CN117070425B

CN117070425B - 提高益生菌在机体内代谢稳定性的工艺方法及益生菌冻干粉

Info

Publication number: CN117070425B
Application number: CN202311301828.6A
Authority: CN
Inventors: 陶纯长; 金庭飞
Original assignee: Guangdong Yike Weisheng Technology Co ltd
Current assignee: Guangdong Yike Weisheng Technology Co ltd
Priority date: 2023-10-10
Filing date: 2023-10-10
Publication date: 2024-03-08
Anticipated expiration: 2043-10-10
Also published as: CN117070425A

Abstract

本发明公开了一种提高益生菌在机体内代谢稳定性的工艺方法，包括以下步骤：益生菌发酵培养：将益生菌活化液接种至培养基中，培养，离心，获得益生菌菌泥；培养基包括胰蛋白胨、大豆蛋白胨、葡萄糖、低聚果糖和L‑谷氨酰胺；益生菌冻干粉制备：将益生菌菌泥与冻干保护剂混合均匀，冻干，获得益生菌冻干粉；冻干保护剂包括乳铁蛋白、甘露醇、海藻糖和抗性糊精。本发明工艺方法在制备益生菌冻干粉时，采用合适的发酵培养基以及冻干保护剂，可提升益生菌产胞外多糖、细菌素、有机酸和短链脂肪酸的能力，可保护益生菌进入体内后抵抗肠道中恶劣环境，可提高益生菌在肠道中的定植率，且益生菌定植后能稳定高产有益活性物质。

Description

提高益生菌在机体内代谢稳定性的工艺方法及益生菌冻干粉

技术领域

本发明涉及益生菌技术领域，尤其涉及一种提高益生菌在机体内代谢稳定性的工艺方法及益生菌冻干粉。

背景技术

为使益生菌能够长期保存，最好将其制成干燥状态。目前，常采用的制备菌粉干燥方法有气流干燥法、冷冻干燥法和喷雾干燥法。目前较为常用的方法是冷冻干燥法，在保护益生菌活力方面最为有效。冷冻干燥技术不仅方便益生菌运输、销售和应用，而且可以降低其贮藏期内菌体免遭外界侵害，使益生菌粉性状和菌数保持相对稳定,进而更好发挥益生作用。但冻干过程中，由于受到各种因素影响,导致细胞活力下降，甚至菌体死亡。冻干保护剂可以改变益生菌冻干时的环境，减少冷冻干燥过程中对细胞的损害,尽可能保持微生物原有的各种生理生化特性和生物活性。

益生菌因对机体具有多种益生功效而逐渐成为研究热点。益生菌的多种益生特性与其代谢产生的活性产物密切相关。益生菌的活性代谢产物主要有胞外多糖、细菌素、维生素、有机酸和短链脂肪酸等，它们在抗炎症、抗氧化、调节免疫、预防或治疗代谢性疾病等方面发挥积极作用。胞外多糖（Extracellular polysaccharide，EPS）是微生物中以紧密结合的包膜或松散附着的粘液层形式分泌的细胞外大分子，其功能和应用主要取决于单糖组成、分子量和分支。根据单糖组成不同，乳酸菌产生的胞外多糖可分为同型多糖和异形多糖。研究表明，EPS可作为既具有双歧杆菌生长刺激作用又具有抗病原菌生物膜作用的高效制剂。在控制炎症和感染的免疫平衡方面也起着重要作用。除此之外，EPS还具有抗氧化活性、调节免疫、抗肿瘤等作用。细菌素是由细菌通过核糖体途径合成的蛋白类抗菌物质，一般由革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和古细菌产生，具有杀死/抑制其他微生物的能力，且具有无抗药性、无残留、杀菌快等优点。乳酸菌细菌素是由乳酸菌发酵产生的多肽类物质，相对分子量较小，能抑制或杀死革兰氏阳性菌和腐败菌，也有部分乳酸菌细菌素对革兰氏阴性菌有明显的抑菌作用。另外，很多细菌素被报道还具有抗肿瘤、抗病毒等功能活性。有机酸是益生菌的一种重要代谢产物，大部分乳酸菌都能产生多种有机酸，有机酸起到调节肠道内pH，抑制有害菌生长的作用。短链脂肪酸(short chain fatty acids，SCFAs)是特定的结肠厌氧细菌发酵膳食纤维和抗性淀粉后产生的主要细菌代谢产物。可以促进细胞生长，降低肠道内环境的pH值，调节宿主肠道健康。研究表明，益生菌在SCFAs的生产中起着至关重要的作用，不同的细菌合成SCFAs的效率不同。产生SCFAs的途径有很多种，细菌中产生SCFAs最普遍的途径是通过糖酵解途径，某些细菌类群如双歧杆菌也可以利用磷酸戊糖途径产生相同的代谢物。

