CN114540239B - 一株兔源性预防宠物腹泻屎肠球菌zjuids-r1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一株兔源性预防宠物腹泻屎肠球菌ZJUIDS‑R1及其应用。所述屎肠球菌ZJUIDS‑R1(Enterococcus Faecium)保藏号为：CGMCC NO.24376。本发明从健康宠物兔粪便中分离获得的益生菌中筛选出来具有预防腹泻功能的屎肠球菌。该菌株具有较强的胆盐水解酶活力，在耐酸耐胆盐方面比其他乳酸菌有明显的优势，适合肠胃环境并具有增殖能力。该菌株无抗生素耐性，具有抗菌活性，能抑制肠内有害的病原菌。所述屎肠球菌ZJUIDS‑R1可在制备预防各种宠物腹泻产品中的应用。本发明中的屎肠球菌可广泛用于开发预防腹泻相关益生功能产品。

Description

一株兔源性预防宠物腹泻屎肠球菌ZJUIDS-R1及其应用

技术领域

本发明属于动物微生物技术领域，涉及具有预防腹泻功能的屎肠球菌，尤其涉及一株兔源性预防宠物腹泻屎肠球菌ZJUIDS-R1及其应用。

背景技术

中国作为世界养兔最多的国家，兔饲养规模在不断扩大，疫病流行也呈现增加的趋势，其中断奶幼兔腹泻是一些兔场最主要的传染性疾病。据调查，一些生产体系不完善的兔场中，幼兔死亡率高达50％～70％，其中腹泻占到80％以上。家兔腹泻病因复杂而诱因多种多样，例如低纤维日粮、抗生素诱发、饲料应激和病原菌污染等，控制腹泻难度大，患病后治愈率低，是养兔业有待解决的难题之一。抗菌药物的使用同样存在生态安全、药物残留、耐药性、抗生素相关性腹泻等弊端，近年来，世界各国都在推进饲料“禁抗”模式，因此寻求安全有效的抗生素替代品迫在眉睫。

益生菌是一类摄入足够量时能改善宿主健康作用的微生物，在肠道内发挥益生作用后能有效降低动物体内的药物残留和细菌耐药性，抵抗外来致病菌的定植，在防治动物腹泻、促进动物生长、提高免疫机能等方面有一定的优势，能有效降低幼龄动物的发病率和死亡率、提高成年动物生产性能、改善肉质、提高饲料转化率等。益生菌作为一种天然高效环保的添加剂，具有在动物体内无残留、无毒副作用、无抗药性、无污染等特点，被认为是兔子、猫和狗等宠物抗生素最有效的替代品。

宠物腹泻是一种症状而不是一种疾病，引起这种症状的原因非常复杂，同时又存在多种多样的诱因，其病因大致可分为环境因素、营养因素和疾病因素。温差变化大、断乳、转群、长途运输等环境变化，均会打乱动物的采食规律，影响肠道消化功能，引起腹泻。就兔而言，长期饲喂高蛋白、高纤维或含高碳水化合物饲料、饲料发霉、不定时饲喂、饲料中随意添加抗生素等都会引起仔兔发生腹泻。导致动物腹泻的病原微生物主要又分为细菌、病毒、寄生虫、附红细胞体、真菌等。引起动物腹泻的细菌常见于大肠杆菌、沙门氏菌、魏氏梭菌、巴氏杆菌、产气荚膜梭菌等，其中以大肠杆菌为病因的腹泻占首位，单一病原菌可以引起动物腹泻，也可以与其他病原菌混合感染发病，在生产和生活中混合感染引起的腹泻占比最大。

发明内容

本发明的目的是提供一种兔源性预防宠物腹泻屎肠球菌ZJUIDS-R1，所述屎肠球菌ZJUIDS-R1(Enterococcus Faecium)已于2022年1月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC NO.24376。本发明所提供的屎肠球菌ZJUIDS-R1(Enterococcus Faecium)的16s rDNA全序列如SEQ ID No.1所示。

本发明从健康宠物兔的粪便中筛选出一株屎肠球菌ZJUIDS-R1(EnterococcusFaecium)，通过细菌形态学、生理学、培养特性和16S rDNA测序等对该菌进行了鉴定。

本发明所提供屎肠球菌ZJUIDS-R1(Enterococcus Faecium)的菌落形态学特征为：在MRS琼脂培养基上形成明显的菌落，菌落大小0.5～1.0mm。菌落圆形，边缘整齐，白色，表面光滑。其菌体形态特性为：革兰氏阳性球菌，无芽孢、无鞭毛，单个、成对或聚集存在。

