JP4193269B2

JP4193269B2 - 新規な生体浄化活性型乳酸菌製剤

Info

Publication number: JP4193269B2
Application number: JP05719399A
Authority: JP
Inventors: 忠世秦; 俊之丸岡
Original assignee: ビーエイチピーエイチカンパニーリミテッド
Priority date: 1999-03-04
Filing date: 1999-03-04
Publication date: 2008-12-10
Anticipated expiration: 2019-03-04
Also published as: ES2168076A1; GB2365444B; CA2314775C; GB0018956D0; CN1160085C; NL1015933C2; ES2168076B2; JP2000256202A; US6333188B1; DE10042625A1; RU2186575C2; CA2314775A1; FR2813084A1; FR2813084B1; GB2365444A; CN1339301A; BR0005049A; AU4896600A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、本発明者らが世界において初めて分離採取することに成功した、ラクトバチラス属（乳酸桿菌）に属しながら、従来公知菌にはない特異的な性質を有するラクトバチラスクリアランスと、脂質の代謝に深く関与しているエンテロコッカスフェカリス（腸球菌）の生菌体および死菌体の１種または２種と、を併用することによって、個々の特長をより鮮明且つ効果的に発現させる人および動物の健康に極めて有意義な乳酸菌製剤に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
腸内には、３００種、１００兆個もの菌が棲息しているといわれ、その全重量は１ｋｇにもおよび、人の細胞総数６０兆個よりはるかに多い。そして人および動物の健康や各種疾病に深く関わっていることが、長年にわたる疫学的調査や研究により次第に明らかになり、専門家は腸内細菌叢を一つの重要な臓器とみなしている。健康なときは、ビヒドバクテリウム属、ラクトバチラス属で代表される乳酸菌群に属する善玉菌が優勢な状態でバランスを保ちながら共生している。そのバランスが日常の食事の量や質の変化、過労、睡眠不足、精神ストレス等、様々な要因によって崩れ、ウェルシ菌、ベーヨネラ菌で代表される悪玉菌の繁殖力が旺盛となり、善玉菌を追い出し始めると、有害物質の産生が増加し、先ず下痢、便秘などの便通異常に始まって、血液の汚れからくる、慢性疲労や肌の荒れ、肝臓障害、高血圧や動脈硬化に到るまで、様々な疾病を誘発し、全身的な老化を押し進めることになる。
【０００３】
かって、ロシアのメチニコフ（1845〜1916）が老化の主因を腸内の腐敗発酵によって形成される毒物による中毒説を掲げ、対策としてヨーグルト類などの乳酸菌飲料を愛飲することが老化防止に役立つと提唱した。それ以来、乳酸菌の歴史は注目を浴びては、いつしか消え、消えては浮かぶ、の繰り返しで真の意味での実用性を獲得することは出来なかった。これは、疫学的調査が示すものと、実験が明らかにするものとが、旨く繋がらなかったからである。
【０００４】
最近に到り、微生物学の長足の進歩により、腸内の善玉菌の働き、すなわち、腸内の酸度を下げ、腸の運動を促進して、食物の消化と栄養素の吸収を助けること、有害物質の生成を抑えると同時に分解すること、ビタミンおよびアミノ酸を合成すること、病原菌の腸管感染を防禦すること、免疫力を高めること、など重要な働きを荷なっていることが解明されるにしたがい、メチニコフの推測が裏付けられ、今では健康学の常識にさえなってきている。
【０００５】
それに加えて、最近の健康志向の追い風にのり、乳酸菌は飲料として、また整腸剤として、人々の間にすっかり定着したかにみえる。しかしながら、現実は乳酸菌を毎日欠かさず摂取または服用しても健康を増進したとか、症状が改善された、という実感は得られず、確かな効果を期待する人にとっては物足らないことは否めず、残念なことに乳酸菌製品は単なる気休めとして飲まれるか、またはコーヒーなどと同じく嗜好品としての性格の方が、未だ強いのが実情である。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
以上のような状況にあって、短期間の投与により、従来の乳酸菌飲料または乳酸菌製剤にはない卓絶した効果を発揮する製品が求められていたが、以前、本発明者らがラクトバチラスクリアランスと命名した新種が健康に高い効果を見いだしたものの、とりわけ腸内浄化作用に力不足な点もあって、その解決に高力価株の作出などいろいろと試みてきたが、該菌単独使用のみでは限界があると認めざるを得なかった。従って、他の有効物質との併用により、健康な人にとっては、より生き生きとした健康体に、半健康人または半病人にとっては、不快な自覚症状が解消され、はっきりと健康体を取り戻していくことを体感し得る乳酸菌製剤が求められていた。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために生物・無生物を問わず、相性の良いパートナーを求めて鋭意追求した結果、終にラクトバチラスクリアランスと同じ乳酸菌群に属するエンテロコッカスフェカリスの内、トリグリセライドおよびコレステロールの中の少なくとも１種を低下させ得る菌株を見いだし、本発明を達成するに到った。すなわち、ラクトバチラスクリアランスの生菌体と、トリグリセライドおよびコレステロールの少なくとも１種または２種を低下させ得るエンテロコッカスフェカリスの生菌体と、からなることを特徴とする整腸用ならびに高脂血、高コレステロールおよび／または高血圧改善用乳酸菌製剤である。
【０００８】
本発明の第二は、ラクトバチラスクリアランスの生菌体と、トリグリセライドおよびコレステロールの少なくとも１種または２種を低下させ得るエンテロコッカスフェカリスの死菌体と、からなることを特徴とする整腸用ならびに高脂血、高コレステロールおよび／または高血圧改善用乳酸菌製剤である。
【０００９】
本発明の第三は、ラクトバチラスクリアランスの生菌体と、トリグリセライドおよびコレステロールの少なくとも１種または２種を低下させ得るエンテロコッカスフェカリスの生菌体および死菌体と、からなることを特徴とする整腸用ならびに高脂血、高コレステロールおよび／または高血圧改善用乳酸菌製剤である。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明にいうラクトバチラスクリアランス（Lactobacillus clearans）とは、次の生化学的性状▲１▼、▲２▼、▲３▼および、▲４▼を有する新規なラクトバチラス属の菌株である。すなわち、▲１▼肉エキス５ｇ、ペプトン５ｇ、ブドウ糖１ｇ、ＣａＣＯ₃１ｇ、水１Ｌ（ｐＨ中性）にＮａ₂Ｓ・９Ｈ₂Ｏ０．５ｇ及び／又はＮＨ₄ＯＨ０．５ｍｌを添加したときに、Ｎａ₂Ｓ・９Ｈ₂ＯとＮＨ₄ＯＨの双方を減少せしめることができる；▲２▼ステファンソン・ウェサムの培地〔（Ｓ−Ｗ）と略す；ＫＨ₂ＰＯ₄１ｇ、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．７ｇ、ＮａＣｌ１ｇ、（ＮＨ₄）₂ＨＰＯ₄４ｇ、ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．０３ｇ、ブドウ糖５ｇ〕にビタミン〔Ａ：９００国際単位、Ｂ₁：１ｍｇ、Ｂ₂：１ｍｇ、Ｂ₆：１ｍｇ、Ｂ₁₂：５γ、ニコチン酸アミド：１６ｍｇ、パントテン酸カルシウム：８ｍｇ、Ｃ：６４ｍｇ、Ｄ₂：１２０国際単位〕及びカザミノ酸１ｇよりなる培地に該菌を培養し、その対数増殖期にＮａ₂Ｓ・９Ｈ₂Ｏ０．５ｇ及び／又はＮＨ₄ＯＨ０．５ｍｌを添加しても発育促進作用を示さない；▲３▼自然分離菌はＮａ₂Ｓ・９Ｈ₂Ｏに対して従来公知の乳酸菌よりは強く、ラクトバチラスデオドランスよりは弱い抵抗性を示す；▲４▼グラム陽性菌、桿状、運動性なく、カタラーゼ陰性、硝酸塩を還元せず、ゼラチンを分解せず、インドール、硫化水素を生成せず、ブドウ糖、乳糖よりの乳酸形成能力は高く、酢酸、添加によって発育促進される；ラクトバチラス属の菌株である（特公平４−６３２号参照）。
【００１１】
ラクトバチラスクリアランスの特長は、通常のラクトバチラスが有する作用に加えて、特許第１７１４４１３号および平成１１年特許願第１５１７７号の記載のように、▲１▼腸内腐敗有臭物質を資化、分解する；▲２▼腸内細菌叢の内、善玉菌の代表であるビフィドバクテリウム、ラクトバチラスなどの増大に加担して、逆に悪玉菌の代表であるウェルシュ菌、ベーヨネラ菌などを著しく減少させ、腸内細菌叢のバランスを良くして腸内環境を改善する；▲３▼主として腸管感染起炎菌の増殖を抑制し、且つ毒性を減弱化させる；など従来のラクトバチラスにはない強力な腸内浄化作用を具備している。
【００１２】
以下、これらの作用を試験を通して説明することにする。先ず初めに、試験管内テスト（in vitro）を行った。試験管（18×180 mm）に糞便の１０倍希釈液１５ｍｌを入れ、▲１▼１２０℃、１５分間高圧滅菌したもの、▲２▼滅菌しないもの、それぞれに供試菌を接種し、ゴム栓にて密栓し、３７℃、７２時間、嫌気的に培養した後、試験管内の空気を１ｍｌ、シリンジで吸引し、容量５Ｌの匂い袋に注入して、パネラー６人による嗅覚官能テストを実施した。なお、臭気の程度は、表１に示した糞便の臭気の評価基準に拠った。
【００１３】
【表１】

