CN110627919B - 一种肠道益生元黑皮鸡枞菌多糖orp-1及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种肠道益生元黑皮鸡枞菌多糖ORP‑1及其制备方法和用途，所述肠道益生元为黑皮鸡枞菌多糖ORP‑1，它是以黑皮鸡枞菌多糖为原料，经分步醇沉、DEAE‑52纤维素柱层析及superdex‑75分子筛凝胶柱层析分离纯化获得；该化合物分子量为2.4×10⁴Da，其单糖组成按摩尔比为甘露糖:葡萄糖:半乳糖:岩藻糖＝1.48:1.00:29.65:8.22。在体外模拟口腔、胃及小肠消化过程中，该新型肠道益生元具有抵抗消化的特性，但在人体粪便体外模拟酵解过程中，能被粪便微生物酵解利用，并促进肠道益生菌两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)和嗜酸乳杆菌(Lacrobacillus acidophilus)的增殖。

Description

一种肠道益生元黑皮鸡枞菌多糖ORP-1及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于益生元食品技术领域，具体涉及一种肠道益生元黑皮鸡枞菌多糖ORP-1及其制备方法和用途。

技术背景

黑皮鸡枞菌，学名卵孢小奥德蘑(Oudemansiella raphanipes)。该菌具有很高的食用和药用价值，也是我国传统的药用真菌之一。因其鲜嫩醇香、肉质细嫩、洁白如玉、口感独特、生熟皆可食、食药两用、营养丰富而备受人们的青睐。与其它真菌多糖相比，目前对黑皮鸡枞菌多糖的研究还较少。大部分的研究集中在黑皮鸡枞菌多糖提取工艺优化和菌丝体液体发酵培养基的优化，黑皮鸡枞菌多糖活性研究鲜有报道。

“益生元”(prebiotics)是指赋予宿主健康益处的宿主微生物选择性利用的基质。目前国际上认可的益生元主要包括低聚果糖(FOS)、低聚异麦芽糖(IMO)、低聚乳果糖(LACT)等。一些藻类、植物等的天然提取物也能作为益生元使用。一般评估益生元功效主要针对三个方面：(1)在上消化道不被消化，对胃部的酸性环境和各类消化酶具有抵抗性，能够在进入大肠前保持完整性；(2)在大肠内能够被某类微生物选择性发酵利用从而改善肠道菌群促进人体健康；(3)促进肠道中一种或几种有益菌生长并增强其活性。

现阶段对于多糖益生效果的研究手段主要有两种：一是动物试验，主要利用小鼠、兔子等哺乳动物来消化多糖，再对特定指标进行检测；二是利用胃肠道模拟器，对消化前后的消化液进行检测，从而判断多糖对肠道菌群的影响。静态模拟消化系统由于无需特殊仪器设备且操作简单，成为当前应用最为广泛的胃肠道体外模拟器。该消化系统包括三个部分，分别为口腔模拟体系、胃部及小肠模拟体系和大肠发酵体系，前两部分根据人体消化道内实际情况通过消化过程温度、消化液组成、消化环境的pH及消化时间对消化生理条件进行模拟，大肠发酵体系为批式发酵，将菌液加入到所需培养基中进行厌氧发酵且过程中不添加营养物质，此方法易建立模型，多用于研究底物消化情况。多糖是一种天然高分子聚合物，大量体外模拟消化实验表明，多糖很难通过胃肠道直接吸收，但可被肠道微生物分解利用产生短链脂肪酸(SCFA)。短链脂肪酸对维持肠黏膜屏障完整性、稳定肠道微环境具有积极意义。研究表明，香菇、平菇、杏鲍菇等食用菌多糖及某些植物多糖具有潜在的益生元活性。

