JPS5953829B2 - ビフィドバクテリウム・ロンガムに属する新規微生物、その菌体の製造法および該微生物を含む組成物 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は耐酸性を有するビフィドバクテリウム・ロンガ
ム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）
、ビフィドバクテリウム・ロンガムＭ−８２０１（Ｂｉ
ｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ Ｍ−８２
０１） （以下「本菌」と記載する）、その製造方法
およびこれらを含む組成物に関する。

本発明の目的は耐酸性を有する点に有用性の高い新規微
生物を提供すること、この新規微生物を分離採取するこ
とおよびこの新規微生物を増殖することからなる新規微
生物の菌体の製造方法を提供することにある。

本発明のもう１つの目的は耐酸性を有する新規微生物を
含有する食品用、飼料用ならびに整腸剤組成物を提供す
ることにある。

本明細書における「生残率」は試験開始時の生菌数に対
する保存後の生菌数の百分率であり、また「嫌気性菌培
養寒天平板培地」はＢＬ寒天平板培地、ＭＧ寒寒天根板
培地その他嫌気性菌を培養するために一般に広く使用さ
れている寒天平板培地である。

ビフィドバクテリウム属に属する微生物は、人または動
物（たとえば、豚、ニワトリ、モルモット、ネズミ、マ
ウスなど）の消化管、糞便中に見出され、これらのもの
から多数の菌種あるいは菌株が分離されている。

ビフィドバクテリウム属に属する菌の分類については、
１９６３年にＲｅｕｔｅｒが人に由来する菌をビフィド
バクテリウム（以下「Ｂ、」と略記する）・ビフィダム
ａ （Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄ
ｕｍ ａ） トｂ、Ｂ、イ’／７アンチス（Ｂ、 １ｎ
ｆａｎｔｉｓ）、Ｂ、パルブローラムａ （Ｂ、ｐａ
ｒｖｕｌｏｒｕｍ ａ） とす、Ｂ、ブレーベａ （
Ｂ、ｂｒｅｖｅ ａ）とす、Ｂ、リヘローラム（Ｂ、ｌ
ｉｂｅｒｏｒｕｍ ）、Ｂ、ラクテンチス（Ｂ、１ａｃ
ｔｅｎｔｉｓ ）、Ｂ、アドレツセンチスａ（Ｂ、ａｄ
ｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ ａ ） 〜ｄ 、 Ｂ、 ｏ
ンガムａ（Ｂ、ｌｏｎｇｕｍ ａ ）とｂの８菌種に分
類しくＺｅｎ廿耐ｂｌａｔｔ ｆｕｒ Ｂ
ａｋｔｅｒｉｏｌｏｇｉｅ 。

ｐａｒａｓｉｔｅｎｋｕｎｄｅ 、 Ｉｎｆｅｃｋｔ
ｉｏｎｓ ＫｒａｎｋｈｅｉｔｅｎｕｎｄＨｙｇｉｅ
ｎｅ ： Ａｂｔ、 Ｉ、Ｏｒｉｇｉｎａｌｅ、１９１
巻第４８６頁、１９６３年）、光間は人および動物に由
来するすべての菌をＢ、ビフィダムについて２つのタイ
プ、Ｂ。

インファンチスについて２つのタイプ、Ｂ、ブレーベに
ついて３つのタイプ、Ｂ、パルブローラムについて２つ
のタイプ、Ｂ、サーモフィルム（Ｂ、 ｔｈｅｒｍｏｐ
ｈｉｌｕｍ ）にツイて４つのタイプ、Ｂ。

アドレツセンチスについて４つのタイプ、Ｂ、ロンガム
について４つのタイプ、Ｂ、シュードロンガム（Ｂ、ｐ
ｓｅｕｄｏｌｏｎｇｕｍ）について４つのタイ□プ、Ｂ
、リベローラムおよびＢ、ラクテンチスについてそれぞ
れ１つのタイプに分類して報告している。

そして国際微生物学会の中におかれている細菌の命名と
分類についての国際委員会のビフィドバクテリウム小委
員会はＢ、ビフィダム、Ｂ、インファンチス、Ｂ、ブレ
ーベ、Ｂ、サーモフィルム、Ｂ。

アドレツセンチス、Ｂ、ロンガム、Ｂ、シュードロンガ
ム、Ｂ、スイス（Ｂ、５ｕｉＳ）１、Ｂ、コリネフオル
メ （Ｂ、 ｃｏｒｙｎｅｆｏｒｍｅ ）、Ｂ、アステ
ロイデス（Ｂ、ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ ）および゛Ｂ０
インチ゛イカム（Ｂ、 ｉｎｄｉｃｕｍ ） （７）１
１菌種に分類し、Ｂｅｒｇｅｙ’ｓＭａｎｕａｌ第８版
にもとりあげられている（Ｂｕｃｈａｎａｎ 、 Ｒｏ
Ｅ、 ａｎｄ Ｇｉｂｂｏｎｓ 、 Ｎ、Ｅ、 ：Ｂｅ
ｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒ
ｍｉｎａｔｉｖｅＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、８ｔｈｅ
ｄ、第６６９頁〜第６７６頁、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、
Ｔｈｅ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ Ｃｏ、、
１９７４年）。

