KR20030043543A - 김치에서 분리한 내산성 및 내담즙산성이 우수한 신규락토바실러스 플랜타륨 및 이를 함유하는 제품 - Google Patents

Abstract

본 발명은 김치에서 유래된 내산성 및 내담즙산성이 뛰어난 새로운 유산균인 락토바실러스 플랜타륨 YM 0105(기탁번호 KCCM-10315)균주 및 이를 함유하는 제품에 관한 것이다.

본 발명에 의한 신균주는 한국인이 섭취하는 음식 중 가장 많은 부분을 차지하는 김치에서 분리하여 한국인에게 적응성이 뛰어나며, 내산성 및 내답즙산성이 우수하여 한국인의 장내 정착율이 뛰어나고, 우유에서 생장이 가능하고, 스트렙토코커스 써모필러스와 공생할 수 있어 발효유제조에 유용하게 이용할 수 있을 뿐만 아니라 기타 유가공식품에도 다양하게 이용 할 수 있다.

Description

김치에서 분리한 내산성 및 내담즙산성이 우수한 신규 락토바실러스 플랜타륨 및 이를 함유하는 제품{THE NEW LACTOBACILLUS PLANTARUM ISOLATED FROM KIMCHI, HAVING HIGH RESISTANCE ABILITY OF ACID AND BILE, AND PRODUCTS CONTAINING IT}

본 발명은 새로운 락토바실러스 플랜타륨에 관한 것으로 보다 상세하게는 김치유래의 내산성 및 내담즙산성이 우수한 신규 락토바실러스 플랜타륨 YM 0105균주 및 이를 함유하는 제품에 관한 것이다.

락토바실러스 플랜타륨은 김치 등 침채류의 발효후기에 많이 나타나는 한국인에게는 친숙한 유산균으로 항 돌연변이 및 항암 효과를 갖는 것으로 보고되고 있고 병원성균에 대한 항균작용도 갖는 균주로 평가 받고 있다. 그러나 락토바실러스 플랜타륨이 상기의 기능성을 적절히 발휘하기 위해서는 사람의 장내에서 정착이 가능해야 하며 이러한 조건을 충족시키기 위해서는 공복시에 pH2.0까지 감소하는 강산성 환경을 극복해야 하며 십이지장 상부에서 분비되는 담즙산에 대해서도 내성이 있어야 한다.

식물성 식품을 주로 섭취하는 한국인에게는 위와 장내 환경도 동물성 식품을 주로 섭취하는 서양인하고는 근본적으로 차이가 있어 김치와 같은 식물로부터 분리한 유산균이 한국인에게 잘 적용될 수 있다.

현재 국내에서 발효유에 사용하고있는 유산균은 대부분이 외국에서 개발된 락토바실러스 등을 사용하며 이것은 동물의 장내, 원유 또는 외국인의 장내로부터 분리된 균주이다.

이에 본 발명자들은 한국인이 통상적으로 섭취하는 배추김치로부터 새로운 락토바실러스 플랜타륨 균을 분리하여, 사람이 섭취한 후에도 사람의 장내에 안착이 될 수 있도록 내산성 및 내담즙산성이 뛰어나며, 우유에서도 생장이 가능한 균주를 개발하고자 연구하였다.

본 발명은 배추김치에서 락토바실러스 플랜타륨을 분리함으로써, 한국인의 식생활에 맞아, 적응성이 높은 락토바실러스 플랜타륨을 제공함에 그 목적이 있다.

또한, 본 발명의 목적은 사람이 섭취했을 때 락토바실러스 플랜타륨이 위산에 사멸하지 않고 위를 통과할 수 있도록 내산성 균주를 제공하며, 십이지장 상부의 담즙산에도 견디어 장내에 무사히 도달할 수 있도록 내담즙산성균주를 제공하는데 목적이 있다.

또한 본 발명은 락토바실러스 플랜타륨을 발효유제조에 적합하도록, 우유에서 잘 생장하며, 농후발효유 제조에 이용되는 Streptococcus thermophilus와 공생관계에 있는 균주를 제공함에 그 목적이 있다.

