TWI342750B

TWI342750B -

Info

Publication number: TWI342750B
Application number: TW092107146A
Authority: TW
Inventors: Yasuhiro Koga
Original assignee: Frente Internat Co Ltd
Priority date: 2002-03-29
Filing date: 2003-03-28
Publication date: 2011-06-01
Also published as: WO2003082027A1; EP1498039A4; TW200305370A; AU2002243005A1; KR100843020B1; JPWO2003082027A1; JP4203855B2; DK1498039T3; CN1309316C; CN1625345A; EP1498039B1; US7674613B2; EP1498039A1; KR20040111434A; EP1498039A8; HK1073230A1; US20070071737A1

Description

1342750 (1) 玖、發明說明【發明所屬之技術領域】本發明係關於以乳酸菌爲有效成份，以防止或治療牙肉炎、牙周炎、牙周病、蛀牙及口臭爲目的之全套口腔保健用醫藥品（生菌製劑）或含有乳酸菌之食品及其使用。【先前技術】依據日本國厚生省之調查，報告罹患牙周病之患者數，於I 975年之調查爲國民之18.2%，於1 993年爲 6 8 . 1 %，於I 9 9 9年則上升爲7 2.9 %，其後，亦持續增加，推測患者數約達9,000萬人，於醫療經濟學上，牙科領域受迫於太多支出負擔已爲現狀。因此，該局已於1 98 8年決定由國家著手於牙周病預防，即所謂「8020運動」之發展及推廣。然而，現在，患者數目仍未見減少，正希望有劃期性的預防法及治療法之開發。近年來，牙周症不單僅是牙肉組織之慢性感染症之疾病，亦指出其形成對於循環系統疾病之心肌梗塞、動脈瘤之血管破壞等原因之危險性。並且亦作爲糖尿病及誘發早產之危險因素，而受注目。牙周病之治療，至今仍無適切之治療法，以牙科技術處理時，即實施投予殺菌劑於患部’外科手術及經口投予之使用抗生素等。然而，長期連續投予治療用之殺菌劑或抗生素時，會形成因爲使用這些藥物而產生新的耐性菌，以及因藥劑之副作用發生等之許 -5- (2) (2)1342750 多難題，現今仍未確立令人滿足之治療法。因此，以預防或治療牙周病或蛀牙爲目的，取代投予殺菌劑或抗生素之方法，而檢討使用乳酸菌以預防或治療上述疾病之可能性。作爲使用乳酸菌以預防及治療牙周病或蛀牙之方法，以 Enterococcus faecium 、 Streptococcus equinus 、 Lactobacillus fermentum 及 Lactobacillus salivarius 之菌體及/或水萃取物爲有效成份之方法係揭示於特開昭6 1 -91126號及特公平4— 52249號，另外，於 W099/0 78261 中討論，於 Lactobacillus spp.V20 及 Streptococcus oralis 所發現或所產生之阻礙葡萄糖基轉移酵素（glucosyl transferase)之活性或抑制蛀牙增殖之因子，以及阻礙過氧化氫產生之上述乳酸菌。另一方面，人類口腔內，存在著4 00種類以上之細菌，其菌數達至100億個。隨之一提，唾液中，檢測出 108至109CFU/ml値之菌數。因此，人類口腔內形成複雜之口腔細菌群（flora)，對於牙周病或蛀牙等之預防及治療，以單純的體外（in vitro )系統所得之成績，而討論其外插對於人類之有效性係非常有問題的。另外，以投予於人類爲前提，爲討論其有效性時，關於作爲生菌製劑或含有乳酸菌之食品之生菌殘存性、進而其香味及物性，有考慮之必要。然而，有關利用乳酸菌於預防及治療上述之牙周病或蛀牙之文獻中，並未揭示使用人類及模式動物之體內（in vivo)系統中，有關除菌或抑制牙周病及蛀牙之 (3) (3)1342750 原因菌之數據，或是有關作爲生菌製劑或含有乳酸菌之食品之生菌殘存性、香味及物性之數據。 W投予於人類爲前提之預防及治療牙周病及蛀牙手段之生菌製劑或含有乳酸菌之食品所使用之菌株，於使用人類或模式動物之試驗中，應選定明顯地可除菌或抑制口腔內病原菌之牙周病及蛀牙原因菌之乳酸菌株，並且使用生菌製劑或含有乳酸菌之食品時，該乳酸菌株之殘存性高爲必要條件，以香味及物性亦優異爲宜。【發明內容】〔發明之揭示〕有鑑於關於如上述之利用乳酸菌於預防及治療牙周病或蛀牙之先前技術，本發明之目的係提供，可防止以牙周病菌、蛀牙菌爲原因菌之牙周病及/或蛀牙之發病或再發再生之乳酸菌株。本發明之其他目的係提供含有如上述乳酸菌株之生菌製劑及含有乳酸菌之食品。如上述之菌株，使用人類及模式動物之試驗中，可除菌或抑制口腔內病原菌之牙周病及蛀牙之原因菌，進而使口腔內細菌群正常化，防止發生口臭，保持唾液生理上正常之酸鹼値等性質，選定証實於臨床上具有效性之菌株係最重要的。本發明者係由上述之觀點，探索屬於乳酸菌屬之各種乳酸菌，發現唾液乳桿菌（Lactobacillus salivarius)具有上述特性，而完成本發明。 (4) (4)1342750 因此本發明係提供含有以乳酸菌 Lactobacillus sal ivarius爲有效成份之生菌製劑及含有乳酸菌之食品。本發明之生菌製劑及含有乳酸菌之食品係可使用於使口腔內細菌群正常化、防止或治療牙肉炎、牙周炎及牙周病之發生、預防或治療蛀牙之發生以及預防口臭的發生及除去口臭等。另外，本發明係提供唾液乳桿菌中尤其適合之菌株 Lactobacillus s a 1 i v a r i u s TI 2 7 1 1 株（F E R Μ B P - 7 9 7 4 )，以及其菌體及乾燥菌體。