WO2024014882A1 - 폴리아민 고생산 바실러스 코아귤란스 균주 - Google Patents

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WO2024014882A1
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WO
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polyamine
spores
culture
bacillus coagulans
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PCT/KR2023/009974
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이해익
이도영
김희웅
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이해익
이도영
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    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus

Definitions

  • the present invention relates to strains of the genus Bacillus that produce large amounts of polyamines under anaerobic conditions. More specifically, it relates to the Bacillus coagulans PA strain, which proliferates in the intestines of animals under anaerobic conditions, produces polyamines, and supplies them directly to the animals. Through this process, polyamines are continuously produced in the intestines and are continuously absorbed into the body.
  • Polyamines are substances that exist in large quantities within cells, and various physiological meanings of polyamines have recently been discovered.
  • the physiological effects expected from the intake of polyamines include anti-aging, lifespan extension, anti-inflammatory, and cell rejuvenation effects. Accordingly, interest in polyamines or polyamine compositions has increased, and efforts are being made to apply them to everyday processed foods, health foods, cosmetics, etc.
  • Examples of technology for producing polyamines for food include fish testes (Japanese Patent Laid-open No. 8-238094), yeast cells (Japanese Patent Laid-Open No. 2001-008663, Japanese Patent Laid-Open No. 2001-095483), soybeans or rice embryos. (Japanese Patent Laid-Open No. 10-101624, Japanese Patent Laid-Open No. 2007-291027), etc., a method for extracting polyamines has been proposed.
  • the disclosed method of extraction from animals, plants and various materials requires complex extraction and separate purification processes for the production of polyamines, so production costs are high, and especially when plants are used as raw materials, putrescine, a polyamine with a strong unpleasant odor, is used. Since it contains a large amount of putrescine, processed products made from it remain a problem that needs to be solved, such as low preference or content.
  • Polyamines are supplied to the body by being synthesized naturally within cells from precursors such as ornithine, or polyamines contained in food or polyamines synthesized by intestinal bacteria are absorbed into the body through the intestinal tract, becoming an important source. In young, growing individuals, polyamine synthesis occurs actively, but with age, the ability to synthesize polyamines decreases. Therefore, consuming foods containing large amounts of polyamines or polyamines synthesized by intestinal bacteria are important in maintaining polyamine levels in the body.
  • the purpose of the present invention is to provide a novel strain that has the ability to produce large amounts of polyamines in the human intestine and supply them to the human body.
  • the present invention provides a Bacillus coagulans PA strain (accession number KCTC 14266BP), which has the ability to produce polyamines.
  • the strain is characterized by having a 16s rRNA sequence represented by SEQ ID NO: 1, and is capable of producing polyamines, especially spermidine, at high content and with high efficiency under aerobic and anaerobic conditions.
  • the present invention provides a culture or spore containing polyamine, obtained by fermentation or culturing using the above strain.
  • the present invention provides a food composition, feed composition, and cosmetic composition containing the above strain, its spores, its culture, or its fermentation product.
  • the present invention provides a method for producing polyamine including the step of fermentation using the above strain.
  • the present invention provides a composition for promoting hair growth and a composition for improving skin, comprising as an active ingredient any one or more selected from the group consisting of the strain, its culture, its spores, and its fermented product.
  • the present invention provides a beverage with increased polyamine content fermented using the above strain.
  • the present invention provides a method for promoting hair growth comprising administering to an individual an effective amount of at least one selected from the group consisting of the above-mentioned strain, its culture, its spores, and its fermented product.
  • the present invention provides a skin improvement method comprising administering to an individual an effective amount of at least one selected from the group consisting of the above-described strain, its culture, its spores, and its fermented product.
  • the Bacillus coagulans PA strain according to the present invention continuously produces polyamines not only under aerobic conditions but also in the anaerobic intestine, so it can be absorbed from the intestines and have the effect of increasing the concentration of polyamines in the blood.
  • the strain administered as needed can be excreted and used safely.
  • Bacillus coagulans PA strain of the present invention forms spores in an inexpensive medium and can be supplied in the form of spores, so separate fermentation costs and processing costs for polyamine production are not required, thereby reducing production costs. Since it does not cause problems such as fermentation odor, it can be applied to various types of foods.
  • Bacillus coagulans PA strain of the present invention has the effect of promoting hair growth, it is also useful as a pharmaceutical, food or cosmetic composition for promoting hair growth and as a composition for improving skin.
  • Figure 1 shows the 16s rRNA base sequence represented by SEQ ID NO: 1 of the Bacillus coagulans PA strain.
  • Figure 2 is a schematic diagram showing the taxonomic position of the Bacillus coagulans PA strain.
  • Figure 3 shows the results of TLC analysis of polyamines produced by Bacillus coagulans PA strain cultured under aerobic or anaerobic conditions: 1 is Bacillus coagulans ATCC7050 strain, 2 is B. Bacillus coagulans PA strain. Each was cultured aerobically, 3 to 5 are polyamine standard materials of different concentrations, 6 is Bacillus coagulans ATCC7050 strain, and 7 is Bacillus coagulans Each was cultured anaerobically with the PA strain. B. coagulans ATCC7050 strains 1 and 6 are strains that produce small amounts of polyamines at a normal level.
  • Figure 4 is a chromatogram confirming the dansyl derivative of the polyamine of the strain culture by HPLC to confirm the polyamine produced by the Bacillus coagulans PA strain (A: spermidine standard, B: Bacillus coagulans PA culture solution )am. At this time, the peak that appears at a retention time near 27 minutes is spermidine.
  • Figure 5 is a comparative photo of hair 10 days, 30 days, and 100 days after taking the Bacillus coagulans PA strain of the present invention.
  • Figure 6 is a comparative photo of the improvement of wrinkles under the eyes after taking 10 9 cells of the Bacillus coagulans PA strain spores of the present invention every day for 4 weeks.
  • Bacillus coagulans PA proliferates well in the intestinal tract and as a result has the effect of increasing the concentration of polyamines in the blood.
  • the strain or its spores can be administered directly, providing an economical and simple method of supplying polyamines to the body. can be provided.
  • the present invention provides a Bacillus coagulans PA strain (accession number KCTC 14266BP), which has the ability to produce polyamines.
  • the strain of the present invention can be obtained by isolating facultative anaerobic bacteria that form heat-resistant spores from rice straw and hay, and selecting strains that mass-produce high polyamine content through a mutagenesis process.
  • the selected strain can produce polyamines, especially spermidine, under aerobic or anaerobic conditions.
  • spermidine can be produced under both aerobic and anaerobic conditions.
  • spermidine can be produced at a high content of 120 ⁇ g/mL or more in aerobic culture and about 90 ⁇ g/mL or more in anaerobic culture in 5% soybean medium. was confirmed.
  • the strain of the present invention is characterized by having a 16s rRNA sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the strain of the present invention can be provided in various forms.
  • it can be provided in the form of a culture or spore containing polyamine, which is obtained by fermentation or culturing using the above strain.
  • the present invention provides a food composition, feed composition, and cosmetic composition containing the Bacillus coagulans PA strain, its spores, its culture, or its fermentation product.
  • spore refers to a resting cell of a bacterium, and for the purposes of the present invention, the spore refers to a resting cell of Bacillus coagulans PA.
  • the Bacillus coagulans PA strain provided by the present invention is useful for spores germinating in the intestines of animals, proliferating into vegetative cells, directly producing polyamines, and continuously supplying them to the host.
  • the term "culture” refers to a product obtained after culturing the above-mentioned strain, and may be a culture stock solution containing bacteria, or may be a culture strain or bacteria obtained by removing or concentrating the culture supernatant.
  • the composition of the culture may include not only the components necessary for normal Bacillus coagulans culture, but also additional components that act synergistically on the growth of Bacillus coagulans, and the composition accordingly can be prepared by anyone skilled in the art. It can be easily selected by .
  • the newly isolated Bacillus coagulans PA of the present invention can be cultured through a conventional culture method of Bacillus coagulans strains, but is not limited thereto.
  • a medium natural medium or synthetic medium can be used.
  • glucose, sucrose, dextrin, glycerol, starch, etc. can be used as carbon sources for the medium, and nitrogen sources can be soybean hot water extract, peptone, meat extract, yeast extract, defatted soybean meal, ammonium salts, nitrates, and other organic or inorganic substances.
  • Nitrogen-containing compounds may be used, but are not limited to these components.
  • Inorganic salts included in the medium may include magnesium, manganese, calcium, iron, and phosphorus, but are not limited to these.
