CN109486732B - 一种长双歧杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种长双歧杆菌，于2018年7月17日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)予以保藏，保藏编号为：CGMCC No.16126。本发明提供的长双歧杆菌，抑制病原菌能力强且制为冻干粉后存活率高。

Description

一种长双歧杆菌及其应用
技术领域
本发明属于人体微生态学技术领域，尤其涉及一种长双歧杆菌及其应用。
背景技术
各种微生物（细菌）经常从不同的环境附到人体，并能在一定部位定居和不断生长、繁殖后代，这种现象通常称为“细菌定植”。定植的微生物必须依靠人体不断供给营养物质才能生长和繁殖，才能进而对人体产生影响。
通常而言，人体具有如下几种免疫机制：
a．结构屏障
幼儿抵抗外来病原微生物感染的“结构屏障”包括体表屏障和内部屏障。体表屏障由覆盖在体表的皮肤及与外界相通的腔道内衬着的粘膜构成，是机体防御微生物的第一道防线。如小肠粘膜上皮不仅具有消化吸收营养物质的功能同时也是一道抵抗有害物质(包括细菌、病毒、病原体、变应原大分子物质等)的重要屏障(Kato等)，特别是血脑屏障，它能阻止血液中的病原微生物及其他大分子物质进入脑组织和脑室。此外，消化道的蠕动和呼吸道粘膜纤毛的运动不仅对肠腔内微生物有机械清除作用，粘膜上皮的定期脱落更替降低了各种微生物建群的机会。
b．化学屏障
呼吸道和消化道各器官分泌的各种分泌物(含有溶菌酶、补体、天然抗体等)构成了幼儿抗感染的“化学屏障”。如幼儿口腔中的唾液(主要含有溶菌酶)可杀死多种病原微生物，胃分泌的胃酸和胃蛋白酶能破坏日粮抗原并能有效抑制多种微生物从口咽进入小肠，而进入小肠的某些微生物对小肠中的胆汁也非常敏感；另外，胰液中的蛋白酶可破坏细菌细胞膜。肠道杯状细胞分泌的粘液既可保护脆弱的肠上皮免受机械损伤，又可作为一种粘性基质来包栽抗原物质，使其更易被胰和上皮细胞分泌的酶降解(Gaskins，1999)；此外，粘膜可以保护上皮免受肠道菌群分泌的消化酶的破坏和阻止病原体侵入上皮(Nevtre等，1987)．
c．生物屏障
肠道中的大量正常菌群又被称为“生物屏障”。Hentges等(1983)认为正常菌群的主要作用是阻止入侵微生物在肠道中建群。Gaskin等(1996)报道认为正常菌群可刺激动物机制的发育从而增强机体免疫。正常菌群分泌的各种抗菌物质如细菌素能抑制某些厌氧菌繁殖。此外，正常菌群与病原微生物在建群点，营养等生存条件上存在的竞争关系，也在抑制病原微生物的生长发育和繁殖。
d．吞噬细胞，自然杀伤细胞及体液中的抗菌物质
幼儿血液中的吞噬细胞(部分来自母乳)包括中性粒细胞和单核／巨噬细胞。中性粒细胞在机体防御细菌感染中具有重要作用。中性粒细胞中的杀菌／渗透增强蛋白(BPl)不仅对革兰氏阳性菌具有广谱抑制和杀伤作用，而且具有中和细菌内毒素，抑制细胞因子释放和抵御内毒素致死效应等作用(柯岩等，1998)。自然杀伤细胞(NK细胞)可产生干扰素，发挥细胞毒作用而杀伤感染细胞。此外，体液中的补体、Tuftsin都发挥重要的非特异性免疫作用。
e．乳源非抗体保护蛋白
人乳铁蛋白(Loctoferrin，LTF)是母乳中一种非抗体保护蛋白，是新生幼儿转运铁离子并作为母亲乳腺及新生婴儿肠道的一种防御屏障，此外，还具有调节非特异性免疫，促进粒细胞和淋巴细胞有丝分裂等功能。
长双歧杆菌(BL)，是益生菌的一种，属于双歧杆菌，是对人体有益的一种菌种。一般用于食品类的双歧杆菌，具有调节肠道健康的功效。但现有的长双歧杆菌普遍具有如下缺陷：
1、抑制病原菌能力较弱。
2、冻干菌粉的冻干工艺直接关系到冻干后菌粉的存活率，其制为冻干菌粉后，活菌数量较低，影响其效用。
发明内容
为此，本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种抑制病原菌能力强且制为冻干粉后存活率高的长双歧杆菌。
本发明所要解决的第二个技术问题是现有技术中的冻干菌粉工艺得到的长双歧杆菌菌粉的存活率低的问题，进而提供一种菌株存活率高的长双歧杆菌冻干粉的制备方法。
本发明的长双歧杆菌，于2018年7月17日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）予以保藏，保藏编号为：CGMCC No. 16126。
所述的长双歧杆菌，其16SrDNA序列具有如SEQ ID NO.1 所示的序列结构。所述SEQ ID NO.1的序列结构具体如下：
