。

2.产H₂O₂检测

将德式乳杆菌DM8909作为参考菌株。

活化LSA-52菌株、LSA-894菌株和德式乳杆菌DM8909后分别在TMB-HRP培养基上划线，于三气培养箱中37℃厌氧培养48h。取出平板，在空气中暴露菌体，观察菌落颜色变化。最后根据颜色变化的时间，判断菌株产过氧化氢的能力，分别为强(变化时间<10min)、中(变化时间为10至20min)、弱(变化时间为20至30min)或无(变化时间>30min或无变色)。

表4过氧化氢半定量产能测定结果

菌种	暴露空气后变色时间	过氧化氢产能
			LSA-52	2min	++++
LSA-894	10min	+++
			DM8909	<1min	+++++

过氧化氢能够有效抑制和杀灭病原菌，是女性阴道内乳杆菌抑制和杀灭其他外来病原菌的重要手段。实验结果如表4所示：在暴露空气1-2min时，LSA-52菌株开始出现变色，菌落呈微蓝色状态，在3-4min时，菌落的蓝色持续加深，6min时菌落呈明显的深蓝色；LSA-894菌株的菌落在暴露空气10min时出现蔚蓝色，15min时菌落呈明显的深蓝色；德式乳杆菌DM8909在暴露空气1min时呈现出深蓝色菌落。因此，按照过氧化氢产能的判断标准，LSA-52菌株和LSA-894菌株均具有较强的过氧化氢产能，具有守护女性阴道内菌群健康、抑制和杀灭外来病原菌的应用前景。

3.菌株发酵能力检测

将德式乳杆菌DM8909作为参照菌株。

2次活化LSA-52菌株、LSA-894菌株和德式乳杆菌DM8909，离心，弃上清，重悬菌体并将液体浊度调至适宜浊度(～10⁸CFU/mL)，取菌悬液接种至MRS液体培养基中(接种量5％v/v)，37℃厌氧培养24h。将培养的菌液离心取上清，利用pH计检测发酵液pH。

表5发酵液pH检测结果

菌株	发酵pH
		DM8909	4.01
LSA-52	3.82
		LSA-894	3.81

实验结果如表4所示：LSA-52菌株的发酵液pH为3.82，LSA-894菌株的发酵液pH为3.81，均小于德式乳杆菌DM8909，所述LSA-52菌株和所述LSA-894菌株产酸能力均优于参考菌株，更有利于其成为阴道内的优势菌群。

实施例4：体外抑制女性妇科炎症常见致病菌检测

1.菌株上清抑制假丝酵母菌能力检测

将活化后的各乳杆菌离心，弃上清，用PBS溶液将菌体重悬调至浊度(～10⁸CFU/mL)，将调好浊度的LSA-52菌株菌液、LSA-894菌株菌液、德式乳杆菌DM8909菌液分别接种至MRS液体培养基中(接种量5％v/v)，记为LSA-52组、LSA-894组、DM8909组，将各个实验组37℃厌氧培养24h后取出，菌液离心，取上清液过0.22μm滤膜后分别取100μL至96孔板中备用。

将活化的白假丝酵母菌和光滑假丝酵母菌离心，弃上清，用PBS溶液将菌体重悬调至浊度(～10⁸CFU/mL)，接种至YPD液体培养基中(5％v/v)，取100μL含有病原菌的YPD培养基分别加至含100μL菌液上清的96孔板中，含病原菌的YPD培养液加至空白MRS培养基作为阳性对照，空白YPD培养基加至空白MRS培养基作为阴性对照，置于酶标仪中，37℃培养，每隔30min测量一次OD₆₀₀处吸光度，共持续检测40h，通过测量病原菌生长情况表示菌株上清对假丝酵母菌的抑制能力。

抑菌效果如图8和9所示：白假丝酵母菌稳定期OD₆₀₀约为1.42，光滑假丝酵母菌稳定期OD₆₀₀约为1.55；各组菌液上清液与白假丝酵母菌共培后，DM8909组稳定期OD₆₀₀为0.86左右，具有轻微抑制效果，而LSA-52组和LSA-894组稳定期OD₆₀₀分别为0.34和0.42左右，表现为强抑制性。菌液上清液与光滑假丝酵母菌共培后，DM8909组稳定期OD₆₀₀为1.04左右，而LSA-52组和LSA-894组稳定期OD₆₀₀约为0.78，抑菌效果优于德氏乳杆菌。

白假丝酵母菌是目前80～90％ VVC患者的主要病原菌，本发明菌株对白假丝酵母菌具有强抑制作用，可做为治疗VVC的潜在开发药物。

2.抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和阴道加德纳菌能力检测将德式乳杆菌DM8909作为参照菌株。

