KR20050039791A

KR20050039791A - 락토바실러스 파라카제이

Info

Publication number: KR20050039791A
Application number: KR1020050025429A
Authority: KR
Inventors: 최남희; 김남현; 김민성
Original assignee: 코바이오텍 (주)
Priority date: 2005-03-28
Filing date: 2005-03-28
Publication date: 2005-04-29

Abstract

본 발명은 락토바실러스 파라카제이에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 산 및 담즙산 내성을 가지고, 유기산 생성능과 콜레스테롤 흡착 능력이 우수하여 식품, 의약품 등에 광범위하게 사용될 수 있는 새로운 락토바실러스 파라카제이 KBT2005에 관한 것이다. 락토바실러스 파라카제이 유산균은 동물체의 장에 서식하면서 유익한 작용을 하는 대표적 미생물로서, 현재 발효유와 생균제 등에 널리 사용되고 있는 프로바이오틱 유산균이다. 락토바실러스 파라카제이 KBT2005는 인체 및 동물체의 체내 및 장내에서 유해한 성질을 나타내는 여러 종의 병원성 미생물의 생육을 효과적으로 억제하고, 내산성 및 담즙산 염에 대한 분해 기능을 가지고 있기 때문에 식품, 의약품, 사료첨가제, 동물약품 등 여러 가지 광범위하게 사용될 수 있다.

Description

락토바실러스 파라카제이 {Lactobacillus paracasei}

본 발명은 유산균인 락토바실러스 파라카제이 균주를 요구르트 등의 발효유 종균제 및 생균제의 제조에 이 균주를 이용하는 용도에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 본 발명은 사람의 장내에서 분리, 동정한 락토바실러스 파라카제이 KBT2005 균주와 이 균주가 보유한 유기산 생성능, 내산성, 내 담즙산성, 콜레스테롤 흡착 능력 및 유해 세균에 대한 억제 능력을 이용하여, 이 균주를 배양한 것을 발효유 제조의 종균제 및 생균제용 유산균제로 응용하는 것이다.

　　　　 국내외적으로 식품에 대한 공중위생 및 안전성에 대한 관심이 높아지는 현실에서 항생제를 비롯한 항균성 물질의 오남용으로 인해 발생하는 잔류성 및 내성균 문제가 지속적인 논란의 대상이 되고 있다. 때문에 이러한 항균성 물질을 대체할 수 있는 유용한 자원의 개발이 시급하며 이를 위하여 생균제, 프리바이오틱스, 효소제, 올리고당 등에 대한 연구가 활발히 진행되고 있는 현실이다.

　　　 인간의 장내세균총은 인간의 건강과 밀접한 관련성을 지니고 있어 장내균총을 정상적으로 유지하는 것은 질병의 예방, 항생제 사용의 감소 및 국민 보건 향상과 직접적으로 연관되어 있으며 이러한 것과 관련하여 인체의 장관내에서 정상적인 장내 균총의 형성에 기여하면서 건강에 유익한 역할을 하는 발효유 종균제 및 생균제로서의 유산균의 개발이 지속적으로 연구의 대상이 되고 있다.

종래 발효유의 제조에 사용되는 종균제는 우유를 빠른 시간에 발효하여 젖산 등의 유기산을 생성하여 제품의 풍미와 보관성을 증진하는데 그 목적이 있었다. 국민 소득의 증가와 더불어 식품에 대한 공중위생 및 안전성에 대한 관심이 높아지면서 발효유 제조에 이용되는 종균제에도 건강 증진을 위한 추가적인 기능을 부여하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다.

한편 생균제를 의미하는 프로바이오틱스(Probiotics)란 용어는 1965년에 릴리(Lilly)와 스틸웰(Stilwell)에 의해 제창되었으며 1975년 이후에 일반화되어 세계적으로 사용되어 오고 있다. 프로바이오틱스는 그리스어의 공생의 의미에서 유래하고 있으며 항생제(Antibiotics)와는 달리 생물 상호간에 생명 활동 유지에 유익한 관계를 의미한다.