上述之本發明之生菌製劑及含有乳酸菌之食品係以含有 LactobaciHus salivarius中之 Lactobacillus s a 1 i v a r i u s TI 2 7 1 1 株（F E R Μ B P — 7 9 7 4 )尤佳。另外，本發明係提供於製造 Lactobacillus salivarius ΤΙ 2711株（FERM BP- 7974 )之生菌製劑及含有乳酸菌之食品時，乳酸菌 Lactobacillus salivarius TI 2711 株 (FERM BP - 7974 )之使用，以及含有乳酸菌 Lactobacillus salivarius ΤΙ 2711 ( FERM BP— 7974 )及與該菌株之作用機序相異之活性成份之組成物。用以實施發明之最佳型態本發明者爲選定符合上述本發明目的之乳酸菌株，依據下述之步驟，以健康人口腔內所分離之複數乳酸菌屬之保存菌株（30菌株），進行試驗，選定最適合之菌株。 1、選定比一般之乳酸桿菌，於最短時間內增殖之菌 -8- (5) (5)丨1342750 株（參考試驗1之①項）。 2、乳酸菌屬之保存菌株（30株）與牙周病之主要原因菌之臨床分離株之 Porphyromonas gingi vali s、 Prevotella intermedia 及 Prevotella nigrescens，分別進行混合培養，選定可強力地阻止牙周病菌繁殖之菌株（參考其中一例之使用Porphyromonas gingivalis之試驗例1之 ②項）。 3 ' 其次，將上述1之乳酸菌屬之保存菌株（30 株）與駐牙之主要原因菌之臨床分離株之 Streptococcus mutans 及 Streptococcus sobrinus，分別進行混合培養，選定可有意義地阻止蛀牙菌繁殖之菌株（參考其中一例之使用Streptococcus mutans之試驗例1之③項）》 4、進而，爲証明對於蛀牙具有效性，定量混合培養中不溶性葡聚糖（蛀牙之主要原因物質），選定可有意義地阻礙不溶性葡聚糖產生之菌株（參考試驗例1之③項） 5、其次，爲証明依據上述之1至4之in vitro試驗所選定之 Lactobacillus salivarius ΤΙ 2711 株之有效性，更進一步進行無菌小鼠之感染模式試驗（參考試驗例 2 )。其槪要如下所述。 (1 ) 將牙周病菌之 Porphyromonas gingivalis 接種於無菌小鼠之口腔內，使之附著後，經口投予 Lactobacillus salivarius TI 2711 株，測定 porphyr〇m〇nas gingivalis之菌數，証實有意義地阻止其繁殖（參考實驗 (6) (6)1342750 (2) 將姓牙菌之Streptococcus mutans接種於無菌小鼠’使之附著後，經口投予Lact 〇 b aci 11 u s s a 1 i v ar iu s TI 2711株，測定streptococcus mutans之菌數，証實有意義地阻止其繁殖（參考實驗2)。 6、作爲臨床試驗，招募經本人同意之健康志願者 (n = 5 7 )，採集口腔內唾液，分別測定總菌數、牙周病菌 (BPAR =呈現黑色之革蘭氏陰性、嫌氣性桿菌之菌落）及姓牙菌之Streptococcus mutans及有用菌之乳酸桿菌之菌數，另外，並測定唾液之酸鹼値及唾液中之不溶性葡聚糖量，以及使用探針測定器，進行口腔內之口臭測定。其後，以 Lactobacillus salivarius TI 2711 之淀劑 (錠果），使上述之志願者服用，服用期間爲8週，於服用後第4週及最後之第8週，測定上述所有項目，以及進行問診以調查服用後之有效性或副作用等。關於全部項目，進行統計學處理（Wilcoxon法）之結果，任一項目之服用前後，均得客觀之有意差，另外，合倂問.診結果，進行綜合評價時，其有效性於臨床學上亦可明確地証實 (參照試驗例3 ) 配合上述本發明目的之菌株，以上述1至4所選定之 Lactobacillus salivarius TI 2711 株之細菌學上性狀如下所示。 A :形態學上性狀細胞形態：桿菌細胞之大小：0.6至0·9χ 1.7至5.2//m -10- (7) (7)1342750 運動性：無孢子之有無：無革蘭氏染色性：陽性 B :生理學上性狀（陽性：+，陰性：—）產生氣體：- 過氧化氫酵素（catalase):- 明膠液化能：-對氧氣反應：兼性嫌氣性口引Π朵（indole)之生成：— 硝酸鹽還原能：-硫化氫之生成：-所生成乳酸之光學活性體：左旋體 C :糖之利用性（利用性陽性：+，利用性陰性：-）阿拉伯糖：-扁桃有1 : -纖維二糖：一七葉苷：一半乳糖：+ 葡萄糖：+ 果糖：+ 葡糖酸：+ 乳糖：+ 麥芽糖：+ 苷露糖醇：+ -11 - (8) (8)1342750 苷露糖：+ 蜜二糖：+ 棉子糖：+ 松三糖：— 鼠李糖：+ 核糖：— 山梨糖醇：+ 蔗糖：+ 木糖：— 水楊昏：— 海藻糖：+ 基於上述之細菌學上性質，依據 Barges Manual of Systematics Bacteriology、2 卷（ 1986)及腸內菌世界、光岡知足、叢分社（ 1 980 ) 之分類規準，將以上述1至 4 所選定之本發明之菌株，同定爲 Lactobacill us salivarius ，命名該菌株爲 Lacto b aci 11 u s salivarius ΤΙ 2711株。本菌株係於平成14年3月26日寄託於獨立行政法人產業技術總合硏究所特許生物寄託中心（〒3 05 -8566日本國茨城縣筑波市東1 丁目1番地中央第6)，委託號碼爲FERM BP — 7974。本發明之 Lactobacillus salivarius TI 2711 株係抑制或阻止人類等寄主經口攝取之牙周病菌或蛀牙菌附著及增殖於牙肉組織及牙周囊袋、牙齒部份，可抑制或排除口腔 -12- 1342750 Ο) 內所存在之病原菌。因此，對於預防或治療亦可稱爲國民病之牙周病或蛀牙，提供極爲有效之手段。如此之寄主及口腔內微生物間之相互作用係於自然界廣泛地觀察到，可理解寄主及微生物之關係下共生、寄生或拮抗現象。