KR20080110447A

KR20080110447A - 인간의 모유에서 분리한 프로바이오틱 활성 및 체중 증가억제 효과를 갖는 유산균

Info

Publication number: KR20080110447A
Application number: KR1020077011080A
Authority: KR
Inventors: 강지희; 유병일; 윤성일; 박한오
Original assignee: (주)바이오니아
Priority date: 2006-08-04
Filing date: 2007-05-14
Publication date: 2008-12-18
Also published as: EP2046943A1; EP2046943B1; USRE46912E1; JP5081242B2; WO2008016214A1; CN101541947A; US8309076B2; DK2046943T3; EP2046943A4; JP2009545311A; KR101108428B1; CN101541947B; US20100203025A1; USRE48652E1

Abstract

본 발명은 인간의 모유로부터 분리한 유산균에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 한국 여성의 모유에서 분리되고, 내산성, 내담즙성 및 항균활성등의 프로바이오틱 활성과 체중증가 억제 효과를 갖는 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) BNR17 균주에 관한 것이다. 본 발명의 락토바실러스 가세리 BNR17은 내산성, 내담즙성 및 장세포에 대한 부착활성과 세균성 미생물에 대한 높은 항균활성을 가지며, 인간이 섭취하는 음식물 중의 단당류 성분을 소화효소가 분해할 수 없는 다당류로 합성하여 체외로 배출시킴으로써 체중증가 억제 효과를 가진다. 이러한 여러 가지 유익한 기능으로 인해 본 발명 균주는 발효유 및 다양한 발효 제품, 동물의 사료 첨가제뿐만 아니라, 체중 증가를 방지하기 위한 생균제제 및 식품보조첨가제로도 유용하게 사용될 수 있다.

Description

인간의 모유에서 분리한 프로바이오틱 활성 및 체중 증가 억제 효과를 갖는 유산균{LACTIC ACID BACTERIA ISOLATED FROM MOTHER'S MILK WITH PROBIOTIC ACTIVITY AND INHIBITORY ACTIVITY AGAINST BODY WEIGHT AUGMENTATION}

본 발명은 프로바이오틱 유산균에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 인간의 모유에서 분리된 것으로서 내산성 및 내담즙성, 항균력 등의 프로바이오틱 활성이 뛰어나며, 체중 증가 억제 효과를 나타내는 락토바실러스 속의 신규한 유산균에 관한 것이다.

유산균은 인간과 그 역사를 함께 해 왔으며, 인간의 건강에 매우 유익한 영향을 미치는 미생물로써 그 유용성이 날로 증가하고 있다. 최근에는 유산균에 대한 연구가 활발히 진행되어 일반 식품뿐만 아니라 건강식품 및 약품으로써 개발되는 등 그 응용범위가 넓어지고 있다. 유산균에 속하는 세균들로는 스트렙토코커스(Streptococcus)속, 페디오코커스(Pediococcus) 속, 류코노스톡(Leuconostoc) 속, 락토바실러스(Lactobacillus) 속, 스포로락토바실러스(Sporolactobacillus) 속 및 비피도박테리움(Bifidobacterium) 속의 미생물 등이 있다.

이러한 유산균들은 동물의 장내에 서식하면서 동물이 섭취한 영양분 및 섬유소 등을 분해시켜 에너지원으로 사용하고, 젖산 및 항생물질 등을 생산하여 장내 유해균의 발육을 억제함으로써 장내 건강유지에 중요한 역할을 한다. 또한, 유산균은 동물의 성장촉진 및 사료 이용율 개선, 병에 대한 저항력증가, 유해세균의 증식억제, 폐사율 감소, 부패 독성물질의 생성 억제 및 각종 비타민 생성에도 이용되고 있다.

그러나, 상기와 같은 효능을 발휘하려면 외부로부터 유입되는 유산균이 아무런 장애없이 장내에 도달하여 장의 점막에 부착된 후, 그 기능을 나타내어야 한다. 그러기 위해서는 직접 장에 부착될 수 있는 균주여야 하고, 경구 투여시 위산에 의한 파괴가 적어야 하며, 담즙산에 대한 내성이 강해야 하고, 병원균에 대한 항균 능력이 강해야 하는 등의 조건을 기본적으로 충족시킬 수 있어야 한다.

또한, 인간을 위한 식품이나 의약품에 사용될 유산균의 경우 그 분리원이 인간일 경우 효과가 가장 잘 나타날 수 있으며, 특히 여성의 모유로부터 분리된 유산균은 그 효능이 보다 광범위하며 안전성 또한 높은 것으로 평가받고 있다. 그러나, 지금까지 발견된 인간 유래 유산균들은 대부분 성인의 분변이나 모유를 먹고 자라는 신생아의 분변으로부터 분리된 것으로서, 모유에서 분리된 유산균들도 락토바실러스 루테리 종이 대부분이고, 다른 종에 속하는 유산균들은 거의 보고된 바가 없다.

한편, 비만은 원인이 정확하게 밝혀지지 않은 여러 가지 요인들에 의해 복합적으로 발생하는 만성적인 질환으로써, 고혈압, 당뇨, 심혈관 질환, 담석, 골관절염, 수면무호흡증, 호흡장애, 전립선암, 유방암, 대장암 등을 유발하는 요인으로 작용할 수 있다. 이러한 비만의 예방 또는 치료방법으로는 크게 식이-운동요법, 수 술요법, 약물요법이 있다. 식이-운동 요법은 저칼로리-저지방 섭취와 산소를 소비하는 육체 활동을 통한 치료 방법인데, 이는 인내심을 가지고 반복적, 지속적으로 수행하여야 하기 때문에 대중적인 효과를 보기는 어렵다. 수술요법은 외과적 수술을 통해 체지방을 물리적으로 제거하는 방법으로서 단기간에 효과를 볼 수 있는 장점이 있지만 수술을 해야 하는 점, 효과의 지속성이 없다는 점, 비용이 많이 든다는 점 등으로 인해 제한적으로 활용되고 있다. 약물요법은 여러 가지 부작용을 야기시키킬 수 있기 때문에 사용상 주의가 요구된다.

최근 유산균이 생산하는 다당류에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 유산균이 세포외 다당류를 만드는 기작은 아주 복잡한 것으로 알려져 있으며, 유산균종에 따라 그 생산량과 구조에도 많은 차이를 보인다. 유산균이 생산하는 다당류는 항암효과, 면역증진효과 등이 있음이 보고되어 있으며 (Kitazawa, H. Int. J. Food Microbiol., 1998. 40. 169-175, Hosono, A. Biosci. Biotechnol. Biochem., 1997. 61. 312-316, Chabot, S. Lait. 2001. 81. 683-697), GRAS (Generally Recognized As Safe)로 분류되는 유산균의 특성상 이 유산균이 생산하는 다당류 또한 섭취시 안전할 것으로 여겨진다.

