CN1625345A - 含乳酸杆菌作为活性成分的活细菌制剂以及含有乳酸杆菌的食品 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种含有乳酸杆菌，唾液乳酸杆菌作为活性成分的活细菌制剂或者食品。提供了含有乳酸杆菌的活细菌制剂或者食品，其中乳酸杆菌通过使口腔内微生物群落正常化，能够防止由牙周疾病致病细菌和致龋齿细菌导致的牙周疾病和/或龋齿的发生、复发和恶化，能够防止口臭产生和保持唾液的pH值在生理正常的水平。

Description

含乳酸杆菌作为活性成分的活细菌制剂 以及含有乳酸杆菌的食品
技术领域
本发明涉及一种含有乳酸杆菌作为活性成分用于彻底口腔护理的药物(活细菌制剂)，用于预防和治疗牙龈炎、牙周炎、牙周疾病、龋齿和口臭，以及涉及一种含有乳酸杆菌的食品及其应用。
背景技术
根据日本厚生劳动省(Japanese Ministry of Health，Labor andWelfare)的调查报告，患有牙周疾病的患者数目占国民人口的总数根据调查由1975年的18.2％上升到1993年的61.8％和1999年的72.9％，其后该数字稳定增长，而推测的病人数目已达到甚至9千万，目前的形势是从医药经济的观点大量开支投入到牙科领域。
因此，当局在1988年决定在全国范围内致力于牙周疾病的预防，并开展和推动了所谓的“8020行动”。
然而，当前病人的数目仍然没有减少，因此人们期望发展出该疾病预防和治疗的突破性方法。
近年来，牙周疾病被指出不仅仅是牙龈器官的慢性感染疾病，也具有引起诸如由血管瘤导致的心脏梗塞和血管损伤等循环系统疾病的危险，而牙周疾病作为诱发糖尿病和早产的危险因素也引起了注意。迄今仍无牙周疾病的合适治疗方法，实际上使用牙科方法治疗，即发病部位的杀菌剂给药，外科手术，和抗生素口服给药。然而，长期连续给药杀菌剂和抗生素进行治疗会由于其使用产生新的耐药细菌，同时带来药物副作用产生的许多严重问题。因此，目前的形势是没有建立起任何令人满意的治疗方法。
因此，为预防和治疗牙周疾病和龋齿，作为杀菌剂和抗生素给药的替代方法，人们研究了应用乳酸杆菌预防和治疗上述疾病的可能性。
应用乳酸杆菌预防和治疗牙周疾病的方法，应用粪肠球菌(Enterococcus faecium)，马链球菌(Streptococcus equinus)，发酵乳酸杆菌(Lactobacillus fermentum)，唾液乳酸杆菌(Lactobacillussalivarius)细胞或者水提取物作为活性成分的方法，公开于日本专利早期公开(Kokai)No.61-91126和日本专利公开(Kokoku)No.4-52249。此外，在国际专利公开WO99/07826中，研究了由乳酸杆菌(Lactobacillusspp.)V20和口腔链球菌(Streptococcus oralis)表达或者产生的阻遏葡萄糖基转移酶抑制活性和口臭发展的因子，和上述的抑制过氧化氢产生的乳酸杆菌。
同时，有400种或者更多种的细菌栖息于人类口腔，而细菌数目达到甚至100亿。顺便提及，唾液中检测到108到109CFU/毫升(菌落形成单位/毫升)水平的细菌数目。因此，人类口腔中形成了复杂的微生物群落(口腔微生物群落)，因而基于简单的体外系统所获得结果的推断讨论人类牙周疾病和口臭的预防和治疗效果是非常成问题的。此外，为讨论假定对人给药的效果，也需要考虑含有乳酸杆菌的活细菌制剂或者食品中活细菌的活力，以及这种含有乳酸杆菌的活细菌制剂或者食品的风味和物理化学特征。然而，在上述的关于使用乳酸杆菌预防和治疗牙周疾病和口臭的文献中，根本没有公开使用人或者模型动物的体内系统获得的消除或者抑制牙周疾病和龋齿的数据，或者有关含有乳酸杆菌的活细菌制剂或者食品中活细菌活力的数据，以及这种含有乳酸杆菌的活细菌制剂或者食品的风味和物理化学特征。
因为预想用含有乳酸杆菌的活细菌制剂或者食品对人给药，用其中的细菌菌株作为预防和治疗牙周疾病和口臭的手段，在使用人和模型动物的试验中应当选择能确切地消除或者抑制牙周疾病和龋齿的病原细菌(口腔病原细菌)的乳酸杆菌菌株。此外，当乳酸杆菌菌株用于含有乳酸杆菌的活细菌制剂或者食品时，关键是乳酸杆菌菌株应当表现出高活力，优选制剂或者食品表现出优良的风味和物理化学特征。
发明的内容
考虑到目前涉及应用乳酸杆菌预防和治疗上述牙周疾病和龋齿的技术水平，本发明的目的是提供能够防止牙周疾病和/或龋齿发病、复发和恶化的乳酸杆菌菌株，其中引起疾病的细菌是牙周疾病致病细菌和生龋细菌。本发明的另一个目的是提供含有包括上述乳酸杆菌菌株的乳酸杆菌活细菌制剂和食品。
选择如上所述的其效力被临床证实的菌株是极其重要的，它能够消除或者抑制牙周疾病和龋齿的病原细菌(口腔病原细菌)，以及使口腔微生物群落正常化以防止口臭的产生，将唾液的pH值保持在正常的生理水平等等。
本发明的发明人从上述观点出发筛选了各种属于乳酸杆菌属的乳酸杆菌，结果发现唾液乳酸杆菌具有上述特征，从而实现了本发明。
因此，本发明提供了含有乳酸杆菌的活细菌制剂或者食品，其中含有作为活性成分的乳酸杆菌，唾液乳酸杆菌(Lactobacillussalivarius)。本发明的含有乳酸杆菌的活细菌制剂或者食品能够用于使口腔内微生物群落正常化，防止牙龈炎、牙周炎和牙周疾病的发作，防止龋齿的发作，防止口臭的发生和消除口臭，等等。
