TWI829090B

TWI829090B - 抗憂鬱劑、抗老化劑及抗肥胖劑

Info

Publication number: TWI829090B
Application number: TW111104753A
Authority: TW
Inventors: 高橋知也; 溫淑芳; 林士弘; 吳佳佳; 張志萱; 謝岱儒; 李明翰; 呂亦晃
Original assignee: 日商安露莎慧央集團股份有限公司
Priority date: 2021-05-11
Filing date: 2022-02-09
Publication date: 2024-01-11
Also published as: JP7113550B1; TW202243684A; JP2022174415A

Abstract

本發明的課題為判明乳酸菌之Lactobacillus kosoi10H株所具有的新穎的性質，根據該新穎的性質提供新的用途。

本發明的解決手段為提供一種抗憂鬱劑、抗老化劑或抗肥胖劑，含有以寄存編號NITE BP-02811寄存的乳酸菌kosoi(Lactobacillus kosoi)10H株的菌體作為有效成分。

Description

抗憂鬱劑、抗老化劑及抗肥胖劑

本發明是關於含有乳酸菌之Lactobacillus kosoi10H株的菌體之抗憂鬱劑、抗老化劑及抗肥胖劑。

在過去，已知有乳酸菌或其發酵產物(fermentation product)具有各式各樣的生理機能(physiological function)。例如在專利文獻1記載有源自植物的屬於乳酸菌屬(Lactobacillus)等的乳酸菌具有腸管免疫活性化作用或派亞氏淋巴叢細胞(Peyer's patch cell)的IgA抗體產生促進作用。而且，在專利文獻2有如下的報告：胚芽乳酸菌(Lactobacillus plantarum)所產生的活性物質有助於Cisd2基因表現(gene expression)的增加、粒線體損傷(mitochondrial damage)的減少、延遲神經退化(neurodegeneration)及肌肉減少症(sarcopenia)等的老化狀態而促進長壽。再者，在專利文獻3記載有從韓式泡菜分離出的包含特定的乳酸菌株的組成物對老化與失智症(dementia)具有預防或治療效果。

本申請人發現由蔬菜黑糖發酵液單離的乳酸菌之Lactobacillus kosoi10H株為具有與其他的乳酸菌不同的新穎的基因體構造(genome structure)之好果糖乳酸菌 (fructophilic lactic acid bacteria)，及具有優良的免疫賦活作用(參照專利文獻4)。

[專利文獻1]日本國特開2007-308419號公報

[專利文獻2]日本國特開2020-59694號公報

[專利文獻3]日本國特許第6009080號公報

[專利文獻4]日本國特開2020-92704號公報

在專利文獻2記載的活性物質可考慮為由胚芽乳酸菌GKM3之特定的菌株產生，根據使長壽基因的表現增加的作用。在專利文獻3中記載有針對從韓式泡菜分離出的為數眾多的乳酸菌株進行檢討的結果，僅戊糖乳酸菌(Lactobacillus pentosus)變種植物乳酸菌(plantarum)C29等的特定的菌株具有抗氧化、抗老化及失智症的預防或治療效果。另一方面，在專利文獻4記載的Lactobacillus kosoi10H株對其他的乳酸菌具有比較小的基因體，同時具有萄葡糖(glucose)的資化能力低，以果糖(fructose)當作適當的碳源(carbon source)進行資化之特徵。雖然揭示該菌株在腸管黏膜中促進IgA的產生，具有優良的免疫賦活作用，但是關於其他的作用則不明確。

本發明其課題為判明這種乳酸菌之Lactobacillus kosoi10H株所具有的新穎的性質，根據該新穎的性質提供新的用途。

為了解決上述課題，本發明人們就 Lactobacillus kosoi10H株的新的有用性專心致志檢討的結果發現，在使用動物模式(animal model)的實驗系統中，包含Lactobacillus kosoi10H株的菌體的組成物具有抗憂鬱作用、抗老化作用及抗肥胖作用而完成了本發明。也就是說，本發明包含以下的實施形態。

(1)、一種抗憂鬱劑，含有以寄存編號(deposit number)NITE BP-02811寄存的乳酸菌kosoi(Lactobacillus kosoi)10H株的菌體作為有效成分。

(2)、如(1)之抗憂鬱劑，其中菌體為死菌體。

(3)、如(1)或(2)之抗憂鬱劑，其中為醫藥品、飲食品或配合於醫藥品、飲食品之有效成分組成物的形態。

(4)、一種抗老化劑，含有以寄存編號NITE BP-02811寄存的乳酸菌kosoi(Lactobacillus kosoi)10H株的菌體作為有效成分。

(5)、如(4)之抗老化劑，其中菌體為死菌體。

(6)、如(4)或(5)之抗老化劑，其中為醫藥品、飲食品或配合於醫藥品、飲食品之有效成分組成物的形態。

(7)、如(6)之抗老化劑，其中前述飲食品為美容用飲食品或健康增進用飲食品。

(8)、一種抗肥胖劑，含有以寄存編號NITE BP-02811寄存的乳酸菌kosoi(Lactobacillus kosoi)10H株的菌體作為有效成分。

(9)、一種乳酸菌kosoi(Lactobacillus kosoi)10H株菌體的使用，係用以改善人類或非人類哺乳動物中的憂鬱症狀 (depressive symptom)，用以製造抗老化用或抗肥胖用的醫藥品、飲食品或配合於醫藥品、飲食品之有效成分組成物。

依照本發明，作為乳酸菌kosoi(Lactobacillus kosoi)10H株所具有的新穎的用途，可提供包含該菌體之抗憂鬱劑、抗老化劑及抗肥胖劑及美容用飲食品、健康增進用飲食品。

圖1是顯示本發明的有效成分組成物的製程之流程圖。

圖2是就本發明的有效成分組成物，顯示進行使用憂鬱動物模式的高架十字測試的結果之圖表。將橫軸所示的投予各試樣的憂鬱誘發小鼠移動於高架十字迷宮(elevated plus maze)後的總距離顯示於縱軸。