나아가, 본 발명의 목적은 본 발명에 의한 신규 락토바실러스 플랜타륨균주 및/또는 이의 배양물을 함유하는 발효유 제품 등을 제공하는데 있다.

도 1은 본 발명의 락토바실러스 플랜타륨 YM 0105균주의 광학현미경 사진이다.

도 2는 본 발명의 락토바실러스 플랜타륨 YM 0105균주를 환원탈지유에서 배양할 때 생존능력을 나타내는 그래프이다.

도 3은 본 발명의 락토바실러스 플랜타륨 YM 0105균주를 환원탈지유에서 스트렙토코커스 써모필러스와 같이 혼합 배양할 때 생균수의 변화를 나타내는 그래프이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 의하면 한국인에게 적응성이 높으며, 위산 및 담즙산에 견디고 우유에서 잘 생장하며, 발효유제조에 적합한 신규 락토바실러스 플랜타륨 YM 0105 균주를 제공한다.

이하, 본 발명에 따른 새로운 락토바실러스 플랜타륨 균주의 분리, 동정등에 대해 자세히 설명하면 다음과 같다.

[신균주의 분리]

균주 분리를 위해 pH 4.1-4.3의 잘 숙성된 배추김치를 일반시중에서 구입하여 즉시 김치즙을 멸균 tube에 채취하였다

Lactobacillus균 분리는 김치즙의 시료를 Lactobacilli 선택배지인 LBSagar[1L당 트립톤(tryptone) 10g, 효모추출물(yeast extract) 5g, KH₂PO₄6g, (NH₄)₂HC₆H₅O₇2g, 포도당(glucose) 20g, tween80 1g, CH₃COONa·3H₂O 25g, MgSP₄·7H₂O 0.575g, MnSO₄·4H₂O 0.12g, FeSO4·7H₂O 0.034g, 아가 15g]에 0~100군의 균락이 생기도록 희석하고, 48시간 배양 후 총 120균주를 분리하였다.

분리된 균주는 MRS broth에 2회 계대배양한 후 냉장 보관하면서 실험하였다.

선발된 120균주는 현미경 형태관찰, 그램염색으로 최종확인 후 API 50CHL kit(biomerieux, France)를 통해 49개의 당에 대하여 37℃에서 48시간 배양하면서 색의 변화를 관찰하였고, 내산성과 내담즙산성이 우수한 균주를 선발하기 위해 1%pepsin이 포함된 pH2.5의 인공위액과 0,3% Oxgall이 포함된 담즙산에 저항성이 가장 뛰어난 균주를 선발하였다.

선발된 균주를 YM 0105로 명명하고, 2001년 9월 24일자로 한국미생물보존센터(KCCM)에 기탁하였다. (기탁번호 KCCM-10315)

[신균주의 동정]

가. 형태학적 특징

12%의 탈지분유에서 2일 배양한 후 광학현미경으로 관찰한 결과는 도 1과 같이 전형적인 간균의 형태이다.

나. 생리화학적 특징

1) 그램염색

락토바실러스 플랜타륨은 그램양성의 세균으로써, 본 실험에서도 그램염색결과 그램양성의 균으로 판명되었다.

2) 당 이용능력

API 50CHL kit(biomerieux, France)를 통해 49개의 당에 대하여 37℃에서 48시간 배양하면서 색의 변화를 관찰하여 각각의 당을 유일한 탄소원으로써 이용하는지의 여부를 실험하였다

사용한 당 및 결과는 표 1과 같다.

Bergey's Manual of Systematic Bacteriology의 락토바실러스 플래타륨 당이용능력과 비교한 결과 모든 당의 이용능력이 일치하였다.

