CN102311932A - 改善口腔内细菌群的唾液乳酸杆菌及其保健组合物 - Google Patents

Abstract

本发明揭示包含保藏号为CGMCC No.3505的唾液乳酸杆菌SG-M6(Lactobacillus salivarius SG-M6)，更进一步揭示该唾液乳酸杆菌SG-M6的核苷酸序列包含SEQ ID NO：1，并以本发明唾液乳酸杆菌SG-M6及其发酵产物制成的组合物达成下列功效：改善口腔内细菌群、抑制个体口内的牙周细菌生长有效应用于预防或治疗口腔细菌性疾病。

Description

改善口腔内细菌群的唾液乳酸杆菌及其保健组合物

技术领域

本发明涉及保藏号为CGMCC No.3505的唾液乳酸杆菌SG-M6(Lactobacillus salivarius SG-M6)及其制得的发酵产物于口腔保健中的应用。

背景技术

正常人口腔内存在着许多细菌、霉菌、甚至病毒，而其中又以细菌的数量为最大：每毫升唾液中有1亿个细菌，整个口腔中的细菌种类超过600种，然而这些细菌并非全都是致病菌，其中也包括部份的益生菌。正常状况下这些细菌彼此维持菌落的相对平衡而不会致病，但如果身体免疫力或抵抗力变差、口腔环境改变、服用药物或有全身性疾病等情况下，就会使致病菌过度生长而造成口腔疾病，轻则导致口臭、滋生牙菌斑、牙龈发炎等，重则引发龋齿、牙周病，甚至是细菌侵入血管内大量繁殖而造成菌血症。

根据牙医师公会全国联合会全年度健保资料统计，台湾地区成年人罹患牙周病比例高达9成，由此可见牙齿保健的重要性。

牙周病一般可分为两种，亦即牙龈炎(又作齿龈炎，gingivitis)和牙周炎(periodontitis)。牙龈炎主要征兆是牙龈出血、肿胀、发红等。牙周炎则是指支撑牙龈组织和牙齿的齿槽骨(alveolar bone)遭到破坏的状态。

罹患牙周病，牙齿和牙龈间的沟槽会变深，形成「牙周囊袋」(periodontalpocket)。通常牙齿健康者的牙周囊袋深度约在1mm到2mm之间，轻度牙周炎患者的牙周囊袋深度约是3～4mm，中度患者是4～6mm，重度患者的牙周囊袋深度则超过6mm以上。随着牙周囊袋的加深，牙龈本身会变短。当牙齿外观看起来变长，或者牙齿开始晃动，都可能是重度牙周病的警讯。

牙龈炎及牙周炎都是「牙周细菌」(periodontal bacteria)感染造成，代表性细菌有牙龈卟啉菌(Porphyromonas gingivalis)。

唾液中的醣蛋白(glycoprotein)会在牙齿表面形成薄膜，使细菌可在此附着，细菌吸取了食物中的糖分后，薄膜会变大、增厚，进而形成牙菌斑。再者，如果牙周囊袋中形成牙菌斑的话，牙周细菌便会在该牙菌斑中大量繁殖。由于牙周细菌具厌氧性，所以氧气难以到达的牙周囊袋是它最适合滋生的环境。牙菌斑也是变形链球菌(Streptococcus mutans)的温床，90％以上的成年人口腔中都携带这种细菌，而此菌亦是造成龋齿的主要细菌。当变形链球菌分解糖分产生的酸性物质侵蚀牙齿的珐琅质(enamel)和象牙质(dentin)后，就会造成龋齿。

就牙周病而言，当牙周细菌侵入牙龈时，就会引起免疫反应。牙周细菌会分泌酵素溶解牙龈细胞进而入侵到牙龈内部。在牙周细菌数量尚少时，还能阻止它的入侵，一旦大量繁殖，就会无法抑制。

目前有一些方式可以预防龋齿或牙周病的产生，例如施用避免细菌附着至牙齿表面的抗附着剂，以减少牙菌斑的形成避免细菌侵蚀牙质(中国台湾专利申请号094144377)；使用抗菌剂以抑制细菌孳生(美国专利第5,368,845号；WO 92/14475)；或是目前所广泛使用的氟化物，利用其能降低珐琅质对酸性物质的溶解度以预防龋齿。

发明内容

本发明的目的在提供一种新的唾液乳酸杆菌SG-M6(Lactobacillussalivarius SG-M6)，(保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC No.3505，保藏日期为2009年12月10日，分类命名为：唾液乳杆菌)更进一步揭示该唾液乳酸杆菌SG-M6，其包含编码如SEQ IDNO：1所示的核苷酸序列。本发明的另一目的在揭露以唾液乳酸杆菌SG-M6于培养基发酵后制得的发酵产物。