기술적 과제

본 발명은 인간의 모유로부터 분리된 유산균에 관한 것으로서, 산성 pH 및 담즙산에 대한 저항성과 장부착능이 강하여 장내에 서식하면서 소화 효소에 의해 분해된 저당류 탄수화물을 체내로 흡수되지 않는 고분자 다당물질로 전환시켜 배출시키므로써 체중 증가 억제 효과 등을 나타낼 수 있는 유산균을 제공하는 것을 목적으로 한다.

기술적 해결방법

본 발명은 인간의 모유에서 분리한 유산균인 락토바실러스 가세리 BNR17을 제공한다.

본 발명의 유산균 균주는 하기와 같은 균학적 특성을 갖는다.

① 균의 형태 - 락토바실리 엠알에스(Lactobacilli MRS) 한천평판배지에서 37℃, 24시간 배양했을 때의 형태:

. 균집락(colony)의 형태, 크기 및 색조: 원형, 0.5 ㎜×2 ㎜, 유백색, 표면 원활.

. 그람(Gram) 염색: 양성.

. 균의 형태: 막대형(간균).

. 포자 형성능: 없음.

. 운동성: 없음.

② 생리적 성질

. 생육온도범위: 25∼45℃

. 생육 pH 범위: pH 4.0∼10.0

. 최적생육온도: 37∼40℃

. 최적생육pH: pH 6.0∼8.0

③ 산소의 영향: 통성혐기성.

④ 당이용성 :

글리세롤(Glycerol) -, 리보오즈(Ribose) -, 아도니톨(Adonitol) -,

갈락토즈(Galactose) +, D-글루코즈(Glucose) +, D-프럭토즈(Fructose) +,

D-만노즈(Mannose) +, 만니톨(Mannitol) -, 솔비톨(Sorbitol) -,

N-아세틸글루코사이드(Acetylglucoside) +, 에스쿨린(Esculin) +,

살리신(Salicin) +, 셀로비오즈(Cellobiose) +, 말토즈(Maltose) +,

락토즈(Lactose) +, 멜리비오즈(Melibiose) -, 사카로즈(Saccharose) +,

트레할로즈(Trehalose) +, 이눌린(Inulin) -, 멜레지토즈(Melezitose) -,

라피노즈(Raffinose) -, 전분(Starch) -, β-젠티오비오즈(Gentiobiose) -,

D-트라노즈(Turanose) +, D-타가토즈(Tagatose) +

⑤ 내산성: pH 2.0에서 생존.

⑥ 내담즙성: 0.3％의 담즙 농도에서 생존.

⑦ 장내부착능: 인체 장상피세포인 Caco-2 세포주에 부착.

⑧ 항생제 내성: 젠타마이신(Gentamicin), 카나마이신(Kanamycin), 스트렙토마이신(Streptomycin), 바시트라신(Bacitracin), 네오마이신(Neomycin), 날리딕산 (Nalidixic acid), 시프로플록삭신 (Ciprofloxacin), 폴리믹신 B (Polymixcin B), 트리메토프림 (Trimethoprim)에 대해 내성.

에리스로마이신(Erythromycin), 페니실린(Penicillin), 테트라사이클린(Tetracycline), 암피실린(Ampicillin), 클로람페니콜(Chloramphenicol), 반코마이신(Vancomycin), 세폭시틴 (Cefoxitin), 리팜핀 (Rifampin)에 대해 감수성.

⑨ 병원성 세균에 대한 항균성 대장균(E. coli), 황색포도상구균(S. aureus), 살모넬라균(S. typhimurium), 바실러스균(B. cereus), 리스테리아균(L. monocytogenes), 프로테우스균(P. mirabilis)에 대해 항균성 가짐.

⑩ 항균성 펩타이드의 존재: 유산균의 항균성 펩타이드 성분인 박테리오신 중 가세리신(gassericin) T에 해당하는 유전자가 중합효소연쇄반응(PCR)에 의해 검출됨.

다당류의 생성: 본 발명의 유산균은 글루코즈가 2％ 함유되어 있는 MRS 배지에서 배양 24시간째에 약 520 mg/L의 다당류 생성능을 나타냈으며 그 구조를 분석한 결과 글루코즈, 만노즈, 갈락토즈, 퓨코즈(fucose), 아라비노즈(arabinose), D-글루코사민(glucosamine)이 주성분인 것으로 나타남. 또한, 본 유산균이 생산하는 다당류는 α-아밀라제(amylase), 판크레아틴(pancreatine) 등의 소화효소에 의해 분해되지 않음.

우리나라는 서양과는 식습관이 매우 다르므로, 한국인으로부터 분리한 유산균이 한국인에게 가장 적합한 것은 자명하다. 본 발명의 한국 여성의 모유에서 분리한 유산균인 락토바실러스 가세리 BNR17은 프로바이오틱 유산균이 가져야 하는 기본적인 조건을 모두 충족하고 있으며, 이러한 특성은 한국인에게 가장 잘 부합되는 건강증진효과를 나타낼 수 있다. 본 발명자들은 상기와 같은 특성을 갖는 본 발명의 유산균 균주를 락토바실러스 가세리 BNR17이라 명명하고, 2006년 1월 23일자로 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁하였다(기탁번호: KCTC 10902BP).

또한, 본 발명은 상기 유산균을 유효량 함유하는 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 식품, 식품용 첨가제, 동물 사료 또는 동물 사료용 첨가제와 같은 다양한 형태로 제공될 수 있다.

본 발명에 따른 신규 유산균인 락토바실러스 가세리 BNR17(기탁번호: KCTC 10902BP)은 내산성과 내담즙성 및 항균활성이 우수하므로, 다양한 유산균 발효유 및 발효 제품을 생산하기 위한 종균으로 사용할 수 있다. 이때, 상기 발효유 식품으로는 요구르트, 칼피스, 치즈, 버터 등을 들 수 있고, 발효 제품으로는 두부, 된장, 청국장, 젤리, 김치 등을 들 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 발효유 및 발효 제품은 통상적인 제조 방법에서 균주만을 본 발명의 유산균 균주로 대체함으로써 용이하게 제조할 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 본 발명의 락토바실러스 가세리 BNR17을 섭취시킨 실험군 래트(rat)의 경우, 유산균주 대신 PBS(phosphate-buffered saline)를 섭취시킨 대조군 쥐(rat)에 비해 약 7.7％의 체중 증가 억제 효과를 가진다(표 6참조). 또한, 실험군의 경우 체중증가와 식이효율에 있어서도 대조군에 비해 유의적인 감소를 나타내며, 실험군과 대조군의 분변 중에 포함된 다당류 함량을 측정한 결과 실험군의 분변에서의 다당류 함량이 대조군보다 높은 것으로 나타났다(도 6 참조). 이러한 결과는 락토바실러스 가세리 BNR17의 난소화성 다당류 생성능이 체중 조절에 영향을 미칠 수 있다는 것을 의미한다. 한편, 락토바실러스 가세리 BNR17을 섭취한 실험군의 경우, 외견상 부작용은 관찰되지 않았으며, 각 장기의 무게도 대조군의 것과 유의적인 차이를 보이지 않았다(표 7 및 표 8 참조). 또한, 미생물 인체 섭취시 문제가 될 수 있는 균의 전이현상도 관찰되지 않아 본 발명의 유산균은 인간이 섭취하기에 안전한 것으로 나타났다(도 7 참조).

