FI109357B - Menetelmä Lactobacillus-kannan eristämiseksi - Google Patents

Description

109357

Menetelmä Lactobaci 11 us-kannan eristämiseksi Förfarande för isolering av en Lactobacillus-stam Tämä keksintö koskee menetelmää sellaisen Lactobacil-5 lus-kannan eristämiseksi, joka kanta on

Lactobacillus plantarum 299 DSM 6595,

Lactobacillus casei ssp. rhamnosus 271 DSM 6594, 10 ja jolla on kyky kolonisoida suoliston limakalvoja in vivo ja vakiintua niillä, kun kyseisiä bakteereja on otettu suun kautta, tai niiden muunnosta, jolla on olennaisesti vastaava REA-malli. Lisäksi keksintö liittyy menetelmään maha-suolikanavan infektioiden 15 ennaltaehkäisyyn tai hoitoon tarkoitetun koostumuksen valmistamiseksi.

Monien ihmisten suoliston mikrofloora on häiriintynyt, i mikä tarkoittaa, että hyödyllisten ja haitallisten suolistobakteerien välinen tasapaino on häiriintynyt. Joukko 20 tekijöitä, muun muassa stressi, sappisuolojen esiintyminen, ruokavalio jne. vaikuttavat bakteeriflooraan. Merkittävintä on kuitenkin, että nykyaikainen antibiootti-···. hoito voi tuhota normaali flooran pitkäksi ajaksi, ja si- *'! ten estää normaalin käymisprosessin. Jos käymisprosessi • · · 25 häiriytyy ja hyödyllisten bakteerien määrä pienenee, on ’· *j seurauksena, että paksusuolen limakalvo näivettyy ja lakkaa toimimasta, samalla kun potentiaaliset taudinai-: .· heuttajabakteerit lisääntyvät nopeasti. Nämä bakteerit ·* tunkeutuvat paksusuolen huonosti toimivan seinämän läpi 30 ja infektoivat kehon elimet. Tämä johtaa tehohoitoa vaa-;··: tivaan tilaan, jossa on märkäpesäkkeitä joka puolella kehoa, ja mahdollisesti myös useimpien kehon elinten * * · . , toiminnan lakkaamiseen, elinten kokoonpainumiseen. Vat- ’ ’·’ saontelon märkäpesäkkeiden aiheuttama "verenmyrkytys" eli ' ’ 35 sepsis on vieläkin hyvin yleinen vatsaontelon leikkauk- ; siin liittyvä kirurginen komplikaatio, jossa kuolleisuus on suuri. Näitä potilaita hoidetaan nykyään antibiooteil- I t | la ja märkäpesäkkeeseen kohdistuvalla kirurgisella toi- 2 109357 menpiteellä, siinä määrin kuin pesäke pystytään paikantamaan. Tällä hetkellä antibiootteja annetaan tavanomaisesti ennen suolistoon kohdistuvaa leikkausta siitä seuraa-vien infektioiden ja niiden aiheuttamien tautien vaaran 5 vähentämiseksi. Antibioottihoito on kuitenkin kallista.

Vaarana ovat myös erilaiset komplikaatiot, kuten allergia ja normaalin suolistoflooran tuhoutuminen sekä entistä patogeenisempien bakteerien liikalisääntyminen.

Se tosiseikka, että laktobasilleilla olisi edullinen 10 vaikutus suoliston limakalvoihin, on uudelleen esiin tuotu vanha ajatus. On vielä monelta kohdin epäselvää, mitä mikro-organismeja asiaan liittyy. Samoin suoliston ekologiassa on monia selvittämättömiä kysymyksiä. Toinen asiaan liittyvä ongelma on se, että Lactobacillus-suvun luo-15 kittelu on epätäydellinen, mistä syystä suoliston toiminnalle edullisten kantojen identifioiminen on vaikeaa.

Kuitenkin seuraavat seikat tuntuvat olevan tällä hetkellä yleisesti hyväksyttyjä: 20 - Lactobacillus-suvun bakteereilla on ilmeinen kyky eri tavoilla ehkäistä patogeenisten bakteerien vakiintu-*··.* mistä, niin elintarvikkeissa kuin suolistossa.

- Tietyt Lactobacillus-kannat ovat muita saman lajin * · ·/·· kantoja tehokkaampia suojaamaan ja aktivoimaan suolistoa.

·:·: 25 - Laktobasillien fermentoimilla elintarvikkeilla on osoittautunut olevan kolesterolia vähentävä vaikutus, todennäköisesti koska ne hillitsevät kolesterolin tuotan- · · toa suolistossa, mutta ehkä myös siksi, että bakteerit >(ti. käyttävät kolesterolia steroidien valmistukseen.

... 30 - Suurten laktobasillimäärien nauttiminen parantaa • · ·;·’ suoliston motorista aktiviteettia. Tämän vaikutuksen syy- • · · tä ei tunneta.

*:*·: - Suuri laktobasilliedustus suolistossa torjuu syö- . pää, mihin näyttää olevan useita syitä. Ensinnäkin tietyt 35 laktobasillit pystyvät nitriittireduktaasi-entsyymin ’···’ avulla ehkäisemään nitroosiamiinien tuotantoa suolistos- 3 109357 sa. Nitroosiamiinit aiheuttavat syöpää. Toiseksi lakto-basillit saattavat estää tiettyjä bakteerien tuottamia entsyymejä aktivoimasta potentiaalisesti karsinogeenisia aineita. Lisäksi on merkkejä siitä, että laktobasillit 5 vaikuttaisivat syöpäkasvaimiin kasvua rajoittavasti, kenties koska immunologisen puolustusjärjestelmän makrofagit aktivoituvat laktobasillien läsnäolosta.