本发明的另一个目的是提供所述屎肠球菌ZJUIDS-R1在制备预防兔源性宠物腹泻产品中的应用。所述宠物主要包括：犬、猫、兔、豚鼠、龙猫、仓鼠等。

所述产品为具有抗腹泻功能的药品、保健品及宠物食品和饲料(包括兔、犬、猫、豚鼠、龙猫、仓鼠等)。

本发明所述的具有预防腹泻功能的药品包括具有抗腹泻功能的活菌制剂(如活菌菌粉、菌液制剂)，以及处方膏药，该活菌制剂中屎肠球菌ZJUIDS-R1的活菌数为1.0×10¹⁰～5.0×10¹⁰CFU/g，处方膏药中活菌数为10⁸CFU/g。

所述具有抗腹泻功能的保健品是具有预防腹泻功能的滴剂(ZJUIDS-R1有效菌保证值1*10⁹CFU/ml)。

所述具有抗腹泻功能的宠物食品是具有预防腹泻功能的宠物奶粉、宠物罐头等，其中ZJUIDS-R1有效菌保证值1*10⁹CFU/g。

本发明所述的具有抗腹泻功能的饲料由屎肠球菌ZJUIDS-R1单独或与其他菌株混合发酵制备。所述饲料优选为具有预防腹泻功能的草粉(例如为提摩西草草粉)混合物，为青贮饲料。

本发明所提供的屎肠球菌ZJUIDS-R1(Enterococcus Faecium)在动物试验中腹泻预防率达到87.5％(n＝8)。其具有以下能力：(1)具有较强的胆盐水解酶活力；(2)能耐受酸和胆盐，并且具有一定的增殖能力；对常见的抗生素敏感；具有抗菌活性。即，能耐受胃肠道环境、无抗生素耐性、能抑制肠内有害的病原菌。

本发明从健康宠物兔粪便中分离获得的益生菌中筛选出来具有预防腹泻功能的屎肠球菌。本发明提过对动物的细菌性腹泻，且偏向多种致病菌混合感染导致的腹泻等进行实验研究，结果显示该菌株具有较强的胆盐水解酶活力。该菌株在耐酸耐胆盐方面比其他乳酸菌有明显的优势，适合肠胃环境并具有增殖能力。该菌株无抗生素耐性，具有抗菌活性。本发明中的屎肠球菌可广泛用于开发预防腹泻相关益生功能产品。

附图说明

图1为屎肠球菌ZJUIDS-R1的菌落形态图。

图2为屎肠球菌ZJUIDS-R1革兰氏染色的菌体形态图。

图3为屎肠球菌ZJUIDS-R1的16S rDNA的电泳鉴定图。

图4为屎肠球菌ZJUIDS-R1对抗菌的平板示例。其中1-4分别为：大肠杆菌ATCC25922、鼠伤寒沙门氏菌ATCC 13311、金黄色葡萄球菌CMCC 26003、单核细胞增生李斯特菌CMCC5400。

图5为屎肠球菌ZJUIDS-R1抗生素敏感性的平板示例。其中1-10号分别为：青霉素、氨苄西林、头孢曲松、庆大霉素、四环素、红霉素、环丙沙星、林可霉素、复方新诺明、氯霉素。

图6为屎肠球菌ZJUIDS-R1腹泻粪便形状图。

图7为屎肠球菌ZJUIDS-R1抗腹泻肠道切片图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

实施例1、屎肠球菌ZJUIDS-R1的筛选及鉴定：

1.屎肠球菌ZJUIDS-R1的筛选

1.1样品来源

本发明所使用的菌株均从科研用兔、花鸟市场、健康宠物兔中采集到的宠物兔粪便样品中分离获得。粪便样品共采集53份，其中所有采样对象在被采样前的至少一个月时间内未出现腹泻等胃肠道疾病。

1.2菌株的分离纯化

每份样本取2颗新鲜粪便，用无菌EP管收集，立即送至实验室进行菌株分离。取1颗粪便放入1mL的无菌生理盐水中，涡旋混匀后静置10min，3000r离心5min；然后在超净台中吸取富集液100uL，用无菌生理盐水进行十倍梯度稀释，选取10^-6、10^-7、10^-8三个稀释梯度，每个梯度取菌液100μL涂于MRS琼脂培养基上，于37℃培养48h。培养结束后，从琼脂培养基中选择生长有50～150个单菌落的平板，挑取典型菌落，在MRS琼脂平板上多次划线纯化，直至整个平板上的菌落形态一致，挑取单菌落到MRS液体培养基增菌培养。其中共得到97株乳酸菌，得到的菌株均在含40％甘油的MRS液体培养基中于-80℃冷冻保存。