  • amino acids, vitamins, nucleic acids, and compounds related thereto may be added to the medium.
  • the term "fermented product” refers to a medium obtained by inoculating and culturing (fermenting) Bacillus coagulans PA strain in a medium containing the main ingredients of food, or a culture containing microorganisms cultured with the medium. it means. Additionally, the fermented product may be a culture obtained by inoculating and culturing Bacillus coagulans PA strain on food raw materials.
  • the food raw materials may be grains, grain-derived foods, etc., and the grains may be soybeans, rice, barley, wheat, corn, etc., and preferably soy milk or green tea, but are not limited thereto.
  • the fermentation product may be comprehensively interpreted as including all filtrate, dilution solution, concentrate thereof, crude preparation, purification product, dried product, pulverized product, etc. of the medium or culture, but is not limited thereto.
  • the food composition, feed composition, and cosmetic composition according to the present invention may exhibit hair growth promoting effects and skin improving effects.
  • the skin improvement may mean skin aging improvement, wrinkle improvement, skin regeneration, or scalp improvement, and preferably may mean wrinkle improvement.
  • the term “food” refers to a natural product or processed product containing one or more nutrients, preferably in a state that can be eaten directly after a certain degree of processing, and has the usual meaning. As such, it may include all foods, food additives, health functional foods, and beverages.
  • the above-mentioned “health functional food” refers to a food group or food composition that has added value so that it acts and manifests the function of the food for a specific purpose, and is designed to sufficiently express the body's regulatory functions related to biological defense rhythm regulation, disease prevention and recovery, etc. to the living body. It means processed food.
  • the functional food may further include food auxiliary additives, appropriate carriers, excipients, and diluents that are foodologically acceptable.
  • the “feed composition” may include both animal feed and additives for animal feed.
  • the feed composition of the present invention may be in the form of a dry or liquid preparation, and may further include other non-pathogenic microorganisms or enzyme preparations in addition to the strain, its spores, its culture, or its fermentation product.
  • Raw materials for feed include various grains and soybean proteins, as well as peanuts, peas, sugar beets, pulp, grain by-products, animal intestine powder, and fish meal powder, etc., which can be used without limitation.
  • the “cosmetic composition” can be used as an external skin preparation and can be applied directly to the required area.
  • it can be manufactured into various dosage forms such as ointment, cream, emulsion, shampoo, rinse, soap, etc.
  • the cosmetic composition of the present invention may further include at least one additive selected from the group consisting of purified water, oil, surfactant, moisturizer, stabilizer, alcohol, thickening agent, chelating agent, colorant, preservative, and fragrance.
  • the food composition, feed composition, or cosmetic composition containing the strain, its spores, its culture, or its fermentation product of the present invention may contain the strain in the form of spores, and 10 4 to 10 14 spores per 1 g. can be included.
  • the present invention provides a method for producing polyamine including fermentation using the above strain.
  • the fermentation may be fermentation of soy milk or green tea, and the polyamine may be spermidine.
  • fermentation may be performed by inoculating 10 1 to 10 9 cell/mL of the strain into the soy milk or green tea, preferably inoculating 10 4 to 10 8 cell/mL.
  • the fermentation may be performed at 30 to 50°C for 20 to 80 hours, and preferably may be cultured at 37 to 47°C for 24 to 72 hours after strain inoculation.
  • the present invention provides a composition for promoting hair growth, comprising as an active ingredient at least one selected from the group consisting of the strain, its culture, its spores, and its fermented product.
  • the composition for promoting hair growth may be a food composition for promoting hair growth, a cosmetic composition, a feed composition, or a pharmaceutical composition.
  • the present invention provides a composition for improving skin, comprising as an active ingredient any one or more selected from the group consisting of the above strain, its culture, its spores, and its fermentation product.
  • the composition for improving skin may be a food composition, cosmetic composition, feed composition, or pharmaceutical composition for improving skin.
  • composition for promoting hair growth and the composition for improving skin of the present invention, the specific meanings of the strain, food composition, cosmetic composition, and feed composition are as described above.
  • the pharmaceutical composition for promoting hair growth and the pharmaceutical composition for improving skin according to the present invention include the live cells of the strain of the present invention, the form of the dried strain, spores, culture of the strain, lysate of the strain, and fermentation product of the strain itself. It may be provided as a composition, or it may be provided as a composition that can be combined with a pharmaceutically acceptable carrier or medium.
  • the pharmaceutical composition for promoting hair growth according to the present invention may refer to a pharmaceutical composition for treating or preventing hair loss.
  • the pharmaceutical composition for improving skin according to the present invention may refer to a pharmaceutical composition for treating or preventing skin aging diseases or skin wrinkles.
  • the pharmaceutical composition for hair growth promotion and the pharmaceutical composition for skin improvement of the present invention may be formulated using methods known in the art to provide rapid, sustained or delayed release of the active ingredient after administration to a mammal, respectively. You can.
  • the dosage form may be in the form of powder, granule, tablet, emulsion, syrup, aerosol, soft or hard gelatin capsule, sterile injectable solution, or sterile powder, and may be provided as an enteric-coated enteric preparation as an oral unit dosage form.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention can be administered through several routes, including orally, transdermally, subcutaneously, intravenously, or intramuscularly, and the dosage of the active ingredient depends on the route of administration, the patient's age, gender, weight, and patient's severity. It can be appropriately selected according to various factors such as, and the pharmaceutical composition according to the present invention can be administered in parallel with a known therapeutic agent that has the effect of preventing, improving, or treating the symptoms of hair loss disease.
  • the pharmaceutical composition for promoting hair growth and the pharmaceutical composition for improving skin of the present invention may also be provided as a quasi-drug composition for promoting hair growth and a quasi-drug composition for improving skin.
  • the quasi-drugs may include external skin preparations and personal hygiene products.
  • it may be a disinfectant cleaner, shower foam, garnish, wet tissue, detergent, soap, hand wash, or ointment, but is not limited thereto.
  • compositions or quasi-drug composition of the present invention include all animals, including humans.
  • it may be a mammal such as a dog, cat, or mouse, but is not limited thereto.
  • the present invention provides a beverage with increased polyamine content fermented using the above strain.
  • the beverage may refer to fermented beverages such as fermented soymilk, fermented tea, fermented milk, fermented soybean beverage, and soymilk-yogurt, but is not limited thereto.
  • the present invention provides a method for promoting hair growth comprising administering to an individual an effective amount of at least one selected from the group consisting of the above-mentioned strain, its culture, its spores, and its fermented product.
  • the present invention provides a skin improvement method comprising administering to an individual an effective amount of at least one selected from the group consisting of the above-described strain, its culture, its spores, and its fermented product.
  • the hair growth promotion method or skin improvement method of the present invention includes administering an effective amount of the above-mentioned strain, its culture, its spores, or its fermentation product to an individual.
  • the specific effective amount for a specific subject depends on the type and degree of response to be achieved, the specific composition including whether other agents are used as the case may be, the subject's age, weight, general health, gender and diet, time of administration, and route of administration. It is desirable to apply it differently depending on various factors including the secretion rate of the composition, administration period, drugs used together or simultaneously with the specific composition, and similar factors well known in the field of health functional foods.
  • the daily dosage is 0.0001 to 100 mg/kg, preferably 0.01 to 100 mg/kg, based on the amount of the active ingredient of the present invention, and can be administered 1 to 6 times a day.
  • the dosage or administration of each active ingredient must be such that the content of each active ingredient is too high and does not cause side effects. Therefore, it is desirable to determine the effective amount of the composition suitable for the purpose of the present invention by considering the above-mentioned matters.
  • Microorganisms were isolated from approximately 400 samples of hay and silage collected in Korea. Each sample was suspended by adding a small amount of sterile saline solution, then heat-treated in a constant temperature water bath at 80°C for 20 minutes. The resulting spore liquid was spread on MRS plate medium and cultured at 55°C for 48 to 72 hours, and then plated on MRS plate containing 0.7% calcium carbonate. It was spread on a plate medium and cultured in an anaerobic incubator at 45°C for 3 to 5 days to isolate bacteria forming a clear zone. The polyamine production of the isolated bacteria was examined through the following examples.
  • Example 1 To investigate the production amount of polyamine produced by the bacteria isolated in Example 1, the strain was inoculated into a medium suspended in 5 ml of 5% soybean flour and cultured aerobically and anaerobically at 45°C for 48 hours. 1 ml of 5% HClO 4 was added to 1 ml of 5% soybean medium after the culture was completed, shaken for 6 hours, and the culture solution was centrifuged to measure the amount of polyamine from the supernatant.
