KR20180081699A

KR20180081699A - 락토바실러스 플란타룸 kcc-32 및 이를 포함하는 조성물

Info

Publication number: KR20180081699A
Application number: KR1020180078950A
Authority: KR
Inventors: 최기춘; 박형수; 김현섭; 김지혜
Original assignee: 대한민국(농촌진흥청장)
Priority date: 2016-08-19
Filing date: 2018-07-06
Publication date: 2018-07-17
Also published as: KR102457212B1

Abstract

본 발명은 신규한 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 균주 KCC-32(KACC92135P) 및 이를 이용한 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 상기 락토바실러스 플란타룸 KCC-32(KACC92135P)의 지방 생성 억제 활성을 이용하여 생균제로서 다양한 지방 생성 억제용 조성물을 제공하며, 바람직하게 총체보리 사일리지 제조용 미생물 첨가제를 제공한다. 본 발명의 균주를 이용하여 제조된 식물체 사일리지는 가축의 불필요한 지방 생성을 억제할 수 있어 가축의 품질을 높일 수 있다. 또한, 본 발명의 균주는 사일리지 내 유해균의 생장을 억제하여, 효과적인 항균용 조성물로 사용될 수 있다.

Description

락토바실러스 플란타룸 KCC-32 및 이를 포함하는 조성물{Lactobacillus plantarum KCC-32 and composition comprising the same}

본 발명은 신규한 락토바실러스 플란타룸 균주 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 항균 효과 및 지방 생성 억제 활성이 우수한 신규한 락토바실러스 플란타룸 균주 및 이를 이용한 품질이 개선된 사일리지에 관한 것이다.

생균제는 장내 미생물 생장을 유지 및 증진함으로써 숙주의 건강에 유익한 효과를 제공하는 살아있는 미생물이다. 이러한 생균제는 소화를 돕고, 병원균을 억제하며, 항종양 활성과 같은 다양한 생리학적 기능을 한다. 생균제는 항미생물제로 알려져 있으며, 다양한 생균제 균주들은 자연살생세포의 면역 반응 활성을 증진시키는 것으로 보고되었다. 또한 생균제는 위산 내성, 담즙염 내성 및 상피 세포에 부착성을 가지며, 경쟁을 통해 병원균의 결합을 조절한다.

생균제 균주는 발효 식품으로써 이들의 광범위한 용도를 볼 때, 안전한 것으로 알려져 있다. 생균제가 오랫동안 장내에 머무르면서 숙주에 건강상 유익한 효과를 주기 위해서, 생균제의 장 점막에 대한 접착성이 중요한 요소가 될 수 있다. 다양한 생균제 균주 가운데, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)은 장 점막 접착성이 우수한 것으로 알려져 있다. 그러나 장내 접착성은 병원균 박테리아의 병원성 여부에 대한 주요한 요소이며, 장내 점막은 박테리아 접착 및 콜로니화에 중요한 위치이다.

최근 인간의 건강 증진을 위해 생균제에 대한 관심이 증가되었고, 생균제는 염증의 조절, 에너지 대사 및 체중 항상성에 중요한 역할을 한다. 체내 과도한 지방의 축적은 비만 및 심혈관 질환과 같은 질병을 일으킨다. 비만의 발현은 1980 및 2014년 사이에 두배가 되었으며, 비만이 전세계적으로 확산되고 있음이 WHO에 의해 보고되었다. 나아가, 소아 비만은 전세계적으로 문제를 일으키고 있다. 최근 통계에 따르면, 5세 이하의 420만명의 어린이들이 비만인 것으로 보고되었다. 따라서, 식품 또는 사료에 생균제 또는 항균제로써 안전하게 사용할 수 있으면서, 지방 생성 억제 효과를 갖는 신규 미생물을 개발하는 것이 필요한 실정이다.

본 발명은 상기와 같은 기술적 과제를 해결하기 위하여, 신규 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-32(KACC92135P) 균주를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주를 포함하는 지방 생성 억제용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 신규 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-32(KACC92135P) 균주를 포함하는 식물체 사일리지 제조를 위한 미생물 첨가제를 제공한다.

또한, 본 발명은 신규 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-32(KACC92135P) 균주를 포함하는 식물체 사일리지 제조방법을 제공한다.

본 발명의 신규 균주는 지방 생성 억제용 조성물로 제조될 수 있으며, 상기 지방 생성 억제용 조성물은 식품, 화장품, 의약품, 건강식품, 음료 등의 다양한 형태로 이용될 수 있다.

또한, 본 발명은 신규 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-32(KACC92135P) 균주를 포함하는 사료 첨가제를 제공한다.

상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 신규 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-32(KACC92135P) 균주를 제공한다.

상기 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-32(KACC92135P) 균주는 2016년 7월 5일자로 국립농업과학원 농업유전자자원센터에 기탁하였으며, 수탁번호 KACC92135P를 부여받았다.