Useimmissa tavallisissa elintarvikkeissa nykyään käy-10 tettyjen laktobasillien ratkaiseva heikkous on niiden huono hengissäpysyminen matkalla mahan ja pohjukaissuolen läpi. Tämän vuoksi kehitettiin tuote nimeltä "acidofilus-piimä", jossa maito on fermentoitu suoraan ihmisen ulosteesta eristetyllä Lactobacillus acidophilus -kannalla.

15 L. acidophilus selviytyy hyvin maha-suolikanavan yläosasta. On kuitenkin olennaista, jos halutaan vaikuttaa pitkäaikaisesti suoliston mikroflooraan, että laktobasilli pystyy vakiintumaan suolistossa. Artikkelin Lidbeck, A et ai, Scand J Infect Dis, 4, s. 531-537, 1987 mukaan suo-20 liston mikroflooran laktobasillimäärän kasvu, joka tapahtuu Lactobacillus acidophilusta sisältävän valmisteen ’··* nauttimisen jälkeen, hidastuu asteittain, kun tuotteen nauttiminen loppuu, ja siten bakteerifloora saavuttaa ·,’·· alkuperäisen koostumuksensa, kun on kulunut yhdeksän päi- 25 vää ilman laktobasillitäydennystä.

EP-A2-0 199 535 kuvaa biologisesti puhtaan Lactobacil-lus acidophilus -viljelmän, ATCC talletus nro 53 103, joka on eristetty ihmisen ulosteesta ja pystyy kokeissa tarttumaan limakalvosoluihin in vitro. Tarttumista ei 30 kuitenkaan ole osoitettu in vivo.

·;·’ WO 89/05849 kuvaa sian ruoansulatuskanavasta eristet- tyjä maitohappobakteereja, jotka on seulottu muun muassa ·:··; in vitro sian ruoansulatuskanavan epiteelisoluihin kiin- . nittymisen sekä hapon ja sapen sietokyvyn perusteella.

I I I

35 Mainituilla bakteereilla voidaan hapattaa maitoa, jota *···' sitten voidaan antaa porsaille mm. E. colin aiheuttaman 4 109357 ripulin ehkäisemiseksi tai hoitamiseksi.

Kaikki nykyään kaupallisessa käytössä olevat Lactobacillus -kannat on selektoitu sen perusteella, että ne ovat kohtalaisen kykeneviä kasvamaan tärkeissä perustuotteis-5 sa, kuten esimerkiksi maidossa. Jotta jollakin kannalla voisi olla lisäksi jokin muu hyödyllinen vaikutus, eräs edellytys on epäilemättä se, että kanta pystyy vakiintumaan suolistossa ja kilpailemaan siellä jo olevan mikro-flooran kanssa. Se, mitkä ominaisuudet ovat tarpeen, jot-10 ta tietty Lactobacillus-kanta kestää tämän kilpailun, on vielä suurimmaksi osaksi tuntematonta.

Tämä keksintö koskee sellaista ihmisen suoliston limakalvojen in vivo kolonisoimiseen ja niillä vakiintumiseen kykenevän Lactobacillus-kannan eristämisprosessia, joka 15 kanta on

Lactobacillus plantarum 299 DSM 6595,

Lactobacillus casei ssp. rhamnosus 271 DSM 6594, 20 jossa laktobasillit eristetään ihmisen suoliston limakalvoilta puhdasviljelmiksi sopivassa elatusaineessa ja selektoidaan sitten sen mukaan, millainen kyky niillä on kolonisoida suolisto ja vakiintua siellä.

·,'·· Kannan kyky kolonisoida suolisto testataan mieluiten ·:*·; 25 antamalla sitä suun kautta ja verifioimalla sen jälkeen kannan esiintyminen suoliston limakalvolla vähintään 10 • · ;'j‘; päivän kuluttua bakteerin antamisen lopettamisesta.

Eristettyjen kantojen täydentävä seulonta voidaan suo-<i>>; rittaa, joko ennen kolonisaatiotestiä tai sen jälkeen, ... 30 määrittämällä erilaisia toiminnallisia ja teknisiä omi- naisuuksia, kuten sapenkestävyys, pH-resistenssi, kyky */·: fermentoida vaadittua ainetta, edullisesti kauraa, ja tuottaa miellyttävä maku, lyofilisoinnin eli pakastus-. kuivauksen kestokyky, antibioottiresistenssi jne.

35 Selvitäkseen matkasta maha-suo li kanavan läpi valittu- ··· jen kantojen tulisi siis kyetä pysymään hengissä pH:ssa 5 109357 1,0 30 minuutin ajan sekä kasvamaan 0,1 %:isen sapen läsnäollessa.

Erään teorian mukaan fakultatiivisesti heterofermenta-tiiviset Lactobacillus-kannat ovat edullinen tyyppi 5 suolistossa vakiintumisen kannalta.

Keksinnön mukaisella menetelmällä eristetyillä uusilla Lactobacillus-kannoilla on kyky kolonisoida ihmisen suoliston limakalvoa in vivo, ja ne on talletettu Budapestin sopimuksen mukaisesti DSM:ään (Deutsche 10 Sammlung von Mikro-organismen und Zellkulturen GmbH), Braunschweig, Saksa, 2. heinäkuuta 1991. Ne ovat i

Lactobacillus plantarum 299 DSM 6595

Lactobacillus casei ssp. rhamnosus 271 DSM 6594 15

Keksinnön mukaisella menetelmällä eristetty kanta voi olla myös variantti, jonka REA-malli on olennaisesti samanlainen kuin yllä mainituilla kannoilla. REA-malli tarkoittaa kuviota, joka muodostuu jäljempänä kuvattavan 20 menetelmän mukaan restriktioentsyymillä pilkotun DNA:n elektroforeesissa agar-geelillä. Karakterisoimalla kannat *...· niiden REA-mallin avulla voidaan tunnistaa tutkittavat :.j.· eristetyt bakteerit. Tämä ei aikaisemmin ole ollut . ·.: mahdollista. Toisilleen läheistä sukua olevat *:··: 25 Lactobacillus-kannat, joiden REA-malleissa on eroa, osoittavat eroja kyvyssään tarttua suoliepiteeliin.

