CN111387506A - 一种嗜酸乳杆菌的用途及含所述嗜酸乳杆菌的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种嗜酸乳杆菌PBIL2‑003(Lactobacillus acidophilus PBIL2‑003)的用途及含所述嗜酸乳杆菌的组合物，所述嗜酸乳杆菌具有增强免疫效果。可促进脾淋巴细胞的增殖，从而提高机体脾淋巴细胞的免疫应答能力；能显著改变脾淋巴细胞的活性，诱导细胞增殖和分化，促进细胞因子的分泌而增强机体的免疫功能；能显著增强巨噬细胞吞噬活性，参与机体非特异性免疫反应。本发明提供的嗜酸乳杆菌具有耐酸性、耐胆盐特性、具有较强的抑菌能力、安全性好。本发明提供的含有以上嗜酸乳杆菌的组合物，其安全性具有保证，避免了副作用，可作为具有增强免疫力作用的食品或保健食品使用。

Description

一种嗜酸乳杆菌的用途及含所述嗜酸乳杆菌的组合物
技术领域
本发明涉及乳酸菌技术领域，尤其涉及一种嗜酸乳杆菌的用途及含所述嗜酸乳杆菌的组合物。
背景技术
益生菌包括严格厌氧的双歧杆菌、耐氧的乳杆菌属、兼性厌氧球菌和兼性厌氧的芽孢杆菌属等。其中，嗜酸乳杆菌属于耐氧的乳杆菌属，革兰阳性杆菌，因其具有调节肠道菌群、抑制不良微生物生成、提高机体免疫力及降低胆固醇等生理功能,广泛应用于畜禽的生产中。嗜酸乳杆菌的作用归纳起来主要有：营养作用、免疫作用和治疗作用；嗜酸乳杆菌的营养作用是通过动物消化道微生物的竞争排斥作用，帮助动物建立有利于宿主的胃肠道微生物区系，预防腹泻、促进生长、提高饲料利用率，生产无污染、无公害的畜禽产品；嗜酸乳杆菌的免疫作用是通过调节机体免疫系统，限制体内病原体的定植、控制炎症性肠病和代谢紊乱，而使宿主获得健康。益生菌在临床用于治疗免疫系统失调引起的疾病，可明显减少呼吸道感染的感染时间、频率、抗生素的使用时间道，改善过敏性哮喘的治疗效果；嗜酸乳杆菌在临床用于治疗免疫系统失调引起的疾病，可明显减少呼吸道感染的感染时间、频率、抗生素的使用时间道，改善过敏性哮喘的治疗效果。
嗜酸乳杆菌的免疫调节功能在公开文献上有所提及，但现有包括专利等公开文献均为提供一种有效增强机体免疫力的嗜酸乳杆菌，沈曦等在《乳酸杆菌的免疫调剂及抗过敏作用研究》(四川大学学报(医学版)；2016；47(2)；192-196)中将包括嗜酸乳杆菌La28在内的四种乳杆菌投用于小鼠，测定免疫脏器系数与血清Th1细胞因子[干扰素-γ(IFN-γ))、白细胞介素(IL)-12]，然而，投用以上乳杆菌的小鼠免疫脏器系数、血清细胞因子的实验结果并无统计学意义，可见，其并未提供有效调节免疫力的乳杆菌。另外，研究发现，即使是同一种菌的不同菌株，对免疫系统的激活作用差异相当大。
发明内容
本发明提供了一种增强免疫力的嗜酸乳杆菌PBIL2-003的用途，在于能显著改变脾淋巴细胞的活性，诱导细胞增殖和分化，通过促进细胞因子的分泌而增强机体的免疫功能，其效果优于现有已知益生菌，同时具有优秀的耐酸性、耐胆盐特性、以及较强的抑菌能力、对抗生素敏感。
作为本发明的第一个目的，在于提供了一种嗜酸乳杆菌PBIL2-003的新用途，具体为，促进脾淋巴细胞的增殖，从而可以提高机体脾淋巴细胞的免疫应答能力；显著改变脾淋巴细胞的活性，诱导细胞增殖和分化，可通过促进细胞因子的分泌而增强机体的免疫功能；显著增强巨噬细胞吞噬活性，可以参与机体非特异性免疫反应。
作为本发明的另一个目的，在于提供一种含有上述嗜酸乳杆菌PBIL2-003的组合物。
本发明的嗜酸乳杆菌(PBIL2-003)的特征在于，是一种从长寿老人人体中分离并鉴定的嗜酸乳杆菌新型菌株。最早披露于专利申请“一种灵芝益生菌复合发酵产物、制备方法及其应用”(申请号：201911424255.X，申请日：2019.12.31)中，该专利申请仅提及本菌株的名称和保藏信息，未涉及其制备、鉴定和分离方法，以及用途等信息。