其次，敘述關於本發明之乳酸菌株（Lactobacillus salivarius ΤΙ 2711 株）之用途。以本發明之乳酸菌株（Lactobacillus salivarius ΤΙ 2711株）爲有效成份之可直接投予或亦可與適當的添加劑作爲單劑投予，另外，亦可與其他活性成份，例如與該菌株之作用機序相異之其他牙齒保健醫藥品同時投予或作爲合劑投予。其投予型態，例如散劑、顆粒劑 '錠劑、膠囊劑及糖漿劑等之型態爲宜，可安全地經口投予》將本發明之乳酸菌株以這些投予型態使用時，以使用本發明之乳酸菌株之乾燥菌體（生菌）作爲製劑爲宜。本發明之乳酸菌株之乾燥菌體（生菌）係可依常法而製得，例如將本發明之乳酸菌株純培養，以離心分離等方法集菌後，加入適當的安定劑，冷凍乾燥而可製得。另外，上述各種製劑可依常法製造，與主要藥物之本發明之乳酸菌株，可使用賦形劑、結合劑、崩壞劑、被覆劑、潤滑劑、安定劑、矯味矯臭劑、溶解補助劑、滑澤劑、懸濁劑及稀釋劑等之醫藥品之製劑技術領域中，通常所使用之已知醫藥品添加物而可製造。上述各種製劑之投予量係依對象患者之種類及程度等而異，例如本發明之乳酸菌株之乾燥菌體，因應症狀可每 -13- (10) (10)1342750 日lmg至2,000mg左右，每日1次或分數次投予。另外，本發明之乳酸菌株係可廣泛地添加於例如錠果、口香糖及糖果類等之點心類、韓國泡菜（gimchi)等之醃菜類之一般食品使用，可提供含有乳酸菌之食品。使用本發明之乳酸菌株於食品時，亦以使用本發明之乳酸菌株之乾燥菌體（生菌）爲宜，將其作爲食品與所容許之添加物，可任意地廣泛地添加於一般的食品。另外，本發明之乳酸菌株係可以優酪乳等醱酵食品之型態攝取。如此之醱酵食品，例如於牛乳或羊乳等之醱酵原料中，接種製造優酪乳之種菌（starter )如 Lactobacillus bulgaricus 、 Lactobacillus acidophilus 、 Lactobacillus helveticus、Streptococcus thermophilus 及 Streptococcus lactis等酪農乳酸菌與本發明之乳酸菌株，混合培養，或分別於醱酵原料中，單獨培養後混合而可製造。本發明者，爲更提升本發明之乳酸菌株之效果，爲發現與本發明之乳酸菌株成相加或相乘效果之物質，以蛀牙爲指標，調查含有本發明之乳酸菌株與寡糖及糖醇類之組成物之效果。其結果發現將糖醇之赤蘚醇與本發明之乳酸菌株同時使用，於抑制不溶性葡聚糖產生時，相對於各自單獨之抗蛀效果，顯示出相乘效果（參考試驗例4 )。糖醇類（木糖醇、麥芽糖醇、苷露糖醇及赤蘚醇等）及寡糖（果寡糖、木糖寡糖、蔗果三糖及棉子糖等）對於蛀牙有效爲眾所皆知，但是這些糖醇及寡糖與乳酸菌株之 -14- (11) (11)1342750 相乘效果或相加效果係依據乳酸菌株之選定而有很大的不同。可單獨或混合這些有效的糖醇及寡糖，使用於本發明之生菌製劑或含有乳酸菌之食品。這些糖醇及寡糖亦可達成賦形劑或甘味劑之機能。這些糖醇及寡糖之種類及配合比率等，並無特別的限制，可以任何糖醇或寡糖，以任何比率使用。例如錠果時，使用常用之打錠技術，適當地選擇錠劑組成、打錠壓力等條件及錠果之硬度等，可容易地製造含有任何比率之任何糖醇或寡糖之製品。以下，參考實施例及試驗例，更詳細地說明本發明，但本發明不以這些爲限。【實施方式】試驗例1 :選擇適合抑制口腔內病原細菌之乳酸桿菌之菌株（Lactobacillus 屬） ①關於增殖性之試驗於 MRS ( Methicillin resistant staphylo cocci) broth (Difico )培養基，分別接種lx 107CFU/ml之如表1所示之30株屬於Lactobacillus屬之乳酸菌，於37°C之好氣性條件下培養6小時後，以瓊脂平板法，測定生菌數。亦即，將1 m 1之各菌株於上述培養第6小時之培養液以嫌氣性稀釋液（4.5g/l 之 KH2P〇4、6.0g/l 之 Na2HP04，〇.5g/l之半胱氨酸鹽酸鹽、0.5g/l之瓊脂及 0.5g/l之 Tween 80 (Polysorbate 80))，進行階段稀釋，將 0.1ml -15- (12) (12)1342750 之稀釋液塗抹於MRS瓊脂培養基（於MRS broth中，添加1.5%之瓊脂所成之瓊脂平板），於37°C之嫌氣性條件下培養4 8小時後，計數菌落數，乘以稀釋倍數而求得生菌數。其結果如表1所示。 ②對於牙周病原因菌之主要病原菌之 Porphyromonas gingivalis JCM 8525株之抑制作用之試驗 10ml之添力卩0.7°/。之葡萄糖於GAM bouillon (日水）之液體培養基中，單獨 Porphyromonas gingivalis JCM 8 5 2 5株（菌數：lx 106CFU/ml )(對照組）或分別與表I 所示之 30株乳酸桿菌（菌數：1 X 106CFU/ml )混合接種。於嫌氣培養條件下，以3 7 °C培養1 2小時後，以瓊脂平板法，測定培養液中Porphyromonas gingivalis之生菌數，求出相對於單獨培養Porphyromonas gingivalis時之 Porphyromonas gingivalis 之生菌數（對照組，100% )，與 Lactobacillus 屬菌混合培養時之 Porphyromonas gingivalis之生菌數比率》以填脂平板法，測定Porphyromonas gingivalis之菌數時，係於EG壤脂培養基（日水）中添加i〇#g/mi之慶大黴素（gentamycin)所成之 EG-GM培養基作爲選擇培養基使用，只培養Porphyromonas gingivalis，測定其菌數。亦即將進行單獨Porphyromonas gingivalis或分別與各乳酸桿菌株（3 0株）之混合培養之上述培養液，各採取1 m 1 ’以上述嫌氣性稀釋液階段稀釋，將其〇」m丨以曲 -16- (13) (13)1342750 玻棒（Conrida stick)塗抹於EG-GM瓊脂平板，於37t 下’嫌氣培養48至72小時，計數所得之菌落後，乘以稀釋倍數而求出其生菌數。