圖3是就本發明的有效成分組成物等，顯示進行使用憂鬱動物模式的高架十字測試的結果之圖表。將橫軸所示的投予各試樣的憂鬱誘發小鼠滯留於高架十字迷宮的開放部的時間的比例顯示於縱軸。

圖4是就本發明的有效成分組成物等，顯示測定老化促進小鼠(senescence accelerated mouse)所產生的體重增加率的結果之圖表。

圖5是顯示投予本發明的有效成分組成物等之老化促進小鼠的試驗開始第133天的體重增加率的結果之圖表。

圖6是顯示投予本發明的有效成分組成物等之老化促進小鼠的11項目的老化度評價分數的平均值的經時變化之圖表。

圖7是顯示投予本發明的有效成分組成物等之老化促進小鼠的22週齡中的11項目的老化度評價分數的平均值之圖表。

圖8是顯示投予本發明的有效成分組成物等之老化促進小鼠的22週齡中的毛的光澤分數之圖表。

圖9是顯示投予本發明的有效成分組成物等之老化促進小鼠的22週齡中的腦勻漿(brain homogenate)上清的類澱粉蛋白β(amyloid β)的濃度之圖表。

圖10是顯示投予本發明的有效成分組成物等之老化促進小鼠的22週齡中的腦勻漿上清的IL-1β的量之圖表。

接著，就本發明的各實施形態參照圖式進行說明。此外，在以下說明的各實施形態不是限定與申請專利範圍有關的發明，而且，在各實施形態中說明的諸要素及其組合的全部不一定對本發明的解決手段是必須。

(I)、有效成分的乳酸菌

本發明的一實施形態中的有效成分是由蔬菜黑糖發酵液單離的特定的乳酸菌株及其變異株(variant)。較佳為由商品名[Georina(註冊商標)酵素])的培養液得到的屬於乳酸菌屬的菌，更佳為乳酸菌kosoi(Lactobacillus kosoi)10H株(寄存編號NITE BP-02811)或其變異株。[變異株]是指意味著包含對特定的菌株，在藉由對熟習該項技術者周知的方法熟習該項技術者不給予其主要的性質變化的範圍不使其變異者，或者若與其同等的話熟習該項技術者可確認者。

此外，乳酸菌kosoi(Lactobacillus kosoi)10H株係以平成30年(2018年)11月7日(原寄存日)寄存於日本國獨立行政法人製品評價技術基盤機構、專利微生物寄存中心(292-0818日本國千葉県木更津市上總鎌足2-5-8 122號室)。寄存編號為NITE BP-02811(以下稱本菌株為[10H株])。而且，該10H株的分類學的性質係記載於由本發明人們所發表的論文(Chiou T-Y et al，Antonie van Leeuwenhoek(2018)、111：1149-1156)及專利文獻4，其全體透過參照併入本說明書而構成。

(乳酸菌kosoi10H株的特徵)

本菌株可考慮為作為最近發現的好果糖乳酸菌(FLAB：Fructophilic lactic acid bacteria)，從習知的乳酸菌進化而來的細菌(Filannino et al.“Fructose-rich niches traced the evolution of lactic acid bacteria toward fructophilic species”Critical Reviews in Microbiology、Vol.45、No.1、2019、pp.65-81)。FLAB棲息在以花或水果、發酵食品或果糖為主食的昆蟲的消化管等，果糖豐富的環境。據說FLAB為不是以葡萄糖而是喜好以果糖作為碳源的異型發酵性的乳酸菌，而藉由追加氧等的電子受體(electron acceptor)基質促進在葡萄糖存在下的生長。10H株對其他的FLAB及乳酸菌具有比較小的基因體大小(genome size)與低的GC含量(參照Filannino et al.的 Figure3)。因此，將乳酸菌屬再分類，將本菌株分類為當作新的屬之Apilactobacillus屬也被提出(參照Zheng et al.International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology、Vol.70、No.4、2020、pp.1-77)。因此，本發明的有效成分具有與習知的乳酸菌不同的菌體成分，有發揮根據該菌體成分的新的作用的可能性。

(II)、抗憂鬱劑

在本說明書中，用語[憂鬱]是指廣泛被定義者，抑鬱情緒、以興趣或喜悅的顯著的喪失為主症狀，進而包含睡眠障礙或思考、集中力的減退、自殺意念或自殺企圖等的情緒障礙或精神障礙，不管對該等發病的生理學的背景或藥理學的背景。而且，用語[憂鬱]也特別包含焦慮狀態(anxiety state)。因此，用語[抗憂鬱劑]是指廣泛為該等的障礙的處置用的預防劑或治療劑。

本實施形態的抗憂鬱劑係意味著為了改善對象者的憂鬱狀態之有效的組成物，含有以乳酸菌kosoi(Lactobacillus kosoi)10H株(寄存編號NITE BP-02811)的菌體作為有效成分。在本說明書所稱的[改善]此一用語包含在人類或非人類哺乳動物中產生的憂鬱狀態暫時地、間歇地或持續地減輕、緩和、降低或消失。較佳為包含恢復到無憂鬱狀態的正常的狀態或接近正常的狀態。因此，本實施形態的抗憂鬱劑如以下所詳述的，包含醫藥品、飲食品或配合於醫藥品、飲食品之有效成分組成物的形態等。而且，醫藥品、飲食品之中也以健康食品較佳，可使用於用以使具有憂鬱狀態的人類或非人類哺乳動物中的該症狀減輕、緩和、降低或消失。

(III)、抗老化劑及抗肥胖劑

用語[抗老化]是指廣泛被定義者，緩和、改善、抑制、預防及治療斑、皺紋和暗沉等的皮膚疾病、心肌梗塞(myocardial infarction)、腦梗塞(cerebral infarction)、骨質疏鬆症(osteoporosis)、阿茲海默症(Alzheimer’s disease)、類風溼性關節炎(Rheumatoid arthritis)、糖尿病性血管病變(diabetic angiopathy)、白內障(cataract)等的老化症狀。較佳為指具有皮膚的老化預防或改善作用。具體而言，指預防或改善外部因素(紫外線、空氣的乾燥等)或隨著老化之皮膚的保濕功能或彈性的降低、肌膚的張力和光澤艷麗的減少、粗糙、皺紋、暗沉等的老化症狀。用語[抗老化劑]是指包含使用於這種抗老化用的藥劑。而且，可考慮為因上述的老化症狀與代謝功能的降低或伴隨著能量的過度攝取之體重增加(肥胖)也有關聯，故為了發揮抗老化作用而抑制肥胖也是有用。因此，作為本發明的一實施形態係提供一種抗肥胖劑，含有以乳酸菌kosoi(Lactobacillus kosoi)10H株的菌體作為有效成分。

