CN116875500B - 利用罗伊氏乳杆菌YSs207制备调节人体微生态平衡的生物活性物质及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体提供了一种利用罗伊氏乳杆菌YSs207制备调节人体微生态平衡的生物活性物质及其应用。本发明所述的包含罗伊氏乳杆菌的生物活性物质，包括如下组分：膳食纤维、桑叶粉、菊粉、甘草粉和罗伊氏乳杆菌YSs207。本发明的生物活性物质制备工艺简单、成本低廉、使用方便，且具有良好的调节人体微生态平衡的作用。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种利用罗伊氏乳杆菌YSs207制备调节人体微生态平衡的生物活性物质及其应用。
背景技术
人体所携带的微生物细胞数达百万亿之多，这些数量庞大的共生微生物群体主要分布于人体的皮肤、口腔以及胃肠道，其中肠道是微生物最为集中的部位。实验证实，在人体微生态系统中，肠道微生态是主要的，最活跃的，对人体健康具有显著的影响。肠道微生态系统是指由肠道菌群等生物成分与食源性非生物成分(未被消化的食物)以及来自胃、肠、胰和肝的分泌物(如激素、酶、黏液和胆盐等)共同构成的位于肠道的局部的生态系统。可以说肠道菌群对宿主的营养、代谢以及免疫功能起到了至关重要的作用，对维持人体健康十分重要，是实现宿主正常生理功能不可或缺的一部分。
肠道是人体消化吸收的重要场所，也是人体最大的免疫器官，并有研究称肠道为人体第二个大脑，原因在于肠道内广泛分布的神经系统。肠道的健康取决于肠道的活动性。健康人体中病菌会受到肠内有益菌群的抵抗，不能在短时间内侵入人体其他的循环，很快就随着大小便排出体外，不能致使人生病，但是一旦肠道内的菌群失衡，有害细菌与食物发酵产生气体会导致腹胀、恶心、呕吐；肠道运动畅，大便很容易积累在肠内，形成宿便，成为各种疾病的根源。肠道菌群间的平衡受宿主的生理、食物、药物和肠道菌的相互作用等影响，各种因素都会破坏菌相间的平衡，导致肠道从有益菌占优势转向有害菌占优势，从而造成许多肠道疾病。因此，增加肠道有益菌的数量，减少有害菌数量，是保证肠胃健康运转的关键所在。
目前，调整肠道菌群的方式主要以补充益生菌种类和数量、补充益生菌所需营养物质、抑制或杀灭肠道有害菌、增强人体免疫力以提高巨噬细胞对有害菌的吞噬作用等方式以达到肠道菌群平衡的目的。尽管如此，但是现有包含益生菌的补剂大多在加工、运输及保质期储存的过程中容易丧失活性，不易维持长期稳定，或进入人体胃肠道，与胃酸、胆汁或消化液等人体内环境接触后，会大量死亡或凋亡，益生菌的效用减弱。因此，获得一种长期温度，且能改善肠道微生态平衡的组合物尤其重要。
罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)是已报道的几乎天然存在于所有脊椎动物和哺乳动物肠道内的乳酸菌。罗伊氏乳杆菌对肠黏膜具有很强的黏附能力，可改善肠道菌群分布，拮抗有害菌定植，避免罹患肠道疾病；罗伊氏乳杆菌能产生一种被称为“罗伊氏菌素(Reuterin)”的非蛋白质类广谱抗菌物质，能广泛抑制革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母、真菌和病原虫等的生长。罗伊氏乳杆菌益生菌制剂可改善人体机能，提高免疫力从而促进人体健康。
发明内容
本发明的目的就在于利用罗伊氏乳杆菌YSs207制备调节人体微生态平衡的生物活性物质，该生物活性物质制备工艺简单、成本低廉、使用方便，且具有良好的调节人体肠道微生态的作用，进而实现进一步调节人体微生态的作用。
本发明的目的是通过如下方案实现的：
本发明的目的是通过如下方案实现的：
一种罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）YSs207，所述罗伊氏乳杆菌YSs207于2023年03月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址武汉，保藏编号为CCTCC NO:M 2023347。
