KR20160076171A - 복분자로부터 분리한 락토바실러스 플란타룸 균주 및 이를 포함하는 식품 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 복분자로부터 분리한 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) GBL16 (KCCM11621P) 균주 및 이를 포함하는 식품 조성물에 관한 것이다.
Description
본 발명은 복분자로부터 분리한 락토바실러스 플란타룸 균주 및 이를 포함하는 식품 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 복분자로부터 분리한 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) GBL16 (KCCM11621P) 균주 및 이를 포함하는 식품 조성물에 관한 것이다.
복분자(Rubus occidentalis)는 장미과(Rosaceae)의 낙엽관목이며, 중국이 원산지이고 일본, 한국 등 동아시아에 분포한다. 우리나라에서는 남부 및 중부지방에서 해발 50∼1000 m의 산기슭 양지에 자생하며 초여름에 검붉은 열매를 수확하여 식용하고 있다.
복분자에 대한 연구로는 대부분 복분자의 유효성분, 복분자의 생리활성, 복분자를 이용한 다양한 식품개발에 관한 연구가 주를 이루고 있으며, 복분자의 생리활성에 대한 연구로는 항 돌연변이 활성과 암세포 성장 억제 효과, 항종양 효과, 면역 활성 증진 효과, 항산화 작용이 보고되었고, 이 외에도 복분자의 잎과 줄기에 항균활성 물질로 알려진 탄닌 및 플보노이드 화합물이 함유되어 있으며, 복분자 씨 추출물에서 노로바이러스 저해 활성이 보고되고 있다.
복분자의 생리활성이나 복분자를 이용한 식품 개발에 대한 연구는 활발히 진행되고 있으나 복분자 발효식품에 관한 연구는 복분자주 외에는 거의 보고되지 않아 이에 대한 연구가 필요한 실정이다.
유산 균주는 인간이나 동물의 장관에 생존하여 건강유지에 큰 역할을 담당하는 것으로 알려져 있다. 장내에 정착한 유산 균주는 병원성 세균이 소화관 상피에 부착하는 것을 방해하여 질병발생을 막아주며, 유산 균주에 의해 생성된 박테리오신(bacteriocin) 같은 대사산물은 설사를 일으키는 병원성 미생물과 장내 유해균을 죽이거나 증식을 억제하는 등의 건강 증진 효과를 보여준다.
또한, 건강을 추구하는 현대에 있어서 성인과 관련된 질병의 예방 및 치료 측면에서 볼 때 병원성 세균의 억제능, 콜레스테롤 저하능, 면역 증강능, 항 돌연변이원성, 항종양활성 및 항암 효과가 있어 건강 유지에 큰 역할을 담당하는 것으로 알려져 있기 때문에, 프로바이오틱스(probiotics)라는 기능적인 측면에서 유산 균주가 크게 주목을 받고 있다.
프로바이오틱스는 “살아있는 미생물을 적정량 투여하였을 때, 숙주에게 유익한 영향을 미치는 것(FAO/WHO, 2001)”으로 정의된다. 프로바이오틱스로 사용되는 미생물들이 효과가 있으려면 위장관내에서 생존할 수 있어야 하고, 장내에서 증식할 수 있어야 한다.
대표적인 프로바이오틱스 균주인 유산 균주는 이미 여러 나라에서 다양하게 상품화되어 사용되고 있는데, 상기 유산 균주는 일반적으로 Lactobacillus sp., Streptococcus sp., Pediococcus sp., Enterococcus sp. 등을 포함하고 있으며, 젖산과 아세트산과 같은 유기산, 과산화수소 그리고 박테리오신과 같은 항균물질 등 다양한 대사물질을 생산하여 장내 부패균 및 유해한 병원성 세균의 생육을 저해하고 있는 것으로 알려져 있다.
유산 균주 및 이의 용도에 관한 종래기술로는 항균물질을 생산하는 유산균 및 이를 함유하는 생균제 조성물 (한국공개특허 제10-2009-0105171호), 김치로부터 분리된 유산균 및 그의 용도 (한국공개특허 제10-2010-0000394호), 노화 및 치매의 예방 및/또는 치료 활성을 갖는 유산균 (한국공개특허 제10-2014-0023241호) 등이 개시되어 있으나, 복분자로부터 분리한 유산 균주에 대해서는 알려져 있지 않은 실정이다.