본 발명의 발명자들은 신규 락토바실러스 플란타룸 KCC-32 균주의 활성을 연구하던 중, KCC-32 균주의 세포외 분비물이 3T3-L1 세포에 지방 세포 분화를 현저하게 억제하는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다. 상기 3T3-L1 세포는 마우스 3T3 세포로부터 유래된 세포 라인으로 섬유아세포와 유사한 형태를 가지며, 적절한 조건 하에 지방 세포와 같은 형태로 분화될 수 있다.

본 발명의 발명자들은 락토바실러스 플란타룸 균주를 동물의 배설물로부터 분리하는 단계; 상기 분리한 락토바실러스 플란타룸 균주의 세포외 분비물의 활성능을 검정하는 단계; 상기 분리한 신규 미생물인 락토바실러스 플란타룸 균주의 동정 단계; 및 상기 분리된 락토바실러스 플란타룸 균주를 이용하여 생균제 특성을 검정하는 단계를 거쳐, 지방 생성 억제 활성이 우수한 신규 미생물인 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-32 (KACC92135P) 균주를 얻었다.

본 발명의 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-32 (KACC92135P) 균주는 3T3-L1 세포의 지방 세포로의 분화를 억제하여 지방 생성 억제 활성을 나타낼 수 있다.

보다 구체적으로, 본 발명에 따른 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) KCC-32 (KACC92135P) 균주 또는 이를 포함하는 지방 생성 억제용 조성물은 PPARγ2, C/EBPα, FAS, 및 아디포넥틴(adiponectin)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 지방 생성 유전자의 발현을 현저하게 억제시킴으로써, 지방 생성을 효과적으로 억제할 수 있다.

상기와 같은 우수한 지방 생성 억제 효과로 인해 상기 균주는 지방 생성 억제용 조성물의 제조에 이용할 수 있으며, 특히, 우수한 생균제 효과로 인해서 다양한 지방 생성 억제용 조성물을 포함하는 식품, 의약품, 화장품, 건강식품 등의 제조에 이용될 수 있다.

본 발명의 지방 생성 억제용 조성물이 포함되는 식품, 의약품, 화장품, 건강식품 등의 제조는 업계에서 일반적으로 실시하는 방법을 통하여 제조될 수 있다.

본 발명의 발명자들은 본 발명의 신규 균주가 독성이 없으면서, 지방 생성 억제 활성이 뛰어나, 우수한 생균제로 이용될 수 있다는 것을 실험을 통해서 밝혀내었다. 본 발명의 균주를 사일리지 제조 시 첨가하고 가축에 급여할 때, 본 발명의 균주의 우수한 지방 생성 억제 활성으로 인해 가축의 불필요한 지방 생성을 억제하여 가축의 품질을 향상시킬 수 있다.

또한, 본 발명은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-32 (KACC92135P) 균주를 포함하는 항균용 조성물을 제공한다. 상기 항균용 조성물은 KCC-32 균주의 항균 효과에 의해 유해균의 생장을 억제시킬 수 있다. 상기 유해균은 후자리움 옥시스포럼(Fusarium Oxysporum), 아스퍼질러스 클라바투스(Aspergillus clavatus), 페니실리움 크리소게눔(Penicillium chrysogenum), 스코풀라리옵시스 브레비카울리스(Scopulariopsis brevicaulis) 및 아스퍼질러스 플라부스(Aspergillus Flavus) 등으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 항균용 조성물은 식품, 화장품, 의약품 또는 사료 등에 사용될 수 있으나, 바람직하게 사료에 사용될 수 있으며, 유해균의 생장을 억제시켜 사료의 품질을 현저하게 향상시킬 수 있다.

또한, 본 발명의 KCC-32 균주를 사일리지에 처리하면 사일리지 내 젖산 및 초산의 함량은 현저하게 증가되며, 그에 따라 pH가 감소되어, KCC-32 균주는 우수한 사료용 젖산균 첨가제로써 활용될 수 있다.

본 발명은 상기 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-32 (KACC92135P) 균주를 포함하는 식물체 사일리지 발효용 미생물 첨가제를 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-32 (KACC92135P) 균주를 포함하는 항균용 미생물 첨가제를 제공한다. 바람직하게 상기 사일리지 발효용 또는 항균용 미생물 첨가제는 사일리지에 사용될 수 있다. 본 발명의 KCC-32 균주는 사일리지에 처리할 경우, 사일리지 내 유해균의 생장을 효과적으로 억제하고 사일리지의 품질을 향상시킬 수 있다.

상기 식물체 사일리지 발효용 미생물 첨가제를 첨가하는 대상이 되는 식물체는, 예를 들어 볏짚, 라이그라스(ryegrass), 총체보리, 총체벼, 호밀 또는 옥수수일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 가축의 사료로 이용될 수 있는 식물체라면 모두 이용될 수 있으나, 바람직하게는 이탈리안 라이그라스 또는 총체보리에 이용할 수 있다.

상기 식물체 사일리지 발효용 또는 항균용 미생물 첨가제는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-32 (KACC92135P) 균주를 포함하는 배양원액, 또는 상기 배양원액의 희석액의 형태로 첨가할 수 있다.