본 발명의 유산균 식품은 상기 락토바실러스 가세리 BNR17을 독립적으로 또는 허용 가능한 담체에 첨가하거나, 인간 또는 동물이 섭취하기에 적합한 조성물 형태로 제조될 수 있다. 즉, 본 발명의 유산균은 다른 프로바이오틱 세균을 함유하지 않은 식품 및 이미 몇 가지의 프로바이오틱 세균을 함유한 식품에 첨가되어 사용될 수 있다. 예컨대, 본 발명의 유산균 식품을 제조함에 있어서, 본 발명의 유산균과 함께 사용 가능한 다른 미생물들은 인간이나 동물이 섭취하기에 적합하고 섭취시 병원성 유해세균을 억제하거나 포유동물 장관 내의 미생물 균형을 개선시킬 수 있는 프로바이오틱 활성을 갖는 것들이며, 특별히 제한되지 않는다. 그러한 프로바이오틱 미생물의 예로는 사카로미세스(Saccharomyces), 칸디다(Candida), 피치아(Pichia) 및 토룰롭시스(Torulopsis)를 포함하는 효모(yeast), 아스퍼질러스(Aspergillus), 리조퍼스(Rhizopus), 뮤코(Mucor), 페니실린(Penicillium) 등과 같은 곰팡이 및 락토바실러스(Lactobacillus), 비피도박테리움(Bifidobacterium), 류코노스톡(Leuconostoc), 락토코커스(Lactococcus), 바실러스(Bacillus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 그로피오니박테리움(Propionibacterium), 엔테로코커스(Enterococcus), 페디오코커스(Pediococcus) 속에 속하는 세균 등이 있다. 적당한 프로바이오틱 미생물의 구체적인 예로는 사카로미세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), 바실러스 코아귤란스(Bacillus coagulans), 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 비피도박테리움 비피둠(Bifidobacterium bifidum), 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis), 비피도박테리움 론검(Bifidobacterium longum), 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium), 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 알리멘타리우스(Lactobacillus alimentarius), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 쿠르바투스(Lactobacillus curvatus), 락토바실러스 델브루키(Lactobacillus delbruckii), 락토바실러스 존스니(Lactobacillus johnsonii), 락토바실러스 파시미누스(Lactobacillus farciminus), 락토바실러스 가세리( Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis), 페디오코커스 애시디락티시(Pediococcus acidilactici)등을 들 수 있다. 바람직하게는, 우수한 프로바이오틱 활성을 가지면서 면역활성 증강 및 항암작용이 뛰어난 프로바이오틱 미생물 혼합균을 본 발명의 유산균 식품에 추가로 포함함으로써 그 효과를 더욱 증진시킬 수 있다. 본 발명의 유산균 식품에 사용될 수 있는 담체의 예로는 증량제, 고섬유 첨가제, 캡슐화제, 지질 등일 수 있으며 이러한 담체들의 예는 당업계에 충분히 공지되어 있다. 본 발명의 유산균인 락토바실러스 가세리 BNR17은 동결건조되거나 캡슐화된 형태 또는 배양 현탁액이나 건조분말 형태일 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 상기 유산균을 함유하는 동물 사료용 첨가제 또는 이를 함유하는 동물사료의 형태로 제공될 수 있다.

본 발명의 동물 사료용 첨가제는 건조 또는 액체 상태의 제제 형태일 수 있으며, 상기 락토바실러스 가세리 BNR17 이외에 비병원성의 다른 미생물을 더 포함할 수도 있다. 첨가할 수 있는 미생물로는 예컨대 단백질 분해 효소, 지질 분해효소 및 당 전환 효소를 생산할 수 있는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 고초균, 소의 위와 같은 혐기적 조건에서 생리적 활성 및 유기물 분해능이 있는 락토바실러스 균주, 가축의 체중을 증가시키며 우유의 산유량을 늘리고 사료의 소화 흡수율을 높이는 효과를 보여주는 아스퍼질러스

오리자에(Aspergillus oryzae)와 같은 사상균(Slyter, L. L. J. Animal Sci.1976, 43. 910-926) 및 사카로미세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)와 같은 효모(Johnson, D. E et al. J. Anim. Sci.,1983, 56, 735-739 ; Williams, P. E. V. et al,1990, 211) 등이 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 동물 사료용 첨가제는 상기 락토바실러스 가세리 BNR17 이외에 하나 이상의 효소제제를 더 포함할 수도 있다. 첨가되는 효소제제는 건조 또는 액체 상태가 모두 가능하며 효소제제로는 리파제(lipase)와 같은 지방 분해효소, 파이틱 애시드(phytic acid)를 분해하여 인산염과 이노시톨인산염을 만드는 파이타제(phytase), 녹말과 글리코겐(glycogen) 등에 포함되어 있는 α-1,4-글리코시드 결합(glycoside bond)을 가수분해하는 효소인 아밀라제(amylase), 유기인산에스테르를 가수분해하는 효소인 포스파타제(phosphatase), 셀룰로스(cellulose)를 분해하는 카르복시메틸셀룰라제(carboxymethylcellulase), 자일로스(xylose)를 분해하는 자일라제(xylase), 말토스(maltose)를 두 분자의 글루코스(glucose)로 가수분해하는 말타제(maltase) 및 사카로스(saccharose)를 가수분해하여 글루코스-프룩토스(glucose-fructose) 혼합물을 만드는 전환효소(invertase) 등과 같은 당 생성 효소 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 유산균을 동물 사료용 첨가제로 사용함에 있어서, 사료용 원료로는 각종 곡물 및 대두 단백을 비롯한 땅콩, 완두콩, 사탕무우, 펄프, 곡물 부산물, 동물 내장 가루 및 어분 가루 등이 사용될 수 있으며, 이들은 가공되지 않거나 또는 가공된 것을 제한없이 사용할 수 있다. 가공과정은, 반드시 이에 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면 사료원료가 충진된 상태에서 가압 하에 일정한 배출구로 압축되는 공정으로, 단백질의 경우에는 변성이 되어 이용성이 증가되는 압출 성형(extrusion)을 사용하는 것이 바람직하다. 압출성형(extrusion)은 열처리 과정을 통해 단백질을 변성시키고 항효소인자를 파괴시키는 등의 장점을 갖는다. 또한, 대두 단백질과 같은 경우에는 압출 성형을 통해서 단백질의 소화율을 향상시키고 대두에 존재하는 단백질 분해효소의 저해제중의 하나인 트립신 저해제(trypsin inhibitor)와 같은 항 영양인자들을 불활성화시키며 단백질 분해효소에 의한 소화율 향상을 증가시켜 대두 단백의 영양적 가치를 증가시킬 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 락토바실러스 가세리 BNR17(기탁번호: KCTC 10902BP)을 유효량 함유하는 비만 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 락토바실러스 가세리 BNR17 유산균은 통상적으로, 투여 경로에 따라 선택되는 약학적 담체 및 부형제, 또는 보조 유효 성분 등과의 혼합에 의해서 얻어지는 정제 또는 캡슐과 같은 단위 형태로 투여된다.

