KR100495864B1 - 자돈 분변에서 분리한 락토바실러스 속 미생물 및 상기 미생물을 첨가한 동물용 유제품 및 동물사료용 조성물 - Google Patents

자돈 분변에서 분리한 락토바실러스 속 미생물 및 상기 미생물을 첨가한 동물용 유제품 및 동물사료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 자돈 분변에서 분리한 락토바실러스 속 미생물 및 상기 미생물을 첨가한 동물용 유제품, 동물사료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 락토바실러스 속 미생물은 대장균 등 장내 유해미생물의 증식을 억제시켜 소화관 장애로 인한 가축의 폐사율을 감소시키는 효과가 있다.
또한 본 발명은 항생물질을 대체할 수 있는 생균제로 사용할 수 있는 효과가 있다.

Description

자돈 분변에서 분리한 락토바실러스 속 미생물 및 상기 미생물을 첨가한 동물용 유제품 및 동물사료용 조성물{LACTOBACILLI SEPARATED FROM EXCREMENT OF YOUNG PIG AND ANIMAL MILK PRODUCT AND FEED CONTAINING LACTOBACILLI}
본 발명은 자돈 분변에서 분리한 락토바실러스 속 미생물 및 상기 미생물을 첨가한 동물용 유제품, 동물사료용 조성물에 관한 것이다.
일반적으로 젖산균(lactic acid bacteria)은 탄수화물을 분해하고, 이를 이용하여 젖산을 만드는 세균으로서, 산소가 적은 곳에서 잘 증식하는 통성 혐기성균 또는 편성 혐기성균이다. 젖산균은 5개 속으로 구분할 수 있는데, 스트렙토코커스(Streptococcus), 페디오코커스(Pediococcus), 루코노스탁(Leuconostoc), 비피도박테리아(Bifidobacteria) 및 락토바실러스(Lactobacillus)로 나뉜다. 상기 연쇄상 구균인 스트렙토코커스 속 미생물은 동형발효균으로, 우유를 발효시켜 젖산을 생성함으로써 부패균이나 병원균을 억제하는 것으로 알려져 있다. 상기 페디오코커스 속 미생물은 사련균의 형태를 가지는 동형 발효균으로, 소시지 등의 육류 발효에 관여한다. 상기 쌍구균인 루코노스탁 속 미생물은 이형발효를 하며 채소류의 발효에 주로 관여한다. 상기 비피도박테리아 속 미생물은 산소가 있는 곳에서는 생육하지 못하는 편성 혐기성 균으로, 당을 발효하여 유아에게 유용하게 대사될 수 있는 L(+)형의 젖산을 생성한다. 마지막으로 상기 락토바실러스 속 미생물은 동형 또는 이형발효를 하는 젖산간균으로, 유제품이나 채소의 발효과정에서 흔히 볼 수 있는 균이다. 이들 중에서 사람의 장내에 가장 많은 젖산균은 편성 혐기성 젖산균인 비피도박테리아로서 락토바실러스, 스트렙토코커스 등과 같은 통성 혐기성 젖산균보다 약 1백 내지 1천배 이상 많이 존재하는 것으로 알려져 있다.
젖산균은 장내 pH를 산성으로 유지시켜 대장균이나 클로스트리디움(Clostridium sp.)과 같은 유해균의 번식을 억제하고 설사와 변비를 개선할 뿐 아니라, 비타민 합성, 항암작용, 혈청 콜레스테롤 저하 등의 역할을 한다. 특히, 젖산균은 장의 점막과 상피세포에 강하게 결합할 수 있는 특정 단백질을 가지고 있어 유해 세균의 생장을 막는 정장작용에 많은 도움을 준다. 또한, 젖산균은 대식세포의 증식을 촉진하여 대식세포의 장내 유해 세균에 대한 인지능력, 살균능력 등을 강화시키고, 면역 관련 물질의 분비를 촉진하여 면역 증강 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다(Gabriela perdigon, et al., J. of food Protection, 53:404-410, 1990; Katsumasa sato, et al., Microbiol. Immunol., 32(7):689-698, 1988). 그 중에서도 락토바실러스 속 미생물은 애시도필린(acidophillin)을 생산하여 이질균, 살모넬라균, 포도상구균 등 유해균의 생장을 저해하고, 설사 원인균의 증식을 억제하여 장내균총을 정상화함으로써 설사를 멈추게 하는 작용을 하는 것으로 알려져 있다. 사람에서 발견되는 락토바실러스 속 미생물로는 락토바실러스 애시도필러스(L. acidophilus), 락토바실러스 살리바리우스(L. salivarius) 및 락토바실러스 퍼르멘텀(L. fermentum) 등이 있다. 이외 락토바실러스 카제이(L. casei), 락토바실러스 플란타럼(L. plantarum), 락토바실러스 불가리쿠스(L. bulgaricus), 락토바실러스 헬베티쿠스(L. helveticus) 및 락토바실러스 유구르티(L. jugurti) 등은 사람의 장내에서 검출되지 않는 균에 속한다.