发明内容

本发明旨在提供一种肠道益生元黑皮鸡枞菌多糖ORP-1及其制备方法和用途。本发明ORP-1作为一种新型肠道益生元，其满足益生元的三个特性，具有潜在的益生元活性，在医疗保健等领域具有广阔的应用前景。本发明首次将黑皮鸡枞菌多糖经分离纯化得到的单一组分多糖ORP-1应用于体外模拟消化、酵解实验，使得对黑皮鸡枞菌多糖的益生元活性研究更具有目的性和靶向性。

本发明黑皮鸡枞菌多糖ORP-1，是以黑皮鸡枞菌多糖为原料，分离纯化后获得的单一组分多糖ORP-1，其分子量为2.4×10⁴Da，其单糖组成按摩尔比为甘露糖:葡萄糖:半乳糖:岩藻糖＝1.48:1.00:29.65:8.22。

本发明黑皮鸡枞菌多糖ORP-1的制备方法，包括如下步骤：

步骤1：以600mg纯度不低于85％的黑皮鸡枞菌粗多糖为原料，以40vt％、50-90vt％乙醇进行分步醇沉；

步骤2：步骤1所得沉淀经烘干、称重、溶解后置于DEAE-52纤维素层析柱，上样条件为100mg粗多糖溶于1mL蒸馏水、流速1mL/min，得到水洗脱多糖溶液；

步骤3：将步骤2所得水洗脱多糖溶液经浓缩、冷冻干燥、称重、溶解后置于superdex-75分子筛凝胶层析柱，上样条件为50mg多糖溶于300μL蒸馏水、流速0.3mL/min，合并收集到的多糖溶液，浓缩并冷冻干燥，得到新型肠道益生元黑皮鸡枞菌多糖ORP-1。

本发明黑皮鸡枞菌多糖ORP-1的用途，是在制备肠道益生元制剂中的应用。

本发明黑皮鸡枞菌多糖ORP-1的应用，是以所述多糖ORP-1制备肠道益生元制剂。

本发明黑皮鸡枞菌多糖ORP-1，一方面在口腔、胃及小肠的体外模拟消化过程中具有抵抗消化的特性；另一方面在人体粪便体外模拟酵解过程中能被粪便微生物酵解利用，并促进肠道益生菌两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)和嗜酸乳杆菌(Lacrobacillus acidophilus)的增殖。

本发明的有益效果体现在：

本发明以黑皮鸡枞菌多糖为原料，经分步醇沉、DEAE-52纤维素柱层析及superdex-75分子筛凝胶柱层析分离纯化获得。分步醇沉法使不同分子量大小的多糖组分初步分离，为下一步更加精细的分离纯化做好充分准备，最终ORP-1产品纯度高达95％以上。

本发明得到的新型益生元ORP-1，在口腔、胃及小肠的体外模拟消化过程中，具有抗消化性；在人体粪便体外模拟酵解过程中，能被肠道微生物当作代谢底物酵解利用并产生能调节肠道pH的酸性物质(短链脂肪酸)；同时促进肠道益生菌两歧双歧杆菌和嗜酸乳杆菌的增殖；ORP-1具有益生元活性，功效显著，其市场应用前景十分广阔。

附图说明

图1为本发明实施例5中黑皮鸡枞菌多糖ORP-1的高效液相色谱图。从图中可知，ORP-1是保留时间为9.554min的单一吸收峰，通过测定与计算得出ORP-1的分子量为2.4×10⁴Da。

图2为本发明实施例5中黑皮鸡枞菌多糖ORP-1的单糖组成结果图，ORP-1的单糖组成按摩尔比为甘露糖:葡萄糖:半乳糖:岩藻糖＝1.48:1.00:29.65:8.22。

图3A-C为本发明实施例5中口腔、胃、小肠体外模拟消化产物中总糖及还原糖含量变化。从图中可知，黑皮鸡枞菌多糖ORP-1经口腔、胃、小肠消化液消化后，总糖含量和还原糖含量都没有显著变化，说明ORP-1在上消化道具有抗消化性。

