CN102373162A - 唾液乳酸杆菌(Lactobacillus salivarius)M6及含有该唾液乳酸杆菌M6的抑菌组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种唾液乳酸杆菌(Lactobacillus salivarius)M6，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为CGMCC 3505。本发明也提供一种可与动物饲料拌合或加入水中，同时可与抗生素合并使用，具有抗生素耐受性的乳酸菌，该菌株可以抑制沙门氏菌(Salmonella enterica)及大肠杆菌(Escherichia coli)等病原菌的生长。本发明的唾液乳酸杆菌M6菌的抑菌组合物，可使用于动物的饮用水、饮用水添加物、饲料、食品添加物、人类及动物的医疗组合物及人类的饮品、饮品添加物、食品、食品添加物等。通过本发明的实施，可有效预防及治疗动物或人类病原菌感染，并可增加或维持肠道益生菌数量，进而抑制病原菌生长，降低抗生素使用量，达到预防动物与人类疾病感染的目的。

Description

唾液乳酸杆菌(Lactobacillus salivarius)M6及含有该唾液乳酸杆菌M6的抑菌组合物

技术领域

本发明涉及一种含有唾液乳酸杆菌M6菌株的抑菌组合物，该组合物具有可以抑制大肠杆菌(Escherichia coli)及沙门氏菌(Salmonella enterica)等病原菌生长的作用。 

背景技术

益生菌(Probiotics)泛指应用于人体或生物体上能改善内生性微生物相的平衡，并有益于宿主的活菌。常见的益生菌种类有乳酸杆菌属(Lactobacillus)、双叉杆菌属(Bifidobacterium)及链球菌属(Streptococcus)，又以乳酸菌为近年来最常应用的菌株。乳酸菌是指能够代谢碳水化合物并产生50％以上乳酸的细菌总称，其对肠道健康有正面帮助，临床上也有以Bifidobacterium spp.及Lactobacillus spp.作为治疗及预防腹泻、婴幼儿过敏症、溃疡性结肠炎等相关研究，其中，已有相关研究以动物实验证明唾液乳酸杆菌可抑制与消灭幽门螺旋杆菌。正常的体内环境并不是无菌的，当体内的坏菌量少时，并不会产生不良影响，而且只要益生菌占优势，坏菌就不会大量滋生。 

近代人类以集约养殖的方式来获得稳定的动物性蛋白质供应，同时为避免牲口在高密度环境中，疾病容易彼此传染而造成重大的损失，因此习惯上在饲料中添加各种抗生物质如青霉素(penicillins)、氯四环霉素(chlorotetracyclines)、四环霉素(tetra-cyclines)等抗生素或磺胺二甲嘧啶(sulfamethazine)、磺胺噻唑(sulfathiazole)等合成抗菌剂来提升动物的抵抗力，以减少因传染病所造成的经济损失。但是利用抗生素治疗不仅可以破坏致病性细菌繁殖，同时也会破坏益生菌的生长环境，因此也会造成动物体吸收消化系统的破坏，此外长期使用含抗 生素饲料虽可抑制致病菌的生长，却也因生长周期缩短，使营养物质无法沉淀，畜禽产品风味与质量下降。 

益生菌能与饲料中的矿物质结合，增加钙、磷的吸收，改善骨骼成长，改善肉的质量。通过益生菌活化巨噬细胞，进而强化体内非特异性的先天免疫力，预防或治疗腹泻、下痢等疾病。而对于微生物体系尚未建构完整的幼年生物体，补充乳酸菌的作用尤其显著。 

长期食用残留抗生素的肉品，会产生愈来愈多的抗药性病菌，当人体生病需要抗生素治疗时，很多抗生素对病菌已经束手无策。另一方面，在动物体内施用抗生素，除了杀死肠道中的致病菌，同时也杀死了益生菌，大幅削弱肠道功能，容易导致腹泻、脱水等现象，不利于健康。 

禁用抗生素已经是世界潮流，但对亚热带、热带国家，尤其是经济状况不佳的开发中国家而言，全面禁用抗生素有其困难度。基于现实状况的考虑，若将乳酸菌与抗生素合并使用，减少抗生素使用量，仍可以促进动物生长，也可以减少抗药性菌株的问题。 