또한 본 발명은 식물체에 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-32 (KACC92135P) 균주를 첨가하는 것을 특징으로 하는 식물체 사일리지 제조방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 식물체 사일리지 제조방법은 당업계에서 사용되는 일반적인 방법으로서, 예를 들어 식물체의 발효를 위한 복수의 발효 단계들을 포함할 수 있다. 상기 복수의 발효 단계들은, 예를 들어 혐기성균인 초산균의 발효 단계 및 이후 젖산균의 발효 단계 등을 포함할 수 있으며, 당업자에 의해 적절한 조건으로 수행될 수 있다.

본 발명은 또한 상기 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-32 (KACC92135P) 균주를 포함하는 사료 첨가제를 제공한다. 본 발명의 사료 첨가제는 업계에서 일반적으로 이용되는 방법으로 제조될 수 있다.

본 발명의 상기 신규 균주는 독성이 없으면서, 지방 생성 억제 활성이 뛰어나, 우수한 생균제로 이용될 수 있고, 이러한 신규 균주는 우수한 지방 생성 억제 활성으로 인해 사료 첨가제로 제조하여 사일리지에 첨가함으로써, 가축의 불필요한 지방 생성을 억제하여 가축의 품질을 향상시킬 수 있다.

또한, 본 발명은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-32(KACC92135P) 균주로부터 분리된 세포외 분비물을 포함하며, 지방 생성 억제 활성을 나타내는 지방 생성 억제용 식품 조성물 또는 화장품 조성물을 제공한다. 상기 식품 조성물 또는 화장품 조성물은 불필요한 지방의 생성을 효과적으로 억제하는 기능성 식품 조성물 또는 화장품 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 락토바실러스 플란타룸 KCC-32는 우수한 지방 생성 억제 활성을 가진다. 본 발명에 따른 상기 균주를 이용하여 다양한 지방 생성 억제용 조성물을 제조할 수 있다. 본 발명의 균주를 이용하여 제조된 식물체 사일리지는 가축의 불필요한 지방 생성을 억제함으로써 가축의 품질과 생산성을 높일 수 있다. 본 발명의 지방 생성 억제용 조성물은 독성이 없어 우수한 생균제 효과를 가지므로, 식품, 의약품, 화장품, 건강식품 등 다양한 형태로 활용될 수 있다. 또한, 본 발명의 균주는 사일리지 내 유해균의 생장을 억제하여, 효과적인 항균용 조성물로 사용될 수 있다.

도 1은 A: KCC-32의 항진균 활성; B: KCC-32의 다양한 pH에 대한 내성; C: KCC-32의 유도된 위액에 대한 내성; D: KCC-32의 담즙염에 대한 내성을 나타낸다. 상기 결과는 3회 반복 ± STD의 평균으로 나타내었다.
도 2는 A: KCC-32의 소수성 분석; B: KCC-32의 자가 응집 분석 결과를 나타낸다. 상기 결과는 3회 반복 ± STD의 평균으로 나타내었다.
도 3은 KCC-32의 발효 산물의 세포독성 분석 결과를 나타낸다. 상기 결과는 3회 반복 ± STD의 평균으로 나타내었다.
도 4는 3T3-L1 지방 세포 내 지방 축적을 20X 배율로 현미경 관찰한 결과이다. A: 대조군 지방세포; B: 250 μg의 FP로 처리한 지방 세포.
도 5는 오일 레드 O 염색된 지방 세포를 20X 배율로 현미경 관찰한 결과이다. A: 대조군 지방 세포; B: 250 μg의 FP로 처리된 지방 세포; C: 지질 염색의 정량. 상기 결과는 3회 반복의 평균 ± SEM으로 나타내었다. 10일째에 대조군 지방 세포 분화와 함께 ^* P<0.05.
도 6은 지방 생성 유전자의 일반 및 Real time PCR 발현 분석이다; A:PPARμ; B: C/EBPα; C: FAS; D:Adiponectin. 상기 결과는 3회 반복의 평균 ± SEM으로 나타내었다. 10일째에 대조군 지방 세포 분화와 함께 ^* P<0.05.
도 7은 A: 대조군 지방 세포; B: 트로글리타존(5μM)으로 처리된 지방 세포; C: FP(250μg/ml)으로 처리된 지방 세포; D: PPARγ의 Real-time PCR 발현 분석 비교 결과를 나타낸다. 상기 결과는 3회 반복의 평균 ± SEM으로 나타내었다. 10일째에 대조군 지방 세포 분화와 함께 ^* P<0.05.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

실험 방법

샘플의 수집

동물 분변 샘플을 대한민국, 천안에서 수집하였다. 샘플의 1 그램을 멸균수를 사용하여 계열 희석하였다. 샘플을 패트리디쉬의 MRS 배지에 따르고, 플레이트를 24-48시간 동안 37℃에서 배양하였다. 분리물을 무작위적으로 선택하고 항균 및 생균제 스크리닝을 수행하였다. KCC-32로 명명된 단일 균주는 항균제 및 생균제 특성을 나타내었으며, 추가적인 실험을 위해 사용되었다.

