KR101373224B1

KR101373224B1 - 폴리아민을 생산하는 신규한 락토바실러스 속 ａｍｌ 15균주 및 그 배양액을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물

Info

Publication number: KR101373224B1
Application number: KR1020120112106A
Authority: KR
Inventors: 권기석; 김범수; 이중복; 남영호; 조순영
Original assignee: 안동대학교 산학협력단
Priority date: 2012-10-09
Filing date: 2012-10-09
Publication date: 2014-03-11

Abstract

본 발명은 신규한 락토바실러스 속 AML-15(Lctobacillus sp. AML -15)균주, 폴리아민 생산을 위한 기질없이도 폴리아민 성분인 Putrescine, Spermidine, Spermine을 생산하는 배양방법과 이의 배양물 및 이를 유효성분으로 함유하는 미백활성 또는 여드름개선용 화장료 조성물을 제공하는 뛰어난 효과가 있다.

Description

폴리아민을 생산하는 신규한 락토바실러스 속 ＡＭＬ 15균주 및 그 배양액을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물 {Lactobacillus sp. AML15 strain, culture medium thereof and cosmetics composition containing the same as an effective ingredient}

본 발명은 폴리아민을 생성하는 신규한 락토바실러스 속 AML 15 균주(Lactobacillus sp. AML 15; KCTC12047BP) 및 그 이용에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 우리나라 전통 발효 식품인 젓갈로부터 폴리아민을 생산하는 GRAS (Generally Recognized As Safe)급 신규한 락토바실러스 속 AML 15균주를 분리하고 이를 폴리아민 생산을 위한 기질이 첨가되지 않은 MRS 변형 배지에 배양하여 그 배양물을 유효성분으로 함유하는 미백 또는 여드름개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.

폴리아민은 아미노산의 탈탄산 작용, 알데히드와 케톤의 아미노화와 아미노기 전이반응에 의해 주로 생성되는 질소화합물이다. 폴리아민은 저분자량이며 미생물, 식물과 동물의 대사과정에서 합성되므로 이들 세포에서 흔히 발견되는 구성성분이다(Estefania et al., Int. J. Food Microbiol. 2011; Brink et al., Int. J. Food Microbiol. 1990).

또한 식품과 음료 중의 폴리아민은 원재료의 효소작용과 미생물의 아미노산 탈탄산 작용으로 생성된다. 이러한 아미노산의 종류는 다양하지만 그중 폴리아민류에 속하는 푸트리신, 스퍼미딘과 스퍼민은 모든 생체 세포의 필수 불가결한 구성성분이다(Romain et al., Pediatric Res. 1992; Bardoocz et al., J. Nutr. Biochem.1993). 이와 같은 폴리아민은 장의 기능과 면역체계의 대사작용을 높게 유지하기 위해 필수적이 성분이다.

발효식품은 항산화 시스템 강화, 그리고 인체의 방어력을 높이는 면역 시스템 강화 효과를 가져다주며, 다양한 기능성 소재의 가능성이 보고되고 있다 (Magwamba et al., J. Food Port. 2010). 이러한 발효식품은 우수한 발효미생물과 이들의 발효작용에 의해 영양학적으로는 물론 생리 기능성 측면에서도 매우 우수한 물질을 함유하고 있는 식품이다.

따라서, 우수한 기능성 미생물을 다양하게 함유하고 있는 우리나라 전통발효 식품으로부터 식의약용으로 이용가능한 GRAS (Generally Recognized As Safe)급의 미생물 분리동정은 고부가가치를 가지고 산업적으로 이용가능성이 다양한 미생물자원의 확보를 위해서 반드시 필요한 분야라 할 것이다.

미생물을 버섯, 쌀, 과즙 등에 접종한 후 배양한 배양물을 화장료에 유효성분으로 함유시켜 이용하는 기술(대한민국 등록특허 제0302505호, 일본공개특허공보 제2004-097999호)이 공지되어 있다. 상기 문헌 등에 따르면, 미생물 배양액를 화장료 조성물로 사용할 경우 그 효과가 미비할 뿐만 아니라 조성물에 포함된 활성성분이 불분명한 경우가 대부분이며 따라서 안정성 문제가 제기되어 그 사용이 제한적이다. 미생물을 화장료 조성물로 이용하기 위해서는 명확한 활성성분의 규명과 검정이 반드시 필요하다. 이러한 조건을 만족시키기 위해서는 미생물 동정에 있어서 식의약적으로 안정성이 보장된 균원을 선정하는 것과, 선정된 균원으로부터 균주를 동정함에 있어서도 균주 선별기준을 안정성과 그 균주가 생산하는 효과가 알려진 특정 화합물로 선택하는 것이 중요하다.