本发明发明人鉴于传统上无法将抗生素与益生菌合并使用所衍生的各项缺点，乃亟思加以改良创新，并经多年苦心孤诣潜心研究后，终于成功研发完成本发明唾液乳酸杆菌M6可与抗生素搭配使用的抑菌饲料组合物。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种含有唾液乳酸杆菌M6菌株的抑菌组合物，该组合物具有可抑制大肠杆菌(Escherichia coli)及沙门氏菌(Salmonella enterica)等病原菌生长的效果。 

本发明的另一目的在于提供一种含有唾液乳酸杆菌M6菌株的抑菌组合物的应用，可与抗生素结合使用，降低抗生素使用剂量，同时具有抑制致病菌生长，提升肠道益生菌数量。 

本发明的另一目的在于提供一种含有唾液乳酸杆菌M6菌株的抑 菌组合物的应用，该抑菌组合物可作为动物的饮用水、饲料的添加物，以增进动物抵抗病原菌的能力；该抑菌组合物更可进一步作为人类食品、饮品、食品或饮品添加物，以增进人体抵抗病原菌的能力。 

为了实现本发明目的，本发明的唾液乳酸杆菌M6已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为CGMCC 3505，保藏日期为2009年12月10日。 

本发明的唾液乳酸杆菌M6菌株筛选自动物肠道，菌株最佳培养温度为37℃。 

将本发明所筛选到的唾液乳酸杆菌M6菌株，分别进行滤纸片琼脂扩散法(disc agar diffusion)分析、病原菌混合培养试验分析。分析结果显示，本发明M6菌株可以抑制大肠杆菌(E.coli)及沙门氏菌(S.enterica)等病原菌的生长，甚至有杀菌效果。 

将本发明的唾液乳酸杆菌M6菌株配制为饲料喂食离乳龄为25日的离乳猪，结果显示本发明M6菌株具促进保育猪生长的效能，并对生长性能有改善的趋势性。 

将本发明的唾液乳酸杆菌M6菌株与其它乳酸菌，如鼠李糖乳酸杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、植物乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)、副干酪乳酸杆菌(Lactobacillus paracasei)、发酵乳酸杆菌(Lactobacillus fermentum)、嗜酸性乳酸杆菌(Lactobacillus acidophilus)作比较，对于三种动物常用抗生素如金霉素(Chlortetracycline)、新霉素(Neomycin)、杆菌肽(Bacitracin)的耐受性进行比较，结果显示唾液乳酸杆菌M6菌株与其它乳酸菌相比，具有明显的抗生素耐受性，因此本唾液乳酸杆菌M6可与抗生素联合使用及降低抗生素使用量。 

本发明含唾液乳酸杆菌M6菌株的抑菌组合物可用于提升肠道益生菌数量。 

含唾液乳酸杆菌M6菌株的抑菌组合物还可用于促进动物生长、 降低饲料换肉率、节省饲养成本。 

本发明含唾液乳酸杆菌M6菌株的抑菌组合物用于抑制下痢。 

含有本发明唾液乳酸杆菌M6菌株的抑菌组合物，除可配制为水溶液做为动物饮用水之外，亦可搭配常用饲料添加物制成技术，以制备成其它形式，包括动物饲料添加物、动物用及人类用医疗组合物、食品添加物、饮料添加物、食品、饮品、健康食品等，经口服方式为动物及人类所摄取。于一较佳实施例中，该抑菌组合物可制成乳酸锭剂、粉末或颗粒状，并可添加于动物饲料或食品中(如：1吨的饲料添加1公斤粉末或颗粒状的唾液乳酸杆菌M6菌株)；或可单独或与其它乳酸菌发酵制成酸奶或优格等乳制品；或可调整与抗生素比例搭配，降低抗生素在饲料使用的百分比。 