caggatgaacgctggcggcgtgcttaacacatgcaagtcgaacgggatccctggcagcttgctgtcggggtgagagtggcgaacgggtgagtaatgcgtgaccaacctgccctgtgcaccggaatagctcctggaaacgggtggtaataccggatgctccgctccatcgcatggtggggtgggaaatgcttttgcggcatgggatggggtcgcgtcctatcagcttgttggcggggtgatggcccaccaaggcgttgacgggtagccggcctgagagggtgaccggccacattgggactgagatacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagcgacgccgcgtgcgggatggaggccttcgggttgtaaaccgcttttgttcaagggcaaggcacggtttcggccgtgttgagtggattgttcgaataagcaccggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtagggtgcgagcgttatccggatttattgggcgtaaagggctcgtaggcggttcgtcgcgtccggtgtgaaagtccatcgcctaacggtggatctgcgccgggtacgggcgggctggagtgcggtaggggagactggaattcccggtgtaacggtggaatgtgtagatatcgggaagaacaccaatggcgaaggcaggtctctgggccgtcactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacggtggatgctggatgtggggccctttccacgggtcccgtgtcggagccaacgcgttaagcatcccgcctggggagtacggccgcaaggctaaaactcaaagaaattgacgggggcccgcacaagcggcggagcatgcggattaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctgggcttgacatgtgccggatcgccgtggagacacggtttcccttcggggccggttcacaggtggtgcatggtcgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaaccctcgccgcatgttgccagcgggtgatgccgggaactcatgtgggaccgccggggtcaactcggaggaaggtggggatgacgtcagatcatcatgccccttacgtccagggcttcacgcatgctacaatggccggtacaacgcggtgcgacacggtgacgtggggcggatcgctgaaaaccggtctcagttcggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaaggcggagtcgctagtaatcgcggatcagcaacgccgcggtgaatgcgttcccgggccttgtacacgccgcccgtcaagtcatgaaagtgggtagcacccgaagccggtggcccgacccttgtggggggagccgtctaaggtgaga。
所述的长双歧杆菌在制备调理胃肠道健康和/或提高免疫力的药物中的应用；或者所述的长双歧杆菌在制备保健品或乳制品的应用。
优选地，所述的长双歧杆菌在制备治疗和/或预防腹泻的药物中的应用。
由所述的长双歧杆菌制备得到的长双歧杆菌冻干粉。
本发明的长双歧杆菌冻干粉的制备方法，包括如下步骤：
向所述的长双歧杆菌中加入保护剂，混合均匀，将其置于-30~-50℃的温度下预冻1-3h，然后置于-10~-20℃的温度下升华10-20h，再置于-10~-25℃的温度下升华10-20h，再在20-30℃的温度下二次升华1-5h，在真空下放置1-5h后，即得长双歧杆菌冻干粉。
优选地，所述保护剂为脱脂奶粉、麦芽糖、蔗糖、可溶性淀粉、甘露醇、谷氨酸钠、L-半胱氨酸、明胶中的一种或多种。
优选地，所述的长双歧杆菌冻干粉的制备方法，具体包括如下步骤：
（1）取所述的长双歧杆菌，厌氧培养，得到发酵液；
（2）取步骤（1）中发酵得到的所述发酵液，将其置于转速为8000-12000 r/min下，离心10-30min，收集菌泥；