본 발명의 약학적 조성물에 적합한 담체, 부형제 및 희석제에는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 검, 인산칼슘, 알긴산염, 트래거캔스 고무, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정질 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 스테아르산마그네슘 또는 광유 등이 포함된다. 본 발명의 미생물 조성물은 추가로 윤활제, 습윤제, 유화제 및 현탁화제, 방부제, 감미제 또는 향미제를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 당업계에 공지된 방법을 사용하여, 위장을 통과한 뒤 소장에 도달하여 활성 성분인 미생물이 신속하게 장내에 방출되도록 장용 피복 제제로 제조될 수 있다.

또한, 본 발명의 미생물 조성물은 통상적인 캡슐화 방법을 사용하여 캡슐 형태의 조성물로 제조될 수 있다. 예를 들어, 표준 담체를 사용하여 동결 건조시킨 본 발명의 미생물을 함유하는 펠렛(pellet)을 제조한 후, 이를 경질의 젤라틴 캡슐내에 충전시킬 수 있다. 또는, 본 발명의 미생물과 임의의 적절한 약제학적 담체, 예를 들어 수성 검, 셀룰로스, 규산염 또는 오일을 사용하여 현탁액, 분산액을 제조한 후, 이러한 분산액 또는 현탁액을 연질의 젤라틴 캡슐내에 충전시킬 수도 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 특히, 경구용 단위 제형으로서 장용 피복된 장용성 제제로서 제공될 수 있다. 본 명세서에서의 "장용 피복"은 위산에 의해서는 분해되지 아니하여 피복이 유지되나, 소장에서는 충분히 분해되어 활성 성분이 소장내에 방출될 수 있도록 하는, 약제학상 허용 가능한 모든 종류의 공지의 피복을 포함한다. 본 발명의 "장용 피복"은 pH 1의 HCl 용액과 같은 인공 위즙을 36℃ 내지 38℃에서 접촉시킬 때, 2시간 이상 동안 그대로 유지되며, 바람직하게는 이후에 pH 6.8의 KH₂PO₄ 완충 용액과 같은 인공 장즙에서 30분 이내에 분해되는 피복을 지칭한다.

본 발명의 장용 피복은 1개의 코어(core)에 약 16 내지 30, 바람직하게는 16 내지 20 또는 25 mg 이하의 양으로 피복된다. 본 발명의 장용 피복의 두께가 5 내지 100 ㎛, 바람직하게는 20 내지 80 ㎛인 경우가 장용 피복으로서 만족스러운 결과를 나타낸다. 장용 피복의 재료는 공지의 고분자 물질들 중에서 적당히 선택된다. 적당한 고분자 물질은 다수의 공지 문헌(L. Lachman 외, The Theory and Practice of Industrial Pharmacy, 3판, 1986, pp. 365∼373; H. Sucker 외, Pharmazeutische Technologie, Thieme, 1991, pp. 355-359; Hagers Handbuch der pharmazeutischen Praxis, 4판, Vol. 7, pp. 739 ∼ 742, 및 766 ∼ 778, (SpringerVerlag, 1971); 및 Remington's Pharmaceutical Sciences, 13판, pp. 1689 ∼ 1691 (Mack Publ., Co., 1970))에 열거되어 있고, 셀룰로즈 에스테르 유도체, 셀룰로즈 에테르, 아크릴 수지의 메틸아크릴레이트 공중합체 및 말레산 및 프탈산 유도체의 공중합체가 이들에 포함될 수 있다.

본 발명의 장용 피복은 장용 피복 용액을 코어에 분무하는 통상적인 장용 피복법을 사용하여 제조될 수 있다. 장용 피복 공정에 사용되는 적당한 용매로는 에탄올과 같은 알콜, 아세톤과 같은 케톤, CH₂Cl₂ 와 같은 할로겐화 탄화수소 용매이며 이들 용매들의 혼합 용매가 사용될 수도 있다. 디(di)-n-부틸프탈레이트 또는 트리아세틴과 같은 연화제를 1 대 약 0.05 내지 약 0.3 (코팅 재료 대 연화제)의 비율로 피복 용액에 첨가한다. 분무 과정을 연속적으로 수행하는 것이 적절하며 피복의 조건을 고려하여 분무량을 조절하는 것이 가능하다. 분무압은 다양하게 조절할 수 있고, 일반적으로 약 1 내지 약 1.5 바(bar)의 분무압으로 만족할만한 결과가 얻어진다.

본 명세서의 "약학적 유효량"은 포유동물의 장내에서 체내로 흡수되는 저당류의 양을 감소킬 수 있는 본 발명의 미생물의 최소량을 의미하며, 본 발명의 조성물에 의하여 체내에 투여되는 미생물의 양은 투여 경로, 투여 대상을 고려하여 적절하게 조정될 수 있다.

본 발명의 조성물은 대상 개체에 매일 일회 이상 투여될 수 있다. 단위 투여량은 사람 피험자 및 다른 포유동물을 위한 단위 투여에 적합하게 물리적으로 분리된 단위를 의미하며, 각 단위는 적절한 약제학적 담체를 포함하며 치료 효과를 나타내는 본 발명의 미생물의 예정된 양을 함유한다. 성인 환자의 경구 투여용 투여 단위는 본 발명의 미생물 0.1 g 이상을 함유하는 것이 바람직하며, 본 발명의 조성물 경구 투여량은 일회에 0.1 내지 10 g, 바람직하게는 0.5 내지 5 g이다. 본 발명의 미생물의 약학적 유효량은 0.1 내지 10 g/1일이다. 그러나, 투여량은 환자의 체중, 비만 증상의 심각도 및 사용되는 미생물과 보조 유효 성분에 따라 가변적이다. 또한, 일일 총 투여량을 여러 횟수로 분할하여 필요에 따라 연속적으로 투여할 수 있다. 따라서, 상기 투여량 범위는 어떠한 방식으로도 본 발명의 범위를 제한하지 아니한다.