そしてビフィドバクテリウムに属するその他の菌種にツ
イては、５ｃａｒｄｏｖｉ （Ａｒｃｈｉｖ ｆｕｒＭ
ｉｋｒｏｂｉｏｌｏｇｉｅ第６８巻、第２７８頁１９６
３年およびＺｅｎｔｒａｌｂｌａｔｔ 、 ｆｕ
ｒ Ｂａｋｔｅｒｉｏｌｏｇｉｅ 。

ｐａｒａｓｉｔｅｎｋｕｎｄｅ 、 Ｉｎｆｅｃｔ
ｉｏｎｓｋｒａｎｋｈｅｉｔｅｎｕｎｄＨｙｇｉｅｎｅ
： Ａｂｔ、ＩＩ、Ｏｒｉｇｉｎａｌｅ、第１２３巻
、第６４頁１９６９年）により、Ｂ、ルミナーレ（Ｂ、
ｒｕｍｉｎａｌｅ ）およヒＢ、グロボＸ ム（Ｂ、
ｇｌｏｂｏｓｕｍ ）が、Ｃｒｏｃｉａｎｉ （Ｉｎｔ
ｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｙｓ
ｔｅｍａｔｉｃＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、第２４巻、
第６頁、１９７４年）により、Ｂ、デンチウム（Ｂ、
ｄｅｎｔｉｕｍ）、Ｂ、カテヌラーツム（Ｂ、ｃａｔｅ
ｎｕｌａｔｕｍ）およびＢ、アングラータ’ ム（Ｂ、
ａｎｇｕｌａｔｕｍ）が、Ｚａｎｉ （Ｉｎｔｅｒｎａ
ｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔ
ｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、第２４巻、第２９頁
１９７４年）により、Ｂ、マグナム（Ｂｏｍａｇｎｕｍ
）が、Ｔｒｏｖａｔｅｌｌｉ （Ａｒｃｈｉｖ 、
ｆｕｒＭｉｋｒｏｂｉｏｌｏｇｉｅ、第９８巻、第１８
７頁、１９７４年）により、Ｂ、プローラム（Ｂ、 ｐ
ｕｌｌｏｒｕｍ）が、Ｇｅｏｒｇ（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏ
ｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、第８８巻、第４７７頁
、１９６４年）により、Ｂ、エリクソニ（Ｂ、ｅｒｉｋ
ｓｏｎｉｉ ）がそれぞれ報告されている。

更にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃ
ｏ１１ｅｃｔｉｏｎ （以下ｒ ＡＴＣＣ」と略記する
）のカタログ（Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｏｆ ５ｔｒａｉ
ｎｓ Ｉ、１３ｔｈｅｄ、、第４５頁−第４７頁、１
９７８年）によれば、前記の種の他にＢ。

ヘルミフオルメ （Ｂ、 ｖｅｒｍｉｆｏｒｍｅ）が知
られている。

このように、ビフィドバクテリウム属に属する菌種は多
数知られているが、ビフィドバクテリウム属の菌種の分
類の日本における権威者であり、前記国際委員会の委員
である光岡の著書（本間道、光間知足共編「ビフィズス
菌」第３５頁〜第３６頁、■ヤクルＩ・本社、１９７８
年７月）によれば、現状では、なお主として糖分解性状
によって次のように鑑別分類するのが妥当であるとされ
ている。

それによればこの属の種は、Ｂ、ビフィダムａ、Ｂ、ビ
フィダムｂ、Ｂ、インファンチス サブスピーシーズ（
以下「ＳＳ、 Ｊと略記する）インファンチＸ （Ｂ、
１ｎｆａｎｔｉｓ ５ｕｂｓｐｅｃｉｅｓ １ｎｆａｎ
ｔｉｓ）、Ｂ。

インファンチスＳＳ、リベローラム、Ｂ、インファン′
チスＳＳ、ラクテンチス、Ｂ、ブレーベＳＳ、ブレーベ
、Ｂ、ブレーベＳＳ、パルブローラム、Ｂ、サーモフィ
ル１ム（Ｂ、ルミナーレと同−表現型）、Ｂ、アルドレ
ッセンチスａ、Ｂ、アルドレツセンチスｂ（Ｂ、７’ン
チウムおよびＢ、エリクソニと同−表現型）、Ｂ、アル
ドレツセンチスｃ （Ｂ、カテヌラーツムと同−表現
型）、Ｂ、アルドレツセンチスｄ （Ｂ、アングラ−ツ
ムと同−表現型）、Ｂ、ロンガムＳＳ、ロンガムａ１Ｂ
、ロンガムＳＳ、ロンガムｂ、Ｂ、Ｃ７ンガムｓｓ。

アニマリスａ （Ｂ、ａｎｉｍａｌｉｓ ａ） （
Ｂ、？グナム、Ｂ、スイスおよびＢ、プローラムと同−
表現型）、Ｂ、ロンガムＳＳ、アニマリスｂ、Ｂ、シュ
ードロンガ。

ム（Ｂ、グロボスムと同−表現型）、Ｂ、アステロイデ
ス（Ｂ、コリネフオルメと同−表現型）およびＢ、イン
ディカムである。

さらに光岡の最近の著書（光間知足著「腸内菌の世界」
叢文社、１９８０年８月）によれは゛Ｂ、ロンガムＳＳ
、アニマリスａおよびｂは、Ｂ、ｏンガムの亜種（ｓｕ
ｂｓｐｅｃｉｅｓ）ではなく、新たにＢ、アニマリスと
して分類されている。