图4A-B为本发明实施例5中人体粪便体外模拟酵解产物中总糖、还原糖含量变化及酵解液中pH变化。从图中可知，总糖含量始终呈减少趋势(图4A)，还原糖含量没有明显变化(图4A)，说明微生物能够降解黑皮鸡枞菌多糖ORP-1，并立即被微生物利用；从图4B中可知，空白组酵解液pH变化不明显；FOS组酵解液pH持续下降并于24h后趋于稳定；ORP-1组pH整体呈下降趋势，说明黑皮鸡枞菌多糖ORP-1能够被肠道微生物利用，并产生能调节肠道pH的酸性物质。

图5为本发明实施例5中ORP-1对两歧双歧杆菌和嗜酸乳杆菌体外增殖作用。从图中可知，培养48h后，ORP-1能够明显促进两种益生菌的增殖。

具体实施方式

实施例1：

本实施例新型肠道益生元为黑皮鸡枞菌多糖ORP-1，其分子量为2.4×10⁴Da，其单糖组成按摩尔比为甘露糖:葡萄糖:半乳糖:岩藻糖＝1.48:1.00:29.65:8.22；其制备步骤如下：

以600mg纯度不低于85％的黑皮鸡枞菌粗多糖为原料，以40％、50％乙醇浓度进行分步醇沉；沉淀经烘干、称重、溶解后置于DEAE-52纤维素层析柱，上样条件为100mg粗多糖溶于1mL蒸馏水、流速1mL/min，得到水洗脱多糖溶液；再经浓缩、冷冻干燥、称重、溶解后置于superdex-75分子筛凝胶层析柱，上样条件为50mg多糖溶于300μL蒸馏水、流速0.3mL/min，合并收集到的多糖溶液，经浓缩、冷冻干燥得到新型肠道益生元黑皮鸡枞菌多糖ORP-1。

图1为本实施例所得黑皮鸡枞菌多糖ORP-1的高效液相色谱图。

实施例2：

本实施例新型肠道益生元为黑皮鸡枞菌多糖ORP-1，其分子量为2.4×10⁴Da，其单糖组成按摩尔比为甘露糖:葡萄糖:半乳糖:岩藻糖＝1.48:1.00:29.65:8.22；其制备步骤如下：

以600mg纯度不低于85％的黑皮鸡枞菌粗多糖为原料，以40％、60％乙醇浓度进行分步醇沉；沉淀经烘干、称重、溶解后置于DEAE-52纤维素层析柱，上样条件为100mg粗多糖溶于1mL蒸馏水、流速1mL/min，得到水洗脱多糖溶液；再经浓缩、冷冻干燥、称重、溶解后置于superdex-75分子筛凝胶层析柱，上样条件为50mg多糖溶于300μL蒸馏水、流速0.3mL/min，合并收集到的多糖溶液，经浓缩、冷冻干燥得到新型肠道益生元黑皮鸡枞菌多糖ORP-1。

本实施例所得产品的HPLC图谱与实施例1相似。

实施例3：

本实施例新型肠道益生元为黑皮鸡枞菌多糖ORP-1，其分子量为2.4×10⁴Da，其单糖组成按摩尔比为甘露糖:葡萄糖:半乳糖:岩藻糖＝1.48:1.00:29.65:8.22；其制备步骤如下：

以600mg纯度不低于85％的黑皮鸡枞菌粗多糖为原料，以40％、70％乙醇浓度进行分步醇沉；沉淀经烘干、称重、溶解后置于DEAE-52纤维素层析柱，上样条件为100mg粗多糖溶于1mL蒸馏水、流速1mL/min，得到水洗脱多糖溶液；再经浓缩、冷冻干燥、称重、溶解后置于superdex-75分子筛凝胶层析柱，上样条件为50mg多糖溶于300μL蒸馏水、流速0.3mL/min，合并收集到的多糖溶液，经浓缩、冷冻干燥得到新型肠道益生元黑皮鸡枞菌多糖ORP-1。