【００１４】
ラクトバチラスクリアランスの代表的な３菌株、すなわちFERM P-17148菌、FERM P-17149菌およびFERM P-17150菌を用いて、上記の試験管内テストにより、脱臭能力を試験した。その結果は、表２に示したように、高圧滅菌したものは明らかに脱臭され、糞便の弱い臭い〜糞便の微弱な臭い、へと変化した。一方、滅菌しないものは糞便中に多数棲息する腐敗性菌の活躍もあってか、有臭有毒物質が次々と産生されるため、その脱臭の程度は、高圧滅菌したものに比して低かったが、それでも明らかに脱臭されていた。以上のテストはラクトバチラスクリアランスの代表的な３株の成績であるが、同種の他の菌株についても類似の成績であった。
【００１５】
【表２】

【００１６】
次に、経口投与試験（in vivo ）として、ラクトバチラスクリアランスFERM P-17150菌により製造したヨーグルト１５０ｍｌを毎日１回摂取し、摂取後２０〜３０日、５０〜６０日、８０〜９０日の間、連日排泄糞便の臭気を測定し、その平均値を表３に示した。測定方法は、摂取１０名の排泄糞便０．５ｇのそれぞれを容量２０Ｌの匂い袋に入れ、室温で放置し、３０分後の臭気をパネラー６人により判定した。ここで、摂取していない人５名の糞便の臭気の平均値を１００とした。糞便の臭気は、食事内容などによって、かなり変動がみられたが、ヨーグルトを試飲した１０名の平均臭気は、摂取１ヵ月後には約５０％に、２ヵ月後には７０％減少、３ヵ月後には８５％減少した。しかし、３ヵ月以降は、そのまま継続して摂取しても、臭気の程度は、８０〜９０％減少したままで終始した。
【００１７】
【表３】