Ｂ、ロンガムに属する公知の菌株の菌学的性質にライて
前記光岡およびＢｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ第８版
に記載されている事項をまとめれば、第１表のとおりで
ある。

文献 （１）日本細菌学雑誌、第２４巻 第６号 第２６１頁
〜２８０頁、１９６９年。

（２）本間道、光間知足共編「ビフィズス菌」第５２頁
株式会社ヤクルト本社、１９７８年７月。

（３） Ｂｕｃｈａｎａｎ、Ｒ，Ｅ、＆ Ｇｉｂｂ
ｓｏｎｓ、 ＮＥ編、Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎ
ｕａｌ ｏｆ ＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅＢ
ａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、第８版、第６７２頁−第６７
３頁、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、 Ｔｈｅ Ｗｉｌｌｉ
ａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ Ｃｏ、、１９７４年。

記号の説明 ＋１強陽性 一：陰性 Ｓ：おくれで反応 ±：陰性またはおくれで東隣性 ■：不定 一：まれに陽性 注１ （ａ）細胞は長く、弯曲した桿棒状あるいは隆起又は唖
鈴状の桿状であり、二またに分かれることがある。

（ｂ） ダラム染色性は変動する。

（Ｃ）コロニーは凸状ないしクッション状あるいは金縁
、直径２〜５ｍｍ、軟かく湿潤し、光沢または粘性あり
。

（ｄ） グルコースからの最終生産物：酢酸および土
（＋）乳酸、ガス酸性せず。

（ｅ） ペントースを発酵し、グルコン酸塩を発酵し
ないビフイドバクテリアは、通常この種に分類され、以
前デーネル） （１９５７年および１９６０年）の第
５群に分類されていた。

（ｆ） ４６．５℃および２０℃において生育せず。

（ｇ） 乳児および成人の糞便から分離される。

（ｈ） 標準菌株： Ｅ１９４ｂ、 ＡＴＣＣ１５７
０７（Ｒｅｕｔｅｒ、１９７１年）。

一方ビフィドバクテリウム属に属する菌は、人又は動物
の腸内菌叢を形成する主要な菌であることか゛知られて
おり、従来これらの菌は整腸剤、食品、栄養剤、あるい
は飼料に広く利用されている。

しかしながら、ビフィドバクテリウム属に属する公知の
菌は一般に耐酸性に乏しく、酸性の状態におけるこの菌
の生残率は極めて低い印本細菌学雑誌、２９巻４号、６
９１〜６９７頁、１９７４年及び薬剤学、２８巻、４号
、３３１〜３３２頁、１９６８年）。

そしてこの菌を用いて発酵乳を製造し、ＩＮ（４，６〜
４．９で７日間保持した場合、この菌の生残率は約１／
１００に減少することも知られている （ＦｏＭｕｌｌ
ｅｒら；Ｍｉｌｃｈｗｉｓｓｅｎｓ−ｃｈａｆｔ、２３
巻、９号、５５４〜５５８頁及び１０号、６１４〜６１
８頁、１９６８年）。

そしてＭｕｌｌｅｒらはこの論文の中でビフィドバクテ
リウム菌を含む発酵乳製品において、製品の世が４．３
以下であってはならないと述べている。

このことはこの菌がＩＨ４，３以下において急激に死滅
することを意味している。

従って、公知のビフィドバクテリウム属に属する菌を食
品、医薬品、飼料に使用する場合、酸性の食品の保存中
に、又、食品、経口投与医薬品又は飼料−として用いた
ときには、人あるいは動物の胃の低い世において死滅す
る欠点がある。

このような点からビフィドバクテリウム属に属する耐酸
性菌について研究がなされ、Ｂ、ビフィダムについて耐
酸性を有する変異株の存することが知られ（特公昭５６
−４２２５０号公報）、そしてこれらの変異株を用いた
発酵乳の製造法も知られている（特開昭５２−８３９７
５号公報）。

又、先に用品らが発明した特許第７０８３９３号（特公
昭４７−２９９９５号公報）におけるラクトバチル・ビ
フイダス変異株Ｍ−７２０４（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌ
ｕｓ ｂｉｆｉｄｕｓ ｖａｒ、Ｍ−７２０４）（
微工研菌寄第１３２４号。

以下寄託株という。）は、耐酸性を有する菌株であり、
そしてこの菌株は現在の分類によればＢ、ロンガムに属
する変異株である。

しかし後述するように寄託株と本菌とは菌学的性質が異
なり、特に耐酸性において本菌が格段にすぐれている。

以上のように多種、多株にわたって人の消化管に存在す
るビフィドバクテリウム属の細菌のうち、年令を問わず
人の腸管内に広く存在することが知られ（Ａｍｅｒｉｃ
ａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃ１１ｎｉｃａｌＮｕｔ
ｒｉｔｉｏｎ、３０巻、１７９９〜１８１０頁、１９７
７年）、その出願頻度が最も高イ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅ
５ｅａｒｃｈ、 ５５巻、３４０７〜３４１７頁、１９
７５年）Ｂ、ロンガムについて耐酸性を有する菌株を取
得することは食品、飼料あるいは医薬品産業上特に利用
価値の高いものであるが、未だ満足すべき菌株は知られ
ていない。