（3）向步骤（2）中得到的菌泥中加入所述保护剂，所述保护剂与所述菌泥的重量比为3:1，混合均匀，将其置于-40℃的温度下预冻3h，然后置于-15℃的温度下升华15h，再置于25℃的温度下升华2h，在真空下放置2h后，使所述菌泥的含水量小于5%，即得长双歧杆菌冻干粉。
优选地，所述保护剂为脱脂奶粉、麦芽糖、蔗糖、可溶性淀粉、甘露醇、谷氨酸钠、L-半胱氨酸、明胶中的一种或多种。
优选地，步骤（1）具体为：取所述长双歧杆菌，按3%的接种量接种至培养基上，在温度为37℃下，初始pH值为7.5的条件下，培养36~48小时，得到发酵液。
优选地，所述培养基为凝固牛乳。
本发明的上述技术方案，相比现有技术具有以下优点：
（1）本发明所述的长双歧杆菌，从婴儿粪便分离大量的长双歧杆菌，根据抑制病源菌能力、产酸能力、消化能力等试验，筛选出能够较好地消化蛋白、肉渣、玉米、淀粉、树叶、草的长双歧杆菌，得到本发明所述的长双歧杆菌，将其用于人体，因为同源菌种好定殖，长双歧杆菌会抑制有害菌，进而维护肠道菌群生态平衡，形成生物屏障，抑制有害菌对肠道的入侵。另外，所述长双歧杆菌还可以通过产生大量的短链脂肪酸促进肠道蠕动及菌体大量生长改变渗透压而防止便秘。此外，菌体崩解产物和代谢物中含有多种酶、小肽、短链脂肪酸等成分，补充营养成分等优势。
（2）本发明所述的长双歧杆菌，在人的胃肠道疾病中，特别是腹泻发挥了很好的预防和治疗作用，并且通过多种途径弥补了抗生素和疫苗的不足，为人类的健康和获得安全的食品开辟了新的途径。
（3）本发明所述的长双歧杆菌，对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的抑菌直径较大，具有较强的抑制病原菌能力。
（4）本发明所述的长双歧杆菌，耐酸耐胆盐性良好，且经过冻干粉等工艺操作后菌株活性仍然较为理想、种子的保存期长。且通过本发明所述的长双歧杆菌冻干粉的制备方法制备，制备过程中，采用特定的保护剂，使制为冻干粉后长双歧杆菌的保持较高的存活率。
附图说明
图1是本发明所述的长双歧杆菌的菌液镜检结果图。
具体实施方法
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本实施例的长双歧杆菌，于2018年7月17日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）予以保藏，保藏编号为CGMCC No. 16126。
实施例1 长双歧杆菌的分离筛选
从健康新生婴儿和断奶婴儿的粪便中分离出了30多种双歧杆菌，而在非过敏体质的儿童中发现了和成年人相匹配的双歧杆菌微生物区系（或者说发现了比正常儿童高的更多的双歧杆菌类型）这些双歧杆菌粘附在儿童肠道的粘液中，对有毒物质侵害儿童机体有保护作用，因此，我们可以在儿童食物中增加双歧杆菌的含量，来增加儿童对疾病的抵抗能力和对过敏性物质的过敏反应。
本发明的保藏编号为CGMCC No. 16126的所述长双歧杆菌从新生儿和婴儿的粪便中分离，并通过如下方法分离得到：
将人体肠道粪便1克，装入放由30个玻璃球的灭菌瓶内加生理盐水作100倍稀释充分打均后，再作10-3、10-4、依次到10-8稀释度，取10-4、10-5、10-6、10-7、10-8五个稀释度的菌液分别接种于LYT通用琼脂平板、伊红、美兰琼脂、BB(BS)双歧杆菌选择性培养基。每种培养基接6个平板，接种后立即上下翻转培养皿使接种液在平皿表面均匀扩散。其中3个作需氧培养，24小时后即观察。另3个作厌氧培养48小时。经过肉眼观察和解剖显微镜45℃角折射光观察。将每种菌落再移植到LYT琼脂一个菌落及液体培养基一个菌落，分别做厌氧和需氧，同时涂片作革兰氏染色镜检，分离出138个菌株，进行鉴定结果属于8个科，11个属的36种菌，其中所分离筛选出的菌种每月继代一次，5代前冻干保存。
按照如下标准进行种子菌株的筛选：⑴.无内外毒素、无毒、无害、安全、无副作用；⑵.有利于促进体内菌群平衡或预防生态失调；⑶.高产抗菌活性物质、产酸能力强；⑷.来源于自身肠道的益生菌才具有较好的粘附性能。得到具有抑制病原菌、调节肠道微生态平衡、提高机体免疫力的长双歧杆菌。
得到的所述长双歧杆菌为革兰氏阳性杆菌，其特性如下：大小为0.5-0.8×2-8μm，呈杆状、棒状或分叉为V、Y型，所述长双歧杆菌中到大菌落，呈灰白色，中央隆起，表面平滑或粘液状。显微镜下45°折光性观察，菌落结构较为细致，边缘不规则，有荧光度刻纹，边缘一部分有彩色光带。
所述长双歧杆菌的代谢产物以乙酸为主。能发酵葡萄糖，阿拉伯糖、木糖、核糖和乳糖。以下对所述长双歧杆菌生产种子传至第1代、第10代、第13代，对不同代次菌种的形态、培养特性、和活菌数进行了测定，结果显示所述长双歧杆菌传至第13代时，其形态、培养特性未发生变异，活菌数较高，符合相关要求和规定。