【００１８】
かって、本発明者らは、自然界の浄化と菌との相関関係において、その対称物を試験の容易な有臭物質に絞り、これらを硫黄化合物、窒素化合物および炭素化合物に大別した。そして有臭硫黄化合物の代表としてＮａ₂Ｓ・９Ｈ₂Ｏを、有臭窒素化合物の代表としてＮＨ₃を、有臭炭素化合物の代表として酢酸、酪酸などの低級脂肪酸を、資化、分解しうる菌は、それより高分子の有臭硫黄化合物、有臭窒素化合物および有臭炭素化合物の多くを資化、分解しえることを見いだし、ＳＮＣ−理論と称した。この理論に沿って、以下の各種試験を行った。
【００１９】
合成培地として、１Ｌ中に、肉エキス５ｇ、ペプトン５ｇ、酪酸ナトリウム３ｇ、ブドウ糖５ｇ、ＣａＣＯ₃３ｇ、にＮａ₂Ｓ・９Ｈ₂Ｏ０．５ｇまたはアンモニア水（ＮＨ₄ＯＨ）０．５ｍｌを添加し、ラクトバチラスクリアランスを接種し、３７℃、７２時間、嫌気的に培養を行い、添加したＮａ₂Ｓ・９Ｈ₂ＯまたはＮＨ₄ＯＨの減少率を経時的に測定した。採用した測定方法は、Ｎａ₂Ｓ・９Ｈ₂Ｏについては、ＪＩＳＫ０１０２−１９８５ヨウ素滴定法、ＮＨ₄ＯＨについては、ＪＩＳＫ０１０２−１９８５インドフェノール青吸光度法である。測定結果を表４および表５に示した。これらの表から明らかなようにラクトバチラスクリアランスは有臭有毒のＮａ₂Ｓ・９Ｈ₂ＯおよびＮＨ₄ＯＨを７２時間で、４０〜５０％も減少させる能力を有している。つまり、他の多くの有臭有毒の物質を資化および分解することを意味しているのである。
【００２０】
【表４】

【００２１】
【表５】

【００２２】
ラクトバチラスクリアランスの脱臭作用を評価する方法として、先に試験管内における官能テストおよび化学的検査について述べたが、その際に調製した糞便１０倍希釈液を培養直前と、７２時間培養後と、にそれぞれ遠心分離し、その上清５ｍｌを採取し、１０倍に希釈してＳ²⁺イオンおよびＮＨ₄ ⁺イオンの濃度を測定し、それぞれの減少の程度を算出した。その結果は表６から明らかなように、上述の合成培地での減少率よりも、糞便中に含まれるＳ²⁺イオンおよびＮＨ₄ ⁺イオンの減少率の方が、やや高いといえる。これはラクトバチラスクリアランスの棲息場所として、糞便中の方が適していることを物語っている。採用した測定方法は、Ｓ²⁺イオンについては、ＪＩＳＫ０１０２−１９８５ヨウ素滴定法、ＮＨ₄ ⁺イオンについては、ＪＩＳＫ０１０２−１９８５インドフェノール青吸光度法である。
【００２３】
【表６】

【００２４】
上記の上清２μｌをガスクロマトグラフィーに注入して、低級脂肪酸の分析を行った。ガスクロマトグラフィーは、Col.unisole F-200 30/60 ガラス 3φ×3m、キャリアガス 50ml/分(He)、水素 0.55kg/cm²G、空気0.55kg/cm²G 、カラム温度１４０℃、Inj 200 ℃で使用した。測定物質は、酢酸、プロピオン酸、Iso-酪酸、n-酪酸、Iso-吉草酸、n-吉草酸で、これらの濃度を合算したものを表７に示した。表７から判るように低級脂肪酸の濃度は、高圧滅菌した場合には５０〜７５％減に、滅菌しない場合でも４０〜６０％減になった。
【００２５】
【表７】

【００２６】
ラクトバチラスクリアランスの代表的な３菌株、すなわちFERM P-17148菌、FERM P-17149菌およびFERM P-17150菌の凍結乾燥菌体をそれぞれ製造し、これらを等量ずつ混合したものを剤として、その２ｇ（５×１０⁸個／ｇ）を連日服用し、腸内細菌叢のうち善玉菌の代表として知られるビヒドバクテリウム（Bifidobacterium ）およびラクトバチラス（Lactobacillus 、但しその人固有の菌株、投与したラクトバチラスクリアランスは含まない）を、一方悪玉菌の代表としてベーヨネラ（Veillonella ）およびクロストリディウム（Clostridium perfrigens＝ウエルシ菌）の消長（菌数／糞便１ｇ）を経時的に測定した。健常者２０人への経口投与結果を表８に、病弱者２０人への経口投与結果を表９に示した。
【００２７】
【表８】