本発明者らは、ビフィドバクテリウム・ロンガムに属す
る菌であって、強い耐酸性を有する菌を分離すべく検索
を行い、健康な乳児糞便からビフィドバクテリウム・ロ
ンガムに属し耐酸性を有する有用性ある菌株を見出した
。

次に本発明について詳細に記載する。

（１）耐酸性菌株の取得 本発明者らは前記のような耐酸性を有する菌株を自然界
から取得すべく、ビフィドバクテリウム属に属する菌種
が多数存在する健康な乳児の糞便から次に方法により菌
株の分離を行なった。

乳児糞便を滅菌生理食塩水で希釈し、ＭＧ寒天培地（Ｍ
ｏｄｉｆｉｅｄ Ｇａｒｃｈｅ’ ｓ ＡｇａｒＯ
略寺口ら、食品衛生学雑誌、２３巻、１号、３９〜４４
頁、１９８２年）の平板に塗抹し、３７℃で嫌気培養し
た。

そして得られたコロニーの中で゛ビフィドバクテリウム
属特有の形態を示し、かつ塗抹標本の顕微鏡観察により
ダラム陽性であり、棒状、こん棒状又は分岐状の画形を
示す菌を釣菌しＭＧ寒天平板培地に画線塗抹し、前記と
同様の方法で嫌気培養を反復し、純粋に単離された菌株
を得た。

この菌株をＩＩ（４，５〜５．５に調整したＭＧ寒天平
板培地で嫌気培養し、得られたコロニーヲ更にペニシリ
ンＧカリウム（明治製菓製）０．５〜１．０単位／ｍｌ
含有ＭＧ寒天乎板培簾で嫌気培養し２０余の菌株を得た
。

次いでこれらの菌株を上記２種のＭＧ寒天平板培地で嫌
気培養を反復し、最も生育のすぐれた１菌株を分離した
。

（２）菌学的性質 この分離した菌株の菌学的性質は、次のとおりである。

２−１ 生理学的性質 ａ ガスを産生ぜず ｂ １５℃で発育せず Ｃ運動性なし ｄ 好気的条件で発育せず ｅ ブドウ糖からの主な発酵生成物乳酸及び酢酸 ｆ 糖からの酸生成 アラビノース、キシロース、グルコース、フラクトース
、ガラクトース、シュークロース、マルトース、ラクト
ース、メリビオース、メレチトースは陽性、 ラムノース、リボース、セロビオース、トレハロース、
グリコーゲン、イヌリン、マンニトール、ソルビトール
、イノシトー ル、エスクリン、サリシン、“アミグダリン、グルコン
酸塩は陰性、 ラフィノース及びデキストリンは遅れて陽性、マンノー
ス、スターチ及びα−メチルグルコシドは遅れて東隣性
、 ｇインドール産生ぜず ｈ 硫化水素産生ぜず ｉ 硝酸塩を還元せず ｊ カタラーゼ陰性 ｋ ペニシリン含有ＭＧ寒天平板培地（ペニシリンＧカ
リウムラム０．５〜１．０単位／ｍ１．） 。

で発育（後述する（３）の試験参照）。

１ 耐酸性（後述する（４）の試験参照）菌体を滅菌し
た緩衝液に懸濁して但を４．３に調整し、５℃で７日間
保持した時、少なくとも１％の生残率を示す。

２−２ 形態学的性質 ａ 画形（光学顕微鏡による観察） ＢＬ寒天平板培地（光間知足；臨床検 査、１８巻、１１６３〜１１７２頁、１９７４年）を用
い、３７℃で４８時間常法により嫌気培養した本菌は、
０．５〜０．８ Ｘ １．７〜４．０μ、桿状あるいは
分岐状の画形を有する。

ｂ コロニーの形態 前記２−２）のａ）と同一の条件で培養 した本菌のコロニーの形態（光間知足著 「腸内菌の世界」、１１０頁、叢文社、１９８０年８月
）は次のとおりで゛ある。

形 状：円形（ｃｉｒｃｕｌａｒ） 隆 起：凸円状（ｃｏｎｖｅｘ） 周 縁：円滑（ｅｎｔｉｒｅ） 大きさく直径）：１〜３ｍｍ 色 調：褐色で不透明 表 面：円滑で光沢あり 以上の菌学的性質から、本菌は糖の発酵性のうちＡＴＣ
Ｃのカタログ記載の菌株（以下ＡＴＣＣ株と記載する）
とはリボース及びラフィノースについて異っているが、
分類学上公知のＢ、ロンガムに属する菌学的性質を示し
、かつ耐酸性において公知のＡＴＣＣ株と異っている。

さらにこの性質は２０代にわたって継代培養しても維持
されていたので、本菌独特の性質とみることができ、本
菌は公知の菌株にはないすぐれた耐酸性を有する新菌株
と認められる。

本発明者らはこの菌株をＢ、ロンガムＭ−８２０１を命
名し、昭和５７年５月３１Ｂ４こ工業技術院微生物工業
技術研究所に寄託し、微工研菌寄第６５４８号なる受託
番号を得た。