(IV)、劑的形態

本實施形態的抗憂鬱劑、抗老化劑或抗肥胖劑能以醫藥品、飲食品或配合於醫藥品、飲食品之有效成分組成物的形態使用。作為該有效成分組成物使用的情形，依照乳酸菌培養的習用方法培養有效成分的乳酸菌菌體，不僅原封不動地使用由所得到的培養物藉由離心分離等的集菌手段分離者，也能使用：該培養、發酵液(包含培養上清)、其培養物的粗精製品或精製品、該等的冷凍乾燥品或者使用酵素或物理的手段處理菌體之細胞質或細胞壁劃分。

而且，菌體不僅為活菌體，也可以為藉由通常的一般的加熱滅菌操作而被滅菌者。因乳酸菌kosoi(Lactobacillus kosoi)10H株在高糖濃度(高滲透壓)之過嚴的生長條件下生長，故被預想具有堅固的細胞表層構造。加熱處理較佳為65~85℃ 1分以上，例如10分、30分或60分左右，更佳為70~75℃、1分以上，例如5分、10分或30分左右。即使是被加熱處理過的菌體，不僅可期待抗憂鬱、抗老化及抗肥胖作用，活菌的情形也有在製品製造以後的配送時或陳列時引起形態變化的可能性，故不更進一步引起形態變化的加熱滅菌過的死菌體可適合使用。

而且，在本實施形態的有效成分組成物中更依照需要也能含有適合10H株的維持、增殖等的營養成分的適量。作為該營養成分的具體例可舉出：微生物的培養用的培養基所利用之例如果糖、葡萄糖、山梨糖(sorbose)、核糖(ribose)、來蘇糖(lyxose)、木糖(xylose)、阿拉伯糖(arabinose)、乳果糖(lactulose)、蔗糖(sucrose)等的碳源；例如酵母萃(yeast extract)、蛋白腖(peptone)等的氮源；維生素類、礦物類、微量金屬元素、其他的營養成分等的各成分。作為維生素類可舉例說明例如維生素B、維生素D、維生素C、維生素E、維生素K等。作為微量金屬元素可舉例說明例如鋅、硒等。作為其他的營養成分可舉例說明例如乳果寡醣(lactosucrose)、大豆寡醣(soybean oligosaccharide)、乳酮糖(lactulose)、乳糖醇(Lactitol)、寡果醣(fructooligosaccharide)、半乳寡醣(galactooligosaccharide)等的各種寡醣(oligosaccharide)。該等寡醣的配合量未被特別限定，惟通常在本實施形態的組成物中選自於成為1~30重量%左右的量範圍較佳。

給予本實施形態的有效成分組成物中的10H株的配合量一般在組成物100g中可由菌數成為10⁸~10¹³個左右(無須為活菌數)的量適宜選擇。活菌數的測定可藉由使用包含10%果糖的MRS液體培養基的限界稀釋培養法(limiting dilution-culture method)求出。因該活菌數與濁度相關，故若預先求出活菌數與濁度的相關，則取代活菌數的測定可藉由測定濁度計算上述活菌數。本實施形態的有效成分組成物適宜配合適當的可食性載體(食品原料)、製藥上容許的載體，調製成如後述的飲食品、醫藥品等的形態較佳。以下就包含該有效成分組成物的醫藥品及飲食品的形態具體地進行說明。

(醫藥品)

本實施形態的抗憂鬱劑、抗老化劑或抗肥胖劑以醫藥品的情形係使用與10H株一起在製劑學上被容許的適當的製劑載體，被調製成一般的醫藥組成物的形態而被實用。作為該製劑載體通常可舉例說明在該領域被使用之已知的填充劑、增量劑、結合劑、保濕劑(moisturizer)、崩散劑 (disintegrating agent)、表面活性劑、潤滑劑等的稀釋劑或賦形劑(excipient)。該等係依照所得到的製劑的給藥單位形態被適宜選擇使用。

作為醫藥組成物的給藥單位形態可選擇各種形態，惟較佳可舉出口服給藥用製劑、外用給藥製劑。作為口服給藥製劑的代表的製劑可舉出：錠劑、丸劑、散劑、液劑、懸濁劑、乳劑、細粒劑、膠囊劑等。

在成形成錠劑的形態時，作為上述製劑載體例如可使用：乳糖、白糖、氯化鈉、葡萄糖、尿素、澱粉、碳酸鈣、高嶺土(kaolin)、結晶纖維素、矽酸、磷酸鉀等的賦形劑；水、乙醇、丙醇、單糖漿(simple syrup)、葡萄糖液、澱粉液、明膠(gelatin)溶液、羧甲基纖維素(carboxymethyl cellulose)、羥丙基纖維素(hydroxypropyl cellulose)、甲基纖維素(methylcellulose)、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone)等的結合劑；羧甲基纖維素鈉(carboxymethylcellulose sodium)、羧甲基纖維素鈣(carboxymethylcellulose calcium)、低取代度羥丙基纖維素(hydroxypropyl cellulose with low degree of substitution)、乾燥澱粉、海藻酸鈉(sodium alginate)、洋菜粉末(agar powder)、昆布糖粉末(laminaran powder)、碳酸氫鈉(sodium bicarbonate)、碳酸鈣等的崩散劑；聚氧乙烯去水山梨醇脂肪酸酯類(polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters)、月桂硫酸鈉(sodium lauryl sulfate)、硬脂酸單甘油酯(monoglyceride stearate)等的界面活性劑；白糖、硬酯 (stearin)、可可脂(cocoa butter)、氫化油(hydrogenated oil)等的崩散抑制劑、四級銨鹼(ammonium base)、月桂硫酸鈉等的吸收促進劑；甘油(glycerin)、澱粉等的保濕劑；澱粉、乳糖、高嶺土、膨土(bentonite)、膠體狀矽酸等的吸附劑(adsorbent)；精製滑石、硬脂酸鹽(stearate)、硼酸粉末、聚乙二醇(polyethylene glycol)等的潤滑劑等。進而錠劑依照需要能以施以通常的劑皮之錠劑，例如糖衣錠、明膠外包錠、腸溶被錠、膜衣錠或雙重錠、多層錠。