将LSA-52菌株、LSA-894菌株和德式乳杆菌DM8909活化后，取0.5mL菌液与20mL的MRS固体培养基混匀，倾注入平皿内，完全凝固后37℃厌氧培养48h，取出平皿，用打孔器获得菌饼备用。将金黄色葡萄球菌、绿脓假单胞菌、大肠杆菌和阴道加德纳菌等病原菌活化后离心，用PBS将病原菌浊度调节至～10⁸CFU/mL，吸取0.1mL调节好浊度的金黄色葡萄球菌、绿脓假单胞菌、大肠杆菌和阴道加德纳菌等病原菌至相应的适宜病原菌生长的琼脂平板上，进行平板涂布，将乳杆菌菌饼轻放在营养琼脂表面，平皿正置培养24h，用游标卡尺测量抑菌圈大小，根据抑菌圈的大小表示实验菌株抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和阴道加德纳菌等病原菌的能力。

结果如表6所示：LSA-52菌株和LSA-894菌株对女性阴道炎病原菌如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和阴道加德纳菌均有抑制效果，且抑制效果皆优于对照菌株DM8909。

表6LSA-52、LSA-894和参照菌株对女性阴道炎病原菌的抑菌圈直径(㎜)

实施例5：粘附能力检测

分别将LSA-52菌株、LSA-894菌株和德式乳杆菌DM8909菌液离心，弃上清，PBS缓冲液重悬菌体后将液体浊度调至适宜浊度(～10⁸CFU/mL)，离心去上清，用等体积完全培养基(90％DMEM高糖培养基+10％FBS)重悬菌体从而获得乳杆菌菌悬液；T75培养瓶培养Hela细胞(购自中国科学院细胞库)以1×10⁶cells/mL的细胞密度接种1mL于12孔板中，待培养24h后形成单细胞层。吸出细胞培养板中的培养液，每孔加入PBS溶液洗涤细胞3次后加入1mL乳杆菌菌悬液，轻柔晃动细胞培养板，使菌体充分散均匀，将细胞培养板和剩余菌悬液置于37℃，5％CO₂培养箱中黏附3h，每组3个平行。粘附结束后，吸出细胞培养板中培养液，加入PBS溶液洗涤细胞3次，加入0.1％ TritonX-100PBS溶液裂解细胞5min，制成菌悬液，梯度稀释，涂布于MRS琼脂上，厌氧培养48h后进行乳杆菌的计数。

粘附率的计算公式如下：

黏附率＝菌株存活率(％)＝N_l/N₀×100％；

式中，N₁-菌株粘附处理后活菌数(CFU/mL)；N₀-菌株粘附前活菌数(CFU/mL)。

表7LSA-52、LSA-894和对照菌株对Hela细胞的黏附能力

菌株	对Hela细胞黏附率
		DM8909	5.43％
LSA-52	12.23％
		LSA-894	15.56％

结果表7所示：结果显示，LSA-52菌株和LSA-894菌株的黏附能力显著高于DM8909，更有易于在阴道内定植。HeLa细胞源自妇女的子宫颈癌细胞，常用作阴道上皮细胞的替代细胞用于体外研究。益生菌对上皮细胞的黏附力越强越有利于定殖于人体，与病原菌竞争占位，防止病原菌的入侵，更有利于其发挥益生功能。

实施例6：乳杆菌安全性检测

1.溶血性检测

以英诺克李斯特氏菌(Listeria innocua)CICC 10417作为阴性对照，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)CICC 10473作为阳性对照，将本发明乳杆菌接种于血琼脂平板上测定其溶血性。结果如图10和11所示，金黄色葡萄球菌CICC 10473产生明显的溶血环，而英诺克李斯特氏菌CICC 10417、LSA-52菌株和LSA-894菌株均无溶血环出现，表明菌株无致病性。

2.药敏检测

根据CLSI M45-A3肉汤稀释法苛养菌少见菌药物敏感性试验参考方法对LSA-52菌株和LSA-894菌株进行氨苄西林(AM)、克林毒素(CM)、达托毒素(DPC)、红霉素(ERY)、利奈唑胺(LZ)、美罗培南(MRP)、万古霉素(VA)药敏性检测，检测结果如图12、13和表8所示：

表8药敏试验结果

检测结果表明LSA-52和LSA-894菌株对氨苄西林(AM)、克林毒素(CM)、达托毒素(DPC)、红霉素(ERY)、利奈唑胺(LZ)、美罗培南(MRP)、万古霉素(VA)这些抗生素都表现为敏感，证明两株乳杆菌均安全可靠。