一种生物活性物质，包含罗伊氏乳杆菌YSs207。
在本发明中，所述包含罗伊氏乳杆菌YSs207的生物活性物质，包括如下组分：膳食纤维、桑叶粉、菊粉、甘草粉和罗伊氏乳杆菌YSs207。
进一步地，按重量份数计算，包括如下组分：5～15份膳食纤维、1～10份桑叶粉、1～6份菊粉、1～6份甘草粉和15～35份罗伊氏乳杆菌YSs207。
进一步地，以重量份数计算，所述膳食纤维：桑叶粉：菊粉；甘草粉为1～4:1～3:0.5～1.5:0.5～1.5。
进一步地，以重量份数计算，所述膳食纤维：桑叶粉：菊粉；甘草粉为3:2:1:1或2:1:1:1。
进一步的，还包括瑞士乳杆菌粉、双歧杆菌粉或嗜酸乳杆菌粉中的一种或多种。
在本发明的一个实施方式中，所述包含罗伊氏乳杆菌的生物活性物质，按重量份数计算，包括如下组分：5～15份膳食纤维、1～10份桑叶粉、1～6份菊粉、1～6份甘草粉、15～25份罗伊氏乳杆菌YSs207、5～15份瑞士乳杆菌粉、10～20份双歧杆菌粉和5～15份嗜酸乳杆菌粉。
进一步地，还包含低聚麦芽糖。
优选地，以重量份数计算，所述低聚麦芽糖为1～10份。
进一步地，还包含低聚木糖。
优选地，以重量份数计算，所述低聚木糖为5～15份。
在本发明的一种实施方式中，所述包含罗伊氏乳杆菌的生物活性物质，按重量分数计算，包括如下组分：5～15份膳食纤维、1～8份桑叶粉、1～10份菊粉、1～8份甘草粉、1～10份低聚麦芽糖、5～15份低聚木糖、20～40份罗伊氏乳杆菌YSs207、15～25份瑞士乳杆菌粉、10～20份双歧杆菌粉和5～15份嗜酸乳杆菌粉。
本发明还提供一种罗伊氏乳杆菌YSs207在制备调节人体微生态平衡药物中的应用；优选地，在制备调节肠道微生态平衡药物中的应用。
本发明还提供一种上述包含罗伊氏乳杆菌YSs207的生物活性物质在制备调节人体微生态平衡药物中的应用；优选地，在制备调节肠道微生态平衡药物中的应用。
在本发明中，所述调节人体肠道微生态平衡包括抑制肠道有害菌增殖，所述有害菌可选地包括大肠杆菌、沙门氏菌、气荚膜杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌等；优选大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌。
本发明的有益效果：
本发明提供的罗伊氏乳杆菌YSs207及包含其的生物活性物质，一方面可耐受胃酸、胆盐等机体胃肠内环境，增加益生菌存活率，使益生菌能够在肠道发挥作用；另一方面可调节肠道环境，辅助人体微生态平衡。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
实施例1
按重量份数计算，分别称取10份膳食纤维、5份桑叶粉、5份菊粉、5份甘草粉，混匀；再加入20份罗伊氏乳杆菌YSs207、10份瑞士乳杆菌粉(LH43)、15份双歧杆菌粉(BB14)、10份嗜酸乳杆菌粉(LA1063)，混匀，将混匀后的组合物过80目筛即得。
实施例2
按重量份数计算，分别称取3份膳食纤维、9份桑叶粉、6份菊粉、5份甘草粉，混匀；再加入20份罗伊氏乳杆菌YSs207、10份瑞士乳杆菌粉(LH43)、15份双歧杆菌粉(BB14)、10份嗜酸乳杆菌粉(LA1063)，混匀，将混匀后的组合物过80目筛即得。
实施例3
按重量份数计算，分别称取12份膳食纤维、8份桑叶粉、4份菊粉、4份甘草粉、5份低聚麦芽糖、9份低聚木糖，混匀；再加入20份罗伊氏乳杆菌YSs207、10份瑞士乳杆菌粉(LH43)、15份双歧杆菌粉(BB14)、10份嗜酸乳杆菌粉(LA1063)，混匀，将混匀后的组合物过80目筛即得。
实施例4
按重量份数计算，分别称取12份膳食纤维、8份桑叶粉、4份菊粉、5份低聚麦芽糖、9份低聚木糖，混匀；再加入20份罗伊氏乳杆菌YSs207、10份瑞士乳杆菌粉(LH43)、15份双歧杆菌粉(BB14)、10份嗜酸乳杆菌粉(LA1063)，混匀，将混匀后的组合物过80目筛即得。