将分离得到的97株乳酸菌进行抗菌活性鉴定，其中95株被淘汰，剩余的5株抗菌活性结果结合耐酸、耐胆盐试验结果筛选出预防腹泻最佳菌株，命名为ZJUIDS-R1。

2.屎肠球菌ZJUIDS-R1的鉴定

2.1菌落特征

屎肠球菌ZJUIDS-R1在MRS琼脂培养基培养48h后，直径在0.5～1.0mm之间，菌落圆形，边缘整齐，白色，表面光滑，见图1。

2.2显微镜下形态：

屎肠球菌ZJUIDS-R1菌落涂片：革兰氏染色呈阳性，不产芽孢，无鞭毛，球菌，单个、成对或成簇排列，见图2。

2.3 16S rDNA鉴定

用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取目标菌株基因组DNA，将提取的乳酸菌基因组DNA作为PCR扩增的模板，采用细菌通用引物27F和1492R进行16S rDNA的PCR实验，PCR反应扩增结束后，取PCR产物进行琼脂糖凝胶检测拍照，扩增片段长度为1.5kb左右，见图3。将PCR产物送至生工生物工程(上海)有限公司进行测序，结果如SEQ ID NO：1所示，在NCBI网站上进行BLAST序列比对，结果显示该序列与屎肠球菌的16S rDNA序列同源性超过99％。

根据菌株ZJUIDS-R1的序列比对结果，确定筛选的乳酸菌ZJUIDS-R1为屎肠球菌(Enterococcus Faecium)。

实施例2屎肠球菌ZJUIDS-R1预防腹泻能力的确认

1.菌株发酵液的制备

将于甘油管中保存的菌株先在MRS琼脂平板上划线活化2～3次，然后挑取单菌落在MRS液体培养基中扩大培养，37℃静置培养18h，菌液的浓度达到10⁸CFU/mL左右，取出后4℃离心机8000rmp，离心15min，收集上清液。

2.体外抗菌能力的测定

2.1指示菌株培养

将四种指示菌株(大肠杆菌ATCC 25922、鼠伤寒沙门氏菌ATCC 13311、金黄色葡萄球菌CMCC 26003、单核细胞增生李斯特菌CMCC5400)从-80℃冰箱取出，放于室温溶解，分别挑取少量甘油管菌液于LB培养基上活化，24h后挑取LB培养基上的指示菌株单菌落再划线传代3次。将最后一次活化的单菌落接种于LB液体培养基中，37℃静置培养24小时后取出，4℃离心机8000rmp，离心15min，弃去上清液保存下层菌体沉淀并重悬，使活菌数达到10⁸CFU/mL。

2.2琼脂扩散法

采用国际通用琼脂扩散法测量乳酸菌代谢产物的抑菌活性。

使用光口锥形瓶配置LB固体培养基，待培养基灭菌后置于55℃水浴保温，等温度降下来后放于超净台中，将指示菌菌液按照1％的量接入锥形瓶中，摇晃至混合菌液，将指示菌悬液与LB固体培养基混合好后倒入已经放置牛津杯的平皿中制成15mL/皿的LB平板。待LB平板凝固后，用无菌镊子轻轻拔掉牛津杯。每孔定量加入200μL，以恩诺沙星溶液为阳性对照，接入乳酸菌悬液和发酵上清液，将接好液体的平板放于37℃，培养24h。培养结束后，用游标卡尺测量抑菌圈直径并记录。

表1.ZJUIDS-R1对病原菌抑制能力的结果

表1的结果显示，ZJUIDS-R1对常见的致病菌都有较好的抗菌效果，其中对大肠杆菌O157和单核细胞增生李斯特菌的抗菌效果最好，其次是鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌。

实施例3屎肠球菌ZJUIDS-R1的耐酸性及耐胆盐性的确认

1.耐酸实验

挑取屎肠球菌ZJUIDS-R1单菌落在MRS液体培养基中扩大培养18h，将扩大后菌悬液以1％的量接种到MRS液体培养基，37℃培养18h后。将培养液于4℃经8000r/min离心5min收集菌体，用磷酸盐缓冲液(pH 6.8)洗涤2次后。菌体悬浮于pH 1.5的MRS液体培养基中，将初始活菌数校正至大约10⁸CFU/mL，37℃培养3h。采用倾注平板法对0h和3h样品中的活菌进行计数，倾注后的平板于37℃培养48h，测定其存活率，存活率计算公式如下：