본 발명의 조성물을 주기적으로 복용하는 경우, 장내에 본 발명의 미생물들이 균총을 이루면서 인체가 당류를 흡수하는 것을 경쟁적으로 방해할 뿐 아니라, 단당류 형태의 탄수화물을 다당류 형태로 전환시켜 이들이 체내에서 흡수되는 것을 방지하고, 미생물이 생산한 비소화성 식이섬유가 장내 유용균의 생육조건을 좋게 하여 장운동을 자극함으로써 결과적으로 본 발명의 조성물이 비만의 예방 및 치료제로 기능하게 된다.

한편, 의약적 조성물의 체중 감소 효과 또는 비만 방지 효과를 극대화하기 위해서 종래 당업자에게 공지되어 있는 임의의 체중 감소제를 적절한 함량으로 포함할 수 있으며, 이때 첨가제의 함량 범위는 반복실험 등을 통해 당업자가 용이하게 결정할 수 있다. 첨가제로 유용한 성분의 바람직한 예로는 콘쥬게이트리놀레산(conjugated linoleic acid), 폴리덱스트로즈(polydextrose), 이눌린(inulin), 구아검(guar gum), 아랍검(arabic gum), L-카르틴(carteine), 포도씨 추출물, 프럭토올리고당(fructooligosaccharide), 자일로올리고당(xylooligosaccharide), 라피노즈(raffinose), 글루콘산(gluconic acid), 샴피뇽(champignon), 폴리안토시아니딘(polyanthocyanidine), 락툴로즈(lactulose), 락티톨(lactitol), 락토수크로즈(lactosucrose), 당귀 추출물, 헛개나무 추출물, 감귤껍질 추출물 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 상기 락토바실러스 가세리 BNR17(기탁번호: KCTC 10902BP)을 배양함으로써 제조되는 배양액을 제공한다. 본 발명의 배양액의 제조에 사용되는 배지는 특정한 종류에 한정되는 것은 아니며, 예컨대 통상의 미생물 배양용 배지를 포함하는 임의의 배지를 제한없이 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 배양액은 특정한 용도에 따라 임의의 첨가물을 추가로 포함하여도 무방하다. 예를 들면, 본 발명의 배양액의 체중 감소 효과를 극대화하기 위하여 종래 당업자에게 공지되어 있는 임의의 체중 감소제를 적절한 함량으로 포함할 수 있으며, 이때 유효 약물의 구체적인 함량 범위는 반복실험 등을 통해 당업자가 용이하게 결정할 수 있음이 자명하다.

또한, 본 발명은 상기 유산균이 생산하는 박테리오신 펩타이드 및 이를 코딩하는 유전자를 제공한다. 본 발명은 본 발명의 박테리오신 펩타이드를 "가세리신 BNR17"로 명명하였으며, 서열번호 5로 기재되는 염기 서열을 갖는다. 본 발명의 박테리오신인 가세리신 BNR17과 종래에 보고되어 있는 항균성 펩타이드인 가세리신 T (NCBI Blast Search No. AB029612, 서열번호 6)의 염기서열을 비교한 결과, 약 98％의 상동성이 있음을 알 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 가세리신 BNR17 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명의 재조합 벡터는 일반적인 대장균 균주 발현용 벡터에 서열번호 5로 기재되는 염기서열을 갖는 유전자를 삽입함으로써 제조될 수 있다. 본 발명의 재조합 벡터의 제조에 사용될 수 있는 모벡터는 특정한 종류에 한정되는 것은 아니며, 일반적으로 사용할 수 있는 모든 미생물 발현용 벡터, 바람직하게는 대장균 발현용 벡터가 제한없이 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

상기 형질전환체는 상기 제조합 벡터를 임의의 숙주 세포에 도입시킴으로써 용이하게 제조될 수 있다. 상기 숙주 세포로는 임의의 진핵 또는 원핵 생물, 다세포 동물 유래의 세포주 등이 제한없이 사용될 수 있음은 당업자에게 있어서 자명하다.

도 1은 본 발명의 락토바실러스 가세리 BNR17과 락토바실러스 가세리 KC26(미국 국립생물정보센터 진뱅크(GENBANK) 기탁번호 : AF243156)의 16S rRNA 서열을 비교한 것이다.

도 2는 본 발명의 락토바실러스 가세리 BNR17의 장내 부착활성을 보여주는 현미경 사진이다.

도 3은 본 발명의 락토바실러스 가세리 BNR17이 여러가지 병원성 세균에 대한 항균력이 있음을 보여주는 사진이다.

도 4는 본 발명의 락토바실러스 가세리 BNR17의 증식에 따른 포도당 소비속도와 다당류 생성을 보여주는 그래프이다.

■; 세포 성장, ◆; 포도당 농도, ▲; EPS(다당류) 농도

도 5는 락토바실러스 가세리 BNR17을 섭취시킨 래트의 분변량을 나타낸 그래프이다.

도 6은 락토바실러스 가세리 BNR17을 섭취시킨 래트의 분변 중 EPS(다당류) 농도를 나타낸 그래프이다.

도 7은 본 발명의 락토바실러스 가세리 BNR17을 섭취시킨 래트의 소장 이외의 장기로부터 분리된 콜로니들의 RAPD-PCR 프로파일(profile)을 보여주는 전기영동 사진으로서, 각각 서열번호 7(A), 서열번호 8(B) 및 서열번호 9(C)로 기재되는 프라이머를 이용하여 실험한 결과이다.

레인 1; Lb. gasseri BNR17, 레인 2-5; Lb. gasseri BNR17을 섭취한 래트의 소장 이외의 장기로부터 분리된 콜로니들.

M; DNA 크기 마커

발명의 실시를 위한 최선의 형태

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 모유로부터 유산균의 분리

아기를 분만한지 2주 이내의 여성의 모유를 채취하여 인산완충용액을 이용해 적절하게 희석한 후 원액과 희석액을 락토바실러스 선택배지에 도말하였다. 37℃에서 2∼3일간 배양하여 나타난 콜로니들을 형태 및 색깔별로 구별하여 다시 순수분리하였다. 분리된 콜로니에 대해 그람염색 및 현미경 관찰을 실시하여 그람 양성이면서 막대형의 형태를 갖는 콜로니만 선별하였으며, 이들을 pH 6.8의 MRS 액체배지에서 37℃, 24시간 배양하면서 배양액의 pH가 4.5 이하로 감소하는 콜로니를 재선별하였다. 이후 pH2.0의 MRS 배지에서 2시간 배양한 후 다시 0.3％의 oxgall이 첨가된 MRS 배지내에서 9시간 배양한 경우에 생존이 가능한 내산성, 내담즙성 락토바 실러스 균주를 분리하였고, 16S rRNA 시퀀싱(sequencing)으로 동정하여 락토바실러스 가세리 종에 속하는 균주임을 확인하였으며(서열번호 1, 도 1 참조), 이를 "락토바실러스 가세리 BNR17"로 명명하였다.