本发明的又一目的是提供一种改善口腔内细菌群的保健组合物，将前述唾液乳酸杆菌SG-M6或其发酵产物应用于口腔保健，可有效抑制个体口内的牙周细菌生长。

本发明唾液乳酸杆菌SG-M6所包含SEQ ID NO：1是和已知的唾液乳酸杆菌的遗传物质有明显差异(详见图1)。此外，乳酸菌鉴定是使用API 50CHL套组(法国API BioMerieux Research laboratory，La Balme Les Grottes，Montalien，Jeraeh，France)，API 50CHL比对显示出本发明的唾液乳酸杆菌SG-M6与欧洲专利号1312667所揭露的菌株WB21(保藏号FERM P-17991)、美国专利公开第2007/0071737所揭露的菌株TI2711(保藏号FERM BP-7974)、欧洲专利第0154549号所揭露的菌株AD0001(保藏号FERM P-7537)有明显差异，如表一所示。

表一、本发明的唾液乳酸杆菌SG-M6与欧洲专利号1312667所揭露的菌株WB21(保藏号FERM P-17991)、美国专利公开第2007/0071737所揭露的菌株TI2711(保藏号FERM BP-7974)、欧洲专利第0154549号所揭露的菌株AD0001(保藏号FERM P-7537)的API 50CHL比对

API50CHL	醣	本发明的唾液乳酸杆菌(SG-M6)	EP1312667(WB21)(FERMP-17991)	US2007/0071737(TI2711)(FERMBP-7974)	EP0154549(AD0001)(FERMP-7537)
						0	控制组	-
1	甘油(Glycerol)	-
						2	赤藓糖醇(Erythritol)	-
3	D-阿拉伯糖(D-Arabinose)	-	-	-	-
						4	L-阿拉伯糖(L-Arabinose)	-
5	D-核糖(D-Ribose)	+	-	-	-
						6	D-木糖(D-Xylose)	-	-	-	-
7	L-木糖(L-Xylose)	-
						8	核糖醇(Adonitol)	+
9	β-甲基-木糖苷(β-Methyl-xyloside)	-
						10	半乳糖(Galactose)	+	+	+	+
11	D-葡萄糖(D-Glucose)	+	+	+	+
						12	D-果糖(D-Fructose)	+	+	+
13	D-甘露糖(D-Mannose)	+	+	+	+
						14	L-山梨糖(L-Sorbose)	-
15	鼠李糖(Rhamnose)	+	+	+
						16	卫矛醇(Dulcitol)	-
17	肌醇(Inositol)	-
						18	甘露糖醇(Mannitol)	+	+	+	+
19	山梨糖醇(Sorbitol)	+	+	+	+
						20	α-甲基-D-甘露糖苷(α-Methyl-D-mannoside)	-
21	α-甲基-D-葡萄糖苷(α-Methyl-D-glucoside)	-
						22	N-乙酰葡萄糖胺(N-Acetyl glucosamine)	+
23	苦杏仁苷(Amygdaline)	-	-	-	-
						24	熊果苷(Arbutine)	-
25	七叶苷(Esculine)	+	-	-	+
						26	水杨苷(Salicine)	+	-	-	+
27	纤维二糖(Cellobiose)	-	-	-	-
						28	麦芽糖(Maltose)	+	+	+	+
29	乳糖(Lactose)	+	+	+	+
						30	木蜜二糖(Melibiose)	+	+	+	+
31	蔗糖(Saccharose)	+	+	+	+
						32	海藻糖(Trehalose)	+	+	+	+
33	菊糖(Inuline)	-
						34	落叶松糖(Melezitose)	-	-	-	-
35	D-棉子糖(D-Raffinose)	+	+	+	+
						36	淀粉(Amidon)	-
37	肝糖(Glycogen)	-
						38	木糖醇(Xylitol)	-
39	β-龙胆二糖(β-Gentiobiose)	-
						40	D-松二糖(D-Turanose)	-
41	D-来苏糖(D-Lyxose)	-
						42	D-塔格糖(D-Tagatose)	-
43	D-炭藻糖(D-Fucose)	-
						44	L-炭藻糖(L-Fucose)	-
45	D-阿拉伯胶醇(D-Arabitol)	-
						46	L-阿拉伯胶醇(L-Arabitol)	-
47	葡萄糖酸(Gluconate)	-
						48	2-keto-gluconate(2-酮-葡萄糖酸)	-
49	5-keto-gluconate(5-酮-葡萄糖酸)	-