【００２８】
【表９】

【００２９】
表８および表９から判るように、ラクトバチラスクリアランス製剤を服用する前の腸内細菌叢をみると、健常者は病弱者に比べて、善玉菌は平均２２０％多く、逆に悪玉菌は僅か２２．５％に過ぎない。このことは、腸内細菌叢の現状が、現在の健康状態の指標となること、すなわち腸内細菌叢が如何に健康に深く関わっているかを如実に示している。さらに、新たな知見として本剤を服用することにより、健常者は先ず善玉菌が増えだし、その増加にしたがって、悪玉菌が徐々に減少していくというパターンをとっている。これに対し、病弱者は悪玉菌が先ず減少し始め、その後善玉菌が漸次増加していくというパターンをとることが判った。全体としてみると、善玉菌および悪玉菌の平均的な消長は、服用後間もなく、善玉菌は増えだし、反対に悪玉菌は減少していく。そして、３ヵ月目頃からその傾向は加速して、ビヒドバクテリウムは６ヵ月後５０％増、１年後には１１０％増に、ラクトバチラスは６ヵ月後３００％増、１年後には９５０％増になった。これに対し、クロストリディウムは６ヵ月後７０％減、１年後８５％減に、ベーヨネラは６ヵ月後６７．５％減、１年後には８２．５％減になった。
【００３０】
ラクトバチラスクリアランスの病原菌に対する作用をみるため、大腸菌Ｏ−１５７（Escherichia coli O-157）、サルモネラエンテリティディス（Salmonella enteritidis）およびシゲラフレクスネリー（赤痢菌、Shigella flexneri ）それぞれの単独培養とラクトバチラスクリアランス（FERM P-17150）との混合培養とを行い、その結果を比較した。培養に用いた培地組成は、１Ｌ中に肉エキス１０ｇ、ペプトン１０ｇ、ブドウ糖２ｇ、ＮａＣｌ２ｇ、ＣａＣＯ₃１ｇを含み、ｐＨ７．２に調整した。培養は３７℃で嫌気的に行い、７２時間毎に継代培養することを繰り返し、その都度平板に希釈塗布して、菌の消長、出現コロニーがＳ型（原型）か、変異して毒性が減弱したＲ型か、その割合はどうか、などを観察した。実験に供した病原菌は、株式会社メディック（登録衛生検査所）より入手したものである。
【００３１】
大腸菌Ｏ−１５７の単独培養成績を表１０に、大腸菌Ｏ−１５７とラクトバチラスクリアランスとの混合培養成績を表１１に示した。表１０から判るように大腸菌Ｏ−１５７の単独培養では、２０代の継代をとおして菌数はほぼ一定の４〜５×１０⁹個／ｇであって、この間Ｒ型が出現することはなかった。一方、大腸菌Ｏ−１５７とラクトバチラスクリアランスとの混合培養では、表１１から明らかなように、ラクトバチラスクリアランスの菌数の変動は小さいが、大腸菌Ｏ−１５７の菌数の変動は大きく、継代５代目頃からＲ型が出現し、以後継代を重ねるにしたがって、Ｒ型の割合が増加し、１８代目で全ての菌がＲ型を形成した。それ以降、継代を継続しても、二度とＳ型が復活することはなった。
【００３２】
【表１０】

【００３３】
【表１１】

【００３４】
サルモネラエンテリティディスの単独培養成績を表１２に、サルモネラエンテリティディスとラクトバチラスクリアランスとの混合培養成績を表１３に示した。表１２から判るようにサルモネラエンテリティディスの単独培養では、菌数は３〜５×１０⁹個／ｇであって、１４代目で自然発生的にＲ型が出現し、２０代目でその割合は５％になり、以後継代毎に増減しながら５０代目で最高数値２３％を記録したが、それ以降のＲ型の割合は２０％前後で終始した。一方、サルモネラエンテリティディスとラクトバチラスクリアランスとの混合培養では、表１３から明らかなように、僅か５代の継代でＲ型の割合が２９％にもなり、継代を重ねるにしたがい、Ｒ型の割合が増加し、１０代目で５０％、２０代目で９０％、４７代目で終に１００％になった。それ以降継代を続けると、ときとしてＳ型が復活するが、その割合は１％未満であり、７０代を過ぎるとＳ型は完全に消失し、再び復活することはなかった。
【００３５】
【表１２】

【００３６】
【表１３】

【００３７】
シゲラフレクスネリー（赤痢菌）の単独培養成績を表１４に、シゲラフレスネリー（赤痢菌）とラクトバチラスクリアランスとの混合培養成績を表１５に示した。表１４から判るようにシゲラフレクスネリー（赤痢菌）の単独培養では、１０代目で自然発生的にＲ型が出現し、２０代目でその割合は９％になり、以降継代毎に増減しながら４０代目で最高数値２０％を記録したが、それ以降のＲ型の割合は１０〜２０％前後で終始した。一方、シゲラフレクスネリー（赤痢菌）とラクトバチラスクリアランスとの混合培養では、表１５から明らかなように、僅か５代の継代でＲ型が出現し、継代を重ねるにしたがい、Ｒ型の割合が増加し、８０代目で終に１００％になった。それ以降継代を続けると、ときとしてＳ型が復活するが、その割合は１％未満であり、１０８代を過ぎるとＳ型は完全に消失し、再び復活することはなかった。
【００３８】
【表１４】

【００３９】
【表１５】

【００４０】
大腸菌Ｏ−１５７、サルモネラエンテリティディスおよびシゲラフレクスネリー（赤痢菌）の各々のＳ型およびＲ型について、その毒性を調べるため、１群１０匹として、８週令雄性マウス１匹当たり１×１０⁸個の菌を腹腔内投与した。なお、Ｓ型については保存株を、Ｒ型についてはラクトバチラスクリアランスによって、１００％Ｒ型に変異した時点の菌株を使用した。その結果は、表１６に示すように、Ｓ型の病原菌においては、全て４日以内に死亡したが、Ｒ型ではシゲラフレクスネリー（赤痢菌）が７日目に死亡した以外は、死亡例はみられなかった。
【００４１】
【表１６】

【００４２】
先に述べた、ラクトバチラスクリアランスで製造したヨーグルトを人に経口投与し、腸内細菌叢の変化を調べた際に、１回／月の割合で、血液検査を実施した。その結果、投与前に比べて８０％を越える人に、明らかにコレステロールおよび中性脂肪（トリグリセライド）に１０％前後の低減が認められた。
【００４３】
本発明のラクトバチラスクリアランスの特長を、従来公知のラクトバチラス属の菌との機能面からみた相違点は表１７に示したとおりである。
【００４４】
【表１７】