　　　발효유용 종균제 및 생균제로 사용되고 있는 균주로는 유산균이라 불리는 유산간균, 유산구균, 장구균, 비피더스균 등이 사용되고 있다. 특히, 이들 균주 중 인간의 장내에서 서식하며 유기산을 생성하는 유산균으로는 락토바실러스속, 루코노스톡속, 페디오코커스속, 엔테로코커스속 및 비피도박테리움속 등이 있다. 유기산을 생성하는 유산균의 알려진 효과로는 장관내 미생물총 정상화, 유기산 생성을 통한 유해균의 소화기성 질병발생 억제, 항생제 대체 효과 등이 있다.　　　

　　 유산균의 경우 상기와 같이 많은 유용한 점이 있음에도 불구하고 현재 발효유용 종균제 및 생균제로서 사용되고 있는 유산균의 대부분은 건강 증진에 대한 정확한 평가가 이루어지지 않은 경우가 다수이며 또한 인체용 생균제는 인간의 장내에서 분리하여 개발하는 것이 가장 이상적이나 많은 생균제로 사용되는 균주가 그러하지 못하고 있다.

　　 본 발명자들은 상기와 같은 사실을 감안하여 유기산을 효과적으로 생산하는 신규 유산균인 락토바실러스속 균주를 인간의 장내에서 분리하여 이를 동정하였으며, 상기 분리동정한 락토바실러스 파라카제이 KBT2005 균주의 내산성, 내담즙성 등에 대한 장관내 생존력 평가를 통해 발효유용 종균제 및 생균제로서 사용 가능함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

　　 따라서 본 발명의 목적은 유기산의 생성능이 높으며, 내산성과 내담즙성이 우수하고 콜레스테롤 저해 능력이 우수하여 발효유의 종균제 및 생균제로 사용하여 인간의 건강증진에 이바지할 수 있는 새로운 락토바실러스 파라카제이 KBT2005 균주를 인간의 장내로부터 분리 동정하여 제공함에 있다.

본 발명자들은 사람의 분변에서 분리된, 종래의 락토바실러스 파라카제이균에 비하여 위산 및 담즙에 내성을 가지며 생리적 효능이 우수하고 항균물질도 생산하는 균주를 얻는데 성공하였다. 즉 본 발명을 병원성 미생물과 부패성 미생물의 생육을 억제하고 내산성 및 내담즙산성을 가지고 또한 콜레스테롤 억제 능력을 지니고 있는 새로운 균주인 락토바실러스 파라카제이 KBT2005를 제공함에 있다.

본 발명은 인간의 장내에서 분리된 유산균주를 유산균 분리 배지에서 37℃, 24시간 배양한 후 각각의 유산균주를 순수하게 분리한 후 보관하며 내산성과 내담즙성 유무를 확인한 후 내산성과 내담즙성이 확인된 균주만을 선발하는 단계; 확인된 유산균주 중 유기산 생산능력이 높은 유산균주만을 최종적으로 재선발하는 단계; 확인된 유산균주 중 콜레스테롤의 흡착능력이 높은 유산균주만을 최종적으로 재선발하는 단계; 최종적으로 선발된 균주에 대하여 형태적, 생화학적 특성 및 지방산분석을 통한 균주의 동정 단계로 구성된다.

　　　 상기 단계에서 인간의 장내에서부터 유산균을 분리하는 배지로 유산균 분리용 배지인 MRS 한천배지를 사용하였다. 유산균을 배양하기 위해서는 전술한 배지와 동일한 성분을 사용하며 한천을 사용하지 않은 액체배지를 사용하였다.

　　　　유산균주의 균 동정은 버기의 매뉴얼 (Bergey's manual of determinative bacteriology)을 참고로 MIDI 시스템을 이용하여 지방산 분석과 함께 균주의 탄수화물 이용성을 평가할 수 있는 API 50 CHB kit를 사용하여 실시하였다.