为了对该微生物进行鉴定和分离，对嗜酸乳杆菌(PBIL2-003)进行了16S rDNA基因组序列分析，对比结果显示与嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)的同源相似性为99％。该菌属于乳杆菌科中的乳杆菌属，革兰氏阳性杆菌，末端呈圆形，兼性厌氧菌，在pH4.5-9.5生长，最适pH6.5左右。菌体呈长杆状或者呈对状，两端钝圆，不产生芽孢；在MRS琼脂培养基中呈乳白色、半透明状圆形小菌落、边缘不规则。通过菌株细胞形态、生理生化特性、16S rRNA基因序列、pheS基因序列等实验数据综合分析，参考《伯杰氏系统细菌学手册》，菌株的鉴定结果为：嗜酸乳杆菌并命名为嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)，于2018年4月16日保藏于武汉中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M2018208。并利用菌体API 50CH系统进行了鉴定。本发明提供的嗜酸乳杆菌具有增强免疫效果，可促进脾淋巴细胞的增殖，从而可以提高机体脾淋巴细胞的免疫应答能力；能显著改变脾淋巴细胞的活性，诱导细胞增殖和分化，可通过促进细胞因子的分泌而增强机体的免疫功能，能显著增强巨噬细胞吞噬活性，可以参与机体非特异性免疫反应。
在实施例中，提供了菌株的耐酸胆盐特性检测试验、产酸性能及抑菌能力测定、抗生素耐药谱测定证实本发明提供的嗜酸乳杆菌具有耐酸性、耐胆盐特性、具有较强的抑菌能力、安全性好。
在实施例中，通过乳酸菌胞外多糖含量测定，选择EPS含量大于150mg/L的株菌进行体外细胞增殖及免疫刺激实验，进行体外增强免疫力活性测定。由于脾淋巴细胞和巨噬细胞是主要的免疫细胞，淋巴细胞増殖活性和分泌细胞因子水平在评价细胞免疫功能中具有重要意义。巨噬细胞是机体免疫系统中重要的递呈细胞，在特异性免疫反应和非特异性免疫免疫反应中发挥着重要作用。体外脾淋巴细胞增殖试验验证本发明提供的菌株均够促进脾淋巴细胞的增殖，从而可以提高机体脾淋巴细胞的免疫应答能力；脾淋巴细胞分泌IL-2和TNF-a含量的测定结果说明本发明提供的菌株能显著改变脾淋巴细胞的活性，诱导细胞增殖和分化，可通过促进细胞因子的分泌而增强机体的免疫功能；腹腔巨噬细胞吞噬能力的测定结果说明本发明提供的菌株能显著增强巨噬细胞吞噬活性，可以参与机体非特异性免疫反应；动物实验证明本发明提供的嗜酸乳杆菌菌株对试验小鼠无毒性，中剂量和高剂量嗜酸乳杆菌菌株给药可显著提高小鼠的脾脏指数和胸腺指数；ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验说明一定剂量嗜酸乳杆菌菌株可以显著促进小鼠脾淋巴细胞增殖；小鼠碳廓清实验证实高剂量的嗜酸乳杆菌增加了免疫抑制小鼠的细胞吞噬能力；NK细胞活性测定结果证实嗜酸乳杆菌增强小鼠的非特异性免疫水平；小鼠肠道菌群检测证实中剂量和高剂量嗜酸乳杆菌显著增加了乳酸杆菌数量，降低大肠杆菌数量，通过增加有益菌比例，可达到平衡肠道菌群的目的。
将嗜酸乳杆菌菌株制备冻干菌粉，冻干保护剂如下：蔗糖10-15％、奶粉15-20％、甘油1-3％、壳聚糖1-3％、谷氨酸钠2-4％，其中百分比为质量百分比。
本发明还提供了冻干粉组合物的制备方法，其步骤如下：
步骤一，制备保护剂
保护剂配方：蔗糖10-15％、奶粉15-20％、甘油1-3％、壳聚糖1-3％、谷氨酸钠2-4％，将上述原料混合后与1T大罐发酵培养得到的菌泥按重量1:(2-4)比例，按500-800rpm速率进行搅拌混匀后得到菌泥混合液；
步骤二，菌粉包被
将菌泥混合液按1:1-2的比列加入到2-5％的变性淀粉溶液中，按500-800rpm速率进行搅拌混匀后，于冰箱中于-20℃预冻6h后，在-50℃、真空度30pa真空冷冻干燥机中冷冻干燥48h后，进行高速粉碎获得。
本发明提供的含有以上嗜酸乳杆菌的组合物，其安全性具有保证，避免了副作用，可作为具有增强免疫力作用的食品或保健食品。
所述组合物，可以是生物化学领域公知的制剂剂型，如片剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂等口服药物制剂形式，可以增加制剂领域公知的赋形剂。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供了一种新型嗜酸乳杆菌，具有优秀的耐酸、耐胆盐特性，对抗生物敏感，服用安全；通过灌胃给药可以平衡免疫低下小鼠的肠道菌群，增强免疫器官及免疫细胞功能，促进免疫细胞增殖，提高免疫细胞活力，提高机体特异性免疫和非特异性免疫水平。通过实验结果显示，嗜酸乳杆菌菌株可通过消化道进入机体体现其功能性，但在免疫功能调节方面具有剂量依赖性，服用有效剂量菌株可体现出更好的免疫调节作用。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明提供的嗜酸乳杆菌PBIL2-003形态图片；
图2为8株菌多糖含量测定结果；