<참고문헌>
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본 발명자들은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여 복분자로부터 토종발효미생물인 유산 균주를 분리 및 동정하여 상기 유산 균주의 안전성 평가, 장내 생존성 및 항균활성, 효소활성 및 비만억제 효과를 평가함으로써, 생균제로서의 특성 및 기능성을 조사하였으며, 상기 균주를 이용하는 유산 균주 발효 음료를 제조할 수 있음을 알아내고 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 복분자로부터 분리한 새로운 유산 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 유산 균주의 식품 조성물로서의 용도를 제공하는 것이다
본 발명은 상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 복분자로부터 분리한 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) GBL16 (KCCM11621P) 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주를 포함하는 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 의하면, 복분자로부터 분리한 새로운 유산균으로서, 내산성, 인공 위액에 대한 저항성, 담즙 내성, Staphylococcus aureus에 대한 생육 저해 활성 및 지방 축적의 억제 활성을 갖고, 용혈 독성 및 베타-글루쿠로니데이즈(β-glucuronidase)에 대한 활성을 나타내지 않으며, 복분자 착즙액에서 발효시, 발효 3일째에 최대치의 균수를 나타내고, 발효 5일 후의 pH는 3.0~3.5이며, 산도는 2.8~2.9%이고, 당도는 9~10 °브릭스인 락토바실러스 플란타룸 균주를 이용한 새로운 용도를 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명에 의한 균주의 그람 염색(Gram staining) 현미경 관찰 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 의한 균주의 계통 발생론적 관계도를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 의한 균주의 용혈성(hemolysis) 테스트 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 의한 균주의 3T3-L1 지방전구 세포에 대한 세포 독성 조사 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명에 의한 균주의 3T3-L1 지방전구 세포의 축적 억제효과 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 의한 균주의 계통 발생론적 관계도를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 의한 균주의 용혈성(hemolysis) 테스트 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 의한 균주의 3T3-L1 지방전구 세포에 대한 세포 독성 조사 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명에 의한 균주의 3T3-L1 지방전구 세포의 축적 억제효과 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 복분자로부터 분리한 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) GBL16 (KCCM11621P) 균주에 관한 것이다.
본 발명의 상기 균주는 내산성, pH 2.5로 조정한 0.5% NaCl 용액에 3 mg/mL의 펩신을 첨가한 인공 위액에 대한 저항성, 담즙 내성, Staphylococcus aureus에 대한 생육 저해 활성 및 지방 축적의 억제 활성으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 갖는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 상기 균주는 용혈 독성(hemolytic toxicity) 및 베타-글루쿠로니데이즈(β-glucuronidase)에 대한 활성을 나타내지 않는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 상기 균주는 복분자 착즙액에서 발효시, 발효 3일째에 최대치의 균수를 나타내고, 발효 5일 후의 pH는 3.0~3.5이며, 산도는 2.8~2.9%이고, 당도는 9~10 °브릭스인 것을 특징으로 하는 균주.
본 발명의 상기 균주에서, 상기 MRS 액체배지는 본 발명이 속하는 기술분야에서 유산 균주의 배양시 통상적으로 사용되는 배지로서, 그 조성은 Pancreatic digest of gelatin 10.0 g/L, Beef extract 8.0 g/L, Dextrose 20.0 g/L, Dipotassium phosphate 2.0 g/L, Polysorbate 80 1.0 g/L, Sodium acetate 5.0 g/L, Ammonium citrate 2.0 g/L, Magnesium sulfate 0.2 g/L 및 Manganese sulfate 0.05 g/L으로 이루어져 있다.
본 발명의 상기 균주는 복분자 열매로부터 분리한 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 균주를 포함하는 식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 상기 식품 조성물에서, 상기 균주가 식품 조성물의 전체 중량대비 0.0001~50중량%, 바람직하게는 0.1~20중량%의 함량으로 포함될 수 있으나, 상기 함량이 이에 한정되는 것은 아니고, 사용 용도에 따라 상기 함량을 적절히 조절할 수 있다.
본 발명의 상기 식품 조성물에서, 상기 식품은 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능식품, 조제유류, 영유아식, 식육 가공품, 어육 제품, 두부류, 묵류, 면류, 건강보조식품, 조미식품, 소스류, 과자류, 유가공품, 김치, 절임식품, 음료, 천연 조미료 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 식품 조성물에서, 상기 식품은 유산 균주 발효 음료일 수 있다.
본 발명의 상기 식품 조성물에서, 상기 균주 생균일 수 있다.
본 발명의 상기 식품 조성물은 통상의 방법에 의해 제조할 수 있는 것이므로, 이에 대한 상세한 설명은 생략한다.
이하, 하기의 실시예 및 제조예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명이 이들 실시예 및 제조예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 복분자로부터 유산 균주 분리
전라북도 고창군 지역의 복분자 낙과를 수집한 후 이를 25℃ incubator에서 약 6～7일 동안 자연발효를 진행하였다. 발효 원액을 멸균증류수에 희석하여 MRS (Difco, Sparks, MD, USA) 및 2%의 CaCO3가 첨가된 MRS 고체배지에 도말하여 30℃에서 24～48시간 배양 후 얻어진 균주 중에서 단일 콜로니를 선택하여 각각의 액체배지에 계대 배양하여 실험에 사용하였다.
<실시예 2> 분리 균주의 동정
(1). 형태학적 관찰
분리된 유산 균주의 동정을 위하여, 그람 염색을 통하여 상기 유산 균주를 염색한 후, 현미경을 이용하여 형태학적 특성을 확인하였다.
상기 분리균주의 스트리킹을 통하여, 단일 콜로니(single colony)의 모양, 크기, 색깔 등의 특징을 관찰하여 형태학적 관찰을 시행한 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
또한, 상기 단일 콜로니를 그람 염색 후 현미경 관찰한 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에서 보는 바와 같이, 상기 분리 유산 균주는 그람 양성이고, 단간균의 형태를 나타냄을 알 수 있다.