　　　　이하 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만, 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1: 유산균의 분리 및 선발>

본 발명 유산균의 분리를 위해 인체의 분변시료 1g을 생리식염수 10ml에 현탁하고, 현탁액의 적당량을 취하여 유산균 분리용 한천배지(MRS)에 도말한 후 37℃에서 24시간 배양하였다. 한천배지에서 형성된 콜로니 중에서 서로 형태가 다르거나 유산균으로 판단되는 콜로니를 각각 순수 분리하고 현미경 관찰을 통하고 탄수화물 분해능을 평가하여 유산균 여부를 최종적으로 확인하였다.

<실시예 2 : 선발된 유산균의 내산성과 내담즙성 및 유기산 생산능력 확인>

상기 실시예 1에서 분리하여 선발된 유산균주의 내산성과 내담즙성을 확인하기 위하여 내산성은 pH 2, 3, 4, 5로 조정한 phosphate 버퍼에 선발된 유산균주를 10, 20, 30, 120분 방치한 후 MRS 한천배지에 도말하고 37℃에서 배양한 후 생존율을 확인하였으며 내담즙성은 MRS 한천 배지에 bile salt를 0.2, 0.3, 0.4, 0.5%(w/v)첨가하고 선발된 유산균주를 접종한 후 37℃에서 24시간동안 배양하여 생존여부를 확인하였다. 선발된 유산균주의 내산성과 내담즙성은 표 1에 나타내었다. 그리고 이 균주를 대상으로 우유의 발효 중 유기산 생산능력을 확인하기 위하여 시판 우유에 초기 접종량을 5%로 맞추고 37℃에서 배양하며 유산균주의 성장성과 유기산의 생성을 측정하였다. 측정된 종합적인 결과에 따라 최종적으로 내산성과 내담즙성이 우수하고 유기산 생산능력이 높은 유산균주를 선발하였다. 본 발명 락토바실러스 파라카제이 KBT2005 균주의 유기산 생산능력은 도 1에 나타난 바와 같다.

본 발명 락토바실러스 파라카제이 KBT2005 균주의 내산성과 내담즙성

반응시간 (분)	CLW-011 내산성에 대한 생존율 (%)
반응시간 (분)	pH2	pH3	pH4	pH5
10	80	100	100	100
20	65	100	100	100
30	54	95	100	100
120	46	90	100	100

Bile salt (%)	생존여부	비고
0.2	+	+; 생존, -; 비생존
0.3	+
0.4	±
0.5	-

<실시예 3; 락토바실러스 파라카제이 KBT2005 균주의 동정 및 특성조사 >

상기 실시예 2에서 내산성과 내담즙성을 지닌 유산균으로 선발된 균주를 형태적, 생리학적 특성을 조사하고 동정하였다.

　실험 결과, 선발된 유산균주의 형태적, 생화학적 특성은 표 2, 및 표 3에 나타낸 바와 같으며 카탈라아제 음성이다.

　　따라서, 상기 선발된 본 발명의 유산균을 락토바실러스 파라카제이 KBT2005 (Lactobacillus paracasei KBT2005) 균주로 명명하였고, 이를 한국미생물보존센터에 2005년 1월 29일자로 기탁번호 KCCM 10644P로 기탁하였다.