相對於單獨培養 Porphyromonas gingivalis 時之 Porphyromonas gingivalis 生菌數（對照組，100% )，與 Lactobacillus 屬菌混合培養時之 Porphyromonas gingivalis 之生菌數比率作爲 Porphyromonas gingivalis 之生存率，依下述式計算。其結果之P. gingivalis之生存率 (% )如表 1所示。因此，Lactobacillus屬菌對於 Porphyromonas gingivalis之阻礙率（％)係以對照組 (1〇〇% )減去 P. gingivalis之生存率（％ )所得之値 (% )表示。生存率=混合培養液中之八菌數γ 1(?(? 、單獨培養之尸適數 ③對於蛀牙之主要原因菌Streptococcus mutans MT 8148 株之抑制及抑制不溶性葡聚糖產生之試驗將 5ml之添加 0,7%之葡萄糖及 3%蔗糖於 GAM bouillon (日水）之液體培養基，放入先端離心管，進而將單獨 Streptococcus mutans MT 8148 株（菌數：ΐχ 1 06 C F U/ m 1 )(對照組）或分別與表1所示之3 0株之乳酸桿菌（菌數：1 X 1 〇6CFU/ml )混合接種。於好氣條件之 3 7 °C下，培養 24小時後，將培養液中 Streptococcus mutans之生菌數以瓊脂平板法測定，求出相對於單獨培 -17- (14) (14)1342750 養 Streptococcus mutans 時之 Streptococcus mutans 之生菌數（對照組’ 100% ),與Lactobacillus屬菌混合培養時之Streptococcus mutans之生菌數比率。以壞脂平板法測定Streptococcus mutans之菌數時，以 TCYSB 填脂培養基（40g/l 之 Trypticase soy agar(BBL)、0.3g/l之半胱氨酸、5g/l之酵母萃取物、 2〇〇g/l之蔗糖、5g/l之瓊脂及i〇u/ml之枯草桿菌素 (Bacitracin))作爲選擇性培養基，只培養 streptococcus mutans，測定菌數。亦即各採取iml之上述培養液，以上述嫌氣性稀釋液階段稀釋，將其0.1ml塗抹於上述之選擇培養基平板’於3 7°C下培養72小時，計數平板上所生成之菌落後，乘以稀釋倍數而求出其生菌數。相對於單獨培養 Streptococcus mutans 時之 Streptococcus mutans 生菌數（對照組，100% )，與 Lactobacillus 屬菌混合培養時之 Streptococcus mutans 之生囷數比半作爲Streptococcus mutans之生存率（％ )，與上述②同樣地計算。其結果之Streptococcus mutans之生存率（％ )如表1所示。因此，Lactobacillus屬菌對於 S. mutans之阻礙率（％ )係以對照組（1〇〇% )減去s. mutans之生存率（％)所得之値（％)表示。另一方面，關於不溶性葡聚糖測定，放入上述培養液之各先端離心管所附著之不溶性葡聚糖，以抹刀 (spatula )削落，以3,00〇rpm，離心1 5分鐘，收集沈澱物，以 PBS ( Phosphate Buffer Solution)洗淨 2 次後， -18- (15) 1342750 加入5ml之PBS成測定檢體。另外苯酚一硫酸法定量（糖、蛋白質、楣橋禮子著生化學實驗法 23 ) Streptococcus mutans 時，戶斤測定之各Lactobacillus屬菌混合培養時’ 糖量之比率（不溶性葡聚糖之生成率所示。因此，Lactobacillus屬菌對性葡聚糖阻礙率（％ )係以對照,1 mutans所產生之不溶性葡聚糖之生 (% )表示。，不溶性葡聚糖係以 ί鏈硏究法追補版高。相對於單獨培養不溶性葡聚糖量，與所測定之不溶性葡聚，％ )之結果如表1 於 S. mutans之不溶且（100% )減去 S. 成率（％ )所得之値 -19- (16) 1342750 表l:Lactobacillus屬各種乳酸菌株之增殖性、對於p.gingivalis JCM 8525株及S.mutans MT 8148 株之抑制效果(in vitro)以及不溶性葡聚糖之生成抑制效果培養條件好氣的嫌氣的好氣性好氣性 Lactobacillus屬增殖性 (第6小時之生菌數/ml) P.gingivalis 之生存率(％) S.mutans 之生存率(％) 不溶性葡聚糖之生成率(％) (1) Lactobacillus acidophilus A 5.0 xlO7 101 72 60 (2) L. acidophilus B 3.0 xlO7 111 111 80 (3) L. casei Ή1001 2.0 xlO7 106 106 100 (4) L. casei TI1002 6.2 xlO7 100 100 98 (5) L. rhamnosus TI1003 7.2 xlO7 111 111 69 (6) L. gasseri ΤΙ 1004 8.2 xlO8 55 55 11 (7) L. gasseri TI1005 4.6 xlO8 60 60 8 (8) L. gasseri TI1006 6.0 x10s 65 65 15 (9) L. johnsonii TI1008 4.0 xlO8 82 4 70 (10) L. salivarius ATCC11741 1.8 xlO9 5.2 0.9 28 (11) L. salivarius ATCC11742 1.2 xlO9 10 1.2 30 (12) L. salivarius TI1101 2.0 xlO9 5 0.5 26 (13) L. salivarius Til 102 3.0xl09 1.0 0.1 31 (14) L. salivarius Til 103 2.2 xlO9 5.2 2.0 28 (15) L. salivarius TI1104 1.6 xlO9 10.2 1.8 28 (16) L. salivarius TI1109 1.8 xlO9 5.0 3.0 26 (17) L. salivarius TI2700 2.6 xlO9 0.5 4.0 28 (18) L. salivarius TI2703 2.0 xlO9 4.8 2.6 26 (19) L. salivarius TI2704 2.0 xlO9 5.6 3.2 32 (20) L. salivarius TI2705 3.0 xlO9 0.1 1.0 28 (21) L. salivarius TI2706 3.2 xlO9 0.1 0.8 22 (22) L. salivarius TI2707 2.4 xlO9 0.2 2.8 30 (23) L. salivarius TI2708 2.2 xlO9 0.5 2.2 30 (24) L. salivarius TI2709 3.0 xlO9 0.05 1.0 28 (25) L. salivarius TI2710 3.6 xlO9 0.05 0.5 25 (26) L. salivarius TI2711 4.0 xlO9 0.002 0.05 20 (27) L. salivarius TI2714 2.2 xlO9 0.005 0.01 21 (28) L. salivarius TI2715 2.1 xlO9 10.1 0.1 26 (29) L. salivarius TI2721 3.0 xlO9 1.0 0.08 22 (30) L. salivarius TI2722 3.2xl09 2.0 0.08 24 (31) Control* 100 100 100 *)對照組係分別單獨培養P.gingivalis及S.mutans所得之菌數，以1〇〇(%)表示。 -20- (17) (17)1342750 如表1所示之結果顯示，30株Lactobacillus屬中，對於增殖性最佳之牙周病菌Porphyromonas gingivalis及虫主牙菌Streptococcus mutans之增殖，最強力抑制而且不溶性葡聚糖之產生量少，非常優異之菌株爲（26)號之 Lactobacillus salivarius ΤΙ 2711 株。試驗例 2: In vivo 中，Lactobacillus salivarius ΤΙ 2711 株對於無菌小鼠口腔內之 Porphyromonas gingivalis (牙周病原因菌）及Streptococcus mutans (蛀牙原因菌）之有效性 ①試驗方法實驗1 使用BALB/C 4週大之無菌小鼠，分爲對照組（感染後非投予組，η = 1 0 )，以及牙周病原因菌感染後投予組 (η= 10 )。分別對於感染後投予組及對照組，接種lx 109CFU/0.5ml 之牙周病原因菌之 Porphyromonas gingivalis JCM8525於口腔內，連續3天，合計3次，其次，於感染後第 1週，投予本發明之乳酸菌株之 Lactobacillus salivarius ΤΙ 2711 株（菌數爲 lx 1 〇9CFU/〇. 5ml )於感染後投予組，連續3日，合計3次。其後，分別於第1週、第2週及第4週將感染小鼠之口腔內，以充份浸染嫌氣稀釋液之無菌棉棒，充份拭取，採樣口腔內全部唾液，測定唾液中所含之 Porphyromonas gingivalis。Porphyromonas gingivalis 之菌數測定係與試 -21 - (18) (18)1342750 驗例1之②項同樣地進行。實驗2 使用B A L B / C 4週大之無菌小鼠，分爲對照組（感染後非投予組，η = 1 0 ) ’以及牙周病原因菌感染後投予組 (η = 10 )。分別對於感染後投予組及對照組，接種lx 109CFU/0.5ml 之蛀牙原因菌 Streptococcus mutans MT8148於口腔內，連續3天，合計3次，其次，於感染後第 1週，投予本發明之乳酸菌株之 Lactobacn丨us salivarius ΤΙ 2711 株（菌數爲 lx 109CFU/0.5ml)於感染後投予組，連續3曰，合計3次。其後，分別於第I週、第2週及第4週將感染小鼠之口腔內，以充份浸染嫌氣稀釋液之無菌棉棒，充份拭取，採樣口腔內全部唾液，測定唾液中所含之 Streptococcus mutans。Streptococcus mutans之菌數測定係與試驗例 1 之③項同樣地進行。以上in vivo中之實驗1及實驗2之說明槪要如圖10 所示。另外，實驗1及實驗2之結果如圖1及圖2所不。 (試驗結果）如圖1所示之實驗1結果顯示，對於無菌小鼠 (BALB/C )，比較投予本發明之乳酸菌株Lactobacillus salivarius ΤΙ 2711 株前後之牙周病原因菌之 -22- (19) (19)1342750

Porphyromonas gingivalis 之菌數時，依據 Wi】coxon 法之有意差檢定時，其有意差爲 P< 〇.〇〇1，於投予後之 Porphyromonas gingivalis 菌數明顯地減少。如圖 2所示之實驗 2結果顯示，對於無菌小鼠 C BALB/c )，連續 4週投予本發明之乳酸菌株 Lactobacillus salivarius TI 2711 株，調査姓牙原因菌之 Streptococcus mutans MT8148之菌數變化時，投予後之菌數，已於第I週時P< 〇.〇1，與投予前之菌數比較爲有意義地減少，即使至第4週，於統計學上亦持續地顯示有意義地減少（P < 〇 . 01 )。試驗例3 臨床試驗之說明由得到其書面同意之5 7名健康志願者，依循下述之說明，實施臨床試驗。將本發明之乳酸菌株 Lactobacillus salivarius TI 27】1株之冷凍乾燥菌末，調製成每錠含有140mg (菌數爲lx 108CFU/0.5ml )之錠果。