3) 효소 활성

본 발명의 신균주를 MRS 배지에 37℃로 배양하면서,분광광도계(spectrophotometer)를 사용하여 0.D 550nm에서 1.0까지 도달한 후 원심분리하고, 생리적 식염수로 균수를 10⁶CFU/ml 수준으로 희석하여, API-ZYM kit(biomerieux, France)를 이용하여 37℃에 8시간 배양한 후 ZYM-A용액과 ZYM-B 용액을 1방울 떨어뜨린 후 10분간 실온에서 방치한 다음 효소활성을 측정하였다. 효소활성은 API-ZYM kit manual의 표준 색상도와 비교하여 0-50 nanomole의 수치로 표시하였으며, 그 결과는 하기 표 2와 같다.

β-glucuronidase는 benzopyrene을 발암성 물질로 전환시키는 작용을 하는 발암효소로 알려져 있는데 본 발명의 락토바실러스 플래타륨 YM 0105균주는 β-glucuronidase 활성이 없는 안전한 균주임을 확인할 수 있었다.

또한 Leucine arylamidase활성이 높은 균주는 산생성능력이 높은 것으로 알려져 있으며 YM 0105균주는 leucine arylamidase활성이 비교적 낮아 산 생성능력이 높지 않은 것을 알 수 있다.

4) 16s rRNA Sequence 분석

본 발명의 신균주 락토바실러스 플랜타륨 YM0105는 한국미생물보존센터(KCCM)에 의뢰하여 최신의 미생물 동정기법인 16s rRNA sequence를 분석하였다. 분석결과(접수번호 : 01-40) 99%의 유의성으로 Lactobacillus plantarum으로 확정되었다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것은 아니다.

실시예 1

신균주의 인공위액에 대한 내산성 검정

유산균은 젖산이 생성된 산성환경의 배양액에서 사멸율이 증가하며, 사람이 섭취했을 때 인체의 위에서 머무는 동안 염산(HCl)이 0.4∼0.5%(0.1N HCl정도)함유되어 있고 총 산도가 0.45∼0.6%에 달하는 위액과 접촉하게 된다. 위액의 pH는 시간에 따라 변하는데 공복 시에는 1.8, 식후에는 5정도로 상승한다. 따라서 유산균을 섭취한 후 장까지 도달하기 위해서는 위산에 대한 내성이 있어야 만 한다.

본 발명에 따른 신균주와 한국생명공학연구원 유전자은행(KCTC)으로 부터 구입한 기존의 균주인 락토바실러스 플랜타륨 KCTC 3104를 MRS broth에 2회 계대배양 후 균체를 회수하여 내산성 측정용 인공위액으로 사용하기 위해 1% pepsin이 첨가된 pH 2.5로 조절된 MRS broth에 접종하여 37℃에서 3시간 배양 후 MRS agar에 분주하여 37℃배양 후 균수를 측정하였다.

신균주는 표3에서 확인 할 수 있는 바와 같이 KCTC 3104보다 생존율이 월등히 우수하여 인공위액에 대한 내산성이 뛰어난 균주 임을 알 수 있다.

실시예 3

신균주의 내답즙산성 검정

담즙산은 간에서 합성되어 담낭으로 옮겨져 농축된 후 십이지장으로 분비되는 계면활성제와 같은 물질로 많은 유산균들이 이 담즙산에 의해 성장이 억제되는 것으로 알려져 있다. 따라서 섭취한 유산균이 장내까지 도달하기 위해서는 담즙에 대한 내성이 있어야만 한다.

신균주 및 기존의 KCTC 3104를 MRS broth에 2회 계대배양 후 0.3% oxgall이포함된 MRS agar와 oxgall이 포함되지 않은 MRS agar에 각각 도말하여 37℃에서 48시간 배양한 후 생성된 colony를 계수하여 비교하였다.

표 4에서 보는 바와 같이 기존 균주인 락토바실러스 플랜타륨 KCTC 3104는 담즙산이 포함된 배지에서 성장하지 못하고 68.8%만이 살아 남았으나, 신균주 락토바실러스 플랜타륨 YM 0105는 담즙산에서도 전혀 사멸하지 않고 오히려 균수가 증가하는 것으로 나타나 담즙산에 내성이 있는 균주임을 알 수 있다.