【００４５】
エンテロコッカスフェカリス（Enterococcus faecalis ）の一般性状は、乳酸菌群に属し、腸内細菌叢を構成する菌群であって、糞便１ｇ当たり、通常１×１０⁷個程度棲息している。球〜卵形で２個または短い連鎖で出現し、一般の連鎖球菌に比して、生育温度域が１０〜４５℃と広く、熱や乾燥、塩素、胆汁酸などに対して抵抗性が強いグラム陽性の球菌である。菌株によっては、病原性を有するものが存在するが、概ね無害であり、その生菌体は整腸剤として、日本においても、数十年前から市販されており、経口的には実質無毒であることは、すでに実証済みである。これら市販品とは別個に、最近に到り、一部の菌株に、その生菌体または死菌体が血中コレステロールおよび中性脂肪（トリグリセライド）の値を効果的に低下させることが明らかになった。従って、これらに関連する典型的な成人病（生活習慣病）、すなわち高脂血症、高血圧症、動脈硬化症などの疾患に対する予防ないしは治療に期待されている。なお、本発明でいうエンテロコッカスフェカリスとは、この能力を有する菌株を指す。
【００４６】
本発明に使用するエンテロコッカスフェカリスの生菌体の調製方法の１例は次のとおりである。すなわち、常法により培養し、遠心分離した菌体を生理的食塩水に懸濁させた後、洗浄し、再度遠心分離し、集菌したものであり、保護剤として可溶性デンプンを使用して凍結乾燥したものである。また、エンテロコッカスフェカリスの死菌体の調製方法の１例は、上記生菌体を取得する際に得られる洗浄後の遠心分離菌体と可溶性デンプンとを１００℃の熱水中で３０分間処理し、それを凍結乾燥したものである。
【００４７】
エンテロコッカスフェカリスは、硫化ナトリウム（Ｎａ₂Ｓ・９Ｈ₂Ｏ）およびアンモニアを試験管内で低減させる能力はないが、糞便１０倍希釈液に対する脱臭能力は弱いながらも認められた。エンテロコッカスフェカリスの代表的な２菌株、すなわちFERM P-17151菌およびFERM P-17152菌の脱臭能力を、表１８に示す。なお、試験方法はラクトバチラスクリアランスの場合と同様で、評価基準は表１に示したとおりである。
【００４８】
【表１８】

【００４９】
エンテロコッカスフェカリスの代表的な２菌株を毎日１×１０⁹個／人経口投与し、摂取前の糞便の臭気を１００とし、摂取後２０〜３０日、５０〜６０日、８０〜９０日の糞便の臭気を測定し、表１９に示した。表１９から判るとおり、エンテロコッカスフェカリスによる臭気の減少が僅かながらもみられた。
【００５０】
【表１９】

【００５１】
エンテロコッカスフェカリスの代表的な２菌株、すなわちFERM P-17151菌、およびFERM P-17152菌の生菌体および死菌体をそれぞれ製造し、生菌体同志および死菌体同志で等量ずつ混合したものを剤として、１×１０⁹個／日／人を６ヵ月間服用し、腸内細菌叢の消長を善玉菌の代表として知られるビヒドバクテリウムおよびラクトバチラス（その人固有の菌株、投与したラクトバチラスクリアランスは含まない）の菌数／糞便１ｇの消長を、一方悪玉菌の代表としてベーヨネラおよびクロストリディウムの菌数／糞便１ｇの消長を，経時的に測定した。健常者１０人への経口投与結果を表２０に示した。表２０から判るように、生菌体の方が死菌体に比して、やや高い改善効果がみられた。しかし、ラクトバチラスクリアランスの効果には遠く及ばなかった。
【００５２】
【表２０】

【００５３】
エンテロコッカスフェカリスの病原菌に対する作用をみるため、大腸菌Ｏ−１５７（Escherichia coli O-157）、サルモネラエンテリティディス（Salmonella enteritidis）およびシゲラフレクスネリー（赤痢菌、Shigella flexneri ）との混合培養を行ったが、これらの病原菌がＳ−Ｒ変異する割合は、自然発生的に現れる割合とほとんど差異はなかったが、継代する毎に病原菌の菌数が徐々に減少し、サルモネラエンテリティディスは２５代目で、シゲラフレスネリー（赤痢菌）は３３代目で、大腸菌Ｏ−１５７は３５代目で消滅した。これはエンテロコッカスフェカリスの発育増殖が、病原菌に打ち勝っていることを示唆しているが、病原菌の発育を抑制する何らかの生理活性物質も産生している可能性は否定できない。
【００５４】
エンテロコッカスフェカリスの上記生菌体製剤および死菌体製剤を飼料にそれぞれ１×１０⁹個／飼料１ｇ添加し、３ヵ月間飼育したマウスと、通常の飼料のみで飼育したマウスとの、血清中のトリグリセライドおよびコレステロールを比較した。なお、マウスは各群１０匹とし、飼料は自由摂取とした。トリグリセライドの測定はＥ−テストワコーにより、コレステロールの測定はＣ−テストワコーにより、実施し、対照とするマウスの平均値を１００％として、表２１に示した。表２１から判るように生菌体および死菌体に関わらず、摂取し続けたマウスは両値とも２０〜４０％低下し、その有効性には疑問の余地はない。
【００５５】
【表２１】

【００５６】
８週令の高血圧自然発生ラット（ＳＨＲ）１５匹を３群に分け、エンテロコッカスフェカリスの上記生菌体製剤および死菌体製剤を飼料にそれぞれ１×１０⁹個／飼料１ｇ添加した群および菌体製剤を投与しない対照群を設け、３ヵ月間飼育を行った。３ヵ月後の血圧を表２２に示した。表２２から明らかなように、約１０％前後の血圧降下作用が認められた。
【００５７】
【表２２】