(2). 생화학적 특성
유산 균주의 생화학적 특성은 미생물 동정장치 Vitek 2 시스템 (BioMerieux, USA)의 CBC 카드를 이용하여 조사하였다.
생화학적 특성을 조사하기 위하여, 카탈라제 시험(catalase test) 및 VITEK 2 시스템을 실시하였다. 상기 카탈라제 시험 결과, 상기 유산 균주는 기포를 형성하지 않는 카탈라제 음성균으로 나와 혐기성 미생물임을 확인하였다.
미생물 동정 장치인 VITEK 시스템을 이용하여 동정한 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
생화학적인 특성으로는 상기 표 2에서 보는 바와 같이, D-galactose, β-galactosidase, D-glucose, D-mannitol, Saccharose, D-Trehalose, D-sorbitol 등에 대해 양성 반응을 나타내었으나, arginine GP, pyruvate, tyrosine arylamidase, urease, citrate 등에 대해서는 음성반응을 나타내었다는 바, Lactobacillus plantarum과 99%의 유연성(probability)을 나타내어, Lactobacillus plantarum과 가장 유사한 균주임을 알 수 있다.
베타-갈락토시다제(β-galactosidase)는 락토오스(lactose) 가수분해 효소로서 유당 불내증을 완화시킬수 있어, 유당 불내증 환자들에게 주로 나타나는 복부 팽만감, 과도한 가스발생이나 설사 등을 완화시키는 효과가 있을 것으로 기대된다.
(3). 16S 및 18S rRNA 염기서열에 따른 분자생물학적 동정
최종적인 동정을 위하여, 분리 균주의 16S rRNA 염기서열을 결정하여 알려진 균주들과 비교하였다.
유산 균주의 16S rRNA 시퀀싱은 분리 균주의 chromosomal DNA를 분리한 후에 518F(5’-CCAGCAGCCGCGGTAATACG-3’: 서열번호 1)과 800R(5’-TACCAGGGTATCTAATCC-3’: 서열번호 2)의 프라이머를 사용하여 PCR 하였다.
균주의 16S rRNA 염기서열은 진뱅크(GeneBank) 데이타베이스에 등록된 균주들의 16S rRNA 염기서열과 상동성을 조사하여 계통학적 유연 관계를 분석하였으며, 그 결과를 Mega 6 프로그램으로 neighbor-joining tree에 의해 계통도를 작성하여 유전적 유사성을 확인한 결과를 도 2에 나타내었다.
또한, 상기 분리 유산 균주의 결정된 16S rRNA 염기서열로 상동성을 분석한 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
도 2 및 상기 표 3에서 보는 바와 같이, 진뱅크에 등록된 균주 및 상기 분리 유산 균주의 type strain과 99% 이상의 높은 상동성을 나타냄을 알 수 있는 바, 상기 분리 유산 균주는 Lactobacillus plantarum으로 동정하였으며, 이를 “Lactobacillus plantarum GBL16”으로 명명하였다.
상기 Lactobacillus plantarum GBL16 균주를 2014년 12월 04일자로 한국미생물보존센터(KCCM)에 KCCM11621P의 기탁번호로 기탁되었다.
<실시예 3> 장내 생존성 측정
분리균주의 장내 생존성을 측정하기 위하여, 먼저 산 저항성은 단순 산성 pH에 대한 내성과 체내 소화관 조건과 유사한 인공위액 내성시험을 실시하여 확인하였다.
단순 산성 pH에 대한 내성은 Kobayashi 등의 방법 (Jpn. J. Microbiol. 29: 691-698 (1974))을 변형하여 1N HCl를 사용하여 pH 2.5로 조정한 MRS 액체배지(Difco, USA)를 사용하였다.
또한, 인공 위액은 1.0 N HCl을 사용하여 pH 2.5로 조정한 0.5% NaCl 용액에 pepsin(Sigma Co., USA)을 3 mg/mL 되도록 첨가하였다.
상기 분리 균주의 인공 담즙에 대한 저항성 측정은 MRS 액체배지에 oxgall(Sigma-Aldrich Co., USA)을 0.3%로 첨가하여 인공 담즙을 조제하여 사용하였다.
복분자로부터 분리된 유산 균주를 MRS 액체배지에 1%(v/v) 접종하여 30℃에서 24시간 배양한 후, 원심분리 (9,950×g, 5 min)하여 상징액을 제거하고 균체를 회수한 다음, pH 2.5의 MRS 액체배지와 인공 위액 및 인공 담즙액을 각각 초기 배양액과 동량으로 첨가하여 현탁하였다.
내산성과 인공 위액 저항성 측정은 37℃에서 2시간 배양하였으며, 담즙액의 경우 37℃에서 3시간 배양한 후 생균수를 측정하였다. 실험의 대조군으로 MRS 용액(pH 2.5)과 인공 위액 및 인공 담즙액 대신 MRS 액체배지를 사용하여 내산성과 인공 위액 및 인공 담즙액에 대한 저항성을 비교하였다.