现今在益生菌生产工艺的研究上，多为提高活菌量、抗逆性（耐胃酸耐胆盐）的研究，在保证益生菌在人体内定植并稳定代谢有益活性成分上还鲜有研究，除了要摄入足够的活菌数量的益生菌外，还需要能在体内定植并正常的生长代谢，才能为人体肠道健康长期的保驾护航。而在筛选益生菌的技术上，目前市场上仍停留在筛选易于发酵，活力强这一层面上，而想要获得真正对人体起到长期有益作用的益生菌，还需要筛选代谢能力旺盛的益生菌。而益生菌的益生功能在不同菌株上有差异，在各功能方向上优势也不同，如何能提升益生菌在各个方面的性能，是本发明对益生菌及其生产工艺深入探究的目的。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种提高益生菌在机体内代谢稳定性的工艺方法。

本发明的目的之二在于提供一种益生菌冻干粉。

本发明的目的之三在于提供一种能够提高益生菌在机体内代谢稳定性的食品。

本发明的目的之一采用如下技术方案实现：

一种提高益生菌在机体内代谢稳定性的工艺方法，包括以下步骤：

益生菌发酵培养：将益生菌活化液接种至培养基中，培养，离心，获得益生菌菌泥；所述培养基包括质量比为（0.5-1.5）：（0.5-1.5）的胰蛋白胨和大豆蛋白胨，包括质量比为1：（1~3）：（0.01~0.5）的葡萄糖、低聚果糖和L-谷氨酰胺；

益生菌冻干粉制备：将所述益生菌菌泥与冻干保护剂混合均匀，冻干，获得益生菌冻干粉；所述冻干保护剂包括质量比为1：（4~6）：（1~3）：（1~3）的乳铁蛋白、甘露醇、海藻糖和抗性糊精。

作为本发明的一个优选的方案，所述培养基包括量比为1：1的胰蛋白胨和大豆蛋白胨，包括质量比为1：2：0.05的葡萄糖、低聚果糖和L-谷氨酰胺。

本发明所提供的培养基，采用合适的碳源，合理设置低聚果糖和葡萄糖的配比，促进了益生菌的生长速度和产酸能力；同时采用合适的氮源，并设置大豆蛋白胨和胰蛋白胨的特定配比，能够促进益生菌的生长活力，促进其分泌胞外多糖；而L-谷氨酰胺又可以诱导益生菌产生细菌素。低聚果糖、葡萄糖、L-谷氨酰胺、大豆蛋白胨和胰蛋白胨的复配，加上配比的优化，能够促进益生菌性能全面提升。

作为本发明的一个优选的方案，所述冻干保护剂包括质量比为1：5：2：2的乳铁蛋白、甘露醇、海藻糖和抗性糊精。

本发明提供的冻干保护剂包括甘露醇、海藻糖、抗性糊精，它们都是益生菌的优质碳源，具有促进益生菌生长的作用，对益生菌在冻干过程中保持一定的活力有帮助，糖类以及醇类具有多个羟基，在冷冻干燥过程中能够取代水分子以及细胞膜中的磷酸基团或者能够与益生菌中的蛋白质极性基团形成氢键，达到保护细胞膜以及蛋白质的完整性。乳铁蛋白具有较好的生物可降解性、生物相容性和优良的乳化能力，将其用作冻干保护剂，能有效提高益生菌的胃肠道抗性，也可以在肠道中发挥其本身具有的抗癌、调节免疫力等作用。同时，本发明合理设置乳铁蛋白、甘露醇、海藻糖、抗性糊精等组分的配比，大幅提高了益生菌在胃酸和胆盐溶液中的耐受性。

作为本发明的一个优选方案，所述培养基包括按照重量百分比计的以下组分：酵母浸粉0.5~0.9%、牛肉浸粉0.4~0.8%、胰蛋白胨0.2~0.6%、大豆蛋白胨0.2~0.6%、柠檬酸氢二铵0.01~0.3%、磷酸氢二钾0.1~0.3%、无水硫酸镁0.01~0.04%、硫酸锰0.001~0.01%、乙酸钠0.2~0.7%、吐温80 0.01~0.3%、葡萄糖0.5~2%、低聚果糖0.5~4%、L-谷氨酰胺0.01~0.5%、蒸馏水余量。