使志願者於各餐間服用，每次5錠，每日5次，合計25錠。服用期間爲2個月，連續服用，進行採取唾液、口臭測定及醫師問診。以服用前爲第1次檢查，進行採取唾液、口臭測定 (探針測定器C21，InterScan社製、美國）及問診，同樣地於服用後第4週實施第2次檢查，於服用後第8週實施第3次最後檢查。 -23- (20) (20)1342750 圖1]係表示於本試驗例之臨床試驗之說明槪要圖。 ®唾液中之菌數測定法將1 0 0 // 1所採取之健康志願者（η = 5 7 )之唾液 > 加入900 /Ζ丨之滅菌嫌氣性稀釋液（參考試驗例1之①項）作爲原液（X 1倍液）’進而階段稀釋’調製成X 3、X 5、X 6倍之稀釋液，計量〇· 1ml，以曲玻棒塗抹於預先準備之如下所述之選擇培養基之瓊脂平板培養基。其後’進行3 7 °C之72小時培養，計數所出現菌落數，求出總菌數、Lactobacilli菌數、牙周病菌菌數及姓牙菌群菌數。其次，採取1白金耳之菌落，進行革蘭氏染色，於顯微鏡下確認。選擇培養基 *總菌數：使用BL瓊脂培養基及EG瓊脂培養基 * Lactobacilli :變法LBS瓊脂培養基 •牙周病菌（BPAR =嫌氣性革蘭氏陰性黑色桿菌）：EG-GM瓊脂培養基、BL瓊脂培養基 •蛀牙菌群(Streptococcus mutans、S. sobrinus): TCYSB瓊脂培養基

Φ)不溶性葡聚糖之定量：依據苯酚-硫酸法 © 口臭測定：使用探針測定器C21 ( InterScan社製、美國），測定溫度爲20°C 颂酸鹼値之測定：小型酸鹼値測量器（堀場製作所 -24- (21) (21)1342750 製） (試驗結果） ①關於口腔內總菌數所得之總菌數之結果如圖3所示。如圖3所示，認爲錠果服用前及服用4週後之口腔內總菌數，幾乎無有意差。 ②關於口腔內牙周病菌（BPAR=產生黑色色素之革蘭氏陰性嫌氣性桿菌）之變化所得之口腔內牙周病菌菌數之結果如圖4所示。如圖 4所示，服用前之具有檢出限界以下之菌數者有8名存在，其平均値爲1〇6 6i 13CFU/唾液總量，服用4週後，具有檢出限界以下之菌數者大幅增加至30名，其平均値爲 10s 3± 16CFU/唾液總量（P < 0.000 1 )。因此顯示服用 Lactobacillus salivarius TI 2711株可除菌及抑制病原菌之牙周病菌。 ③關於口腔內蛀牙菌（革蘭氏陽性之黏液鏈球菌）之變化所得之口腔內駐牙菌菌數之結果如圖5所示。如圖5 所示，認爲服用前後之唾液中黏液鏈球菌菌數，無有意差a -25- (22) (22)1342750 ④關於口腔內乳酸菌之變化所得之口腔內乳酸菌菌數之結果如圖6所示。如圖6 所示，關於口腔內乳酸菌之菌數，認爲服用前後無有意差。 ⑤唾液酸鹼値之變化唾液酸鹼値變化之測定結果如圖7所示。關於服用前之5 7名，彼此間之酸鹼値差異大（酸鹼値變化幅度）亦大，其平均値以PH7.0±0.7表示，服用4週後，其酸鹼値之差異變小，其平均値以PH7.3 ± 0.2表示，顯示大約與血液之酸鹼値同値。亦即，顯示正常地保持唾液酸鹼値。此現象亦可見於8週後，維持正常的酸鹼値，而且彼此間之差異亦非常地小。這些結果是由根本顛覆給予人類乳酸菌時是否促進乳酸產生，助長蛀牙疑問之數據，其臨床上意義係極爲重要的結果。 ⑧關於唾液中不溶性葡聚糖產生量之變化唾液中不溶性葡聚糖產生量之測定結果如圖8所示。如圖8所示，服用前之唾液中不溶性葡聚糖量之平均値爲 9.9± 6.0mg/唾液總量，服用後第4週，平均値爲7.6土 5.8mg/唾液總量（P<0.05)，認爲具有於統计學上有意差。進而，於第8週，平均値爲4.2± 2.2 mg/唾液總量（P <0.001)，認爲服用 Lactobacillus salivarius TI 2711 株，具有效果和劑量相關性（Dose Response -26- (23) (23)1342750

Correlation )。此乃依據臨床試驗所示之構成本發明乳酸菌株之有效性之科學根據之一部份証據。亦即，本發明之乳酸菌株係可阻止齒垢（Dental plaque)之主要原因物質之不溶性葡聚糖產生，由根本可阻斷嫌氣性之牙周病菌或蛀牙菌之繁殖場所，認爲可得到完全抑制蛀牙或牙周病等之慢性感染症之進展、發病及再發之手段。另外，長期服用 Lactobacillus sal ivarius TI 2711 株時，因爲可如上所述使唾液之酸鹼値成爲正常，而且使齒垢難以形成，所以抑制口腔內細菌於齒垢內部產生酸，強烈顯示對於蛀牙或牙周病之預防或輕度病例之治療有所助益。 ⑦關於以探針測定器測定口臭之結果口臭測定係使用探針測定器測定健康者吐氣中之揮發性硫化合物量。發生口臭之主要原因之一，可舉例因爲牙周病菌之蛋白質分解。亦即，牙周病菌係因爲具有非常高的蛋白質分解酵素（protease )活性，容易分解本菌營養源之一之口腔內食物殘渣等之蛋白質，而產生H2S或 CH3SH及其他之Thiol (毓基）類及Sulfide類（硫化物）等之揮發性硫化物（VSC = Volatile Sulfurated Compound)之口臭原因物質者。使用探針測定器，於室溫（2〇°C )下測定57名之服用含有本發明之乳酸菌株錠果前之健康志願者之吐氣中之揮發性硫化物量，以RU値 (Response U n i t，p p b = p ar t s per billion )爲 65ppb 以上之 2〇名志願者爲對象，進行服用後之追蹤測定。其結果如 -27- (24) (24)1342750 圖9所示。如圖9所示，該20名之口臭RU値，於服用前爲164 ± 96ppb (平均土標準誤差），於服用後第4週降低爲94 ±21ppb，認爲於統計學上極具有意差（P<〇.〇〇5)。另外，於第8週之測定，RU値降低爲90± 21ppb， 65ppb以下之幾乎未感覺口臭之正常者有13名存在（P< 0.00 1 )。亦即，以服用前之有口臭之志願者數爲100%時，其數目於第4週減少爲52%，並且於第8週減少爲38%。