具体实验方法如下：
将所述长双歧杆菌N9024株的基础种子分别接种PTYG液体培养基，双歧杆菌37 ℃静置培养18 h制备生产种子。将生产种子在PTYG液体培养基中连传13代（培养方法同上），观察和测定不同代次菌种的形态、培养特性、和活菌数，以确定生产菌种的代次。
其测试结果如下：
Figure 691721DEST_PATH_IMAGE001
上述结果显示生产种子传至13代时，所述双歧杆菌不低于1.0×108 CFU/mL，其能够保证生物制品生产的正常进行，表明保藏编号为CGMCC No. 16126的所述长双歧杆菌的生产种子在1-13代活力稳定。所述长双歧杆菌的第1代、第10代、第13代生产种子的菌液均为组成均一的菌株，其形态特征与原始种子一致，其菌液镜检结果如图1所示，表明四种菌的生产种子在1-13代内其形态特征稳定。
所述的长双歧杆菌，其16SrDNA序列具有如SEQ ID NO.1 所示的序列结构。所述SEQ ID NO.1的序列结构具体如下：caggatgaacgctggcggcgtgcttaacacatgcaagtcgaacgggatccctggcagcttgctgtcggggtgagagtggcgaacgggtgagtaatgcgtgaccaacctgccctgtgcaccggaatagctcctggaaacgggtggtaataccggatgctccgctccatcgcatggtggggtgggaaatgcttttgcggcatgggatggggtcgcgtcctatcagcttgttggcggggtgatggcccaccaaggcgttgacgggtagccggcctgagagggtgaccggccacattgggactgagatacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagcgacgccgcgtgcgggatggaggccttcgggttgtaaaccgcttttgttcaagggcaaggcacggtttcggccgtgttgagtggattgttcgaataagcaccggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtagggtgcgagcgttatccggatttattgggcgtaaagggctcgtaggcggttcgtcgcgtccggtgtgaaagtccatcgcctaacggtggatctgcgccgggtacgggcgggctggagtgcggtaggggagactggaattcccggtgtaacggtggaatgtgtagatatcgggaagaacaccaatggcgaaggcaggtctctgggccgtcactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacggtggatgctggatgtggggccctttccacgggtcccgtgtcggagccaacgcgttaagcatcccgcctggggagtacggccgcaaggctaaaactcaaagaaattgacgggggcccgcacaagcggcggagcatgcggattaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctgggcttgacatgtgccggatcgccgtggagacacggtttcccttcggggccggttcacaggtggtgcatggtcgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaaccctcgccgcatgttgccagcgggtgatgccgggaactcatgtgggaccgccggggtcaactcggaggaaggtggggatgacgtcagatcatcatgccccttacgtccagggcttcacgcatgctacaatggccggtacaacgcggtgcgacacggtgacgtggggcggatcgctgaaaaccggtctcagttcggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaaggcggagtcgctagtaatcgcggatcagcaacgccgcggtgaatgcgttcccgggccttgtacacgccgcccgtcaagtcatgaaagtgggtagcacccgaagccggtggcccgacccttgtggggggagccgtctaaggtgaga。