本发明的唾液乳酸杆菌M6菌株经乳酸菌协同组合的饲料直接使用或干燥后使用。 

活菌饲料添加物，可以增加动物消化力、降低环境污染、促进动物生长及提高存活率。以微生物混入饲料中使用投予动物至少有五种好处：(1)促进生长。(2)提高饲料效率，微生物可以分解一些宿主的消化系统不能分解的物质。(3)提高乳牛的泌乳量，促进了瘤胃的代谢。(4)增进健康，微生物促进肠道免疫系统产生抗体。(5)降低环境污染，因其微好气生长的特性，以活性肠道正常乳酸菌为主要有效成分的饲料添加物，应可在动物肠道内将铵盐及硫化物等恶臭物质同化为菌体或转化为挥发性较低的化合物型态。 

本发明的唾液乳酸杆菌M6菌株已经保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为CGMCC 3505，保藏日期为2009年12月10日。 

本发明的含有唾液乳酸杆菌M6菌株的抑菌组合物可与抗生素结合使用，降低抗生素使用剂量，同时具有抑制致病菌生长，提升肠道益生菌数量；又可作为动物的饮用水、饲料的添加物，以增进动物抵 抗病原菌的能力；该抑菌组合物更可进一步作为人类食品、饮品、食品或饮品添加物，以增进人体抵抗病原菌之能力。 

附图说明

图1为唾液乳酸杆菌M6菌株对大肠杆菌的抑制作用； 

图2为唾液乳酸杆菌M6菌株对沙门氏菌的抑制作用； 

图3为唾液乳酸杆菌M6菌株菌数10⁸与病原菌混合培养试验； 

图4为唾液乳酸杆菌M6菌株菌数10⁷与病原菌混合培养试验； 

图5为唾液乳酸杆菌M6菌株菌数10⁶与病原菌混合培养试验； 

图6为唾液乳酸杆菌M6菌株菌数10⁵与病原菌混合培养试验； 

图7为唾液乳酸杆菌M6菌株菌数10⁴与病原菌混合培养试验。 

具体实施方式

参阅以下有关本发明较佳实施例的详细说明及附图，可进一步了解本发明的技术内容及其目的功效。 

本发明以下面的实施例予以示范阐明，但本发明不受下述实施例的限制。 

实施例1  唾液乳酸杆菌对大肠杆菌与沙门氏菌的抑制作用 

1.滤纸片琼脂扩散法 

唾液乳酸杆菌M6筛选自动物肠道，培养特征如下：在MRS(Difco，REF288130)琼脂平板上长成直径2-3mm的灰色菌落，最佳培养温度为37℃。 

分别取一白金耳的大肠杆菌(BCRC 11634)与沙门氏菌(BCRC12947)菌落接种于TSA培养基(Soybean-Casein Digest Agar Medium，DifcoTM，REF236950)斜面，经过35-37℃培养17-24小时，使用分光光度计进行浊度测定，调整适当菌体浊度(约600nm的浊度80％，80％T)。分别吸取大肠杆菌与沙门氏菌的菌液0.5mL至温度48℃的TSA培养基中混合均匀后，再定量15mL倒入培养皿中上，放置1小 时待凝固后，取直径8mm无菌滤纸锭沾取唾液乳酸杆菌M6菌株的菌液，轻放至上述培养皿上，于35-37℃下培养17-24小时观察结果，测量抑制圈直径，同时用抗生素链霉素(streptomycin)做正对照组(positive control)。 

如图1所示，本发明唾液乳酸杆菌M6的大肠杆菌抑制圈直径为11mm，抗生素链霉素1μg/mL的大肠杆菌抑制圈直径为11mm，显示唾液乳酸杆菌M6对大肠杆菌具抑制作用，且抑菌效果等同于抗生素。 

如图2所示，本发明唾液乳酸杆菌M6的沙门氏菌抑制圈为11.5mm，而抗生素链霉素10μg/mL的沙门氏菌抑制圈直径为11.2mm，显示唾液乳杆菌M6对沙门氏菌有抑制作用，且抑菌效果等同于抗生素。 