本发明的发酵产物是指经能培养出唾液乳酸杆菌SG-M6成分的培养基发酵后的产物，该培养基的主要成分为葡萄糖、蛋白酶、肉类萃取物、酵母菌萃取物、盐类等物质。唾液乳酸杆菌SG-M6的发酵产物即使经过透析膜纯化后，例如使用Spectra/

Dialysis Membrane；MWCO：3500进行透析，亦不影响其抑菌效力。

牙周细菌皆会受到该保健组合物的影响而停止生长甚至死亡。藉此能够抑制口内常见的牙周病菌诸如变形链球菌(Streptococcus mutans)、血链球菌(Streptococcus sanguis)、牙龈卟啉菌(Porphyromonas gingivalis)及黏放线菌(Actinomyces viscosus)等滋生的特性，可将该组合物应用于预防或治疗口腔细菌性疾病：

1.与牙龈卟啉菌相关的疾病：牙周疾病(Periodontal disease)、骨质疏松症、海绵静脉窦血栓性静脉炎(Cavernous sinus thrombophlebitis)、牙周病(Periodontitis)、心血管疾病、感染性心内膜炎(infective endocarditis)、糖尿病、呼吸系统疾病、动脉硬化、冠状心脏病、中风、类风湿性关节炎。

2.与血链球菌相关的疾病：蛀牙、感染性心内膜炎、急感染性关节炎(Acuteseptic arthritis)、心血管疾病。

3.与变形链球菌相关的疾病：蛀牙、感染性心内膜炎。

4.与黏放线菌相关的疾病：牙周病。

本发明所揭露的保健组合物，其唾液乳酸杆菌SG-M6活菌及发酵产物具有抑制细菌滋生的能力，因此能以唾液乳酸杆菌SG-M6菌株及发酵产物直接涂抹于口腔的方式使用，或是在不破坏菌株及发酵产物活性而让其能于口腔内复原的前提下，将菌株及发酵产物加以冷冻或干燥化，进而制成锭剂或喷剂、溶于液体、以食品、医药品添加剂、或口腔清洁剂方式加以制造并使用。惟，任何方式只要不破坏保健组合物抑制细菌的能力即为本发明的可能适用方式。

另，本发明所述的个体为哺乳动物，较佳为人。

附图说明

图1.显示本发明的SEQ ID NO：1与已知的唾液乳酸杆菌(美国专利公开号US 2002/0094328中的菌株ATCCll741)的核苷酸序列比对图(使用NCBIblast程序)。Query为ATCC11741的序列，Sbjct为本发明SEQ ID NO：1的序列；

图2.唾液乳酸杆菌SG-M6治疗组(tLSP15)肝脏组织切片(200X)；

图3.唾液乳酸杆菌SG-M6治疗组(tLSP15)肾脏组织切片(200X)；

图4.对照组的四环霉素治疗组(tTC)肝脏组织切片(200X)；

图5.对照组的四环霉素治疗组(tTC)肾脏组织切片(200X)；

图6.对照组的无治疗(distilled water)组(tMT)肝脏组织切片(200X)；

图7.对照组的无治疗(distilled water)组(tMT)肾脏组织切片(200X)；

图8.唾液乳酸杆菌SG-M6预防组(pLSP15)肝脏组织切片(200X)；

图9.唾液乳酸杆菌SG-M6预防组(pLSP15)肾脏组织切片(200X)；

图10.对照组的四环霉素预防组(pTC)肝脏组织切片(200X)；

图11.对照组的四环霉素预防组(pTC)肾脏组织切片(200X)；

图12.对照组的无预防(distilled water)组(pMT)肝脏组织切片(200X)；

图13.对照组的无预防(distilled water)组(pMT)肾脏组织切片(200X)。

具体实施方式

下述的实施例提供本发明更进一步细节的说明，这些实施例为本发明最佳的实施例，其用以说明此发明，然非限制本发明的范围。本实施例中揭露一种用于预防或治疗口腔细菌性疾病的保健组合物，其中有效成分为唾液乳酸杆菌SG-M6(Lactobacillus salivarius)的发酵产物，在此以体外(in vitro)或活体(in vivo)实验加以验证该菌体的发酵产物对于牙周病的疗效。

试验方法

1.体外实验(in vitro study)