  • cyclohexane: ethyl acetate 3: 2 (v/v) was used as a developing solvent, and 1 to 3 ⁇ l of dansyl-treated sample and spermidine were used. After loading and developing 1 to 3 ⁇ l of the spermidine standard, take pictures under ultraviolet light and measure the intensity of the spot with a densitometer to calculate the amount of spermidine from the standard curve. was quantified.
  • Bacillus coagulans was selected according to the method of analyzing the taxonomic characteristics of Bacillus strains according to the Burgess Manual (Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 2002 ). ) were selected for the second round of 6 types of bacteria classified as Each of these six strains was classified as Bacillus coagulans by analyzing 16sRNA, and the Phy53 strain with the highest polyamine productivity (spermidine, ⁇ g/mL) was selected (Table 2).
  • Phy53 strain cultured in MRS liquid medium at 37°C for 30 hours was centrifuged to collect bacterial cells and suspended in 0.8% saline solution at pH 7.0. Mutations were induced by adding 100 ⁇ g/ml of nitrosoguanidine (NTG) and adjusting the treatment time to achieve a death rate of 99.9%, and then cultured in Spizizen minimal medium containing 5mM dicyclohexylamine. 10 5 per sheet were smeared and cultured at 37°C for 5 days. The surviving bacteria were cultured in 5% soybean medium for 36 to 72 hours, and then the amount of polyamine produced was measured.
  • NVG nitrosoguanidine
  • Bacillus coagulans Phy53 ⁇ the strain that formed heat-resistant spores and had the highest polyamine production was selected and named Bacillus coagulans Phy53 ⁇ . Afterwards, mutations were induced in the Bacillus coagulans Phy53 strain using the same process as above, and the strain with the highest polyamine production was finally selected, which was named Bacillus coagulans PA. .
  • Bacillus colonies formed on MRS agar plates of the Bacillus coagulans PA strain were small and flat, had smooth rounded edges, and had a matte white appearance on the surface.
  • Bacillus coagulans As a result of microscopic observation in the logarithmic phase of bacterial growth using MRS liquid medium, it had a short rod-shaped appearance similar to the comparative strain Bacillus coagulans, the strain was Gram positive, and the spores were located in the center of the bacterial body and were involved in spore production. Accordingly, the bacteria expanded.
  • gelatin, and starch produces acid from glucose, but does not produce acid from arabinose, xylose, or mannitol, is catalase positive, and grows under aerobic and anaerobic conditions.
  • the Bacillus coagulans PA strain of the present invention and the Bacillus coagulans ATCC7050 strain which is a strain that produces a small amount of polyamine at a typical level, were cultured under aerobic or anaerobic conditions, respectively, and polyamine production was confirmed by TLC. Confirmed. After developing the dansyl derivative of the strain culture by TLC, the spots that appeared under ultraviolet light were compared with the migration distance of the polyamine standard material, and the results are shown in Figure 3. As a result of the analysis, polyamine spots such as spermine and putrescine were confirmed in the cultures of each strain (1, 2, 6, 7), and in particular, the Bacillus coagulans PA strain of the present invention was identified. When cultured aerobically (2) and anaerobically (7), spots of spermidine, which were not visible in the ATCC7050 strain (1, 6), appeared in very dark concentrations.
  • the processed product of the B. coagulans PA strain of Example 2 of the present invention is mainly used in the form of spores, it is advantageous to form a high concentration of spores in the culture medium.
  • spores were obtained through the following process.
  • 3% of the pre-culture medium was inoculated into the main culture medium consisting of 5% soybean extract, 0.5% glucose, 0.5% yeast extract, 0.1% potassium phosphate dibasic, and 0.05% sodium phosphate dibasic, and incubated at 37°C for dissolved oxygen (OD). Cultivate at a rotation speed of 5 mg/L or more and 360 rpm. After culturing for 2 to 4 days, collect the bacteria by centrifugation. This is suspended in sterilized water, heat treated at 80°C for 30 minutes, centrifuged to recover the spores, washed twice with distilled water, and used as a spore liquid. The spore liquid was used as a spore suspension or by centrifuging to recover the spores and freeze-drying them.
  • OD dissolved oxygen
  • Bacillus coagulans PA strain significantly increased spermidine production under both aerobic and anaerobic conditions.
  • Bacillus coagulans ATCC 7050 Bacillus coagulans ATCC 7050 is a common facultative anaerobic Bacillus coagulans bacterium that produces small amounts of polyamines under aerobic and anaerobic conditions.
  • Bacillus coagulans PA produces spermidine of 141 ⁇ g/mL under aerobic conditions and 105 ⁇ g/mL under anaerobic conditions, showing significantly higher productivity than conventional strains in both aerobic and anaerobic conditions. It was shown under all optimal culture conditions.
  • Example 4 To measure changes in blood polyamine concentration following administration of spores of the Bacillus coagulans PA strain of Example 2 (Example 4) and spores of existing strains, 10-week-old male mice were tested. Each spore sample of each strain was administered to 10 animals. At this time, the microorganism administration group was administered 10 7 cells of spores of the Bacillus coagulans PA or Bacillus coagulans ATCC 7050 strain, respectively, three times a week, and the polyamine administration group was administered 30 ⁇ g and 60 ⁇ g of spermidine three times a week, respectively. For the microorganism administration group and the polyamine administration group, each of the above doses was diluted in 200 ⁇ L of sterilized water and administered orally three times a week.
  • the Bacillus coagulans PA strain obtained in Example 2 was administered daily in powder form with 10 9 spores (Example 4) to a total of 5 men aged 40 to 60 years old with hair loss symptoms for 4 months. It was administered orally once.
  • a probiotic product is produced by mixing 10 4 to 10 14 Bacillus coagulans PA spores (Example 4) per 1 g of dried material of one or two or more types of mixture materials that can be processed into powdered green juice, such as sprouted barley, kale, and Angelica leaf. to provide.
  • Bacillus coagulans PA spores are resistant to drying and heat, so they have the advantage of being able to maintain bacterial counts for more than a year at room temperature.
  • Bacillus coagulans PA spores per 1 to 2 g of green tea are mixed and placed in a tea bag to provide probiotics for easy ingestion of Bacillus coagulans bacteria.
  • Bacillus coagulans PA (Example 2) was inoculated into sterilized soymilk at a density of 108 cells per 1 mL of soymilk, and cultured at 37-45°C for 24-72 hours. At this time, for the purpose of improving flavor, it can be fermented with lactic acid bacteria such as Bifidobacterium and Lactobacillus. Sugar, concentrated juice, thickener, and acidulant are added here to provide soy milk yogurt high in polyamines with live Bacillus coagulans PA bacteria.
  • lactic acid bacteria such as Bifidobacterium and Lactobacillus.
  • Sugar, concentrated juice, thickener, and acidulant are added here to provide soy milk yogurt high in polyamines with live Bacillus coagulans PA bacteria.

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Abstract

본 발명은 폴리아민을 다량 생산하는 바실러스 코아귤란스 PA 균주 및 이를 이용한 폴리아민의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 바실러스 코아귤란스 PA 균주는 포자 자체를 섭취할 시 혐기적인 장내에서 증식하며 폴리아민을 지속적으로 다량 생산하여 인체에 공급이 가능하므로, 본 발명의 균주, 이의 포자, 이의 배양물 또는 이의 발효물을 폴리아민, 특히, 스퍼미딘을 고효율로 생산할 수 있는 식품, 사료 등으로 적용하여 활용 가능하며, 발모 촉진용 및 피부 개선용 기능성 원료로도 유용하게 사용될 수 있다.

Description

폴리아민 고생산 바실러스 코아귤란스 균주
본 발명은 혐기적 조건에서 폴리아민을 다량으로 생산하는 바실러스 속 균주에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 혐기적 조건인 동물의 장내에서 증식하며 폴리아민을 생산하여 동물에게 직접 공급하는 바실러스 코아귤란스 PA(Bacillus coagulans PA)균주에 관한 것이다. 이 과정을 통하여 폴리아민은 장내에서 연속적으로 생산되어 체내로의 흡수가 연속적으로 이루어지는 특징을 가진다.
폴리아민은 세포 내에 다량으로 존재하는 물질로서 최근 폴리아민의 여러 가지 생리적 의미가 구명되고 있다. 폴리아민의 섭취에 의해 기대되는 생리 작용으로는 노화억제, 수명 연장, 항염증, 세포부활 작용 등이 알려져 있다. 이에 따라서 폴리아민 또는 폴리아민 조성물에 대한 관심이 높아져 일상적인 가공식품, 보건용 식품, 화장품 등으로 적용하기 위한 노력이 경주되고 있다.