在成形成丸劑的形態時，作為製劑載體例如可使用：葡萄糖、乳糖、澱粉、可可脂(cacao butter)、硬化植物油、高嶺土、滑石等的賦形劑；阿拉伯膠(gum arabic)粉末、黃蓍膠(tragacanth)粉末、明膠、乙醇等的結合劑；昆布糖、洋菜等的崩散劑等。

再者，在醫藥組成物中依照需要也能含有：著色劑、保存劑(preservative)、香料、風味劑、甜味劑(edulcorant)等或其他的醫藥品。

上述醫藥組成物的給藥方法特別無限制，係依照各種製劑形態、患者的年齡、性別和其他的條件，疾病的程度等而決定。而且，雖然其給藥量依照用法、患者的年齡、性別和其他的條件、疾病的程度等而適宜選擇，但通常上述的有效成分組成物以每一日體重每1kg約0.5~100mg左右較佳，該製劑可一日分成1~4次給藥給人。

(飲食品)

本實施形態的抗憂鬱劑、抗老化劑或抗肥胖劑以飲食品的情形例如可舉出發酵乳、乳酸菌飲料、發酵蔬菜飲料、發酵水果飲料、發酵豆漿飲料等。[發酵乳]是指以乳酸菌、雙叉乳酸桿菌或酵母使乳或乳製品發酵之作成糊狀或液狀者。因此，在該發酵乳包含有飲料形態同時包含有酸酪乳(yogurt)形態。而且，[乳酸菌飲料]是指以如下當作主原料並使其稀釋於水之飲料：以乳酸菌、雙叉乳酸桿菌或酵母使乳或乳製品發酵之作成糊狀或液狀者。

作為其他的飲食品形態的例子可舉出：醃菜、味噌、發酵茶、麵包等的發酵食品；斷乳食品、奶粉、嬰幼兒食品等的嬰幼兒用食品；發泡製劑、口香糖、軟糖、布丁等的糕點類；麵類；膠囊(capsule)、顆粒、粉末、錠劑等的營養輔助食品等；前述發酵乳及乳酸菌飲料以外的乳製品等。特別是因包含即使因加熱也能保持功能性的有效成分，故需要加熱程序的加工食品的形態較佳。作為特佳的形態可舉出衛生管理上需加熱調理的加工食品，例如照護食品等。本實施形態的飲食品可提供即使因對食物中毒預防有效的75℃的加熱也穩定的抗憂鬱劑、抗老化劑或抗肥胖劑。

本說明書中的[飲食品]是指包含專門口服地使用於飲食用的形態的全部(例如也包含飲料)，即使是錠劑等的形態，只要專門使用於飲食用，就包含於本說明書中的飲食品。例如以憂鬱狀態的改善或抗老化等為概念，依照需要顯示其意旨之健康食品、健康輔助食品、病人用食品、營養輔助食品或者日本國厚生勞働省所規定的保健功能食品(特定保健用食品、營養功能食品)也包含在本說明書中的飲食品。

作為較佳的實施形態，可舉出美容用飲食品。用語[美容用]是指為了抑制對象者的老化的進行並維持或改善美的外觀的用途，此也包含改善肌膚和頭髮的美的外觀和防止肥胖等。特別是在後述的實施例中，因口服攝取了本實施形態的有效成分之老化小鼠的毛長出來的樣子、毛的光澤艷麗及眼周圍的皮膚狀態等的老化指標被改善，故可期待透過抑制對象者的老化所得到的改善美的外觀，亦即作為美容用的飲食品的用途。而且，本實施形態的美容用飲食品更進一步也能當作口服用的抗肥胖劑、皮膚(肌膚)老化防止(預防)劑、皮膚(肌膚)的彈性改善劑、抗皺劑、膚質改善劑，美髮改善劑、便通改善劑、身體狀況改善劑、體質改善劑使用。

上述美容用飲食品因藉由抗老化作用及抗肥胖作用調整對象者的身體狀況，改善體質，故在不同的觀點中，也能當作健康增進用飲食品使用。在本說明書中，[健康增進]是指不僅意味著不生病、不虛弱，還意味著增強身體的、精神的而且社會的完全良好的狀態之[健康]狀態。

而且，該美容用飲食品及健康增進用飲食品除了上述的有效成分之外，也可以適宜依照需要含有生理活性物質、(食品)原料、(食品)添加物等。作為添加物/原料，例如可舉出：在食品等的製造、加工、保存時藉由添加、混合、浸潤和其他的方法使用，例如賦形劑、增量劑、增稠劑(thickener)、結合劑、潤滑劑、穩定劑、著色劑、乳化劑、助溶劑、食用色素、香味料、調味料、香辛料、甜味料、保存劑以及通常當作香料使用者。

作為依照本實施形態的飲食品中的前述有效成分組合物的含量未被特別限定，可適宜決定。從達成憂鬱狀態的改善及抗老化的效果的觀點，對各個飲食品的全質量，例如0.001質量%以上較佳，0.01質量%以上更佳，0.1質量%以上再更佳。另一方面，飲食品中的有效成分組合物的含量的上限未被特別限制，例如，如後述的實施例原封不動地攝取作為有效成分組合物的冷凍乾燥菌體也可以，但通常可配合飲食品的形態適宜調整。

