CN108795809B - 一种植物乳杆菌jylp-002及其制备的产品和应用 - Google Patents

一种植物乳杆菌jylp-002及其制备的产品和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种植物乳杆菌JYLP‑002及其制备的产品和应用。采用保藏菌株植物乳杆菌JYLP‑002，制成外用和内服产品联合使用。既能通过外用，缓解局部炎症，抑制致病菌，定植阴道壁，产生抑菌物质，消除异味，保持环境菌群平衡；又能通过调理肠道，增强机体免疫力，改善因患病带来的不适症状。避免了使用抗生素造成的耐药性风险，避免使用抗生素对身体带来的胃肠道伤害。提高阴道炎治愈率，降低阴道炎复发概率。

Description

一种植物乳杆菌JYLP-002及其制备的产品和应用
技术领域
本发明涉及植物乳杆菌及应用技术领域，特别是涉及一种植物乳杆菌JYLP-002及其制备的产品和应用。
背景技术
目前治疗阴道炎的方法如下：
1、抗生素治疗。抗生素治疗效果明显，但缺点也很显著，抗生素的使用会将致病菌和有益菌一同杀死，虽然会暂时缓解症状，但严重导致阴道环境菌群空缺，极易造成复发。滥用抗生素会使有害菌产生耐药性。同时，长期服用抗生素会引发胃肠道不适、免疫力低下等，会诱发其他病症的发生。
2、中药治疗。中药治疗阴道炎的方法繁杂，种类多样，效果迟缓，针对性不强，容易使患者放弃治疗希望，造成生理和心理的双重打击。即便治疗成功，患者在治疗过程依然要经受长时间的瘙痒、肿胀等症状的困扰。
3、外用微生态制剂的疗法。阴道局部给用微生态制剂会对环境菌群进行改善，但是盲目使用会造成阴道新的菌群失衡，效果单一。
现有技术中也有采用多种手段结合的方式，比如：外用微生态制剂与内服抗生素联合治疗。服用抗生素，会杀灭有益菌和致病菌，适时补充有益微生物能够重建菌群生态平衡。是个破而后立的过程。但用抗生素，容易使致病菌产生耐药性。同时服用抗生素会影响肠道菌群，降低免疫力，容易引发其他并发症。外用微生态制剂与中药联合治疗。外用微生态制剂能够抑制致病菌，定植阴道壁，产生抑菌物质，调整阴道环境。配合中药，清热排毒，消炎祛湿，止痒祛除异味。但中药外用效果，及用量并没有内服效果明显,但是内服中药依然有副作用，作用效果迟缓。
因此，如何研发一种能够提高阴道炎治愈率，降低阴道炎复发概率且不会产生耐药性风险，不会对身体带来伤害的方式，是本发明要解决的技术问题。
发明内容
本发明就是针对上述存在的缺陷而提供一种植物乳杆菌JYLP-002及其制备的产品和应用。本发明主要是为了解决目前市面上治疗阴道炎，避免抗生素带来的耐药性问题。避免抗生素带来的身体不适。降低了阴道炎复发的风险。本发明的植物乳杆菌避免使用抗生素造成的耐药性风险，避免使用抗生素对身体带来的胃肠道伤害。提高阴道炎治愈率，降低阴道炎复发概率。
本发明的一种植物乳杆菌JYLP-002及其制备的产品和应用技术方案为，一种植物乳杆菌JYLP-002，其分类命名为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum，保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏单位地址:中国科学院微生物研究所，邮政编码为100101，其保藏编号为:CGMCC No.15801，保藏日期是2018年5月23日。
所述的一种植物乳杆菌JYLP-002在制备治疗阴道炎产品中的应用。
所述的一种植物乳杆菌JYLP-002制备的产品，包括外用清洗液和内服粉剂；其中外用清洗液含有植物乳杆菌JYLP-002发酵液成分的外用清洗液；内服粉剂由低聚异麦芽糖与该植物乳杆菌JYLP-002的冻干菌粉混合制成。
所述的植物乳杆菌JYLP-002发酵液培养基：蛋白胨8-15g，牛肉浸粉6-10g，酵母浸粉3-6g，K2HPO4 1-3g，柠檬酸三铵1.5-3g，乙酸钠3-6g，葡萄糖18-23g，吐温80 0.8-1.2mL，MgSO4·7H2O 0.5-0.6g，MnSO4·4H2O 0.2-0.3g，蒸馏水1000mL；培养条件：37℃，静置培养：18-24h。
优选的，所述的植物乳杆菌JYLP-002发酵液培养基：蛋白胨10g，牛肉浸粉8.6g，酵母浸粉5g，K2HPO4 2g，柠檬酸三铵2g，乙酸钠
5g，葡萄糖20g，吐温80 1mL，MgSO4·7H2O 0.58g，MnSO4·4H2O 0.25g，蒸馏水1000mL。
发酵液中发酵菌数：3.0×109-5.0×109cfu/mL。
将植物乳杆菌JYLP-002发酵液离心，真空冷冻干燥，得到菌粉，与低聚异麦芽糖混合复配成100亿/g的菌粉。低聚异麦芽糖：购自保龄宝生物股份有限公司。
所述的产品的应用，每天早晚服用2g内服粉剂；同时将外用清洗液每天早晚各取20mL喷洗一次患处，持续30天，对提高阴道炎治愈率和降低阴道炎复发率有明显的促进作用。
本发明的有益效果为：本发明利用保藏菌株植物乳杆菌JYLP-002，制成外用和内服产品联合使用。外用制成清洗液，内服用低聚异麦芽糖与该菌种的冻干菌粉混合制成一定菌数的粉剂。联合使用，既能通过外用，缓解局部炎症，抑制致病菌，定植阴道壁，产生抑菌物质，消除异味，保持环境菌群平衡；又能通过调理肠道，增强机体免疫力，改善因患病带来的不适症状。