实施例2 长双歧杆菌冻干粉的制备
本实施例的长双歧杆菌为保藏编号为CGMCC No. 16126的菌株，其通过如下方法制备为长双歧杆菌冻干粉：
（1）取所述长双歧杆菌，在温度为37℃下，初始pH值为7.5的凝固牛乳中培养36~48小时，作为本实施例的优选实现方式，所述长双歧杆菌按3%的接种量接种至作为培养基的凝固牛乳上，并采用摇瓶培养的方式培养；所述凝固牛乳可采用市售的凝固型牛乳，也可使用牛乳自行制备。对于实现本发明的目的而言，采用的培养基并不唯一，本领域技术人员还可将凝固牛乳替换为其他常规的双歧杆菌的培养基。
（2）取步骤（1）中发酵得到的所述发酵液，将其置于离心机中，转速为8000 r/min，离心30min，收集菌泥；
（3）向步骤（2）中得到的菌泥中加入所述保护剂，所述保护剂为蔗糖、脱脂奶粉和明胶按照5:3:1的重量比混合而成。将所述蔗糖、所述脱脂奶粉、所述明胶混合均匀，经115℃灭菌30min，待冷却至室温后，在无菌条件下与所述菌泥按照3:1的重量比混匀，制成菌悬液，将其置于-40℃的温度下预冻3h，然后置于-15℃的温度下升华15h，再置于25℃的温度下升华2h，在真空下放置2h后，使所述菌泥的含水量小于5%，即得长双歧杆菌冻干粉。
实施例3 长双歧杆菌冻干粉的制备
本实施例的长双歧杆菌为保藏编号为CGMCC No. 16126的菌株，其通过如下方法制备为长双歧杆菌冻干粉：
向所述的长双歧杆菌中加入保护剂，混合均匀，将其置于-30℃的温度下预冻1h，然后置于-20℃的温度下升华10h，再置于-10℃的温度下升华20h，再在30℃的温度下二次升华5h，在真空下放置1h后，即得长双歧杆菌冻干粉。
本实施例中，所述保护剂为脱脂奶粉，作为本实施例可替换的实现方式，所述保护剂还可替换为脱脂奶粉、麦芽糖、蔗糖、可溶性淀粉、甘露醇、谷氨酸钠、L-半胱氨酸、明胶中的一种或多种。
效果试验例
为验证本发明的技术效果，进行以下实验：
实验一、保藏编号为CGMCC No. 16126的长双歧杆菌种子的制备保存期试验
取保藏编号为CGMCC No. 16126的所述长双歧杆菌，将基础种子冻干粉于-80 ℃条件下保存，保存期为2年，每两年检测一次。
其中，活菌计数的方法具体如下：
无菌称取3 g所述长双歧杆菌制剂，加入27 mL液体培养基或生理盐水，充分摇匀（用数个玻璃球摇打）后作10倍系列稀释，选择适宜稀释度进行接种。采用LBS选择性培养基，细菌的每个稀释度按0.2 mL接种3个平板，并迅速转动平板，使菌液在培养基表面流匀。培养48小时后，观察每个平板上的细菌生长情况，并计数。当每个平皿上的菌落数小于10或大于300时，应重新调整最后稀释度，重新测定。根据3个平皿菌落总数按下列公式计算活菌数：
Figure 164290DEST_PATH_IMAGE002
检测结果如下：
Figure 12161DEST_PATH_IMAGE003
Figure 937391DEST_PATH_IMAGE004
Figure 161699DEST_PATH_IMAGE005
实验二、长双歧杆菌的活菌数对比实验
取实施例2中制备得到的所述的长双歧杆菌冻干粉，记为CGMCC No. 16126组；取中国专利文献CN104120093A中保藏编号为CGMCC No.6283的长双歧杆菌，按照实施例2中的方法制备得到冻干粉，记为CGMCC No.6283组；按照实验一的方法检测两组的菌粉在常温下保存不同时间的活菌数。
其实验结果如下：
Figure 957617DEST_PATH_IMAGE006
实验三、菌株的耐酸耐胆盐特性实验
为了模拟动物体内的胃肠道环境，配制人工胃液和人工肠液，进行体外的耐酸耐胆性能的研究。此外作用时间也是进行此类试验时应考虑的重要问题之一。由于胆盐的存在改变了菌体外膜的通透性，所以对益生菌产生抑制、杀灭作用，进而影响益生菌的存活。
耐胃酸试验：取保藏编号为CGMCC No. 16126的所述长双歧杆菌，置于人工胃液中，37℃静置培养2h，取样测定活菌数，并计算存活率。
耐胆酸盐试验：取保藏编号为CGMCC No. 16126的所述长双歧杆菌，以人工肠液为基础，向其中加入0.3%的胆盐，然后所述长双歧杆菌置于其中，在37℃静置培养2h，取样测定活菌数，并计算存活率。
耐胃酸的检测结果为存活率66.0%；耐胆酸盐的检测结果为存活率51.1%。
实验四、抑制病原菌能力实验