최근에는 사람의 장내에 소수 존재하는 락토바실러스 속 미생물을 장내에 정착시키기 위해, 락토바실러스 속 미생물을 분리하고 이를 이용하여 생균제, 식품첨가제 및 정장제 등으로 개발하고자 하는 연구가 활발히 진행되고 있다. 대한민국 특허출원 제2000-316517호에는 산생성능력 및 내산성이 우수한 신규 락토바실러스 애시도필러스 YD9904 균주 및 이를 함유하는 제품에 대해 개시되어 있고, 대한민국 특허출원 제2001-70689호에는 내산성 및 내담즙성이 우수하고, 병원성 미생물과 부패성 미생물의 생육을 억제시키는 항균능력이 있는 락토바실러스 애시도필러스 30SC에 대해 개시되어 있다. 또한 대한민국 특허출원 제2001-85666호에는 내산성, 내담즙성 및 인체 안전성이 우수하고, 병원성 세균 억제활성, 소취효과 등을 갖는 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) viro-01에 대해 개시되어 있으며, 대한민국 특허출원 제2001-11797호에는 로타바이러스 및 유해 미생물 억제 활성을 갖는 신규 내산성 락토바실러스 루테리 프로바이오-16 및 이를 함유하는 생균 활성제에 대해 개시되어 있다. 상기와 같은 락토바실러스 속 미생물에 대한 대부분의 연구는 내산성 및/또는 병원성 또는 부패성 미생물을 갖는 락토바실러스 속 미생물에 대해서 수행되어 오고 있다.
이러한 시점에서 락토바실러스 속 미생물 분리대상을 더욱 확대하고 신규 미생물을 분리하여 국내 농가에서 빈번히 발생하는 돈사, 우사 및 계사 등을 감소시킬 양질의 사료첨가제로 이용될 수 있는 생균제를 필요로 하고 있다.
상기 전술한 문제점을 해결하기 위한 본 발명의 목적은 자돈 분변에서 분리한 대장균 생장 억제력을 갖는 락토바실러스(Lactobacilli)속 미생물을 제공하는데 있다.
또한 본 발명의 목적은 락토바실러스(Lactobacilli)속 미생물을 함유한 동물용 유제품 또는 동물사료용 조성물을 제공하는데 있다.
상기 전술한 기술적 과제를 해결하기 위한 본 발명은 자돈 분변에서 분리한 락토바실러스속 미생물 및 상기 미생물을 첨가한 동물용 유제품, 동물사료용 조성물에 관한 것이다.
보다 상세히 설명하면 본 발명은 락토바실러스(Lactobacilli)속 미생물이 락토바실러스 애시도필러스 KY01인 것을 특징으로 하는 락토바실러스(Lactobacilli)속 미생물에 그 특징이 있다.
또한 본 발명은 락토바실러스(Lactobacilli)속 미생물을 함유한 동물용 유제품 또는 동물사료용 조성물에 그 특징이 있다.
이하 본 발명의 단계를 설명하면 다음과 같다.
본 발명에서는 자돈의 분변을 채취하여 0.02%의 소디움 아지드(Sodium Azide)가 첨가된 MRS배지를 이용하여 젖산균주를 분리한다.
상기 젖산균주의 내담즙성, 내산성 및 동물 장벽세포 흡착성을 측정하고, 젖산균의 당발효, 대장균 생장 억제력, 내담즙성, 내산성이 우수한 균주를 분리한다.
상기 분리한 젖산균주를 락토바실러스 애시도필러스 KY01(Lactobacillius acidophilus KY01)로 명명하고, 한국농용미생물보존센터에 2003년 3월 20일자로 기탁하였다(수탁번호:KACC 91041).
또한 상기 락토바실러스 애시도필러스 KY01(Lactobacillius acidophilus KY01)에 대해 당발효, 내담즙성, 내산성, 형태의 관찰, 장내 흡착성, 숙주 특이성, 대장균 생장 억제력을 측정한다.
본 발명자는 상기와 같은 방법으로 락토바실러스 애시도필러스 KY01(Lactobacillius acidophilus KY01)이 내산성, 내담즙성 및 대장균 억제능에 대해 우수한 결과를 나타냄을 입증한다.