本发明避免了使用抗生素造成的耐药性风险，避免使用抗生素对身体带来的胃肠道伤害。提高阴道炎治愈率，降低阴道炎复发概率。
附图说明：
图1所示为实施例3中本发明植物乳杆菌JYLP-002和加德纳菌：ATCC14018共培养曲线图；
图2所示为实施例3中本发明植物乳杆菌JYLP-002和白假丝酵母：CICC 1965共培养曲线图；
图3所示为实施例3中各株乳杆菌的抑菌直径对比柱状图(单位：mm)。
图4所示为JYLP-002发酵上清液对加德纳菌抑制作用(抑菌圈)照片；
图5所示为JYLP-002发酵上清液对白色念球菌抑制作用(抑菌圈)照片；
图6所示为实施例4中细胞黏附的不同乳杆菌的柱状比较图；
图7所示为实施例5中实验一的治愈率比较图。
具体实施方式：
为了更好地理解本发明，下面用具体实例来详细说明本发明的技术方案，但是本发明并不局限于此。
实施例1
优势乳酸菌筛选
①菌种来源：健康年轻女性阴道分泌物
②平板培养基：蛋白胨10g牛肉浸粉8.6g酵母浸粉5g K2HPO4 2g柠檬酸三铵2g乙酸钠5g葡萄糖20g吐温80 1mLMgSO4·7H2O 0.58g MnSO4·4H2O 0.25g琼脂15g蒸馏水1000mL
③菌株的分离
青州中心医院妇科体检医生协助采样，用无菌棉拭于阴道后1/3处一次性顺时针刮抹，须避免接触到外阴部和阴道口以防污染。取出后立即放至无菌水中，并编号记录。
对样品液体做十倍梯度稀释，每个梯度取100μL均匀涂布于MRS固体平板培养基上，随后取出置于厌氧罐中，37℃厌氧培养过夜。
次日可见平板上长有形态大小各异的菌落，挑取若干乳酸菌的特征菌落作二代划线纯化处理，平板厌氧活化1天，得培养物，即为本发明的植物乳杆菌JYLP-002。
随后做菌株鉴定。
④16S rRNA序列的测定
16S rRNA扩增引物使用的是27F：5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'和1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。产物委托有资质的第三方实验室进行Sanger测序。应用BLAsT算法在GenBank数据库中把序列和16srRNA基因进行比较，应用MEGA4.0程序建立邻接树。
BLAST分析，表明JYLP-002十分接近植物乳杆菌(99％亲缘)
16S rRNA序列:
TCTAAAAGGTTACCCCACCGACTTTGGGTGTTACAAACTCTCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAATCCGAACTGAGAATGGCTTTAAGAGATTAGCTTACTCTCGCGAGTTCGCAACTCGTTGTACCATCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCACCAGAGTGCCCAACTTAATGCTGGCAACTGATAATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTATCCATGTCCCCGAAGGGAACGTCTAATCTCTTAGATTTGCATAGTATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTAGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGAATGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTGAAGGGCGGAAACCCTCCAACACTTAGCATTCATCGTTTACGGTATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTACCCATACTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGACAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAGTTCCACTGTCCTCTTCTGCACTCAAGTTTCCCAGTTTCCGATGCACTTCTTCGGTTGAGCCGAAGGCTTTCACATCAGACTTAAAAAACCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAAATACCGTCAATACCTGAACAGTTACTCTCAGATATGTTCTTCTTTAACAACAGAGTTTTACGAGCCGAAACCCTTCTTCACTCACGCGGCGTTGCTCCATCAGACTTTCGTCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGATTACCCTCTCAGGTCGGCTACGTATCATTGCCATGGTGAGCCGTTACCCCACCATCTAGCTAATACGCCGCGGGACCATCCAAAAGTGATAGCCGAAGCCATCTTTCAAGCTCGGACCATGCGGTCCAAGTTGTTATGCGGTATTAGCATCTGTTTCCAGGTGTTATCCCCCGCTTCTGGGCAGGTTTCCCACGTGTTACTCACCAGTTCGCCACTCACTCAAATGTAAATCATGATGCAAGCACCAATCAATACCAGAGTTCGTTCGACT。