.·;·. Keksinnön mukaisella menetelmällä eristetty

Lactobacillus-kanta, jolla on kyky kolonisoitua ja vakiintua ihmisen suoliston limakalvoilla in vivo, voi 30 myös sisältyä maha-suolikanavan infektioiden ehkäisyyn ;·’ tai hoitoon tarkoitettuun koostumukseen yhdistettynä ta- : vanomaiseen kantaja-aineeseen.

·:··; Tavanomaisia kantaja-aineita ovat esimerkiksi fysiolo- . gisesti hyväksyttävät kyseisellä bakteerilla fermentoidut ·;;/ 35 substraatit sekä erilaiset elintarvikkeet, erityisesti '···’ tärkkelys- tai maitopohjaiset, mutta myös inertit kiinte- 6 109357 ät tai nestemäiset aineet, kuten suolaliuos tai vesi.

Sopivassa substraatissa pitäisi olla liuenneita tai kiinteitä kuituja, jotka eivät imeydy maha-suolikanavassa, ja joista laktobasilleilla fermentoidessa muodostuu lyhyitä 5 rasvahappoja. Esimerkkinä sopivista, tärkkelystä sisältävistä substraateista voidaan mainita viljat, kuten kaura ja vehnä, maissi, juurekset, kuten peruna, ja tietyt hedelmät, kuten vihreät banaanit.

Nykyaikainen lääketieteellinen sairaiden ja kirurgis-10 ten potilaiden hoito perustuu laajalti ravinnon antamiseen laskimoiden kautta, jolloin suolisto ei saa fermen-toitavaa ainetta, mistä on seurauksensa. Paksusuoli toimii kehon omana käymisastiana, jonka tarkoitus on valmistaa käyttökelpoisia ravintoaineita muun muassa paksusuo-15 Ien omaa toimintaa varten, mutta myös haitallisten aineiden, esimerkiksi raskasmetallien, liiallisen kolesterolin jne. eliminoimiseksi. Jotta paksusuoli voisi toimia, sen on saatava sopivia bakteereja ja substraatteja, erityisesti tärkkelystä ja ravintokuituja. Noin puolet pak-20 susuolen sisällöstä on bakteereja, enimmäkseen anaerobista tyyppiä. Tärkeimmät bakteerit ovat ne, jotka ovat • * · paksusuolen limakalvolla. Paksusuolen bakteereista vähem-mistö on potentiaalisesti haitallisia. Niin kauan, kuin . ·,: läsnä on hyödyllisiä bakteereja, haitallisen bakteeri- ;·· 25 flooran kasvu estyy. Tuoreet tutkimukset ovat osoitta- neet, että paksusuolen limakalvo saa suurimman osan ra- * » vinnostaan fermentaatiotuotteista, pääasiassa lyhyiden rasvahappojen muodossa. Normaali fermentaatioprosessi vaatii noin 30 kuitugramman saantia päivittäisessä ravin-30 nossa sekä sopivien bakteerien läsnäoloa.

;·’ Edullinen koostumuksen substraatti, joka myös antaa ; koostumukselle erinomaisen ravintoarvon, on kauraan ·:··· perustuva ravintoliuos. Kaurahiutaleet ovat , ", osoittautuneet monella tavalla hyväksi fermentaation ·;;/ 35 substraatiksi: niissä on runsaasti proteiineja, hiilihyd- '·· raatteja, rasvaa, ravintokuituja sekä vesiliukoista kui- 7 109357 tua, ns. beta-glukaaneja. Lisäksi kaura, kauranjyvien rasva, sisältää hyvin runsaasti pinta-aktiivisia fosfoli-pidejä, jotka toimivat mahan limakalvon "korroosion estäjinä" ja siten suojaavat limakalvoa. Lopuksi kauran pro-5 teiinien aminohappokoostumus vastaa suurelta osin ihmisen tarpeita. WO 89/08405 kuvaa enteraaliseen ruokintaan sopivan ravinnekoostunnuksen, joka saadaan yhdistämällä kauran entsymaattinen hajottaminen a-amylaasilla, mahdollisesti proteaasilla, ja β-glukanaasilla sekä kuumakäsit-10 tely ja fermentaatio laktobasilleilla, jotka kykenevät kiinnittymään suolistoon spontaanisti. Mainitussa patent-i tihakemuksessa kuvattu ravintokoostumus yhdessä tämän keksinnön mukaisella menetelmällä eristetyn Lactobacillus -kannan kanssa on erinomainen koostumus ravinnon 15 antamiseksi potilaille normaalin hoidon yhteydessä suurten leikkaustoimenpiteiden jälkeen, sepsiksen ja elinten kokoon painumisen uhrien erityishoitoon sekä eri suolistosairauksien, esimerkiksi haavaisen paksusuolen tulehduksen hoitoon.

20 Ollakseen käyttökelpoinen kaurahiutalepohjaisessa ravintokoostumuksessa Lactobacillus-kannan tulisi täyttää seuraavat ehdot: • - fermentoi kauraa hyvin - säilyy hengissä pH:ssa 1,0 (joka vastaa mahan pH:ta) ·;··· 25 30 minuuttia |V. - säilyy hengissä ja kasvaa sappisuolojen läsnäollessa - omaa kyvyn asettua suoliston limakalvolle ja pysyä siinä.

. On myös olennaista, että pH-arvo laskee fermentaation 30 aikana nopeasti, jotta muiden bakteerien kasvu estyy.