실시예 4

환원탈지유에서 배양 중 신균주의 생존능력 검정

우유에서 유산균을 배양하는 중 우유의 영양성분을 분해하지 못하여, 성장이 어렵거나 주위의 산성환경이나 분해물 등으로 생육에 영향을 받아 사멸된다면 이용가치가 떨어진다.

신균주를 12% 환원탈지유에 1% 접종하여, 6시간, 12시간, 24시간 별로 배양시간에 따른 생육상태를 측정하였다. 신균주는 도 2에서 보는 바와 같이 우유에서 성장하면서 균수가 급속히 증가하는 것을 알 수 있어 우유에서 잘 성장할 수 있는균주 인 것으로 나타났다.

실시예 5

환원탈지유에서 Streptococcus thermophilus와 혼합 배양 검정

농후발효유제조에는 주로 Streptococcus thermophilus와 Lactobacilli가 혼합되어 이용되고 있다. 따라서 신균주를 농후발효유에 이용하기 위해서는 Streptococcus thermophilus와 공생관계가 유지되어야 한다. 신균주를 요구르트 제조에 주로 이용되는 Streptococcus thermophilus와 혼합배양하면서 생균수의 변화를 알아본 결과 도 3과 같다.

신균주 및 Streptococcus thermophilus 모두 도 3에서 보는 바와 같이 단독배양보다 혼합배양하면서, 생균수가 오히려 증가되어 서로의 생장을 저해하지 않고 공생관계에 있는 것으로 나타나 농후발효유 제조에도 아무런 문제가 없는 것으로 나타났다.

실시예 6

신균주를 이용한 발효유의 제조 예

우유에 탈지분유를 4%(w/v) 용해한 후 신균주 락토바실러스 플랜타륨 YM 0105를 1%(v/v), 스트렙토코커스 써모필러스균을 1%(v/v) 그리고 락토바실러스 애시도필러스균을 1%(v/v) 접종한 후 8시간 배양하면서 배양액으로 사용하였다. 당액을 제조하기 위하여 당액 100g기준, 과당 19.5g, 올리고당 19.2g, 과즙 19.5g, 펙틴 1.1g, 향료 0.19g, 물 40.51g을 혼합하여 용해하였다. 최종제품은 배양액 73.3%, 당액 26.7%를 혼합하여 제조한 후 5℃에서 보관하였다.

실시예 7

신균주로 이용한 발효유의 관능검사

상기 실시예 5에서 제조된 농후발효유를 식음하고 기호성의 정도를 관능검사하였다. 관능검사는 총 20명의 인원을 대상으로 9점 평점법으로 실시하였으며, 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.

표 5에서 확힌할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 신균주로 제조된 발효유는 관능 한계인 5점을 상회하는 바, 풍미, 조직감 및 색깔에 있어서 기호성이 우수함을 알 수 있었다.

이상에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명의 락토바실러스 플랜타륨 YM 0105 균주는 배추김치에서 유래한 유산균으로 한국인의 색생활에 적합하여 적응성이 뛰어난 유산균으로, 인공위액에 대한 내산성 및 담즙산에 대한 내성이 탁월하여 사람이 섭취시 장에 도달하는 능력이 우수하며. 우유에서도 잘 생장하고, 스트렙토코커스 써모필러스와 공생관계에 있어 한국인의 장내환경에 적합한 발효유등의 유가공식품 제조에 다양하게 이용할 수 있다.

Claims (2)

1. 김치에서 유래된 내산성 및 내담즙산성이 뛰어난 새로운 균주인 락토바실러스 플랜타륨 YM 0105 (한국미생물보존센터에 2001년 9월 24일자로 기탁: 기탁번호 KCCM-10315)
2. 제 1항에 따른 락토바실러스 플랜타륨 YM 0105 및/또는 그 배양물을 함유하는 발효유제품