종래에는, 효모 균체 또는 동물의 장기 등 폴리아민을 다량 포함하는 원료로부터 폴리아민을 추출하고, 이를 섭취 가능한 음식물로 제조하는 방법에 관한 기술 내용이 개시된 바 있다.
식품용 폴리아민을 제조하는 기술의 일례로, 어류의 정소(일본공개특허공보 평8-238094호), 효모 균체(일본공개특허공보 2001-008663, 일본공개특허공보 2001-095483), 대두 또는 쌀 배아(일본공개특허공보 평10-101624호, 일본공개특허공보 2007-291027) 등으로부터 폴리아민을 추출하는 방법이 제시되고 있다.
천연물로부터 직접 추출에 의하여 정제된 폴리아민을 공급하는 방법과는 별개로 폴리아민을 다량 함유한 발효물의 이용이 제시되고 있다. 폴리아민 함량이 높은 대두 배아를 폴리아민 고생산 균주를 이용하여 발효함으로써(한국등록특허 10-2288725) 폴리아민의 생산성과 스퍼미딘(spermidine)의 순도를 높이는 방법도 제시되고 있다.
그러나, 동식물 및 각종 소재로부터 추출법으로 개시된 방법은 폴리아민의 생산을 위해 복잡한 추출 및 별도의 정제 공정을 필요로 하므로 생산 비용이 높고, 특히 식물을 원료로 한 경우에는 불쾌취가 심한 폴리아민인 푸트레신(putrescine)을 다량 함유하므로 이를 원료로 한 가공품은 기호도 또는 함량이 떨어지는 등 해결해야 할 문제점으로 남아있다.
천연물의 추출에 의하여 정제된 폴리아민을 공급하는 방법과는 별개로 폴리아민의 함향을 높인 식품을 섭취하는 방법에 대해서도 연구한 바 있다(한국등록특허 10-1794772, 일본등록특허 6054052). 이 방법에 의하면 통상의 낫토보다 5배나 많은 폴리아민 고함유 낫토를 식품형태로 섭취할 수 있다. 그러나 이 또한 특정 발효물에 대한 호불호가 일반적인 섭취 방법의 제한선이 된다.
폴리아민의 체내 공급은 오르니틴과 같은 전구체로부터 세포 내에서 자체적으로 합성되거나 음식물에 함유되어 있는 폴리아민이나 장내세균이 합성하는 폴리아민 등이 장관을 통하여 체내로 흡수되어 중요한 공급원이 된다. 성장하고 있는 젊은 개체에서는 폴리아민이 활발하게 합성이 이루어지나 나이가 들어감에 따라 폴리아민의 합성 능력은 떨어지게 된다. 따라서 폴리아민이 다량 함유된 음식물을 섭취하거나 장내세균이 합성하는 폴리아민은 체내의 폴리아민 수준을 유지하는데 중요한 의미를 갖게 된다.
따라서, 본 발명자들은 장내에서 증식을 할 수 있는 통성혐기성 균주 중에서 폴리아민 고생산이 가능한 균주를 연구한 결과, 폴리아민 생산능력이 획기적으로 상승한 신균주인 바실러스 코아귤란스 PA(Bacillus coagulans PA) 균주를 개발하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 인간의 장내에서 폴리아민을 다량 생산하여 인체에 공급할 수 있는 능력을 갖는 신규한 균주를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 폴리아민을 생산하는 능력을 갖는, 바실러스 코아귤란스 PA(Bacillus coagulans PA) 균주(수탁번호 KCTC 14266BP)를 제공한다.
일 구현예에서, 상기 균주는 서열번호 1로 표시되는 16s rRNA 서열을 갖는 것을 특징으로 하며, 호기적 및 혐기적 상태에서 폴리아민, 특히, 스퍼미딘을 고함유 고효율로 생산할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 균주를 이용하여 발효 또는 배양하여 얻어지는, 폴리아민을 포함하는 배양물 또는 포자를 제공한다.
나아가, 본 발명은 상기 균주, 이의 포자, 이의 배양물 또는 이의 발효물을 포함하는 식품 조성물, 사료 조성물 및 화장료 조성물을 제공한다.
더 나아가, 본 발명은 상기 균주를 이용하여 발효시키는 단계를 포함하는 폴리아민의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양물, 이의 포자 및 이의 발효물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 발모 촉진용 조성물 및 피부 개선용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주를 이용하여 발효시킨 폴리아민 함량이 증진된 음료를 제공한다.
또한, 본 발명은 개체에 상기의 균주, 이의 배양물, 이의 포자 및 이의 발효물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 유효한 양을 투여하는 단계;를 포함하는 발모 촉진 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 개체에 상기의 균주, 이의 배양물, 이의 포자 및 이의 발효물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 유효한 양을 투여하는 단계;를 포함하는 피부 개선 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 바실러스 코아귤란스 PA(Bacillus coagulans PA) 균주는 호기적 조건에서 뿐만 아니라 혐기적인 장내에서도 폴리아민을 지속적으로 생산하므로 장관에서 흡수되어 혈중 폴리아민 농도를 높이는 효과를 나타낼 수 있고, 장내에 일시적으로 서식하는 특성을 나타내 필요에 따라 투여된 균주는 배출이 가능하여 안전하게 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 Bacillus coagulans PA 균주는 저렴한 비용의 배지에서 포자를 형성시켜 포자의 형태로 공급이 가능하므로 폴리아민의 생산을 위한 별도의 발효비용 및 가공비가 필요하지 않아 생산비용을 절감할 수 있고, 발효취 등의 문제가 발생하지 않아 다양한 형태의 식품에 적용이 가능하다.
나아가, 본 발명의 Bacillus coagulans PA 균주는 발모를 촉진하는 효과를 가지므로, 발모 촉진용 약학적, 식품 또는 화장료 조성물 그리고 피부 개선용 조성물로도 유용하다.
도 1은 바실러스 코아귤란스 PA 균주의 서열번호 1로 표시되는 16s rRNA 염기서열을 나타낸 것이다.
도 2는 바실러스 코아귤란스 PA 균주의 분류학상 위치를 나타낸 개략도이다.
도 3은 호기적 또는 혐기적 조건에서 배양한 바실러스 코아귤란스 PA 균주가 생산하는 폴리아민을 TLC로 분석한 결과이다: 1은 바실러스 코아귤란스 ATCC7050 균주, 2는 B. 바실러스 코아귤란스 PA 균주로 각각 호기적으로 배양한 것이며 3~5는 농도를 달리한 폴리아민 표준 물질이며 6은 바실러스 코아귤란스 ATCC7050 균주, 7은 바실러스 코아귤란스 PA 균주로 각각 혐기적으로 배양한 것이다. 1과 6의 B. coagulans ATCC7050 균주는 폴리아민을 통상적인 수준으로 소량 생산하는 균주이다.
도 4는 바실러스 코아귤란스 PA 균주가 생산한 폴리아민을 확인하기 위하여 상기 균주 배양물의 폴리아민의 단실(dansyl) 유도체를 HPLC로 확인한 크로마토그램(A: 스퍼미딘 표준물질, B: 바실러스 코아귤란스 PA 배양액)이다. 이때, 27분 근처의 retention time에서 나타난 피크가 스퍼미딘(spermidine)이다.
도 5는 본 발명의 바실러스 코아귤란스 PA 균주를 복용 후 10일, 30일 및 100일 후 시점의 모발 비교 사진이다.
도 6은 본 발명의 바실러스 코아귤란스 PA 균주 포자를 109 cell씩 4주간 매일 복용하고 난 후의 눈 밑 주름 개선 비교 사진이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명자들은 폴리아민을 체내에 효율적으로 공급하는 방안에 대하여 연구하던 중, 일부의 식용 가능한 통성 혐기성 균이 호기적인 조건뿐만 아니라 혐기적인 조건에서 폴리아민 생합성능이 높다는 것을 발견하였다. 혐기적인 조건에서 높은 폴리아민 생합성능력을 나타내는 것은 인간의 장내에서 폴리아민을 다량 생산하여 공급하는 새롭고 간편한 방법으로 전환할 수 있다는 것을 의미한다. 따라서 인간의 장내에서 폴리아민을 대량 생산하여 인체에 공급하기 위하여 혐기적인 조건에서 폴리아민을 다량 생산하는 식용 가능한 균주를 탐색하고 돌연변이 육종을 통하여 폴리아민 생산성을 대폭 제고한 바실러스 코아귤란스 PA(Bacillus coagulans PA)균주를 완성하였으며 이를 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하였다(수탁번호 KCTC 14266BP).