이하 본 발명의 구성을 실시예, 시험예, 도표 및 도면을 통하여 상세히 설명하기로 한다. 다만, 본 발명의 권리범위는 실시예, 시험예, 도표 및 도면에 의하여 본 발명의 청구범위가 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
(1) 시료 채취
경기도 일대 양돈장의 이유전 자돈이나 갓 태어난 새끼돼지 돈사에서 가로 세로 각각 1㎝의 틀을 채취하고자 하는 바닥에 놓고 그 위로 가로 10회, 세로 10회, 좌우 대각선으로 각각 10회씩 멸균된 면봉으로 문질러서 채취한 다음 그 끝을 멸균가위로 절단해 MRS배지를 넣은 무균시험관에 넣어 시료를 취하였다. 시험관을 아이스박스(Ice Box)에 넣어 빠른 시간 내에 실험실로 운송하여 시험하였다.
⑵ 젖산균주의 분리
상기 실시예 (1)에 의해 실험실로 운송된 시료를 0.02%의 소디움 아지드(Sodium azide, NaN3)가 첨가된 MRS 액체배지를 37℃에서 24시간 배양하고, 0.02%의 소디움 아지드(Sodium azide, NaN3)가 첨가된 MRS 한천배지에 백금이를 이용하여 분산 접종하며 37℃에서 약 2일간 배양하였다. 상기 MRS 한천 배지상에서 생장한 특징적인 균락을 백금이로 채집하여 MRS 액체배지에 접종하고 다시 37℃에서 24시간 배양하였다. 배양액을 DYNA 원심분리기(Centrifuge, Clay Adams, Co. USA)를 사용하여 6,000rpm에서 15분간 원심분리하였고, 상등액을 버린 후 12% 탈지유 5㎖를 넣어 실험에 사용될 때까지 냉동(-70℃) 보관하였다.
⑶ 대장균 분리
서울대학교 수의과대학 병리학 연구실에서 1996년부터 3년간 국내 이유전 자돈의 설사병 병변을 나타내는 소장에서 분리한 대장균(E. coli) K88(F4): O149: H19(LT+, STb+), K99(F5): STa+, 987P(F6): STa+, F41(Kiowa): STa+, STb+를 분양받아 TSB(Difco)액체배지에 37℃에서 24시간 배양하였다. 배양액을 DYNA 원심분리기(Centrifuge, Clay Adams, Co. USA)를 사용하여 6,000rpm에서 15분간 원심분리하였고, 상등액을 버린 후 12% 탈지유 5㎖를 넣어 실험에 사용될 때까지 냉동(-70℃) 보관하였다.
⑷ 젖산균의 특성 분석
시험예 1. 젖산균의 내담즙성
MRS 배지에 0%, 0.1%, 0.3% 및 0.5%의 담즙추출물(from porcine, Sigma, USA)을 첨가하여 실험배지를 만들고, 순수분리하여 보관중인 균주를 해동하여 2회 계대 배양한 균주들은 약 105 CFU/㎖ 수준으로 1% 접종하여 37℃에서 24시간 배양 후 pH 및 생균수를 측정하였다.
시험예 2. 젖산균의 내산성
MRS 배지에 0.1N 염산(HCl)을 첨가하여 pH 2.0, pH 3.0 및 pH 4.0으로 조절한 다음 멸균하고 순수분리하였다. 보관중인 젖산균주를 해동하고 2회 계대 배양한 균주들을 약 107 CFU/㎖ 수준으로 1% 접종하여 37℃에서 20분 간격으로 2시간 생균수를 측정하였다.
시험예 3. 젖산균의 동물 장벽세포 흡착성
윤 등(1984)의 방법을 개량하여 사용하였으며, 이유전 자돈의 십이지장, 공장 부위와 닭의 소낭, 십이지장 부위를 채취하여 아이스 박스(Ice box)에 넣어 실험실까지 운반하여 사용하였으며, PBS완충용액(buffer)을 사용하였다. 장상피세포 준비는 이하와 같은 방법으로 준비하였다. 닭의 소낭 및 십이지장 부위, 자돈의 십이지장 및 공장의 부위를 채취하여 PBS를 사용하여 4℃에서 30분간 방치하고 PBS로 7회 세척하였다. 다시 슬라이드 글라스 끝부분으로 장상피세포를 채취하고 PBS로 부유하여 장상피세포 부유액을 제조하였다. 모든 세포의 부유액은 접착성 박테리아가 제거되는 지를 입증하기 위해서 현미경으로 시험하였다. 상기와 같이 준비된 장상피세포로 젖산균의 동물 장벽세포 흡착성의 시험은 이하와 같은 방법으로 시험하였다. 하룻밤 배양된 락토바실러스를 6000rpm/15분으로 원심분리하고 PBS로 재부유시켜 108 CFU/㎖의 균수를 포함하는 부유액을 제조하였다. 박테리아 세포부유액이 든 1㎖의 테스트 튜브에 1㎖의 장상피세포 부유액을 첨가하였다. 상기 혼합부유액을 37℃에서 30분간 20rpm으로 원심분리하였다. 순수 분리된 균주의 자돈상피에 대한 흡착성을 관찰하기 위하여 장상피세포 부유액과 혼합액을 백금이로 떠서 슬라이드 글라스 위에 도말한 후, 크리스탈 바이올렛(Crystal violet)을 사용하여 염색한 다음 사진기가 설치된 현미경(ZEISS AXIOPHOT, Germany)으로 침지유(Immersion Oil)를 사용하여 관찰하고 ASA 100 컬러필름을 사용하여 촬영하였다.