2.唾液乳酸杆菌M6与病原菌混合培养试验 

将唾液乳酸杆菌M6以MRS培养基，于37℃厌氧培养后，稀释使其最终的菌数分别为10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸。在培养唾液乳酸杆菌M6的同时，将大肠杆菌(BCRC 11634)及沙门氏菌(BCRC 12947)培养于TSB培养基中，并以37℃培养16小时后，将10⁸的大肠杆菌与10⁸的沙门氏菌混合并个别添加在有10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸菌数的唾液乳酸杆菌M6中，进行共同培养，于培养0～30小时过程中，每2小时取样测试唾液乳酸杆菌M6、大肠杆菌及沙门氏菌的菌数。 

如图3所示，唾液乳酸杆菌M6菌株10⁸菌数(CFU/mL)分别与大肠杆菌及沙门氏菌混合培养，结果为大肠杆菌在4小时内菌数由10⁸减少至10¹，沙门氏菌在2小时内菌数由10⁸减少至10¹，可见唾液乳酸杆菌M6抑制病原菌的效果强，甚至有杀菌效果。 

如图4所示，唾液乳酸杆菌M6菌株10⁷菌数(CFU/mL)分别与大肠杆菌及沙门氏菌混合培养，大肠杆菌在6小时内菌数由10⁸减少至0，沙门氏菌在5小时内由10⁸减少至0。 

如图5所示，唾液乳酸杆菌M6菌株10⁶菌数(CFU/mL)分别与大肠杆菌及沙门氏菌混合培养，大肠杆菌在18小时内由10⁸减少至0，沙门氏菌在12小时内由10⁸减少至0。 

如图6所示，唾液乳酸杆菌M6菌株10⁵菌数(CFU/mL)分别与大肠杆菌及沙门氏菌混合培养，大肠杆菌在24小时内由10⁸减少至0，沙门氏菌在20小时内由10⁸减少至0。 

如图7所示，唾液乳酸杆菌M6菌株10⁴菌数(CFU/mL)分别与大肠杆菌及沙门氏菌混合培养，大肠杆菌在28小时内由10⁸减少至0，沙门氏菌在24小时内由10⁸减少至0。 

实施例2动物试验 

1.唾液乳酸杆菌M6对保育猪生长性能之影响 

取36头离乳猪(离乳日龄：25日)，依性别随机分配至对照组、抗生素组或唾液乳酸杆菌M6组，每组12头。饲料成分以玉米、黄豆粉为主，对照组饲料中未包含卡巴得及唾液乳酸杆菌M6，抗生素组饲料添加卡巴得(carbadox)，唾液乳酸杆菌M6组则在饲料中添加唾液乳酸杆菌M6。试验期间采用任食方式及自由饮水，试验进行28天以比较仔猪生长性能、细菌数与下痢比较。各猪只于试验开始及结束时秤重，并纪录每组的采食量，以计算日增重和饲料换肉率。试验结束后各组采12头的粪便，并分析大肠杆菌群与唾液乳酸杆菌M6的菌数。试验以组为单位，数据利用统计分析系统程序包分析，使用一般线性模式程序(general linear model procedure，GLM)进行变方分析，比较其差异性，并以邓肯氏新多变域法(Duncan’s new multiplerange test)比较各组间平均值差异的显著性。 

请参考表1，保育猪开始的体重相近，但保育期结束时，喂饲唾液乳酸杆菌M6组的保育猪的体重高于对照组和抗生素组，但统计上无显著差异(p＞0.05)。三组在每日平均增重(average daily gain，ADG)上无统计性差异(p＞0.05)，但唾液乳酸杆菌M6组高于对照组和抗生 素组，显示唾液乳酸杆菌M6具促进保育猪生长的趋势。唾液乳酸杆菌M6组和抗生素组采食量高于对照组，但饲料换肉率则是唾液乳酸杆菌M6组低于对照组和抗生素组，表示唾液乳酸杆菌M6可以有效降低饲养成本。 

表1饲料对保育猪生长性能的影响 

请参考表2，保育期结束时，三组粪便细菌分析在大肠杆菌群无显著差异，但唾液乳酸杆菌M6组的乳酸杆菌数显著(p＜0.05)高于对照组和抗生素组，故肠道健康指标(乳酸杆菌和大肠杆菌群比例)以唾液乳酸杆菌M6组最好，显示唾液乳酸杆菌M6可显著促进保育猪的肠道健康。此试验显示唾液乳酸杆菌M6对保育猪生长性能有改善的趋势性，且具有取代抗生素对畜产动物喂饲的潜力。 