作为本发明的一个优选方案，所述培养基包括按照重量百分比计的以下组分：酵母浸粉0.7%、牛肉浸粉0.6%、胰蛋白胨0.4%、大豆蛋白胨0.4%、柠檬酸氢二铵0.15%、磷酸氢二钾0.2%、无水硫酸镁0.02%、硫酸锰0.004%、乙酸钠0.5%、吐温80 0.1%、葡萄糖1%、低聚果糖2%、L-谷氨酰胺0.05%、蒸馏水余量。

作为本发明的一个优选方案，所述冻干保护剂包括按照重量百分比计的以下组分：甘油1~3%、乳铁蛋白0.5~2%、大豆蛋白0.5~2%、乳清分离蛋白0.5~2%、甘露醇2~8%、海藻糖1~3%、抗性糊精1~3%、甘氨酸0.5~2%、L-酪氨酸0.5~2%、明胶0.2~0.8%、无菌水余量。

作为本发明的一个优选方案，所述冻干保护剂包括按照重量百分比计的以下组分：甘油2%、乳铁蛋白1%、大豆蛋白1%、乳清分离蛋白1%、甘露醇5%、海藻糖2%、抗性糊精2%、甘氨酸1%、L-酪氨酸1%、明胶0.5%、无菌水余量。

作为本发明的一个优选方案，所述益生菌包括干酪乳杆菌K35，和/或，青春双歧杆菌Y54。更加优选地，所述益生菌为干酪乳杆菌K35。

干酪乳杆菌K35和青春双歧杆菌Y54采用本发明的培养基进行发酵培养，生长情况好，能够产生更多的胞外多糖，以及乙酸、苹果酸和乳酸等短链脂肪酸，并且，再采用本发明的冻干保护剂制作益生菌冻干粉，益生菌的存活率高，也能够提高益生菌在胃酸和胆盐溶液中的耐受性，有助于益生菌在肠道中的定植，并促进其生长，提高其生长活力，提升其在机体内的代谢稳定性。

作为本发明的一个优选方案，所述的提高益生菌在机体内代谢稳定性的工艺方法，包括以下步骤：

益生菌发酵培养：接种4~6%的益生菌活化液于培养基中，35~38℃恒温厌氧培养16~20h，然后于2~6℃，4000~5000r/min条件下离心20~40min，获得益生菌菌泥；所述益生菌为干酪乳杆菌K35或青春双歧杆菌Y54；所述培养基包括质量比为（0.5-1.5）：（0.5-1.5）的胰蛋白胨和大豆蛋白胨，包括质量比为1：（1~3）：（0.01~0.5）的葡萄糖、低聚果糖和L-谷氨酰胺；

益生菌冻干粉制备：将所述益生菌菌泥与冻干保护剂混合均匀，静置10~30min，接着置于-90~-70℃预冻1~3h，然后冷冻干燥，时间为45~50h，温度为-90~-70℃，真空度为22~28Pa，获得益生菌冻干粉；所述冻干保护剂包括质量比为1：（4~6）：（1~3）：（1~3）的乳铁蛋白、甘露醇、海藻糖和抗性糊精。

本发明的目的之二采用如下技术方案实现：

一种益生菌冻干粉，由目的之一任一项所述的工艺方法制备而成。

本发明的目的之三采用如下技术方案实现：

一种能够提高益生菌在机体内代谢稳定性的食品，包括目的之二所述的益生菌冻干粉。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

（1）本发明所提供的提高益生菌在机体内代谢稳定性的工艺方法，在制备益生菌冻干粉时，采用合适的发酵培养基以及冻干保护剂，可提升益生菌产胞外多糖、细菌素、有机酸和短链脂肪酸的能力，可保护益生菌进入体内后抵抗肠道中恶劣环境，耐胃酸耐胆盐溶液能力强，可提高益生菌在肠道中的定植率，且益生菌定植后能稳定高产有益活性物质，使益生菌在人体内长期的发挥切实的益生作用。