实施例2
不同菌株培养过程中，pH值下降速度的对比
降低pH值能力(MRS培养基发酵16h后)如表1所示：
表1
菌种 pH值 菌种 pH值
JYLP-002 3.65 ATCC4357 5.17
CICC22700 4.12 CICC6236 4.12
ATCC39392 3.98 ATCC8014 4.04
CICC6126 4.62 ATCC11443 4.23
表格中的其他菌株均来自ATCC和CICC菌种保藏中心。
结论：由表1可知，JYLP-002菌株在相同时间、相同条件下，pH值下降最快，与其它菌株相比有着更强的产酸能力。
不同菌种发酵长得快慢。(37℃MRS培养基初始pH值6.2-6.4发酵到峰值时间,每个菌的检测数据均是测10次后取平均值)如表2所示：
表2
结论：由表2可知，JYLP-002菌株在相同培养条件下，与其它对照菌株相比有更强的繁殖能力。
实施例3
抑制有害菌生长(共培养)(加德纳菌是细菌性阴道病主要致病菌、白假丝酵母是念珠菌性阴道炎的主要致病菌)
加德纳菌：ATCC 14018
共培养培养基：MRS培养基
JYLP-002初始接种量：106cfu/mL
加德纳菌初始接种量：106cfu/mL
说明书附图图1为共培养曲线图。
结论：JYLP-002在液体环境下会明显抑制加德纳菌的生长
白假丝酵母：CICC 1965
共培养培养基：5°Bé麦芽汁1.0L
JYLP-002初始接种量：106cfu/mL
白假丝酵母初始接种量：106cfu/mL。
说明书附图图2为共培养曲线图。
结论：JYLP-002在液体环境下会明显抑制白假丝酵母的生长。
抑制致病菌抑菌圈实验(加德纳菌、白假丝酵母)
各株乳杆菌的抑菌直径对比柱状图(单位：mm)如说明书附图图3所示。抑菌圈实验请见说明书附图图4、图5所示。
实施例4
不同菌株对Caco-2细胞的粘附率实验
在40个视野下的粘附数量
试剂
MRS培养基：蛋白胨10.0g、牛肉粉5.0g、酵母粉4.0g、葡萄糖20.0g、吐温80 1.0mL、K2HPO4·7H2O2.0g、醋酸钠·3H2O 5.0g、柠檬酸三铵2.0g、MgSO4·7H2O 0.2g、MnSO 4·4H2O0.05g
DMEM培养基(购于GIBCO公司)
PBS 1L配方pH7.4：磷酸二氢钾(KH2PO4)：0.27g，磷酸氢二钠(Na2HPO4)：1.42g，氯化钠(NaCl)：8g，氯化钾(KCl)0.2g，加去离子水约800mL充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调pH至7.4，最后定容到1L。
粘附操作
将Caco-2细胞分别置于含10％热灭活新生牛血清和双抗(青霉素浓度100U/mL、链霉素1.0μg/mL)的DMEM培养液中，于37℃、5％CO2、相对湿度95％的二氧化碳培养箱中孵育，每天换1次培养液，3～4d传代1次，15～20d后将细胞接种于24孔培养板中，接种密度约为5×105CFU/mL，待细胞长至单层后进行黏附试验。
将活化好的JYLP-002按体积分数为1％的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃培养12～14h，离心收集菌体(4000g，4℃，10min)。后用无菌PBS(pH 7.4)洗涤3次，将菌体重悬于PBS中，用PBS将菌悬液稀释调整至所需要的浓度(3×108CFU/mL)。将已长成单层的细胞用灭菌PBS(pH 7.4)漂洗2次，每孔加入0.5mL植物乳杆菌菌悬液[细菌浓度(3×108CFU/mL)]和0.5mL新鲜的DMEM培养液。置37℃、5％CO2、相对湿度95％的二氧化碳培养箱中孵育1h，用灭菌的PBS漂洗细胞5次，以除去未黏附的细菌。漂洗完后，用甲醛固定，革兰染色，镜检，倒置显微镜下计算20个随机视野下100个细胞上黏附的细菌数。以不加菌液细胞培养为对照。计算每个细胞黏附的平均细菌数。每个处理做3个平行。实验结果如说明书附图图5所示。总结：JYLP-002有较强的粘附性。
实施例5
临床实验
服用抗生素之后的不良症状缓解
治愈率和阴道pH值
实验一益生菌菌液清洗治疗效果
实验组：JYLP-002的MRS培养基发酵液
对照组1：JYLP-002的MRS培养基发酵液的离心上清液
对照组2：生理盐水
每组实验人数：100人
操作内容：每天早晚各取20mL喷洗一次患处，持续30天
结果如说明书附图图7所示。
治愈率的计算方法
治愈率＝(治愈人数/实验人数)×100％
BV:发酵液62％上清液23％盐水6％
VVC:发酵液53％上清液17％盐水4％
结论：发酵液有明显的治疗效果；上清液有一定的治疗效果；生理盐水无明显的治疗效果。
实验二益生菌菌粉与甲硝唑联合治疗细菌性阴道病的作用
实验组：甲硝唑+JYLP-002菌粉
对照组1：甲硝唑+低聚异麦芽糖
对照组2：甲硝唑
每组实验人数：100人
操作内容：甲硝唑服用2h后，分别服用JYLP-002菌粉2g、低聚异麦芽糖和不服用。持续15天后，甲硝唑停用。继续服用菌粉和低聚异麦芽糖15天。