（３）ペニシリンＧカリウムに対する感受性の比較本菌
、前記寄託株、ＡＴＣＣ１５７０７及びＡＴＣＣ１５７
０８の４種のＢ、ロンガムに属する菌株について、ペニ
シリンＧカリウムに対する感受性を次の方法により試験
した。

上記４菌株をブリラグスリバーブロース（光間知足；臨
床検査、１８巻、１１６３〜１１７２頁、１９７４年）
に５％（Ｖ／Ｖ）接種し、３７℃で２４時間培養した培
養液を被検菌液とした。

次にＭＧ寒天培地を用いて調整したペニシリンＧカリウ
ムを含む平板に前記被検菌液の１白金耳を画線塗抹し、
３７℃で常法により嫌気培養した。

２〜５日培養後、コロニーの形成の有無を観察し、各菌
株のペニシリンＧカリウムに対する感受性の比較を行な
った。

ペニシリンＧカリウムの培地中の濃度とコロニー形成の
有無を第２表に示す。

（イ）＋：コロニーを形成する （＋）：わずかにコロニーを形成する 一：コロニーを全く形成しない 第２表から明らかなように本菌は、他の３菌株よりペニ
シリンＧカリウムに対する感受性が低く０．５〜１．０
単位／ｍｌの濃度でも発育可能であった。

５ｕｔｔｅｒ及びＦｉｎｅｇｏｌｄ （Ａｎｔｉｍｉｃ
ｒｏｂｉａｌＡｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅ
ｒａｐｙ、 １０巻、４号、７３６〜７５２頁、１９７
６年）はビフィドバクテリウム属のペニシリンＧに対す
る感受性は、０．５単位／ｍ１以下と報告しており、本
菌はビフィドバクテリウム属の中で゛もペニシリンＧカ
リウムに対して低い感受性を示す菌株である。

（４）耐酸性の比較 本菌、前記寄託株、ＡＴＣＣ１５７０７、ＡＴＣＣ１５
７０８の４種のＢ、ロンガムに属する菌株について、耐
酸性を次の方法により試験した。

４−１ ミルクカルチャーにおける生残性試験 前記ブリラグスリバーブロースを用いて 調整した前記４菌株の前培養液を酵母エキス０．２５％
（Ｗ７′ｗ）を添加した１０℃（Ｗ／Ｗ） 還元脱脂乳
培地に１０℃（Ｖ／Ｖ）接種して３７℃で６〜８時間培
養し、さらに同培地で２〜４代継代培養し、Ｉｆ（４，
８のミルクカルチャーを調製した。

このミルクカルチャーを急冷して５℃で保存した場合の
生菌数の変化と生残率を第３表に示す。

ビフィドバクテリウム菌の生菌数は、ミルクカルチャー
を光間（臨床検査、１８巻、１１６３〜１１７２頁、１
９７４）の希釈液で段階的に希釈した後、ＭＧ寒天培地
の試験管を用いた高層寒天培養法（寺口ら；食品衛生学
雑誌、２３巻、１号、３９〜４４頁、１９８２年）で測
定した。

第３表から明らかなように本菌は他の３菌株よりミルク
カルチャーにおける生残性が極めて高く７日間の保存で
５０％以上の生残率を示した。

４−２ 低坦緩衝液における生残性試験 前記４菌株のミルクカルチャーを滅菌生理食塩水で１７
１０に希釈し、これを各声の緩衝液に１７３０の割合で
添加、混合し、最終的に４．０．４．３．４．６．５，
０．６．０の５段階の世になるように調整して５℃に保
存した。

緩衝液は酊４．０〜５．０の場合１／１００モルの酢酸
−水酸化ナトリウムの酢酸緩衝液を使用し、ＩＨ６，Ｏ
の場合、１７１００モルのリン酸２ナトリウム−リン酸
↓カリウムのリン酸緩衝液を使用した。

前記、ｐｎ緩衝液中の前記４菌株の生菌数の変化と生残
率を第４表に示す。

生菌数は前記４−１項記載の方法で測定した。

結果を第４表に示す。

第４表から明らかなように、本菌はいずれの倶において
も他の３菌株より生残性が高く、特にＩＩ（４，０〜５
．０の低い組成においてその差が顕著である。

即ち本菌を５℃で７日間保存した場合、但５．０におい
て２４．３％、ＩＩ４．６において１１．８％、ｌＨ４
，３において１．２％、ｐＨ４，０において０．３％の
生残率を示すのに対して、他の３菌株は世５．０におい
てさえも生残率がいずれも１％未満である。

本菌の試験結果は、前記Ｍｕｌｌｅｒらの報告と比較し
ても格段にすぐれている。

即ち、Ｍｕｌｌｅｒらの報告ではｐＨ４，６〜４．９で
７日間保存したときのビフィドバクテリウム菌の生残率
が約１％であるのに対して、本菌のそれはｐＨ５，０で
２４．３、ｐＨ４，６で１１．８％である。