(V)、具有抗憂鬱、抗老化或抗肥胖作用之有效成分組合物的製造方法

在本發明的其他的側面中，提供具有抗憂鬱、抗老化或抗肥胖作用之有效成分組合物的製造方法。圖1是顯示該有效成分組成物的製程之流程圖。該方法包含：從乳酸菌kosoi10H株的保存菌株調製種培養液之種子培養程序(S01)；使用得到的種子培養液在菌體生產用的培養基培養之主培養程序(S02)；從主培養後的培養液回收並清洗菌體之菌體清洗程序(S03)；對清洗後的菌體進行加熱處理之加熱處理程序(S04)；回收加熱處理後的菌體之回收程序(S05)。

種子培養程序(S01)係種植乳酸菌kosoi10H株的保存菌株例如冷凍乾燥菌或冷凍保存菌並使用適合本菌株的生長的培養基，例如包含D-果糖的MRS培養基等，可藉由在18~39℃下培養16~96小時左右而得到。將該種子培養液接種到主培養液，其接種量在1~10%(v/v)的範圍進行較佳。

主培養工序(S02)只要能使在上述程序(S01)得到的種菌增殖就未被特別限定，可依照需要適宜修正使用通常使用於乳酸菌的培養的方法。例如，培養溫度以20~40℃為佳，25~35℃較佳。而且，培養也可以在有氧條件下及在厭氧條件下的任一個進行，但在厭氧條件下進行較佳，例如，可一邊通入碳酸氣(carbonic acid gas)等的厭氧氣體一邊進行培養。而且，也可以在液體靜置培養等的微氧條件下培養。

作為培養的培養基未被特別限定，可依照需要適宜修正使用通常使用於乳酸菌的培養的培養基。也就是說，作為碳源，例如可依照資化性使用果糖、葡萄糖、山梨糖、核糖、來蘇糖、木糖、阿拉伯糖、乳果糖、蔗糖、澱粉水解產物(starch hydrolysate)、廢糖蜜(molasses)等的糖類。作為氮源，例如可使用氨、硫酸銨、氯化銨、硝酸銨等的銨鹽類和硝酸鹽類。而且，作為無機鹽類，例如可使用氯化鈉、氯化鉀、硫酸鉀、硫酸鎂、氯化鈣、硝酸鈣、氯化錳、硫酸亞鐵等。而且，也可以使用蛋白腖、大豆粉、脫脂大豆粕、肉萃(meat extract)、酵母萃等的有機成分。而且，作為調製完了的培養基，例如可適合使用MRS培養基。

作為實施形態之一，將乳酸菌kosoi10H株接種到包含高糖濃度且D-果糖的培養基並進行培養較佳。在本實施形態中，[高糖濃度]是意味著使用提高糖濃度的培養基進行培養，例如可藉由添加果糖、葡萄糖、山梨糖、核糖、來蘇糖、木糖、阿拉伯糖、乳果糖、蔗糖等的糖溶液進行調整。高糖濃度培養基是指具有比通常的培養基的滲透壓高的滲透壓高的培養基。高糖濃度培養基例如所添加的糖類的最終濃度至少為10質量%，較佳為10~40質量%，即使在40質量%以上的糖濃度下也能生長。再者，作為10H株的碳源，為包含5~20質量%，較佳為5~15質量%的D-果糖的培養基。D-果糖不僅可作為單糖添加，而且作為蔗糖或寡醣或多糖類(包含蔬菜和蕈類等)添加的培養基成分分解在培養中而被供給也可以。因此，作為高糖濃度的培養基，包含以D-果糖作為其構成成分的蔗糖或紅糖(muscovado)或黑糖等的源自於天然產物的糖類較佳。藉由在包含如此高糖濃度且D-果糖的培養基進行培養，即使在其他的乳酸菌株等的存在下，也能以優勢菌株使10H株生長。

菌體清洗程序(S03)是藉由離心分離或過濾等從上述培養後的培養液分離菌體，使用生理食鹽水等清洗菌體的程序。清洗次數可藉由在主培養程序(S02)使用的培養基成分和菌體的使用目的而適宜選擇。而且，依照情況也可以無菌體清洗程序(S03)，直接對在上述得到的培養液進行加熱處理。

加熱處理程序(S04)是藉由加熱對在上述菌體清洗程序(S03)得到的菌體進行殺菌處理的程序。加熱溫度可為65~100℃，加熱時間可由1分~120分左右適宜選擇。較佳的加熱處理為65~85℃ 1分以上，例如10分、30分或60分左右，更佳為70~75℃ 1分以上，例如5分、10分或30分左右。

接著，在回收程序(S05)中藉由對上述加熱處理後的處理液進行過濾或離心分離等來回收菌體。例如，可藉由以5000旋轉/分、4℃、離心分離20分鐘並集菌來回收處理液。菌體原封不動地冷凍保存也可以，進而該菌體也可以藉由冷凍乾燥、噴霧乾燥、真空乾燥、轉筒乾燥(drum drying)等當作乾燥物回收。據此得到的菌體可當作本發明組成物的有效成分利用。而且，也可以對所得到的菌體使用進行了磨碎或破碎等的處理之磨碎物或破碎物。

接著，舉出實施例，更詳細地說明本發明，但是本發明絲毫不被該等實施例限制。此外，在以下的實施例中表示各種成分的添加量的數值的單位%是意味著質量%。

[實施例]

(實施例1)乳酸菌kosoi的冷凍乾燥菌體的製造

將乳酸菌kosoi10H(寄存編號NITE BP-02811)的保存菌株植菌(inoculate)到在500mL的MRS培養基(Difco Laboratories公司)添加10質量%的果糖的培養基，在30℃下進行了48小時靜置培養(種子培養)。將該培養液添加到在10L的MRS培養基添加10質量%的果糖的培養基(5%植菌)，在30℃靜置48小時進行主培養。然後，將培養液進行5000rpm、20分鐘離心分離後，除去上清。將得到的菌體懸濁在10L的滅菌生理食鹽磷酸緩衝液後，進行5000rpm、20分鐘離心分離，得到清洗菌體。重複兩次該操作。更進一步將10L的滅菌生理食鹽磷酸緩衝液加入到所得到的菌體進行懸濁後，進行70℃、30分鐘加熱處理。接著，進行5000rpm、20分鐘離心分離，得到加熱處理菌體。再者，重複3次利用10L的滅菌蒸餾水進行的懸濁、離心分離操作。使最終得到的沉澱冷凍乾燥，得到14.3g的乾燥菌體。冷凍乾燥裝置係使用EYELA U-2200，在2~3Pa的真空條件、-80℃的捕集(trap)溫度下運轉72小時。