생화학 및 생리학적 분석

락토바실러스 KCC-32 균주를 하룻밤 배양한 후, 생화학 및 생리학적 특성을 분석하기 위해 사용하였다. 발효성 산의 정량을 위해 메가자임 분석 키트(Bray, Co. WIcklow, Ireland)를 사용하였다. 탄수화물 발효 및 효소 생산의 분석을 위해 API 50 CH 및 API-ZYM 키트(Marcy-I’ Etoile, France)를 사용하였다.

KCC-32의 항균성 실험 및 항진균 분석

항균성 스크리닝은 Valan Arasu M et al에서 설명된 디스크 확산법을 통해 수행하였다. Fusarium Oxysporum, Aspergillus clavatus, Penicillium chrysogenum, Scopulariopsis brevicaulis 및 Aspergillus Flavus와 같은 진균 균주는 대한민국, 전주의 KACC로부터 수득하였다. 항진균 스크리닝은 Ilavenil et al에 약간 변형된 미세희석법을 통해 수행하였다.

16s rRNA 시퀀싱 및 유전자 은행 기탁

16s rRNA 유전자 시퀀싱은 솔젠트사(Solgent Co)에서 수행하였다. 락토바실러스 KCC-32의 유전체 DNA는 QIAquick® 키트(Qiagen Ltd., Crawley, UK)를 사용하여 분리 및 정제하였다. 앰플리콘은 공통 프라이머 27 F(5’ AGA GTT TGA TCG TGG CTC AG 3’) 및 1492 R(3’ GCT TAC CTT GTT ACG ACT T 5’)을 사용하여 분석하였다. LAB KCC-32의 정렬된 16s rRNA 서열은 NCBI 유전자 은행의 데이터베이스로 BLAST 분석하였다. 수득한 KCC-32의 16s rRNA 서열은 NCBI 유전자 은행에 기탁번호 KP091748.1로 기탁하였다.

KCC-32의 프로바이오틱 분석 방법

낮은 pH에 대한 내성 분석 방법

락토바실러스 KCC-32의 낮은 pH에 대한 내성은 Tambekar and Bhutada에서 설명된 방법을 통해 실험하였다. 자극된 위액에 대한 KCC-32 균주의 내성은 Charteris WP et al에 설명된 방법을 통해 실험하였다.

담즙 내성 분석 방법

KCC-32의 신선 배양물은 0.5% 소듐 디옥시콜레이트 및 0.3% 우담(oxgall) (DCA Sigma, St Louis, MO, USA)과 같은 담즙염을 포함하는 멸균된 MRS 배지로 접종하고 37℃에서 배양하였다. 부분 표본은 다른 시간 간격(24 및 48 시간)으로 수집하였고 흡광도는 600 nm에서 측정하였다. 담즙염 배지가 없는 MRS 배지는 대조군으로 사용되었다. 실험 결과는 대조군에 비해 담즙염의 존재에서, 600 nm에서 광학 밀도로 측정된 박테리아의 성장 백분율로 나타내었다.

자가 응집 및 소수성 분석 방법

상호작용 표면을 갖는 세포막의 응집은 Del Re et al에 약간의 변형을 통해 실험되었다. KCC-32 및 CB의 소수성은 Rosenberg et al 1980에 의해 설명된 방법을 통해 분석되었다. 자가 응집은 하기 방정식에 따라 계산됨:

1-(At/A0) x 100,

상기 At는 시간 t=1, 2 또는 3에서 흡광도, A0는 t=0일 때 흡광도를 나타냄.

소수성은 하기 식을 사용하여 계산됨:

소수성% = (OD초기-OD최종)/OD초기 X 100

지방 세포 분화 실험 방법

무세포 상청액의 제조 방법

락토바실러스 KCC-32를 48시간 동안 37℃에서 MRS 배지에 배양하고, 세포 외 이차 대사물질 생산을 위해 충분한 시간을 제공하였다. 이후, 배양된 박테리아 세포를 15분 동안 5000 g에서 원심분리하였고; 상청액 내 상기 박테리아 균주를 0.22 μm 박테리아 필터를 사용하여 제거하였다. 무세포 상청액을 동결 건조한 후, 여러가지 농도(200 μg, 500 μg, 1 mg, 2 mg 및 3 mg/ ml)를 3T3-L1 세포에 대한 추가적인 실험을 위해 제조하였다.