このように本菌は低い阻領域においてすぐれた耐酸性を
有し、この性質は従来公知の菌株及び文献にも認められ
ないすぐれたものである。

前記の結果と同様の傾向は、前記液体培地ブリラグスリ
バーブロースで培養した各菌株の菌体についても認めら
れた。

４−３）ヨーグルトにおける生残性試験 １２％（Ｗ／Ｗ）の還元脱脂乳を９０℃で１０分間殺菌
した後、４５℃に冷却し、１０％（Ｗ／ Ｗ）還元脱脂
乳で調整したストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓＴｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）
とラクトバチルス・ブルガリク、７． （Ｌａｃｔｏ
ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）の混合カル
チャー３％（Ｖ／Ｖ）および本菌のミルクカルチャー２
％（Ｖ／Ｖ）を接種し、４０℃で５時間発酵し、のち直
ちに冷却し、ヨーグルトを製造した。

そしてこのヨーグルトを５℃で１０日間保持し、ヨーグ
ルト中の本菌の生残菌数を測定した。

生菌数の測定は、ヨーグルトを前記光間の希釈液で段階
的に希釈し、ビフィドバクテリウム菌選択培地であるＭ
ＧＬＰ寒天培地（赤口ら；食品衛生学雑誌、２３巻、１
号、３９〜４４頁、１９８２年）を使用した高層寒天培
養法によった。

又比較のため本菌の代りにＡＴＣＣ１５７０８を用いて
同様に試験上た。

そして生菌数の変化及び生残率を、ヨーグル１−の阻及
び乳酸酸度の参考値とともに第５表に示す。

尚、前記寄託株及びＡＴＣＣ１５７０７を用いた試験も
行なったが、ＡＴＣＣ１５７０８とほぼ同等の結果を示
したので、これらの菌株の結果は第５表に記載しなかっ
た。

第５表から明らかなように本菌を使用して製造したヨー
グルＩ・を５℃で１０日間保存した場合、ヨーグルト中
には製造直後の３２％の本菌が生存している。

一方ＡＴＣＣ１５７０８を使用して製造したヨーグル１
〜では、１％以下の生残率であり本菌の生残率が極めて
高い。

このように酸性の食品、低声の緩衝液及 び、ミルクカルチャーにおいて、本菌の生残率と他のＢ
、ロンガムに属する菌のそれとの間には格段の相違が認
められ、本菌はすぐれた耐酸性を有することが判明した
。

以上のことがら本菌は本質的に耐酸性を備えており、培
養物又はその加工物の保存中の生菌数の低下が少なく、
広い耐酸の飲食物への加工が可能である。

更に本菌を凍結及び凍結乾燥したときの生残率もすぐれ
ていることが試験により確認されているので本菌の用途
は極めて広範である。

たとえば、古くから知られている人又は動物の医薬品と
しての整腸剤に使用できることは勿論、粉末状の食品、
飼料あるいは液状又は半固状の飼料、食品に添加あるい
は混在させることもできる。

このように本菌は従来公知の菌株には認められないすぐ
れた性質を有しており、産業上極めて有用である。

実施例 １ 肉エキス５０ｇ、酵母エキス１００ｇ、ペプトン１００
ｇ、乳糖２００ｇ、に２ＨＰＯ４５０ｇ、ＫＨ２ＰＯ４
１０ｇ、シスチン４ｇ及び水９．５１からなる培地（ｐ
ｆ（６，５）１０１を１２１℃で１５分間滅菌し、３７
℃に冷却した。

一方、予め同一組成の培地により３７℃で１６時間前培
養した本菌のシードカルチャー５００ｍ１を前記の培地
１０１に接種し、３７℃で１６時間培養した。

さらに９０℃で３０分殺菌した同一組成培地２００１に
前記培養液全量（１０，５１）を接種し、３７℃で１６
時間培養した。

培養後の生菌数は２．５ Ｘ １０９／ｍｌであた。次
いでシャープレス型遠心分離機（１５゜０００ｒｐｍ）
により菌体を集め、培地と同量の９０℃で３０分間殺菌
の生理食塩水に再懸濁し、前記と同様遠心分離して再度
集菌した。

得られた菌体を脱脂粉乳１０％（Ｗ／Ｗ）、蔗糖１％（
Ｗ／Ｗ）、グルタミン酸ソーダ１％（Ｗ／Ｗ）からなる
溶液（９０℃、３０分殺菌）２０１に懸濁し、常法に従
って凍結乾燥し、１，４Ｘ１０”７ｇの本菌を含有する
粉末的２、２ｋｇを得た。

実施例 ２ 酵母エキス０．２％（ｗ７ｗ）、脱脂粉乳１０％（Ｗ／
Ｗ）からなる９０℃３０分殺菌後の培地１０１００Ｏに
本菌を接種し、３７℃で６時間培養した。

一方、１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂乳培地１５００ｍｌを
９０℃で３０分間殺菌し、ス１〜レプ）−コツカス・サ
ーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒ
ｍｏｐｈｉｌｕｓ）及びラクトバチルス・ブルガリクス
（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）
の混合カルチャー５０ｍ１を接種し、４２℃で４時間培
養した。

これとは別に乳脂肪３．１％（Ｗ／Ｗ）、無脂乳固形分
９％（Ｗ／Ｗ）からなる生乳５０１を６０℃に加温し、
１５０ｋｇ／ｃｍ２の圧力で均質し、９０℃で１０分間
殺菌し、４０℃に冷却した。