结果
(1)实验组治愈率接近50％；
(2)低聚异麦芽糖治愈率偏低40％只有甲硝唑的35％；
(3)胃肠不适反应人数比例实验组30％对照组1 73％对照组2 91％。
结论：1、菌粉能辅助甲硝唑进行治疗阴道炎；
2、菌粉能缓解甲硝唑带来的不良症状。
实验三JYLP-002发酵液与甲硝唑的协同治疗细菌性阴道病的作用
实验组：JYLP-002发酵液+抗生素
对照组：生理盐水+抗生素
每组实验人数：100人
操作内容：
甲硝唑服用2h后，分别取用20mL JYLP-002发酵液和生理盐水喷洗患处，甲硝唑服用15天后停药。发酵液和生理盐水继续再使用15天。
结果如表3所示
表3
治愈率 复发率
实验组 60％ 3/60
对照组 35％ 11/35
实验组：治愈率60％ 复发率3/60
对照组：治愈率35％ 复发率11/35
治愈率计算方法
治愈率＝(治愈人数/每组实验人数)×100％
复发率计算方法
复发率＝(复发人数/每组实验人数)×100％
结论：JYLP-002菌液与抗生素联合使用对治疗细菌性阴道炎有明显的治疗效果，且复发率较低
实验四JYLP-002菌粉和发酵液与抗生素的协同治疗作用
实验组：JYLP-002菌液+JYLP-002菌粉
对照组：JYLP-002菌液+JYLP-002菌粉+甲硝唑
每组实验人数：100人
操作：对照组：甲硝唑服用2h后，服用JYLP-002菌粉2g，并同时取用20mL JYLP-002发酵液喷洗患处。甲硝唑服用15天后，停用，并继续服用菌粉和使用菌液15天。
实验组：同对照组规律服用菌粉和使用菌液，使用30天。
结果如表4所示
表4
治愈率 复发率
实验组 82％ 1/82
对照组 73％ 3/73
结论：服用抗生素对益生菌的联合治疗有负面效果，单纯使用JYLP-002菌液和菌粉内外服联合使用，对提高治愈率和降低复发率有明显的促进作用。
序列表
<110> 山东中科嘉亿生物工程有限公司
<120> 一种植物乳杆菌JYLP-002及其制备的产品和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1045
<212> RNA
<213> 植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)
<400> 1
caaaaggacc ccaccgacgg ggacaaaccc aggggacggg cggggacaag gcccgggaac 60
gacaccgcgg cagcgaccgc gaacagcgac cgaccagagg cgaggcagcc acaaccgaac 120
gagaaggcaa gagaagcacc cgcgagcgca accggaccac cagagcacgg gagcccaggc 180
aaaggggcag agagacgcac cccacccccc gggcaccggc agccaccaga ggcccaacaa 240
gcggcaacga aaaaggggcg ccggcgggac aacccaacac cacgacacga gcgacgacaa 300
ccagcaccac cgaccagccc cgaagggaac gcaaccagag caagagcaag accggaaggc 360
cgcgagccga aaaaccacag cccaccgcgg cgggcccccg caaccgagca gccgcggccg 420
acccccaggc ggaagcaagc gagcgcagca cgaagggcgg aaacccccaa cacagcacac 480
gacggaggac accagggaca accggcaccc aaccgagccc agcgcagaca gaccagacag 540
ccgcccgcca cgggcccaaa cacgcacacc gcacacagga gccacgcccc gcaccaagcc 600
cagccgagca cccgggagcc gaaggccaca cagacaaaaa accgccgcgc cgcacgccca 660
aaaaccggac aacgcgccac cacgaaccgc ggcgcggcac gagagccggg ccggaaaacc 720
gcaaaccgaa cagacccaga agccaacaac agagacgagc cgaaaccccc accacgcggc 780
ggcccacaga ccgccaggga agacccacgc gcccccgagg aggggccggc cagcccaagg 840
gccgaacccc caggcggcac gacagccagg gagccgaccc caccacagca aacgccgcgg 900
gaccaccaaa aggaagccga agccaccaag ccggaccagc ggccaaggag cggaagcacg 960
ccagggaccc ccgccgggca ggcccacgga ccaccagcgc caccaccaaa gaaacagagc 1020
aagcaccaac aaaccagagc gcgac 1045