식의약용으로 이용가능한 GRAS급의 미생물은 폴리아민 성분인 Putrescine, Spermidine, Spermine을 생산함은 물론이고, 생산된 폴리아민류는 항산화능을 비롯한 각종 생리활성능 등을 갖는다고 보고되고 있다(Maijala et al., Meat Sci., 1993; Sara et al., Int. J. Food Microbiol. 1999). 우리나라 전통발효 식품내에 존재하는 특정 생리활성 기능을 갖는 유용한 미생물을 자원화한다면 고부가가치를 갖는 식의약 산업군으로의 활용이 가능할 것이다.

이러한 점들을 감안하여, 본 발명자들은 대표적인 전통 발효식품인 젓갈로부터 항균활성과 면역시스템강화에 효과적인 폴리아민을 생산하는 신규한 미생물을 분리하고자 하였으며, 이를 배양한 배양물의 미백활성과 항균활성을 검정하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

따라서 본 발명의 목적은, 항균성이 우수한 폴리아민류를 생성하는 GRAS (Generally Recognized As Safe)급 미생물을 전통발효 식품으로부터 분리동정하여 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은, 상기 분리동정된 미생물의 폴리아민생산용 기질이 제공되지 않은 조건에서도 폴리아민 성분인 푸트리신, 스퍼미딘, 스퍼민을 생산할 수 있는 배양배지를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은, 폴리아민류를 생성하는 미생물의 배양액을 유효성분으로 함유하는 미백 또는 여드름개선용 화장료 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 상기 목적은 전통발효식품 젓갈류를 수집하고 이들 각각을 균원으로 사용하여 배양하는 단계와; HPLC 분석을 통하여 상기 배양액중 폴리아민성분인 푸트리신, 스퍼미딘, 스퍼민이 검출되는 배양액을 선별하는 단계와; 상기 선별된 배양액 배양균주의 16S rRNA 유전자 염기서열 분석을 통하여 신규한 균주를 동정하고 락토바실러스 속 AML 15(Lactobacillus sp. AML 15; KCTC12047BP)라 명명한 다음 기탁하는 단계와: 상기 동정된 균주가 폴리아민 생산용 기질이 없는 조건에서도 폴리아민을 생산할 수 있는 배지조성을 확립하는 단계와; 상기 배지조성에 따라 배양된 락토바실러스 속 AML 15(KCTC12047BP)균주 배양액의 미백활성과 항균활성을 검정하는 단계를 통하여 달성하였다.

본 발명은 항균성이 우수한 폴리아민류를 생성하는 GRAS (Generally Recognized As Safe)급 미생물을 제공하는 효과가 있으며, 폴리아민생산용 기질이 제공되지 않은 조건에서도 폴리아민 성분인 푸트리신, 스퍼미딘, 스퍼민을 생산할 수 있는 배양배지를 제공하고, 이를 사용한 미생물 배양을 통하여 수득한 배양액을 유효성분으로 함유하는 미백 또는 여드름개선용 화장료 조성물을 제공하는 뛰어난 효과가 있다.

도 1는 본 발명 락토바실러스 속 AML 15 균주(Lactobacillus sp. AML 15; KCTC12047BP)의 동정 결과를 나타낸 균주계통도이다.
도 2는 본 발명 락토바실러스 속 AML 15 균주의 형태학적 특성을 주사전자현미경을 이용하여 촬영한 사진도이다.
도 3은 본 발명 락토바실러스 속 AML 15 균주 배양액으로부터 폴리아민 성분을 검출한 TLC분석결과를 보인 사진도이다; 푸트리신(Putrescine), 스퍼미딘(Spermidine), 스퍼민(Spermine), I:Lactobacillus sp. AML-15, II:Lactobacillus sp. AML-15 with 0.1% ornithine, III:Lactobacillus sp. AML-15 with 0.1% arginine, IV:Lactobacillus sp. AML-15 with 0.1% ornthine+0.1% arginine.
도 4는 본 발명 락토바실러스 속 AML 15 균주 배양액으로부터 폴리아민 성분을 검출한 HPLC분석결과를 나타낸 그래프이다; (A)Putrescine, Spermidine, Spermine (B)균주 배양액.
도 5는 Putrescine, Spermidine, Spermine(A)과 본 발명 락토바실러스 속 AML 15 균주 배양액(B)의 Tyrosinase 효소억제 활성 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 Putrescine, Spermidine, Spermine의 여드름 원인균인 프로피오니박테리움 에크니스 (Propionibacterium acnes)균주에 대한 항균활성의 실험 결과를 보인 사진도이다.
도 7은 본 발명 락토바실러스 속 AML 15 균주 배양액의 여드름 원인균인 프로피오니박테리움 에크니스 (Propionibacterium acnes)균주에 대한 항균활성을 나타낸 결과 도이다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 목적일 뿐이므로, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 폴리아민류 생성 균주의 분리동정