본 발명의 신균주인 Bacillus coagulans PA는 장관에서 잘 증식하여 그 결과 혈중 폴리아민의 농도를 높이는 효과가 있어 균주 또는 이의 포자 자체를 직접 투여가 가능하므로, 경제적이고 간단하게 체내에 폴리아민을 공급하는 방법을 제공할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 폴리아민을 생산하는 능력을 갖는, 바실러스 코아귤란스 PA(Bacillus coagulans PA) 균주(수탁번호 KCTC 14266BP)를 제공한다.
본 발명의 상기 균주는 볏짚 및 건초로부터 내열성 포자를 형성하는 통성혐기성 세균을 분리하고, 돌연변이 유발 과정을 거쳐 고함유의 폴리아민을 대량 생산하는 균주를 선별함으로써 얻을 수 있다. 선발된 상기 균주는 호기적 또는 혐기적 상태에서 폴리아민, 특히, 스퍼미딘(spermidine)을 생산할 수 있다. 바람직하게는, 호기적 상태 및 혐기적 상태 모두에서 스퍼미딘을 생산할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명의 상기 균주를 이용하여 5% 콩배지내에 호기적 배양에서 120 μg/mL 이상, 혐기적 배양에서 약 90 μg/mL 이상의 스퍼미딘을 고함유로 생산할 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 상기 균주는 서열번호 1로 표시되는 16s rRNA 서열을 갖는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 상기 균주는 여러가지 형태로 제공이 가능하다. 예컨대, 상기 균주를 이용하여 발효 또는 배양하여 얻어지는, 폴리아민을 포함하는 배양물 또는 포자의 형태로 제공할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 상기 바실러스 코아귤란스 PA(Bacillus coagulans PA) 균주, 이의 포자, 이의 배양물 또는 이의 발효물을 포함하는 식품 조성물, 사료 조성물 및 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어, "포자"는 세균의 휴지 세포를 말하며, 본 발명의 목적상 상기 포자는 바실러스 코아귤란스 PA의 휴지 세포를 의미한다.
본 발명에 의해 제공되는 바실러스 코아귤란스 PA 균주는 포자가 동물의 장내에서 발아하여 영양세포로 증식하며 직접 폴리아민을 생산하여 숙주에게 연속적으로 공급하는데 유용하다.
본 발명에서 용어, "배양물"은 상기 균주를 배양한 다음 수득한 산물을 의미하며, 균체를 포함한 배양 원액일수 있으며, 또한 배양 균주, 배양 상등액을 제거하거나 농축한 균체일 수 있다. 상기 배양물의 조성은 통상의 바실러스 코아귤란스 배양에 필요한 성분뿐 아니라, 바실러스 코아귤란스의 생장에 상승적으로 작용하는 성분을 추가적으로 포함할 수 있으며, 이에 따른 조성은 당업계의 통상의 기술을 가진 자에 의하여 용이하게 선택될 수 있다.
본 발명의 신규 분리한 바실러스 코아귤란스 PA는 통상적인 바실러스 코아귤란스 균주의 배양방법을 통해 배양할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 배지로는 천연배지 또는 합성배지를 사용할 수 있다. 배지의 탄소원으로는 예를 들어, 글루코오스, 수크로오스, 덱스트린, 글리세롤, 녹말 등이 사용될 수 있고, 질소원으로는 대두 열수추출물, 펩톤, 육류 추출물, 효모 추출물, 탈지대두박, 암모늄염, 질산염 및 기타 유기 또는 무기 질소 함유 화합물이 사용될 수 있으나, 이러한 성분에 한정되는 것은 아니다. 배지에 포함되는 무기염으로는 마그네슘, 망간, 칼슘, 철, 인 등이 사용될 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다. 상기 탄소원, 질소원 및 무기염의 성분 이외에 아미노산, 비타민, 핵산 및 그와 관련된 화합물들이 배지에 첨가될 수 있다.
본 발명에서 용어, "발효물"은 식품의 주원료를 함유하고 있는 배지에 바실러스 코아귤란스 PA 균주를 접종 및 배양(발효)하여 수득한 배지 또는 상기 배지와 함께 배양한 미생물을 포함하는 배양물을 의미한다. 또한 상기 발효물은 식품 원료에 바실러스 코아귤란스 PA 균주를 접종 및 배양하여 수득한 배양물일 수 있다. 상기 식품 원료는 곡물류, 곡물류 유래 식품 등일 수 있고, 상기 곡물류는 콩, 쌀, 보리, 밀, 옥수수 등일 수 있으며, 바람직하게는 두유 또는 녹차일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 발효물은 상기 배지 또는 배양물의 여과액, 희석액, 이들의 농축액, 이들의 조정제물, 정제물, 건조물, 분쇄물 등을 모두 포함하는 것으로 포괄적으로 해석될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 상기 식품 조성물, 사료 조성물 및 화장료 조성물은 발모 촉진 효과 및 피부 개선 효과를 나타내는 것일 수 있다.
본 발명에서, 상기 피부 개선은 피부 노화 개선, 주름 개선, 피부 재생 또는 두피 개선을 의미하는 것일 수 있고, 바람직하게는 주름 개선을 의미하는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 "식품"이란, 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서, 식품, 식품 첨가제, 건강기능식품 및 음료를 모두 포함하는 것일 수 있다.
상기 "건강기능식품"이란 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체내조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미한다. 상기 기능성 식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제, 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 "사료 조성물"은 동물 사료 및 동물 사료용 첨가제를 모두 포함하는 것일 수 있다. 본 발명의 사료 조성물은 건조 또는 액체 상태의 제제 형태일 수 있으며, 상기 균주, 이의 포자, 이의 배양물 또는 이의 발효물 이외에 비병원성의 다른 미생물 또는 효소제제를 더 포함할 수도 있다. 사료용 원료로는 각종 곡물 및 대두 단백을 비롯한 땅콩, 완두콩, 사탕무우, 펄프, 곡물 부산물, 동물 내장 가루 및 어분 가루 등이 사용될 수 있으며, 이들은 가공되지 않거나 또는 가공된 것을 제한없이 사용할 수 있다.
상기 "화장료 조성물"은 피부 외용제로 사용될 수 있으며, 필요 부위에 직접 도포될 수 있다. 예를 들어, 연고, 크림, 에멀젼, 샴푸, 린스, 비누 등 다양한 제형으로 제조될 수 있다. 본 발명의 화장료 조성물에는 정제수, 유분, 계면활성제, 보습제, 안정화제, 알코올, 중점제, 킬레이트제, 색소, 방부제 및 향료로 이루어지는 군으로부터 적어도 1종 이상 선택된 첨가제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 균주, 이의 포자, 이의 배양물 또는 이의 발효물을 포함하는 상기 식품 조성물, 사료 조성물 또는 화장료 조성물에는 상기 균주가 포자의 형태로 포함될 수 있고, 1 g 당 104내지 1014개의 포자로 포함될 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 상기 균주를 이용하여 발효시키는 단계를 포함하는 폴리아민의 제조방법을 제공한다.
상기 폴리아민의 제조방법에 있어서, 상기 발효는 두유 또는 녹차의 발효일 수 있고, 상기 폴리아민은 스퍼미딘일 수 있다. 이때, 상기 두유 또는 녹차에 상기 균주를 101~109cell/mL 접종하여 발효시키는 것일 수 있고, 바람직하게는 104~108cell/mL 접종하여 발효시키는 것일 수 있다.
상기 폴리아민의 제조방법에 있어서, 상기 발효는 30 내지 50℃에서 20 내지 80시간 이루어지는 것일 수 있고, 바람직하게는 균주 접종 후 37 내지 47℃에서 24 내지 72시간 배양하는 것일 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양물, 이의 포자 및 이의 발효물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 발모 촉진용 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서 상기 발모 촉진용 조성물은 발모 촉진용 식품 조성물, 화장료 조성물, 사료 조성물 또는 약학적 조성물일 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양물, 이의 포자 및 이의 발효물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 피부 개선용 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서 피부 개선용 조성물은 피부 개선용 식품 조성물, 화장료 조성물, 사료 조성물 또는 약학적 조성물일 수 있다.