3T3-L1 지방 세포의 배양 방법

마우스 3T3-L1 전구 지방 세포를 American Type Culture Collection (ATCC, USA)으로부터 수득하였다. 추가적인 단계는 Choi et al. 2007에 설명된 프로토콜에 약간의 변형을 가하여 수행되었다. 3T3-L1 전구 지방 세포를 3 x 10⁴세포/웰의 농도로 6개의 웰 플레이트에 놓았다. 지방 세포 분화는 100% 융합(confluence)이 달성된 이후에(즉 3일 후) 시작되었다. 10% 소태아 혈청(FBS), 0.5 mM 3-이소부틸-1-메틸잔틴(IBMX), 0.25 μM 덱사메타손, 및 1 μg/ml 인슐린을 포함하는 DMEM 배지를 지방 세포 분화의 유도를 위해 사용하였다. 48시간 이후 배지를 10% (FBS) 및 1 μg/ml 인슐린만으로 다시 변경하였다. 48시간 이후 배지를 10% FBS만을 포함하는 것으로 다시 변경하였다. 지방 세포 생성의 FECS의 역할을 밝히기 위해, 10% FBS를 포함하는 전구 지방 세포를 수용한 DMEM 배지를 실험 기간(10일)의 종료까지 매 48시간마다 FECS의 다른 농도(250 μg, 500 μg, 1 mg, 2 mg 및 3 mg/ ml)로 혼합하였다.

세포 증식 분석 방법

세포 증식의 분석에 수용성 테트라졸리움(Water soluble tetrazolium, WST); 2(2-메톡시-4-니트로페닐)-3(-니트로페닐)-5-(2,4-디설포페닐)-2-H-테트라졸리움 모노소듐염(2(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3(-nitrophenyl)-5-(2, 4-disulfophenyl)-2-H-tetrazolium monosodium salt)을 사용하였다. 전구 지방 세포를 96 웰 내 1x10⁵ 세포/웰의 밀도로 시드하였다. 3T3-L1 세포는 KCC-32의 동결 건조된 세포 외 분비물(FECS)의 다양한 농도(250 μg, 500 μg, 1 mg, 2 mg 및 3 mg/ml)로 처리하였다. 이후, 96 웰 플레이트는 24시간 동안 5% CO₂ 농도에서 37℃로 유지된 CO₂ 배양기 내 저장하였다. 배양 이후, 배양물은 WST 시약으로 처리하였고 2-4 시간 동안 배양하였다. 그 다음 세포 생존은 스펙트럼 카운트 ELISA 리더기를 사용하여 450 nm에서 측정하였다.

지방 정량을 위한 오일 레드 염색 방법

KCC-32 FP(250 μg/ml, 10일째)와 함께 지방 세포 분화 이후, 세포를 1시간 동안 10% 포르말린으로 고정하였고 이후 60% 이소프로판올과 함께 두 번 알콜 세척하였다. 이후 0.35% 오일 레드 O를 사용하여 세포를 실온에서 10분간 염색하였고 증류수로 두 번 세척하였다. 염색된 세포는 EVOS® XL 현미경을 사용하여 사진을 찍었다. 추가로, 오일 레드 염색은 100% 이소프로판올을 사용하여 지방 세포로부터 제거하였고 490 nm의 광학 밀도에서 정량하였다.

지방 생성 전사 인자의 qPCR 측정 방법

전체 RNA는 RNA 지방 조직 미니 키트(Qiagen, USA)를 사용하여 추출하였다. 이후 RNA를 UVS-99 마이크로 볼륨 UV/Vis 분광 광도계-ACT 유전자를 사용하여 정량하였다. 이후 cDNA는 제조자의 지시(Superscript III RT-PCR을 위한 첫 번째 가닥 합성 시스템-Invitrogen Life Technology)에 따라 합성되었다. qPCR 실험은 ABI 7500 Real-Time PCR 시스템을 사용하여 수행하였다. 특정한 유전자의 발현은 SYBR 그린 real-time PCR 마스터 믹스를 사용하여 결정하였다. 이후, 20μl 반응물은 10μl SYBR green (Applied biosystems, Foster City, CA), 1μl cDNA, 1 μl 10 pmole 포워드(FP) 및 리버스 프라이머(RP)를 포함한다. 각각의 프라이머는 하기와 같다. PPARγ2-FP: gtgctccagaagatgacagac; RP: ggtgggactttcctgctaa, C/EBPα- FP: gcaggaggaagatacaggaag; RP: acagactcaaatcccaaca, Adiponectin- FP: ccgttctcttcacctacgac; RP: tccccatccccatacac, FAS- FP: cccagcccataagagttaca; RP: atcgggaagtcagcacaa. 일반적인 PCR (Gene Amp PCR system 9700)은 Maxime PCR mix kit (i-Taq) 제조자의 프로토콜에 약간의 변형을 가하여 수행되었다. 프로토콜은 94℃에서 5분, 45초 동안 95℃, 45초 동안 57-59℃, 1분 동안 72℃의 29-35 사이클, 5분 동안 72℃ 및 4℃에서 유지하였다. 최종적으로 PCR 증폭된 생산물을 1.2% 아가로스 겔에서 용해시키고, DNA는 세이프 뷰 핵산 염색(ABM- applied biological Material)을 사용하여 확인하였다. DNA 발현은 GADPH 전사 신호에 대하여 일반화하였다.

통계적 분석 방법

모든 수치 데이터는 세 번의 독립적인 실험을 통해 수득하였다. 실험 결과는 평균(mean) ± 평균의 표준오차(SEM)로 나타내었다. 대조군 및 실험군 지방 세포 사이의 통계적 차이를 변량 분석(one ANOVA)를 포함하는 SPS/16 소프트웨어 가설 실험 방법을 통해 분석하였다. 0.05 미만의 현저한 실험값의 차이를 통계적인 현저성을 나타내는 것으로 고려하였다.