本发明还提供了唾液乳酸杆菌TI 2711菌株(FERM BP-7974)作为特别优选的唾液乳酸杆菌菌株，及其细胞细胞和干燥细胞。本发明上述的含有乳酸杆菌的活细菌制剂和食品尤其优选含有唾液乳酸杆菌TI 2711菌株(FERM BP-7974)作为唾液乳酸杆菌菌株。
本发明还提供了用于制备含有唾液乳酸杆菌TI 2711菌株(FERMBP-7974)的活细菌制剂和食品的，乳酸杆菌唾液乳酸杆菌TI 2711菌株(FERM BP-7974)的应用，以及一种含有乳酸杆菌唾液乳酸杆菌TI2711菌株(FERM BP-7974)和具有不同于该菌株作用机制的活性成分的组合物。
附图的简要说明
图1是显示唾液乳酸杆菌TI 2711菌株对小鼠口腔牙龈卟啉单胞菌JCM 8525菌株抑制效果(体内)的图。
图2是显示唾液乳酸杆菌TI 2711菌株对小鼠口腔变异链球菌(S.mutans)MT8148菌株抑制效果(体内)的图。
图3是显示人口腔内细菌总数变化的图。
图4是显示人口腔牙周炎致病细菌(黑色-着色厌氧杆菌，BPAR)数目变化的图。
图5是显示人口腔变异链球菌数目变化的图。
图6是显示口腔内乳酸杆菌数目变化的图。
图7是显示人唾液pH值变化的图。
图8是显示人唾液中不溶解葡聚糖的量的变化的图。
图9是显示使用口气分析仪(Halimeter)测定口臭结果的图。
图10是显示试验实施例2中实验1和2的实验程序概要的图。
图11是显示试验实施例3中临床试验的试验程序概要的图。
实施本发明的最佳方式
为选择满足本发明上述目的的乳酸杆菌菌株，本发明的发明人根据下述程序测试了分离自健康对象口腔的许多乳酸杆菌属母株(30种菌株)并选择出最适宜菌株。
1.选择与一般的乳酸杆菌相比在最短时间内增殖的菌株(参见试验实施例1，(1))。
2.将乳酸杆菌属的各个母株(30个菌株)和临床上分离的主要牙周疾病致病细菌牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)，中间普雷沃菌(Prevotella intermedia)和黑色普雷沃菌(Prevotellanigrescens)(例如见试验实施例1，(2)使用牙龈卟啉单胞菌)的培养物混合，选择能够强烈地抑制牙周疾病致病细菌生长的菌株。
3.然后，将上述第1部分的乳酸杆菌属各个母株(30个菌株)和临床上分离的引起龋齿的主要细菌菌株变异链球菌(Streptococcusmutans)和茸毛链球菌(Streptococcus sobrinus)(例如见试验实施例1，(3)使用变异链球菌)的培养物分别混合，选择能够明显抑制致龋齿细菌生长的菌株。
4.进一步地，为了证实对于龋齿的效果，对混合培养物中不溶葡聚糖(龋齿的主要致病物质)进行了定量，选择显著抑制不溶葡聚糖产生的菌株(见试验实施例1，(3))。
5.然后，为了证实上述体外试验1到4部分选择的唾液乳酸杆菌TI 2711菌株的效果，进行了无菌小鼠感染模型试验(见试验实施例2)。程序概要如下。
1)将牙周疾病致病细菌牙龈卟啉单胞菌接种到无菌小鼠口腔并在其中繁殖。然后，口腔给予唾液乳酸杆菌TI 2711菌株，对牙龈卟啉单胞菌细胞数目进行计数以确证致病细菌生长受到明显抑制(见实验1)。
2)将致龋齿细菌变异链球菌接种到无菌小鼠口腔并在其中繁殖。然后，口腔给予唾液乳酸杆菌TI 2711菌株，对变异链球菌细胞数目进行计数以确证致病细菌生长受到明显抑制(见实验2)。
6.作为临床试验，在知情同意的情况下对健康志愿者(n＝57)进行接种并从他们收集口腔内唾液。分别计数细菌总数，牙周疾病致病细菌数目(革兰氏阴性BPAR菌落(黑色-着色厌氧杆菌))，致龋齿细菌变异链球菌数目，和有益细菌乳酸杆菌数目。此外，测定唾液的pH值和唾液中不溶解葡聚糖的量，使用口气分析仪测量口腔的口臭程度。
此后，志愿者在8个星期的服用期内服用唾液乳酸杆菌TI 2711片剂(糖味片剂)。在服用4周后和8周后，即在服用期结束测定所有上述项目，通过询问测验服用后的效果和副作用。用Wilcoxon法统计处理所有项目的结果。结果所有项目在服用前后客观观察到明显差异。此外，基于询问的综合结果进行了总体评价，并清楚地确证了临床试验的效果(见实验3)。
上述1到4部分所选择的作为满足本发明目的的菌株的唾液乳酸杆菌TI 2711菌株的细菌学特征如下。
A：形态学特征
细胞形态：杆状细菌
细胞大小：0.6～0.9×1.7～5.2微米
运动性：无
芽孢发生：无
革兰氏染色：阳性
B：生理学特征(阳性：+，阴性：-)
气体产生：-
过氧化氢酶：-
凝胶液化能力：-
氧化特性：兼性需氧
吲哚产生：-
硝酸盐还原能力：-
硫化氢产生：-
产生的乳酸旋光异构体：L-异构体
C：糖的同化作用(同化作用阳性：+，同化作用阳性：-)
阿拉伯糖：-
苦杏苷：-
纤维二糖：-
七叶苷：-
半乳糖：+
葡萄糖：+
果糖：+
葡萄糖酸：-
乳糖：+
麦芽糖：+
甘露醇：+
甘露糖：+
蜜二糖：+
棉子糖：+
松三糖：-
