JP2992945B2 - ラクトバチルス・アシドフィルス乳酸菌 - Google Patents

ラクトバチルス・アシドフィルス乳酸菌

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JP2992945B2 JP6040921A JP4092194A JP2992945B2 JP 2992945 B2 JP2992945 B2 JP 2992945B2 JP 6040921 A JP6040921 A JP 6040921A JP 4092194 A JP4092194 A JP 4092194A JP 2992945 B2 JP2992945 B2 JP 2992945B2
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Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、新規なラクトバチルス
・アシドフィルス乳酸菌に関し、更に詳細には、公知の
ラクトバチルス・アシドフィルス乳酸菌の有する作用、
即ち大腸癌リスクを高めると考えられる抱合胆汁酸の脱
抱合作用と、必須脂肪酸及び脂溶性ビタミン等の脂質系
栄養素の吸収阻害作用とを示さずに、血清及び肝臓コレ
ステロール低下作用を有する新規なラクトバチルス・ア
シドフィルス乳酸菌に関する。
【0002】
【従来の技術】従来、ラクトバチルス属乳酸菌が血中コ
レステロール低下作用を有することに関する報告がなさ
れている。例えばGrunewaldは、ラクトバチルス・アシ
ドフィルス(Lactobacillus acidophilus)による発酵
乳を10%含む餌をラットに対して4週間給餌したとき
に、血清コレステロールレベルが有意に減少(p<0.
05)することを報告している(J. of Food Sience 4
7:p2078-2079(1982))。またGillilandらは、in vitroで
胆汁酸存在下生育促進能及びコレステロール資化能を有
する豚腸管由来のラクトバチルス・アシドフィルスを高
コレステロール食の豚に給餌したときに、血清コレステ
ロールレベルの上昇を顕著に抑制することを報告してい
る(Applied &Environmental Microbiology 49:p377-381
(1985))。更に鈴木らは、ラクトバチルス・アシドフィ
ルス発酵乳を高コレステロール飼料とともにラットに対
して12日間給餌したときに、血清コレステロール上昇
抑制効果が認められること、及びこの乳酸菌菌体には腸
管からのコレステロールミセルの吸収を減少させる作用
があることを報告している(日本畜産学会報62
(6):p565-571(1987))。
【0003】一方、胆汁酸は肝臓でコレステロールから
生合成され、胆汁中に含まれる。脂質の消化吸収に役立
っており、通常はグリシンやタウリンとアミド結合して
抱合型となり、タウロコール酸やグリココール酸等とし
て存在している。腸内において抱合胆汁酸が脱抱合を受
けると腸管下部において吸収されにくくなり、大腸にお
いて腸内細菌により二次胆汁酸に変換されると有害な発
癌性を示すようになる。Gillilandらは、ヒトの腸管由
来のラクトバチルス・アシドフィルスは、全て胆汁酸脱
抱合活性が認められることを報告している(Applied & E
nvironmental Microbiology 33:p15-18(1977))。
【0004】食生活の欧米化やライフスタイルの変化に
ともなって、近年の我が国においては心臓病が死亡原因
の上位を占めている。動脈硬化の原因となるコレステロ
ールを多く含む動物性脂肪の摂取を減らすことや、毎日