실험 결과

동정 및 분자적 특성

본 실험에서 총 15가지 박테리아 균주를 동물 분변으로부터 분리하였다. 이들 분리된 균주들 가운데, 하나의 균주가 모든 실험된 곰팡이에 대한 항진균 효과를 나타내었으며, 상기 균주를 KCC-32로 명명하였다. KCC-32 균주의 16srRNA를 시퀀싱하였고, 서열 정보는 NCBI 데이터베이스를 사용하여 비교하였다. 블라스트(BLAST) 결과는 동정된 락토바실러스 KCC-32 균주가 다른 L.plantarum 균주와 99% 이상의 상동성을 보였다. 상기 16srRNA 서열은 기탁번호 KP091748.1로 NCBI 유전자은행 데이터베이스에 기탁하였다.

생리학적 및 생화학적 특성

동정된 KCC-32 균주에 대하여 다양한 생화학 및 생균제 실험을 수행하였다. KCC-32 균주를 48시간 동안 배양한 후, 배양물을 현미경으로 관찰하였다. KCC-32 균주는 크림색이며, 막대형 및 그람 양성이다. KCC-32 균주는 다양한 탄수화물을 발효시키는 것으로 나타났다(표 1). 또한, KCC-32 균주는 다양한 세포 내 외 효소를 생산하는 것으로 나타났다(표 2).

번호	탄수화물 명칭	KCC-32
1	Glycerol	-
2	Erythritol	+
3	D-Arabinose	+
4	L-Arabinose	+
5	D-Ribose	+
6	D-Xylose	+
7	L-Xylose	+
8	D-Adonitol	-
9	Methyl-βD-Xylopyranoside	-
10	D-Galactose	-
11	D-Glucose	+
12	D-Fructose	+
13	D-Mannose	-
14	L-Sorbose	+
15	L-Rhamnose	+
16	Dulcitol	+
17	Inositol	+
18	D-Mannitol	+
19	D-Sorbitol	+
20	Methyl-αD-Mannopyranoside	+
21	Methyl-αD-Glucopyranoside	+
22	N-Acetylglucosamine	-
23	Amygdalin	+
24	Arbutin	-
25	Esculinferric citrate	+
26	Salicin	+
27	D-Cellobiose	+
28	D-Maltose	-
29	D-Lactose	+
30	D-Melibiose	+
31	D-Saccharose	-
32	D-Trehalose	+
33	Inulin	+
34	D-Melezitose	+
35	D-Raffinose	+
36	Amidon	-
37	Glycogen	+
38	Xylitol	+
39	Gentiobiose	+
40	D-Turanose	+
41	D-Lyxose	+
42	D-Tagatose	+
43	D-Fucose	-
44	L-Fucose	-
45	D-Arabitol	-
46	L-Arabitol	-
47	Potassium gluconate	+
48	Potassium2-keto gluconate	-
49	potassium 5-keto gluconate	+

+: 양성 반응, -: 음성 반응

	세포외 효소	KCC-32
1	Alkaline phosphatase	++
2	Esterase (C₄)	++
3	Esterase lipase (C₈)	+++
4	Lipase (C₁₄)	++
5	Leucine arylamidase	+++
6	Valine arylamidase	++
7	Cystine arylamidase	++
8	Trypsin	++
9	-Chymotrypsin	+++
10	Acid phosphatase	+
11	Naphthol-AS-biphosphohydrolase	++
12	-Galactosidase	+
13	-Galactosidase	++
14	-Glucuronidase	+++
15	-Glucosidase	++
16	-Glucosidase	++
17	N-Acetyl--glucosaminidase	++
18	-Mannosidase	++
19	-Fucosidase	++

+: 약한 생산, ++: 보통 생산, +++: 강한 생산

항생제 내성 및 항균 효과 실험

락토바실러스 KCC-32 균주는 카나마이신 및 클로람페니콜 등과 같은 실험된 일반적인 항생제에 감수성을 보였다(표 3). KCC-32의 발효 산물은 젖산, 아세트산 및 숙신산 각각에 대하여 최대 생성량으로 측정하였다(표 4). KCC-32 균주는 Fusarium Oxysporum, Aspergillus clavatus , Penicillium chrysogenum , Scopulariopsis brevicaulis 및 Aspergillus Flavus와 같은 독소 생성 곰팡이에 대한 억제 활성을 보였다(도 1A).