鼠李糖：+
核糖：-
山梨醇：+
蔗糖：+
木糖：-
水杨苷：-
海藻糖：+
基于前述的细菌学特征，并根据伯杰氏细菌分类学手册，卷2(1986)和Tomotari Mitsuoka，Chonaikin no Sekai(World ofEnterobacteriaceae)，Soubunsha，(1980)，本发明上述1到4部分选择的菌株被鉴定为唾液乳酸杆菌，该菌株被命名为唾液乳酸杆菌TI 2711菌株。该菌株于2002年3月26日保存于独立的管理机构，国立高等工业科技研究所，国际专利生物保藏机构(Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，日本，邮政编码：305-8566)，保藏号为FERM BP-7974。
本发明的乳酸杆菌菌株，唾液乳酸杆菌TI 2711菌株口腔给药时能够抑制或者阻止牙周疾病致病细菌和致龋齿细菌附着到齿龈组织，牙周袋和牙齿，以及抑制或者阻止这些致病菌的生长，并且能够抑制或者消除存在于口腔中的病原细菌。因此，本发明提供了预防和治疗可称为全国性疾病的牙周疾病和龋齿的非常有效的手段。自然界中广泛观察到这种宿主和口腔内微生物的相互作用，这种相互关系可理解为宿主和微生物之间的共生，寄生或拮抗现象。
后面将描述本发明的乳酸杆菌菌株(唾液乳酸杆菌TI 2711菌株)的应用。
本发明的乳酸杆菌菌株(唾液乳酸杆菌TI 2711菌株)能够作为活性成分给药或者作为单独活性成分的制剂与合适添加剂一起给药，或者可以单独或者作为混合物与其它活性组分，例如其它具有不同于该菌株作用机制的口腔护理药物同时给药。优选的剂型包括例如粉剂，颗粒剂，片剂，胶囊剂，针剂等等，且菌株能够安全地口服给药。当本发明的乳酸杆菌菌株用于这些剂型时，优选将本发明乳酸杆菌菌株的干燥细胞配制成制剂。本发明乳酸杆菌菌株的干燥细胞(活细菌)能够通过传统的方式来获得，例如培养本发明乳酸杆菌菌株纯培养物，通过例如离心方法收集细胞，向细胞中加入合适的稳定剂并冻干细胞。
上述各种制剂也可通过传统的方式来制备，且可以通过使用诸如赋形剂，粘合剂，崩解剂，包被剂，脱模剂，稳定剂，反佐药，增溶助剂，润滑剂，悬浮剂和稀释剂等已知的药用添加剂与作为活性成分的本发明的乳酸杆菌菌株来制备。
上述各种制剂的剂量变化依赖于给药对象病症的类型和严重性，例如依据症状可以以每天一次或者几次，给予大约1毫克到2,000毫克量的本发明乳酸杆菌菌株干燥细胞制剂。
另外，本发明的乳酸杆菌菌株可以通过添加到广泛范围的各种食品包括例如诸如糖味片剂，口香糖和糖果等糖食，和诸如朝鲜泡菜等泡菜中，从而提供含有乳酸杆菌的食品。同时当本发明的乳酸杆菌菌株用于食品时，优选使用本发明乳酸杆菌菌株的干燥细胞(活细菌)，它能够可选择地和食品中容许的添加剂一起添加到广泛范围的食品中。
此外，本发明的乳酸杆菌菌株能够以诸如酸奶等发酵食品的方式摄取。通过例如将本发明的乳酸杆菌菌株和作为酸奶生产发酵细菌的制酪业乳酸杆菌诸如嗜酸乳酸杆菌(Lactobacillus acidophilus)，瑞士乳酸杆菌(Lactobacillus helveticus)，嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)和乳链球菌(Streptococcus lactis)一起接种到诸如牛奶和羊奶等发酵原料中，并在发酵原料中将各种细菌混合培养或者单独培养后混合培养物，从而来制备这些发酵食品。
为了寻找对本发明的乳酸杆菌菌株显示辅助或协同效应的物质从而增强本发明乳酸杆菌菌株的效果，本发明发明人用龋齿作为指标研究了含有寡聚糖或者糖醇和本发明乳酸杆菌菌株的组合物的效果。结果发现当糖醇赤藓糖醇和本发明的乳酸杆菌菌株一起使用时，和各种物质单独的抗龋齿效果比较表现出抑制不溶解葡聚糖产生的协同效应(见试验实施例4)。
人们广泛了解糖醇(木糖醇，麦芽糖醇，山梨醇，赤藓糖醇等)和寡聚糖(果糖寡聚糖，木糖寡聚糖，蔗果三糖，棉子糖等)对龋齿有效。然而，然而这些糖醇和寡聚糖和乳酸杆菌菌株提供的协同效应或者辅助效应依赖于选择的乳酸杆菌菌株而有极大差异。
这些有益的糖醇和寡聚糖能分别被单独使用或者以组合物形式用于本发明含有乳酸杆菌的活细菌制剂或者食品中。这些糖醇和寡聚糖能够起赋形剂或者甜味剂的作用。这些糖醇和寡聚糖的类型和混合比例没有特别限制，任意糖醇或者寡聚糖能够以任意比例使用。例如，就糖味片剂来说通过合适地选择片剂组成，诸如糖味片剂的压缩压力和硬度等条件并使用传统的片剂制造技术能够很容易地制备含有任意比例任意糖醇或者寡聚糖的产品。
本发明将参考下述实施例和试验实施例进行更具体地说明。然而，本发明不受这些实施例限制。
试验实施例1：筛选适于抑制口腔内病原细菌的乳酸杆菌菌株(乳酸杆菌属)
(1)测定增殖特性的试验
将显示于表1中的30株属于乳酸杆菌属的乳酸杆菌分别以1×107CFU/毫升(菌落形成单位/毫升)的量接种到MRS肉汤(Difico)中，37℃在无氧条件下培养6小时，然后使用琼脂平板法对有活力的细菌进行计数。