の生活の中で運動する機会を増やすこと、また危険因子
である喫煙を節制することなどが奨励されているが、長
い間培われた生活習慣を変えることは困難であることが
多い。高脂血症に効果的な医薬品も開発されてきてはい
るが副作用の危険性も有り、軽度の場合には食事療法が
有効であるので、その重要性が指摘されている。このよ
うな背景の中で嗜好性が高く容易に摂取が可能な食品の
なかに、心臓病の主要な原因である高脂血症を予防する
成分が求められている。
【0005】乳酸菌の中には、上述の通り血清コレステ
ロールを減少させるものがあることが報告されている。
その詳細な作用機構は明らかでないが、乳酸菌によるコ
レステロールの吸着(Bottazzi et. al., Annual Micro
biology 36:p1-6(1986))、および胆汁酸の吸着、あるい
はタウロコール酸やグリココール酸等の胆汁酸脱抱合活
性(Gilliland et. al., 1977)等による効果である可
能性が考えられている。しかしながら、この胆汁酸脱抱
合能は遊離のコール酸を生じて抱合胆汁酸のコレステロ
ール吸収能を阻害すると同時に、脂肪や脂溶性ビタミン
類等の栄養素の吸収阻害にも作用し、その潜在的な危険
性が指摘されている(Rambaud et. al.,Microbiology R
eviews 12:p207-220(1993))。例えば臨床的には、小腸
上部における胆汁酸脱抱合は、脂質吸収不良及び下痢等
を招くことが良く知られている(King and Toskes Gast
roenterology 76:p1035-1055(1979))。また、家畜の飼
育においては、その体重増加は腸内菌を有する通常動物
よりも無菌動物において優れているが(Coats et. al.,
British J. of Nutrition 13:p205-212(1959))、腸内
菌による胆汁酸の脱抱合活性を抑制すると生育が改善さ
れる(Feighner andDashkevicz, Applied Enviromental
Microbiology 53:p331-336(1987))ことから、胆汁酸脱
抱合作用が栄養素の消化吸収に及ぼす影響は重要である
と考えられる。
【0006】また脱抱合された胆汁酸は、回腸部位では
再吸収されにくいので大腸へ移行しやすく、そこで発癌
プロモーターである二次胆汁酸に変換されることから、
大腸癌のリスクを増大させることも考えられている(Hi
ll, Mutation Research 238:p313-320(1990))。
【0007】しかしながら、従来前述の胆汁酸脱抱合作
用及び栄養吸収阻害作用を示さずに血中コレステロール
低下作用を有するラクトバチルス属乳酸菌の創製手段並
びにこのようなラクトバチルス属乳酸菌自体に関する報
告はなされていないのが現状である。
【0008】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、胆汁
酸脱抱合作用を示さず、胆汁酸脱抱合により二次胆汁酸
を生じることなく、且つ、栄養吸収阻害作用を示さない
性質を保持し、血中コレステロール低下作用を有する新
規なラクトバチルス・アシドフィルス乳酸菌を提供する
ことにある。
【0009】
【課題を解決するための手段】本発明によれば、胆汁酸
脱抱合作用及び栄養吸収阻害作用を示さずに血中および
肝臓コレステロール低下作用を有するラクトバチルス
アシドフィルス乳酸菌が提供される。
【0010】以下に本発明を更に詳細に説明する。
【0011】本発明のラクトバチルス・アシドフィルス
乳酸菌は、公知の乳酸菌と異なる作用、即ち胆汁酸脱抱