(實施例2)透過憂鬱動物模式進行的抗憂鬱作用的評價

皮質酮(CORT：corticosterone)是一種類似於人類的皮質醇(cortisol)的囓齒類的壓力激素(stress hormone)，在患有重度憂鬱症(major depressive disorder)的人類和暴露於慢性壓力(chronic stress)的囓齒動物中會惡化。因此，皮質酮誘發性憂鬱症樣行為被廣泛用作動物的壓力造成的憂鬱症的慢性模式。藉由慢性地投予CORT，可模仿壓力對動物的焦慮關聯的接近-迴避-避難行動的影響。

2-1、小鼠

雄性C57BL/6小鼠是從財團法人國家實驗研究院國家實驗動物中心(National Laboratory Animal Center)(台灣)獲得。所有的小鼠在365×207×140mm的籠子中每一籠子各收容5匹，在23±2℃從上午7點30分開始12小時的明暗循環下飼養。每天觀察動物的健康狀態。未觀察到主要的不良事件(adverse event)。水與飼料係自由攝取。投予期間中每週測定一次24小時的飲水量，每週測定兩次體重。算出小鼠的體重變化率。所有的動物實驗及程序均得到台灣工業技術研究院的設施內實驗動物照護及使用委員會Institutional Animal Care and Use Committee(ITRI-IACUC-2019-083M)的批准。

2-2、投予方法

將8週齡的雄性C57BL/6小鼠分成4組(各組n=10)。(1)、假手術組(sham group)，(2)載體組(vehicle group)(溶劑對照組)，(3)LK600組(以600mg/kg/天投予在實施例1調製的乳酸菌kosoi的冷凍乾燥菌體的組)，(4)氟西汀(fluoxetine)組(以15mg/kg/天投予氟西汀鹽酸鹽(fluoxetine hydrochloride)，製品編號1279804，Sigma-Aldrich公司製的組)。對假手術組的小鼠每天皮下注射生理食鹽水3.25mL/kg/天並投予21天(第0-20天)，對其他組的小鼠每天皮下注射CORT(皮質酮，製品編號C2505，Sigma-Aldrich公司製)40mg/kg/天(3.25mL/kg/天)並進行了誘導憂鬱。CORT係將2% DMSO(製品編號D2650，Sigma-Aldrich公司製)添加到芝麻油(製品編號S3547，Sigma-Aldrich公司製)並溶解。每日口服投予載體(溶劑)、LK(使在實施例1調製的乳酸菌kosoi的冷凍乾燥菌體懸濁的水溶液)、氟西汀(水溶液)(5mL/kg/天)，投予期間以21天(第0~20天)。在第21天到第25天之間進行行為測試，在第28天處死小鼠。

2-3、統計分析

數據係使用一元配置(one-way layout)的ANOVA(變異數分析：analysis of variance)進行分析，進行了Dunnett的事後分析(post hoc analysis)。所有的統計分析係使用EZR(R版本4.0.3，R Commander 2.7-1，參考文獻：Bone Marrow Transplantation 2013：48、452-458.)進行。p值未滿0.05的情形被認為統計上顯著。

2-4、高架十字測試

高架十字迷宮(EPM：elevated plus maze)測試是基於動物討厭高處的開放空間，有想停在封閉的空間的傾向。在EPM測試中，藉由在封閉的臂(arm)上度過更多的時間來表現焦慮。在EPM測試中，使用高度50cm的升降式的十字型(+)的裝置，裝有兩條開放的臂與兩條閉合的臂。各臂的長度為30cm，寬度為5cm。在閉合的兩條臂有包圍臂的15cm的個子高的壁。小鼠在實驗前未接受迷宮的馴化(acclimatization)。為了開始行為分析，將各小鼠配置於迷宮的中央區域(5×5cm)，使其探索5分鐘。在各臂上度過的時間係以在開放的臂與閉合的臂上度過的時間的比例進行分析。然後在各測試之間以70%乙醇清洗迷宮，以使氣味不會成為下一隻小鼠的行為的妨礙。

2-5、結果

將其結果顯示於圖2及圖3。對假手術組，在載體組中總移動距離(圖2)及開放部滯留比例(圖3)的減少傾向被認定。但是，LK600組(600mg/kg/天的乳酸菌kosoi的冷凍乾燥菌體投予組)對載體組顯著地增加了總移動距離(圖2，Dunnett，p<0.05)及開放部滯留比例(圖3，Dunnett，p<0.01)。該效果與作為抗憂鬱藥使用的氟西汀15mg/kd/天投予組比較為同等或超過。

(實施例3)透過老化動物模式進行的抗老化作用的評價

藉由AKR/J系統的選擇性近親交配，製作老化促進小鼠(SAM)。該小鼠顯示老年性類澱粉變性(senile amyloidosis)、老年性骨質疏鬆症、白內障、免疫反應(immune response)的降低、學習/記憶障礙等的過早老化(premature aging)現象。老化促進小鼠prone-8(SAMP8：Senescence-accelerated mouse prone-8)因腦的萎縮早期就開始，伴隨嗜睡/記憶障礙和情緒障礙，故為特別廣泛用於失智症(dementia)研究的模式(T.Takeda,et al.,A new murine model of accelerated senescence.Mech Ageing Dev.17(1981)183-194)。SAMP8的壽命為對照菌株(reference strain)之SAM/resistant 1(SAMR1)的大約一半。已知老化促進小鼠SAMP8藉由給予高脂肪飲食(high fat diet)而更進一步加速老化，一邊發病成第II型糖尿病，一邊成為阿茲海默型失智症(Alzheimer dementia)的病理模式(Mehta et al.,Experimental Induction of Type 2 Diabetes in Aging-Accelerated Mice Triggered Alzheimer-Like Pathology and Memory Deficits.Journal of Alzheimer’s Disease 39：145-162,2014)。