·;' On osoitettu, että sellaisten laktobasillien antami- nen, joilla on kyky kolonisoitua tai tarttua suolistoon, ·;··· voi torjua muunlaisen bakteeritlooran kolonisoimasta suo- . listoa, ja siten vähentää sepsiksen riskiä bakteeri-in- 35 fektioiden, kuten vatsaontelon leikkauksia seuraavien komplikaatioiden yhteydessä. Tämä hoito näyttää olevan 8 109357 yhtä tehokas kuin nykyään käytetty tavanomainen hoito antibioottien muodossa. Siten vaikuttaa järkevältä, että potilaat, joille tehdään suolileikkaus, esihoidetaan lak-tobasilleilla mieluummin kuin antibiooteilla. Näin voi- i 5 täisiin vakiinnuttaa entistä halvempi hoitomuoto, jolla on vähemmän mahdollisia sivuvaikutuksia, koska normaali suolistotloora ei tuhoutuisi.

Keksinnön mukaisella menetelmällä eristettyä Lactobacilius-kantaa voidaan käyttää myös osana fermen-10 toitua ravintokoostumusta, jota annetaan antibioottien sijasta, kirurgisiin leikkauksiin liittyvien bakteeri-infektioiden ehkäisyyn tai hoitoon, leikkauksen jälkeiseen kuntoutukseen jne.

Eläinkokeet ovat osoittaneet tilastollisesti merkit-15 sevää kyseisestä eläinlajista eristettyä Lactobacillus-kantaa sisältävällä koostumuksella käsiteltyjen eläinten eloonjäämistä. Rottakokeet ovat osoittaneet, että koostumus ehkäisee kokeellisesti aiheutetun paksusuolen tulehduksen (colitis) ja suolistohaavojen syntyä ja nopeuttaa 20 niiden paranemista.

Ravintokoostumus voidaan antaa millä tahansa sopivalla • · · ·...·’ tavalla, edullisesti suun tai peräsuolen kautta, esimerkiksi peräruiskeena. Se voidaan antaa myös enteraalisesti katetrilla joko mahalaukun kautta tai suo-·:*·· 25 raan suolistoon. Kokeet ovat osoittaneet, että vaikutus j*.\ tehostuu, jos annetaan myös ravintokuituja esimerkiksi i · kaurahiutalevellin tai β-glukaanien muodossa. Hoidon tulisi tapahtua yhden tai useamman kerran päivittäin, 1 -. 2 viikon ajan.

30 Liitteinä olevista kuvista 1 ja 2 näkyy uusien Lacto- bacillus-kantojen 299 ja 271 REA-mallit. Kuvasta 3 näkyy laktobasillien konsentraatio ileumissa ennen laktobasil-·:··· leiliä fermentoidun kauravellin nauttimista, välittömästi , sen jälkeen sekä vastaavasti muutaman päivän kuluttua.

« t * I > I i i 9 109357 ESIMERKKEJÄ

Lactobacillus-kantoien eristäminen ihmisistä

Jotta saataisiin eristettyä kantoja, joilla on kyky kolonisoida ihmisen suoliston limakalvoa ja vakiintua 5 siinä, Lactobacillus-kantoja kerättiin ihmisen limakalvolta. Paksusuolesta otettiin kudosnäytteitä suolentähys-timen avulla, ja ohutsuolen (jejunum ja ileum) paloja otettiin kirurgisten leikkausten yhteydessä. Limakal-vonäytteet pantiin välittömästi erityiseen elatusainee-10 seen (0,9 % NaCl, 0,1 % peptoni, 0,1 % Tween 80 ja 0,02 % kysteiini, kaikki pitoisuudet paino/tilavuus-prosentteina) , homogenoitiin 2 minuutin ultraäänikäsittelyllä ja sekoitettiin 1 minuutin ajan ennen siirtoa Rogosa-agaril-le (Difco Laboratories, Detroit, Michigan, USA). Maljoja 15 inkuboitiin anaerobisesti 37 °C, 2 d (Gas Pak Anaerobic

System, BBL). Yhdestä kolmeen pesäkettä poimittiin satunnaisesti kultakin maljalta kasvatettiin puhdasviljelmiksi 5-9 kertaa Rogosa-agarilla, ja säilytettiin tiheinä viljelminä jäädytetyssä puskurissa lämpötilassa -80 °C.

20 Kaikkiaan 209 Lactobacillus-kantaa eristettiin noin 61 eri koehenkilöstä. Kaikki eristetyt kannat karakterisoi-tiin 49 eri hiilihydraatin fermentointikyvyn suhteen kau-pallisen testipakkauksen API 50 CH:n avulla (API, Monta-.'\i lieu Verceu, Ranska). Ohutsuolen ja paksusuolen lakto- ;··· 25 basilliflooran koostumuksesta ei löydetty merkittävää eroa.

• ·

Eri ryhmien edustavista kannoista määritettiin pH- I I f resistenssi, kyky kasvaa sapen läsnäollessa sekä kyky . fermentoida kauravelliä.

30 pH -resistenssi testattiin lisäämällä 0,1 ml:aan bak- ··' teerisuspensiota (109 CFU/ml, joka oli viljelty Rogosa- lihaliemessä, sentrifugoitu ja resuspendoitu fysiologi-seen suolaliuokseen) 2 ml fosfaattipuskuria, pH 1,0. 30 , ·, minuutin kuluttua suspensio ympättiin Rogosa-agarmaljoil- I « » 35 le, ja jos 3 päivän 37 °C:ssa inkuboinnin jälkeen oli nä-’·.* kyvissä minkäänlaista kasvua, testi katsottiin positiivi- 10 109357 seksi. Vain muutama testatuista kannoista läpäisi tämän kokeen.

Kasvu sapen läsnäollessa testattiin kasvattamalla eristettyjä laktobasilleja 0,1% ja vastaavasti 0,15% 5 naudan sapen läsnäollessa Rogosa-agarmaljoilla, joita inkuboitiin anaerobisesti kolme päivää 37 °C:ssa. Noin 80 % kannoista pystyi kasvamaan 0,1% sapen läsnäollessa, kun taas vain 18 % pystyi kasvamaan 0,15% sapessa.