合作用及び栄養吸収阻害作用を示さずに血中および肝臓
コレステロール低下作用を有する以外は、グラム陽性、
桿菌、運動性なし、カタラーゼ陰性、通性嫌気性、生育
至適温度30〜40℃、15℃で生育しない、DL乳酸生
成という菌学的性質においては相違のない菌である。
【0012】このような本発明のラクトバチルス・アシ
ドフィルス乳酸菌としては、工業技術院、生命工学工業
技術研究所に寄託されているラクトバチルス・アシドフ
ィルスCL−92(Lactobacillus acidophilus CL−
92)(FERM−P−14205)、ラクトバチルス
・アシドフィルスCL−0062(Lactobacillus acid
ophilus CL−0062)(FERM−P−1420
4)等を挙げることができる。
【0013】前記ラクトバチルス・アシドフィルスCL
−92(FERM−P−14205)は、胆汁酸脱抱合
作用及び栄養吸収阻害作用を示さずに血中および肝臓コ
レステロール低下作用を有し、以下に示す菌学的性質を
有する。
【0014】(形態学的性質) 1)細胞の形:桿菌、2)運動性の有無:無、3)胞子
の有無:無、4)グラム 染色:陽性 (生理学的性質) 1)カタラーゼ:陰性、2)インドールの生成:陰性、
3)硝酸塩の還元:陰性、4)酸素に対する態度:通性
嫌気性、5)15℃で生育:無、6)グルコースからホ
モ乳酸発酵によりDL乳酸生成、ガス産生無7)各種糖
類から酸生成の有無 グルコース + メリビオース − ラクトース + ラフィノース + マンノース + マンニトール − フラクトース + ソルビトール − ガラクトース + エスクリン + シュークロース + サリシン + アラビノース − N−アセチルグルコサミン + マルトース + アミグダリン + キシロース − ゲンチビオース + ラムノース − メレチトース − セロビオース + デキストリン − トレハロース + スターチ − また前記ラクトバチルス・アシドフィルスCL−006
2(FREM−P−14204)は、以下に示す菌学的
性質を示す。
【0015】(形態学的性質) 1)細胞の形:桿菌、2)運動性の有無:無、3)胞子
の有無:無、4)グラム 染色:陽性 (生理学的性質) 1)カタラーゼ:陰性、2)インドールの生成:陰性、
3)硝酸塩の還元:陰性、4)酸素に対する態度:通性
嫌気性、5)15℃で生育:無、6)グルコースからホ
モ乳酸発酵によりDL乳酸生成、ガス産生無7)各種糖
類から酸生成の有無 グルコース + メリビオース + ラクトース + ラフィノース + マンノース + マンニトール − フラクトース + ソルビトール − ガラクトース + エスクリン + シュークロース + サリシン + アラビノース − N−アセチルグルコサミン + マルトース + アミグダリン + キシロース − ゲンチビオース + ラムノース − メレチトース − セロビオース + デキストリン + トレハロース + スターチ − 本発明のラクトバチルス・アシドフィルス乳酸菌は、例
えば以下に示す(1)〜(6)のスクリーニング等を行なうこ
とにより得ることができる。
【0016】(1)分離同定試験 健常なヒトの新鮮冀便等の乳酸菌含有物を培養し、出現
したコロニーを、グラム染色にて検鏡、グラム陽性の乳
酸桿菌であることを確認し、更に各種糖からの酸生成、
乳酸旋光性、15℃生育性、ガス産生、カタラーゼ陰性
等の確認試験により、ラクトバチルス・アシドフィル
同定される菌株を分離する。
【0017】(2)コレステロール吸着試験 乳酸菌株を培養後、遠心分離して集菌し、集菌した菌
を、PPLO(BACT PPLO SERUM FRACTION (DIFCO LABO