시험예 4. 젖산균의 전자현미경 관찰
자돈 젖산균주의 세포 형태를 관찰하기 위하여 최종선발된 균주를 순수분리하여 MRS 평판배지에 도말한 후 37℃에서 48시간 배양한 후 균락을 분리하여 4℃에서 3시간동안 0.05M 소디움 카코딜레이트(Sodium Cacodylate, pH 7.2)완충용액에서 2% 파라포름알데하이드(Paraformaldehyde)와 2% 글루타알데하이드(Glutaraldehyde)로 전결착시켰다. 결착시킨 후 0.05M 소디움 카코딜레이트(Sodium Cacodylate, pH 7.2)완충용액으로 4℃에서 10분간 3회 반복 세척하였다. 세척한 후 0.05M 소디움 카코딜레이트(Sodium Cacodylate, pH 7.2)완충용액에서 1% 오슈이움 테트록사이드(Osmium Tetroxide)를 첨가하여 4℃에서 2시간 후결착시켰다. 결착시킨 후 상온에서 증류수로 2회 세척하고 4℃에서 30분간 0.5% 뉴아닐 아세테이트(uranyl acetate)로 앤 블록(En bloc)염색하였다. 상온에서 10분 동안 에탄올 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 100%, 100.100% 각각을 처리하여 탈수시킨 후, 금으로 코팅하고 SEM(JSM-5410LV, JEOL, Japan)으로 관찰하였다.
시험예 5. 젖산균의 당발효
최종 선발된 균주를 10시간 배양하고 멸균된 0.1% 펩톤(peptone)용액으로 세척한 다음 다시 멸균된 0.1% 펩톤(peptone)용액으로 10배 희석하여 API kit(API50 CHL, BIOЕRIEUX, France)을 이용하여 사용법에 따라 접종액(inoculum)을 만들고 API 50 CHL배지에 접종하여 대(strip)를 만든 다음 37℃에서 24시간 배양한 후 색 변화를 관찰하였다. API 50 CHL의 배지의 조성은 이하 표 1과 같다.
API 50 CHL 배지의 조성
배지의 조성물 함 량
폴리펩톤(Polypeptone) 10g
효모 추출물(Yeast extract) 5g
트윈 80(Tween 80) 1㎖
디포타슘 포스페테이트(Dipotassium Phosphate) 2g
소디움 아세테이트 3H2O(Sodium acetate 3H2O) 5g
디암모늄 시트레이트(Diammonium citrate) 2g
마그네슘 썰페이트(Magnesium sulphate 7H2O) 0.2g
망간네이즈 썰페이트(Manganese sulphate 4H2O) 0.05g
브로모크레솔 퍼플(Bromocresol Purple) 0.17g
탈미네랄 수 1000㎖
시험예 6. 젖산균의 대장균 생장 억제력
젖산균의 선발은 헤리스(Harris 등, 1989)의 아가 웰 디퓨젼(Agar Well diffusion)방법을 개선하여 사용하였다. 멸균된 금속 천공 실린더(metal boring cylinder, diamete; 8㎜)를 세워둔 페트리디쉬(petridish)에 바텀 한천(Bottom Agar)으로 MRS 한천(agar, Difco) 20㎖를 붓고, 대장균(E. coli)이 105 CFU/㎖ 수준으로 접종된 반고형상 트립틱 한천 0.85%(Semi-solid Tryptic Soy Agar, Difco)를 부어 천공된 평판을 만들고 완전히 응고시켰다. 그 다음 실린더(cylinder)를 빼내고 MRS 한천(agar, Difco) 0.05㎖를 넣어 아래쪽을 막고 시험공에 각 균주의 배양액을 0.15㎖씩 주입하여 한천(agar) 평판을 4℃에서 12시간 방치하며 37℃에서 12시간 배양한 후 억제환을 관찰하여 억제력이 높은 균주를 선발하였다.