Näiden tulosten perusteella valittiin 20 eri Lactoba-10 cillus-kantaa jatkotutkimuksiin.

Ihmisen suoliston kolonisaatio in vivo Terveille koehenkilöille annettiin tietyn ajan päivittäin annos fermentoitua kauravelliä, johon sisältyi kah-15 denkymmenen eri Lactobacillus-kannan seos. Kannat oli selektoitu huolellisesti yllä kuvatun mukaan. Sen jälkeen tutkittiin, mitkä nautituista kannoista olivat löydettävissä ohutsuolen ja paksusuolen limakalvoilta.

Fermentoitu kaurahiutalevelli tehtiin jäljempänä kuva-20 tun menetelmän mukaan. Tämä tehtiin kullakin tutkimuksen Lactobacillus-kannalla, kuten jäljempänä ilmenee taulu- • · · kosta 1. Erilaiset valmisteet sekoitettiin sellaisissa suhteissa, että lopullinen valmiste sisälsi 8 x 107 CFU grammassa pakastuskuivattua tuotetta.

* » *;··· 25 Tutkimukseen osallistui 12 iältään 31 - 56-vuotiasta vapaaehtoista, joista kukin sai kymmenen 100 ml pullol-lista nestemäistä kauravelliä, joka pohjautui grammaan » · · pakastuskuivattua tuotetta vesimillilitraa kohti. Suo- , liston limakalvoista otettiin näytteitä ennen kuin kaura- • * · « * [ / 30 velliä oli alettu nauttia, 11 päivän kuluttua, kun koe- • · ···' henkilöt olivat syöneet päivittäin 100 ml kauravelliä aamiaiseksi 10 päivän jakson aikana, ja vielä kymmenen t t päivän kuluttua, toisin sanoen 11 päivää kauravellin , nauttimisen lopettamisesta. Suolinäytteet otettiin kudos- ··; · 35 näytteinä ohutsuolesta (ileum) Watsonin kapselin avulla *.··’ sekä rectumista peräsuolen tähystimen avulla. Kudosnäyt- 11 109357 teet preparoitiin edellä kuvatulla tavalla ja analysoitiin elävien laktobasillien osalta. Kustakin näytteestä poimittiin Rogosa-agarmaljalta noin kymmenen pesäkettä, joita kasvatettiin puhdasviljelminä ja säilytettiin pak-5 kasessa -80 °C:ssa, kunnes ne identifioitiin.

Kaikki eristetyt kannat testattiin API 50 CH:lla kuten edellä. Isolaatit, jotka näyttivät vastaavan tai pääasiassa vastaavan mitä tahansa testikannoista, tutkittiin edelleen plasmidianalyysillä ja restriktioendonukleaasi-10 analyysillä jäljempänä kuvattujen menetelmien mukaan.

Yleisenä suuntauksena havaittiin, että suoliston limakalvon laktobasillimäärä kasvoi fermentoidun kauravellin nauttimisen aikana, ja että tämä kasvu jatkui 11 päivää nauttimisen päätyttyä. Kuvassa 3 on esitetty pylväsdiag-15 rämmin avulla laktobasillien logaritminen konsentraatio ileumissa ennen kokeen alkua (t=0), kokeen päättämisen jälkeisenä päivänä (t=l) ja vielä 10 päivän kuluttua (t=ll) . Lisäys oli selvempi ohutsuolessa, mutta toisaalta laktobasillimäärä kokonaisuudessaan oli suurempi pak-20 susuolessa. Lisäksi voitiin huomata, että colonin sisältämät gram-negatiiviset anaerobibakteerit olivat vähenty-

III

. /· neet fermentoidun kauravellin nauttimisen jälkeen.

* Seuraavia kantoja löydettiin vallitsevassa asemassa suoliston limakalvolta 10 päivää laktobasillien nauttimi-25 sen loppuunsaattamisesta: rv. Lactobacillus plantarum 299 löydettiin 11 koehenkilös- *..*t tä (viidellä koehenkilöllä ainoastaan ohutsuolesta ja i · viidellä muulla vain paksusuolesta);

Lactobacillus casei ssp. rhamnosus 271 löytyi neljästä vt»*» 30 koehenkilöstä (yhdellä vain ohutsuolesta ja kahdella » » ...* muulla vain paksusuolesta); ;*·,· Lactobacillus reuteri 108 löytyi neljästä koehenkilös- • » tä (yhdellä koehenkilöllä vain ohutsuolesta ja yhdellä muulla vain paksusuolesta); ti* '·· : 35 Lactobacillus murinus/casei ssp. tolerance 294 löytyi kahdesta koehenkilöstä.

12 109357

Kantoja, jotka eristettiin uudelleen 11 päivää bakteerien nauttimisen lopettamisesta, löydettiin limakalvolta noin konsentraatiossa 3 x 103 - 105 CFU/g ohutsuolen limakalvoa ja konsentraatiossa 103 - 3 x 107 CFU/g paksusuolen 5 limakalvoa.

Kaurahiutalevellin valmistus

Fermentoitua kaurahiutalevelliä valmistettiin kolmessa vaiheessa: 10 (i) 1295 g kaurahiutaleita (MP-450, Nord-Mills,

Jarna, Ruotsi); proteiinipitoisuus 14,2 % ja tuhkapitoisuus 2,1 %), 129,5 g entsyymiseosta (Nord Malt, Söder-hamn, Ruotsi) ja 5390 g vesijohtovettä sekoitettiin ja kuumennettiin 95 °C:seen sekoittaen hitaasti. Velli jääh-15 dytettiin 50 °C:seen, lisättiin 1 % (w/v eli paino/tila-vuus) β-glukanaasia (GV-L, Grindsted Products A/S, Bra-band, Tanska) ja inkuboitiin 2 tuntia 50 °C:ssa (ii) Velliin ympättiin tuoreita laktobasilleja ja fer-mentoitiin 15 - 20 tuntia 37 °C:ssa. pH oli 3,4 - 3,9.