即1毫升的各个菌株的培养物肉汤在培养6小时后用无氧稀释缓冲液(4.5克/升KH2PO4，6.0克/升Na2HPO4，0.5克/升的盐酸半胱氨酸，0.5克/升的琼脂，0.5克/升的吐温80)进行系列稀释，将0.1毫升的各种稀释液接种到MRS琼脂培养基(向MRS肉汤(Difico)中加入1.5％琼脂的琼脂平板)上并在无氧条件下在37℃培养48小时。然后对菌落数进行计数并乘以稀释倍数得到有活力细菌的数目。结果显示于表1。
(2)对主要牙周疾病致病细菌牙龈卟啉单胞菌JCM 8525菌株抑制活性的试验
牙龈卟啉单胞菌JCM 8525菌株单独(细胞数：1×106CFU/毫升)(对照)或者它们分别和表1中显示的30株乳酸杆菌(细胞数：1×106CFU/毫升)的混合物接种到10毫升由GAM(Nissui)肉汤组成含有0.7％葡萄糖的液体培养基中。细胞在无氧条件下在37℃培养12小时后，使用琼脂平板法对各个培养物肉汤中的牙龈卟啉单胞菌细胞数进行计数，得到由含有乳酸杆菌属细菌的混合培养物获得的有活力牙龈卟啉单胞菌细胞数目，相对于由单独培养牙龈卟啉单胞菌获得的有活力牙龈卟啉单胞菌细胞数目(对照，100％)的比例。
为了使用琼脂平板法对牙龈卟啉单胞菌细胞数目计数，通过使用由含有10微克/毫升庆大霉素的EG琼脂培养基(Nissui)组成的EG-CM培养基作为筛选培养基令只有牙龈卟啉单胞菌细胞生长，然后对细菌数目进行计数。即取1毫升的牙龈卟啉单胞菌单独培养或者和各个乳酸杆菌菌株混合培养的培养物肉汤，用上述的无氧稀释缓冲液进行系列稀释，将0.1毫升的各种稀释液用Conradi棒涂布到上述的EG-CM琼脂平板上并在无氧条件下在37℃培养48到72小时。然后对获得的菌落数进行计数并乘以稀释倍数得到有活力细菌的数目。
含有乳酸杆菌属细菌的混合培养物获得的有活力牙龈卟啉单胞菌细胞数目，相对于单独培养牙龈卟啉单胞菌获得的有活力牙龈卟啉单胞菌细胞数目(对照，100％)的比例，被视作牙龈卟啉单胞菌的生存率，生存率根据下述公式计算。牙龈卟啉单胞菌生存率的结果显示于表1。据此用由对照的生存率(100％)减去牙龈卟啉单胞菌的生存率(％)获得的值(％)来表示乳酸杆菌属细菌对牙龈卟啉单胞菌的抑制率。
生存率＝(牙龈卟啉单胞菌混合培养物中的细胞数)/(牙龈卟啉单胞菌单独培养物中的细胞数)×100
(3)主要龋齿致病细菌变异链球菌MT 8148菌株和不溶解葡萄糖产生的抑制试验
将5毫升体积的包含含有0.7％葡萄糖和3％蔗糖GAM肉汤(Nissui)的液体培养基装入离心样品收集管中，用变异链球菌MT 8148菌株单独(细胞数：1×106 CFU/毫升)(对照)或者它们分别和表1中显示的30株乳酸杆菌(细胞数：1×106CFU/毫升)的混合物接种。细菌在无氧条件下在37℃培养24小时后，使用琼脂平板法对各个培养物肉汤中有活力的变异链球菌细胞数进行计数，得到含有乳酸杆菌属细菌的混合培养物获得的有活力变异链球菌细胞数目，相对于单独培养变异链球菌获得的有活力变异链球菌细胞数目(对照，100％)的比例。
为了使用琼脂平板法对变异链球菌细胞数目计数，通过用TCYSB琼脂培养基(40克/升胰蛋白胨大豆琼脂(BBL)，0.3克/升半胱氨酸，5克/升酵母提取物，200克/升蔗糖，5克/升琼脂，10单位/毫升杆菌肽)作为筛选培养基使得只有变异链球菌细胞生长，然后对细菌数目进行计数。即取1毫升的各种上述培养物肉汤，用上述的无氧稀释缓冲液进行系列稀释，将0.1毫升的各种稀释液涂布到上述选择培养基平板上并在无氧条件下在37℃培养72小时。然后对产生的菌落进行计数并乘以稀释倍数得到有活力的细菌数目。
含有乳酸杆菌属细菌的混合培养物获得的有活力变异链球菌细胞数目，相对于单独培养变异链球菌获得的有活力变异链球菌细胞数目(对照，100％)的比例，被看作变异链球菌的生存率，生存率根据和上述(2)同样的方法计算。变异链球菌生存率的结果显示于表1。据此用由对照的生存率(100％)减去变异链球菌的生存率(％)获得的值(％)来表示乳酸杆菌属细菌对变异链球菌的抑制率。
此外，为测量不溶解葡聚糖，用刮铲充分地铲刮这些含有上述培养物肉汤有不溶解葡聚糖附着的样品收集管，将培养物肉汤3,000rpm离心15分钟以收集沉淀物。用PBS(磷酸盐缓冲溶液)清洗沉淀物两次，添加5毫升的PBS以获得测量样品。用酚/硫酸法对不溶解葡聚糖进行定量(Reiko Takahashi，生物化学实验方法，23卷，附录，研究糖的方法，蛋白质和糖链)。获得由和每种乳酸杆菌属细菌的混合培养物得到的不溶解葡聚糖量相对于由单独变异链球菌培养物得到的不溶解葡聚糖量的比例(产生不溶解葡聚糖的比例(％))，这些结果显示于表1。据此，用由变异链球菌产生的不溶解葡聚糖的产率减去由对照产生的不溶解葡聚糖的比率(100％)获得的值(％)来表示乳酸杆菌属细菌对变异链球菌产生不溶解葡聚糖的抑制率(％)。
表1：各种乳酸杆菌属的产乳酸杆菌的增殖特性，对牙龈卟啉单胞菌JCM 8525菌株和变异链球菌MT 8148菌株(体外)抑制效果和抑制不溶解葡聚糖产生的效果
  培养条件   有氧的   无氧的   有氧的   有氧的
  乳酸杆菌属   增值特性(6小时后的细胞数目/毫升)   牙龈卟啉单胞菌生存率(％)   变异链球菌生存率(％)   不溶解葡聚糖产率(％)