유산 균주가 프로바이오틱스(probiotics)가 되기 위한 필수조건으로 위장관 상부의 산성 조건 및 소화 효소가 많은 담즙이 존재하는 환경에서의 생존이 요구된다.
따라서, Lactobacillus plantarum GBL16의 내산성 및 인공 위액, 그리고 인공 담즙액 저항성을 확인한 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
상기 표 4에서 보는 바와 같이, pH 2.5로 조정한 MRS 액체배지에서 2시간 처리 후에 초기 균수보다 오히려 증가하여 생존율이 141%로 높게 나타났다.
인공 위액 저항성에서는 인공 위액을 2시간 처리한 후에, 73%의 생존율을 나타냈으며, 인공 담즙 저항성에서는 0.3% oxgall에서 3시간 처리한 후에, 초기 균수보다 증가하여 각각 162%의 생존율을 나타냈다.
따라서, 복분자로부터 분리된 유산 균주는 높은 내산성과 인공 위액 저항성 및 담즙 내성을 나타내어, 프로바이오틱스로서 활용될 가능성이 높은 것으로 판단된다.
<실시예 4> 유산 균주의 항균활성 측정
유산 균주의 항균활성 시험은 agar-well diffusion assay 방법 (Appl Environ Microbiol 67:15 (2001))을 변형하여 유해균주에 대한 생육저해활성을 확인하였다.
분리 유산 균주의 항균활성 실험에 사용된 병원성 균주는 하기 표 5에서 보는 바와 같이, 그람 양성 균주로 Streptococcus thermophilus , Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes를 사용하였으며, 그람 음성 균주로 Escherichia coli O157:H7을 포함한 총 4종의 공시 균주를 사용하였다.
항균 활성을 측정하기 위하여, 4종의 유해 균주를 105∼106 CFU/mL 농도로 최적 한천배지에 도말한 후, 여기에 직경 5 mm로 구멍을 내고, 그 구멍에 분리 균주의 배양액을 109 CFU/mL 농도로 soft-agar에 함유시켜 넣어 30℃에서 24시간 배양한 후, 유해 균주에 대한 생육 저해환을 측정하여 항균활성 유무를 관찰하였다.
상기 분리한 유산 균주의 항균 활성을 측정하기 위하여, agar-well diffusion assay 방법 (Appl Environ Microbiol 67:15 (2001)을 통하여, Streptococcus thermophilus , Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes , Escherichia coli O157:H7 4종의 병원성 균주에 대하여 항균 활성을 확인한 결과를 하기 표 6에 나타내었다.
상기 표 6에서 보는 바와 같이, 상기 유산 균주는 Streptococcus thermophilus, Listeria monocytogenes , Escherichia coli O157:H7 3종의 병원성 균주에 대해서는 저해환의 크기가 9.49∼11.75 mm로 약한 저해활성을 보였으나, Staphylococcus aureus에 대해서는 저해환의 크기가 20mm 이상으로 Staphylococcus aureus에 대한 생육 저해 활성이 우수함을 확인할 수 있다.
유산 균주의 항균 활성은 유산 균주가 생성하는 항균물질과 젖산에 의한 낮은 pH 등의 복합적인 작용이라고 알려지고 있다.
또한, 병원성 균주 중 Staphylococcus aureus는 중요한 식중독의 주요 원인이 될 뿐만 아니라, 수술부위 감염, 폐렴 등 병원 내 감염증을 잘 일으키는 균으로 알려져 있으며, 유아에 장염을 일으키고 이로 말미암아 이차로 다발성 장 궤양과 천공을 초래한다는 보고도 있다.
따라서 본 실시예를 통하여, Staphylococcus aureus의 성장 저해율이 높은 유산 균주를 생균의 형태로 섭취할 경우, 장내 유해 세균을 억제하여 정장 작용에 도움이 될 것으로 생각된다.
또한, 차후 항균 물질에 대한 추가 연구를 통하여, 천연 식품 보존제로서의 활용 가능성도 기대할 수 있을 것이다.
<실시예 5> 유산 균주의 용혈성(hemolysis) 측정
분리 유산 균주의 용혈성 여부 조사는 Sheep blood agar plate(Hanil Komed Co., Ltd., Sungnam, Korea)에 유산 균주를 스트리킹 한 후, 30℃에서 48시간 배양하여 균체 주위에 용혈 현상에 의한 투명환의 생성 여부로 용혈성을 판단하였다.
유산 균주가 생균 활성제 또는 프로바이오틱 미생물로 활용되기 위해서는 인체에 대한 용혈성 등의 독성이 없는 안전성이 요구된다.
용혈작용은 적혈구의 유전적인 결함이나 화학물질, 뱀 등의 독액, 미생물이 생성하는 독성물질에 의해서 형성되는 비정상적인 작용이며, 용혈성은 적혈구를 파괴하거나 분해하는 현상이다.
분리 유산 균주가 용혈성 독성이 없음을 확인하기 위하여, sheep blood agar에 분리 균주를 스트리킹하여 균체 주위에 투명환의 생성 여부로 용혈성을 판단한 결과, 도 3에서 보는 바와 같이, 용혈 독성을 나타내지 않는 것으로 나타났다.