RATORIES))等のコレステロール源を加えたリン酸バッ
ファー等に分散して、インキュベートする。次いで遠心
分離上清のコレステロール濃度を測定して、乳酸菌体に
より吸着されたコレステロールの割合を百分率で求め、
コレステロール吸着率20%以上の菌株を選択する。
【0018】(3)胆汁酸吸着試験 乳酸菌株を凍結乾燥し、タウロコール酸を含むリン酸バ
ッファー等に分散し、インキュベートする。次いで遠心
分離した上清の胆汁酸濃度を測定して、乳酸菌体により
吸着された胆汁酸の割合を百分率で求め、胆汁酸吸着率
50%以上の菌株を選択・分離する。
【0019】(4)胆汁酸脱抱合能の試験 選択した菌株を培養後、遠心して得られた菌体をタウロ
コール酸またはグリココール酸を含む、培養液と同じ容
量のリン酸バッファー等に再分散してインキュベートす
る。次いで遠心分離により菌体を除き、上清をシリカゲ
ルG薄層クロマトグラフィー等により分析してコール酸
の生成を測定する。この分析は、展開溶媒として、イソ
オクタン:イソプロピルエーテル:氷酢酸:イソプロパ
ノール=2:1:1:1等を用い、発色剤により発色さ
せることにより行なうことができる。この測定によりコ
ール酸の位置にスポットが認められない菌株を選択・分
離する。
【0020】これらのin vitroのスクリーニングを経た
乳酸菌株について、次いで(5)及び(6)の動物試験を行な
う。
【0021】(5)血清及び肝臓コレステロールの試験 SDラット等の動物に、試験群にはコレステロール、コ
ール酸ナトリウムを含む前記(4)までの in vitro 試験
で選別された乳酸菌株をそれぞれ接種し、培養した発酵
乳の凍結乾燥粉末を含む精製飼料を自由摂取させる。対
照群はコレステロール及びコール酸ナトリウムを試験群
と同量含み、未発酵の脱脂粉乳を含む精製飼料を自由摂
取させる。それぞれ10日間飼育後解剖し、腹部後大静
脈より採血し、更に肝臓を採取して血清コレステロール
及び肝臓コレステロールを測定する。測定の結果、対照
群よりコレステロールが低下した菌株を選択・分離す
る。
【0022】(6)乳酸菌発酵乳の投与による動物の生育
試験 SDラット等の動物に、試験群にはコレステロール、コ
ール酸ナトリウムを含む(5)で選択された乳酸菌を接種
し、培養した発酵乳の凍結乾燥粉末を含む精製飼料を自
由摂取させる。対照群はコレステロール及びコール酸ナ
トリウムを試験群と同量含み、未発酵の脱脂粉乳を含む
精製飼料を自由摂取させる。それぞれ30日間飼育し、
試験期間中の食餌量、体重増加を測定する。増体重、飼
料効率に差がなく、栄養吸収阻害が認められない乳酸菌
を選択・分離する。
【0023】以上(1)〜(6)までのスクリーニング等を行
なうことにより、胆汁酸脱抱合作用及び栄養吸収阻害作
用を示さずに血中および肝臓コレステロール低下作用を
有する目的のラクトバチルス・アシドフィルス乳酸菌を
取得することができる。この際前記スクリーニングは、
操作性及び菌株の選択性等を向上させるために、(1)〜
(6)の順番若しくは(2)と(3)とを逆にした順番で行なう
のが好ましい。
【0024】本発明のラクトバチルス・アシドフィルス
乳酸菌を用いて発酵乳等を調製し、砂糖、酸味料、香料
等を適宜添加することにより、発酵乳、ヨーグルト、乳
酸菌飲料、アシドフィラスミルク等の乳製品を調製し、
あるいは前記発酵乳を凍結乾燥し粉末製品としたり、そ
の粉末を打錠して錠剤製品として、経口摂取等させるこ
とによって血中および肝臓コレステロールを低下させる
食品、飲料、飼料等に利用することができる。この際必
要に応じて、ビフィズス菌、ラクトバチルス・ブルガリ