3-1、小鼠

雄性SAMP8/TaHsd(老化促進小鼠)是從Envigo RMS B.V.(荷蘭)獲得。根據供應商的住房政策，使SAMP8小鼠在6週齡時獨居。到達時，小鼠為4~7週齡。6~7週齡的SAMP8小鼠在出貨前成獨居，被分配為批次1。4~5週齡的SAMP8小鼠在5~6週齡(檢疫後)成獨居，被分配為批次2。所有的小鼠都在365×207×140mm的籠子(無蓋)單獨收容，在溫度23±20℃，從上午7點30分開始12小時的明暗循環下飼養。批次2的小鼠比批次1小鼠晚兩週開始實驗，並配合年齡。為了馴化，從測試開始前17天給予所有的小鼠control diet(LFD，D12450Ji，Research Diets)。SAMP8的一部分的小鼠在10~11週齡時變更為高脂肪飲食(HFD，D12492i，Research Diets)。HFD與LFD係每週餵食3次。動物的健康狀態係每天監控。水與飼料係自由攝取。飼料的每日的消耗量係每週測定。水的消耗量係每2~3週測定24小時的飲水量。體重係在測試期間中每週測定兩次。算出小鼠的體重的變化率。所有的動物實驗及程序均得到台灣工業技術研究院的設施內實驗動物照護及使用委員會Institutional Animal Care and Use Committee(ITRI-IACUC-2019-069V1)的批准。

3-2、投予方法

將10~11週齡的雄性SAMP8小鼠分成3組(各組n=9，由批次1與批次2的兩方構成，在批次2中以4~5匹/組)。為如下的3組：(1)、LFD(低脂飲食(low fat diet))組，(2)、載體(高脂肪飲食)組，(3)、LK600(高脂肪飲食)組。在載體(高脂肪飲食)組與LK600(高脂肪飲食)組(以600mg/kg/天投予在實施例1調製的乳酸菌kosoi的冷凍乾燥菌體的組)從試驗開始第0天起，使其自由攝取高脂肪飲食，在LFD組使其自由攝取低脂飲食。而且，在LFD(低脂飲食)組與載體(高脂肪飲食)組投予糊精(dextrin)1500mg/kg/天，在LK600(高脂肪飲食)組投予乳酸菌kosoi的冷凍乾燥菌體600mg/kg/天，同時投予糊精900mg/kg/天。作為投予(給藥)方法，每天使用探頭(sonde)進行了122天(從測試開始第0~121天)口服投予5mL/kg/天。第122天到第132天之間，在不進行檢體的投予下繼續測試，在第133天處死小鼠。

統計分析係藉由分析軟體EZR(R version 4.0.3，R commander 2.7-1)進行，圖4及圖6為重複測定的變異數分析(analysis of variance)(Repeated measures ANOVA)，圖5為非成對t檢定(unpaired t test)及圖7~10係使用一元配置的ANOVA進行分析，進行了Dunnett的事後分析(post hoc analysis)。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

3-3、體重增加率的測定

體重常被當作顯示小鼠的健康狀態的指標使用。與LFD(低脂飲食)組比較，攝取了高脂肪飲食的載體(高脂肪飲食)組(在圖4中表示為HFD Vehicle(載體))的體重增加率顯著變高(Repeated measures ANOVA，P<0.001)(圖4)。在連同LK600與高脂肪飲食一起投予的組(在圖4中表示為HFD LK600)中，雖然高於LFD(低脂飲食)組，但比攝取了高脂肪飲食的載體(高脂肪飲食)組顯著變低(Repeated measures ANOVA，P<0.05)(圖4)。測定測試開始第133天的小鼠的體重，將比較各組的結果顯示於圖5。如圖5所示，藉由非成對t檢定，在連同LK600與高脂肪飲食一起投予的組和載體(高脂肪飲食)組之間認定了顯著差異(significant difference)(p<0.05)。

3-4、老化指標的測定

老化度評價分數

為了評價SAMP8小鼠的老化的程度，使用老化度評價分數，該老化度評價分數係以0~4合計表示行為和外表的變化的11項目的分數(參照表1)。圖6是顯示投予本發明的有效成分組成物等之老化促進小鼠的11項目的老化度評價分數的平均值(總老化指標)的經時變化。

[表1]

各投予組的平均評分從9週齡到25週齡逐漸上升。到15週齡為止沒有顯著差異，但在22週齡以後有明顯有差異(圖6)(Repeated measures ANOVA；LK600 vs.載體：P<0.01，LFD vs.載體：P.<0.001)。將22週齡的各組的老化度評價分數平均值的合計顯示於圖7。如圖7所示，與LFD(低脂飲食)組比較，載體(高脂肪飲食)組顯示出顯著高的分數(Dunnett，P<0.001)。另一方面，LK600(高脂肪飲食)組與載體(低脂飲食)組比較，顯著地抑制了該上升(Dunnett，P<0.01)。分數的變化主要是毛的外觀的指標之光澤感與密集度的類別(category)為中心。因此，將各投予組中的22週齡的毛的光澤感(Glossiness of fur)的分數顯示於圖8。如圖8所示，與LFD(低脂飲食)組比較，載體(高脂肪飲食)組顯示顯著高的分數(Dunnett，P<0.001)。另一方面，LK600(高脂肪飲食)組與載體(低脂飲食)組比較，顯著地抑制了該上升(Dunnett，P<0.01)。