따라서, 상기 유산 균주는 용혈성과 같은 인체에 대한 독성이 없음이 검증되어 생균 활성제 또는 프로바이오틱 등의 미생물로서 안전성이 있는 것으로 확인되었다.
<실시예 6> 유산 균주의 효소 활성
분리 유산 균주의 효소 활성 측정은 API ZYM kit(BioMerieux, Lyon, France)를 사용하여 평가하였다.
유산 균주를 MRS 액체배지에 배양한 후 배양액을 원심분리(9,500×g, 3 min, 4℃)하여 균체를 회수한 후, 현탁 배지(suspension medium)에 현탁하여 5～6 McFarland 스탠다드로 탁도를 맞춰 준비한 후, 스트립의 각 큐플에 65μl 씩 분주하여 30℃에서 4시간 배양하였다.
4시간 동안 배양한 후, 표면 활성 증가와 용해를 돕기 위한 ZYM-A, ZYM-B 시약을 각각의 큐플에 한 방울씩 떨어뜨린 다음, 밝은 곳에서 약 5분간 반응시켜 색깔의 변화를 관찰하여 효소활성을 측정하였다.
이때, 색의 변화 정도에 따라 0～5까지의 값으로 표시할 수 있으며, 0은 음성 반응, 5는 최대 강도의 반응이고 3이상이면 양성으로 판정하였다.
미생물이 식품 발효의 종균으로 사용되거나, 프로바이오틱 미생물로 사용될 때 이들 균이 생산하는 효소는 중요한 부분을 차지한다. 이에 따라 분리한 유산 균주의 효소 활성을 API ZYM kit로 확인하였다.
API ZYM kit를 이용하여 19개의 효소에 대한 활성 여부를 색의 변화 정도에 따라 0～5값으로 표시하였으며 이 때 값이 3 이상일 때 양성반응(+)으로 나타내었다.
복분자 분리 유산 균주의 효소 활성을 확인한 결과를 하기 표 7에 나타내었다.
상기 표 7에서 보는 바와 같이, leucine arylamidase, β-Galactosidase, α-Glucosidase, β-Glucosidase, N-Acetyl-β-glucosaminidase와 같은 효소에 대하여 활성을 나타내었다.
벤조피렌(benzopyrene) 등의 물질이 체내 유입시 발암물질로 전환하는 효소인 β-glucuronidase 효소에 대한 활성은 가지고 있지 않아서, 발암 유발의 잠재적 위험성이 없음을 입증하여 안전성을 확인하였다.
β-glucuronidase는 주로 대장균, 클로스트리디움, 박테로이드 등의 장내 유해세균에 의해 생성되어지며, 이들이 장내 증식시 벤조피렌 등의 물질이 체내 유입되면 이들이 생성한 β-glucuronidase에 의해 탈포합되어 발암물질로 전환됨으로써, 인체의 건강에 악영향을 주는 물질로 보고되고 있다.
β-galactosidase의 경우, 복분자로부터 분리한 상기 유산 균주가 활성을 나타내는 것으로 보아, 유당을 제거한 우유 가공식품이나 우유 중의 락토오스에 의한 유당 불내증의 저하에 많은 도움이 될 것으로 생각된다.
<실시예 7> 유산 균주의 항비만 효과 측정
(1). 유산균 파쇄액의 전처리
MRS 액체배지에서 24시간 배양한 유산균 배양액을 원심분리(9,500×g, 10 min, 4℃)하여 균체를 회수한 후, PBS(phosphate buffered saline; Hyclone, Logan, USA)로 3회 세척한 다음, 1010 CFU/mL 농도가 되도록 PBS로 현탁하였다.
그 이후 초음파 분쇄기(ultrasonic processor, Branson ultrasonics Model 350)로 30분 동안 2회 소니케이션하고, 유산균을 파쇄한 후에 원심분리(9,500×g, 10 min, 4℃)하여 얻은 상층액을 0.45 μm syringe filter(Millipore, USA)로 제균하였다.
제균한 세포질 분획물은 동결건조(PVTED10R, Ilshinbiobase, Dounducheon, Korea) 한 후 20℃에서 보관하여 실험에 사용하였다.
(2). 3T3-L1 지방전구세포의 배양 및 분화 유도
실험에 사용된 3T3-L1 세포는 American Type Culture Collection (ATCC, Mamassas, VA, USA)에서 분양 받아 사용하였다. 분양받은 3T3-L1 지방 전구세포를 6 웰 플레이트에 3× 105 cells/well로 DMEM (10% BCS, 1% 페니실린/스트렙토마이신)에 2일간 배양한 후, 100% confluence 상태에서 2일간 더 배양하였다.
2일 후에 10% 소태아 혈청(FBS)과 10 μg/mL 인슐린, 0.5 μM 3-isobutyl-1-methylxanthine(IBMX), 0.25 μM 덱사메타손(dexamethasone)이 포함된 분화 배지로 교환하여 2일간 배양하였으며, 그 후 매일 2일마다 5 μg/mL 인슐린이 포함된 배지로 교환해주었다.
이때, 시료의 처리는 분화유도 배지 첨가 시점부터 같이 처리하였다.