以唾液乳酸杆菌SG-M6在液态培养基，本实施例采用MRS培养基于30～37℃培养15～24小时后，将发酵菌液浓缩成30倍，并使用透析膜(Spectra/

Dialysis Membrane；MWCO：3500，Spectrum Laboratories Inc，CA)将其透析48小时，再依实验需求稀释成不同浓度。分别与变形链球菌(Streptococcus mutans，ATCC 25175)、血链球菌(Streptococcus sanguis，ATCC49295)、牙龈卟啉菌(Porphyromonas gingivalis，ATCC 33277)及黏放线菌(Actinomyces viscosus，ATCC 15987)进行纸锭琼脂扩散试验(Disc agardiffusion test)、肉汤稀释法(broth dilution method)、试验样品与病原菌共同培养试验，了解抑制病原菌生长状况。以上四株病原菌菌株购自财团法人食品工业发展研究所生物资源保存及研究中心或ATCC。

(1)纸锭琼脂扩散试验

将培养至浊度相当于0.5比浊度的变形链球菌、血链球菌、牙龈卟啉菌及黏放线菌菌液，以无菌棉棒沾菌液3秒钟，在三个方向平均涂抹于琼脂表面，使接种原平均分布。将唾液乳酸杆菌SG-M6浓缩液透析后，调整成浓缩15倍(LSP15)、浓缩10倍(LSP10)、浓缩5倍(LSP5)、浓缩4倍(LSP4)、浓缩2倍(LSP2)及1倍(LSP1)(未浓缩的发酵菌液)。将直径6mm消毒灭菌的纸锭浸入不同浓度的唾液乳酸杆菌SG-M6发酵产物或活菌液(简称LSB)中三秒钟后，取出纸锭平贴于琼脂表面，置于37℃厌氧培养箱中培养24小时后，测量其抑制圈大小。

(2)肉汤稀释法(Broth dilution method)

将唾液乳酸杆菌SG-M6的30倍发酵产物透析后，将其浓度连续稀释成15倍、10倍、5倍、4倍、2倍及1倍，另将变形链球菌、血链球菌、牙龈卟啉菌及黏放线菌在无菌标准液态培养基(BHI broth)培养至浊度相当于0.5比浊度的菌液，各加入50μL菌液于管中，置于37℃厌氧培养箱中培养48小时后，以平板计数法，计算菌落数，推算样品抑菌浓度。

(3)试验样品与病原菌共同培养试验

将唾液乳酸杆菌SG-M6的活菌或发酵产物，分别与不同病原菌(变形链球菌、血链球菌、牙龈卟啉菌)共同放置于试管中，37℃共同培养。分别于不同时间点取样，以平板计数法，计算菌落数，了解样品抑制病原菌生长状况。

2.动物活体实验(in vivo study)

分设实验组及对照组。唾液乳酸杆菌SG-M6的实验组分成6组(透析后的唾液乳酸杆菌SG-M6的发酵产物浓缩菌液6组，浓度分别为浓缩15倍、浓缩10倍、浓缩5倍、浓缩4倍、浓缩2倍及1倍(未浓缩发酵菌液))，与对照组2组(四环霉素(tetracycline)0.267mg/mL及蒸馏水(distilled water))。

(1)动物牙周病预防效果的评估

选用八周龄的雌性Balb/c小鼠每组12只(表二)，每日投予不同浓度的唾液乳酸杆菌发酵产物、四环霉素0.267mg/mL或蒸馏水各1毫升，并于其下颚前牙扎上齿列矫正用钢线(ligature wire)，并于牙周组织接种牙周病致病菌变形链球菌，即为以人工方式引发牙周组织病变的病态动物模式。此操作至全部动物牺牲为止，并观察记录其病理表征。于由牙科主治医师诊断直至对照组(喂食distilled water，mock-treated group)开始牙龈出现红肿及牙菌斑出现后解除钢线束缚，并停止接种牙周病致病菌。于解除钢线束缚后第4、8、12、及16日，检测老鼠牙周囊袋深度(pocket depth)，各组牺牲3只采血，并取检体进行组织学观察。

表二、动物实验预防组的分组(注：人类使用的四环霉素剂量为每日1000mg每75kg体重，由此推估小鼠每日使用的剂量大约为0.267mg每20g体重)