본 발명의 발모 촉진용 조성물 및 피부 개선용 조성물에 있어서, 상기 균주, 식품 조성물, 화장료 조성물 및 사료 조성물의 구체적 의미는 전술한 바와 같다.
본 발명에 따른 발모 촉진용 약학적 조성물 및 피부 개선용 약학적 조성물은 본 발명의 상기 균주의 생균의 균체, 건조 균주의 형태, 포자, 균주의 배양물, 균주의 파쇄물, 균주의 발효물 자체를 조성물로 제공하는 것일 수 있으며, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 담체 혹은 매체와 조합될 수 있는 조성물로 제공될 수 있다.
본 발명에 따른 발모 촉진용 약학적 조성물은 탈모의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 의미하는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 피부 개선용 약학적 조성물은 피부 노화 질환 또는 피부 주름의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 의미하는 것일 수 있다.
본 발명의 발모 촉진용 약학적 조성물 및 피부 개선용 약학적 조성물은 각각 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화 될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있으며, 경구용 단위 제형으로서 장용 피복된 장용성 제제로서 제공될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있고, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 탈모 질환의 증상을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 치료제와 병행하여 투여할 수 있다.
본 발명의 발모 촉진용 약학적 조성물 및 피부 개선용 약학적 조성물은 발모 촉진용 의약외품 조성물 및 피부 개선용 의약외품 조성물로도 제공될 수 있다.
또한 상기 의약외품은 피부외용제 및 개인위생용품을 포함할 수 있다. 바람직하게는 소독청결제, 샤워폼, 가그린, 물티슈, 세제, 비누, 핸드워시, 또는 연고제일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 상기 약학적 조성물 또는 의약외품 조성물을 투여할 수있는 개체는 인간을 포함한 모든 동물을 포함한다. 예를 들어, 개, 고양이, 마우스와 같은 포유동물일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
일 측면에서, 본 발명은 상기 균주를 이용하여 발효시킨 폴리아민 함량이 증진된 음료를 제공한다.
상기 음료는 발효두유, 발효차, 발효유, 콩 발효음료, 두유-요구르트 등의 발효 음료를 의미할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 개체에 상기의 균주, 이의 배양물, 이의 포자 및 이의 발효물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 유효한 양을 투여하는 단계;를 포함하는 발모 촉진 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 개체에 상기의 균주, 이의 배양물, 이의 포자 및 이의 발효물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 유효한 양을 투여하는 단계;를 포함하는 피부 개선 방법을 제공한다.
본 발명의 발모 촉진 방법 또는 피부 개선 방법은 상기 균주, 이의 배양물, 이의 포자 또는 이의 발효물을 유효량으로 개체에 투여하는 것을 포함한다. 특정 개체에 대한 구체적인 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 개체의 연령, 체중, 일반건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 투여기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 건강기능식품 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다. 일일 투여량은 본 발명의 유효성분의 양을 기준으로 0.0001 내지 100 mg/kg이고, 바람직하게는 0.01 내지 100 mg/kg이며, 하루 1 ~ 6 회 투여될 수 있다. 다만, 각 유효성분의 복용량 또는 투여량이 각 유효성분의 함량을 지나치게 높게 포함하여 부작용을 초래하지 않을 정도이어야 함은 당업자에게 자명하다. 따라서 본 발명의 목적에 적합한 조성물의 유효량은 전술한 사항을 고려하여 결정하는 것이 바람직하다.
이하 본 발명의 실시예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 예시하시 위한 것으로 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. 폴리아민을 생산하는 균주의 탐색 및 선발
1-1. 균주의 탐색
한국내에서 수집한 약 400여점의 건초 및 사일리지를 시료로 하여 미생물을 분리하였다. 각 시료를 멸균 식염수에 소량 가하여 현탁시킨 다음 80℃ 항온 수조에서 20분간 열처리하여 얻은 포자액을 MRS 평판배지에 도말하여 55℃에서 48~72시간 배양한 다음, 이를 0.7% 탄산 칼슘이 함유된 MRS 평판배지에 도말하여 45℃의 혐기적 배양기에서 3~5일간 배양하며 클리어존(clear zone)을 형성하는 균을 분리하였다. 분리된 균은 하기 실시예를 통해 폴리아민 생산량을 조사하였다.
1-2. 폴리아민의 정량
상기 실시예 1에서 분리한 균이 생산하는 폴리아민의 생산량을 조사하기 위하여, 균주를 5ml의 5% 콩가루를 현탁한 배지에 접종하고 45℃에서 48시간 동안 호기적 및 혐기적으로 배양하였다. 배양이 끝난 5% 콩배지 1 ml에 5% HClO4 1 ml를 가하고 6시간 진탕한 후 배양액을 원심분리하여 상등액으로부터 폴리아민의 양을 측정하였다.
구체적으로, 상등액 1 ml를 취하여 포화 Na2HCO3 2ml, 1% 단실 클로라이드(dansyl chloride) 2 ml를 가하고 70℃에서 1시간 반응시켰다. 여기에 1% 프롤린(proline) 2ml를 첨가하고 70℃에서 30분간 반응시켰다. 반응액 0.5 ml에 톨루엔(toluene) 0.5 ml를 가하여 와류교반(voltex)한 후 원심분리하여 상등액을 TLC 분석시료로 하였다. TLC(고정상: 실리카겔)를 이용한 분석은 전개용매로 시클로헥산(cyclohexane) : 에틸아세테이트(ethylacetate) = 3 : 2 (v/v)를 사용하였으며 단실(dansyl) 처리한 시료 1 ~ 3 μl와 스퍼미딘(spermidine) 표준물질 (standard) 1 ~ 3 μl를 로딩하여 전개한 후, 자외선 하에서 촬영하고 덴시토미터(densitometer)로 스팟(spot)의 강도를 측정하여 검량곡선(standard curve)로부터 스퍼미딘의 양을 정량화 하였다.
또한, 균주가 생산한 폴리아민의 단실 유도체를 분석하기 위하여, 고속 액체크로마토그래피(HPLC)로 분석을 실시하였다. HPLC(Shiseido SP-LC, Shiseido, Japan)를 이용한 분석은, 단실 유도체를 HPLC 컬럼(ImtaktUnison UK-C18 Column, 75 X 2 mm, particle size 3 μm)으로 25℃에서 H2O:MeOH 조성의 이동상을 0.2 ml/min의 유속으로 50:50 → 0:100 농도 구배용출(gradient elution)하였으며, 하기 표 1에 나타낸 바와 같은 조건에서 HPLC를 수행하였다.
[표 1]
Figure PCTKR2023009974-appb-img-000001
1-3. 균주의 선발
상기의 과정으로 약 30종의 세균을 폴리아민 고생산균으로 1차 선발 한 후 버지스 매뉴얼에 의한 바실러스속 균주의 분류학적 특성 분석 방법 (Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 2002)에 따라서 바실러스 코아귤란스(Bacillus coagulans)로 분류되는 균 6종을 2차 선발하였다. 이들 6종의 균주는 각각 16sRNA를 분석하여 Bacillus coagulans로 분류하였고, 폴리아민의 생산성(spermidine, μg/mL)이 가장 높은 Phy53 균주를 선발하였다(표 2).
[표 2]
Figure PCTKR2023009974-appb-img-000002
실시예 2. 폴리아민 고생산 돌연변이 균주의 제조
MRS 액체배지에서 37℃, 30시간 배양한 Phy53 균주를 원심분리하여 균체를 모은 후 pH 7.0의 0.8% 식염수에 현탁하였다. 여기에 니트로소구아니딘(nitrosoguanidine, NTG)를 100μg/ml 가하여 사멸율 99.9%가 되게 처리시간을 조절하여 돌연변이를 유발한 후 5mM 디시클로헥실아민(dicyclohexylamine)을 함유한 스피자이젠(Spizizen) 최소배지에 1장당 105마리를 도말하고 37℃에서 5일간 배양하여 살아남은 균을 5% 콩배지에서 36~72시간 배양한 후, 생성된 폴리아민 양을 측정하였다. 폴리아민의 생성량이 상승한 돌연변이체 15종 균주 중 내열성 포자를 형성하며 폴리아민 생성이 가장 높은 균주를 선발하여, 바실러스 코아귤란스 Phy53`(Bacillus coagulans Phy53`)으로 명명하였다. 그 후 바실러스 코아귤란스 Phy53`균주를 대상으로 상기와 동일한 과정으로 돌연변이를 유발하고, 폴리아민의 생산량이 가장 높은 균주를 최종 적으로 선발하여, 이를 바실러스 코아귤란스 PA(Bacillus coagulans PA)로 명명하였다.