上式中，N₀为测试菌株0h的活菌数(CFU/mL)；N_t为测试菌株3h的活菌数(CFU/mL)。

2.耐胆盐实验

将活化扩大后的屎肠球菌ZJUIDS-R1菌悬液以1％的量接种到MRS液体培养基中，于37℃培养18h后，漩涡混匀，将初始活菌数校正至大约10⁹CFU/mL。以10％的量接种到含0.3％(m/v)牛胆盐的MRS液体培养基(对照为不含牛胆盐的MRS液体培养基)，于37℃培养3h。然后采用倾注平板法对样品中的活菌数进行计数。倾注后的平板于37℃培养48h。菌株的胆盐耐受能力以3h时每毫升含胆盐培养基中活菌数与不含胆盐培养基中活菌数的差值的对数来表示(log CFU/mL)。

3.如表2所示，屎肠球菌ZJUIDS-R1在pH为1.5的MRS培养基中的存活率为29.41％。在含有0.3％的牛胆盐的环境中存活率为10.03％，说明其具有较好的胆盐耐受性。实验证明，屎肠球菌ZJUIDS-R1具备较高的胃肠道生存能力。

表2.ZJUIDS-R1对酸和胆盐耐受性结果

菌株	酸耐受率(％)	胆盐耐受率(％)
			ZJUIDS-R1	29.41	10.03

4.益生菌必须能够耐受胃肠道中胃酸和胆汁等一系列不良环境而活着才能发挥其益生作用。本发明提供的屎肠球菌ZJUIDS-R1在pH 1.5的条件下能够生长增殖，其能顺利通过胃中的酸性环境到达小肠。同时，屎肠球菌ZJUIDS-R1能耐受胆盐，在肠道内存活，进而能有效地预防腹泻的作用。

实施例4屎肠球菌ZJUIDS-R1的抗生素感受性的确认

将培养18h的浓度约为10⁷CFU/mL屎肠球菌ZJUIDS-R1菌悬液按1％的量加入冷却至45℃左右的灭过菌的MRS琼脂培养基中，充分混合，定量加入15mL/皿。待凝固后，用镊子取药敏纸片放于培养基上。将培养皿正面朝上放于37℃培养箱中培养24h。以无抗生素的纸片为空白对照。测量抑菌圈直径。每个重复三次。

屎肠球菌ZJUIDS-R1对抗生素感受性抑菌圈直径如表3所示。参考CLSI(2017)药敏试验标准可得，屎肠球菌ZJUIDS-R1对青霉素、氨苄青霉素、四环素复方新诺明均表现出极高的敏感性，对红霉素和环丙沙星表现出敏感性。实验结果表明，屎肠球菌ZJUIDS-R1对常见的抗生素敏感。

表3屎肠球菌ZJUIDS-R1对抗生素敏感性结果

注：S，敏感；I，中介；R，耐药

随着抗生素在临床治疗的广泛应用，乳酸菌的耐药性也越来越严重，长期摄入耐药性的乳酸菌会给临床治疗带来很大的困难。本发明所提供的屎肠球菌ZJUIDS-R1对常见的抗生素敏感，不会对人体健康造成危害。

实施例5.屎肠球菌ZJUIDS-R1对宠物兔腹泻的预防作用

1、试验动物和试验设计

试验动物选取24只体重接近、健康程度一致的30日龄新西兰大白兔，随机分为3组，每组雌雄各半，分别记为N(空白对照)组、A(抗生素饲喂)组、T(屎肠球菌ZJUIDS-R1饲喂)组。试验周期28天，前三周，N组、A组和T组分别饲喂无菌生理盐水、抗生素(恩诺沙星)、屎肠球菌ZJUIDS-R1，最后一周饲喂常见肠道致病菌(大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌和金黄色葡萄球菌)，初步探索两株乳酸菌对细菌性腹泻的预防作用。

2、基础日粮与饲养管理

本实验断奶幼兔采用笼养方式，每天早上8点和晚上6点进行饲喂，根据幼兔日龄调整饲喂量，每晚将未吃完的饲料进行称量，计算采食量，自由饮水，每天打扫兔舍的卫生，保证幼兔良好的生活环境。其中A组为基础日粮+生理盐水；B组为基础日粮+拜有利(3mg/Kg/d)；T组为基础日粮+屎肠球菌ZJUIDS-R1(1mL/kg/d，1×10⁸cfu/mL)。其他按照兔场的日常管理进行。