  (1)嗜酸乳酸杆菌A   5.0×107   101   72   60
  (2)嗜酸乳酸杆菌B   3.0×107   111   111   80
  (3)干酪乳酸杆菌TI1101   2.0×107   106   106   100
  (4)干酪乳酸杆菌TI1102   6.2×107   100   100   98
  (5)鼠李糖乳酸杆菌TI1003   7.2×107   111   111   69
  (6)加氏乳酸杆菌TI1004   8.2×108   55   55   11
  (7)加氏乳酸杆菌TI1005   4.6×108   60   60   8
  (8)加氏乳酸杆菌TI1006   6.0×108   65   65   15
  (9)约氏乳酸杆菌TI1008   4.0×108   82   4   70
  (10)唾液乳酸杆菌ATCC11741   1.8×109   5.2   0.9   28
  (11)唾液乳酸杆菌ATCC11742   1.2×109   10   1.2   30
  (12)唾液乳酸杆菌TI1101   2.0×109   5   0.5   26
  (13)唾液乳酸杆菌TI1102     3.0×109     1.0     0.1     31
  (14)唾液乳酸杆菌TI1103     2.2×109     5.2     2.0     28
  (15)唾液乳酸杆菌TI1104     1.6×109     10.2     1.8     28
  (16)唾液乳酸杆菌TI1109     1.8×109     5.0     3.0     26
  (17)唾液乳酸杆菌TI2700     2.6×109     0.5     4.0     28
  (18)唾液乳酸杆菌TI2703     2.0×109     4.8     2.6     26
  (19)唾液乳酸杆菌TI2704     2.0×109     5.6     3.2     32
  (20)唾液乳酸杆菌TI2705     3.0×109     0.1     1.0     28
  (21)唾液乳酸杆菌TI2706     3.2×109     0.1     0.8     22
  (22)唾液乳酸杆菌TI2707     2.4×109     0.2     2.8     30
  (23)唾液乳酸杆菌TI2708     2.2×109     0.5     2.2     30
  (24)唾液乳酸杆菌TI2709     3.0×109     0.05     1.0     28
  (25)唾液乳酸杆菌TI2710     3.6×109     0.05     0.5     25
  (26)唾液乳酸杆菌TI2711     4.0×109     0.002     0.05     20
  (27)唾液乳酸杆菌TI2714     2.2×109     0.005     0.1     21
  (28)唾液乳酸杆菌TI2715     2.1×109     10.1     0.1     26
  (29)唾液乳酸杆菌TI2721     3.0×109     1.0     0.08     22
  (30)唾液乳酸杆菌TI2722     3.2×109     2.0     0.08     24
  (31)对照*     100     100     100
*对照被作为100％，是各种通过单独培养牙龈卟啉单胞菌和变异链球菌得到的细胞数目。
从表1显示的结果可以清楚地知道，在30株乳酸杆菌属的细菌中，显示出最好的增殖特性，最强烈地抑制牙周疾病致病细菌牙龈卟啉单胞菌和致龋齿细菌变异链球菌的繁殖，使其产生最少量不溶解葡聚糖的优良菌株是26号唾液乳酸杆菌TI 2711菌株。
试验实施例2：唾液乳酸杆菌TI 2711菌株在无菌小鼠口腔中对牙龈卟啉单胞菌(牙周疾病致病细菌)和变异链球菌(致龋齿细菌)的体内抑制效果
(1)试验方法
实验1
将4周大的无菌BALB/C小鼠分成对照组(感染后非给药组，n＝10)和牙周疾病致病细菌感染后给药组(n＝10)。将1×109CFU/0.5毫升的牙周疾病致病细菌牙龈卟啉单胞菌JCM 8525分别接种到感染后给药组和对照组小鼠的口腔，连续三天，总共三次。然后在感染确立一周后，再将本发明的乳酸杆菌菌株唾液乳酸杆菌TI 2711菌株(细胞数：1×109CFU/0.5毫升)同样给予感染后给药组，连续三天，总共三次。
此后，在1周，2周和4周后分别用饱含无菌稀释缓冲液的无菌棉拭充分地擦拭各个感染小鼠口腔内部以收集口腔的全部唾液，对唾液中含有的牙龈卟啉单胞菌细胞数目进行计数。以和试验实施例1，(2)中的同样方法对牙龈卟啉单胞菌细胞数目进行计数。
实验2