实施例5
按重量份数计算，分别称取12份膳食纤维、8份桑叶粉、4份菊粉、4份甘草粉、5份低聚麦芽糖、9份低聚木糖，混匀；再加入20份瑞士乳杆菌粉(LH43)、15份双歧杆菌粉(BB14)、10份嗜酸乳杆菌粉(LA1063)，混匀，将混匀后的组合物过80目筛即得。
实施例6
按重量份数计算，分别称取12份膳食纤维、8份桑叶粉、4份菊粉、4份甘草粉、5份低聚麦芽糖、9份低聚木糖，混匀；再加入30份罗伊氏乳杆菌YSs207，混匀，将混匀后的组合物过80目筛即得。
实验例1稳定性考察
分别取实施例1-6制备的组合物5g，根据《国标GB4789.—2016食品微生物菌落总数的测定》中的方法测定活菌数量，然后于温度为38-40℃、湿度为50-60％的培养箱中放置2个月，再次测定活菌数量，计算活菌存活率。
表1活菌存活率测定结果
| 类别 | 罗伊氏乳杆菌(％) | 瑞士乳杆菌(％) | 双歧杆菌(％) | 嗜酸乳杆菌(％) |
| 实施例1 | 83.9 | 84.1 | 81.2 | 83.5 |
| 实施例2 | 78.5 | 73.2 | 70.9 | 81.2 |
| 实施例3 | 89.6 | 87.2 | 83.1 | 84.7 |
| 实施例4 | 73.5 | 76.5 | 82.9 | 71.8 |
| 实施例5 | 0 | 75.3 | 80.4 | 78.2 |
| 实施例6 | 79.4 | 0 | 0 | 0 |
本发明实施例制备的益生菌粉储存2个月后，益生菌存活率较高，表明其存放稳定性较好。
实验例2不同条件下的耐受性实验
2.1酸性条件下耐受考察
在500mL的纯化水中加入0.5mol的稀盐酸调节pH值至1.5，然后加入1.5g胃蛋白酶，充分溶解后用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌得到人工胃液。取实施例3制备的组合物0.5g加入到上述人工胃液中，充分溶解，在37℃恒温震荡环境中反应4h，每隔2h取样，稀释，用固体MRS培养基划线检测罗伊氏乳杆菌活菌数量。
表2酸性条件下活菌存活率
从上表可以看出，本发明的组合物在胃液类似的环境中有很高的存活率，充分的表明本发明的组合物具有很强的耐酸性。
2.2碱性环境下耐受考察
准确称取6.8gKH2PO4加入500mL纯化水充分溶解，用0.25MmNaOH调节pH值为6.8；然后加入2.5g胰蛋白酶，充分溶解，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，得到人工肠液。取实施例3制备的组合物0.5g加入到上述人工肠液中，充分溶解，在37℃恒温条件下震荡消化3h，每隔1h取样，稀释，用固体MRS培养基划线检测罗伊氏乳杆菌活菌数量。
表3碱性条件下活菌存活率
实验例3体外抑菌实验
将实施例3组合物使用无菌注射用水溶解，按2.0％接种量接种于MRS培养液中，在37℃环境中180rpm/min震荡培养24h，6000rpm/min，4℃离心10min，取上清液，0.2μm无菌滤膜过滤，备用，采用牛津杯法(牛津杯外径×内径×高度＝8mm×6mm×10mm)测定抑菌活性，每杯150μL上清液，取大肠杆菌ATCC25922，金黄色葡萄球菌ATCC 25923，沙门氏菌ATCC14028，37℃培养24h，测量抑菌圈直径，结果显示对金黄色葡萄球菌抑菌圈直径可达15mm以上，对大肠杆菌抑菌圈可达17mm以上，对沙门氏菌抑菌圈可达18mm以上。
实验例4对小鼠肠道菌群变化量的影响实验
4.1健康成年雌性BALB/C小鼠60只(SPF级)，体重范围20g±2g，实验动物随机分为3组，即空白对照组、实施例3一组、实施例6一组，每组20只，按20/kg灌胃给予相应受试物(空白对照组灌胃给予等量生理盐水)，每日一次，连续给样20d。给予受试物前及末次给样24h后检测肠道菌群。