본 발명자는 상기 실시예 ⑴∼⑷(시험예 1∼시험예 6)에 의하여 대장균 생장 억제력, 내담즙성 및 내산성이 우수한 젖산균주를 분리하고, 상기 젖산균주를 락토바실러스 애시도필러스 KY01(Lactobacillius acidophilus KY01)로 명명하였다.
또한 본 발명자는 락토바실러스 애시도필러스 KY01(Lactobacillius acidophilus KY01)을 한국농용미생물보존센터에 2003년 3월 20일자로 기탁하여 기탁번호(KACC 91041)를 부여받았다.
이하 상기 락토바실러스 애시도필러스 KY01(Lactobacillius acidophilus KY01)을 상기 시험예 1∼6의 방법을 기초로 하여 형태 및 생장, 당발효, 내담즙성, 내산성, 장내 흡착성, 숙주의 특이성 및 대장균 생장 억제력의 정도를 측정하였다.
시험예 7. 형태 및 생장
상기 시험예 4의 시험방법으로 락토바실러스 애시도필러스 KY01(Lactobacillius acidophilus KY01)의 형태 및 생장을 관찰하였다.
이하 상기 시험예 7의 결과를 표 2에 나타내었다.
락토바실러스 애시도필러스 KY01의 형태 및 생장
젖산균의 형태 간균
45℃에서 생장 +a
15℃에서 생장 -b
카탈라아제 생산 -c
pH 9.6에서 생장 +a
pH 4.0에서 생장 +a
가스 생성 -c
그람염색 +d
a +; 생장 b -; 생성하지 않음 c +; 생성, -; 생성하지 않음 d +; 그람 양성, -; 그람 음성
상기 표 2에 나타낸 바와 같이 락토바실러스 애시도필러스 KY01(Lactobacillius acidophilus KY01)은 젖산균의 일반적인 형태인 간균의 형태를 나타내었다. 또한 상기 균주는 온도 45℃, pH 9.6 및 pH 4.0에서 생장이 가능하였다.
시험예 8. 당 발효
상기 시험예 5의 시험방법을 기초로 API CHL 50을 이용한 당 발효(당 이용성)를 측정하였다.
이하 상기 시험예 8의 결과를 표 3 및 표 4에 나타내었다.
락토바실러스 애시도필러스 KY01의 당 발효
탄수화물 락토바실러스 애시도필러스 KY01
글리세롤 -
에리트로톨 -
D-아라비노즈 -
L-아라비노즈 -
리보즈 -
D-자일로즈 -
L-자일로즈 -
아도니톨 -
β메틸-자일로사이드 -
갈락토오즈 -
D-글루코오즈 +
D-프락토오즈 +
D-만노오즈 -
L-솔보오즈 -
람노오즈 -
듈시톨 -
이노시톨 -
만니톨 -
솔비톨 -
α메틸-D-만노오사이드 -
α메틸-D-글루코사이드 -
N 아세틸 글루코사민 +
아미그달린 -
알부틴 -
에스쿨린 +
살리신 -
셀로바이오즈 +
+; 발효, -; 비발효
락토바실러스 애시도필러스 KY01의 당 발효
탄수화물 락토바실러스 애시도필러스 KY01
말토오즈 +
락토오즈 -
멜리비노오즈 -
슈크로오즈 +
트레할로오즈 +
이눌린 -
멜레지토오즈 -
라핀노오즈 +
전분 -
글리코젠 -
자일리톨 -
젠티오바이오즈 -
D-튜란노오즈 -
D-라이쏘즈 -
D-타가토오즈 -
D-퓨코오즈 -
L-퓨코오즈 -
D-아라비톨 -
L-아라비톨 -
글루코네이트 -
2 케토- 글루코네이트 -
5 케토- 글루코네이트 -
+; 발효, -; 비발효
상기 표 3 및 표 4에 나타낸 바와 같이 98.7%의 신뢰도로 락토바실러스 애시도필러스 KY01(L. acidophilus KY01)은 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus)로 판명되었다.
시험예 9. 내담즙성
상기 시험예 1의 시험방법으로 락토바실러스 애시도필러스 KY01(L. acidophilus KY01)의 담즙에 대한 내성을 측정하였다.