将4周大的无菌BALB/C小鼠分成对照组(感染后非给药组，n＝10)和致龋齿细菌感染后给药组(n＝10)。将1×109CFU/0.5毫升的致龋齿细菌变异链球菌MT 8148分别接种到感染后给药组和对照组小鼠的口腔，连续三天，总共三次。然后在感染确立一周后，再将本发明的乳酸杆菌菌株唾液乳酸杆菌TI 2711菌株(细胞数：1×109CFU/0.5毫升)同样给予感染后给药组，连续三天，总共三次。
此后，在1周，2周和4周后分别用饱含无菌稀释缓冲液的无菌棉拭充分地擦拭各个感染小鼠口腔内部以收集口腔的全部唾液，对唾液中含有的变异链球菌细胞数目进行计数。以和试验实施例1，(3)中的同样方法对变异链球菌细胞数目进行计数。
如上所述的实验1和2体内实验方案的要点显示于图10中。另外，实验1和2的结果显示于图1和图2中。
(试验结果)
实验1的结果清楚地显示于图1中，比较本发明的乳酸杆菌菌株唾液乳酸杆菌TI 2711菌株对无菌BALB/C小鼠给药前后牙周疾病致病细菌牙龈卟啉单胞菌的细菌数，牙龈卟啉单胞菌的细菌数给药后明显减少，基于Wilcoxon法在显著性检验中具有P＜0.001的显著差异。
从显示于附图2的实验2的结果可以清楚地看出，当用本发明的乳酸杆菌菌株唾液乳酸杆菌TI 2711菌株对无菌小鼠(BALB/C)给药4周时，研究了致龋齿细菌变异链球菌MT 8148菌株细胞数目的变化，结果显示细菌数给药4周后和给药前比较已经明显减少，甚至在第4周后细胞数目仍继续减少并具有统计显著性(P＜0.001)。
试验实施例3
临床试验程序
根据下述程序在书面知情同意的情况下对57名健康志愿者进行了临床试验。
制备每片含有140毫克(细菌数：1×108CFU/毫升)本发明的乳酸杆菌唾液乳酸杆菌TI 2711菌株冻干细胞粉末的糖味片剂，并令各个志愿者在饭间服用，每次5片每天5次，即每天总共25片。各个志愿者在总共两个月的服用期每天服用片剂，收集唾液，测量口臭并进行医生问讯。
在服用前进行第1次检查，收集唾液，测量口臭(口气分析仪C21，由美国Interscan公司制造)并进行医生问讯。在服用4周后同样进行第2次检查，在服用8周后进行第3次最终检查。
这个试验实施例中的临床试验程序要点显示于图11。
(a)对唾液中细胞数目进行计数的方法
向100微升体积从每个健康志愿者(n＝57)收集的唾液中加入900微升无菌无氧稀释缓冲液(见试验实施例1，(1))得到贮存溶液(×1倍溶液)，将此溶液系列稀释得到×3，×5和×6倍稀释溶液。定量0.1毫升体积的每种稀释溶液，用Conradi棒涂布并铺展在预先制备的如下所示选择培养基的琼脂平板培养基上。此后，在无氧条件下在37℃培养72小时，对出现菌落数进行计数得到总细菌数目，乳酸杆菌数目，致牙周疾病细菌数目和致龋齿细菌组的细菌数目。然后挑取一接种环各个菌落并进行革兰氏染色，在显微镜下确证结果。
选择培养基
总细菌数目：BL琼脂培养基和EG琼脂培养基
乳酸杆菌：改良的LBS琼脂培养基
致牙周疾病细菌(BPAR＝革兰氏阴性黑色-着色厌氧杆菌)：EG-GM琼脂培养基，BL琼脂培养基
致龋齿细菌组细菌(变异链球菌，茸毛链球菌)：TCYSB琼脂培养基
(b)不溶解葡聚糖的定量测定：使用酚/硫酸法。
(c)口臭的测量：使用口气分析仪C21(由美国Interscan公司制造)，且测定温度20℃
(d)pH值的测定：小型pH计(Horiba Seisakusho公司制造)
(试验结果)
(1)口腔总细菌数
得到的总细菌数结果显示于图3中。如图3所示，服用糖味片剂之前和服用4周后人口腔细菌总数目没有显著差异。
(2)口腔牙周疾病致病细菌数目的变化(BPAR＝革兰氏阴性黑色-着色厌氧杆菌)
得到的口腔牙周疾病致病细菌数目显示于图4中。如图4所示，服用前8人显示出细胞数低于检测极限，平均值为106.6±1.3CFU/总唾液，而在服用4周后，具有细胞数目低于检测极限的人的数目显著增加为30，而平均值为105.3±1.6CFU/总唾液(P＜0.0001)。因此，服用乳酸杆菌唾液乳酸杆菌TI 2711菌株显示出能消除和抑制病原细菌即致龋齿细菌。
(3)口腔致龋齿细菌数目的变化(革兰氏阳性变异链球菌)
龋齿细菌组细胞数目得到的结果显示于图5。如图5所示，服用前后唾液中变异链球菌细胞数目没有表现出显著差异。
(4)口腔乳酸杆菌数目的变化
口腔乳酸杆菌细胞数目得到的结果显示于图6。如图6所示，服用前后口腔乳酸杆菌细胞数目没有表现出显著差异。
(5)唾液pH值的变化
唾液pH值变化的测量结果显示于图7。在服用前，57人显示出pH值的显著分布(pH值偏差度)，平均值为pH 7.0±0.7。然而在服用4周后，观察到pH值的分布范围减小，平均值变为pH 7.0±0.2，即大约和血液相同的pH值。即显示出唾液pH值保持在正常水平。服用8周后也观察到这一现象，pH值保持在正常水平，分布范围更小。这些结果构成的数据完全消除了对给予乳酸杆菌后会促进乳酸产生而增进龋齿发展的怀疑。因此这些结果具有非常重要的临床意义。
(6)唾液中产生的不溶解葡聚糖量的变化