图3为7株菌对脾淋巴细胞增殖(PI)指数；
图4为共培养上清液中IL-2和TNF-α含量结果；
图5为筛选获得的菌株J-8制备的冻干菌粉30℃稳定性试验中菌粉存活情况曲线图；
图6为筛选获得的菌株J-8制备的冻干菌粉35℃稳定性试验中菌粉存活情况曲线图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
实施例1：嗜酸乳杆菌PBIL2-003的分离与鉴定。
采集新鲜的烟台市莱州市驿道镇的初家村百岁健康老人粪便，用无菌取样瓶封好后放入冰盒内带回实验室，无菌条件下取粪便中部1g样品至100mL带玻璃珠的灭菌生理盐水中，180rpm摇匀30min后，移液管吸取1-2ml摇匀的混悬液于灭菌MRS液体培养基中，37℃厌氧富集培养24h后，用无菌接种针蘸取培养液在含3％CaCO3的MRS固体培养基划线，37℃厌氧恒温静置培养48h后，挑取培养基上具有明显透明圈的单菌落，接种到斜面上培养24h后进行革兰氏染色、镜检。
根据分离菌的菌落和菌体形态，革兰氏染色以及生理生化反应，按《伯杰氏细菌鉴定手册》进行初步归属。按照北京天根“细菌基因组DNA提取试剂盒”说明书提取菌体总DNA，采用16S通用引物扩增16S rDNA基因组序列。将PCR产物送北京博尚生物技术有限公司进行序列测定，将获得16S rDNA基因序列在NCBI进行BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)比对。通过序列比对，共分离菌株15株，其中7株植物乳杆菌、3株鼠李糖乳杆菌、2株干酪乳杆菌、1株罗伊氏乳杆菌、2株嗜酸乳杆菌。
实施例2：菌株耐酸耐胆盐特性检测
转接活化分离获得的15株菌，将目的菌株接种于灭菌的液体MRS培养基中培养24-36h后，按4％转接量接种pH＝3.0的MRS液体培养基，发酵20-24h后测定菌株吸光度，筛选吸光度＞1.0的菌株，结果如表1所示：
表1 15株菌在pH＝3.0的MRS液体培养基培养后OD值表
Figure BDA0002423818170000051
Figure BDA0002423818170000061
通过测定15株乳酸杆菌在pH＝3.0的MRS液体培养基发酵20-24h后的吸光度，结果显示其中仅有J-3和J-9两株菌发酵液OD值＜1.0，说明该两株乳酸菌在酸性条件下存活率较低，耐酸性较差。
将初步筛选获得的13株乳酸杆菌活化后，接种于灭菌的液体MRS培养基中培养20h，按4％转接量接种接种于pH＝2.4和0.3％浓度胆盐的灭菌MRS中37℃培养，分别于0min、10min、1h、2h取菌悬液，进行平板菌落计数，计算菌株耐酸耐胆盐能力，实验结果如表2所示：
表2 13株菌在pH＝2.0及0.3％浓度胆盐的MRS液体培养基不同时间段内存活率表
Figure BDA0002423818170000062
对13株乳酸杆菌在pH＝2.0的不同时间段及0.3％浓度胆盐不同时间段的耐受性检测，耐酸结果显示：13株菌在不用时间段内耐酸性差异很大，2h内存活率＞10％的菌株有9株；耐胆盐结果与耐酸结果相似，不同菌株间差异较大，9株耐酸性较强的菌株中耐胆盐能力均＞10％，说明其耐胆盐能力较强。
实施例3：产酸性能及抑菌能力的测定
将目的菌株种子液以2％接种量接种到初始pH值一致的MRS培养基中，37℃静置培养20h后，采用pH计，测定发酵液的pH值。
纯菌培养液以4000r/min离心30min，取其上清液，采用钢圈法进行抑菌试验。将大肠杆菌、沙门氏菌及金黄色葡萄球菌分别涂布培养基表面，每皿均匀内置无菌钢圈3个，其中两个钢圈内加满发酵液上清液，另一钢圈内以灭菌生理盐水作对照。对筛选获得的9株耐酸性较强的菌株，检测其对3种致病菌的抑菌能力，结果如表3所示：
表3 9株菌对3种致病菌的抑制作用(mm)表
菌株 大肠杆菌 沙门氏菌 金黄色葡萄球菌 pH
J-1 11.8±0.19 12.4±0.03 11.3±0.78 3.78±0.07
J-4 10.9±0.45 12.5±0.17 12.8±0.03 3.50±0.28
J-6 12.4±0.08 13.2±0.05 11.3±0.04 3.73±0.21
J-8 12.4±0.14 15.4±0.74 12.9±0.72 3.59±0.07
J-10 11.8±0.06 13.5±0.01 12.7±0.81 3.60±0.08
J-11 12.4±0.09 11.2±0.04 12.0±0.65 3.60±0.14