表2饲料对保育猪肠道健康的影响 

实施例3唾液乳酸杆菌M6与其它乳酸菌对于常用动物抗生素的耐受性比较 

以抗生素敏感性试验分析比较唾液乳酸杆菌M6与其它乳酸菌对于抗生素的耐受性，若抑制圈愈小表示此乳酸菌对抗生素的耐受性愈好。将唾液乳酸杆菌M6及其它乳酸菌分别以MRS培养基于37℃厌氧培养后，个别取100μL均匀涂抹于MRS琼脂上。静置20-30分钟后，放置6mm无菌滤纸片，添加三种常用于动物饲料的抗生素5μL，置于35～37℃厌氧培养16～24小时后，分别测量其抑制圈之大小(mm)，测量结果如表3。当金霉素浓度为10μg/Disc或30μg/Disc，抑制圈大小皆以唾液乳酸杆菌M6最小；杆菌肽浓度为10U/Disc，唾液乳酸杆菌完全没有抑制圈，而其它乳酸菌的抑制圈为14～33mm；新霉素浓度为5μg/Disc、10μg/Disc及30μg/Disc，抑制圈大小皆以唾液乳酸杆菌M6最小，实验结果证明唾液乳酸杆菌M6与其它乳酸菌相较之下，具有明显的抗生素耐受性。 

表3、唾液乳酸杆菌M6与其它乳酸菌 

对于三种动物常用抗生素的耐受性比较 

注1：″-″表示乳酸菌对此抗生素具有强耐受性。 

注2：抑制圈愈小表示此乳酸菌对抗生素之耐受性愈好 

上列详细说明针对本发明之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明技艺精神所为的等 效实施或变更，例如：含有唾液乳酸杆菌M6菌株的抑菌组合物的应用，以及制作含有唾液乳酸杆菌M6的抑菌组合物形式的变化的等效性实施例，均应包含于本案的专利范围中。 

综上所述，本案所提供的含唾液乳酸杆菌M6抑菌组合物，不但在施用方式上便利多元化，且该菌即使在与抗生素合并使用下，对病原菌仍具有有效抑制与预防的功效上确属创新，并能较常用技术增进上述多项功效。 

Claims (10)

1.一种唾液乳酸杆菌(Lactobacillus salivarius)M6菌株，其特征在于，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为CGMCC3505。

2.根据权利要求1所述的唾液乳酸杆菌M6菌株，其特征在于，所述菌株用于抑制细菌的生长，该细菌包括但不限于大肠杆菌(Escherichia coli)及沙门氏菌(Salmonella enterica)。

3.根据权利要求1所述的唾液乳酸杆菌M6菌株，其特征在于，所述菌株具有抗生素耐受性。

4.一种含唾液乳酸杆菌M6菌株的抑菌组合物，其特征在于，所述组合物用于提升肠道益生菌数量。

5.根据权利要求4所述的抑菌组合物，其特征在于，所述组合物用于促进动物生长、降低饲料换肉率、节省饲养成本。

6.根据权利要求4所述的抑菌组合物，其特征在于，所述组合物用于抑制下痢。

7.一种含唾液乳酸杆菌M6菌株的抑菌组合物的组合方法，其特征在于，所述组合方法制成动物饮用水、饮用水添加物、饲料、食品添加物、人类及动物的医疗组合物及人类的饮品、饮品添加物、食品或食品添加物。

8.根据权利要求7所述的抑菌组合物的组合方法，其特征在于，与乳酸菌协同组合的饲料直接使用或干燥后使用。

9.根据权利要求7所述的抑菌组合物的组合方法，其特征在于，所述抑菌组合物为乳酸锭剂、粉末或颗粒状。

10.根据权利要求8所述的抑菌组合物的组合方法，其特征在于，所述抑菌组合物与抗生素联合使用，以降低抗生素在饲料使用的百分比。

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