(2)动物牙周病治疗效果的评估

选用八周龄的雌性Balb/c小鼠每组12只(表三)，于其下颚前牙扎上齿列矫正用钢线，并于牙周组织接种牙周病致病菌变形链球菌，直至对照组牙龈出现红肿及牙斑出现为止，即为以人工方式引发牙周组织病变的病态动物模式。分别由牙科主治医师诊断于组织病变后，每日投予不同浓度的乳酸杆菌发酵产物或乳酸杆菌活菌、四环霉素0.267mg/mL或蒸馏水各1毫升，并观察记录其病理表征。于开始治疗日解除钢线束缚，并停止接种牙周病致病菌。于解除钢线束缚后第4、8、12、及16日，检测老鼠牙周囊袋深度，各组牺牲3只采血，并取检体进行组织学观察。

表三、动物实验治疗组的分组

(3)牙周囊袋深度(periodontal pocket depth)改善百分比

以对照组为标准，使用Mann-Whitney test与各组中每个个体做检测，有显著差异的个体称为改善个体。(改善个体个数/全组个体数)×100％＝牙周囊袋深度改善百分比。

(4)临床病理及生化检验

将未死亡动物牺牲，颈动脉取血在3000r.p.m.，4℃的条件下离心10分钟后，取上层血清，用自动生化分析仪来检测其ALT、AST、Creatinine、BUN生化指标。并取其重要标的脏器(肝、肾)以10％福尔马林液固定，石蜡包埋组织切片后做H.E.stain染色以进行病理学观察。

3.统计分析

实验数值以平均值±标准误差(mean±S.D.)表示。小鼠牙周囊袋状况的实验组与对照组间统计差异，在纵向(longitudinal)研究是采One-Way ANOVA与Dunnett多重事后比较法(Dunnett multiple post hoc comparison)检测，而横断(cross-sectional)研究是以One-Way ANOVA与LSD多重事后比较法(LSDmultiple post hoc comparison)检测。另外采用Mann-Whitney test检测牙周囊袋改善的个体数。Statistical significance level的p值为0.05。

结果

1.体外实验

(1)纸锭琼脂扩散试验

表四、纸锭琼脂扩散试验的抑菌效果。无菌纸锭直径为6mm，若抑菌圈＞6mm表示有抑菌效果，反之则无抑菌效果。培养温度及时间为37℃，24小时，对照组为含四环霉素的纸锭，抑制圈的数值以Mean±SD表示(n＝3)。

	黏放线菌(Actinomycesviscosus)	牙龈卟啉菌(Porphyromonasgingivalis)	变形链球菌(Streptococcusmutans)	血链球菌(Streptococcussanguis)
					LSP1	-	-	-	-
LSP2	10±1.0	12±1.0	9±1.0	9±1.0
					LSP4	13±1.0	14±1.0	13±1.0	16±1.0
LSP5	15±1.0	16±1.0	15±1.0	18±1.0
					LSP10	23.2±1.2	23±1.0	21±1.2	22±1.0
LSP15	31.1±1.1	32±1.1	29±1.0	28±1.4
					LSB	14±1.0	9±0.5	14±1.0	14±1.0
Tetracycline	48.2±2.4	33.4±2.2	29.7±2.0	25.9±1.2

由表四可以见得唾液乳酸杆菌SG-M6浓缩2倍以上的发酵产物(LSP)及活菌(LSB)对于黏放线菌、牙龈卟啉菌、变形链球菌及血链球菌这四种病原菌皆有抑制圈产生，且发酵产物的浓缩倍数愈高，抑制圈愈大，呈现剂量依赖现象。

(2)肉汤稀释法

表五、最低抑菌浓度及抑菌百分比(100％-(Test group÷Control)x 100％)

表五显示唾液乳酸杆菌SG-M6的发酵产物对于牙周致病菌48小时处理后有不同的抑制效果，广泛而言，唾液乳酸杆菌SG-M6产物的高浓度有较好的抑制效果。针对牙周致病菌而言，唾液乳酸杆菌SG-M6的发酵产物对于牙龈卟啉菌的抑制效果最明显，呈现剂量依赖现象，其次为变形链球菌。唾液乳酸杆菌的2倍以上浓缩产物对于这4株病原菌皆有抑制作用。

(3)唾液乳酸杆菌SG-M6的发酵产物或活菌与病原菌共同培养 试验

表六、唾液乳酸杆菌SG-M6发酵产物(简称LS)与变形链球菌共同培养，抑制病原菌生长情形。

表六显示唾液乳酸杆菌SG-M6发酵产物2倍浓缩液于共同培养8小时，已无变形链球菌病原菌存在，2.5倍浓缩液于共同培养时间4小时已无变形链球菌病原菌存在，可见低浓度唾液乳酸杆菌发酵产物在短时间就有很好的抑制效果。