J-12 11.8±0.02 15.2±0.62 13.8±0.13 3.70±0.14
J-13 10.9±0.14 12.3±0.14 12.3±0.48 3.59±0.14
J-14 13.0±0.07 12.7±0.14 12.50±0.01 3.68±0.04
抑菌结果显示：9菌株对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌3种指示菌抑菌圈直径均在10mm以上，说明该9株菌有较强的抑菌能力。
实施例4：抗生素耐药谱测定
研究证实，乳酸菌耐药性存在菌株差异性，作为进入人和动物机体的外源性活菌在肠道内生长、定植、繁殖，其耐药基因可能以各种方式在肠道内微生物菌群之间相互传递，从而导致某些致病菌也获得了耐药性。因此，对乳酸菌的耐药性进行检测与分析在益生菌制品安全性评价上十分必要；菌株筛选使用时，应选择对各种抗菌药物敏感的菌株，以减少食品安全隐患。
将纯化的菌体划线取单菌落，悬于3mL生理盐水中，并调整菌体浊度为0.5麦氏单位。用棉签均匀涂布MRS培养基表面，用灭菌镊子取药敏纸片贴于培养基表面，培养18-24h后取出，用游标卡尺测量抑菌圈直径，结果如表4所示。
表4抗生素耐药谱测定实验抑菌圈直径(mm)测量结果表
Figure BDA0002423818170000081
本研究中选用常见的8种抗生素进行耐药测定结果显示，9株菌均对链霉素有抗性，J-10对庆大霉素存在抗性，其余8菌株对其不敏感；9株菌对其余6种抗生素敏感，说明菌株对抗生素耐药性较差，使用过程中不会导致耐药性问题产生，考虑菌株实际使用情况，对除J-10外的其余8株菌进行相关提升免疫力功能性指标检测。
实施例5：乳酸菌胞外多糖含量测定
乳酸菌其胞外多糖(EPS)是指乳酸菌在培养基中发酵产生的一类结构复杂的糖类化合物，可参与细胞的代谢，转化、分裂及免疫调节等生理过程，具有保护菌株不受外界侵害，抗氧化、抗肿瘤、调节机体免疫等功效，研究者发现LAB EPS能促进小鼠抗体形成、增强巨噬细胞的吞噬功能，增强机体免疫，且多项体外试验结果表明EPS可以清除各类自由基，对某些自由基的清除效果甚至超越了Vc的清除效果。目前，多种多糖已经应用于临床研究，研究其抗衰老、抗病毒、抗肿瘤等作用，广泛应用于医药行业。
方法：将筛选得到的乳酸菌菌株接种于MRS液体培养基中，37℃培养48h，取10mL发酵液加5ml，体积分数为80％三氯乙酸搅拌，充分搅拌，于4℃、16000rpm离心20min，收集上清液。在上清液中加3倍体积的95％的乙醇，沉淀过夜。于4℃、16000rpm下离心20min，收集沉淀并用蒸馏水溶解，装入透析袋，透析48h，得胞外粗多糖水溶液。采用苯酚-硫酸法测定多糖的含量。8株菌多糖含量测定结果如图2所示：
测定结果显示：同一条培养条件下，不同菌株产EPS含量差异很大，范围在131-295mg/L，说明不同菌株生长代谢存在差异，其功能性有所不同，选择EPS含量大于150mg/L的7株菌进行体外细胞增殖及免疫刺激实验，进行体外增强免疫力活性测定。
实施例6：体外细胞免疫活性调节分析
免疫细胞是免疫系统的核心，是机体发挥免疫作用的主力军，细胞免疫功能的发挥主要通过其本身及其分泌的细胞因子和抗体。脾淋巴细胞和巨噬细胞是主要的免疫细胞，淋巴细胞増殖活性和分泌细胞因子水平在评价细胞免疫功能中具有重要意义。巨噬细胞是机体免疫系统中重要的递呈细胞，在特异性免疫反应和非特异性免疫免疫反应中发挥着重要作用。益生菌在提高和调节免疫力方面的研究被广泛关注。
6.1体外脾淋巴细胞增殖验证
将试验菌株以2％的接种量接种至MRS液体培养基中，标记后置于37℃下培养24h，活化两代后收集菌液，将菌液在4℃条件下6000rpm离心10min，用无菌0.01mol/L、pH 7.4的PBS重悬菌沉淀，弃去上清液，用含10％胎牛血清的RPMI-1640完全培养液重悬菌沉淀，调整各菌株的菌悬液浓度为108CFU/mL。
小鼠脾淋巴细胞的制备：(参考刘东方等，人源乳酸菌筛选及其对小鼠免疫调节作用的研究)固定小鼠，摘眼球放血颈椎脱臼处死小鼠，75％乙醇浸泡3-5min，沿腹腔中线剪开小鼠胸腔，无菌取出脾脏置于浸没于盛有Hank’s液的平皿中的200目不锈钢网筛中，研磨脾脏组织，收集脾脏组织悬液于无菌离心管中，1000rpm离心5min，弃清液，加入2-3mL红细胞裂解液，混匀后静置2-3min，1000rpm离心5min弃上清液，再用RPMI-1640不完全培养基离心洗涤细胞2次。收集细胞，用含10％胎牛血清的RPMI-1640完全培养基重悬细胞，细胞悬液用台盼蓝染色后，血球计数板计数，保证活细胞比例不小于95％，计数后用含10％胎牛血清的RPMI-1640完全培养基调整脾细胞浓度为1×106个/mL备用。