상기 시험예 9의 결과를 도 1에 나타낸 바와 같이 락토바실러스 애시도필러스 KY01(L. acidophilus KY01)은 담즙 농도에 따른 약간의 차이가 나타났지만 담즙에 대해서 내성이 있는 것으로 나타났다. 길리랜드(Gilliland)와 스펙(Speck, 1977)에 따르면, 0.15% 옥스갈(oxgall)이 첨가된 LBS배지에서 담즙에 대한 내성을 지닌 젖산균을 선별할 수 있으며, 담즙에 대한 내성이 있는 젖산균만이 장내에 정착할 수 있다고 보고하였다. 상기와 같은 이론을 바탕으로 락토바실러스 애시도필러스 KY01(L. acidophilus KY01)은 0.15% 이상의 담즙 농도에 대해 내성이 있는 것으로 나타나 장관 내에서 증식 가능성이 높은 균주로 유추할 수 있었다.
시험예 10. 내산성
상기 시험예 2의 시험방법으로 락토바실러스 애시도필러스 KY01(L. acidophilus KY01)을 첨가하고 0.1N 염산(0.1N HCl)으로 MRS배지를 pH 2.0으로 고정한 후 락토바실러스 애시도필러스 KY01(L. acidophilus KY01)을 20분 간격으로 2시간 동안 생균수를 측정하여 산성에 대한 내성을 측정하였다.
상기 시험예 10의 결과를 도 2에 나타낸 바와 같이 락토바실러스 애시도필러스 KY01(L. acidophilus KY01)은 pH 2.0에서도 강한 내성을 나타내는 것으로 나타났다.
콘웨이(Conway, 1987)에 따르면, 락토바실러스 애시도필러스(L. acidophilus ) ADH 균주가 내산성과 흡착력이 우수하다고 하였다. 김 등(1998)은 발효유제품의 스타터(starter)미생물은 pH 2.0에서 30분 경과시 생균수가 크게 감소한다고 보고한 반면, 락토바실러스 애시도필러스 KY01(L. acidophilus KY01)균주는 산에 대한 내성이 높게 나타났다.
시험예 11. 형태
MRS 한천 배지에서 생장한 락토바실러스 애시도필러스 KY01(L. acidophilus KY01)의 균락을 채취하고 고정하여 전자현미경(x5000)으로 형태를 관찰하였다.
상기 시험예 11의 결과를 도 3에 나타낸 바와 같이 락토바실러스 애시도필러스 KY01(L. acidophilus KY01)은 전형적인 간상형의 형태를 나타내었다.
시험예 12. 장내 흡착성
상기 시험예 3의 시험방법으로 이유전 자돈의 장 상피세포를 구하여 락토바실러스 애시도필러스 KY01(L. adidophilus KY01)의 십이지장(Duodenum), 공장(Jejunum), 회장(Illium), 결장(Colon) 부위의 상피세포에 흡착성을 광학현미경(x1500)을 통해 관찰하였다.
상기 시험예 12의 결과를 도 4a 및 도 4b에 나타낸 바와 같이 락토바실러스 애시도필러스 KY01(L. acidophilus KY01)은 십이지장, 공장 상피세포에서 잘 흡착하였으나, 결장상피세포에는 흡착하지 않았다. 이러한 결과는 풀러(Fuller, 1973)와 클리멘(Kleeman, 1981)이 보고한 동일 균속 중에서도 균주 차이에 다른 부위별 결착성의 차이를 나타낸다는 결과와 일치하였다.
시험예 13. 숙주의 특이성
상기 시험예 3의 시험방법으로 숙주 특이성을 보기 위해 닭의 소낭, 십이지장 상피세포에 대한 락토바실러스 애시도필러스 KY01(L. acidophilus KY01)균주의 흡착성을 광학현미경(x1500)으로 관찰하였다.
상기 시험예 13의 결과는 도 5a 및 도 5b에 나타낸 바와 같다. 장(1995)과 슈가라(Suegara, 1975) 등이 보고한 바와 마찬가지로 락토바실러스 애시도필러스 KY01(L. acidophilus KY01)은 숙주가 다른 경우 장 상피세포에 흡착하지 못하는 다른 숙주의 특이성을 나타내었다.
시험예 13의 결과와 상기 시험예 12의 결과를 비교해 보면, 락토바실러스 애시도필러스 KY01(L. acidophilus KY01)은 십이지장, 공장 상피세포에는 잘 흡착하는 반면, 닭의 소낭, 십이지장 상피세포에는 잘 흡착하지 않는 것으로 나타났다.