取本发明的保藏编号为CGMCC No. 16126的所述长双歧杆菌、中国专利文献CN104120093A中保藏编号为CGMCC No.6283的长双歧杆菌，再取由中国药品监察所提供致病菌：致病性强毒大肠杆菌44365、致病性强毒沙门氏菌C-79-14、致病性强毒沙门氏菌C-79-20。分别检测各菌株对各致病菌的抑菌半径，并记录。
其检测结果如下：
Figure 241968DEST_PATH_IMAGE007
实验五、保护剂对冻干粉工艺的影响实验
本实验以存活率为指标，考察对保护剂的冻干保护作用。按照实施例2中的方式制备长双歧杆菌冻干粉，区别仅在于：将保护剂分别替换为脱脂奶粉、麦芽糖、蔗糖、可溶性淀粉、谷氨酸钠、L-半胱氨酸、明胶、甘露醇，制备得到长双歧杆菌，分别测试得到的长双歧杆菌冻干粉在常温下保存30天后的存活率。
Figure 513549DEST_PATH_IMAGE008
由此可见，单一的成分作为保护剂的效果并不理想，且保护剂对所述双歧杆菌的保护效果差异较大。为了验证该工艺的稳定性，对实施例2中的方案进行三次实验验证，活菌率结果分别为91.6、92.5、95.9，误差率＜4%，证实结果稳定可靠。
按照实施例2中的方式制备长双歧杆菌冻干粉，区别仅在于：将保护剂分别替换为将脱脂奶粉、蔗糖、明胶三种成分按照1:1:1的重量比混合，并将其记为第一组；将脱脂奶粉、蔗糖、明胶三种成分按照1:3:2的重量比混合，并将其记为第二组；将脱脂奶粉、蔗糖、明胶三种成分按照1:5:3的重量比混合，并将其记为第三组；将脱脂奶粉、蔗糖、明胶三种成分按照2:1:2的重量比混合，并将其记为第四组；将脱脂奶粉、蔗糖、明胶三种成分按照2:3:3的重量比混合，并将其记为第五组；将脱脂奶粉、蔗糖、明胶三种成分按照2:5:1的重量比混合，并将其记为第六组；将脱脂奶粉、蔗糖、明胶三种成分按照3:1:3的重量比混合，并将其记为第七组；将脱脂奶粉、蔗糖、明胶三种成分按照3:3:2的重量比混合，并将其记为第八组；将实施例2制备得到的长双歧杆菌冻干粉，记为第九组。分别测试上述各组得到的长双歧杆菌冻干粉在常温下保存30天后的存活率。
其检测结果如下：
Figure 541548DEST_PATH_IMAGE009
实验六、所述长双歧杆菌对小白鼠安全性试验
取20-22 g的小白鼠，清洁级试验用小白鼠40只，分4 组，每组10 只，其中1-3组均给于本发明所述的长双歧杆菌的活菌制剂，其中，所述长双歧杆菌不低于1.0×107CFU，给药周期为3天，给药结束后，观察所有小白鼠的临床症状，对试验结果进行评价。
观察喂药后小白鼠的精神、采食、饮水、生长、增重等临床情况，以及观察试验期间动物是否有与药物相关的不良反应，如呼吸、行为异常、精神抑制及排粪异常等变化情况。并于给药前当天（第1天）以及实验结束的第13天记录每组小白鼠的重量，计算小白鼠的日均增重。
其实验结果如下：
各组在试验期间小白鼠全部健活，精神良好，食欲旺盛，皮毛肤色正常，排便排尿色泽形态正常，无其他异常临床症状、无生病及死亡显现。
分别于给药前当天（第1天）、实验结束后第13天对每组小白鼠进行称重，并计算各组平均日增重。结果见下表：
Figure 457551DEST_PATH_IMAGE010
从表中发现3个实验组的小白鼠日均增重明显高于空白对照的第4组，表明本发明所述的长双歧杆菌对小白鼠有增重作用，且给药安全性检验合格。
实验七、所述长双歧杆菌对犬肠道菌群失调腹泻模型的改善效果实验
本试验采用头孢氨苄作为诱导药物，通过持续给药导致比格犬肠道菌群紊乱，构建试验犬抗生素相关性腹泻，具体包括如下步骤：取3.5~4月龄，体重5.0~6.5kg的普通级试验用比格犬25只，其中5只，作为对照组，另外20只以梯度增加诱导药物剂量的方式，连续给予抗生素诱导，构建试验犬肠道菌群失调腹泻模型，抗生素诱导15~20天，构模成功。将经抗生素诱导的20只比格犬分为高剂量组、中剂量组、低剂量组、模型组，对高剂量组、中剂量组、低剂量组分别给予高、中、低剂量的本发明所述的长双歧杆菌的活菌制剂，模型组不给药，给药周期为6~8天，给药结束后，观察所有犬只的临床症状。
其实验结果如下：
比格犬体重是一个直观、易考察的指标，且与多种因素密切相关。对治疗前后比格犬的体重进行分析。造模后对不同组的比格犬体重进行两两比较，组间试验犬的平均体重P＞0.05，说明使用抗生素造模对比格犬体重变化影响不大。连续给予所述长双歧杆菌剂制剂7天后，将模型组、低、中、高剂量组两两比较P＞0.05，说明不同剂量长双歧杆菌对试验犬的体重影响不显著。由于本试验中试验犬为幼犬，其体重尚处于增长状态中，且受多方面因素的影响，故该指标无法反应真实的体重恢复程度，仅可作为间接指标。长双歧杆菌制剂对菌群紊乱比格犬体重的影响结果如下：