20 Fermentointi suoritettiin kullakin eri kannalla erikseen, j ja pesäkkeitä muodostavien yksiköiden (CFU) lukumäärä j tuotemillilitraa kohti Rogosa-agarilla (anaerobisesti 37 ··_ °C:ssa, 20 tuntia) vaihteli välillä 6 x 106 - 2 x 108 "! (iii) Fermentoitu velli pakastuskuivattiin. Eri velle- 25 jä sekoitettiin sellaisessa suhteessa, että saatiin kai-'· '· kille kannoille sama CFU/g -arvo. Seosta täydennettiin * * 20 % (w/w) soijajauholla (proteiinia 51 %, tuhkapitoisuus : '.· 5,5 %, rasvaa 1 %) . Rikastettu seos sisälsi 2 x 107 CFU/g V ·' ja sitä pidettiin -18 °C:ssa. Fermentoimaton kaurahiuta- 30 levelli valmistettiin yllä kuvatulla tavalla, mutta fer- ·;··· mentoimatta.

Kauravelliä valmistettiin kaikilla 20 yllä kuvatun ,· _ suolistokolonisaatiotestin avulla selektoidulla kannalla ’· ja siitä määritettiin konsentraatio ennen ja jälkeen pa- * * 35 kastuskuivauksen sekä maku. Tulokset esitetään seuraavas- • sa taulukossa 1.

· « 13 109357

Taulukko 1

Kliinisiin testeihin valitut Lactobacillus-kannat

Kanta Kuvaus CFU/g CFU*/g Maku*** nro.

138 "aggregoituva" 8,8 x 106 1,78 x 106 1 132 L. salivarius 1,1 x 108 6,5 x 106 3 47 L. reuteri 1,2 x 109 3,7 x ΙΟ7 1 108 L. reuteri 1,5 x 109 1,88 x 107 1 98 L. casei pseudo- plantarum 1,63 x 109 6,6 x 108 2 292 L. gasseri 1,58 x 109 5,1 χ 108 4 299 L. plantarum 1,92 χ 109 6,71 x 108 5 136 L. casei casei 3,5 χ 109 1,48 χ 109 2 AI L. plantarum 2,27 χ 109 4,15 χ 108 5 271 L. casei rhamnosus 4,3 χ 109 6,10 χ 108 4 227 L. buchneri 9,45 x 10 1,81 χ 108 1 140 L. gasseri 1,2 χ 108 8,5 χ 106 4 294 L. murinus/casei tolerance 1,63 χ 109 1,3 χ 108 3 283 L. plantarum 7,43 χ 108 7,55 χ 107 4 ... 282 klusteri 25** 7,8 χ 108 6,65 χ 107 2 96 klusteri 19** 4,9 χ 108 4,3 χ 107 3 99 klusteri 12** 4,6 χ 109 1,39 χ 109 4 '· *·’ 99* klusteri 12** 1,0 χ 109 1,6 χ 108 2 * * 308 L. acidophilus 5,9 χ 108 1,0 χ 108 3 • 280 L. salivarius 3,0 χ 108 2,43 χ 106 3 • · · * pakastuskuivauksen jälkeen • j· | ** klusterinumerointi viittaa G. Molinin et ai työhön suolistoon liittyvien laktobasillien numeerisesta tak- • < sonomiasta (julkaistavana).

*· '·' *** asteikolla 5-1 ; Kyvyn antaa kauravellille fermentaation kautta miel- 14 109357 lyttävä raaku arvioi nelihenkinen "asiantuntijalautakun-ta", joka arvioi eri kantojen fermentoimia kauravellejä.

Maku arvioitiin laskevalla asteikolla viidestä yhteen, missä 5 tarkoittaa arviota "erittäin hyvä" ja 1 arviota mauton tai epämiellyttävä. Valittujen 20 testikannan arviointitulokset ovat edellä taulukossa 1.

Kauravellin fermentointi

Ne neljä kantaa, joita löydettiin dominoivassa määrin suoliston limakalvoilta, tutkittiin edelleen kauravellin fermentointikykynsä mukaan, pakastuskuivauksen sietokykynsä sekä kauravellin maunkehityksen suhteen.

Kyky fermentoida kauravelliä arvioitiin määrittämällä kyky alentaa pH 4,0:n alle ja muodostaa pesäkkeitä >108 CFU/g märkää painoa.

Kyky kestää pakastuskuivaus kauravellissä oli toinen valintakriteeri. Tässä yhteydessä mitattiin CFU-pitoisuus pakastuskuivauksen jälkeen.

Yllä mainitun kauravellitestin tulos näkyy seuraavasta taulukosta 2.

1S 109357

Taulukko 2

Kauravellin hapattaminen valituilla Lactobacillus-kan noilla

Kanta 299 271 294 108 lopullinen pH 3.6 3.8 3.4 3.8 happoluku 8.0 6.5 8.1 6.5 L-laktaatti, g/100 g 0.18 0.40 0.32 0.25 D-laktaatti, g/100 g 0.390 0.031 0.24 0.19 kokonaislaktaatti, g/100 g 0.57 0.43 0.55 0.44 D-laktaatin %-osuus 69 7 43 44 asetaatti, g/100 g 0.0084 0.013 0.13 0.0026 katoprosentti pakastuskuivauksessa 65 86 94 98 lopullinen CFU/g 2xl09 4xl09 8x10® lxlO9

Lisäksi valittujen neljän kannan maku arvioitiin, ver-rattuna toisaalta kaupalliseen jogurttiviljelmään (Strep-* " tococcus thermophilus ja Lactobacillus bulgaricus) ja • ’ toisaalta kaupalliseen acidophiluspiimäviljelmään (Lac- tobacillus acidophilus) , käyttäen samoja arvosanoja kuin : : edellä. Tulokset seuraavassa taulukossa 3.