基础日粮的原料有：玉米、麸皮、豆粕、苜蓿草粉、碳酸钙、氯化钠、鱼粉、复合维生素、复合微量元素等。基础日粮营养成分见表4。

表4基础日粮营养成分表

注：表中营养成分均为实测值。

3、测定指标

在试验周期内按时记录兔的采食量、体重，试验结束时，每只断奶幼兔进行耳源静脉采血，取1mL放入肝素钠采血管，取1.5mL放于无菌空白EP管。随后，对断奶幼兔进行剖检取样，取内脏器官肝脏、脾脏和肾脏；每段肠管取样三份；取样前，快速测量兔蚓突长度。试验结束后从兔生长性能、血液生化、血液炎症、血液抗体浓度等指标分析饲喂抗生素和屎肠球菌ZJUIDS-R1对断奶幼兔的影响。

(1)腹泻发生率

试验后期，断奶幼兔饲喂肠道致病菌后，观察并记录断奶幼兔腹泻发生情况，拍照记录腹泻幼兔粪便形态，计算各组断奶幼兔腹泻发生率。

由表5可以看出，N组的腹泻率在所有分组中最高，且明显高于A组、T组的腹泻率，而A组、T组腹泻率基本无差异。即给断奶幼兔饲喂抗生素和ZJUIDS-R1均能降低幼兔的腹泻率。

表5益生菌对断奶幼兔腹泻率的影响

	腹泻发生率(100％)
		N组	37.5
A组	12.5*
		T1组	12.5*

*代表差异显著；

(2)生长性能

通过计算每组断奶幼兔的采食量、日增重和饲料转化率初步评估益生菌对断奶幼兔生长性能的影响。

从表6结果可以看出，N组日采食量与A组存在明显差异，N组日采食量最高，其次是T组、A组；在3个分组中，N组平均日增重最多，其次是T组和A组，但3组之前无显著性差异；计算饲料转化率后发现，A组饲料转化率最高，其次是N组、T组。即在试验期间，N组日采食量最高，同样日增重也最高，但A组料重比最低，益生菌对断奶幼兔生长性能无显著性影响。对饲料的转化率略有提高。

表6益生菌对断奶幼兔生长性能的影响

测定指标	日采食量(g)	日增重(g)	饲料转化率
				N组	139±10.6<sup>a</sup>	36.1±3.3<sup>a</sup>	3.86±0.26<sup>a</sup>
A组	114.3±6.9<sup>b</sup>	31.9±5.6<sup>a</sup>	3.7±0.74<sup>a</sup>
				T组	128.8±7.4<sup>ab</sup>	32.9±1.3<sup>a</sup>	3.91±0.12<sup>a</sup>

(3)血液生化指标

试验结束时，每只断奶幼兔进行耳源静脉采血，取1mL放入肝素钠采血管，1.5mL放于无菌空白EP管。肝素钠采血管内的血进行8000g离心2min制备血浆，使用爱德士全自动生化仪测定血浆葡萄糖(GLU)、血液肌酐(CREA)、血液尿素氮(BUN)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLOB)、白球比(ALB/GLOB)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALKP)等生化指标。

由表7可知，不同处理下N组、A组、T组这3组GLU、BUN、TP、ALB、GLOB、ALT、ALKP等生化指标均无显著性差异(P＞0.05)。但与N组对比分析发现，N、A两组血液内的GLU、BUN、TP、ALB降低，CREA增高。

表7益生菌对断奶幼兔血液生化的影响的影响

检测项目	单位	N组	A组	T组
					葡萄糖GLU	mg/dL	108.20±28.03	95.67±26.90	76.00±44.92
肌酐CREA	mg/dL	0.94±0.09<sup>b</sup>	1.23±0.29<sup>a</sup>	1.08±0.23<sup>ab</sup>
					尿素氮BUN	mg/dL	22.4±7.16	20.00±10.14	20.33±11.74
尿素氮/肌酐BUN/CREA		17.80±4.44<sup>a</sup>	10.35±4.89<sup>b</sup>	13.67±3.27<sup>ab</sup>
					总蛋白TP	g/dL	34.94±37.51	26.28±30.39	28.42±32.99
白蛋白ALB	g/dL	18.62±19.63	14.78±17.22	15.75±18.95
					球蛋白GLOB	g/dL	16.48±18.55	11.65±13.46	12.65±14.34
白球比ALB/GLOB		1.28±0.22<sup>a</sup>	1.25±0.08<sup>a</sup>	1.15±0.23<sup>ab</sup>
					谷丙转氨酶ALT	U/L	61.4±30.53	68.67±15.59	58.67±17.06
碱性磷酸酶ALKP	U/L	119.80±45.32	119.17±29.53	101.17±29.43