Figure 647224DEST_PATH_IMAGE011
其中，单位：kg，
Figure DEST_PATH_IMAGE012
±s，n=2或5。
造模前，各组比格犬活泼好动，被毛平整光滑、粪便干燥成形，较为正常。造模结束时，对照组比格犬饮食正常，行动活跃，排便次数规律，粪便干燥成形。经抗生素诱导的试验犬逐步出现大便稀湿、机敏性降低、偶有厌食或乏力、呕吐等症状，属于抗生素过量致肠道菌群失调所导致的典型症状。
长双歧杆菌制剂对试验犬粪便状态的影响检测结果如下表：
Figure 281468DEST_PATH_IMAGE013
其中，粪便状态：--成形便；+ 成形但水分稍多；++ 粘稠的溏稀便；+++ 水样便。
所述长双歧杆菌制剂对稀便犬只治疗效果统计结果，如下表所示：
Figure 847579DEST_PATH_IMAGE014
由于粪便中的微生物占肠道微生物总量中的大部分，其构成反映了整个消化系统的菌群状态，又因为粪便采集容易、称量方便，所以我们通过分析粪便来研究肠道菌群。采用传统微生物学技术（稀释平板菌落计数法），对犬粪便中可培养微生物进行了分析。经所述长双歧杆菌连续给药6~7天后，对照组取2份样品，模型组与长双歧杆菌给药组20只犬分别取样，共22份样品，进行常规的平板活菌计数。长双歧杆菌对比格犬粪便微生物数量的影响其检测结果如下：
Figure 149247DEST_PATH_IMAGE015
其中，log cfu/g，
Figure 244242DEST_PATH_IMAGE017
±s，n=2或5；表中，*P<0.05，**P<0.01。
连续给长双歧杆菌活菌制剂7天后，通过犬只临床症状、粪便情况及菌群检测结果，统计不同剂量组对幼犬肠道菌群失调症的疗效。其检测结果如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE018
长双歧杆菌活菌制剂以2.0g/只/次，每天2次，连续喂服7天，可以缓解幼犬因肠道菌群失调症所致腹泻症状，促进犬只恢复菌群平衡。由此可见，本发明所述的长双歧杆菌具有调理胃肠道健康，提高免疫力的功能。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
SEQUENCE LISTING
<110> 谭瑛
<120> 一种长双歧杆菌及其应用
<130> 2018
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1448
<212> DNA
<213> 长双歧杆菌
<400> 1
caggatgaac gctggcggcg tgcttaacac atgcaagtcg aacgggatcc ctggcagctt 60
gctgtcgggg tgagagtggc gaacgggtga gtaatgcgtg accaacctgc cctgtgcacc 120
ggaatagctc ctggaaacgg gtggtaatac cggatgctcc gctccatcgc atggtggggt 180
gggaaatgct tttgcggcat gggatggggt cgcgtcctat cagcttgttg gcggggtgat 240
ggcccaccaa ggcgttgacg ggtagccggc ctgagagggt gaccggccac attgggactg 300
agatacggcc cagactccta cgggaggcag cagtggggaa tattgcacaa tgggcgcaag 360
cctgatgcag cgacgccgcg tgcgggatgg aggccttcgg gttgtaaacc gcttttgttc 420
aagggcaagg cacggtttcg gccgtgttga gtggattgtt cgaataagca ccggctaact 480
acgtgccagc agccgcggta atacgtaggg tgcgagcgtt atccggattt attgggcgta 540
aagggctcgt aggcggttcg tcgcgtccgg tgtgaaagtc catcgcctaa cggtggatct 600
gcgccgggta cgggcgggct ggagtgcggt aggggagact ggaattcccg gtgtaacggt 660
ggaatgtgta gatatcggga agaacaccaa tggcgaaggc aggtctctgg gccgtcactg 720