【００５８】
【実施例】
上述のようなラクトバチラスクリアランスの優れた作用と、エンテロコッカスフェカリスの優れた作用とを、組み合わせることにより、驚異的な効能効果を短期間で発現することができた。以下に、本発明の各製剤の製造方法および実施例について説明するが、本発明の趣旨はこれらの製造例および実施例に限定されるものではない。
【００５９】
（製造例１）
ラクトバチラスクリアランス製剤の製造方法は、培地１Ｌ中に、肉エキス５ｇ、ペプトン５ｇ、酢酸ナトリウム３ｇ、アンモニア水１ｍｌ、ブドウ糖１０ｇ、シスチン０．５ｇ、酵母エキス２ｇを含有する培地１０Ｌにラクトバチラスクリアランスを接種し、３７℃、７２時間、嫌気的に培養した。培養後、培養液を遠心分離して、菌塊１０ｇを得た。次いで、生理食塩水５００ｍｌで洗浄し、遠心分離することを２回繰り返した。得られた清浄菌塊をスキムミルク５０ｇ、トレハロース３０ｇ、タウリン０．５ｇからなる溶液５００ｍｌに入れ、よく攪拌し、常法により凍結乾燥して菌製剤８２．５ｇ（菌数３×１０⁹個／ｇ）を得た。これをよく乾燥したスキムミルク３３０ｇに混和させて、１ｇ当たり生菌体５×１０⁸個を含有するラクトバチラスクリアランス製剤に調整した。
【００６０】
（製造例２）
エンテロコッカスフェカリス生菌体製剤の製造方法は、培地１Ｌ中に、肉エキス５ｇ、ペプトン５ｇ、食塩２ｇ、酵母エキス２ｇ、ブドウ糖１０ｇ、を含有する培地１０Ｌにエンテロコッカスフェカリスを接種し、３７℃、７２時間、好気的に培養した。培養後、培養液を遠心分離して、菌塊１６ｇを得た。次いで、生理食塩水８００ｍｌで洗浄し、遠心分離することを２回繰り返した。得られた清浄菌塊を、スキムミルク２０ｇ、可溶性デンプン３０ｇ、グルタミン酸ナトリウム０．５ｇからなる溶液５００ｍｌに入れ、よく攪拌し、常法により凍結乾燥して菌製剤５４ｇ（菌数５×１０⁹個／ｇ）を得た。これをよく乾燥した可溶性デンプン４８６ｇに混和させて、１ｇ当たり生菌体５×１０⁸個を含有するエンテロコッカスフェカリス生菌体製剤に調整した。
【００６１】
（製造例３）
エンテロコッカスフェカリス死菌体製剤の製造方法は、製造例２により得られた清浄菌塊を、生理食塩水５００ｍｌに懸濁して、次いで可溶性デンプン５０ｇを投入し、１１０℃、１５分間加熱殺菌し、その懸濁液を常法により凍結乾燥して菌製剤５３ｇ（菌数５×１０⁹個／ｇ程度）を得た。なお、死菌体製造の際、超音波やその他の方法で菌体を破砕しても製造可能である。
【００６２】
（製造例４）
ラクトバチラスクリアランスとエンテロコッカスフェカリスとの混合製剤の製造方法は、製造例１において製造したラクトバチラスクリアランス製剤と製造例２において製造したエンテロコッカスフェカリス生菌体製剤または製造例３において製造したエンテロコッカスフェカリス死菌体製剤とを等量混和させて混合製剤とする。このとき、製剤中に含まれる菌数は、ラクトバチラスクリアランス２．５×１０⁸個／ｇおよびエンテロコッカスフェカリス２．５×１０⁸個／ｇであるが、製造過程においてラクトバチラスクリアランス製剤とエンテロコッカスフェカリス製剤との割合を変えることにより、任意の菌数を含有する混合製剤を製造することも可能である。また、各製剤の剤型は、粉末状、顆粒状、カプセル剤、など通常の剤型を、適当な賦形剤と共に、適宜選択することができる。
【００６３】
（実施例１）
試験管（18×180 mm）に糞便の１０倍希釈液１５ｍｌを入れ、▲１▼１２０℃、１５分間高圧滅菌したもの、▲２▼滅菌しないもの、にそれぞれに供試菌を接種し、ゴム栓にて密栓し、３７℃、７２時間、嫌気的に培養した後、試験管内の空気を１ｍｌ、シリンジで吸引し、容量５Ｌの匂い袋に注入して、パネラー６人による嗅覚官能テストを実施した。なお、臭気の程度は、表１に示した糞便の臭気の評価基準に拠った。なお、エンテロコッカスフェカリス死菌体製剤の場合には、製造例３において製造した製剤を０．１ｇ試験管に添加した。試験結果は表２３に示すように、糞便の臭気は著しく減弱し、特に糞便の希釈液を高圧滅菌した場合に、その効果は顕著であった。このことは、表２に示したラクトバチラスクリアランス単独接種した場合と比較すると明らかである。
【００６４】
【表２３】

【００６５】
（実施例２）
ラクトバチラスクリアランスFERM P-17150菌を、１Ｌ中の組成がスキムミルク１００ｇ、砂糖５０ｇ、寒天２ｇである培地で、製造したヨーグルト１００ｍｌとエンテロコッカスフェカリス（FERM P-17151菌）生菌体製剤１ｇまたはエンテロコッカスフェカリス（FERM P-17151菌）死菌体製剤１ｇとを併用して、１０名に連日投与し、投与後２０〜３０日、５０〜６０日、８０〜９０日の間、連日排泄糞便の臭気を測定した。測定方法は、摂取１０名の排泄糞便０．５ｇのそれぞれを容量２０Ｌの匂い袋に入れ、室温で放置し、３０分後の臭気をパネラー６人により判定した。ここで、投与していない人５名の糞便の臭気の平均値を１００とした。その平均値は表２４から明らかなように、経口投与においても、糞便の臭気は、日数の経過と共に減弱し、９０日後の臭気は、かなり減弱し、不快感はもはやなかった。この顕著な効果は、表３に示したラクトバチラスクリアランス単独投与した場合と比較すると明らかである。
【００６６】
【表２４】