この殺菌した牛乳に前培養した前記の本菌カルチャー１
０１００Ｏ及びストレフトコツカス・サーモフィルスと
ラクトバチルス・ブルガリクスの混合カルチャー１５０
０ｍｌを接種し、５００ｍ１容の容器に充てんし、密封
し、４０℃で４時間培養し、直ちに冷却した。

得られた発酵乳は乳酸酸度０．８５％、ｐＨ４，４０で
あり、本菌８２ Ｘ １０６／ｍｌ、ストレフトコツカ
ス・サーモフィルス３７×１０７７ｍ１ 、ラクトバチ
ルス・ブルガリクス３１×１０７／ｍｌを含有していた
。

この発酵乳を１０℃で１０日間保存したときの本菌の菌
数は２１Ｘ１０６／ｍｌであり生残率は２６％であった
。

実施例 ３ 乾燥殺菌した澱粉１４ｋｇ及び乳糖６ｋｇに、実施例１
で得た本菌を含有する粉末２０ｇを加えて均一に混合し
、１０”７ｇの本菌を含有する粉末の整腸剤約２０ｋｇ
を得た。

実施例 ４ Ｉ・７１へピユーレ８００ｇ、蔗糖２０ｇ、食塩１ｇ、
グルタミン酸ソーダｏ、 ８ｇ、香料０．５ｇ （い
ずれも市販品）を水１６０ｇと混合し、殺菌冷却し、更
にこの混合液に実施例２と同様の方法で調整した本□菌
２０ｇと常法により調整したラクトバチルス・カゼイ
（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）のカルチ
ャー５０ｇとを添加して均一に混合し、ビフィズス生菌
入り乳酸菌飲料的１ｋｇを製造し、１００ｍ１容ガラス
ビン１０本に分注して密封した。

この乳酸菌飲料は製造直後のｐＨが４．６０であり本菌
を４８ Ｘ １０６／ｍｌ、ラフＩ・バチルス・カゼイ
を５２Ｘ１０６／ｍｌ含有し、１０℃で１０日間保存し
たのちの本菌の菌数は５９ Ｘ １０”／ｍｌ、生残率
１２％であった。

実施例 ５ ） 市販のコーンミール３９ｋｇ、大豆粕２１ｋｇ、ホ
エー粉末１０ｋｇ、脱脂粉乳１０ｋｇ、ルーサンミール
５ｋｇ、蔗糖８ｋｇ、乳糖２ｋｇ、動物脂２ｋｇ、第２
リン酸カルシウム１ｋｇ、炭酸カルシウム０．５ｋｇ、
飼料用混合無機塩（オリエンタル酵母工業製）０．５ｋ
ｇ、飼料用混合ビタミン（オリエンタル酵母工業製）１
ｋｇからなる子豚用配合飼料１００ｋｇに実施例１で得
た本菌を含有する粉末１０ｋｇを添加して均一に混合し
、子豚育生用の粉末飼料的１００ｋｇを得た。