唾液中产生的不溶解葡聚糖量的测量结果显示于图8。如图8所示，服用前唾液中不溶解葡聚糖的量平均为9.9±6.0毫克/总唾液，然而，在服用4周后，平均值变为7.6±5.8毫克/总唾液(P＜0.05)。因此可以看出统计学的显著性差异。此外，在8周后，平均值变为4.4±2.2毫克/总唾液(P＜0.001)，因此可以看出服用乳酸杆菌唾液乳酸杆菌TI 2711菌株的剂量反应相关性。这构成由此临床试验确立的作为本发明乳酸杆菌菌株有效性的部分证据。即发现本发明的乳酸杆菌菌株能够防止作为牙菌斑主要物质的不溶解葡聚糖的产生，根除厌氧的牙周疾病致病细菌和致龋齿细菌栖居部位，因此可能是抑制诸如龋齿和牙周疾病等临床感染性疾病发展、复发和恶化的手段。此外，强烈暗示长期服用乳酸杆菌唾液乳酸杆菌TI 2711菌株可使唾液pH值处于如上所述的正常水平并使牙菌斑难以形成，因此能够抑制口腔细菌在牙菌斑内部产生酸，可用于预防龋齿和牙周疾病和治疗发病较轻的病例。
(7)使用口气分析仪测量口臭的结果
为测量口臭，使用口气分析仪测量健康志愿者呼出的挥发性硫化物。产生口臭的一个主要原因是牙周疾病致病细菌降解蛋白质。即，既然牙周疾病致病细菌具有明显高的蛋白酶活性，它们很容易降解口腔内构成细菌主要营养来源的食品碎屑中的蛋白质，产生导致口臭的物质，即诸如硫醇和硫化物(包括H2S和CH3SH)等挥发性硫化合物(VSC)。
使用口气分析仪在室温(20℃)测量在服用含有本发明乳酸杆菌菌株的糖味片剂前57个健康志愿者呼出的挥发性硫化物量，在服用后对20个志愿者的继续测量显示出较服用前有65ppb(ppb＝十亿分之一)或者更大的RU值(反应单位)。结果显示于图9。
如图9所示，这20个志愿者口臭的RU值在服用前处于164±96ppb(平均值±标准方差)的范围内，但是在服用后，该值减小为94±21ppb，可看出统计学上非常显著的差异(P＜0.005)。
此外，在8周后测量，RU值减小为90±21ppb，有13个正常的志愿者显示出65ppb或者更小的值(P＜0.001)而没有口臭。
即基于服用前具有口臭的志愿者数目，被看作是100％，该数目在服用4周后减小到52％，而在服用8周后更减少到38％。
这些结果充分地显示出剂量反应相关性，其表明了长期服用本发明的乳酸杆菌菌株能够消除口臭。
另外，本发明的乳酸杆菌菌株唾液乳酸杆菌TI 2711菌株抑制牙周疾病致病细菌的事实和抑制口臭产生的事实显示出良好的相关性。
57个志愿者的医生询问的结果，在所有病例中没有发现腹部症状。
试验实施例4
添加不同的寡聚糖和糖醇和接种唾液乳酸杆菌TI 2711菌株对抑制变异链球菌不溶解葡聚糖产生(体外)的效果。
试验方法
将5％的木糖醇，赤藓糖醇和山梨醇等糖醇，和果糖-寡聚糖和蔗果三糖等寡聚糖分别加到含有GAM肉汤(Nissui)作为基本培养基以及含有0.7％葡萄糖和0.3％蔗糖的液体培养基中，将1×107CFU/毫升的变异链球菌MT 8148菌株分别接种到各个培养基中。然后含氧的培养基在37℃培养24小时。
另一方面，将1×107CFU/毫升的变异链球菌MT 8148菌株接种到上述分别含有5％糖醇或者寡聚糖的培养基中，再将1×107CFU/毫升的乳酸杆菌唾液乳酸杆菌TI 2711菌株接种到培养基中。然后，同样将含氧的培养基在37℃培养24小时。在培养结束后，测定两种类型培养物的变异链球菌MT 8148菌株细胞数和不溶解葡聚糖的量(根据试验实施例1叙述的方法)。结果显示于表2。
试验结果
如表2所示，在糖醇和寡聚糖中，最强烈地抑制不溶解葡聚糖产生的物质是赤藓糖醇，赤藓糖醇单独显示出60％的抑制。然而，接种唾液乳酸杆菌TI 2711菌株的混合培养物中，可观察到赤藓糖醇和唾液乳酸杆菌TI 2711菌株的辅助或者协同效果，即基于不接种唾液乳酸杆菌得到的不溶解葡聚糖量被视为100％，可观察到90％的抑制，因此可获得更好的结果。
表2
  寡聚糖和糖醇(5％添加)               未接种唾液乳酸杆菌                   接种唾液乳酸杆菌
  变异链球菌有活力的细胞数(CFU/毫升)   不溶解葡聚糖的量(微克/毫升)   变异链球菌有活力的细胞数(CFU/毫升)   不溶解葡聚糖的量(微克/毫升)
  木糖醇   4.0×105   5,992   5.0×105   1,996
  赤藓糖醇   1.0×105   4,324   1.0×105   962
  山梨醇   4.0×105   4,384   3.0×105   1,691
  果糖-寡聚糖   4.0×105   6,659   2.0×105   1,892
  蔗果三糖   5.0×105   7,392   2.0×105   2,886
  对照(基础培养基)   4.0×105   11,160   2.0×105   2,394
实施例1：唾液乳酸杆菌TI 2711菌株干燥细胞的制备
将唾液乳酸杆菌TI 2711菌株接种到含有0.3％碳酸钙的Briggs新鲜肉汤中，在37℃静置培养18小时。培养结束后，培养物在7,000rpm离心15分钟以得到浓缩1/100体积的细胞。
然后，将含有5％(重量)谷氨酸钠，5％(重量)可溶性淀粉，5％(重量)蔗糖的分散介质和浓缩的细胞以等量混合，将混合物pH值调整到7.0，在-40℃或者更低温度冰冻并冻干。将获得的冻干细胞通过60目的筛网制成粉末，以获得本发明的乳酸杆菌粉末。至于本发明细菌的保藏稳定性，甚至当乳酸杆菌粉末在封闭条件下于室温(24℃)贮存10个月，也没有可见的细胞数目减少。