（2）本发明所提供的提高益生菌在机体内代谢稳定性的工艺方法，通过实验验证，通过本发明工艺方法生产的益生菌冻干粉，其发酵液中胞外多糖、细菌素、有机酸都有显著增加，细胞实验验证，抗炎、粘附能力均有显著提升，经动物实验验证，益生菌粉灌胃小鼠28天，能显著增加小鼠粪便短链脂肪酸的含量。

附图说明

图1为本发明实施例1提供的2株益生菌发酵后的EPS含量对比图；

图2为本发明实施例1提供的2株益生菌发酵后的乙酸含量对比图；

图3为本发明实施例1提供的2株益生菌发酵后苹果酸含量对比图；

图4为本发明实施例1提供的2株益生菌在发酵后乳酸含量对比图；

图5为本发明实施例2提供的不同冻干保护剂生产的干酪乳杆菌K35菌粉耐胃酸能力比较图；

图6为本发明实施例2提供的不同冻干保护剂生产的干酪乳杆菌K35菌粉耐胆盐能力比较图；

图7为本发明实施例2提供的不同冻干保护剂生产的青春双歧杆菌Y54菌粉耐胃酸能力比较图；

图8为本发明实施例2提供的不同冻干保护剂生产的青春双歧杆菌Y54菌粉耐胆盐能力比较图；

图9为本发明实施例3提供的各样品对结肠细胞HT-29粘附力比较图；

图10为本发明实施例3提供的各样品对巨噬细胞THP-1炎症性细胞因子TNF-α分泌的调节作用结果图；

图11为本发明实施例3提供的各样品对巨噬细胞THP-1炎症性细胞因子IL-6分泌的调节作用结果图；

图12为本发明实施例3提供的各样品对巨噬细胞THP-1炎症性细胞因子IL-1β分泌的调节作用结果图；

图13为本发明实施例3提供的各样品对小鼠粪便中短链脂肪酸的含量影响结果图。

具体实施方式

下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。在下述实施例中所采用的原材料、设备等除特殊限定外均可以通过购买方式获得。

目前益生菌冻干粉中的益生菌能否在体内成功定植，定植后是否发挥益生作用等问题在许多益生菌粉产品中仍是不确定的，本发明实施例通过实验验证，确定了一种可提高益生菌在机体内代谢稳定性的工艺方法，并通过体外实验与体内实验，使用不同的菌粉进行对比测试，实验结果表明，本发明实施例提供的工艺方法有效的提升了益生菌在肠道内的代谢稳定性，抗逆性，能够从真正意义上提供一种高活菌数、稳定、益生活力强的益生菌粉产品。

实施例1 促进益生菌高产有益活性代谢产物的培养基的筛选

1.实验材料

1.1实验菌株：

干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）K35，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No15704；

青春双歧杆菌（Bifidobacterium adolescentis）Y54，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No15709）。

1.2实验设备与试剂

实验试剂：无水乙醇、硫酸、盐酸、苯酚、磷酸氢二钠、甲醇、乙酸、苹果酸、乳酸、酵母浸粉、牛肉浸粉、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、柠檬酸氢二铵、磷酸氢二钾、无水硫酸镁、硫酸锰、乙酸钠、吐温80、葡萄糖、低聚半乳糖、低聚果糖、L-谷氨酰胺。

实验设备：立式高压灭菌锅BKQ-B 7511（山东博科）、生物安全柜BSC-1004llA 2（苏州安泰），隔水式恒温培养箱GHP-9050（上海悦丰）、紫外分光光度计UV5（梅特勒托利多）、高效液相色谱仪1260（美国安捷伦）；Agilent EclipseXDB－C18色谱柱（美国安捷伦）、Sigma3K30低温高速离心机（德国Satorious）；万分之一电子天平（TP-214）（美国丹佛仪器）。

2.试验方法

2.1培养基的配制按照配方称取物料，混合均匀后，在高压灭菌过内115℃灭菌30min，取出冷却至45℃±2℃，L-谷氨酰胺用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，加入培养基中，备用。

表1 培养基配方表

2.2益生菌活化将青春双歧杆菌Y54、干酪乳杆菌K35的甘油管置于室温溶解，按2%的接种量接种于MRS培养基中，37℃厌氧活化16h，取出放入冰箱4℃保存，备用。