カス、ストレプトコッカス・サーモフィラス等の酪農用
乳酸菌を必要に応じて、組み合わせて使用することもで
きる。
【0025】前記血中および肝臓コレステロールを低下
させるための有効量は、食品、飲料、飼料等に含有させ
る本発明のラクトバチルス乳酸菌数を基準として、成人
一日当り好ましくは104〜1011個、特に好ましくは
106〜1011個を摂取することにより、目的とする効
果を得ることができる。
【0026】
【発明の効果】本発明のラクトバチルス・アシドフィル
乳酸菌は、公知のラクトバチルス・アシドフィルス
酸菌にはない作用を有する新規な菌であり、生菌のまま
摂取した際に胆汁酸脱抱合作用を示さないために、有害
な2次胆汁酸を生成することなく、更に、コレステロー
ル吸収を阻害することにより、通常は脂質系の栄養吸収
阻害作用が生じるが、コレステロール吸収阻害効果のみ
を示し、栄養吸収阻害作用を示さずに血中及び肝臓コレ
ステロール低下作用を有する。従って乳製品等の食品、
飲料並びに家畜の飼料等に利用することができる。
【0027】
【実施例】以下本発明を試験例及び実施例に基づいて具
体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるもので
はない。
【0028】
【実施例1】以下に示す(1)〜(6)のスクリーニングを順
次実施して、目的のラクトバチルス・アシドフィルス
酸菌を単離した。
【0029】(1)ラクトバチルス・アシドフィルス乳酸
菌の分離同定 健常なヒトの新鮮糞便1gを嫌気性希釈液にて適当な倍
率で希釈し、LBS平板培地(BBL MICROBIOLOGY SYSTE
MS)に塗抹した。これを微好気下で37℃48時間培養
し、得られた白色コロニーをグラム染色にて検鏡し、乳
酸菌であることを確認した。各種糖からの酸生成、乳酸
旋光性、15℃成育性、ガス産生、カタラーゼ陰性等の
確認試験により、ラクトバチルス・アシドフィルスと同
定される菌株を分離した。
【0030】(2)コレステロール吸着試験 (1)で得られた乳酸菌株を、0.2%チオグリコール酸
ナトリウム加MRSブロス(DIFCO LABORATORIES)に接
種し、37℃、24時間培養後に5000rpm、10
分間遠心分離して集菌し、コレステロール源としてPP
LO(BACT PPLO SERUM FRACTION (DIFCO LABORATORIE
S))を0.6ml加え、Oxgall(BACTO OXGALL
(DIFCO LABORATORIES))1%を含む0.1Mリン酸バッ
ファー(pH7.2)計3mlに分散させた。次いで3
7℃、3時間インキュベート後に遠心分離上清のコレス
テロール濃度を測定して、乳酸菌体により吸着されたコ
レステロールの割合を百分率で求めた。ほとんどの菌株
にコレステロール吸着能が認められ、菌株により差があ
るが20%以上のコレステロール吸着率を示すものを分
離した。
【0031】(3)胆汁酸吸着試験 (2)で得られた乳酸菌を凍結乾燥した乳酸菌体2.5m
gを、タウロコール酸0.4mgを含む0.2Mリン酸
バッファー(pH7.2)に分散し、37℃、18時間
インキュベートした。遠心分離上清の胆汁酸濃度を測定
して、乳酸菌体により吸着された胆汁酸の割合を百分率
で求めた。ほとんどの菌株に胆汁酸吸着能が認められ、
菌株により異なるが50%以上の胆汁酸吸着率を示すも
のを分離した。
【0032】(4)胆汁酸脱抱合能の試験 (3)で得られた乳酸菌株を、MRSブロスにて37℃、
16時間培養後、5000rpm、20分遠心分離し、
遠沈回収した菌体をタウロコール酸またはグリココール
酸を10mM含む0.1Mリン酸バッファー(pH7.