本实施例所得产品的HPLC图谱与实施例1相似。

实施例4：

本实施例新型肠道益生元为黑皮鸡枞菌多糖ORP-1，其分子量为2.4×10⁴Da，其单糖组成按摩尔比为甘露糖:葡萄糖:半乳糖:岩藻糖＝1.48:1.00:29.65:8.22；其制备步骤如下：

以600mg纯度不低于85％的黑皮鸡枞菌粗多糖为原料，以40％、80％乙醇浓度进行分步醇沉；沉淀经烘干、称重、溶解后置于DEAE-52纤维素层析柱，上样条件为100mg粗多糖溶于1mL蒸馏水、流速1mL/min，得到水洗脱多糖溶液；再经浓缩、冷冻干燥、称重、溶解后置于superdex-75分子筛凝胶层析柱，上样条件为50mg多糖溶于300μL蒸馏水、流速0.3mL/min，合并收集到的多糖溶液，经浓缩、冷冻干燥得到新型肠道益生元黑皮鸡枞菌多糖ORP-1。

本实施例所得产品的HPLC图谱与实施例1相似。

实施例5：

本实施例新型肠道益生元为黑皮鸡枞菌多糖ORP-1，其分子量为2.4×10⁴Da，其单糖组成按摩尔比为甘露糖:葡萄糖:半乳糖:岩藻糖＝1.48:1.00:29.65:8.22；其制备步骤如下：

以600mg纯度不低于85％的黑皮鸡枞菌粗多糖为原料，以40％、90％乙醇浓度进行分步醇沉；沉淀经烘干、称重、溶解后置于DEAE-52纤维素层析柱，上样条件为100mg粗多糖溶于1mL蒸馏水、流速1mL/min，得到水洗脱多糖溶液；再经浓缩、冷冻干燥、称重、溶解后置于superdex-75分子筛凝胶层析柱，上样条件为50mg多糖溶于300μL蒸馏水、流速0.3mL/min，合并收集到的多糖溶液，经浓缩、冷冻干燥得到新型肠道益生元黑皮鸡枞菌多糖ORP-1。

本实施例所得产品的HPLC图谱与实施例1相似。

实施例6：实施例5产品的益生元活性测定

1、体外模拟口腔消化

收集三名志愿者的唾液，并将此三种唾液等体积混合，得到模拟口腔体外消化的消化液。

配制2mg/mL的黑皮鸡枞菌多糖ORP-1水溶液，分别将等体积的唾液与多糖水溶液混合、等体积的唾液与蒸馏水混合、等体积的多糖水溶液与蒸馏水混合，所有测试管置于37℃恒温摇床中，150r/min保持2h，分别在0.5h、1h、2h取样3mL于5mL离心管中，并放入沸水浴中加热10min去除唾液淀粉酶活性以停止口腔模拟消化反应，设置三组平行实验。

2、体外模拟胃消化

胃电解质溶液的配制：准确称取0.15g CaCl₂、0.6g NaHCO₃、1.1g KCl、3.1g NaCl，并用蒸馏水定容至250mL，后用0.1mol/L的HCl调pH至3.0。

胃液的配制：取150mL胃电解质，分别加入37.5mg胃脂肪酶及35.4mg胃蛋白酶，然后加入1.5mLCH₃COONa(1mol/L)，室温下搅拌10min后，用0.1mol/L的HCl溶液调pH至3.0。

分别将等体积的黑皮鸡枞菌多糖ORP-1水溶液(2mg/mL)与胃液混合，多糖水溶液(2mg/mL)与蒸馏水混合，蒸馏水与胃液混合，设置三组平行实验。在37℃摇床(150r/min)中进行6h胃部模拟消化。分别在消化过程中的0.5h、1h、2h、4h和6h取样3mL并放入沸水浴中加热10min终止消化。