2.3发酵按5%的量将活化液分别接种到2.1的培养基1~6中，37℃厌氧培养20h，取出放入冰箱4℃保存，备用。

2.4发酵液中有益活性代谢产物的测定

（1）胞外多糖的测定

取各个培养基的发酵培养液，8000r/min离心10min，加入3倍预冷体积分数95%乙醇，搅拌均匀后，放置在4℃冰箱中过夜沉淀，弃上清，收集沉淀物。随后加入适量的超纯水溶解沉淀物，并用4%三氯乙酸和Sevage试剂相结合的方法去除蛋白，上清液装入透析袋中（8～14kDa），在流动的超纯水中透析72h，每隔4h换一次水，以去除杂质，得到粗多糖溶液。葡萄糖标准曲线制作：分别吸取50μg/mL的葡萄糖溶液0、0.5、1、1.5、2、2.5mL于25mL比色管中，加去离子水至2.5mL，分别加入5mL的蒽酮溶液，置沸水浴中保温10min。采用分光光度计测定OD₆₂₀值。以葡萄糖浓度为横坐标，OD值为纵坐标绘制葡萄糖标准曲线。样品多糖含量的测定：取上述粗多糖溶液，分别取EPS溶液0.1mL于比色管中，加入去离子水2.4mL，混匀，采用硫酸-蒽酮法测定多糖含量。

（2）有机酸的测定

标准品的制备：精密称取乙酸0.0186g、苹果酸0.0050g、乳酸0.0500g、丁二酸0.0250g、柠檬酸0.0055g，分别置于50mL容量瓶中，加入适量超纯水溶解并定容，摇匀，经0.22μm滤膜过滤后即得各酸标准对照溶液(乙酸300mg/L、苹果酸100mg/L、乳酸500mg/L)。

采用高效液相色谱法测定，绘制标准曲线：将乙酸、苹果酸和乳酸配置成不同浓度的标准品溶液，进行色谱分析，绘制标准工作曲线。以待测成分峰面积(x)为横坐标、质量浓度(y，mg/L)为纵坐标进行线性回归。

供试品溶液的制备：将培养完成的菌液在高速离心机上以4500r/min离心8min，上清液过0.22μm水相针式过滤器后作胞外样。离心得到的菌体在液氮中反复冻融3次后，加入1mL的超纯水，以10000r/min离心10min，上清液过0.22μm水相针式过滤器后作胞内样，上机测定。

（3）细菌素抑菌活力的测定

4℃下4500r/min离心10min以获得发酵上清液，同时以肠炎沙门氏菌ATCC 14028为指示菌，经牛津杯扩散法筛选对其具有较好抑菌效果的菌株。为排除有机酸和过氧化氢的作用，实验将乳酸菌发酵液经离心以获得无细胞上清液，将其排除过氧化氢后，分别用5MNaOH和HCl调pH至5.5。为进一步排除发酵液中其他代谢产物，实验将具有细菌素合成能力的乳酸菌发酵上清液经硫酸铵沉淀法以粗提抑菌物质，具体方法如下：将50mL上清液调pH至5.5后，加入硫酸铵使其饱和度达到80%，静置过夜于4℃下9000r/min离心，所获得的沉淀用1mL pH6.0的磷酸缓冲液（Phosphate buffer solution PBS）溶解，以得到粗品抗菌物质并经牛津杯扩散法测定其对肠炎沙门氏菌的抑菌活性。以等pH值的乳酸、醋酸和盐酸作阳性对照，培养基1~6的新鲜液体培养基作阴性对照。

3.实验结果

3.1胞外多糖含量测定结果

采用硫酸-蒽酮法制作葡萄糖标准曲线，葡萄糖浓度和吸光度之间的线性方程为y=0.1225x-0.0118，R²=0.9918，标准曲线满足分析测试要求。

实验结果如图1所示（图中的配方1~6分别对应培养基1~6），从图中可得，干酪乳杆菌K35和青春双歧杆菌Y54均在使用培养基4中发酵后，发酵液中EPS含量最高。

脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革兰氏阴性细菌外膜的主要成分，作为一种天然免疫刺激剂，能刺激THP-1巨噬细胞合成并释放多种细胞因子，如肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)及白细胞介素6( interleukin 6，IL-6)和白细胞介素1β( interleukin1β，IL-1β)等。

3.2有机酸含量测定结果

采用高效液相色谱法测定，绘制标准曲线：将乙酸、苹果酸和乳酸配置成不同浓度的标准品溶液，进行色谱分析，绘制标准工作曲线。3种有机酸线性方程如下表。

表2 标准曲线线性关系

结果如图2-图4所示（图中的配方1~配方6分别对应培养基1~培养基6），从图中可得，培养基4在提升有机酸产量上表现最优，显著提升了干酪乳杆菌K35在发酵时产乙酸、苹果酸、乳酸的能力。此外，青春双歧杆菌Y54在培养基4中进行发酵培养，其苹果酸和乳酸的产量也是显著提高了。