4.2实验试剂：双歧杆菌选择性培养基(BBL)、乳酸杆菌选择性培养基(LS)、肠杆菌培养基(EMB)，肠球菌培养基(EC)。
4.3在给药前，无菌采集小鼠粪便，加20％灭菌甘油生理盐水，以1：10稀释，制成均匀混悬液，1000转速离心，取上清，存于-80℃冰箱，待分析，最后一次给予组合物24h后，与实验前同样方式取直肠粪便，处理方法同上。
4.4肠道菌实验样品处理方法：将采集到的肠道菌实验粪便样品，依次10倍递增稀释成一系列不同稀释度的含菌液至10-8，选择合适的稀释浓度分别接种在各培养基上，按要求进行培养，按灌胃前后各肠道菌群数量的对数的差值进行成组资料分析。
4、雄性Balb/c小鼠给予受试物前及末次给样后24h，根据《国标GB4789.—2016食品微生物菌落总数的测定》中的方法检测肠道菌群菌落数，连续两只小鼠的粪便放入同一无菌离心管，结果以菌落数的对数值(lg CFU)表示，并按规范规定的结果判定标准对实验结果进行分析，结果见下表。
表4组合物对小鼠肠道菌群的影响
与空白对照组比较，实施例3和6组小鼠肠道内肠球菌、肠杆菌数量均无显著性差异；实施例3和6组乳酸杆菌和双歧杆菌数量明显增加。
实验例5小鼠腹泻模型中组合物对肠道微生态的影响试验
为验证组合物对肠道菌群的调节作用，采用小鼠腹泻模型进行验证。
配制组合物溶液：取5g组合物，加入10mL的纯净水，充分混匀。参照赵艳玲等(2009)的方法建立小鼠腹泻模型，取腹泻小鼠，设置实验例3、6和空白对照组、及正常对照组(不进行任何腹泻干预，仅提供正常饲喂条件)，每组10只，雌雄各半，模型建立后第一天和第二天饲喂约10cells的沙门氏菌，在正常饮食的情况下，从第三天开始分别管饲不同实验例的组合物溶液，每只小鼠0.8mL/天，连续饲喂7天，空白对照组用生理盐水替代微生态混合溶液。每日观察小鼠活动和粪便性状。在实验第10天处死小鼠，取肠道内容物，空白对照组如在10天内死亡的，则取肠道内容物，并及时提取内容物DNA。对小鼠肠道微生物相对丰度进行检测，采用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit试剂盒，按照说明书提取第十天时小鼠小肠内容物DNA。进行肠道微生物16S rDNA的检测，对肠道微生物相对丰度进行分析。
表5小鼠肠道菌群相对丰度
通过小鼠肠道微生物相对丰度的分析来看，益生菌的加入可以显著抑制肠道内沙门氏菌的增殖，并增加有益菌的含量。
Claims (2)
1.一种包含罗伊氏乳杆菌的生物活性物质，其特征在于，所述生物活性物质通过如下方法制备得到：按重量份数计算，分别称取12份膳食纤维、8份桑叶粉、4份菊粉、4份甘草粉、5份低聚麦芽糖、9份低聚木糖，混匀；再加入20份罗伊氏乳杆菌粉、10份瑞士乳杆菌粉、15份双歧杆菌粉、10份嗜酸乳杆菌粉，混匀，将混匀后的组合物过80目筛即得；其中，罗伊氏乳杆菌为罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)YSs207，所述罗伊氏乳杆菌YSs207于2023年3月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2023347；所述瑞士乳杆菌为瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)LH43；所述双歧杆菌为双歧杆菌(Bifidobacterium)BB14；所述嗜酸乳杆菌为嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)LA1063。
2.权利要求1所述的生物活性物质在制备调节人体微生态平衡药物中的应用，其特征在于，所述调节人体微生态平衡为抑制腹泻肠道内沙门氏菌的增殖，并增加有益菌瑞士乳杆菌、双歧杆菌、罗伊氏乳杆菌和嗜酸乳杆菌的含量。
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