表七、唾液乳酸杆菌SG-M6发酵产物(简称LS)与血链球菌共同培养，抑制病原菌生长情形。

表七显示唾液乳酸杆菌SG-M6发酵产物2倍浓缩液于共同培养6小时，已无血链球菌病原菌存在，2.5倍浓缩液于共同培养时间4小时已无血链球菌病原菌存在，可见低浓度唾液乳酸杆菌SG-M6发酵产物在短时间就有很好的抑制效果。

表八、唾液乳酸杆菌SG-M6发酵产物(简称LS)与牙龈卟啉菌共同培养，抑制病原菌生长情形。

表八显示唾液乳酸杆菌SG-M6发酵产物2倍或2.5倍浓缩液于共同培养6小时，已无牙龈卟啉菌病原菌存在，可见低浓度唾液乳酸杆菌SG-M6发酵产物在短时间就有很好的抑制效果。

表九、唾液乳酸杆菌SG-M6活菌(简称LSB)与变形链球菌共同培养，抑制病原菌生长情形。

表九显示唾液乳酸杆菌SG-M6活菌与变形链球菌共同培养，不管是低菌数组(7次方)、中菌数组(8次方)，于共同培养32小时内皆无变形链球菌病原菌存在，可见其皆有抑制变形链球菌生长之效果。

2.动物活体实验

(1)动物牙周病预防效果的评估

表十、唾液乳酸杆菌SG-M6预防组(pLS)的小鼠其牙周囊袋深度(mm)(One-Way ANOVA with Dunnett multiple post hoc comparison)在不同时间点，各组与对照组(pMT)的比较。(^*p＜0.05；^**p＜0.01)

	第4天	第8天	第12天	第16天
					pLSP1	1.33±0.58	1.17±0.76	0.67±0.29**	0.75±0.35**
pLSP2	0.50±0.00**	0.83±0.29**	1.67±1.15	1.50±0.71
					pLSP4	1.23±1.54	0.63±0.75**	0.40±0.17**	0.35±0.21**
pLSP5	0.90±0.52**	0.59±0.26**	0.50±0.00**	0.20±0.00**
					pLSP10	0.96±0.50**	0.83±0.50**	0.40±0.15**	0.30±0.17**
pLSP15	0.73±0.30**	0.47±0.10**	0.40±0.15**	0.40±0.17**
					pTC	0.84±0.50**	0.70±0.34**	0.56±0.26**	0.49±0.25**
pMT	2.22±1.07	2.16±1.25	2.75±1.32	2.21±0.64

评估预防组唾液乳酸杆菌SG-M6发酵产物，各组喂食不同浓度对于牙周囊袋深度的影响，不同时间点各组间都有显著差异。在每个时间点与喂食蒸馏水的对照组(pMT)比较，从时间点第4天至第16天，15倍高浓度(pLSP15)组、10倍(pLSP10)及5倍(pLSP5)浓度对于牙周囊袋的深度减少皆有显著差异。而4倍(pLSP4)浓度组除第4天无显著改善之外，其余时间点皆有显著差异。1倍(pLSP1)浓度组在12天及16天牙周囊袋的改善有显著差异。喂食四环霉素的预防对照组(pTC)在所有的时间点皆有显著差异。

表十一、唾液乳酸杆菌SG-M6预防组(pLS)的小鼠的牙周囊袋深度(mm)(One-Way ANOVA with LSD multiple post hoc comparison)，各浓度组别在不同时间点与第4天(Day 4)比较。(^*p＜0.05；^**p＜0.01)。

pLSP1

pLSP2

pLSP4

pLSP5

pLSP10

pLSP15

pTC

pMT

第4天

1.33±0.58

0.50±0.00

1.23±0.54

0.90±0.52

0.96±0.50

0.60±0.26

0.84±0.50

2.22±1.07

第8天

1.17±0.76

0.83±0.29

0.63±0.75

0.59±0.26

0.83±0.50

0.91±0.51*

0.70±0.34

2.16±1.25

第12天

0.67±0.29

1.67±1.15

0.40±0.17

0.50±0.00

0.40±0.15*

0.40±0.15**

0.65±0.26*

2.75±1.32

第16天

0.75±0.35

1.50±0.71

0.35±0.21

0.20±0.00

0.30±0.17*

0.40±0.17*

0.49±0.25*

2.21±0.64

唾液乳酸杆菌SG-M6发酵产物的各浓度组别，在不同时间点的组内比较，10倍(pLSP10)及四环霉素组(pTC)对于牙周囊袋的深度减少在第12天及第16天有显著差异，而15倍高浓度(pLSP15)组第8天、第12天及第16天有显著差异。