3.3细菌素抑菌活力测定结果

表3 2株菌在培养基1-6中发酵后细菌素抑菌活力结果记录表

注：“-”表示抑菌圈≤8mm，即无抑菌作用。

由表3数据可知，干酪乳杆菌K35和青春双歧杆菌Y54使用培养基4发酵培养后，细菌素粗提物表现出较优的抑菌活性。

综上所述，干酪乳杆菌K35和青春双歧杆菌Y54均采用本发明的培养基4进行发酵培养时，发酵培养液中的3种活性成分的含量均优于其他培养基。

本发明选用培养基4为干酪乳杆菌K35和青春双歧杆菌Y54的最优培养基。

实施例2 冻干保护剂的筛选

1.实验材料

1.1实验菌株

干酪乳杆菌K35、青春双歧杆菌Y54

1.2实验设备与试剂

甘油、乳铁蛋白、大豆蛋白、乳清分离蛋白、甘露醇、海藻糖、抗性糊精、甘氨酸、L-酪氨酸、明胶、无菌水、胰蛋白酶、猪胆盐、氢氧化钠、磷酸二氢钾、盐酸标准溶液；立式高压灭菌锅、恒温培养箱。

2.实验方法

2.1保护剂的配制

按照配方称取各物料，用蒸馏水溶解，121℃灭菌15min，其中甘氨酸、L-酪氨酸用微孔滤膜过滤除菌（0.22μm）。

表4 冻干保护剂配方表

2.2益生菌冻干粉的制备

按5%的接种量，将干酪乳杆菌K35和青春双歧杆菌Y54的活化液分别接种到新鲜培养基4中，37℃厌氧培养20h，4℃下，4500r/min离心30min，取菌泥，分别与保护剂1~4充分混匀，随后静置平衡20min，进入-80℃预冷2h，然后进行冻干，48h（−80℃、真空度25Pa），得到冻干益生菌粉。

2.3益生菌冻干粉耐胃酸耐胆盐能力的测定

实验分组：

第1组：培养基4的干酪乳杆菌K35、青春双歧杆菌Y54菌液，4500r/min离心10min后弃上清液，用生理盐水重悬，浓度调至10¹⁰CFU/mL；

第2组：培养基4+冻干保护剂1生产的干酪乳杆菌K35冻干粉、青春双歧杆菌Y54冻干粉，用无菌生理盐水稀释至10¹⁰CFU/mL；

第3组：培养基4+冻干保护剂2生产的干酪乳杆菌K35冻干粉、青春双歧杆菌Y54冻干粉，用无菌生理盐水稀释至10¹⁰CFU/mL；

第4组：培养基4+冻干保护剂3生产的干酪乳杆菌K35冻干粉、青春双歧杆菌Y54冻干粉，用无菌生理盐水稀释至10¹⁰CFU/mL；

第5组：培养基4+冻干保护剂4生产的干酪乳杆菌K35冻干粉、青春双歧杆菌Y54冻干粉，用无菌生理盐水稀释至10¹⁰CFU/mL。

模拟胃液：取100mL0.3mol/L的NaCl溶液，用盐酸溶液调节pH值至2.5，灭菌后加入1g的胃蛋白酶，运用磁力搅拌器将其充分溶解，4℃保存备用。分别称取1g菌粉（活菌数≥10⁹CFU/g）至20mL模拟胃液中，37℃、90r/min厌氧条件下模拟胃消化过程，于0，2h后取样，采用平板计数法测定活菌数，平行试验3次。

模拟小肠消化液：取3.4gKH₂PO₄用适量超纯水进行溶解并定容至500mL。取100mL已制备好的KH₂PO₄溶液，1mol/L NaOH调节pH值至8.0，灭菌后加入1g胰蛋白酶，0.3g猪胆盐，用磁力搅拌器将其充分溶解后，4℃保存备用。分别称取1g菌粉（活菌数≥10⁹CFU/g）至40mL模拟小肠消化液中，37℃、90r/min厌氧条件下模拟胃消化过程，于0，4h后取样，采用平板计数法测定活菌数，平行试验3次。