실시예 2. 분리된 유산균의 당 이용성 확인 실험

상기에서 분리된 본 발명의 유산균주인 락토바실러스 가세리 BNR17의 당 이용성을 API50CHL 키트(Biomerieux, France)를 이용하여 다른 표준 균주들과 비교한 결과를 하기 표 1에 나타내었다. 표 1에서, 5314는 락토바실러스 가세리 CECT5714; 5315는 락토바실러스 가세리 CECT5715; 11413은 락토바실러스 가세리 LMG11413; 18194는 락토바실러스 가세리 LMG18194; 4479는 락토바실러스 가세리 CECT4479; 18176은 락토바실러스 가세리 LMG18176; 13047은 락토바실러스 가세리 LMG13047을 나타낸다.

표 1

표 1에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 락토바실러스 가세리 BNR17 균주는 락토바실러스 가세리 종의 다른 균주들과 비교할 때, 몇 가지 당의 이용에 있어 확연한 차이가 있음을 확인하였다(굵은 이탤릭체로 표시).

실시예 3. 분리된 유산균의 효소 활성

상기에서 분리된 본 발명의 유산균주인 락토바실러스 가세리 BNR17의 효소활성을 APIZYM 키트(Biomerieux, France)를 이용하여 다른 표준 균주들과 비교한 결과를 하기 표 2에 나타내었다. 13134는 락토바실러스 가세리 LMG13134를 나타낸다.

표 2

표 2에 나타난 바와 같이, 본 발명의 락토바실러스 가세리 BNR17 균주는 락토바실러스 가세리 종의 다른 균주들과 비교할 때, 몇 가지 효소 활성에 있어 차이 가 있음을 확인하였다(굵은 이탤릭체로 표시).

실시예 4. 내산성 및 내담즙성 확인

본 발명의 균주의 내산성 및 내담즙성을 확인하기 위하여, 락토바실러스 가세리 BNR17을 MRS 액체배지 4 ㎖에 접종하여 37℃, 18∼20시간 배양한 후, 이 배양액의 일정량을 pH 2.0으로 조절한 MRS 액체배지에 초기균수 10⁷ CFU/㎖가 되도록 다시 접종하였고, 37℃에서 2시간 배양한 후 MRS 한천평판 배지를 이용하여 생균수를 측정하였다. 또한, 내산성 실험을 실시한 배양액을 그대로 원심분리하여 균체만 회수한 후 0.3％ 황소담즙(oxgall)이 첨가된 MRS 액체배지(pH 6.8)에 접종하였고, 37℃에서 9시간 배양한 후 역시 MRS 한천평판배지를 이용하여 생균수를 측정하였다. 그 결과를 표 3에 나타내었다.

표 3

그 결과, 본 발명의 락토바실러스 가세리 BNR17은 pH 2.0의 강한 산성처리에도 불구하고 생존율이 높은 것으로 확인되었으며, 0.3％ 황소담즙 함유 배지에서도 생존이 높게 나타났다.

실시예 5. 장내부착능 확인

RPMI1640 배지(Gibco)를 이용하여 인간의 장상피세포인 CaCo-2 세포주를 배양한 플레이트에 본 발명의 균주를 일정 균수(약 10⁷ CFU/㎖)가 되도록 접종하였다. 이를 37℃에서 1시간 배양한 후 인산완충용액으로 3회 세척하여 비부착 세포를 제거한 후 메탄올로 검체를 고정하였다. 이후 크리스탈 바이올렛(crystal violet)으로 염색하여 현미경으로 세포를 관찰하였다. 그 결과, 본 발명의 락토바실러스 가세리 BNR17이 CaCo-2 세포에 잘 부착함을 확인하였다(도2).

실시예 6. 병원성 세균에 대한 항균력 확인

BHI 액체배지(Difco)에서 37℃, 18시간 배양한 대장균(E. coli), 황색포도상구균(S. aureus), 살모넬라균(S. typhimurium), 바실러스균(B. cereus), 리스테리아균(L. monocytogenes), 프로테우스균(P. mirabilis)을 초기균수 10⁵ CFU/㎖가 되도록 5 ㎖의 BHI 한천배지(한천 0.7％ 함유) 6개에 각각 접종한 후, 이를 BHI 한천배지(1.5％ 한천 함유)를 부어 굳힌 6개의 평판배지위에 각각 겹쳐 부었다. 6개의 배지를 굳힌 후 각 배지에 직경이 약 4 ㎜ 되는 웰(well)을 뚫고 그 위에 37℃, 24시간 배양한 본 발명의 유산균의 배양상층액(2배 농축액) 40 ㎕를 첨가하여 37℃, 5시간 배양하였다.

그 결과, 웰 주위에 뚜렷한 생육저해환을 관찰할 수 있었으며, 따라서 본 발명의 균주는 여러가지 병원성 세균에 대한 항균력이 있음을 확인하였다(표 4 및 도 3).

표 4

실시예 7. 항생제 내성 확인

MRS 한천평판배지에 면봉으로 락토바실러스 가세리 BNR17 배양액을 도말한 후 에리스로마이신(Erythromycin), 페니실린(Penicillin), 젠타마이신(Gentamicin), 카나마이신(Kanamycin), 스트렙토마이신(Streptomycin), 바시트라신(Bacitracin), 클로람페니콜(Chloramphenicol), 반코마이신(Vancomycin), 테트라사이클린(Tetracycline), 암피실린(Ampicillin), 세폭시틴(Cefoxitin), 리팜핀(Rifampin), 네오마이신(Neomycin), 날리딕산(Nalidixic acid), 시프로플록삭신(Ciprofloxacin), 폴리믹신 B(Polymixcin B), 트리메토프림(Trimethoprim)이 첨가되어 있는 원형디스크를 올려놓은 후 37℃, 24시간 배양하였다.

그 결과, 본 발명의 락토바실러스 가세리 BNR17은 젠타마이신, 카나마이신, 스트렙토마이신 및 바시트라신, 네오마이신, 날리딕산, 시프로플록사신, 폴리믹신 B, 트리메토프림에 대해 내성을 나타내었다.

실시예 8. 항균 펩타이드 유전자의 검출

락토바실러스 가세리 종이 생산하는 것으로 알려진 항균펩타이드인 박테리오신 유전자의 염기서열에 특이적인 서열번호 3 및 서열번호 4로 기재되는 프라이머 (primer)를 만들고, 본 발명의 락토바실러스 가세리 BNR17의 게놈 DNA를 주형(template)으로 이용하는 중합효소연쇄반응(PCR)법으로 박테리오신 유전자의 유무를 조사하였다.