3-5、組織的回收

處死小鼠時，保存了小鼠的血清與腦組織。使用誘導箱與遮罩(mask)並藉由吸入2.5%異氟醚(isoflurane)對小鼠進行深度麻醉，藉由腳趾捏反射確認了麻醉狀態。開胸，以注射器(25G針頭)從右心室採集0.35mL的全血作為血清。心腔內灌流係使用蠕動泵(peristaltic pump)，從剛切開右心房之後的左心室注入15~20mL(10mL/min)的冰冷的人工腦脊隨液(ACSF)。ACSF由124mM NaCl、2.5mM KCl、1.2mM NaH₂PO₄、24mM NaHCO₃、5mM HEPES、12.5mM葡萄糖、2mM MgSO₄.7H₂O、2mM CaCl₂.2H₂O構成。ACSF的pH在室溫下使用碳合氧(carbogen)(95%O₂/5% CO₂)供給氧後，調整為7.4。ACSF在4℃或冰上保存，在使用前以碳合氧進行再充氧(reoxygenation)20分鐘。心腔內灌流後，迅速回收腦，分離成兩個半球。左半球在液態氮(liquid nitrogen)中急速冷凍，以-80℃保存。在室溫下花費2小時使全血樣品凝固後，以10000×g離心分離10分鐘。回收血清，以-80℃保存。

3-6、腦內類澱粉蛋白-β的測定

以添加了蛋白酶抑制劑(protease inhibitor)雞尾酒(K266-100，BioVision)之800μL的T-PER^TM Tissue Protein Extraction Reagent(78510,Thermo Fisher Scientific)將冷凍(-80℃)的左半球的腦勻漿化(homogenize)。然後，以10000 ×g將勻漿(homogenate)離心分離5分鐘。回收上清，以-80°C保存。半球中的類澱粉蛋白-β_1-42的總濃度係使用ELISA套件(Mouse amyloid beta peptide 1-42 ELISA Kit，CSB-E10787m，CUSABIO)，依照製造商的指示進行測定。

已知老化促進模式小鼠SAMP8成為以類澱粉蛋白-β的高表現導致的氧化壓力(oxidative stress)增加為病因的阿茲海默型失智症的模型(Morley et al.,2020 The senescence accelerated mouse(SAMP8)as a model for oxidative stress.and Alzheimer's disease.Biochimica et Biophysica Acta 1822：650-656,2012)。將以SAMP8小鼠的腦評價對LK600(高脂肪飲食)組的類澱粉蛋白-β的效果的結果顯示於圖9。如圖9所示，腦勻漿上清中的類澱粉蛋白-β的水平係與LFD組比較，在載體(高脂肪飲食)組顯著地(Dunnett，p<0.001)上升，但在LK600(高脂肪飲食)組中，與載體(高脂肪飲食)組比較，類澱粉蛋白-β的上升顯著地被抑制(Dunnett，p<0.01)。

3-7、血清中的發炎因子(inflammatory factor)間白素1β(interleukin 1β)(IL-1β)的測定

已知在老年人中IL-1等的發炎性細胞介素(inflammatory cytokine)的產生升高(磯部們，老年醫學的展望-老化與免疫-日本老年醫學會雜誌，48：205-210，2011及Licastro,et al.,Innate immunity and inflammation in ageing：a key for understanding age-related diseases.Immunity & Ageing2：8、2005)。為了調查SAMP8小鼠的 IL-1β的水平是否因LK600的投予而變化，進行了ELISA。匯集各組的血清樣品，將使用Abcam公司的High Sensitivity IL-1β ELISA Kit(ab197742)檢測IL-1β的結果顯示於圖10。如圖10所示，IL-1β水平係與LFD(低脂飲食)組比較，在載體(高脂肪飲食)組顯著地上升(Dunnett，p<0.001)，但在LK600(高脂肪飲食)組中，與載體(高脂肪飲食)組比較，IL-1β的上升顯著地被抑制(Dunnett，p<0.001)。

(處方例1錠劑)

根據習用方法混合以下的成分以製造錠劑。此外，有效成分組合物係使用在實施例1得到的乳酸菌kosoi的冷凍乾燥菌體。

組成

將上述成分混合，打錠，得到錠劑。

(處方例2膠囊劑)

根據習用方法混合以下的成分以得到軟膠囊(soft capsule)。此外，有效成分組合物係使用在實施例1得到的乳酸菌kosoi的冷凍乾燥菌體。

組成

葡萄籽油(grape seed oil) 110mg

將上述成分混合，填充到混合明膠(gelatin)及甘油的膠囊基劑中，得到軟膠囊。

(處方例3美容用飲用水)

根據習用方法混合以下的成分，全量以100g調製了美容用飲用水。此外，有效成分組合物係使用在實施例1得到的乳酸菌kosoi的冷凍乾燥菌體。

組成

包含乳酸菌kosoi菌體的組合物的適用在使用藥劑投予憂鬱模式小鼠和高脂肪飲食投予老化促進模式小鼠的評價中，可確認顯示抗憂鬱作用及抗老化作用(包含肥胖的抑制)。因此，本發明的抗憂鬱劑、抗老化劑及抗肥胖劑具有可當作醫藥品、飲食品，特別是美容用飲食品及健康增進用飲食品利用的可能性。

Claims

一種用以製備抗憂鬱劑的菌體之用途，含有以寄存編號NITE BP-02811寄存的乳酸菌kosoi(Lactobacillus kosoi)10H株的菌體作為有效成分。
如請求項1之用途，其中該菌體為死菌體。
如請求項1或請求項2之用途，其中為醫藥品、飲食品或配合於醫藥品、飲食品之有效成分組成物的形態。
一種用以製備抗老化劑的菌體之用途，含有以寄存編號NITE BP-02811寄存的乳酸菌kosoi(Lactobacillus kosoi)10H株的菌體作為有效成分。
如請求項4之用途，其中該菌體為死菌體。
如請求項4或請求項5之用途，其中為醫藥品、飲食品、飼料或配合於醫藥品、飲食品、飼料之有效成分組成物的形態。
如請求項6之用途，其中該飲食品為美容用飲食品或健康增進用飲食品。
一種用以製備抗肥胖劑的菌體之用途，含有以寄存編號NITE BP-02811寄存的乳酸菌kosoi(Lactobacillus kosoi)10H株的菌體作為有效成分。
如請求項8之用途，其中該菌體為死菌體。
如請求項8或請求項9之用途，其中為醫藥品、飲食品、飼料或配合於醫藥品、飲食品、飼料之有效成分組成物的形態。