2)にて培養液と同じ容量に分散し、37℃、2時間イ
ンキュベートした。次いで5000rpm、20分間遠
心分離して菌体を除いた上清をシリカゲルG薄層クロマ
トグラフィーにて分析した。展開溶媒(イソオクタン:
イソプロピルエーテル:氷酢酸:イソプロパノール=
2:1:1:1)を用いて1時間展開した後に、発色剤
(アニスアルデヒド:氷酢酸:濃硫酸=1:100:
2)を噴霧し、125℃、10分間加熱して発色させ
た。この際(3)で選択されたラクトバチルス・アシドフ
ィルスCL−92株、CL−0062株、CL−82
株、CL−89株、CL−68株、CA−463株、C
L−132株及びCP−855株について分析したとこ
ろ、表1に示すように、ラクトバチルス・アシドフィル
スCL−92株、CL−0062株、CL−82株及び
CL−89株は、抱合胆汁酸を脱抱合せず、遊離のコー
ル酸を生じなかったので、これらの4株を選択分離し
た。これらの結果を表1に示す。
【0033】
【表1】
【0034】以上、in vitroのスクリーニングを経た
後、以下に示す動物試験によるスクリーニングを行なっ
た。
【0035】(5)SDラット4週令、雄5匹を1群と
し、試験群にはコレステロール0.5%、コール酸ナト
リウム0.12%を含む10%還元脱脂乳を95℃、2
0分間加熱殺菌後、(4)で選択したラクトバチルス・ア
シドフィルス株4株をそれぞれ接種し、37℃、16時
間培養した発酵乳の凍結乾燥粉末を20%含む精製飼料
を自由摂取させた。この飼料にはそれぞれ2.0×10
8の乳酸菌生菌が含まれていた。対照群にはコレステロ
ール及びコール酸ナトリウムを同量含み、未発酵脱脂粉
乳を20%含む精製飼料を自由摂取させた。それぞれ1
0日間飼育した後、解剖し、腹部後大静脈より採血する
とともに肝臓も採取して、血清コレステロール及び肝臓
コレステロールを測定した。
【0036】表2に示すように、ラクトバチルス・アシ
ドフィルスCL−92株及びCL−0062株は、対照
群に比べてコレステロールの上昇を有意に抑制した(p
<0.05)。同時にラクトバチルス・アシドフィルス
CL−92株及びCL−0062株においては、TC-HDL
/HDL〔(総コレステロール)−(HDLコレステロー
ル)/HDLコレステロール〕にて表わされる動脈硬化
指数も対照よりも低下しており、高コレステロール症の
改善効果を示すと共に、抗動脈硬化作用を有することが
認められたので、この2株を分離した。この際ラクトバ
チルス・アシドフィルスCL−82株及びCL−89株
は、対照群に比べてコレステロールの上昇抑制効果は認
められなかった。結果を表2及び表3に示す。
【0037】
【表2】
【0038】
【表3】
【0039】表3の結果より、肝臓に蓄積されるコレス
テロールは試験群において、対照群に比べて低下傾向が
認められた。
【0040】(6)SDラット4週令、雄10匹を2群に
分け、試験群にはコレステロール0.5%、コール酸ナ
トリウム0.12%を含む10%還元脱脂乳を95℃、
20分間加熱殺菌した後に、ラクトバチルス・アシドフ
ィルスCL−92株及びCL−0062株を接種し、3
7℃、16時間培養した発酵乳の凍結乾燥粉末を20%
含む精製飼料を自由摂取させた。この飼料にはそれぞれ
2.0×108の乳酸菌が含まれていた。対照群にはコ
レステロール及びコール酸ナトリウムを同量だけ含み、
未発酵脱脂粉乳を20%含む精製飼料を自由摂取させ
た。それぞれ30日間飼育し、試験期間中の食餌量、体
重増加を測定した結果、表4に示すように増体重及び飼
料効率において有意差はみられず、乳酸菌発酵乳の投与
による栄養吸収阻害は認められなかった。結果を表4に
示す。
【0041】
【表4】
【0042】
【比較例1】公知のアシドフィラスJCM−1132株
について、実施例1の(4)、(5)及び(6)と同様な実験を
行なった。その結果、対照群に比べてコレステロールの
上昇抑制効果は認められたが、胆汁酸脱抱合作用及び栄
養吸収阻害作用が同時に認められた。

Claims (2)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 胆汁酸脱抱合作用及び栄養吸収阻害作用
    を示さずに血中および肝臓コレステロール低下作用を有
    するラクトバチルス・アシドフィルス乳酸菌。
  2. 【請求項2】 前記ラクトバチルス・アシドフィルス
    酸菌が、ラクトバチルス・アシドフィルスCL−92
    (Lactobacillus acidophilus CL−92)(FERM
    −P−14205)又はラクトバチルス・アシドフィル
    スCL−0062(Lactobacillus acidophilus CL−
    0062)(FERM−P−14204)であることを
    特徴とする請求項1記載のラクトバチルス・アシドフィ
    ルス乳酸菌。
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