폴리아민류인 푸트리신, 스퍼미딘, 스퍼민을 생산하는 GRAS급 미생물을 분리하기 위해 우리나라 전통발효 식품인 꼴뚜기 젓갈을 목포항에서 구입하고 이들 각각을 균원시료로 사용하였다. 상기 균원 시료들을 각각 멸균 생리식염수에 현탁 및 희석하고, 이를 MRS 한천 배지에 접종한 후 37℃에서 2일간 배양하였다. 상기 한천배지에서 배양된 각각의 배양균주들의 단일 콜로니를 MRS 액체배지에 20mL에 접종한 후 37℃에서 4일간 배양한 후 그 배양액을 원심분리하여 상등액만을 수득하였다. 폴리아민류를 생성하는 균주를 선발은 상기 배양 상등액을 각각 HPLC 분석하여 선별하였다.

배양액 중에서 폴리아민성분인 푸트리신, 스퍼미딘, 스퍼민이 검출되는 균은 젓갈로부터 동정된 미생물이었으며, 상기 미생물의 분류학적 동정을 위해 16S rRNA 유전자 염기분석을 수행하였다.

동정 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이 신규한 락토바실러스 속이 것으로 확인 되었으며 락토바실러스속 AML 15 균주(Lactobacillus sp. AML 15)로 명명하고 이를 한국생명공학연구원에 2011. 11. 14자로 기탁하고 기탁번호를 수여받았다(KCTC12047BP).

또, 본 발명 락토바실러스속 AML 15 균주의 형태학적 특성을 주사전자현미경 (SEM)을 통해 확인하고 이를 도 2에 나타냈다.

< 실시예 2> 본 발명 락토바실러스속 AML 15 균주의 폴리아민 생성을 위한 배양조건 확립

하기 표1에 나타낸 MRS-변형 배지조성에 따라 기질 첨가 없이 락토바실러스속 AML 15 (Lactobacillus sp. AML 15)을 37℃에서 4일간 배양하여 그 상등액을 원심분리를 통하여 수득하였다. 상기 본 발명 락토바실러스속 AML 15균주 배양상등액의 폴리아민성분인 푸트리신, 스퍼미딘, 스퍼민을 HPLC 분석을 통하여 검출하였다.

MRS-변형 배지조성

배지조성성분	함량 (1L 기준, 중량%)
Glucose	1.7
(NH₄)₂SO₄	0.2
K₂HPO₄	0.08
KH₂PO₄	0.06
MnSO₄	0.005
MgSO₄	0.005
CaCO₃	0.03
Yeast extract	1.5
Peptone	1.5
멸균증류수	up to 1L

분석결과, 도 3과 도4에 나타낸 바와 같이 배양액에서 폴리아민 생산을 위한 기질이 제공되지 않았음에도 폴리아민 성분인 푸트리신, 스퍼미딘, 스퍼민이 생성되었음을 확인할 수 있었다.

따라서 본 발명에 따라 제조된 MRS-변형 배지의 조성만으로도 본 발명 락토바실러스속 AML 15균주로부터 폴리아민 성분을 생산할 수 있음을 확인하였다.

< 실시예 3> 본 발명 락토바실러스 속 AML 15 배양액의 미백활성 검정

본 발명 락토바실러스속 AML 15을 상기 실시예 2에 따라 제조된 MRS-변형배지 20mL에 접종한 후 37℃에서 4일간 배양한 후 상기 배양액의 Tyrosinase 저해활성 측정하여 본 발명 락토바실러스 속 AML 15 배양액의 미백활성을 검정하였다. 본 발명 MRS-변형배지에 폴리아민 생산을 위한 기질 오르니틴과 아르기닌을 각각 0.1% 더 첨가구와 오르니틴과 아르기닌 0.1%씩 혼합된 기질 첨가구를 비교구로하여 실험하였다.

Tyrosinase은 반응 후 DL-β-3,4-dihydroxyphenyl alanine (DOPA) chrom을생성하게 되고 상기 생성물이 감소할수록 미백활성에 뛰어난 효과가 있음을 나타낸다. DL-β-3,4-dihydroxyphenyl alanine (DOPA) chrom은 비색법에 의해 측정하였다.