(3). 3T3-L1 지방 전구세포 생존율의 측정
배양이 끝난 세포의 생존율은 MTT[3-(4, 5-dimethylthiazole-2-yl)-2, 5-diphenyl-tetrazolium bromide] 환원 방법을 이용하여 측정하였다.
MTT assay는 살아있는 세포의 미토콘드리아에 존재하는 succinic dehydrogenase에 의해 MTT tetrazolium이 formazan으로 환원되는 것을 이용하여, formazan의 농도를 흡광도 450nm에서 측정함으로써 생존한 세포수를 확인하는 방법이다.
3T3-L1 지방 전구세포를 24 웰 플레이트에 1×105/웰로 접종하고, 100% confluence 상태에서 분화시킨 후, 동시에 샘플을 처리하여 8일동안 배양하였다.
MTT assay는 cell viability assay kit (EZ-Cytox, Gogen, Seoul, Korea)를 이용하였고, 모든 웰에 MTT용액 10μL를 가해주고, 다시 37℃, 5% CO2 배양기에서 4시간 배양하여 MTT가 환원되도록 하여, 흡광도 측정을 위하여 1분 정도 부드럽게 쉐이킹을 한 뒤 microplate reader (Synergy HT, Bio-Tek, Winooski, VT, USA)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
(4） Oil-Red-O 염색
분리 유산 균주의 지방세포 분화억제 활성을 검토하기 위하여, Oil-Red-O staining을 실시하였다. Oil-Red-O staining은 중성 지방을 염색하는 방법으로 지방 세포 내의 중성지방 축적 정도를 시각화 할 수 있다.
3T3-L1 지방 전구세포를 8일 동안 분화시킨 후, 배지를 제거하고 PBS로 세척한 다음, 10% 포름알데하이드 용액으로 세포를 고정시켰다. 다시 PBS로 세척 후 Oil red O 용액을 첨가하여 30분간 실온에서 염색한 다음, Oil red O 용액을 제거한 후, 증류슈로 세척하여 건조시킨 다음 위상차 현미경을 이용하여 관찰하였다.
또한, 흡광도 측정을 위하여 100% 이소프로필 알코올로 염색된 지방구를 용출시켜 microplate reader (Synergy HT, Bio-Tek, Winooski, VT, USA)를 이용하여 500 nm에서 흡광도를 측정하였다.
(5) 유산 균주의 세포독성 측정
복분자로부터 분리된 유산 균주의 지방분화 억제능을 평가하기에 앞서, 3T3-L1 지방세포의 세포 생존율에 미치는 영향을 MTT assay를 통해 분석한 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에서 보는 바와 같이, Lactobacillus plantarum GBL16의 세포 독성을 조사하기 위하여, 0.1, 1, 2, 4, 8 mg/mL의 농도에서 생존율을 확인한 결과, 0.1 mg/mL에서부터 2 mg/mL의 농도까지는 세포의 생장에 큰 영향을 미치지 않는 것을 확인하였으나, 4, 8 mg/mL 농도에서 3T3-L1 지방세포의 생존율이 급격히 감소되는 것을 알 수 있디.
따라서, 3T3-L1 지방 세포의 생장에 영향을 끼치지 않으면서, 세포 독성을 나타내지 않는 1, 2 mg/mL의 농도에서 실험을 진행 하였다.
(6). 유산 균주의 lipid droplet 생성에 미치는 영향
Lactobacillus plantarum GBL16이 3T3-L1 지방 전구세포의 지방구 형성에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위하여, 전지방 세포를 분화 유도한 후, lipid droplet만 특이적으로 염색하는 Oil red O 염색 시약을 이용하여 염색한 다음, 10배 배율의 현미경으로 lipid droplet을 관찰한 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에서 보는 바와 같이, lipid droplet은 phospholipid monolayer에 의하여 둘러 싸여진 중성지방으로 구성된 비활성 소낭으로서, precursor fibroblast에서부터 지방 세포로의 분화 과정에서 나타나며, PPAR γ와 같은 중요한 adipogenic transcription factor들에 의해서 조절되는 것으로 알려져 있다 (Genes Dev. 8, 1654-1633 (1994), Lipid Health Dis. 9, 57 (2010), Biochim. Biophys. Acta 1302, 93-109 (1996)).
Oil red O로 염색하면 중성 지방, 콜레스테롤 에스테르 만이 염색되고, 그 외 유리 지방산, 인지질은 염색이 되지 않는다. Lipid droplet이 축적된 부분은 대부분이 중성 지방이기 때문에, 염색이 가능하다.
따라서, 3T3-L1 지방 전구세포가 지방 세포로의 분화 과정에 나타나는 lipid droplet 생성에 유산균 세포 파쇄액이 어떠한 영향을 미치는지를 확인하기 위하여, 각각의 시료를 농도별로 처리하여 분화를 유도한 후, Oil red O 염색 전후로 구분하여 lipid droplet 생성 정도를 위상차 현미경으로 관찰하였다.