3.乳杆菌对小鼠的毒性试验

选用30只体重14-18g、6-8周龄的SPF级别雌性小鼠，随机分为LSA-52组、LSA-894组和对照组，每组10只。将活化的LSA-52菌株和LSA-894菌株分别离心，弃上清，用PBS溶液将菌体重悬调至浊度(～10⁸CFU/mL)。所有小鼠均给予标准饲料自由采食。LSA-52组和LSA-894组小鼠每天各灌注20μL菌液，对照组则每天灌注20μL生理盐水，一共灌注14天，观察小鼠体重及毒性反应。

阴道灌注菌液14天后，各组小鼠均无异常情况，LSA-52组和LSA-894组与对照组相比阴道未有红肿、发热等症状，无体重异常，未发现振颤、姿态异常、眼球突出、死亡的情况，排尿、呼吸正常。该结果表明LSA-52菌株和LSA-894菌株均无毒性，无刺激性。

实施例7：对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的混合液构建大鼠阴道炎模型治疗能力

所选取的大鼠阴道炎模型由金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的混合液感染构建而成。取SPF级的Wistar雌性大鼠50只，6-8周，体重180～220g，随机分为5组，每组10只，分别为健康对照组、LSA-52组，LSA-894组、德氏乳杆菌DM8909组和感染对照组。适应性喂养7天后，除健康对照组外，其它组大鼠阴道内注入大肠杆菌+金黄色葡萄球菌的混合液0.5ml，(其中每mL含～10⁸CFU/mL金黄色葡萄球菌和～10⁸CFU/mL大肠杆菌)，连续接种7天，每天1次，造成大鼠的阴道炎模型。健康对照组每天1次注入相同体积的生理盐水，连续7天。

将LSA-52菌株、LSA-894菌株和德氏乳杆菌DM8909从新鲜培养的MRS平板上挑取单菌落至MRS液体培养基中，37℃，厌氧培养，离心，PBS重悬，将浊度调节至1×10⁹CFU/mL，给LSA-52组、LSA-894组和德氏乳杆菌DM8909组分别灌注20μL对应的菌液，连7天，每天一次；健康对照组和感染对照组的大鼠每天阴道给与等体积的生理盐水，连续7天，每天一次。

大鼠阴道菌群的测定与分析：治疗结束后，用微量加样器取0.2ml生理盐水，反复冲洗大鼠阴道8～10次，取100μL的阴道冲洗液分别进行大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和乳杆菌活菌计数。

结果如表9所示。实验结果表明，LSA-52组与LSA-894组能够有效治疗大鼠由大肠杆菌和金黄色葡萄球感染造成的阴道炎并恢复大鼠阴道内的乳杆菌数量至健康水平，且疗效优于德氏乳杆菌DM8909组。

表9对大鼠阴道炎模型治疗效果

上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims

1.一株副格氏乳杆菌，其特征在于，所述副格氏乳杆菌(Lactobacillus paragasseri)保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为GDMCC No.62778，保藏日期为2022年9月9日。

2.一株约氏乳杆菌，其特征在于，所述约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为GDMCC No.62780，保藏日期为2022年9月9日。

3.一种菌剂，其特征在于，含有权利要求1所述副格氏乳杆菌和/或权利要求2所述约氏乳杆菌。

4.一种产品，其特征在于，包括以下(1)至(4)中的至少一种：

(1)含有权利要求3所述菌剂的活菌液；

(2)含有权利要求3所述菌剂的死菌液；

(3)由权利要求3所述菌剂经代谢途径获得的代谢产物；

(4)从权利要求3所述菌剂提取获得的提取物。

5.根据权利要求4所述产品，其特征在于，所述产品的剂型为粉剂、膏剂、凝胶、滴剂、栓剂、锭剂、颗粒、胶囊剂、喷雾、片、丸或溶液中的一种。

6.根据权利要求4或5所述产品，其特征在于，所述产品为药品、医疗器械或卫生用品。

7.根据权利要求6所述产品，其特征在于，所述药品含有药学上允许的载体；优选地，所述载体选自填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、润滑剂、矫味剂中的任一种或其组合。

8.根据权利要求6所述产品，其特征在于，所述卫生用品包括卫生湿纸巾、阴道洗液、棉塞、卫生巾、月经垫、尿布、肥皂和避孕套中的至少一种。

9.权利要求1所述副格氏乳杆菌、权利要求2所述约氏乳杆菌、权利要求3所述菌剂或权利要求4至8任一项所述产品在制备预防、缓解、治疗女性常见妇科炎症产品中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述女性常见妇科炎症由尿路致病性大肠杆菌、阴道加德纳菌、白假丝酵母、光滑假丝酵母、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、克里斯滕塞尼气球菌中的任意一种或多种引起。