시험예 14. 대장균의 생장 억제력
실험균주 대장균(E. coli K88, K99, 987P, F41, Mixed)을 락토바실러스 애시도필러스 KY01(L. acidophilus KY01)의 배양액에 각각 105 CFU/㎖ 수준으로 접종한 후 MRS배지와 MRS배지에 2% 탈지유를 첨가한 배지를 이용하여 48시간 배양하여 락토바실러스 애시도필러스 KY01(L. acidophilus KY01)의 대장균 각각에 대한 생장 억제력을 측정하였다.
상기 시험예 14의 결과를 도 6a, 도 6b, 도 6c, 도 6d 및 도 6e에 나타낸 바와 같이 락토바실러스 애시도필러스 KY01(L. acidophilus KY01)의 생장속도는 MRS 배지보다는 탈지유를 첨가한 배지에서 생장속도가 빠르게 나타났고, 12시간이 지나면서 두 배지에서의 생장율은 모두 동일하게 유지되었다.
또한 대장균의 생장률은 MRS배지보다는 탈지유를 첨가한 배지에서 생장률이 약간 유지되었고 12시간이 지나면서 대장균의 생장률은 급격히 감소하였다. 이러한 결과는 KY01의 생장률이 12시간이 지나면서 일정한 상태로 유지되어 대장균을 억제하는 것으로 유추할 수 있었다.
본 발명자는 상기와 같이 락토바실러스 애시도필러스 KY01(Lactobacillus acidophilus KY01, 기탁번호: KACC 91041)이 당발효, 내담즙성, 내산성, 장내 흡착성, 숙주 특이성 및 대장균 생장 억제력 등이 있음을 확인하였다.
실시예 2
공지된 요쿠르트 제조방법으로 락토바실러스 애시도필러스 KY01(Lactobacillus acidophilus KY01, 기탁번호: KACC 91041)균주를 첨가하여 요쿠르트를 제조하였다.
이하 표 5 및 표 6에 락토바실러스 애시도필러스 KY01을 함유한 요쿠르트의 배합비를 나타내었다.
락토바실러스 애시도필러스 KY01을 함유한 요쿠르트의 배합비
원 료 배합비 A 배합비 B 배합비 C
탈지분유 0.40 0.40 3.05
우유 96.10 93.60 95.64
백설탕 0.60 0.60 0.60
락토바실러스 애시도필러스 KY01 2.50 5.00 0.42
물 0.40 0.40 0.29
락토바실러스 애시도필러스 KY01을 함유한 요쿠르트의 배합비
원 료 배합비 A 배합비 B 배합비 C
탈지분유 4.40 4.40 8.05
우유 78.10 80.60 75.77
과육시럽 14.10 9.10 15.01
락토바실러스 애시도필러스 KY01 2.50 5.00 0.42
물 0.40 0.40 0.25
안정제 0.50 0.50 0.50
실시예 3
공지된 사료 제조방법으로 락토바실러스 애시도필러스 KY01(Lactobacillus acidophilus KY01, 기탁번호: KACC 91041)균주를 첨가하여 사료를 제조하였다.
이하 표 7 및 표 8에 락토바실러스 애시도필러스 KY01을 함유한 사료의 배합비를 나타내었다.
락토바실러스 애시도필러스 KY01을 함유한 사료의 배합비
원 료 배합비 A 배합비 B 배합비 C
옥수수 62.5 64.0 64.0
대두박 22.0 22.2 13.3
어분 3.0 3.2 3.5
석회석 0.8 0.9 0.9
인산칼슘 1.3 1.2 4.0
가공염 0.3 0.2 1.4
당밀 1.0 1.0 0.4
과자분 2.0 2.0 2.0
영양제 3.3 3.5 3.7
락토바실러스 애시도필러스 KY01 2.0 0.1 5.0
멀캅탄(Mercaptane, ㎉/㎏) 3,250 3,250 3,270
칼슘 1.12 1.1 1.2
인 0.68 0.6 0.6
락토바실러스 애시도필러스 KY01을 함유한 사료의 배합비
원 료 배합비 A 배합비 B 배합비 C
옥수수 36.8 35.8 36.6
대두박 20.0 19.3 18.0
어분 1.2 2.0 2.0
석회석 0.5 0.5 0.5
가공염 0.2 0.2 0.2
분말우지 8.6 9.5 9.9
포도당 11.0 11.0 11.0
대두유 15.0 15.0 15.0
MCP 1.5 1.5 1.5
영양제 1.6 1.6 1.6
락토바실러스 애시도필러스 KY01 2.0 2.0 2.0
멀캅탄(Mercaptane, ㎉/㎏) 3,290 3,280 3,300
칼슘 1.00 1.00 1.00
인 0.6 0.6 0.7
또한 본 발명자는 경기도 일대의 농장 3곳(농장 A, 농장 B, 농장 C)에서 이유자돈을 대상으로 이유후 2주간 자돈 분변에서 분리한 락토바실러스 속 미생물로 제조한 요쿠르트(시험구)와 상기 락토바실러스 속 미생물로 발효시키기 이전의 탈지분유액(대조구)을 아침과 점심 사이에 200㎖를 급여하여 종료체중(㎏), 일당 증체량(ADG, g/day), 시험구 개선율 등의 락토바실러스 속 미생물로 발효시킨 요쿠르트의 급여효과를 측정하였다.