번호	항생제 명칭	농도 (μg)	KCC-32
1	Chloramphenicol (C)	50	S
2	Kanamycin (K)	30	S
3	Nitrofurantoin (NIT)	50	R
4	Tetracycline (TE)	100	S
5	Streptomycin (S)	25	S
6	Sulphafurazole (SF)	300	S
7	Colistin methane sulphonate (CL)	100	R
8	Dicloxacillin (D/C)	1	R
9	Ampicillin (AMP)	10	S
10	Amikacin (AK)	30	S
11	Gentamicin (GEN)	10	S
12	Cefoxitin (CX)	30	R
13	Cefalexin (CN)	30	S
14	Cefuroxime (CXM)	30	S
15	Co-Trimoxazole (COT)	25	R

< 8mm: 보통(Moderate)=M, > 10mm: 감수성(Susceptibility)=S, R=내성(Resistant)

산	농도 (μg/ml)
젖산	127.23±1.25
초산	28.3±1.04
숙신산	7.29±1.08

낮은 pH 및 담즙염에 대한 KCC-32 균주의 생장 능력

낮은 pH 또는 담즙염과 같은 장관 내 환경에서 KCC-32의 생존 능력을 실험하였다. 실험 결과, KCC-32 균주는 낮은 pH에서 생존할 수 있었으며(도 1B), pH 2 및 3의 위액 스트레스에서도 내성을 가지는 것으로 나타났다(도 1C). pH 2 미만으로 생존 세포는 발견되지 않았다. 또한, KCC-32 균주는 우담(0.3%) 및 소듐디옥시콜레이트(0.5%)와 같은 독성 담즙염에 대한 내성을 보였다(도 1D).

KCC-32 균주의 자가 응집 및 세포 표면 소수성 분석

자가 응집 및 소수성 실험은 장 내 콜로니를 형성하는 박테리아 균주의 능력을 결정하기 위해 수행되었다. 본 실험에서 KCC-32 균주는 강한 자가 응집 활성을 보였고, 시간이 흐름에 따라 자가 응집 속도가 증가하였다(도 2A). 세포 표면 소수성 실험은 클로로폼 및 자일렌을 사용하여 수행하였다. 실험 결과는 KCC-32 균주가 59.07%의 자일렌에 대한 강한 소수성을 나타내었다(도 2B).

3T3-L1 지방 세포(adipocyte) 분화에 FP의 효과 분석

지방 세포를 24시간 동안 KCC-32의 FP의 다양한 농도(250μg, 500μg, 1mg, 2mg, 3mg/ml)로 처리하였다. KCC-32의 FP는 일반 대조군 지방 세포에 비해 250 μg/ml의 초기 농도에서 지방 세포의 증식을 현저하게 감소시켰고, 3 mg/ml의 최대 농도까지 세포 생장이 계속되었다(도 3). 지방 세포 증식 분석에 기초하여, 250 μg/ml의 농도를 추가적인 실험을 위해 선택하였다.

지방 세포 지방 축적에 KCC-32의 Fp의 역할

KCC-32의 FP(250 μg/ml)로 처리된 지방 세포는 대조군 지방 세포에 비해 적은 수의 지질 방울(lipid droplets)을 보였다(도 4A-B). 오일 레드 O로 염색된 지방 세포는 지방 세포 분화 10일째 대조군 지방 세포에 비해 FP 처리된 지방 세포 내 염색된 지방 세포의 수가 감소된 것으로 나타났다(도 5A-B). 본 실험은 지방 세포의 세포질 영역 내 지방 축적의 억제와 관련된다. 또한, 100% 이소프로파놀에 의한 지방 측정 결과는 ES 처리된 지방 세포 내 지질의 축적이 억제되는 것으로 나타났다(도 5C).

지방 세포 유전자 발현의 qPCR 발현 분석

지방 세포 분화뿐만 아니라 지방 축적에 포함된 지방 형성 유전자의 mRNA 발현 프로파일은 분화 10일째 대조군 및 KCC-32의 FP로 처리된 지방 세포로 분석하였다. PPARγ2, C/EBPα를 포함하는 지방 형성 유전자는 일반 지방 세포에 비해 KCC-32의 FP가 처리된 지방 세포에서 현저하게 하향 조절되는 것으로 나타났다(도 6A-B). 주요한 지방 형성 유전자 발현의 하향 조절은 FAS 및 아디포넥틴을 포함하는 지방 형성 유전자의 발현을 현저하게 하향 조절한다(도 6C-D). 각각 유전자에 대 일반 PCR 분석 결과는 real-time PCR의 결과와 일치하였다. 일반 PCR의 결과는 각 유전자에 대한 도면의 상단부에 나타내었다(도 6A-D). 또한, KCC-32의 FP로 처리된 지방 세포는 지방 세포 분화의 10일째 트로글리타존(troglitazone)(5 μM)에 대하여 PPARγ을 처리한 지방 세포에 비해, PPARγ 발현을 현저하게 억제시키는 것으로 나타났다. 마찬가지로, 오일 레드 염색은 FP 처리된 지방 세포에 비해 트로글리타존 처리된 지방 세포에서 지질 방울을 현저하게 증가시키는 것으로 나타났다(도 7A-D). 이러한 결과들은 KCC-32의 FP가 3T3-L1 지방 세포에서 지방 분화를 효과적으로 억제하는 것을 가리킨다.