• · 16 109357

Taulukko 3

Lactobacillus-'kannoilla hapatetun kauravellin maku

Jogurtti Acidophilus- 299 271 294 108 piimä 3 2 5 4 3 1 Näiden arvojen perusteella kantojen 299 ja 271 arvioitiin olevan erityisen kiinnostavia ja niitä kuvataan seu-raavassa yksityiskohtaisemmin.

Lactobacillus-kantojen 299 ja 271 kuvaus

Kannat 299 ja 271, jotka kumpikin eristettiin terveestä ihmisen suolen limakalvosta, on talletettu kokoelmaan Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen | GmbH, 2. heinäkuuta 1991, ja niille on annettu talletus- ! numerot DSM 6595 (299) ja DSM 6594 (271) .

Fenotyyppikuvaus

Kannat 299 ja 271 ovat gram-positiivisia, kata-laasinegatiivisia sauvoja, jotka kasvavat Rogosa-agarilla PH :ssa 5,5. Kantojen kapasiteetit fermentoida eri hiili- '( hydraatteja näkyvät taulukossa 4. Kokeet on tehty API 50 CH:lla valmistajan ohjeiden mukaan.

17 109357

Taulukko 4

Kyky muodostaa happoa eri hiilihydraateista

Kanta 299 271 j 1. Glyseroli I 2. Erytritoli - - 3. D-arabinoosi - - 4. L-arabinoosi + - 5. Riboosi + + 6. D-ksyloosi 7. L-ksyloosi 8. Adonitoli 9. β-metyyli-ksylosidi 10. Galaktoosi + + 11. D-glukoosi + + 12. D-fruktoosi + + 13. D-mannoosi + + 14. L-sorboosi - + 15. Ramnoosi 16. Dulsitoli “ “ 17. Inositoli “ 18. Mannitoli + 19. Sorbitoli + 20. a-metyyli-D-mannosidi + 21. a-metyyli-D-glukosidi “ + 22. N-asetyyli-glukosamiini + + 23. Amygdaliini + + 24. Arbutiini + ^ 25. Eskuliini + 26. Salisiini + 27. Sellobioosi + ... 28. Maltoosi + ·,,,· 29. Laktoosi + , ,·, 30. Melibioosi + '··'· 31. Sakkaroosi + 32. Trehaloosi + ) 33. Inuliini * “ + 34. Meletsitoosi + 35. D-raffinoosi : 36. Amidoni ;T; 37. Glykogeeni 38. Zylitoli ” + 39. β-gentiobioosi + 40. D-turanoosi + 41. D-lyksoosi ” + 42. D-tagatoosi 43. D-fukoosi 44. L-fukoosi ; 45. D-arabitoli 46. L-arabitoli ~ + 47. Glukonaatti j J J 48. 2-keto-glukonaatti ,··>_ 49. 5-keto-glukonaatti 18 109357

Fenotyyppisesti kanta 299 voidaan tunnistaa Lactobacillus plantarumiksi (vain raffinoosi erosi L. plantarum ATCC 14917T:n, L. plantarum-lajin tyyppikannan eli lajin määrittävän kannan testituloksista). 271 voidaan tunnis-5 taa alalajiksi Lactobacillus casei subsp. rhamnosus (vastaa täysin lajin tyyppikantaa).

Genotyypin kuvaus Näitä kahta kantaa on tutkittu kromosomaalisen DNA:n 10 pilkkoutumismallin suhteen, kun DNA on pilkottu EcoRI:-11a, tutkimusmenetelmänä restriktio-endonukleaasi-analyy-si (REA, artikkelin Stähl M, Molin G, Persson A, Ahrne S & Stähl S, International Journal of Systematic Bacteriology, 40:189-193, 1990 kuvaaman menetelmän mukaan).

15 REA voidaan esittää kaavamaisesti seuraavasti: (1) Kromosomaalinen DNA eristetään tutkittavista kannoista (2) DNA pilkotaan restriktioentsyymeillä (3) Pilkotun DNA:n fragmentit erotellaan koon mukaan 20 agaroosigeelielektroforeesilla (4) Eri kantojen juovamallit rekisteröidään ja tul kitaan laserdensitometrin ja siihen liittyvien ohjelmien avulla. Kantojen REA-mallissa ilmenevät erot voidaan ilmaista matemaattisesti pääkompo-;·_ 25 nenttianalyysin avulla. 1990).

’* Lisäksi on tehty plasmidien sisältöä koskeva tutkimus ’ ' (artikkelin Ahrne S, Molin G & Stähl S, Systematic and i Applied Microbiology 11:320-325, 1989 mukainen menetel- '/< ’· mä) .

30 Kanta 299: Tämä kanta sisältää neljä plasmidia, joiden ·:··· koot ovat 4 MDal, 9 MDal, 20 MDal ja vastaavasti 35 MDal.

Kromosomaalisen DNA:n pilkkoutumismalli näkyy kuvassa 1.

/ _ Numerolla 299 merkitty kaista näyttää kannan 299 pilkkou- ’· tumismallin ja v:llä merkityt kaistat esittävät kannan > > · I « ' * 35 299 geneettisen muunnoksen kahdesta eri isolaatista. Tämä • muunnos oli yksi 20:sta ihmisillä kokeillusta kannasta,

• I

19 109357 ja taulukossa 1 sille on annettu tunnus AI. Kaista s on standardi, High MWDNA Markers (AEH; BRL, Bethesda Research Laboratories, Life Technologies, Inc.). Kannan 299 muunnosta ei tavallisilla fenotyyppitesteillä voida erottaa 5 kannasta 299. Myös geneettisesti 299 ja 299v ovat hyvin läheisiä. Muunnoksella on myös osoittautunut olevan sama kyky vakiintua ihmisen suolten limakalvoilla.