這些結果，大致上顯不Dose Response Correlation，顯示長期服用本發明之乳酸菌株，可除去口臭。另外，因本發明之乳酸菌株之 Lactobacillus salivarius ΤΙ 2711株之抑制牙周病菌之事實及抑制發生口臭之事實係非常相關的。另外，依據5 7名之醫師問診結果，認爲全例中均無腹部症狀發生。試驗例4 添加各種寡糖及糖醇類及接種 Lactobacillus salivarius ΤΙ 2711 株，對於 Streptococcus mutans 產生不溶性葡聚糖之抑制效果（in vitro ) 試驗方法含有0.7%之葡萄糖及3%之蔗糖於GAM bouillon -28- (25) (25)1342750 (日水）爲基礎培養基之液體培養基中，分別加入5%之木糖醇、赤蘚醇及山梨糖醇之糖醇以及果寡糖及酮糖之寡糖，接種 lx 107CFU/ml 之 Streptococcus mutans MT 8 1 4 8株於各培養基，於3 7 °C下，進行2 4小時好氣培養。另一方面，於上述之添加5%之糖醇類及寡糖之培養基，分別接種 lx l〇7CFU/ml 之 Streptococcus mutans MT 8148 株後，再接種 lx 107CFU/ml 之 Lactobacillus s a 1 i v a r i u s TI 2 7 1 1株，同樣地於3 7 °C下，進行2 4小時好氣培養。培養終了後，進行二者之 Streptococcus mutans MT 8 1 48株菌量測定及不溶性葡聚糖之定量（試驗例1所記載之方法）。其結果如表2所示。試驗結果如表2所示，糖醇類及寡糖中，最能阻礙不溶性葡聚糖產生之物質爲赤蘚醇，僅赤蘚醇時，約可阻礙 60%，另外，接種 Lactobacillus salivarius ΤΙ 2711 株混合培養之結果，認爲具有其相加或相乘效果，以不接種 Lactobacillus salivarius時之不溶性葡聚糖量爲 100% 時，顯示約90%之阻礙率，而得到良好的結果。 -29- (26)1342750 表2 雜及糖醇不接種 L. sali varius 接種 L.salivarius (添加5%) S.mutans之生菌數不溶性葡聚糖量 S .mutans之生菌數不溶性葡聚糖量 (CFU/ml) (μβ/mi) (CFU/ml) (μ g / m 1) 木糖醇 4.0 x 105 5,992 5.0 χ 105 1,996 赤蘚醇 1.0 χ 105 4,324 1.0 χ ΙΟ4 962 山梨糖醇 4.0 χ 105 4,384 3.0 χ 105 1,691 果_ 4.0 χ ΙΟ5 6,659 2.0 χ ΙΟ5 1,892 嗣糖 5.0 χ ΙΟ5 7,392 2.0 χ ΙΟ5 2,886 對照(基礎培養基) 4.0 χ ΙΟ5 11,160 2.0 χ ΙΟ5 2,394 -30 - (27) 1342750 實施例 1 :調製 Lactobacillus sa 丨 ivarius ΤΙ 2711 株之乾燥菌體將 Lactobacillus salivarius ΤΙ 2711 株，接種於含有 0.3 %碳酸鈣之Brix. River液體培養基後，於37 °C下，進行18小時之靜置培養。培養終了後，進行7,000 rpm之 1 5分鐘離心分離，而得1 / 1 00之培養液量之濃縮菌體。

其次，於該濃縮菌體中，與同量之含有5% (重量）之 glutamic acid soda、5% (重量）之可溶性殿粉及 5% (重量）之蔗糖之分散媒混合，修正酸鹼値爲7.0%後，以-40°C以下冷凍，進行冷凍乾燥。將所得之冷凍乾燥菌末，以60網目之篩子上粉末化，調製成本發明之乳酸菌末。另外，關於本菌之保存安定性，將乳酸菌末於室溫 2 4 °C之密封條件下（鋁層合袋）保管1 0個月，確認其菌數並未降低。

實施例2 :製造醫藥品生菌製劑（錠劑）依據第1 2改正日本藥局方解說書製劑總則「錠劑」之規定，將 2g之實施例 1所調製之 Lactobacillus salivarius ΤΙ 271 1株乾燥菌末（相當菌數爲 5 χ 1 〇9CFU/g )，加入161g之乳糖（日局）、1 16g之澱粉 (日局）' 20g之結合劑之聚乙烯吡咯烷K25(日局）及 0.8g之滑澤劑之硬脂酸鎂（日局），混合均勻，以打錠機壓縮成型，製造290g之每錠3〇〇mg之素錠。 -31 - (28) (28)1342750 實施例3:製造含有乳酸菌之食品（錠果）參考第1 2改正日本藥局方解說書製劑總則「錠劑」之項目，將 0.7g 之 Lactobacillus salivarius TI 2711 株乾燥菌末（相當菌數爲5x 109CFU/g)，加入47g之赤蘚醇、47g之山梨糖醇、2.5g之1 一薄荷醇、1.5g之香料 (萊姆）以及1 .3g之作爲滑澤劑之日本國食品添加物所指定之蔗糖脂肪酸酯，混合均勻，以打錠機壓縮成型，製造95g之每錠300 mg之素錠。實施例4 :製造含有乳酸菌之食品（口香糖）預先枰量 l〇g 之 Lactobaci 丨 lus salivarius TI 2711 株乾燥菌末（相當菌數爲5x 109CFU/g) 、160g之赤蘚醇、 160g之山梨糖醇、20g之作爲香料之薄荷油以及150g之口香糖基本材料（食品添加物），使用製造口香糖用之捏和機將口香糖基本材料充份混煉後，將預先混合均句之甘味料之赤蘚醇及山梨糖醇以及Lactobacillus salivarius TI 2 7 1 1株乾燥菌末者，於混煉口香糖基本材料時，逐次少量加入，混煉均勻，最後加入薄荷油，賦予香味，混煉均勻。混煉終了後，由捏和機取出口香糖塊，以壓延滾輪製作成厚度爲3mm之片狀口香糖’於恆溫室熟成2日後，裁成市售之片狀口香糖大小，而製成口香糖。