KCC-32 균주 처리 시 사일리지의 pH 및 유기산 함량의 변화 측정

락토바실러스 KCC-32 균주를 이탈리안 라이그라스 사일리지에 처리할 때, pH 및 유기산의 함량을 대조군과 비교하여 하기 표 5에 나타내었다.

처리군	pH	젖산 (DM¹⁾%)	초산 (DM%)	부틸산 (DM%)	Flieg′s score
대조군	4.82	3.106	0.327	0.971	58
L. Plantarun KCC-32	3.85	4.891	0.417	0.061	88

¹⁾DM: Dry matter

상기 표 5에 나타난 결과를 볼 때, 대조군(무접종구)에 비해 KCC-32 접종구는 사일리지 내 pH가 현저하게 감소되었으며, 젖산의 함량은 현저하게 증가하였다. 또한 KCC-32 접종구에서 사일리지 내 초산 함량이 증가하였으며, 부틸산의 함량은 감소하였다. 상기 실험군의 이탈리안 라이그라스 사일리지의 등급을 평가할 때, 무접종구의 등급은 보통인 반면, KCC-32 처리구의 등급은 우수로 향상되었다. 이러한 결과로부터, KCC-32 균주는 사일리지 제조 시 우수한 젖산균 첨가제로써 활용 가능성이 있는 것으로 확인되었다.

[참고문헌]

1. Ilavenil S, Vijayakumar M, Kim DH, Valan Arasu M, Park HS, Ravikumar S, Choi KC. Assessment of probiotic, antifungal and cholesterol lowering properties of Pediococcus pentosaceus KCC-23 isolated from Italian ryegrass. J Sci Food Agric2016; 96(2):593-601.

2. Valan Arasu M, Jung W, Ilavenil S, Jane M, Kim DH, Lee KD, et al. Isolation and characterization of antifungal compound from Lactobacillus plantarum KCC-10 from forage silage with potential beneficial properties. J Appl Microbiol2013; 15 (5):11721185.

3. Tambekar DH. and Bhutada SA. Studies on antimicrobial activity and characteristics of bacteriocins produced by Lactobacillus strains isolated from milk of domestic animals. Int. J. Microbiol2010; 8 (2):1-6.

4. Charteris WP, Kelly PM, Morelli L, Collins JK. Development and application of an in-vitro methodology to determine the transit tolerance of potentially probiotic Lactobacillusand Bifidobacterium species in the upper human gastrointestinal tract. J. Appl. Microbiol1998; 84 (5):759-768.

5. Del Re B, Sgorbati B, Miglioli M, Palenzona D. Adhesion, auto-aggregation and hydrophobicity of 13 strains of Bifidobacterium longum. Lett. Appl. Microbiol 2000; 31(6): 438-442.

6. Rosenberg M, Gutnic, D, Rosenberg E. Adherence of bacteria to hydrocarbons: a simple method for measuring cell surface hydrophobicity. FEMS Microbiol. Lett 1980; 9(1):29-33.

7. Choi KC, Lee SY, Yoo HJ, Ryu OH, Lee KW, Kim SM, Baik SH, Choi KM. Effect of PPAR-delta agonist on the expression of visfatin, adiponectin, and resistin in rat adipose tissue and 3T3-L1 adipocytes. Biochem Biophys Res Commun 2007; 357 (1):62-67.

농업생명공학연구원

KACC92135P

20160705

Claims

락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-32(KACC92135P) 균주를 포함하는 지방 생성 억제용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 PPARγ2, C/EBPα, FAS, 및 아디포넥틴으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 지방 생성 유전자의 발현을 억제시키는 것을 특징으로 하는 지방 생성 억제용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 3T3-L1 세포가 지방 세포로 분화되는 것을 억제하는 것을 특징으로 하는 지방 생성 억제용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 식품 조성물, 화장품 조성물 또는 약학 조성물의 제조에 이용되는 것을 특징으로 하는 지방 생성 억제용 조성물.
락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-32(KACC92135P) 균주를 포함하며,
후자리움 옥시스포럼(Fusarium Oxysporum), 아스퍼질러스 클라바투스(Aspergillus clavatus), 페니실리움 크리소게눔(Penicillium chrysogenum), 스코풀라리옵시스 브레비카울리스(Scopulariopsis brevicaulis) 및 아스퍼질러스 플라부스(Aspergillus Flavus)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 병원균에 대한 항균용 조성물.
락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-32(KACC92135P) 균주를 포함하는 사료용 조성물.
락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-32(KACC92135P) 균주를 포함하는 사일리지 발효용 미생물 첨가제.
락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-32(KACC92135P) 균주의 배양액을 식물체의 발효 단계에 첨가하는 것을 특징으로 하는 사일리지 제조방법.
제8항에 있어서, 상기 사일리지는 총체보리 또는 이탈리안 라이그라스 사일리지인 것을 특징으로 하는 사일리지 제조방법.
락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-32(KACC92135P) 균주를 포함하는 지방 생성 억제용 식품 조성물.
락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-32(KACC92135P) 균주를 포함하는 지방 생성 억제용 화장품 조성물.