【００６７】
（実施例３）
実施例１におけると同様に糞便の１０倍希釈液および▲１▼１２０℃、１５分間高圧滅菌したもの、▲２▼滅菌しないもの、にそれぞれに供試菌を接種し、ゴム栓にて密栓し、３７℃、７２時間、嫌気的に培養した後の液とを遠心分離し、各々の上清５ｍｌを採取し、１０倍に希釈して５０ｍｌとした液に含有する遊離の硫黄イオン（Ｓ²⁺）およびアンモニウムイオン（ＮＨ₄ ⁺）の濃度を測定した。また、低級脂肪酸類の濃度はガスクロマトグラフィーにより測定した。これらの測定結果を表２５および表２６に示した。これらの表から明らかなように、糞便中に含有される代表的な物質の減少率は、滅菌のいかんに関わらず、いずれも７０〜９０％もの高率を示した。この高い減少率は、表６および表７に示したラクトバチラスクリアランスを単独に接種した場合と比較すると明らかである。
【００６８】
【表２５】

【００６９】
【表２６】

【００７０】
（実施例４）
ラクトバチラスクリアランスの代表的な３菌株、すなわちFERM P-17148菌、FERM P-17149菌およびFERM P-17150菌のそれぞれの菌製剤を等量ずつ混和させたラクトバチラスクリアランス製剤１ｇ（５×１０⁸個／ｇ）と、エンテロコッカスフェカリスFERM P-17151菌によるエンテロコッカスフェカリス生菌体製剤１ｇ（５×１０⁸個／ｇ）またはエンテロコッカスフェカリスFERM P-17152菌によるエンテロコッカスフェカリス死菌体製剤１ｇ（５×１０⁸個／ｇ）、を使用して、健常者２０名および病弱者２０名に６ヵ月間連日投与して、経時的に腸内細菌叢を追跡調査し、その結果を表２７および表２８に示した。これらの表から判るように、ラクトバチラスクリアランスにエンテロコッカスフェカリスの生菌体または死菌体を混和して経口投与すると、表８および表９に示すように、ラクトバチラスクリアランスの単独投与の場合と比較すると、スピーディーに善玉菌は増加し、一方悪玉菌は減少する。すなわち、健常者の場合には、改善スピードが約２５％アップし、善玉菌の菌数は１０〜５０％多くなり、悪玉菌の菌数は２０〜４０％少なくなっており、病弱者の場合には、改善スピードが約３０％アップし、善玉菌の菌数は１０〜３０％多くなり、悪玉菌の菌数は２０〜５０％少なくなっており、腸内細菌叢の改善が病弱者ほど効率よく行われたといえる。
【００７１】
【表２７】

【００７２】
【表２８】

【００７３】
（実施例５）
ラクトバチラスクリアランスと、大腸菌Ｏ−１５７、サルモネラエンテリティディスまたはシゲラフレクスネリ（赤痢菌）との、それぞれの混合培養にエンテロコッカスフェカリスの生菌体または死菌体を添加して、３７℃で嫌気的に培養し、７２時間毎に継代することを繰り返し、その都度希釈塗布して、それぞれの菌数の消長、大腸菌Ｏ−１５７、サルモネラエンテリティディスおよびシゲラフレクスネリ（赤痢菌）のＳ−Ｒ変異の割合を観察し、その結果を表２９、表３０、表３１，表３２、表３３および表３４に示した。なお、ラクトバチラスクリアランスはFERM P-17150株を、エンテロコッカスフェカリスはFERM P-17152株を使用した。また、エンテロコッカスフェカリスの死菌体は、前記死菌体製剤を培地１Ｌ当たり１ｇを添加した。培養に用いた培地組成は、１Ｌ中に肉エキス１０ｇ、ペプトン１０ｇ、ブドウ糖２ｇ、ＮａＣｌ２ｇ、ＣａＣＯ₃１ｇを含有し、ｐＨ７．２に調整し、１２０℃、１５分間、高圧滅菌したものである。これらの表から判るように、大腸菌Ｏ−１５７、サルモネラエンテリティディスおよびシゲラフレクスネリ（赤痢菌）などの病原菌に、ラクトバチラスクリアランスおよびエンテロコッカスフェカリスの生菌体を接種した場合、継代を重ねるにしたがい、それぞれの病原菌は急速に菌数を減らしながら、Ｒ型に変異していった。大腸菌Ｏ−１５７は１３代目で、Ｒ型に１００％変異し、１５代目で菌そのものが消滅した。サルモネラエンテリティディスは１３代目で、シゲラフレクスネリ（赤痢菌）は１５代目で、Ｒ型に１００％変異する前に、菌が消滅してしまった。ラクトバチラスクリアランスを単独で使用した場合は、表１１、表１３および表１５に示したように、それぞれの病原菌は継代数にしたがって、Ｒ型に変異していくが、菌が消滅してしまうことはなく、常に１〜３×１０⁹個／ｍｌの菌数を保持していた。また、上記病原菌に、ラクトバチラスクリアランスおよびエンテロコッカスフェカリスの死菌体を添加した場合も、生菌体を接種した場合と類似の傾向をしめしたが、生菌体を接種した場合よりも、Ｒ型への変異がやや遅れて進むことと、菌数は減少するものの消滅はしない点が、異なっていた。それでも、Ｒ型へ１００％変異する継代数は、大腸菌Ｏ−１５７が１５代目、サルモネラエンテリティディスが３０代目、シゲラフレクスネリ（赤痢菌）が１５代目で、いずれもラクトバチラスクリアランスを単独に接種した場合に比較して、格段にはやく達成されたのである。
【００７４】
【表２９】