(4)血液炎症指标

试验结束时，每只断奶幼兔进行耳源静脉采血，取1.5mL放于无菌空白EP管内，空白管里的血液，3000r离心10min，分离出上层的血清，通过酶联免疫吸附实验(ELISA)检测血清里的C反应蛋白(CRP)指标。

由表8可知，T组CRP显著低于N、A两组(P＜0.05)，A组CRP相对N组出现下降，但两组差异不显著(P＞0.05)。总体而言，A组、T组都呈下降趋势，即断奶幼兔饲喂抗生素与ZJUIDS-R1均能降低幼兔全身炎症指标，且ZJUIDS-R1降低全身炎症的效果明显好于抗生素。

表8益生菌对断奶幼兔血清C反应蛋白的影响

	CRP(mg/L)
		N组	8.51±0.73<sup>a</sup>
A组	8.15±0.73<sup>a</sup>
		T组	5.02±0.56<sup>b</sup>

(5)血液抗体指标

使用上述分离得到的血清，通过酶联免疫吸附实验(ELISA)检测血清抗体浓度(IgG、IgM、IgA)。由表9可知，就IgA抗体浓度而言，A组显著高于N、T两组(P＜0.05)，N组与T组之间抗体浓度无显著性差异(P＞0.05)。通过对比IgG抗体浓度、IgM抗体浓度可以发现，T组抗体浓度显著高于A组、N组，且A组IgG抗体浓度显著高于N组，而N组IgM抗体浓度显著高于A组。即断奶幼兔补充ZJUIDS-R1能显著提高血液内IgG和IgM抗体水平。

表9益生菌对断奶幼兔血清抗体浓度的影响

(6)益生菌对断奶幼兔盲肠菌群的影响

由表10可知，各分组的coverage指数都等于0.99，表明各组之间样本中序列被测出的概率一样高，同样表明本次测序结果可以代表样本中微生物的真实情况。

通过对比不同分组间的四个指数发现，T组chaos指数最高，A组Shannon指数最高，T组Simpson指数最低。A组和T组的OTU、chaos和Shannon指数均高于N组，表明即断奶幼兔补充ZJUIDS-R1能提高盲肠内的菌群多样性。

表10益生菌对断奶幼兔肠道菌群α多样性的影响

分组	OTU	chaos	Shannon	Simpson	coverage
						N组	1170<sup>a</sup>	1642<sup>a</sup>	5.21<sup>a</sup>	0.0169<sup>a</sup>	0.99<sup>a</sup>
A组	1235<sup>a</sup>	1715<sup>a</sup>	5.31<sup>a</sup>	0.0143<sup>a</sup>	0.99<sup>a</sup>
						T组	1202<sup>a</sup>	1898<sup>a</sup>	5.27<sup>a</sup>	0.0141<sup>a</sup>	0.99<sup>a</sup>

断奶幼兔盲肠内菌群在门水平的变化如表11所示。在所有分组中厚壁菌门(Firmicutes)丰度最高，其次是拟杆菌门(Bacteroidetes)、放线菌门(Actinobacteria)和变形菌门(Proteobacteria)。饲喂益生菌后，T组中的厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、软壁菌门(Tenericutes)等具有提升，表明饲喂益生菌后肠道菌群有所改善。

表11断奶幼兔盲肠菌群在门水平的变化

	N组	A组	T组
				Firmicutes	40811	36755	40929
Bacteroidetes	7003	7918	8228
				Actinobacteria	902	1767	1339
Saccharibacteria	55	140	145
				Tenericutes	125	45	155
Cyanobacteria	38	89	90

(7)十二指肠组织切片

不同组的组织切片见图7，图中可以看下益生菌组在组织切片的效果接近与抗生素组，显著优于空白组，表明益生菌处理可以缓解对组织的损伤。

绒毛高度(VH)越高，与肠道内容物的接触面积越大；隐窝深度(CD)越浅表明细胞的成熟度越好，分泌功能和吸收功能也越好；绒毛高度与隐窝深度比值(V/C值)与动物的生长速度呈正相关。由表12可以看出，与N组相比，益生菌组均显著提高了断奶幼兔十二指肠VH和V/C，降低了CD(P＜0.05)，其作用程度与抗生素组无显著性差异。表明，益生菌对断奶幼兔十二指肠发育存在有益作用。

表12益生菌对断奶幼兔十二指肠的影响

	VH(mm)	CD(mm)	V/C
				N组	950.44±75.12<sup>b</sup>	290.34±19.32<sup>a</sup>	3.27±0.05<sup>b</sup>
A组	1381.20±209.60<sup>a</sup>	252.95±22.08<sup>b</sup>	5.44±0.44<sup>a</sup>
				T组	1182.89±94.30<sup>a</sup>	233.74±19.47<sup>b</sup>	5.07±0.38<sup>a</sup>