3 实验结果

如图5~图8所示，结果表明，在耐胃酸和耐胆盐溶液试验中，干酪乳杆菌K35和青春双歧杆菌Y54的第5组数据的存活率均明显高于其他组。本发明采用培养基4和冻干保护剂4的结合，获得的益生菌冻干粉具有优秀的耐胃酸和耐胆盐溶液能力。

本发明实施例提供的冻干保护剂，甘露醇、海藻糖、抗性糊精都是益生菌的优质碳源，具有促进益生菌生长的作用，对益生菌在冻干过程中保持一定的活力有帮助，糖类以及醇类具有多个羟基，在冷冻干燥过程中能够取代水分子以及细胞膜中的磷酸基团或者能够与益生菌中的蛋白质极性基团形成氢键，达到保护细胞膜以及蛋白质的完整性。乳铁蛋白具有较好的生物可降解性、生物相容性和优良的乳化能力，将其用作冻干保护剂，能有效提高益生菌的胃肠道抗性，也可以在肠道中发挥其本身具有的抗癌、调节免疫力等作用。同时，本发明合理设置乳铁蛋白、甘露醇、海藻糖、抗性糊精等组分的配比，大幅提高了益生菌在胃酸和胆盐溶液中的耐受性。

实施例3 益生菌体内代谢稳定性验证试验

1.实验材料

1.1试验菌粉

样品1：培养基4培养，4500r/min离心30min后用生理盐水重悬得到的干酪乳杆菌K35益生菌菌液。

样品2：培养基4培养，保护剂1冻干得到的干酪乳杆菌K35益生菌菌液。

样品3：4培养基4培养，保护剂2冻干得到的干酪乳杆菌K35益生菌菌粉。

样品4：培养基4培养，保护剂3冻干得到的干酪乳杆菌K35益生菌菌粉。

样品5：培养基4培养，保护剂4冻干得到的干酪乳杆菌K35益生菌菌粉。

1.2实验试剂与设备

佛波酯、脂多糖、免疫因子检测试剂盒、PRMI 1640培养基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶、磷酸缓冲溶液、乙酸标准品、丙酸标准品、丁酸标准品。7890气相色谱分析仪（美国安捷伦）、SHP－250Y生化培养箱（美国BioTek）。

2.试验方法

2.1益生菌粉的黏附能力测定

从液氮罐中取出HT-29细胞，进行复苏、传代培养，培养细胞数量扩增至所需用量后，将HT-29细胞接种于12孔板中，待细胞长至单层后，用无菌PBS冲洗细胞2～3次，然后加入1mL待测菌粉悬浮液。培养2h后，PBS冲洗2～3次，用300μL的胰蛋白酶消化3min，加入700μL含有10%胎牛血清的1640培养液终止反应。并将所得溶液收集至无菌EP管中，并将收集的溶液进行10倍梯度稀释，涂板计数（计数方法参考国标：GB4789.35-2016《食品微生物学检验-益生菌检验》）。同时对空白组的细胞进行计数。供试菌株的粘附能力的计算公式为:粘附能力(CFU/cells)=每个培养皿内粘附的细菌总数/每个培养皿的总细胞数。

2.2益生菌粉的抗炎能力测定

从液氮罐中取出THP-1细胞进行常规复苏、传代培养，培养细胞数量扩增至所需用量。调整THP-1细胞数为1×10⁶cell/mL，接种于6孔板(共2mL培养基)，加入100ng/mL的佛波酯(PMA)对THP-1进行诱导处理72h成为巨噬细胞。待测菌粉菌悬液(1×10⁷CFU/mL)加入PRMI1640培养基进行共培养16h，每个受试菌株设置3个复孔。空白组为巨噬细胞+ＲPMI1640基础培养基。对照组为巨噬细胞+PRMI1640基础培养基+脂多糖(LPS)母液，实验组为巨噬细胞+PRMI1640基础培养基+脂多糖(LPS)母液+待测菌液。各组脂多糖(LPS)母液加至终浓度为1μg/mL，处理6h后，用相应的试剂盒检测细胞培养上清液中炎性细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的含量变化，用以筛选出具有抗炎能力的益生菌。

2.3摄入益生菌粉的小鼠的粪便中短链脂肪酸含量变化

动物分组及给药：

12只4周龄雄性BALB/c小鼠随机分为空白组和实验组。空白组灌胃无菌水，实验组分别灌胃浓度为10⁹CFU/mL的样品1、样品2、样品3、样品4、样品5益生菌粉溶液。每只小鼠每天灌胃量为0.2mL，共计28d。实验前和实验后对所有小鼠称重，第0d和28d无菌收集小鼠粪便。实验结束后，小鼠摘眼球取血后脱颈处死。