실시예 3. 분리된 돌연변이 균주의 형태학적 및 생화학적 특성 분석
3-1. PA 균주의 형태학적 특성
상기 실시예 2의 분리과정을 거쳐 최종 육종된 바실러스 코아귤란스 PA(Bacillus coagulans PA) 균주에 대하여 먼저 형태학적 특성을 분석하였다.
바실러스 코아귤란스 PA 균주의 MRS 한천 평판배지에서 형성된 균 집락은 작고 평평하며 가장자리는 매끈한 둥근 형태이고 표면은 광택이 없는 흰색의 외형을 나타내었다. MRS 액체배지를 이용한 균체 성장의 대수기에서 현미경 관찰한 결과, 짧은 막대모양의 외형으로서 비교 균주인 바실러스 코아귤란스와 유사하였으며, 균주는 그람 양성이었고, 포자는 균체 중앙에 위치하며 포자의 생성에 따라 균체는 팽창하였다.
3-2. PA 균주의 생화학적 특성
API50CHB 키트(BioMеrieux사, France)를 사용하여, 분리된 균주의 생화학적 특성 등을 조사한 결과, 하기 표 3 및 표 4에 나타낸 바와 같은 생화학적 특성(API test 결과)을 가짐을 확인할 수 있었다. 균의 성장에 미치는 온도의 영향과 관련하여서는 25℃ 이상 55℃ 이하의 범위에서 성장이 양호하였으며, 60℃ 이상에서는 균체의 성장이 확인되지 않았다. 본 발명의 PA 균주는 질산염의 환원력은 양성이며, 구연산 이용, 보게스-프로스카우저(Voges-Proskauer) 시험은 음성이었다. 또한, 카제인, 젤라틴, 전분을 분해하며, 포도당으로부터 산을 생성하며 아라비노스, 자일로스, 만니톨로부터는 산을 생성하지 않으며 카탈라아제 양성이며, 호기적 조건 및 혐기적 조건에서 성장하였다.
[표 3]
Figure PCTKR2023009974-appb-img-000003
[표 4]
Figure PCTKR2023009974-appb-img-000004
3-3. PA 균주의 분류학적 특성
또한, 버지스 매뉴얼(Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 2002)에 의한 바실러스속 균주의 분류학적 특성을 분석하였다. 분석된 균주는 바실러스 코아귤란스로 동정되어 바실러스 코아귤란스 PA(Bacillus coagulans PA)로 명명하고, 상기 균주가 서열번호 1로 표시되는 16s rRNA서열을 갖는 다는 것을 확인하였으며(도 1), 상기 균주 서열을 한국생명공학 연구원 생물자원센터(KCTC)에 2020.08.06. 일자로 기탁하였다(기탁번호: KCTC14266BP). 또한, 상기 결과를 종합하여, 바실러스 코아귤란스 PA 균주의 분류학상 위치를 도 2에 나타내었다.
3-4. PA 균주의 폴리아민 생산 특성
상기 실시예 1의 방법으로 본 발명의 바실러스 코아귤란스 PA 균주와 폴리아민을 통상적인 수준으로 소량 생산하는 균주인 바실러스 코아귤란스 ATCC7050 균주를 각각 호기적 또는 혐기적 조건에서 배양하여 폴리아민 생산을 TLC로 확인하였다. 균주 배양물의 단실 유도체를 TLC로 전개한 후 자외선을 비추어 나타난 스폿을 폴리아민 표준물질의 이동거리와 비교하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다. 분 석 결과, 각 균주의 배양물(1, 2, 6, 7)에서 스퍼민(spermine), 퓨트레신(putrescine) 등의 폴리아민 스폿이 확인되었고, 특히, 본 발명의 바실러스 코아귤란스 PA 균주를 호기적(2) 및 혐기적(7) 배양한 경우에, ATCC7050 균주(1, 6)에서는 보이지 않는 스퍼미딘의 스폿이 매우 진한 농도로 나타났다.
이어서, 상기 실시예 1과 동일한 방법 및 표 1의 조건으로 HPLC를 수행하여 바실러스 코아귤란스 PA(Bacillus coagulans PA) 배양액에 함유된 폴리아민의 단실(dansyl) 유도체를 표준물질과 비교 분석한 결과, 27분의 retention time에 스퍼미딘 피크가 검출됨을 확인하여, 생산되는 주된 폴리아민이 스퍼미딘인 것을 확인하였다(도 4).
실시예 4. 분리된 돌연변이 균주의 포자의 생산
본 발명 실시예 2의 B. coagulans PA 균주의 가공품은 포자 상태로 주로 사용하므로 배양액에 고농도의 포자를 형성하여야 유리하므로 일 예로 다음과 같은 과정으로 포자를 취득하였다.
4-1. 전배양
플라스크에 대두 추출물 2%, Glycerol 1%, Yeast extract 1%　로 조성된 배지를 넣고 B. coagulans PA를 103 ~ 105 cell/mL가 되게 접종하고 37℃, 200rpm의 진탕속도로　2일간 전배양을 한다.
4-2. 본배양
발효조에서 대두 추출물 5%, Glucose 0.5%, Yeast extract 0.5%, Potassium phosphate dibasic 0.1%, Sodium phosphate dibasic 0.05%　로 이루어진 본배양 배지에 3% 양의 전배양액을 접종하고 37℃,　용존산소량(OD) 5mg/L이상, 360rpm의 회전속도로 배양한다. 2~4일간 배양 후에 원심분리하여 균을 수거한다. 이를 멸균수에 현탁한 후 80℃에서 30분간 열처리 한 후 원심분리하여 포자를 회수하고 증류수로 2회 세척하여 포자액으로 한다. 포자액은 포자 현탁액 그대로 또는 원심분리하여 포자를 회수한 후 동결건조하여 사용하였다.
실시예 5. 혐기적 또는 호기적 배양에 따른 폴리아민의 생산량
5-2. 돌연변이 균주의 폴리아민 생산량 비교
먼저, 상기 실시예 2의 바실러스 코아귤란스 Phy53(Bacillus coagulans Phy53), 바실러스 코아귤란스 Phy53`(Bacillus coagulans Phy53`) 및 바실러스 코아귤란스 PA(Bacillus coagulans PA) 각각에 대하여, 동물의 장내와 같은 혐기적 조건 및 기타 호기적 조건에서의 폴리아민 생산량을 비교하기 위하여, 5% 콩배지 1 mL당 103 개의 포자를 각각 접종한 후 37℃에서 48시간 진탕 배양 또는 혐기 챔버(chamber)에서 정치 배양하였고, 폴리아민(스퍼미딘) 생산량을 측정하여 하기 표 5에 나타내었다.
[표 5]
Figure PCTKR2023009974-appb-img-000005
그 결과, 본 발명의 신균주인 Bacillus coagulans PA 균주는 호기성 조건 및 혐기성 조건 모두에서 스퍼미딘 생산량의 대폭적인 증가가 이루어졌음을 확인하였다.
5-2. 기존 균주 및 돌연변이 균주의 폴리아민 생산량 비교
동물의 장내와 같은 혐기적 조건에서 본 발명의 Bacillus coagulans PA균주와 기타 호기적 균주와의 폴리아민의 생산성을 비교하기 위하여, 5% 콩배지 1 mL당 103 개의 포자를 각각 접종한 후 37℃에서 48시간 진탕 배양 또는 혐기chamber에서 정치 배양한 다음, 생산된 폴리아민(스퍼미딘)을 측정하여 하기 표 6에 나타내었다.
[표 6]
Figure PCTKR2023009974-appb-img-000006
폴리아민을 다량 생산하는 낫토균으로 알려진 기존의 바실러스 서브틸리스 EE5(Bacillus subtilis EE5)는 호기적인 조건에서는 다량의 폴리아민을 생산하였고, 대표적인 낫토 균주인 바실러스 서브틸리스 바 낫토 미우라(Bacillus subtilis var. natto Miura)는 호기적인 조건에서 일반적인 낫토 수준의 폴리아민을 생산하는데 그쳤다. 반면 상기 두 균주 모두 혐기적인 조건에서는 폴리아민을 거의 생산하지 않아 Bacillus subtilis류는 혐기적 조건에서의 폴리아민의 생산에는 부적합하다는 것을 확인하였다.
바실러스 코아귤란스 ATCC 7050(Bacillus coagulans ATCC 7050)는 통성 혐기성의 일반적인 Bacillus coagulans 균으로 호기적, 혐기적 조건에서 소량의 폴리아민을 생산하였다.