实施例6利用屎肠球菌ZJUIDS-R1制备预防宠物腹泻菌粉

1.屎肠球菌ZJUIDS-R1菌泥的制备

挑取屎肠球菌ZJUIDS-R1单菌落接种于50mL MRS液体培养基中，放置37℃培养箱中培养18h。再次按5％的接种量于250mL MRS液体培养基中活化，放置37℃培养箱中培养24h。最后将活化好的屎肠球菌ZJUIDS-R1以5％接种量于10L发酵罐中进行高密度厌氧培养，于37℃、pH 6.8的条件下培养18h。之后在8000r/min、4℃条件下离心15min，弃去上清液，收集菌体沉淀，用无菌磷酸盐缓冲液(pH 7.0)漂洗菌体2次。即可得到屎肠球菌ZJUIDS-R1菌泥。

2.保护剂的制备

冻干保护剂含有15％的脱脂乳粉，5％的海藻糖，3％的谷氨酸钠，1％的甘油，0.5％的半胱氨酸盐酸盐。水作为溶剂。于110℃灭菌备用。

3.屎肠球菌ZJUIDS-R1菌粉的制备

将上述制备的屎肠球菌ZJUIDS-R1菌体沉淀按1:5的比例与保护剂溶液充分混匀。于-40℃条件下预冻5h，使其均匀冻结在容器内壁上，然后进行真空冷冻干燥，干燥18～20h后，即可得到屎肠球菌ZJUIDS-R1菌粉。用生理盐水复水后，洗涤两次，测得屎肠球菌ZJUIDS-R1菌粉中活菌数为1.0×10¹⁰～5×10¹⁰CFU/g。该抗腹泻菌粉可用于兔子、犬猫、仓鼠和豚鼠、龙猫等宠物。

实施例7利用屎肠球菌ZJUIDS-R1制备预防宠物腹泻草粉

屎肠球菌ZJUIDS-R1预防兔腹泻提摩西草粉的步骤如下：

(1)原料准备：提摩西草收割后，保证清洁，无腐败变质，将其切断至1～2cm，再打磨成粉；

(2)将实施例6所制备的屎肠球菌ZJUIDS-R1菌粉按0.02‰接种量接种到原料中，混合均匀；

(3)储藏条件：避光保存，温度为15～25℃，时间为2年。

实施例8利用屎肠球菌ZJUIDS-R1制备预防宠物腹泻滴剂

预防兔腹泻滴剂，由以下质量比的原料制备而成：低聚半乳糖1％、油酸1％、植物油10％、卵磷脂1％、维生素2％、ZJUIDS-R1菌粉、纯净水35％、丙三醇50％。

将实施例6所制备的屎肠球菌ZJUIDS-R1菌粉按1％的比例添加进去，混合后活菌数达到1.0×10⁸CFU/ml以上。

产品密封、避光低温保存，保质期为1年。

实施例9利用屎肠球菌ZJUIDS-R1制备防腹泻宠物奶粉

断奶幼兔专用防腹泻奶粉，包括以下百分比的原料：羊奶粉65-70％、混合植物油25％，ZJUIDS-R1有效菌保证值10⁷CFU/g，矿物质2％，预混剂(维生素、微量元素等)2％、葡萄糖和麦芽糊精3％。上述防腹泻奶粉可增强机体免疫力，从根源上解决断奶幼兔肠道功能不适、肠道致病菌感染等引起的腹泻问题。

实施例10利用屎肠球菌ZJUIDS-R1制备犬猫胃肠道处方膏

主要包括以下百分比的原料：麦芽糖15％、茯苓10％、陈皮15％、山楂5％、白术(炒)5％、鸡内金5％、预混剂(维生素和微量元素等)5％、纯净水35％，ZJUIDS-R1有效菌保证值10⁸CFU/mL，制备成牙膏状。本产品可以促进肠道免疫，增加机体抵抗力，适用于犬猫疫苗或驱虫不完善、消化不良、食欲不振等。使用方法：体重小于5kg：每天两次，每次3mL；体重5-15kg：每天两次，每次4mL；体重大于15kg：每天两次，每次5mL。本产品可直接饲喂，可拌在粮食内混合饲喂，也可涂抹在爱宠鼻子上让其舔食。