この飼料には１ｇ当り、製造直後１．４×１０７０本菌
が含まれ、室温で３力月間保存後では１ｇ当）） ３．
ＯＸ１０５の本菌が含まれていた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 菌体を滅菌した緩衝液に懸濁し、刃身４，３に調整
   して５℃で７日間保持した時、少くとも１％の生存率を
   有する耐酸性を示すビフィドバクテリウム・ロンガム。 ２ 前記のビフィドバクテリウム・ロンガムが下記の菌
   学的性質を示すことを特徴とする特許請求の範囲第１項
   に記載の菌株。 （ａ）菌体を滅菌した緩衝液に懸濁し、世を４．３に調
   整して５℃で７日間保持した時、少くとも生残率を有す
   る耐酸性。 （ｂ）ＢＬ寒天平板培地を用い、３７℃で４８時間嫌気
   培養したときの菌の形態： ■ 犬きさ：０−５〜（１８Ｘ１７〜４−０μ■ 形状
   ：桿状あるいは分岐状 （Ｃ）ＢＬ寒天平板培地を用い、３７℃で４８時間嫌気
   培養したときのコロニーの形態： ■ 形態：円形 ■ 隆起：凸円状 ■ 周縁：円滑 ■ 大きさく直径）：１〜３ｍｍ ■ 色調：褐色で不透明 ■ 表面：円滑で光沢あり ・（ｄ） ガス：産生ぜず （ｅ） １５℃で発育せず （ｆ） 運動性なし くｇ） 好気的条件で発育せず （ｈ） ブドウ糖からの主発酵生成物：乳酸および酢
   酸 （ｉ） 糖からの酸生成： アラビノース、キシロース、グリコーゲン、フラクトー
   ス、ガラクトース、シュークロース、マルトース、ラク
   トース、メリビオースおよび・ メレチトースは陽性、 ラムノース、リボース、セロビオース、トレハロース、
   グリコーゲン、イヌリン、マンニトール、ソルビトール
   、イノシトール、エスクリン、サリシン、アミグダリン
   およびグルコン酸塩は陰性、 ラフィノースおよびデキストリンは遅れて陽性、マンノ
   ース、スターチおよびα−メチルグルコシドは遅れて東
   隣性、 （ｊ） インドール：産生ぜず、 ′（ｋ）硫化水素：産生ぜず、 “（１）硝酸塩を還元せず、 （ホ）カタラーゼ：陸生、 （ｎ） ペニシリンを含むＭＧ寒天平板培地（ペニシ
   リンＧカリウム：０．５〜１．０単位／ｍ１）で発育す
   る。 ３ 前記のビフィドバクテリウム・ロンガムがビフィト
   バクテリウム・ロンガムＭ−８２０１（微工研菌寄第６
   ５４８号）であることを特徴とする特許請求の範囲第１
   項または第２項に記載の新菌株。 ４ 人の糞便を生理食塩水で希釈し、嫌気性菌培養用寒
   天平板培地で、３７℃において嫌気的に培養すること、
   得られたコロニーの中からビフィドバクテリウム属特有
   の形態を示し、ダラム陽性であって、棒状、こん棒状ま
   たは分岐状の画形を示すコロニーを釣菌すること、得ら
   れた菌を上記嫌気性菌培養用寒天平板培地で、３７℃に
   おいてさらに嫌気的に培養すること、および得られた菌
   を世４．５〜５．５であって、上記嫌気性菌培養用寒天
   平板培地で培養し、さらに０．５〜１．０単位／ｍｌの
   ペニシリンＧカリウムを含む上記の嫌気性菌培養用寒天
   平板培地で培養し、生育の良い菌株中より下記の菌学的
   性質を有する菌株を分離採取することを特徴とする菌体
   を滅菌した緩衝液に懸濁し、世を４．３に調整して、５
   ℃で７日間保持した時、少くとも１％の生残率を有する
   耐酸性を示すビフィドバクテリウム・ロンガムの製造方
   法。 ５ 前記の菌学的性質が下記のものであることを特徴と
   する特許請求の範囲第４項に記載の方法。 （ａ）菌体を滅菌した緩衝液に懸濁し、世を４．３に調
   整して５℃で７日間保持した時、少くとも１％の生残率
   を有する耐酸性、 （ｂ）ＢＬ寒天平板培地を用い、３７℃で４８時間嫌気
   培養したときの菌の形態： ■ 大きさ：０．５〜０．８ Ｘ １．７〜４．０μ■
   形状：桿状あるいは分岐状 （Ｃ）ＢＬ寒天平板培地を用い、３７℃で４８時間嫌気
   培養したときのコロニーの形態： ■ 形状：円形 ■ 隆起：凸円状 ■ 周縁：円滑 ■ 大きさく直径）：１〜３ｍｍ ■ 色調：褐色で不透明 ■ 表面：円滑で光沢あり （ｄ） ガス：産生ぜず （ｅ） １５℃で発育せず （ｆ） 運動性なし くｇ） 好気的条件で発育せず （ｈ） ブドウ糖からの主発酵生成ｖＩＪ：乳酸およ
   び酢酸 （ｉ） 糖からの酸生成： アラビノース、キシロース、グルコース、フラクトース
   、ガラクトース、シュークロース、マルトース、ラクト
   ース、メリビオースおよびメレチトースは陽性、 ラムノース、リボース、セロビオース、トレハロース、
   クリコーゲン、イヌリン、マンニトール、ソルビｌ〜−
   ル、イノシトール、エスクリン、サリシン、アミグダリ
   ンおよびグルコン酸塩は陰性、 ラフィノースおよびデキストリンは遅れて陽性、 マンノース、スターチおよびα−メチルグリコシドは遅
   れて東隣性 （ｊ） インドール：産生ぜず、 （ｋ） 硫化水素：産生ぜず、 （１）硝酸塩を還元せず、 （ホ）カタラーゼ：陰性、 （ｎ） ペニシリンを含むＭＧ寒天平板培地（ペニシ
   リンＧカリウム：０．５〜１．０単位／ｍｌ）で発育す
   る。 ６ 菌体を滅菌した緩衝液に懸濁し、［ｅ４．３に調整
   して、５℃で７日間保持した時、少くとも１％の生残率
   を有する耐緩性を示すビフィドバクテリウム・ロンガム
   を生育培地に培養して、菌体を増殖させることを特徴と
   する前記ビフィドバクテリウム・ロンガムの製造方法。 ７ 前記のビフィドバクテリウム・ロンガムがビフィド
   バクテリウム・ロンガムＭ−８２０１（微工研菌寄第６
   ５４８号）であることを特徴とする特許請求の範囲第６
   項に記載の方法。 ８ 菌体を滅菌した緩衝液に懸濁し、世を４．３に調整
   して、５℃で７日間保持した時、少くとも１％の生残率
   を有する耐酸性を示すビフィドバクテリウム・ロンガム
   の生菌菌体を含有することを特徴とする組成物。 ９ 前記のビフィドバクテリウム・ロンガムがビフィド
   バクテリウム・ロンガムＭ−８２０１（微工研菌寄第６
   ５４８号）であることを特徴とする特許請求の範囲第８
   項に記載の組成物。 １０ 前記の組成物が食品としての用途を有することを
   特徴とする特許請求の範囲第８項または第９項に記載の
   組成物。 １１ 前記の組成物が飼料としての用途を有することを
   特徴とする特許請求の範囲第８項または第９項に記載の
   組成物。 １２ 前記の組成物が整腸剤としての用途を有すること
   を特徴とする特許請求の範囲第８項または第９項に記載
   の組成物。