도 5에서 보는 바와 같이, Lactobacillus plantarum GBL16을 처리하지 않고 분화를 유도하였을 경우에 세포질 내 lipid droplet의 형성이 활발하게 유발되는 것으로 관찰되었고, Lactobacillus plantarum GBL16을 1, 2 mg/mL로 처리하였을 때, 유의적으로 지방구 형성이 억제되는 것을 관찰할 수 있었다.
이와 같은 결과로부터, Lactobacillus plantarum GBL16의 처리가 lipid droplet의 생성을 저해시켜, 지방 축적을 억제하는 효과가 있음을 확인할 수 있다.
<실시예 8> 복분자 유산 발효 특성
(1). 재료 및 전처리
본 실시예에 사용된 복분자는 전라북도 고창군에서 2014년에 수확한 것을 구입하여 40℃에서 보관하며 사용하였다.
복분자 착즙액을 제조하기 위하여, 영하 40℃에 보관한 복분자를 24시간 해동 후, 착즙포에 담고 손으로 으깬 다음, 착즙포에 공기가 들어가지 않도록 준비하고, 유압식 착즙기(KR-70, Koryeo, Incheon, Korea)를 이용하여 하강 버튼을 천천히 누르면서 압력이 2000 psi가 될 때까지 착즙하였다.
유산 발효를 위한 스타터를 접종하기 전에 복분자 착즙액에 있는 오염균을 제거하기 위하여, 복분자 착즙액을 고온 단시간 살균법(high temperature short time, HTST)에 의하여 75℃에서 30초간 가열살균을 한 후, 이를 냉동 보관하여 실험에 사용하였다.
(2). 유산균 접종 및 발효 특성
복분자 착즙액의 유산 발효에 스타터로 사용된 상기 분리 유산 균주는 MRS 액체배지에서 2회 이상 계대배양한 후, 복분자 착즙액에 대하여 접종량이 2.0%(v/v)가 되도록 접종한 다음, 30℃에서 5일간 발효하며 이화학적 특성 및 유산균수를 측정하였다.
이때, pH는 pH meter(S20, Mettler Toledo, Schwerzenbach, Switzerland)로 측정하였으며, 총 산도는 AOAC 방법 (15th ed. Association of Official Analytical Chemists, Washington, DC, USA. p 32-35 (1990))에 의해 복분자 유산발효액 10 mL를 0.1 N NaOH 용액으로 pH 8.3까지 중화시키는데 소비된 0.1 N NaOH의 소비량으로 정의하였고 lactic acid(%, w/w)로 표시하였다.
또한, 당도는 상온에서 hand refractometer (Brix O to 32%, Hand held refractometer N-1a, ATAGO, Japan)를 이용하여 측정하였다.
유산 균수는 발효 원액을 멸균 증류수에 희석하여 MRS 고체배지(Difco)에 도말하여 30℃에서 24∼48시간 배양한 후, 생균수를 측정하였다.
이때, 실험의 양성 대조구인 유산균 표준 균주로서 Lactobacillus plantarum KCCM 12116을 한국종균협회 부설 한국미생물 보존센터에서 분양받아 본 실험의 스타터로 사용된 유산 균주와 비교 하였고, 음성 대조구로서 유산균을 접종하지 않은 복분자 착즙액을 사용하였다.
복분자로부터 분리된 Lactobacillus plantarum GBL16을 이용한 복분자 유산발효 특성을 확인하기 위하여, 발효 기간에 따른 이화학적 특성을 측정한 결과를 하기 표 8에 나타내었다.
상기 표 8에서 보는 바와 같이, 발효 양상은 발효 1일째부터 pH는 감소하고 산도는 증가하였으며, 당도는 서서히 감소하여 발효 완료 후 Lactobacillus plantarum GBL16은 pH 3.20, 산도 2.86%, 당도9.7°Brix를 나타내었고, Lactobacillus plantarum KCCM 12116은 pH 3.20, 산도 2.85%, 당도 9.6°Brix를 나타내었다.
또한, Lactobacillus plantarum GBL16의 균수는 발효 초기 2.2× 108 CFU/mL에서 서서히 증가하여, 발효 3일째 최대치를 나타내었고, 발효 완료 후에 1.8× 1010 CFU/mL을 나타내었다.
Lactobacillus plantarum KCCM 12116의 경우, 발효가 진행됨에 따라 유산균수가 서서히 증가하여 발효 4일째에 2.0× 1011 CFU/mL로 최대치를 나타내었고, 이후 감소하여 발효 완료 후에 1.9× 1011 CFU/mL로 나타났다.
한편, 유산균을 접종하지 않은 복분자 착즙액의 경우 초기 pH는 3.65, 산도 1.37%, 당도 10.4°Brix에서 발효 완료 후에 pH 3.54, 산도 1.39%, 당도 10.3°Brix로 발효전과 크게 차이가 없는 것으로 나타났으며, 유산균은 발효 기간 내내 관찰되지 않았다.
<제조예 1> 유산 발효 음료의 제조
액상과당(0.5%), 올리고당(2%), 설탕(2%), 식염(0.5%), 물(75%)과 같은 부재료와 상기 Lactobacillus plantarum GBL16 균주 5g을 균질하게 배합하여 순간 살균을 하여 유산 발효 음료를 제조하였다.