acgctgagga gcgaaagcgt ggggagcgaa caggattaga taccctggta gtccacgccg 780
taaacggtgg atgctggatg tggggccctt tccacgggtc ccgtgtcgga gccaacgcgt 840
taagcatccc gcctggggag tacggccgca aggctaaaac tcaaagaaat tgacgggggc 900
ccgcacaagc ggcggagcat gcggattaat tcgatgcaac gcgaagaacc ttacctgggc 960
ttgacatgtg ccggatcgcc gtggagacac ggtttccctt cggggccggt tcacaggtgg 1020
tgcatggtcg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa 1080
ccctcgccgc atgttgccag cgggtgatgc cgggaactca tgtgggaccg ccggggtcaa 1140
ctcggaggaa ggtggggatg acgtcagatc atcatgcccc ttacgtccag ggcttcacgc 1200
atgctacaat ggccggtaca acgcggtgcg acacggtgac gtggggcgga tcgctgaaaa 1260
ccggtctcag ttcggatcgc agtctgcaac tcgactgcgt gaaggcggag tcgctagtaa 1320
tcgcggatca gcaacgccgc ggtgaatgcg ttcccgggcc ttgtacacgc cgcccgtcaa 1380
gtcatgaaag tgggtagcac ccgaagccgg tggcccgacc cttgtggggg gagccgtcta 1440
aggtgaga 1448

Claims (10)

1.一种长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)，其保藏编号为CGMCC NO .16126。
2.权利要求1所述的长双歧杆菌在制备调理胃肠道健康和/或提高免疫力的药物中的应用。
3.权利要求1所述的长双歧杆菌在制备保健品或乳制品的应用。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的长双歧杆菌在制备治疗和/或预防腹泻的药物中的应用。
5.一种由权利要求1所述的长双歧杆菌制备得到的长双歧杆菌冻干粉。
6.一种长双歧杆菌冻干粉的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： 向权利要求1所述的长双歧杆菌中加入保护剂，混合均匀，将其置于-30～-50℃ 的温度下预冻1-3h，然后置于-10～-20℃的温度下升华10-20h，再置于-10～-25℃的温度下升华10-20h，再在20-30℃的温度下二次升华1-5h，在真空下放置1-5h后，即得长双歧杆菌冻干粉。
7.根据权利要求6所述的长双歧杆菌冻干粉的制备方法，其特征在于，所述保护剂为脱脂奶粉、麦芽糖、蔗糖、可溶性淀粉、甘露醇、谷氨酸钠、L-半胱氨酸或明胶中的一种或多种。
8.根据权利要求6所述的长双歧杆菌冻干粉的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤： (1)取权利要求1所述的长双歧杆菌，厌氧培养，得到发酵液； (2)取步骤(1)中发酵得到的所述发酵液，将其置于转速为8000-12000r/min下，离心10-30min，收集菌泥； (3)向步骤(2)中得到的菌泥中加入所述保护剂，所述保护剂与所述菌泥的重量比为3: 1，混合均匀，将其置于-40℃的温度下预冻3h，然后置于-15℃的温度下升华15h，再置于25 ℃的温度下升华2h，在真空下放置2h后，使所述菌泥的含水量小于5％，即得长双歧杆菌冻干粉。
9.根据权利要求8所述的长双歧杆菌冻干粉的制备方法，其特征在于，所述保护剂为脱脂奶粉、麦芽糖、蔗糖、可溶性淀粉、甘露醇、谷氨酸钠、L-半胱氨酸、明胶中的一种或多种。
10.根据权利要求8所述的长双歧杆菌冻干粉的制备方法，其特征在于，步骤(1)具体为：取所述长双歧杆菌，按3％的接种量接种至培养基上，在温度为37℃下，初始pH值为7.5的条件下，培养36～48小时，得到发酵液。
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