脾细胞增殖试验：在无菌96孔细胞培养板中，设空白组(培养液200μL)、阴性对照组(浓度为1×106个/mL的淋巴细胞悬液180μL，20μL培养液)、阳性对照组(浓度为1×106个/mL的淋巴细胞悬液180μL，20μL浓度为5μg/mL的Con A)、乳酸菌对照组(培养液180μL，20μL浓度为108CFU/mL的菌悬液)、试验组(浓度为1×106个/mL的淋巴细胞悬液180μL，20μL浓度为108CFU/mL菌悬液)，加样混匀后，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中连续培养48h，加入新鲜配制成CCK-8溶液20μL，继续培养4h，振荡混匀，然后用酶标仪在450nm波长处测定光密度值(OD)，根据下列公式计算脾淋巴细胞转化值和脾淋巴细胞增殖指数(PI)。
脾淋巴细胞增殖指数PI＝(DD1-OD3)/OD2；
OD1为试验组OD值；OD2为阳性对照组OD值；OD3为乳酸菌OD值；PI>1时提示促进增殖；PI<1时提示抑制增殖。
7株菌对脾淋巴细胞增殖指数，结果如图3所示。
结果显示：当各乳酸菌与脾细胞以100:1的比例共同孵育时，除J-1\12外，其余5菌株的PI指数均＞1，说明除J-1\12菌外，其余菌株均够促进脾淋巴细胞的增殖，从而可以提高机体脾淋巴细胞的免疫应答能力。其中J-8\11的增殖作用最为明显，显著高于其他菌株。
6.2脾淋巴细胞分泌IL-2和TNF-α含量的测定
96孔板每孔中加入脾淋巴细胞悬液100μL，在37℃、5％CO2培养箱培养化后，用PBS溶液洗板2次除去未贴壁细胞。向每孔中各加入200uL的不同菌悬液，空白对照组加入200uL的细胞培养液，阳性对照组加入200uL ConA，培养48h后1500转离心10min，收集上清，按照试剂盒指示的操作建立标准曲线并测定共培养上清液中IL-2和TNF-α含量，结果如图4所示。
IL-2是淋巴细胞分泌的重要细胞因子，可以诱导淋巴细胞增殖分化，在调节免疫功能和抗肿瘤方面有着重要的作用。TNF-α由淋巴细胞和巨噬细胞分泌的一种重要的免疫调节因子，能杀伤和抑制肿瘤细胞，促进中性粒细胞吞噬，是重要的炎症因子，并参与某些自身免疫病的病理损伤。
与对照组相比，不同菌株诱导淋巴细胞分泌IL-2的含量各不相同，但均有一定升高，说明菌株不同对细胞的刺激效果存在差异性，其中J-6\8\11\13的含量＞25ng/L；不同菌株诱导淋巴细胞分泌TNF-α的含量也各不相同，但与对照组相比，均有一定升高，其中J-6\8\11\14的含量＞25ng/L；综合比较2种免疫因子增加量，其中J-8效果最好，J-11次之。进一步说明该2株菌能显著改变脾淋巴细胞的活性，诱导细胞增殖和分化，可通过促进细胞因子的分泌而增强机体的免疫功能。
6.3腹腔巨噬细胞吞噬能力的测定
腹腔巨噬细胞的制备：小鼠眼球放血颈椎脱白处死后，置于75％乙醇溶液浸泡5min以消毒皮肤，暴露出腹膜壁酒精擦洗后，用无菌注射器抽10mL Hank’s液，注入腹腔中，敲打轻柔2-3min，使腹腔巨噬细胞尽可能多地悬浮在液体中；用无菌支注射器抽出腹腔悬液，1000r/min离心5min，弃上清液；用RPMI-1640完全培养液吹打细胞使其成为单细胞悬液，血球计数板计数，确保活细胞比例不小于95％，调整细胞浓度为1×106个/mL。
巨噬细胞吞噬中性红能力测定：将100μL巨噬细胞接种于96孔板，细胞在37℃、5％CO2培养箱中培养4h，弃去上清液，贴壁细胞即为巨噬细胞。每孔重新加入含10％血清的RPMI-1640培养液和终浓度分别为108CFU/m L的菌悬液各100μL，对照组加等体积的无菌水。细胞在37℃、5％CO2培养箱中培养24h，弃去上清液，加入0.1％中性红染色液100μL，继续培养30min，弃去中性红染色液，用PBS清洗3次以除去未被吞噬的中性红溶液，后加入200μL细胞裂解液(冰醋酸:无水乙醇＝1:1，v/v)，继续培养2h，振荡混匀，用酶标仪在540nm处测定光密度值，结果如表5所示。
表5各菌株在540nm处光密度值
Figure BDA0002423818170000111
Figure BDA0002423818170000121