<제조예 2> 건강식품의 제조
통상의 건강식품 제조방법에 따라, 상기 Lactobacillus plantarum GBL16 균주 1000 ㎎, 비타민 A 아세테이트 70 ㎍, 비타민 E 1.0 ㎎, 비타민 0.13 ㎎, 비타민 B2 0.15 ㎎, 비타민 B6 0.5 ㎎, 비타민 B12 0.2 ㎍, 비타민 C 10 ㎎, 비오틴 10 ㎍, 니코틴산아미드 1.7 ㎎, 엽산 50 ㎍, 판토텐산 칼슘 0.5 ㎎, 무기질 혼합물 적량, 황산제1철 1.75 ㎎, 산화아연 0.82 ㎎, 탄산마그네슘 25.3 ㎎, 제1인산칼륨 15 ㎎, 제2인산칼슘 55 ㎎, 구연산칼륨 90 ㎎, 탄산칼슘 100 ㎎, 염화마그네슘 24.8 ㎎을 혼합한 다음, 과립을 제조하였다:
<제조예 3> 야채 주스의 제조
상기 Lactobacillus plantarum GBL16 균주 5g을 토마토 또는 당근 주스 1,000 ㎖에 가하여 야채 주스를 제조하였다.
<제조예 4> 유산균 발효 유제품의 제조 (1)
우유 100 중량부에 대하여, 상기 Lactobacillus plantarum GBL16 균주를 우유에 첨가하여 유산균 발효 우유를 제조하였다.
<제조예 5> 유산균 발효 유제품의 제조 (2)
상기 제조예 4에서 제조한 상기 유산균 발효 우유를 이용하여 유산균 발효 버터, 요구르트 및 아이스크림을 제조하였다.
이상에서 구체적인 실험예 및 실시예를 들어 본 발명을 상세하게 설명하였으나, 본 발명은 상술한 실험예 및 실시예에 한정되지 않으며, 본 발명의 기술적 사상의 범위 내에서 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 많은 변형이 가능함은 자명할 것이다.
본 발명에 의하면, 복분자로부터 분리한 새로운 유산균으로서, 내산성, 인공 위액에 대한 저항성, 담즙 내성, Staphylococcus aureus에 대한 생육 저해 활성 및 지방 축적의 억제 활성을 갖고, 용혈 독성 및 베타-글루쿠로니데이즈(β-glucuronidase)에 대한 활성을 나타내지 않으며, 복분자 착즙액에서 발효시, 발효 3일째에 최대치의 균수를 나타내고, 발효 5일 후의 pH는 3.0~3.5이며, 산도는 2.8~2.9%이고, 당도는 9~10 °브릭스인 락토바실러스 플란타룸 균주를 이용한 세로운 용도를 제공할 수 있기 때문에, 본 발명이 속하는 기술분야에 유용하게 작용될 수 있다.
<110> Gochang Blackrasberry Institute
<120> Lactobacillus plantarum strain isolated by Rubus occidentalis and
food composition comprising the same
<130> 9964
<160> 2
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer of 518F
<400> 1
ccagcagccg cggtaatacg 20
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer of 800R
<400> 2
taccagggta tctaatcc 18
Claims (8)
- 복분자로부터 분리한 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) GBL16 (KCCM11621P) 균주.
- 제1항에 있어서, 상기 균주는 내산성, pH 2.5로 조정한 0.5% NaCl 용액에 3 mg/mL의 펩신을 첨가한 인공 위액에 대한 저항성, 담즙 내성, Staphylococcus aureus에 대한 생육 저해 활성 및 지방 축적의 억제 활성으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 갖는 것을 특징으로 하는 균주.
- 제1항에 있어서, 상기 균주는 용혈 독성 및 베타-글루쿠로니데이즈(β-glucuronidase)에 대한 활성을 나타내지 않는 것을 특징으로 하는 균주.
- 제1항에 있어서, 상기 균주는 복분자 착즙액에서 발효시, 발효 3일째에 최대치의 균수를 나타내고, 발효 5일 후의 pH는 3.0~3.5이며, 산도는 2.8~2.9%이고, 당도는 9~10 °브릭스인 것을 특징으로 하는 균주.
- 제1항에 있어서, 복분자 열매로부터 분리한 것을 특징으로 하는 균주.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 균주를 포함하는 식품 조성물.
- 제6항에 있어서, 유산 균주 발효 음료인 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
- 제6항에 있어서, 상기 균주는 생균인 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
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| CN107760620A (zh) * | 2017-10-18 | 2018-03-06 | 天津科睿恒生物科技有限公司 | 一株改善易胖体质及子代体重的植物乳杆菌及应用 |
| KR20180081034A (ko) * | 2016-08-19 | 2018-07-13 | 대한민국(농촌진흥청장) | 락토바실러스 플란타룸 kcc-30 및 이를 포함하는 조성물 |
| KR20180081699A (ko) * | 2016-08-19 | 2018-07-17 | 대한민국(농촌진흥청장) | 락토바실러스 플란타룸 kcc-32 및 이를 포함하는 조성물 |
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2014
- 2014-12-22 KR KR1020140186026A patent/KR101697535B1/ko active IP Right Grant
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