實施例5 :製造含有乳酸菌之食品（醱酵乳）依據種菌 Lactobacillus acidophilus 及 Lactobacillus -32- (29) (29)1342750 salivarius ΤΙ 2711株之混合培養而製造將酸酵乳之種菌之 Lactobacillus acidophilus，接種於含有23g之脫脂奶粉、l.Og之酵母萃取物及0.06g之維生素C之還原脫脂培養基，於3 7 °C下，靜置培養1 6小時者成爲大量種菌（bulk starter) 另一方面，於生乳及脫脂奶粉所成之原料混合物中，分別接種 5 %之實施例 1 所調製之 Lactobacillus salivarius ΤΙ 2711株培養液以及先前所調製成之大量種菌培養液，於3 7°C下，進行培養1 6小時，而得醱酵乳。使用本發明之菌株所製造之醱酵乳係風味佳且美味之喜好性高之製品。〔產業上利用性〕關於本發明之 Lactobacillus salivarius TI 2711 株，進行in vitro試驗，使用無菌小鼠之in vivo試驗以及長期臨床試驗（n==57)之結果，証實任一項試驗中，對於口腔內細菌群之正常化、牙周病菌或蛀牙菌之抑制以及防止發生口臭等，均具有有效性。亦即，服用或攝取本發明之菌株，使口腔內細菌群正吊化，其結果可抑制牙周病菌或蛀牙菌，並且可抑制口臭’本發明之菌株作爲可使用於保持唾液生理上正常的酸驗値、防止或治療牙肉炎、牙周炎及牙周病之發生、預防或治療蛀牙之發生以及預防發生口臭及除去口臭等之生菌 Μ劑或含有乳酸菌之食品之成份係有用的。 -33- (30) (30)1342750 【圖式簡單說明】圖1係表示L. salivarius TI 271 1株對於小鼠口腔內之 P.gingivalisJCM 8525 之抑制效果（invivo)圖。圖2係表示L. salivarius TI 2711株對於小鼠口腔內之 S.mutansMT8148 之抑制效果（invivo)圖。圖3係表示人類口腔內總菌數之變化圖。圖4係表示人類口腔內牙周病菌（BPAR )菌數之變化圖。圖 5係表示人類口腔內黏液鏈球菌（Streptococcus mutans)菌數之變化圖。圖6係表示人類口腔內乳酸菌菌數之變化圖。圖7係表示人類唾液酸鹼値之變化圖。圖8係表示人類唾液中之不溶性葡聚糖（glucan)量之變化圖。圖9係表示以探針測定器測定人類口臭之結果圖。圖1 0係表示於試驗例2之實驗1及實驗2之說明槪要圖。圖1 1係表示於試驗例3之臨床試驗之說明槪要圖》 -34-

Claims

1342750 i 公告丨 , η·：' \_____1 詠义 **、 -一—---_ j 第092107146號專利申請案中文申請專利範圍修正本民國100年3月9日修正拾、申請專利範圍 1- —種使用於防止或治療牙肉炎、牙周炎及牙周病之發生的生菌製劑，其特徵爲以乳酸菌 Lactobacillus salivarius ΤΙ 2711 株（BCRC 910225)爲有效成份。 2- 一種使用於預防或治療蛀牙之發生的生菌製劑，其特徵爲以乳酸菌 Lactobacillus salivarius ΤΙ 2711 株（ BCRC 9 1 022 5 )爲有效成份。 3. —種使用於預防發生口臭及除去口臭的生菌製劑 ’其特徵爲以乳酸菌 Lactobacillus salivarius TI 2711 株 (BCRC 9 1 0225 )爲有效成份。 4. —種使用於防止或治療牙肉炎、牙周炎及牙周病之發生的含有乳酸菌之食品，其特徵爲以乳酸菌 Lactobacillus salivarius ΤΙ 2711 株(BCRC 910225)爲有效成份。 5. —種使用於預防或治療蛀牙之發生的含有乳酸菌之食品，其特徵爲以乳酸菌 Lactobacillus salivarius TI 2711株（BCRC 910225)爲有效成份。 6. —種使用於預防發生口臭及除去口臭的含有乳酸菌之食品，其特徵爲以乳酸菌Lactobacillus salivarius TI 2711株（BCRC 910225)爲有效成份。 7. —種乳酸囷’其特徵爲，Lactobacillus salivarius ΤΙ 2711 ^ ( BCRC 910225)。 T342750 8. —種菌體，其特徵爲純培養乳酸菌Lactobacillus salivarius ΤΙ 2711 株（BCRC 910225)所製得。 9. 一種乾燥菌體，其特徵爲乾燥乳酸菌 Lactobacillus salivarius ΤΙ 2711 株(BCRC 9 1 0 2 2 5 )之菌體所製得。 10. —種乳酸菌 Lactobacillus salivarius TI 2711 株 (BCRC 9 1 0225 )之使用，其特徵爲製造生菌製劑或含有 φ乳酸菌之食品。 1 1 ·如申請專利範圍第1項之生菌製劑，其爲進一步含有選自糖醇及寡糖之物質，且使用於防止或治療牙肉炎、牙周炎及牙周病之發生。 1 2 .如申請專利範圍第1項之生菌製劑，其爲進一步含有選自糖醇及寡糖之物質，使用於預防或治療蛀牙之發生。 1 3 ·如申請專利範圍第】項之生菌製劑，其爲進一步鲁含有選自糖醇及寡糖之物質，且使用於預防發生口臭及除去口臭。 1 4 .如申請專利範圍第丨項至第3項中任一項之生菌製劑’其爲進一步含有選自糖醇及寡糖之物質。 15.如申請專利範圍第1項至第3項中任一項之生菌製劑’其爲進一步含有赤蘚醇。 1 6 ·如申請專利範圍第4項至第6項中任一項之含有乳酸困之食品’其中進一步含有選自糖醇及寡糖之物質，且使用於防止或治療牙肉炎、牙周炎及牙周病之發生。 S -2- 1342750 17. 如申請專利範圍第4項至第6項中任一項之含有乳酸菌之食品，其中進一步含有選自糖醇及寡糖之物質’ 且使用於預防或治療蛀牙之發生。 18. 如申請專利範圍第4項至第6項中任一項之含有乳酸菌之食品，其中進一步含有選自糖醇及寡糖之物質，且使用於預防發生口臭及除去口臭。 19. 如申請專利範圍第4項至第6項中任一項之含有乳酸菌之食品’其中進一步含有選自糖醇及寡糖之物質。 2 0.如申請專利範圍第4項至第6項中任一項之含有乳酸菌之食品’其中進一步含有赤蘚醇。