Claims (3)

1.一种由植物乳杆菌JYLP-002制备得到的产品，其特征在于，包括外用清洗液和内服粉剂；其中外用清洗液含有植物乳杆菌JYLP-002发酵液成分的外用清洗液；内服粉剂由低聚异麦芽糖与该植物乳杆菌JYLP-002的冻干菌粉混合制成；
所述的植物乳杆菌JYLP-002，其分类命名为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum，保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，其保藏编号为:CGMCC No.15801，保藏日期是2018年5月23日；
所述的植物乳杆菌JYLP-002发酵液培养基：蛋白胨8-15g，牛肉浸粉6-10g，酵母浸粉3-6g，K2HPO4 1-3g，柠檬酸三铵1.5-3g，乙酸钠3-6g，葡萄糖18-23g，吐温80 0.8-1.2mL，MgSO4·7H2O0.5-0.6g，MnSO4·4H2O 0.2-0.3g，蒸馏水1000mL；培养条件：37℃，静置培养：18-24h；
发酵液中发酵菌数：3.0×109-5.0×109cfu/mL；
每天早晚服用2g内服粉剂；同时将外用清洗液每天早晚各取20mL喷洗一次患处，持续30天，对提高阴道炎治愈率和降低阴道炎复发率有明显的促进作用。
2.根据权利要求1所述的产品，其特征在于，所述的植物乳杆菌JYLP-002发酵液培养基：蛋白胨10g，牛肉浸粉8.6g，酵母浸粉5g，K2HPO4 2g，柠檬酸三铵2g，乙酸钠5g，葡萄糖20g，吐温80 1mL，MgSO4·7H2O 0.58g，MnSO4·4H2O 0.25g，蒸馏水1000mL。
3.根据权利要求1所述的产品，其特征在于，将植物乳杆菌JYLP-002发酵液离心，真空冷冻干燥，得到菌粉，与低聚异麦芽糖混合复配成100亿/g的菌粉。
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Denomination of invention: A Lactobacillus plantarum jylp-002 and its prepared products and Applications

Effective date of registration: 20220711

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Pledgee: Qingzhou Shandong rural commercial bank Limited by Share Ltd.

Pledgor: SHANDONG ZHONGKE-JIAYI BIO-ENGINEERING CO.,LTD.

Registration number: Y2022980010127

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