본 발명 락토바실러스 파라카제이 KBT2005균주의 형태적 특성

항목	콜로니					균체
항목	크기	색깔	투명도	표면고도	점질도	그람염색	모양
성질	2-3 mm	흰색	불투명	볼록	낮음	양성	막대

본 발명 락토바실러스 파라카제이 KBT2005균주의 탄수화물 이용성에 대한 생화학 적 특성

탄수화물	이용성	탄수화물	이용성	탄수화물	이용성
Glycerol	-	Mannitol	+	D-raffinose	-
Erythritol	-	Sorbitol	+	Amidon	-
D-arabinose	-	α-methyl- D-mannoside	-	Glycogene	-
L-arabinose	-	α-methyl-D-glucosamin	±	Xylitol	-
Ribose	+	N-acetyl-glucosamin	+	β-gentiobiose	±
D-xylose	-	Amygdaline	+	D-turanose	+
L-xylose	-	Arbutine	+	D-lyxose	-
Adonitol	-	Esculine	+	D-tagatose	+
β-methyl-xyloside	-	Salicine	+	D-fucose	-
Galactose	+	Cellobiose	+	L-fucose	-
D-glucose	+	Maltose	±	D-arabitol	-
D-fructose	+	Lactose	-	L-arabitol	+
D-mannose	+	Melibiose	-	Gluconate	±
L-sorbose	-	Saccharose	±	2-ceto-Gluconate	-
Rhamnose	-	Trehalose	+	5-ceto-Gluconate	-
Dulcitol	-	Inuline	-
Inositol	-	Melezitose	+

<실시예4; 콜레스테롤 감소 >

멸균한 MRS 액체 배지 9㎖에 1㎖의 콜레스테를 미셀을 첨가하여 최종 배지내의 콜레스테롤 수준이 100㎎/㎖이 되도록 하였다. 이 배지에 락토바실러스 파라카제이 KBT2005를 배양시켰으며, 배양 후 배지 내에 잔존하는 콜레스테롤 미셀 함량을 다음과 같이 측정하였다.

유산균에 의한 액체 배지 내 콜레스테롤 감소를 아래 표4와 같이 확인할 수 있다.

콜레스테롤 감소

배지	pH	잔존율 (%)
Without 0.2% bile extract
Control		93.25 ± 0.35
MRS broth	4.04	89.26 ± 2.68
MRS broth without Salts (with Tween 80)	4.13	86.80 ± 3.74
MRS broth without Tween 80 (with Salts*)	5.41	86.45 ± 1.40
MRS broth without Salts and Tween 80	4.84	91.57 ± 0.89

With 0.2% bile extract
Control		112.65 ± 0.7
MRS broth	4.71	83.95 ± 1.90
MRS broth without Salts (with Tween 80)	4.62	82.31 ± 4.95
MRS broth without Tween 80 (with Salts*)	4.95	56.12 ± 1.52

* : ammonium citrate, sodium acetate, MgSO₄.7H₂O, MnSO₄.4H₂O, dipotassium phosphate

<실시예5; 유해세균 억제 효과>

락토바실러스 파라카제이 KBT2005를 MRS 배지에 접종하여 37℃에서 24시간 배양한 후, 그 배양액을 분리하였다. Escherichia coli, Staphylococcus aureus 등의 각종 유해균이 도말된 한천 배지에 0.2㎖씩 떨어뜨린 후 37℃에서 24시간 배양한 뒤 유해균의 성장을 저해하는 범위의 지름을 측정하여 표5 및 도 2와 같이 유해균 억제 효과를 확인하였다.

유해균에 대한 생육 저해 효과

균종	저해범위 지름(mm)
Salmonella sp.	10
Klebsiella sp.	7
E.coli	15
Serratia sp.	22
Staphylococcus aureus	16
Morganella morgani	11
Shigella B	17
Shigella D	18
Enterococcus sp.	22

상기한 바와 같이, 본 발명은 유기산의 생성능이 높고, 내산성과 내담즙성, 콜레스테롤 저해 능력이 우수한 락토바실러스 파라카제이( Lactobacillus paracasei) KBT2005를 발효유의 종균제 및 생균제로 사용하여 인간의 건강증진에 이바지할 수 있는 장점이 있다.

도 1은 락토바실러스 파라카제이 KBT2005의 유기산 생성능을 나타낸 것이고

도 2는 유해균에 대한 생육 저해 효과를 나타낸 것이고

(좌 : 대장균에 대한 생육저해 효과 우 : 포도상구균에 대한 생육저해 효과)

Claims

내산성과 내담즙산성을 갖고 유기산 생성능이 높은 락토바실러스 파라카제이( Lactobacillus paracasei) KBT2005(KCCM 10644P)
요구르트 등의 발효유 종균제 및 생균제의 제조의 용도로 락토바실러 스 파라카제이 균주를 이용하는 것