当乳酸菌活菌数与细胞以100:1的比例共同孵育时，与对照组相比，所有菌株均对提高巨噬细胞的吞噬作用有一定的促进作用，但不同菌株间的差异很大，7株菌种，J-8对于巨噬细胞吞噬中性红能力的诱导作用最强，其次为J-11，显著高于对照组，说明该2株菌株能显著增强巨噬细胞吞噬活性，可以参与机体非特异性免疫反应。
通过分析对比J-8、J-11的生物学特性、耐酸耐胆盐能力、抑菌能力、抗生素敏感性、胞外多糖含量、体外细胞免疫活性调节能力，综合选择特性更优的菌株J-8进行动物验证，检测体内提高机体免疫能力。
通过菌株细胞形态、生理生化特性、16S rRNA基因序列、pheS基因序列等实验数据综合分析，参考《伯杰氏系统细菌学手册》，菌株的鉴定结果为：嗜酸乳杆菌。菌体API 50CH系统鉴定如表6及形态图片如图1所示：
表6菌株J-8API 50CH系统鉴定结果
Figure BDA0002423818170000122
测定结果通过系统软件对比后，显示J-8菌株为嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)。按照北京天根“细菌基因组DNA提取试剂盒”说明书提取菌体总DNA，采用16S通用引物扩增16SrDNA基因组序列。将PCR产物送北京博尚生物技术有限公司进行序列测定，将获得16SrDNA基因序列在NCBI进行BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)比对，对比结果显示J-8与嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)的同源相似性为99％。该菌属于乳杆菌科中的乳杆菌属，革兰氏阳性杆菌，末端呈圆形，兼性厌氧菌，在pH4.5-9.5生长，最适pH6.5左右。菌体呈长杆状或者呈对状，两端钝圆，不产生芽孢；在MRS琼脂培养基中呈乳白色、半透明状圆形小菌落、边缘不规则。
实施例7：动物实验
实验方法：
实验动物采用SPF级雄性昆明小鼠，体重20±2g，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司。每组20只，预饲7d后，进行灌胃给药处理；处理方式如表7所示，实验分组设一个空白对照组、模型组、阳性对照组(某品牌增强免疫力保健食品，主要活性成分为1.1g/100g总皂苷、0.3g/100g粗多糖)和三个J-8菌粉剂量组，具体给药剂量见表1，连续给药30d后，空白对照组除外，在第20d连续两天小鼠腹腔注射免疫抑制剂环磷酰胺(CTX，40mg/kg)进行免疫抑制造模处理，继续灌胃30d后，进行实验处理及指标检测。
表7动物实验分组及处理方式
分组 人体剂量cfu/d 处理方式
空白组 -- 灌胃生理盐水0.1ml/10g/d
模型组 -- 灌胃生理盐水0.1ml/10g/d
阳性组 1.6g/d 灌胃生理盐水0.1ml/10g/d(含固体粉末2.67mg)
J-8低剂量 3.0×10<sup>9</sup> 灌胃J-8菌液0.1ml/10g/d(活菌数5.0×10<sup>6</sup>cfu)
J-8中剂量 6.0×10<sup>9</sup> 灌胃J-8菌液0.1ml/10g/d(活菌数1.0×10<sup>7</sup>cfu)
J-8高剂量 1.2×10<sup>10</sup> 灌胃J-8菌液0.1ml/10g/d(活菌数2.0×10<sup>7</sup>cfu)
(1)免疫脏器指数：
实验过程监控实验小鼠生长状况及状态，实验结束后，各实验组小鼠生长状况较好，体征及状态无不良变化，未出现明显疾病及死亡情况，表明J-8菌株对实验小鼠无毒性。
末次给药结束后，禁食不禁水12h，称量小鼠体重，处死后，在无菌条件下，取小鼠脾脏和胸腺，去除粘连组织，滤纸吸干后称重，计算免疫脏器指数(mg/g)＝脾脏或胸腺重量(mg)/小鼠体重(g)，结果如表8所示。
表8小鼠脾脏和胸腺脏器指数检测结果
Figure BDA0002423818170000131
Figure BDA0002423818170000141
与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001
脾脏和胸腺脏器指数能直接反应小鼠机体的免疫能力，小鼠脾脏和胸腺脏器指数检测结果见表8，结果显示，与空白组比较，免疫抑制剂造模处理后，模型组的脾脏指数和胸腺指数显著降低(P＜0.001)，说明使用CTX进行免疫抑制造模成功。与模型组比较，阳性组、中剂量和高剂量J-8菌株给药可显著提高小鼠的脾脏指数和胸腺指数。