락토바실러스 속 미생물로 발효시킨 요쿠르트의 급여효과
농장 A 농장 B 농장 C
시험구A 대조구A 시험구B 대조구B 시험구C 대조구C
시험두수 66 66 50 50 45 48
개시체중(㎏) 7.42 7.55 6.12 5.70 6.04 5.82
종료체중(㎏) 8.76 8.36 8.32 7.47 6.63 5.96
일당증체량(g/day) 191 116 314 253 98 23
시험구 개선율 165% - 124% - 421% -
상기 표 9에 나타낸 바와 같이 개시체중, 종료체중, 일당증체량, 시험구 개선율은 대조구에 비해서 시험구는 유의한 증가를 나타내었다. 특히 일당 증체량은 농장 B가 가장 높게 나타났으며, 시험구 개선율에서는 농장 C가 가장 많이 증가하였다.
본 발명은 상술한 특정의 실시예, 시험예, 도표 또는 도면에 기재된 내용에 기술적 사상이 한정되지 아니하며, 청구범위에서 청구하는 본 발명의 요지를 벗어남이 없이 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 누구든지 다양한 변형의 실시가 가능한 것은 물론이고, 그와 같은 변경은 청구범위 기재의 범위 내에 있게 된다.
상기에서 상세히 설명한 바와 같이 본 발명은 자돈 분변에서 젖산균을 분리하고 대장균 생장 억제력이 우수한 락토바실러스 애시도필러스 KY01(L. acidophilus KY01)을 선별하여 동물용 유제품 또는 동물용 사료조성물의 첨가제로 사용함으로써 대장균 등 장내 유해미생물의 증식을 억제시켜 소화관 장애로 인한 가축의 폐사율을 감소시키는 효과가 있다.
또한 본 발명은 항생물질을 대체할 수 있는 생균제로 사용할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 0%, 0.1%, 0.3% 및 0.5%의 담즙 추출물을 함유한 MRS배지에서 배양한 락토바실러스 애시도필러스 KY01의 내담즙성을 나타낸 그래프이다.
도 2는 0.1N 염산을 첨가한 MRS배지(pH 2.0)에서 배양한 락토바실러스 애시도필러스 KY01의 내산성을 나타낸 그래프이다.
도 3은 락토바실러스 애시도필러스 KY01의 형태를 전자현미경으로 관찰한 것이다.
도 4a는 락토바실러스 애시도필러스 KY01의 돼지 십이지장 상피세포에 대한 흡착성을 나타낸 것이다.
도 4b는 락토바실러스 애시도필러스 KY01의 돼지 공장 상피세포에 대한 흡착성을 나타낸 것이다.
도 5a는 락토바실러스 애시도필러스 KY01의 닭 소낭에 대한 숙주 특이성을 나타낸 것이다.
도 5b는 락토바실러스 애시도필러스 KY01의 닭 십이지장에 대한 숙주 특이성을 나타낸 것이다.
도 6a는 락토바실러스 애시도필러스 KY01의 대장균 K88에 대한 억제력을 나타낸 그래프이다.
도 6b는 락토바실러스 애시도필러스 KY01의 대장균 K99에 대한 억제력을 나타낸 그래프이다.
도 6c는 락토바실러스 애시도필러스 KY01의 대장균 987P에 대한 억제력을 나타낸 그래프이다.
도 6d는 락토바실러스 애시도필러스 KY01의 대장균 F41에 대한 억제력을 나타낸 그래프이다.
도 6e는 락토바실러스 애시도필러스 KY01의 혼합 대장균에 대한 억제력을 나타낸 그래프이다.

Claims (4)

  1. 삭제
  2. 자돈 분변에서 분리한 대장균 생장 억제력을 갖는 락토바실러스 애시도필러스 KY01(Lactobacillus acidophilus KY01, 기탁번호 : KACC 91041) 균주.
  3. 제 2항의 락토바실러스 애시도필러스 KY01을 함유하는 것을 특징으로 하는 동물용 유제품.
  4. 제 2항의 락토바실러스 애시도필러스 KY01을 함유하는 것을 특징으로 하는 동물사료용 조성물.
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