그 결과, 락토바실러스 가세리 BNR17로부터 박테리오신인 가세리신(gassericin)에 해당하는 PCR 산물을 확인하였으며, 그 염기서열을 서열번호 5로 기재하였다. 상기 염기서열은 종래에 보고되어 있는 서열번호 6으로 기재되는 가세리신 T (NCBI Blast Search No. AB029612)의 염기서열을 비교한 결과, 약 98％의 상동성을 나타내었다.

실시예 9. β-글루쿠로니다제(glucuronidase) 활성 측정

장내세균이 생산하는 β-글루쿠로니다제는 발암효소의 하나로 알려져 있어 이 효소의 활성을 나타내는 균주는 유해한 균주로 간주된다. 본 발명의 락토바실러스 가세리 BNR17이 β-글루쿠로니다제 활성이 있는지 여부를 확인하기 위하여 에이피아이 자임키트(APIZYM kit)(Biomerieux, France)를 사용하여 효소활성을 조사하였다.

그 결과, 본 발명의 균주는 β-글루쿠로니다제 활성을 나타내지 않는 안전한 균주임을 확인하였다(표 5).

표 5

실시예 10. 포도당 소비와 다당류 생성

포도당을 2％ (w/v) 직접 첨가하여 제조한 MRS 배지(Difco)를 제조하여 락토바실러스 가세리 BNR17을 최종 균수 10⁶ cfu/㎖가 되도록 접종한 후, 96시간 배양하면서 균수변화를 측정하였으며, 동시에 포도당 소비와 다당류(extracellular polysaccharide, EPS) 생성양상을 조사하였다.

그 결과, 락토바실러스 가세리 BNR17은 배양 12시간만에 최고균수에 도달하였으며 이후로는 생균수가 감소하였다. 이때, 포도당 농도는 배양 7시간 이후 급격히 감소하였으며 36시간 이후로는 큰 차이를 보이지 않아 대부분의 포도당이 36시간 내에 소비되는 것으로 나타났다. EPS 생성은 배양 24시간째에 최대 농도인 520 ㎎/ℓ에 도달하였다가 36시간째에 약간 감소하였으나 이후 다시 증가하는 양상을 보였는데, 이는 균체가 사멸기에 접어들면서 자가분해(autolysis) 현상이 나타나 균체 내부의 여러 가지 다당류 성분이 배양액내로 유출된 때문인 것으로 생각된다(도 4).

실시예 11. 락토바실러스 가세리 BNR17이 생성하는 다당류의 소화효소에 의한 분해 여부 확인

먼저,α-아밀라제(amylase, Sigma)와 판크레아틴(pancreatin, Sigma) 100 mg을 각각 0.05 M 포스페이트 버퍼(pH 7.0)에 녹였다. 락토바실러스 가세리 BNR17의 배양 상층액으로부터 추출한 다당류 (EPS) 용액 200 ㎕에 상기효소액 50 ㎕와 0.05 M 포스페이트 버퍼(pH 7.0) 150 ㎕을 첨가한 후 37℃, 1시간 반응시켰다. 효소의 불활성화를 위해 100℃, 15분간 가열한 후 실온에서 식힌 다음 포도당 키트(Sigma)를 이용하여 포도당의 농도를 측정하였다.

그 결과, 각 소화효소를 처리하기 전 BNR17의 다당류 용액내에서는 포도당이 검출되지 않았으며, 판크레아틴과 α-아밀라제로 처리했을 경우에는 각각 3.70 ㎎/ℓ, 19.1 mg/ℓ가 검출되었다. 상기 결과는 BNR17이 생성하는 다당류가 소화효소에 의해 거의 분해되지 않음을 나타낸다.

실시예 12. 락토바실러스 가세리 BNR17의 체중 증가 억제 효과 확인

8주령된 수컷 SD 쥐(rat)를 두 그룹으로 나누어 한 그룹에는 PBS (pH 7.4)를, 그리고 다른 그룹에는 락토바실러스 가세리 BNR17을 최종 균수 10 ⁹CFU/㎖가 되도록 현탁시킨 PBS액을 8주간 매일 경구투여하면서 일주일에 한번씩 체중 및 급이량, 콜레스테롤 등의 혈액화학치의 변화를 측정하였다. 또한, 분변량과 분변 중의 EPS 양을 측정함으로써 BNR17의 다당류 생성능이 실제 체중증가 억제에 미치는 영향을 조사하였다. 8주 후에는 모든 실험동물을 해부하여 간, 신장, 비장, MLN (mesenteric lymph node)을 적출하여 각각 그 무게를 측정하였다. 이와 동시에 적출한 각 조직의 일부를 균질화한 후 락토바실러스 속의 선택배지인 LBS 아기(agar)에 도말, 배양하여 나타난 콜로니들의 RAPD (random amplified polymorphic DNA)-PCR 프로파일을 조사하고, 이를 락토바실러스 가세리 BNR17 균주의 RAPD-PCR 프로파일과 비교함으로써 투여군의 다른 장기로의 전이 여부를 조사하였다.

그 결과, PBS액을 경구투여한 대조군의 경우 8주간 약 179.1％의 체중 증가를 보였으나, 락토바실러스 가세리 BNR17을 경구투여한 실험군은 약 171.6％의 체중 증가를 보였다(표 6). 또한, 1일 체중 증가도와 식이 효율에 있어서도 대조군에 비해 유의적으로 낮은 수치를 나타내었다.

표 6

상기에서, 식이 효율 비율(food efficiency ratio, FER)은 체중증가(g/day)/섭취한 음식(g/day)을 나타내며, ^*P＜0.05, ^**P＜0.05 이다.

대조군과 실험군의 분변량과 분변 중 EPS의 양을 측정한 결과는 도 5 및 도 6에 나타내었다. 분변량에 있어서는 두 그룹 사이에 큰 차이를 보이지 않았으나 분변 중 함유되어 있는 EPS의 양은 BNR17을 섭취시킨 실험군에서 크게 증가하는 것으로 나타났다. 따라서, 락토바실러스 가세리 BNR17이 체내로 섭취되는 당 성분을 소 화되기 어려운 다당류 성분으로 전환시켜 체외로 배출시켜 체내 흡수율을 낮춤으로써 체중증가 억제를 유도할 수 있음을 확인하였다.

한편, 균주의 인체 섭취시 요구되는 안전성을 알아보기 위해 혈액화학치와 장기 무게를 측정한 결과, 대조군과 실험군의 두 그룹간 유의적인 차이를 보이지 않아 부작용을 유발하지 않는 것으로 나타났다(표 7 및 표 8).