(2)ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验
小鼠T淋巴细胞会受ConA刺激后母细胞发生增殖反应，活性增殖细胞中的线粒体水解酶可以分解MTT(唑氮盐)为蓝紫色结晶，取小鼠脾细胞悬液进行淋巴细胞增殖反应，通过加ConA处理的光密度值减去不加ConA处理的光密度值能反映细胞的增殖情况，结果如表9所示。
表9 ConA诱导脾淋巴细胞增殖检测结果
分组 OD570/光密度差值
空白组 0.38±0.034***
模型组 0.19±0.021
阳性组 0.32±0.037*
J-8低剂量 0.21±0.029
J-8中剂量 0.26±0.050*
J-8高剂量 0.31±0.042*
与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001
脾脏是重要的免疫器官，其中的淋巴细胞的增殖能力直接影响到机体免疫水平。ConA诱导脾淋巴细胞增殖检测结果见表9，其中空白组与模型组比较，光密度差值具有显著性差异(P＜0.001)，说明免疫抑制剂显著降低了小鼠T淋巴细胞的增殖能力；阳性组、中剂量和高剂量J-8菌株组光密度差值显著高于模型组，高剂量组淋巴细胞增殖能力接近阳性对照组，说明一定剂量J-8菌株可以显著促进小鼠脾淋巴细胞增殖(P＜0.05)。
(3)小鼠碳廓清实验
小鼠碳廓清实验是通过小鼠尾静脉注射墨汁，在不同时间测定小鼠的血液光密度值，在一定范围内，体内碳颗粒被清除速率与血碳浓度呈指函数关系，计算吞噬指数表示小鼠碳廓清能力，来反映单核吞噬细胞对外来异物的吞噬功能，进一步体现机体的免疫能力，结果如表10所示。
表10小鼠碳廓清吞噬指数测定结果
分组 吞噬指数
空白组 4.85±0.73**
模型组 3.61±0.26
阳性组 4.58±0.34*
J-8低剂量 3.91±0.22
J-8中剂量 4.17±0.35
J-8高剂量 4.31±0.42*
与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001
小鼠碳廓清吞噬指数测定结果见表10，与模型组比较，空白组吞噬指数达到4.85，对墨汁吞噬能力具有显著性差异，说明免疫抑制剂降低了小鼠吞噬细胞的吞噬能力，造模成功；与模型组比较，其中J-8低剂量和中剂量组吞噬指数增加，但没有显著性差异，高剂量组体现出显著性差异(P＜0.05)，增加了免疫抑制小鼠的细胞吞噬能力。
(4)NK细胞活性测定
当细胞受到NK细胞杀伤后，活细胞胞浆内的乳酸脱氢酶(LDH)可以透过细胞膜，释放到胞外，进一步反应生成紫红色化合物，可以在酶标仪490nm比色测定，计算获得NK细胞活性，获得机体非特异性免疫水平，结果如表11所示。
表11小鼠NK细胞活性测定结果
Figure BDA0002423818170000151
Figure BDA0002423818170000161
与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001
小鼠NK细胞活性测定结果见表11，与空白组比较，免疫抑制模型组小鼠NK细胞活性显著降低；通过J-8菌株给药处理，增加了小鼠NK细胞的活性，其中剂量组(P＜0.05)和高剂量组(P＜0.01)可以显著提高小鼠NK细胞活性，增强小鼠的非特异性免疫水平，其中剂量组与阳性组NK细胞活性一致。
(5)小鼠肠道菌群检测
实验结束后，无菌条件下取小鼠盲肠粪便，进行乳酸杆菌和大肠杆菌的梯度稀释计数培养，结果如表12所示。
表12小鼠肠道菌群测定结果
分组 乳酸杆菌(log cfu/g) 大肠杆菌(log cfu/g)
空白组 9.32±0.14** 7.48±0.16
模型组 6.71±0.18 7.92±0.21
阳性组 6.89±0.13 7.61±0.14
J-8低剂量 7.26±0.17 6.77±0.19
J-8中剂量 8.66±0.15* 6.65±0.14*
J-8高剂量 9.85±0.21** 6.39±0.17*
与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001