(2)动物牙周病治疗效果的评估

表十二、唾液乳酸杆菌SG-M6治疗组(tLS)的小鼠其牙周囊袋深度(mm)(One way ANOVA with Dunnett multiple post hoc comparison)在不同时间点，各组与对照组(tMT)的比较。(^*p＜0.05；^**p＜0.01)

	第4天	第8天	第12天	第16天
					tLSP1	1.83±1.04	1.16±1.15	1.50±1.32	1.00±0.00
tLSP2	3.33±1.53	1.50±1.32	1.17±1.15	0.83±0.29
					tLSP4	3.33±1.53	1.25±1.06	0.65±0.21**	0.35±0.21**
tLSP5	0.96±0.47**	0.75±0.27**	0.58±0.40**	0.20±0.00**
					tLSP10	1.21±0.72**	0.78±0.26**	0.61±0.32**	0.25±0.23**
tLSP15	1.18±0.72**	0.88±0.50**	0.38±0.16**	0.20±0.00**
					tTC	1.05±0.64**	0.89±0.44**	0.63±0.37**	0.48±0.33**
tMT	2.10±0.63	1.91±0.89	2.10±0.97	2.00±0.92

评估治疗组唾液乳酸杆菌SG-M6发酵产物，各组喂食不同浓度发酵产物对于牙周囊袋深度的影响，不同时间点各组间都有显著差异。在每个时间点与对照组(tMT)比较，从时间点第4天至第12天，5倍、10倍及15倍浓度组(tLSP5、tLSP10及tLSP15)对于牙周囊袋的深度减少皆有显著差异(p＜0.05)。而4倍浓度组(tLSP4)在第12天与第16天有显著改善(p＜0.05)。喂食四环霉素的治疗对照组(tTC)在所有的时间点皆有显著差异。

表十三、唾液乳酸杆菌SG-M6治疗组(tLS)的小鼠其牙周囊袋深度(mm)(One way ANOVA with LSD multiple post hoc comparison)各浓度组别在不同时间点与第4天(Day 4)比较(^*p＜0.05；^**p＜0.01)。

tLSP1

tLSP2

tLSP4

tLSP5

tLSP10

tLSP15

tTC

tMT

第4天

1.83±0.58

3.33±1.53

3.33±1.53

0.96±0.47

1.21±0.72

1.18±0.72

1.05±0.64

2.10±0.63

第8天

1.16±1.15

1.50±1.32

1.25±1.06

0.75±0.27

0.78±0.26

0.88±0.50

0.89±0.44

1.91±0.89

第12天

1.50±1.32

1.17±1.15

0.65±0.21

0.58±0.40

0.61±0.32**

0.38±0.16*

0.63±0.37**

2.10±0.97

第16天

1.00±0.00

0.83±0.29

0.35±0.21

0.20±0.00

0.25±0.23**

0.20±0.00*

0.61±0.34**

2.00±0.92

治疗组喂食唾液乳酸杆菌SG-M6发酵产物的各浓度组别，在不同时间点的组内比较(与第4天比较)，各组随着时间牙周囊袋的改善情况。10倍、15倍浓度组及四环霉素组(tLSP10、tLSP15及tTC)在第12天与第16天对于牙周囊袋的深度减少皆有显著差异(p＜0.05)。

(3)牙周囊袋深度(periodontal pocket depth)改善百分比

表十四、唾液乳酸杆菌SG-M6预防组(pLS)牙周囊袋改善百分比(与无处理的对照组(pMT)比较有显著差异(Mann-Whitney test，p＜0.05)改善的个体百分比)。

	第4天	第8天	第12天	第16天
					pLSP1	0	33％	67％	100％
pLSP2	100％	33％	0	0
					pLSP4	67％	67％	33％	100％
pLSP5	60％	29％	100％	100％
					pLSP10	42％	44％	50％	100％
pLSP15	75％	33％	50％	100％
					pTC	62％	50％	71％	100％
pMT	-	-	-	-

唾液乳酸杆菌SG-M6预防组牙周囊袋深度改善百分比在第16天，除了2倍浓度组外，各组皆达到100％。

表十五、唾液乳酸杆菌SG-M6治疗组(tLS)牙周囊袋改善百分比(与无治疗对照组(tMT)比较有显著差异(Mann-Whitney test，p＜0.05)改善的个体百分比)。