【００７５】
【表３０】

【００７６】
【表３１】

【００７７】
【表３２】

【００７８】
【表３３】

【００７９】
【表３４】

【００８０】
（実施例６）
製造例１の製造方法により製造した、ラクトバチラスクリアランスFERM P-17148株またはラクトバチラスクリアランスFERM P-17149株の生菌製剤と、製造例２の製造方法により製造したエンテロコッカスフェカリスFERM P-17151株またはエンテロコッカスフェカリスFERM P-17152株の生菌体製剤と、製造例３の製造方法により製造したエンテロコッカスフェカリスFERM P-17151株またはエンテロコッカスフェカリスFERM P-17152株の死菌体製剤とを組み合わせて、飼料に添加し、１群５匹とし、１０週令の雄性マウスに投与した。飼料１ｇ中のラクトバチラスクリアランスの含有量は５×１０⁸個、エンテロコッカスフェカリスの含有量は５×１０⁸個（生菌体および死菌体併用のときは各２．５×１０⁸個）とし、飼料は自由摂取とし、３ヵ月間飼育し、血清中の中性脂肪（トリグリセライド）およびコレステロールを測定し、通常の飼料のみで飼育した対照群のマウスの値と比較した。なお、中性脂肪の測定はトリグリセライドＥ−テストワコーにより、コレステロールの測定はトリグリセライドＣ−テストワコーにより行い、各群の平均値をとり、対照群のマウスの平均値を１００％として表３５に示した。表３５および表２１から明らかなように、ラクトバチラスクリアランスにトリグリセライドおよびコレステロールの低下作用を有するエンテロコッカスフェカリスの生菌体または死菌体並びに生菌体および死菌体を加えたときの効果は、エンテロコッカスフェカリスを単独に投与した場合に比較すると大幅に向上した。また、単独投与の場合とは異なり、生菌体よりも死菌体を併用する方が、より高い効果を示した。なお、対照群と比較すると、約１／２の水準まで低下した。
【００８１】
【表３５】

【００８２】
（実施例７）
８週令の高血圧自然発症ラット（ＳＨＲ）３５匹を７群に分けて、実施例６に用いた菌体製剤を、飼料に添加して、７ヵ月間飼育した。対照群および各種菌体製剤を投与した群の投与前および投与後の血圧を測定し、表３６に示した。表３６および表２２から明らかなように、３ヵ月後の血圧は平均して１５％程度改善された。また、実施例６と同様に、エンテロコッカスフェカリスにおいては、生菌体よりも死菌体の方がより有効に作用した。エンテロコッカスフェカリス単独投与の場合に比較して、血圧降下作用は１０〜２０％程度、有効度がアップした。
【００８３】
【表３６】

【００８４】
本発明に使用したラクトバチラスクリアランス、エンテロコッカスフェカリスおよび両者を併用した場合のそれぞれの機能面からみた作用を表３７に示した。
【００８５】
【表３７】

【００８６】
【発明の効果】
人間の社会が成熟してゆくのに伴って、ヘルスケアもまた徐々にその考え方を変化させてきた。急性疾患対策が、そして慢性疾患への対応が、何よりも重要視された時代を経て、高齢化社会を迎えて今や視線は「予防医学」へ、さらには「栄養療法」へと注がれ、病気になってから治療するのではなく、病気を未然に防ぐためには、栄養を上手に摂取して、自分で自分の健康をつくっていくという考え方が、主流になりつつある。すなわち、疾病を予防できれば、治療に到らずに済むので、これこそ正に２１世紀の医療を先取りしたものといっても、決して過言ではなかろう。
【００８７】
本発明の乳酸菌製剤は、経口投与することにより、腸内の善玉菌は、次第に勢力を伸ばし、腸粘膜をしっかりガードし、ビタミンを産生し、アミノ酸を合成しつつ、本剤の乳酸菌主導のもと、外来菌および外来病原菌の増殖を抑制し、毒性の減弱化を行い、さらには免疫機能の活性化に貢献するものである。従って、腸内に棲みついている悪玉菌は、著しく減少し、腐敗有臭物質の産生が抑えられるため、排出される糞便の臭気は著しく減少する。さらに、それに追い打ちをかけるかのように、本剤の乳酸菌は腸内腐敗物質を積極的に食べるという働きで、腸内の環境はクリーンに改善され、腸粘膜および周辺の血管、神経の正常化に寄与するのである。
【００８８】
人間の活力、エネルギー、血と肉の源泉たる腸が浄化されたならば、生体必須物質も無駄なく吸収され、逆に腸から吸収される有毒物質は少なくなり、必然的に肝機能がよくなり、そこで血清中の中性脂肪やコレステロールは低下し、血液は美しく浄化される。このようなサラサラとなった血液により血圧は降下すると共に、ホルモン、酵素、抗体、免疫物質などの生体必須物質が、目詰まりすることなく、全身の隅々まで駆けめぐり、新陳代謝がよくなる一方、全身機能が活性化される。すなわち、汚れた腸を一掃して、綺麗な腸に戻してやれば、全てが好転し、病気とはおよそ縁のない生活を全うできることを意味するからである。正にメチニコフの唱えた不老長寿説を一世紀の時の流れを経て具現したものと言えよう。
【００８９】
なお、本発明の乳酸菌製剤は、２〜３年の長きにわたり、力価を維持したままで、保存可能であり、何時でも、何処でも、手軽に利用し得る常備携帯品とすることができるので、その価値は図り知れないものがある。また、超高齢化社会では、それに比例して寝たきり老人も急増し、その排泄物の処理が問題となってくるが、それが減臭化されたものであるならば、それほどの嫌悪感もなく、世話する立場の介護の人達にとっても福音になる。

Claims

ラクトバチラスクリアランスの生菌体と、トリグリセライドおよびコレステロールの少なくとも１種または２種を低下させ得るエンテロコッカスフェカリスの生菌体と、からなることを特徴とする整腸用ならびに高脂血、高コレステロールおよび／または高血圧改善用乳酸菌製剤。
ラクトバチラスクリアランスの生菌体と、トリグリセライドおよびコレステロールの少なくとも１種または２種を低下させ得るエンテロコッカスフェカリスの死菌体と、からなることを特徴とする整腸用ならびに高脂血、高コレステロールおよび／または高血圧改善用乳酸菌製剤。
ラクトバチラスクリアランスの生菌体と、トリグリセライドおよびコレステロールの少なくとも１種または２種を低下させ得るエンテロコッカスフェカリスの生菌体および死菌体と、からなることを特徴とする整腸用ならびに高脂血、高コレステロールおよび／または高血圧改善用乳酸菌製剤。