Tyrosinase효소의 기질로는 5mM DOPA 용액 0.2ml을 사용하였고, 상기 기질에 0.1M phosphate buffer (pH 6.8) 0.2mL, 본 발명 락토바실러스 AML15 균주 배양액 0.5mL과 tyrosinase (250unit/ml) 0.1mL을 첨가하여 35℃에서 2분간 반응한 후 그 반응액을 475nm에서 측정하였다. 측정된 흡광도는 하기 tyrosinase 활성 저해율 계산식을 이용하여 산출하였다.

<계산식>

Tyrosinase 효소활성 저해율 (%) = {1-(시료 첨가구의 흡광도/대조구의 흡광도)} X 100

실험결과, 도 5에 나타낸 바와 같이 푸트리신, 스퍼미딘, 스퍼민중 푸트리신의 Tyrosinase 효소활성 저해율이 가장 뛰어난 것으로 나타났으며, 본 발명 락토바실러스 속 AML15균주를 기질이 첨가되지 않은 MRS-변형 배지에 배양한 배양액에서 20%의 높은 저해활성이 나타났다.

< 실시예 4> 본 발명 락토바실러스 속 AML 15균주 배양액의 여드름 개선효과 검정

본 발명 락토바실러스 속 AML 15균주 배양액의 여드름 개선효과를 확인하기 위하여 여드름의 원인균인 프로피오니박테리움 에크니스 (Propionibacterium acnes)에 대한 항균활성 측정을 수행하였다.

배양배지 제조는 1L를 기준으로 했을 때 0.3g Yeast extract, 0.1g Soluble starch, 10.0g Beef extract, 0.5g Cysteine hydronchloride, 5.0g Dextrose, 3.0g Sodium acetate, 10.0g Tryptone, 5.0g Sodium chloride, 18g agar 그리고 나머지는 멸균증류수로 정량하여 멸균하여 항균활성 측정용 한천배지를 제조하였다.

프로피오니박테리움 에크니스는 상기 제조된 한천 배지에 접종한 후에 37℃에서 1일동안 혐기배양하여 항균활성 측정에 사용하였다. 프로피오니박테리움 에크니스가 배양된 상기 한천배지에 푸트리신, 스퍼미딘, 스퍼민과 본 발명 락토바실러스속 AML 15균주 배양액을 처리하여 항균활성을 측정하였다.

본 발명 MRS-변형배지에 폴리아민 생산을 위한 기질 오르니틴과 아르기닌을 각각 0.1% 더 첨가구와 오르니틴과 아르기닌 0.1%씩 혼합된 기질 첨가구를 비교구로하여 실험하였다.

실험결과, 도 6 및 7에 나타낸 바와 같이 푸트리신, 스퍼미딘, 스퍼민중 스퍼민의 프로피오니박테리움 에크니스 생장 저해율이 가장 뛰어난 것으로 나타났으며, 본 발명 락토바실러스 속 AML15균주를 기질이 첨가되지 않은 MRS-변형 배지에 배양한 배양액과 기질인 오르니틴을 0.1중량% 더 첨가하여 제조한 배지에서 배양한 본 발명 락토바실러스 속 AML15균주 배양액의 프로피오니박테리움 에크니스 생장 저해율에는 큰차이가 나타나지 않았다.

따라서, 기질이 포함되지 않은 폴리아민 생산용 MRS-변형 배지를 사용하여도 본 발명 락토바실러스 속 AML15균주의 항균활성에는 큰 변화가 없음을 확인하였다.

본 발명은 GRAS (Generally Recognized As Safe)급 락토바실러스속 AML 15 균주 및 이의 배양방법을 제공하고, 상기 배양방법을 통하여 수득한 배양액을 유효성분으로 함유하는 미백 또는 여드름개선용 화장료 조성물을 제공하는 뛰어난 효과가 있으므로 화장료산업상 매우 유용한 발명이다.

한국생명공학연구원

KCTC12047

20111114

Claims

젓갈로 부터 분리되는 폴리아민을 생성하는 신규 미생물 락토바실러스속 AML 15 균주 KCTC12047BP.
제 1항의 락토바실러스 AML 15 균주를 배지 전체에 대하여 Glucose 1.7중량%, (NH₄)₂SO₄ 0.2중량%, K₂HPO₄ 0.08중량%, KH₂PO₄ 0.06중량%, MnSO₄ 0.005중량%, MgSO₄ 0.005중량%, CaCO₃ 0.03중량%, Yeast extract 1.5중량%, Peptone 1.5중량% 그리고 나머지가 멸균수로 조성된 MRS 변형 배지에서 배양하여 폴리아민류를 포함하는 것이 특징인 유산균 배양물.
제 2항 기재의 배양물을 유효성분으로 함유하는 미백 또는 여드름 개선용 화장료 조성물.
제 3항 기재의 조성물을 유효성분으로 함유하는 미백 또는 여드름 개선용 화장품.