이에 비하여, 바실러스 코아귤란스 PA(Bacillus coagulans PA)는 호기적 조건에서 141 μg/mL, 혐기적 조건에서 105 μg/mL의 spermidine을 생산하여 기존의 통상적인 균주보다 월등히 높은 생산성을 호기적 및 혐기적인 배양 조건 모두에서 나타내었다.
실시예 6. PA균주의 투여에 따른 혈중 폴리아민 농도의 변화
상기 실시예 2의 바실러스 코아귤란스 PA(Bacillus coagulans PA)균주의 포자(실시예 4) 및 기존 균주의 포자의 투여에 따른 혈중 폴리아민 농도의 변화를 측정하기 위해, 10주령의 수컷 마우스를 대상으로 각 균주의 포자 시료별로 10마리에 투여를 하였다. 이때, 미생물 투여군은 Bacillus coagulans PA 또는 Bacillus coagulans ATCC 7050 균주의 포자를 각각 107cell을 주당 3회, 폴리아민 투여군은 30μg, 60μg의 스퍼미딘(spermidine)을 주당 3회로 각각의 투여량으로 하였다. 미생물 투여군과 폴리아민 투여군은 상기 각각의 투여량을 200μL의 멸균수에 희석하여 주 3회 구강 투여하였으며, 대조군으로는 균주 포자 시료 대신 식염수 200μL를 주 3회 구강 투여하였다. 4주간의 투여 후 채혈하여 혈중 폴리아민(스퍼미딘)의 농도를 측정하여 하기 표 7에 나타내었다.
[표 7]
Figure PCTKR2023009974-appb-img-000007
상기 표 7에 나타난 바와 같이, 혈중 폴리아민 농도 변화에 있어서 Bacillus coagulans ATCC 7050 균주의 포자를 투여한 경우, 대조군과 유의한 차이가 나지 않은 반면, 본 발명의 Bacillus coagulans PA 균주의 포자를 투여한 경우, 폴리아민(스퍼미딘)을 직접 투여한 것과 유사한 효과를 나타내어, 동물의 장내에서 증식하며 폴리아민을 생산하여 숙주에 연속적으로 공급하는데 효과적임을 확인하였다.
실시예 7. PA균주의 투여에 따른 발모 촉진 효과
상기 실시예 2에서 수득된 바실러스 코아귤란스 PA(Bacillus coagulans PA) 균주를 탈모 증상이 있는 40세에서 60세의 총 5명의 남성에게 4개월간 109개의 포자(실시예 4)를 분말 형태로 매일 1회 경구 투여하였다.
상기 남성들에 있어서 본 발명의 균주의 투여 후 10일, 30일 및 100일 후의 변화를 사진으로 촬영하였으며, 그 일부의 결과가 도 5에 도시되어 있다.
그 결과, 복용 후 이마 부분에 새로운 머리카락이 나거나 기존의 머리카락의 굵기가 굵어지는 등 모발의 양 및 질을 개선하는 효과가 있음을 확인하였다.
실시예 8. PA균주의 투여에 따른 피부 개선 효과
상기 실시예 4에서 수득된 바실러스 코아귤란스 PA(Bacillus coagulans PA) 균주의 포자를 분말 형태로 109 cell씩 4주간 매일 복용하도록 하고 난 후의 눈 밑 주름 변화를 사진으로 촬영하였으며, 그 일부의 결과가 도 6에 도시되어 있다.
그 결과, 본 발명의 PA 균주 포자를 복용 후 눈 밑 주름이 개선되는 효과가 있음을 확인하였다.
제조예 1. PA균주 함유 음료의 제조
1-1. 프로바이오틱스 분말 녹즙
새싹 보리, 케일, 명일엽 등 분말 녹즙으로 가공할 수 있는 하나 또는 2종 이상의 혼합물 재료의 건조물 1g 당 104내지 1014개의 바실러스 코아귤란스 PA 포자(실시예 4)가 함유되도록 혼합하여 프로바이오틱스 제품으로 제공한다. 바실러스 코아귤란스 PA포자는 건조 및 열 등에 내성을 가지므로 상온에서 1년 이상 균수를 유지 할 수 있는 장점이 있다.
1-2. 프로바이오틱스 녹차
녹차 1~2g 당 104내지 1014개의 바실러스 코아귤란스 PA 포자(실시예 4)를 혼합하여 티백에 넣어 프로바이오틱스로 바실러스 코아귤란스 균을 용이하게 섭취하도록 제공한다.
1-3. 두유 요구르트
멸균한 두유에 바실러스 코아귤란스 PA균(실시예 2)을 두유 1mL당 108cell이 되게 접종을 한 후 37~45℃에서 24~72시간 배양을 한다. 이때 향미 증진의 목적으로 비피도박테리움속, 락토바실러스속 등의 젖산균과 함께 발효 할 수도 있다. 여기에 설탕, 농축 과즙, 증점제, 산미료 등을 가하여 바실러스 코아귤란스 PA균이 살아있는 폴리아민 고함유 두유 요구르트를 제공한다.
Figure WO-DOC-PAGE-1

Claims (15)

  1. 폴리아민을 생산하는 능력을 갖는, 바실러스 코아귤란스 PA(Bacillus coagulans PA) 균주(수탁번호 KCTC 14266BP).
  2. 제1항에 있어서, 상기 균주는 서열번호 1로 표시되는 16s rRNA 서열을 갖는 것인, 균주.
  3. 제1항에 있어서, 상기 균주는 호기적 또는 혐기적 상태에서 폴리아민을 생산하는 것을 특징으로 하는, 균주.
  4. 제1항에 있어서, 상기 폴리아민은 스퍼미딘(spermidine)인 것을 특징으로 하는 균주.
  5. 제1항의 균주를 이용하여 발효 또는 배양하여 얻어지는, 폴리아민을 포함하는 배양물 또는 포자.
  6. 제1항의 균주, 이의 포자, 이의 배양물 또는 이의 발효물을 포함하는 식품 조성물.
  7. 제1항의 균주, 이의 포자, 이의 배양물 또는 이의 발효물을 포함하는 사료 조성물.
  8. 제1항의 균주, 이의 포자, 이의 배양물 또는 이의 발효물을 포함하는 화장료 조성물.
  9. 제1항의 균주를 이용하여 발효시키는 단계를 포함하는 폴리아민의 제조방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 폴리아민이 스퍼미딘인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  11. 제1항의 균주, 이의 배양물, 이의 포자 및 이의 발효물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 발모 촉진용 조성물.
  12. 제1항의 균주, 이의 배양물, 이의 포자 및 이의 발효물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 피부 개선용 조성물.
  13. 제1항의 균주를 이용하여 발효시킨 폴리아민 함량이 증진된 음료.
  14. 개체에 제1항의 균주, 이의 배양물, 이의 포자 및 이의 발효물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 유효한 양을 투여하는 단계;를 포함하는 발모 촉진 방법.
  15. 개체에 제1항의 균주, 이의 배양물, 이의 포자 및 이의 발효물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 유효한 양을 투여하는 단계;를 포함하는 피부 개선 방법.
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DATABASE Nucleotide 4 June 2018 (2018-06-04), ANONYMOUS : "Bacillus coagulans LA204, complete genome", XP093129471, retrieved from NCBI Database accession no. CP025437.1 *
FUJIWARA, YUKI; MATSUURA, KENTO; HARAGUCHI, KENJI; SUZUKI, HIDEYUKI: "3A09a13 Biosynthetic pathway of polyamines of Bacillus coagulans", ANNUAL MEETING OF JAPAN SOCIETY FOR BIOSCIENCE, BIOTECHNOLOGY, AND AGROCHEMISTRY; MARCH 25 - 28, 2020, vol. 2020, 5 March 2020 (2020-03-05) - 28 March 2020 (2020-03-28), pages 698, XP009542767 *
SUZUKI, HIDEYUKI; FUJIWARA, YUKI; THONGBHUBATE, KULLATHIDA; MAEDA, MASAHIRO: "4A08-05 Discovery of a spore-forming lactic acid bacterium bacillus coagulans that synthesizes and excretes spermidine into the extracellular space under anaerobic conditions. ", PROCEEDINGS OF THE ANNUAL MEETING OF JAPAN SOCIETY FOR BIOSCIENCE, BIOTECHNOLOGY, AND AGROCHEMISTRY (JSBBA 2022); MARCH 15-18, 2022, vol. 2022, 18 March 2022 (2022-03-18) - 18 March 2022 (2022-03-18), pages 1000, XP009552682 *

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