实施例2：药用活细菌制剂(片剂)的制备
根据第12次修定的日本药典指南，用于药物制剂的总则，“片剂”的规定，将2克在实施例1中制备的唾液乳酸杆菌TI 2711菌株干燥细胞粉末(细胞数：5×109CFU/克)，161克的乳糖(JapanesePharmacopoeia)，116克淀粉(Japanese Pharmacopoeia)20克的粘合剂聚乙烯基吡咯烷酮(Japanese Pharmacopoeia)和作为润滑剂的0.8克硬脂酸镁(Japanese Pharmacopoeia)加到一起并均匀混合，用片剂制造设备将混合物压缩成模以得到290克的普通药片(每片300毫克)。
实施例3：含有乳酸杆菌的食品的制备(糖味片剂)
参考第12次修定的日本药典指南，用于药物制剂的总则，“片剂”的规定，将0.7克在实施例1中制备的唾液乳酸杆菌TI 2711菌株干燥细胞粉末(细胞数：5×109CFU/克)，47克赤藓糖醇，47克山梨醇，2.5克1-薄荷醇，1.5克调味剂(酸橙)和作为润滑剂的1.3克在日本规定为食品添加剂的脂肪酸糖酯，加到一起并均匀混合，用片剂制造设备将混合物压缩成模以得到95克的普通药片(每片300毫克)。
实施例4：含有乳酸杆菌的食品(口香糖)的制备
将0.7克量的唾液乳酸杆菌TI 2711菌株干燥细胞粉末(细胞数：5×109CFU/克)，160克赤藓糖醇，160克山梨醇，20克作为调味剂的薄荷油和150克胶基(食品添加剂)预先称重。使用揉面团机将胶基充分揉和以生产口香糖，在胶基揉和时依次部分加入预先制备的作为甜味剂的赤藓糖醇和山梨醇的均匀混合物，和唾液乳酸杆菌TI 2711菌株干燥细胞粉末，均匀揉和，最后加入作为调味剂的薄荷油并均匀揉和。在揉和结束后，从揉面团机中移去一定量的口香糖并使用滚轧机滚轧，以制备具有3毫米厚度的口香糖片。口香糖片在恒温室中陈化2天，切成一定大小的销售的口香糖片以制备口香糖。
实施例5：含有乳酸杆菌的食品(发酵牛奶)的制备
使用发酵细菌嗜酸乳酸杆菌和唾液乳酸杆菌TI 2711菌株混合培养物制备
将发酵牛奶的发酵细菌嗜酸乳酸杆菌接种到含有23克脱脂牛奶，1.0克酵母提取物，0.06克抗坏血酸的减脱脂培养基中，在37℃静置培养16小时以获得大量的发酵剂。
将实施例1中获得的唾液乳酸杆菌TI 2711菌株培养物肉汤和如上制备的大量发酵剂培养物肉汤各以5％的量接种到含有新鲜牛奶和脱脂牛奶的原材料混合物中，在37℃培养16小时以获得发酵牛奶。用本发明的菌株制备的发酵牛奶显示出优良的气味和味道，且是被高度接受的产品。
工业实用性
用本发明的唾液乳酸杆菌TI 2711菌株，使用无菌小鼠进行体外试验的结果，以及长期临床试验的结果(n＝57)表明，在所有这些试验中证实了该菌株对于口腔微生物群落正常化，抑制牙周疾病致病细菌和致龋齿细菌和防治口臭产生的效果。
即通过服用或者摄取本发明的菌株，口腔微生物群落能够正常化，结果牙周疾病致病细菌和致龋齿细菌能够被抑制，而因此口臭的产生能够被抑制。因此，本发明的菌株可用作含有乳酸杆菌的活细菌制品或者食品的成分，以用来保持唾液的pH值在生理正常的水平，预防和治疗牙龈炎、牙周炎和牙周疾病，预防和治疗龋齿，预防口臭的产生并消除口臭。

Claims (12)

1.一种含有乳酸杆菌用于使口腔内微生物群落正常化的活细菌制剂或者食品，其含有作为活性成分的乳酸杆菌唾液乳酸杆菌(Lactobacillus salivarius)。
2.一种含有乳酸杆菌用于预防和治疗牙龈炎、牙周炎和牙周疾病的活细菌制剂或者食品，其含有作为活性成分的乳酸杆菌唾液乳酸杆菌。
3.一种含有乳酸杆菌用于预防或者治疗龋齿的活细菌制剂或者食品，其含有作为活性成分的乳酸杆菌唾液乳酸杆菌。
4.一种含有乳酸杆菌用于防止口臭产生和消除口臭的活细菌制剂或者食品，其含有作为活性成分的乳酸杆菌唾液乳酸杆菌。
5.根据权利要求1到4任一项的含有乳酸杆菌的活细菌制剂或者食品，其中乳酸杆菌是唾液乳酸杆菌TI 2711菌株(FERM BP-7974)。
6.一种乳酸杆菌唾液乳酸杆菌TI 2711菌株(FERM BP-7974)。
7.一种由乳酸杆菌唾液乳酸杆菌TI 2711菌株(FERM BP-7974)纯培养获得的细胞。
8.一种通过干燥乳酸杆菌唾液乳酸杆菌TI 2711菌株(FERMBP-7974)的细胞获得的干细胞。
9.乳酸杆菌唾液乳酸杆菌TI 2711菌株(FERM BP-7974)在制备含有乳酸杆菌的活细菌制剂或食品中的应用。
10.一种含有乳酸杆菌唾液乳酸杆菌TI 2711菌株(FERM BP-7974)，以及具有不同于该菌株作用机制的活性成分的组合物。
11.根据权利要求10的组合物，其含有乳酸杆菌唾液乳酸杆菌TI2711菌株(FERM BP-7974)，以及选自糖醇和寡聚糖的物质。
12.根据权利要求11的组合物，其含有乳酸杆菌唾液乳酸杆菌TI2711菌株(FERM BP-7974)，以及赤藓糖醇。
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