	第4天	第8天	第12天	第16天
					tLSP1	0	0	33％	0
tLSP2	0	33％	67％	33％
					tLSP4	0	50％	50％	50％
tLSP5	36％	38％	40％	50％
					tLSP10	25％	22％	50％	33％
tLSP15	45％	38％	60％	50％
					tTC	30％	20％	47％	33％
tMT	-	-	-	-

唾液乳酸杆菌SG-M6治疗组牙周囊袋深度改善百分比在第16天，除了1倍浓度组外，各组皆在第16天至少达到33％。

(4)临床病理检验

喂食发酵产物的各组在第16天的肝、肾组织切片(图2、图3与图8、图9)，显示各组肝及肾组织细胞无显著毒性伤害的表征，无发炎细胞浸润，与无治疗对照组(tMT或pMT)(图4～图7与图10～图13)相较之下无明显差异。

结论

在体外实验的纸锭琼脂扩散试验可以知道，其中唾液乳酸杆菌SG-M6浓缩2倍以上的发酵产物及活菌对于黏放线菌、变形链球菌、牙龈卟啉菌、血链球菌这四种病原菌皆有抑制圈产生，且浓缩倍数愈高，抑制圈愈大，呈现剂量依赖现象。在肉汤稀释法试验中，显示唾液乳酸杆菌SG-M6的发酵产物浓度对于牙周致病菌有不同程度的抑制效果。广泛而言，唾液乳酸杆菌SG-M6发酵产物的高浓度有较好的抑制效果。共同培养呈现的数据显示，唾液乳酸杆菌SG-M6发酵产物对牙龈卟啉菌、变形链球菌、血链球菌这三种牙周致病菌短时间都有抑制的作用，且浓度愈高、抑制效果愈好；唾液乳酸杆菌SG-M6活菌对于变形链球菌具有抑制效果，活菌数于7次方可在32小时内将变形链球菌完全杀死。

牙周病动物模型活体实验显示唾液乳酸杆菌SG-M6的发酵产物对于牙周状况的改善，预防的效果优于治疗的效果。就预防效果而言，唾液乳酸杆菌SG-M6发酵产物浓缩15倍、10倍、5倍、4倍、2倍及1倍对于牙周囊袋的深度改善皆有显著差异。治疗效果部分，在唾液乳酸杆菌SG-M6发酵产物浓缩15倍、10倍、5倍及4倍有显著差异。

喂食唾液乳酸杆菌SG-M6发酵产物的各组在第16天动物牺牲时取出肝肾组织进行病理切片，显示各组肝及肾脏组织细胞，无显著毒性伤害的表征，表示安全性极高。

结合体外实验及动物活体实验，显示唾液乳酸杆菌SG-M6的发酵产物能预防牙周炎的产生并改善牙周发炎的状况。

惟须注意前述实施例仅代表本发明的各种剂型或态样与特征，以详细说明及例示，以使熟习此技术者能施行并加以利用，为任何替代、变更或修改均应在不脱离本发明的精神与范围内进行。本领域技术人员可从本发明得到本文所述的结果及优点；动物、方法以仅为示范性的较佳实施例代表，并非欲限制本发明的范围。本领域技术人员会对本发明做修正、变更及其它用途，唯这些修正与变更均应包含在本发明的精神内，并应当在本发明所附的专利请求项所定义的范围内。

Claims (10)

1.一种唾液乳酸杆菌SG-M6，其保藏号为CGMCC No.3505。

2.如权利要求1所述的唾液乳酸杆菌SG-M6，其特征在于，包含编码如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

3.一种唾液乳酸杆菌SG-M6的发酵产物，其特征在于，由权利要求1的唾液乳酸杆菌SG-M6于培养基发酵后制得。

4.如权利要求3所述的唾液乳酸杆菌SG-M6的发酵产物，其特征在于，发酵产物是指经能培养出唾液乳酸杆菌SG-M6成分的培养基发酵后的产物。

5.一种改善口腔内细菌群的保健组合物，其特征在于，包含权利要求1所述的唾液乳酸杆菌SG-M6或权利要求3所述的发酵产物。

6.如权利要求5所述的保健组合物，其特征在于，是用以抑制个体口内的牙周细菌生长。

7.如权利要求6所述的保健组合物，其特征在于，所述牙周细菌包含变形链球菌、血链球菌、牙龈卟啉菌或黏放线菌。

8.如权利要求6所述的保健组合物，其特征在于，所述个体为哺乳动物。

9.如权利要求6所述的保健组合物，其特征在于，所述个体为人。

10.如权利要求6所述的保健组合物，其特征在于，为锭剂、喷剂、溶液、食品、医药品添加剂或口腔清洁用品添加剂之中的任一种剂型。

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