短链脂肪酸通常是指碳链中碳原子数少于6的有机脂肪酸，主要包括甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸、己酸等。本方案测定小鼠粪便中短链脂肪酸中的乙酸、丙酸、丁酸。

绘制标准曲线：将乙酸、丙酸和丁酸配置成不同浓度的标准品溶液，进行色谱分析，X轴为质量浓度比，Y轴为峰面积比，绘制标准工作曲线。

样品处理方法：称取小鼠粪便0.2g，加入25%亚磷酸溶液0.25mL使样品酸化，用丙酮定容至1.5mL，静置一段时间，取0.35mL上清液用丙酮定容至1mL，12000r/min离心5min后取200μL上清液置于进样瓶中进行色谱分析。

检测条件：DB-FFAP毛细管柱（30m×250μm×0.25μm）；载气为高纯氮气；起始温度40℃，按每分钟10℃升温至200℃，保持3min；检测器温度为270℃；进样体积1μL；单个样品检测时间约30min。

实验结果

3.1益生菌粉的黏附能力测定

如图9所示，样品5对HT-29细胞的粘附力相较其他组较强，菌株粘附于肠壁细胞的能力是其发挥作用的首要因素，粘附率最高，说明优选培养基4和冻干保护剂4组合制备的益生菌粉对益生菌在肠道内的粘附力有提升作用。

3.2益生菌粉的抗炎能力测定

如图10-图12所示，样品1-样品5均有降低炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β水平的作用，经过优化培养生产的样品5具有更优秀的表现，能够显著降低炎症因子的表达。

3.3小鼠的粪便中短链脂肪酸含量变化

结果如图13所示，图中可得，给小鼠灌胃益生菌样品1-样品5后，都在一定程度上提高了小鼠粪便中丁酸、丙酸、乙酸的含量。其中样品5的菌粉表现更优，说明本发明实施例优选的培养基4和冻干保护剂4组合生产的益生菌粉在小鼠肠道内稳定定植且生长活力较好，产生的短链脂肪酸更多。

上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

Claims

1.一种提高益生菌在机体内代谢稳定性的方法，其特征在于，包括以下步骤：

益生菌发酵培养：将益生菌活化液接种至培养基中，培养，离心，获得益生菌菌泥；所述培养基包括按照重量百分比计的以下组分：酵母浸粉0.7%、牛肉浸粉0.6%、胰蛋白胨0.4%、大豆蛋白胨0.4%、柠檬酸氢二铵0.15%、磷酸氢二钾0.2%、无水硫酸镁0.02%、硫酸锰0.004%、乙酸钠0.5%、吐温80 0.1%、葡萄糖1%、低聚果糖2%、L-谷氨酰胺0.05%、蒸馏水余量；

益生菌冻干粉制备：将所述益生菌菌泥与冻干保护剂混合均匀，冻干，获得益生菌冻干粉；所述冻干保护剂包括按照重量百分比计的以下组分：甘油2%、乳铁蛋白1%、大豆蛋白1%、乳清分离蛋白1%、甘露醇5%、海藻糖2%、抗性糊精2%、甘氨酸1%、L-酪氨酸1%、明胶0.5%、无菌水余量；

所述益生菌为保藏编号为CGMCC No.15704的干酪乳杆菌K35或保藏编号为CGMCCNo.15709的青春双歧杆菌Y54。

2.如权利要求1所述的提高益生菌在机体内代谢稳定性的方法，其特征在于，包括以下步骤：

益生菌发酵培养：接种4~6%的益生菌活化液于培养基中，35~38℃恒温厌氧培养16~20h，然后于2~6℃，4000~5000r/min条件下离心20~40min，获得益生菌菌泥；

益生菌冻干粉制备：将所述益生菌菌泥与冻干保护剂混合均匀，静置10~30min，接着置于-90~-70℃预冻1~3h，然后冷冻干燥，时间为45~50h，温度为-90~-70℃，真空度为22~28Pa，获得益生菌冻干粉。

3.一种益生菌冻干粉，其特征在于，由权利要求1-2任一项所述的方法制备而成。

4.一种食品，其特征在于，包括权利要求3所述的益生菌冻干粉。