实施例11利用屎肠球菌ZJUIDS-R1制备犬猫粮罐头

主要配方如下：鱼60-80％，卡拉胶0.5-1.2％，D-异抗坏血酸钠0.05-0.3％，水15-30％，ZJUIDS-R1菌粉(1.0×10¹⁰CFU/g)。

猫食罐头食品的制法：具体步骤包括对鱼糜、卡拉胶、水及D-异抗坏血酸钠进行混合搅拌均匀，之后进行真空脱汽，采用70-90摄氏度杀菌，杀菌后的产品和菌粉进行混合吸附，最后装罐使用。产品中的ZJUIDS-R1有效菌保证值10⁷CFU/g。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 一株兔源性预防宠物腹泻屎肠球菌ZJUIDS-R1及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1434

<212> DNA

<213> 屎肠球菌(Enterococcus Faecium)

<400> 1

ctcaggacga acgctggcgg cgtgcctaat acatgcaagt cgtacgcttc tttttccacc 60

ggagcttgct ccaccggaaa aagaggagtg gcgaacgggt gagtaacacg tgggtaacct 120

gcccatcaga aggggataac acttggaaac aggtgctaat accgtataac aatcgaaacc 180

gcatggtttt gatttgaaag gcgctttcgg gtgtcgctga tggatggacc cgcggtgcat 240

tagctagttg gtgaggtaac ggctcaccaa ggccacgatg catagccgac ctgagagggt 300

gatcggccac attgggactg agacacggcc caaactccta cgggaggcag cagtagggaa 360

tcttcggcaa tggacgaaag tctgaccgag caacgccgcg tgagtgaaga aggttttcgg 420

atcgtaaaac tctgttgtta gagaagaaca aggatgagag taactgttca tcccttgacg 480

gtatctaacc agaaagccac ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat acgtaggtgg 540

caagcgttgt ccggatttat tgggcgtaaa gcgagcgcag gcggtttctt aagtctgatg 600

tgaaagcccc cggctcaacc ggggagggtc attggaaact gggagacttg agtgcagaag 660

aggagagtgg aattccatgt gtagcggtga aatgcgtaga tatatggagg aacaccagtg 720

gcgaaggcgg ctctctggtc tgtaactgac gctgaggctc gaaagcgtgg ggagcaaaca 780

ggattagata ccctggtagt ccacgccgta aacgatgagt gctaagtgtt ggagggtttc 840

cgcccttcag tgctgcagct aacgcattaa gcactccgcc tggggagtac gaccgcaagg 900

ttgaaactca aaggaattga cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg 960

aagcaacgcg aagaacctta ccaggtcttg acatcctttg accactctag agatagagct 1020

tccccttcgg gggcaaagtg acaggtggtg catggttgtc gtcagctcgt gtcgtgagat 1080

gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc cttattgtta gttgccatca ttcagttggg 1140

cactctagca agactgccgg tgacaaaccg gaggaaggtg gggatgacgt caaatcatca 1200

tgccccttat gacctgggct acacacgtgc tacaatggga agtacaacga gttgcgaagt 1260

cgcgaggcta agctaatctc ttaaagcttc tctcagttcg gattgcaggc tgcaactcgc 1320

ctgcatgaag ccggaatcgc tagtaatcgc ggatcagcac gccgcggtga atacgttccc 1380

gggccttgta cacaccgccc gtcacaccac gagagtttgt aacacccgaa gtcg 1434

Claims (8)

1.一种兔源性预防宠物腹泻屎肠球菌ZJUIDS-R1，其特征在于，所述屎肠球菌（Enterococcus Faecium）ZJUIDS-R1的保藏号为：CGMCC NO. 24376。

2.权利要求1所述的屎肠球菌ZJUIDS-R1在制备预防兔源性宠物兔腹泻产品中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在，所述产品为具有抗腹泻功能的药品、保健品、宠物食品或宠物饲料。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述药品包括具有抗腹泻功能的活菌制剂或处方膏药，该活菌制剂中屎肠球菌ZJUIDS-R1的活菌数为1.0×10¹⁰~5.0×10¹⁰CFU/g，处方膏药中活菌数为10⁸CFU / g，其中活菌制剂为活菌菌粉或菌液制剂。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述保健品是具有预防腹泻功能滴剂，其中ZJUIDS-R1有效菌保证值1*10⁹ CFU/ml。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述宠物食品是具有预防腹泻功能的宠物奶粉、宠物罐头，其中ZJUIDS-R1有效菌保证值1*10⁹ CFU/g。

7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的宠物饲料由屎肠球菌ZJUIDS-R1单独或与其他菌株混合发酵制备。

8.根据权利要求3或7所述的应用，其特征在于，所述的宠物饲料为具有预防腹泻功能的草粉混合物。

Images