实验结束后进行小鼠盲肠内乳酸杆菌和大肠杆菌计数检测，检测结果见表12，结果显示通过免疫抑制剂处理小鼠，小鼠肠道乳酸杆菌数量显著降低(P＜0.01)，大肠杆菌数量增加，但无显著差异，说明小鼠肠道菌群平衡被打破；不同剂量J-8活菌给药处理后，与模型组比较，阳性组和低剂量J-8活菌处理组对小鼠肠道乳酸杆菌和大肠杆菌无显著影响，但中剂量和高剂量处理组显著增加了乳酸杆菌数量，降低了大肠杆菌数量，通过增加有益菌比例，达到平衡肠道菌群的目的。
综上所述，通过灌胃给药J-8菌株可以平衡免疫低下小鼠的肠道菌群，增强免疫器官及免疫细胞功能，促进免疫细胞增殖，提高免疫细胞活力，提高机体特异性免疫和非特异性免疫水平。通过实验结果显示，J-8菌株可通过消化道进入机体体现其功能性，但在免疫功能调节方面具有剂量依赖性，服用有效剂量J-8菌株可体现出更好的免疫调节作用。
实施例8：菌粉贮存期稳定性检测
将筛选获得的菌株J-8制备的冻干菌粉，冻干保护剂如下：蔗糖10-15％、奶粉15-20％、甘油1-3％、壳聚糖1-3％、谷氨酸钠2-4％，其中百分比为质量百分比。
冻干粉的制备方法，其步骤如下：
步骤一，制备保护剂
保护剂配方：蔗糖10-15％、奶粉15-20％、甘油1-3％、壳聚糖1-3％、谷氨酸钠2-4％，将上述原料混合后与1T大罐发酵培养得到的菌泥按重量1:(2-4)比例，按500-800rpm速率进行搅拌混匀后得到菌泥混合液；
步骤二，菌粉包被
将菌泥混合液按1:1-2的比列加入到2-5％的变性淀粉溶液中，按500-800rpm速率进行搅拌混匀后，于冰箱中于-20℃预冻6h后，在-50℃、真空度30pa真空冷冻干燥机中冷冻干燥48h后，进行高速粉碎获得。
将上述步骤获得的冻干粉分别置于在恒温30、35℃、相对湿度为5-10％的条件下储存10W，每1W取样一次进行梯度计数，研究菌粉在此过程中的存活情况，实验结果如图5、6所示。30℃条件下，冻干粉在10W内加速稳定性结果显示，菌粉在该温度下比较稳定，前期下降较快，后期趋于稳定，存活率下降速度显著低于35℃的存活率，保存10W后存活率依旧高于42.84％。35℃条件下，由于存放温度较高，菌粉相对下降较快，6W时活菌数下降接近1个数量级，但10W后活菌数依旧大于106cfu/g，适合益生菌类食品中应用需求。结果进一步提示，高温对菌粉的损失率影响较大，低温条件下菌粉更为稳定。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种嗜酸乳杆菌PBIL2-003(Lactobacillus acidophilus PBIL2-003)的用途，其特征在于，所述嗜酸乳杆菌可促进脾淋巴细胞的增殖，从而可以提高机体脾淋巴细胞的免疫应答能力。
2.根据权利要求1所述的一种嗜酸乳杆菌PBIL2-003的用途，其特征在于，诱导淋巴细胞分泌细胞因子TNF-α、IL-2而增强机体的免疫功能。
3.根据权利要求1所述的一种嗜酸乳杆菌PBIL2-003的用途，其特征在于，显著增强巨噬细胞吞噬活性，可以参与机体非特异性免疫反应。
4.一种含权利要求1～3任一项所述嗜酸乳杆菌PBIL2-003的组合物，其特征在于，所述组合物为冻干粉组合物。
5.根据权利要求4所述的含有嗜酸乳杆菌PBIL2-003的组合物，其特征在于，所述冻干粉组合物中冻干粉的制备方法步骤如下：
步骤一，制备保护剂
保护剂配方：蔗糖10-15％、奶粉15-20％、甘油1-3％、壳聚糖1-3％、谷氨酸钠2-4％，将上述原料混合后与1T大罐发酵培养得到的菌泥按重量1:(2-4)比例，按500-800rpm速率进行搅拌混匀后得到菌泥混合液；
步骤二，菌粉包被
将菌泥混合液按1:1-2的比列加入到2-5％的变性淀粉溶液中，按500-800rpm速率进行搅拌混匀后，于冰箱中于-20℃预冻6h后，在-50℃、真空度30pa真空冷冻干燥机中冷冻干燥48h后，进行高速粉碎获得。
6.根据权利要求5所述的一种组合物，其特征在于，所述冻干粉组合物为粉剂、片剂、硬胶囊、颗粒剂。
7.根据权利要求5所述的一种组合物，其特征在于，所述组合物为具有增强免疫力作用的食品或保健食品。
8.根据权利要求5所述的一种组合物，其特征在于，为口服形式。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN111896655A (zh) * 2020-08-05 2020-11-06 中国农业大学 一种用于分析与发掘消化道益生菌产生的功能性代谢物的方法
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