표 7

표 8

상기 표 8에서, 각 수치는 장기의 무게(g)/쥐(rat)의 체중(g)으로 나타낸다.

또한, 투여한 균이 소장 이외의 장기로 전이되는지의 여부를 조사하기 위하여, 서열번호 7 내지 서열번호 9로 기재되는 염기서열을 갖는 프라이머 p1, p2 및 OPL5를 이용하여 각 장기별로 LBS 아가 플레이트(agar plate)에서 자란 콜로니들의 RAPD-PCR 프로파일을 조사하였다. 상기 PCR 조건은 프라이머 p1과 p2의 경우, 94℃ (2분), 36℃(5분), 72℃(5분) - 4 cycles/94℃(1분), 36℃(1분), 72℃(2분) - 36 cycles이었으며, OPL5의 경우 94℃(2분) - 1 cycle/94℃(40초), 45℃(1분), 72℃(1분) - 2 cycles/94℃(40초), 52℃(1분), 72℃(3분) - 30 cycles/70℃(5분) - 1 cycle이었다.

그 결과, BNR17과 같은 프로파일을 보이는 콜로니는 없었다(도7). 따라서, BNR17은 인체 섭취시 소장 이외의 다른 장기로 전이되지 않는 안전한 균인 것으로 나타났다.

제조예 1. 발효유의 제조

탈지분유를 이용하여 무지유고형분 함량을 8∼20 중량％로 조정한 원료유를 72∼75℃에서 15초간 살균하였다. 살균된 원료유를 일정온도까지 냉각시킨 후, 본 발명의 락토바실러스 가세리 BNR17 균주를 10⁶ cfu/㎖의 농도로 접종하여 pH 4∼5가 될 때까지 배양하였다. 배양완료 후 배양액을 냉각시켰다. 한편, 과즙농축액 0.1∼50 중량％, 식이섬유 0.1∼20 중량％, 포도당 0.5∼30 중량％, 올리고당 0.1∼15 중량％, 칼슘 0.001∼10 중량％, 비타민 0.0001∼5 중량％를 녹여 시럽을 제조하였다. 이렇게 제조된 시럽을 살균한 후 냉각하여 상기 배양액과 일정비율로 혼합·교반하여 균질화시킨 후 용기에 포장하여 발효유를 제조하였다. 이렇게 제조된 발효유는 관능검사 결과 풍미, 물성, 전체적인 맛에 있어서 양호한 결과를 보였다.

제조예 2. 유산균 균말의 제조

본 발명의 락토바실러스 가세리 BNR17을 MRS 액체배지에 10⁶ cfu/㎖의 농도 로 접종하여 37℃에서 18∼24시간 동안 pH-조절 발효(pH-control fermentation)를 실시하였다. pH 조절(control)은 30 부피％ NaOH를 중화제로 하여 pH 5.7±0.2로 실시하였다. 배양완료 후 4℃에서 10,000xg로 원심분리하여 균체를 회수하였다. 전체 조성물에 대해 5 중량％ 탈지유, 2.5 중량％ 유장(whey), 5 중량％ 수크로스(sucrose)가 함유된 보호제를 준비하고, 상기에서 회수한 균체를 보호제와 동량으로 혼합한 후 동결건조기를 통해 분말화하였다. 이렇게 제조된 락토바실러스 가세리 BNR17의 건조균말은 모두 1×10¹¹ cfu/g 이상의 생균수를 나타내었다. 상기 보호제는 10 중량％ 트레할로즈(trehalose), 10 중량％ 말토덱스트린(maltodextrine), 7.5 중량％ 락토즈(lactose)를 추가로 함유하고 있어도 무방하다.

제조예 3. 유산균 제제 제조

제조예 2에서 제조한 유산균 균말을 이용하여 유산균 식품, 정장제 등의 유산균 제제를 제조하였다. 이를 위하여, 락토바실러스 가세리 BNR17의 건조 균말 20 중량％에 올리고당 10 중량％, 무수포도당 20 중량％, 결정과당 5 중량％, 비타민 C 2 중량％, 과일분말향 5 중량％, 알로에 5 중량％, 식이섬유 15 중량％, 차전자피 18 중량％를 혼합하여 스틱 또는 병에 일정량 분주하여 포장하였다. 이렇게 제조된 유산균 제제는 5×10⁸ cfu/g 이상의 생균수를 유지하였다.

제조예 4. 사료첨가용 조성물의 제조

락토바실러스 가세리 BNR17을 포함하는 본 발명의 사료첨가용 조성물을 하기 표 9의 조성으로 제조하였다.

표 9

사료첨가용 조성물의 구성비율(단위: 중량％)

상기에서, 효소제제는 파이타제, 셀룰라제, 자일라나제, 말타제 및 전환효소의 혼합제제를 사용하였고, 비병원성 미생물로는 아스퍼질러스 오리자에를 사용하였다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 락토바실러스 가세리 BNR17은 넓은 생육온도 및 pH 범위를 가지고, 내산성, 내담즙성 및 장세포에 대한 부착활성이 뛰어날 뿐만 아니라, 세균성 미생물에 대한 높은 항균활성을 가지며 체중증가억제 효과를 가지기 때문에 발효유 및 다양한 발효 제품뿐만 아니라 동물의 사료를 제조하기 위한 첨가제로도 유용하게 사용될 수 있다.

서열목록

서열목록 첨부

Claims

락토바실러스 가세리 BNR17(기탁번호: KCTC 10902BP).
제 1항에 있어서, 서열번호 1로 기재되는 16S rRNA 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 가세리 BNR17(기탁번호: KCTC 10902BP).
제 1항의 락토바실러스 가세리 BNR17(기탁번호: KCTC 10902BP)을 유효량 함유하는 조성물.
제 3항에 있어서,

상기 조성물은 식품, 식품용 첨가제, 동물 사료 및 동물 사료용 첨가제로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 4항에 있어서,

상기 동물 사료용 첨가제는 비병원성의 다른 미생물, 효소 및 이들의 조합 중 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항의 락토바실러스 가세리 BNR17(기탁번호: KCTC 10902BP)을 유효량 함유하는 비만 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 1항의 균주가 생산하는 박테리오신 펩타이드.
제 7항의 박테리오신 펩타이드를 코딩하는 유전자.
제 8항에 있어서,

상기 유전자는 서열번호 5로 기재되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 유전자.
제 7항에 있어서, 상기 박테리오신 펩타이드는 서열번호 5로부터 암호화되는 것을 특징으로 하는 박테리오신 펩타이드.
제 8항 또는 제 9항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
제 11항의 재조합 벡터로 형질 전환된 형질전환체.
제 1항의 락토바실러스 가세리 BNR17(기탁번호: KCTC 10902BP)의 배양액.