3、体外模拟小肠消化

肠电解质溶液的配制：准确称取0.033g CaCl₂，0.065g KCl，0.54g NaCl，并用蒸馏水定容至100mL，后用0.1mol/L的NaOH溶液调pH至7.5。

7％(w/w)胰酶溶液的配制：称取7g胰酶，加蒸馏水至100ml，在室温下用玻璃棒搅拌10min，离心10min(4800r/min)，取上清液。

4％(w/w)胆汁溶液的配制：称取4g胆盐，加入蒸馏水至100ml。

小肠液的配制：为了使人工小肠液更具真实性，首先向50mL肠电解质中加入50mL4％胆汁，同时加入50mL 7％胰酶溶液和6.5mg的胰蛋白酶，混合均匀，最后用0.2mol/L的NaOH溶液调pH至7.5。

取经胃部模拟消化后的黑皮鸡枞菌多糖ORP-1与胃液混合消化液，分别加入与模拟肠液体积比为10:3的肠液、肠电解质或蒸馏水，空白对照为蒸馏水与小肠液以10:3的体积比混合，各设三组平行实验。在37℃(150r/min)摇床中进行小肠模拟消化6h。分别在消化过程中的1h、2h、4h和6h取样3mL于5mL离心管中，并放入沸水浴中加热10min以终止消化。

4、体外模拟酵解实验

酵解培养基的配制：称取1g蛋白胨，1g酵母提取物，0.01g氯化血红素，0.25g L-半胱氨酸，0.25g胆盐，0.05g NaCl，0.02g K₂HPO₄，0.02g KH₂PO₄，0.005g MgSO₄·7H₂O，0.005gCaCl₂·6H₂O，1g NaHCO₃，量取0.5mL刃天青溶液(1％，w/v)，1mL吐温-80和5μL维生素K，用蒸馏水定容至250mL。

取31.5mL培养基，用蒸馏水稀释至63mL即得空白基础营养培养基；取31.5mL培养基，加入溶解好的350mg低聚果糖(FOS)或黑皮鸡枞菌多糖ORP-1，分别加蒸馏水稀释至63mL即得含有FOS的基础营养培养基和含有黑皮鸡枞菌多糖ORP-1的基础营养培养基。将此三种培养基在121℃高压灭菌20min。

实验前，采集三名志愿者粪便，采集结束将粪便样品混合，混合后以15％(w/v)的比例在粪便中立即加入PBS缓冲液(0.1M，pH 7.2，已在121℃下灭菌20min)用匀浆机搅拌1min，迅速用已灭菌的八层纱布过滤至无菌烧杯中，得到粪便悬浮液，随后立即将便液转移至厌氧箱中。

在厌氧培养箱的无氧环境中，分别将1.1mL粪便悬浮液加入到含有9.9mL空白基础营养培养基、FOS基础营养培养基及ORP基础营养培养基的厌氧管中。每管设置三组平行。所有厌氧管均至于37℃厌氧培养箱中进行厌氧发酵培养。分别在发酵0h、12h、24h、48h取样2mL，立即置于冰浴中以停止微生物酵解，随后在4℃的低温条件下离心5min(12000r/min)，取上清用于测定总糖、还原糖含量及pH变化。

5、口腔、胃、小肠体外模拟消化产物及酵解产物中总糖及还原糖含量测定

配置100μg/mL的葡萄糖标准溶液，分别取0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1mL葡萄糖标液于试管中，各加入蒸馏水补足至2mL，分别加入1mL 5％苯酚溶液后迅速加入5mL浓硫酸，震荡摇匀后冷却，室温放置20min后于490nm处测吸光度值。以葡萄糖浓度(mg/mL)为横坐标，吸光度值为纵坐标，作出总糖含量标准曲线。

取1mL消化产物及酵解产物稀释液分别按照上述方法测得吸光度值，根据葡萄糖标准曲线计算口腔、胃、小肠体外模拟消化产物及酵解产物中总糖含量。

配置1mg/mL的葡萄糖标准溶液，分别取0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1mL于试管中，分别用蒸馏水补足至1mL，分别加入配置好的DNS溶液2mL，漩涡震荡混匀后至于沸水中5min，流动水冷却后加入蒸馏水均补足至15mL，在540nm的波长下测量吸光度值。以还原糖浓度(mg/mL)为横坐标，吸光度值为纵坐标，作出还原糖含量标准曲线。

取1mL消化产物及酵解产物稀释液分别按照上述方法测得吸光度值，根据还原糖标准曲线计算口腔、胃、小肠体外模拟消化产物及酵解产物中还原糖含量。

6、酵解过程中pH的变化测定

取酵解0h、12h、24h、48h的产物上清液，通过pH计测定不同时间点酵解产物的pH值。

7、ORP-1对两种益生菌的增殖作用

将制备的100mL液体活化培养基于121℃下灭菌20min，冷却。开启两歧双歧杆菌和嗜酸乳杆菌冻干粉，接种于液体活化培养基，放入厌氧培养箱中(气体组成：85％N₂，10％CO₂，5％H₂)在37℃下培养48h，反复活化两次。将第二代菌种进行-80℃冷冻保藏，用第三代活化菌种进行试验。

取6个大试管，分别装入10mL ORP-1浓度为2％的增殖培养基，于121℃下灭菌20min，冷却后，按照5％的比例接种已活化的两种益生菌(每组三个平衡)，置于37℃下厌氧培养48h。用1.0％的无菌水将0、48h取出的培养液样品稀释10⁷～10⁹倍，用血球计数法测定每毫升培养液中活菌的数量。通过公式计算培养液的活菌数之差，得到培养48h后益生菌的增殖数，结果以log cfu/mL表示。

益生菌的增殖数(log cfu/mL)＝log B－log A

其中，A——培养0h的活菌数，(cfu/mL)；

B——培养48h的活菌数，(cfu/mL)。

Claims (3)

1.一种肠道益生元黑皮鸡枞菌多糖ORP-1，其特征在于：

所述黑皮鸡枞菌多糖ORP-1是以黑皮鸡枞菌多糖为原料，分离纯化后获得的单一组分多糖ORP-1，其分子量为2.4×10⁴Da，其单糖组成按摩尔比为甘露糖:葡萄糖:半乳糖:岩藻糖=1.48:1.00:29.65:8.22。

2.一种权利要求1所述的黑皮鸡枞菌多糖ORP-1的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

步骤1：以600 mg纯度不低于85%的黑皮鸡枞菌粗多糖为原料，以40vt%、50-90vt%乙醇进行分步醇沉；

步骤2：步骤1所得沉淀经烘干、称重、溶解后置于DEAE- 52纤维素层析柱，上样条件为100 mg粗多糖溶于1 mL蒸馏水，流速1 mL/min，得到水洗脱多糖溶液；

步骤3：将步骤2所得水洗脱多糖溶液经浓缩、冷冻干燥、称重、溶解后置于superdex-75分子筛凝胶层析柱，上样条件为50 mg多糖溶于300 μL蒸馏水、流速0.3 mL/min，合并收集到的多糖溶液，浓缩并冷冻干燥，得到新型肠道益生元黑皮鸡枞菌多糖ORP-1。

3.一种权利要求1所述的黑皮鸡枞菌多糖ORP-1的用途，是在制备肠道益生元制剂中的应用；所述黑皮鸡枞菌多糖ORP-1，一方面在口腔、胃及小肠的体外模拟消化过程中具有抵抗消化的特性；另一方面在人体粪便体外模拟酵解过程中能被粪便微生物酵解利用，并促进肠道益生菌两歧双歧杆菌和嗜酸乳杆菌的增殖。

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