Kanta 271: Tämä kanta sisältää kaksi plasmidia, joiden koot ovat 3 MDal ja vastaavasti 5 MDal. Kannan kro-10 mosomaalisen DNA:n pilkkoutumismalli näkyy kuvasta 2, kaistana A. Kaista v esittää kannan 271 geneettisen muunnoksen ja kaista s on merkitsee samaa standardia kuin kuvassa 1. Kannan 271 muunnosta ei voida erottaa kannasta 271 tavallisilla fenotyyppitesteillä. Myös geneettisesti 15 271 ja 271v ovat hyvin lähellä toisiaan. Muunnos on myös osoittanut omaavansa kyvyn kolonisoida ihmisen suoliston limakalvot kuten sisarkantansa.

Geneettisesti nämä kaksi tutkittua kantaa eroavat olennaisesti toisistaan. Ne eroavat merkitsevästi myös 20 vastaavista tyyppikannoista.

Lactobacillus 299:n viljely • - -80 °C pakastimesta lisätään ymppi 50 mlraan Lactoba- • t '! cillus Carrying Mediumia (LCM, Efthymiou & Hansen, J.

25 Infect. Dis., 110:258-267, 1962) tai Rogosaa ’· *· - inkuboidaan noin 40 tuntia 37 °C:ssa ' ' - 50 ml ympätään 500 ml:aan LCM:ää : - inkuboidaan noin 40 tuntia 37 °C:ssa * » » v * - 500 ml ympätään 5 l:aan, 30 - inkuboidaan noin 25-30 tuntia 37°C:ssa, ;··: - sentrifugoidaan 10 000 rpm 10 minuuttia - pestään kerran fysiologisessa suolaliuoksessa / , - pelletti suspendoidaan noin litraan fysiologista ’· suolaliuosta.

i * * i i ' ‘ 35 Tämä määrä on arvioitu riittämään noin 400 - 500 lit- : raan kauravelliä. Viljelyalustoja ei ole optimoitu. Rogo- * 20 109357 sa toimi LCM:ää paremmin, mahdollisesti paremman puskuri-toiminnan vuoksi. LCM:ään lisättiin 2 % glukoosia. Samalla menetelmällä voidaan tuottaa muutkin Lactobacillus-kannat.

5

Biologinen koe rotilla 250-300 g painoisille rotille tehtiin standardileik-kaus märkäpesäkkeen aiheuttamiseksi vatsaonteloon siten, että eristettiin ja puhkaistiin osa paksusuolta. Näin 10 saatiin aikaan jatkuva suolensisällön vuoto vatsaonteloon, mikä aiheutti märkäpesäkkeen 24 tunnin kuluessa sekä sepsiksen, josta seurasi suuri kuolleisuus. Käytettiin kolmea 30 eläimen ryhmää. Ryhmä 1 oli käsittelemätön kontrolliryhmä, ryhmälle 2 annettiin antibioottiruiske ja 15 ryhmälle 3 annettiin laktobasilleja hapatetussa kauravel-lissä mahaan. Käytetty Lactobacillus-kanta oli eristetty rotan suolen limakalvolta ja sen oli kokeissa osoitettu pystyvän kolonisoimaan rotan suoliston ja vakiintumaan siinä.

20 Testitulokset arvioitiin analysoimalla bakteerisisältö verestä (mikä merkitsee sepsistä), sekä vatsaontelosta ja suolistosta saaduista viljelmistä. Tulos osoittaa, että .·· kaikilla ryhmä l:n eläimillä oli bakteereita veressä, mikä yleensä johtaa suureen kuolleisuusprosenttiin. Ryh-25 mien 2 ja 3 tulokset olivat yhtenevät, bakteereja esiin-'· ’ tyi kolmessa 30:stä eläimestä, mutta paljon pienemmässä ' ' määrin kuin ryhmässä 1.

i · *

«SI

Claims (6)

109357 PATENTTIVAATIMUKS ET

1. Menetelmä ihmisen suoliston limakalvoja kolonisoimaan ja niillä vakiintumaan in vivo pystyvän Lactobacillus- 5 kannan eristämiseksi, joka kanta on Lactobacillus plantarum 299 DSM 6595, Lactobacillus casei ssp. rhamnosus 271 DSM 6594, 10 tai niiden muunnos, jolla on olennaisesti vastaava REA-malli, tunnettu siitä, että laktobasillit eristetään ihmisen suoliston limakalvolta ja viljellään puhdasvil-jelmiksi sopivassa ravintoalustassa ja sen jälkeen seulotaan suoliston kolonisaatiokyvyn ja siellä vakiintumisen 15 suhteen.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kyky kolonisoitua ja vakiintua testataan antamalla tuotetta suun kautta ja todentamalla esiintyminen 20 suoliston limakalvolla 10 päivää tuotteen nauttimisen päätyttyä.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valinta suoritetaan myös arvioimalla 25 sapenkestävyys ja pH-resistenssi sekä kyky fermentoida * · kaurajauhoja ja tuottaa makua. • 4. Menetelmä maha-suolikanavan infektioiden ennalta- : : : ehkäisyyn tai hoitoon tarkoitetun koostumuksen valmista- 30 miseksi, tunnettu siitä, että sopivaa substraattia fer-mentoidaan kummalla tahansa kannoista Lactobacillus plantarum 299 DSM 6595, » * ’· *: Lactobacillus casei ssp. rhamnosus 271 DSM 6594, ·:··: 35 : tai niiden muunnoksella, jolla on olennaisesti samanlai- 109357 nen REA-malli.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä oraalisesti, enteraalisesti tai rektaalisesti annettavan koostumuksen 5 valmistamiseksi, tunnettu siitä, että Lactobacillus-kannalla fermentoitu substraatti on kaurajauhoihin pohjautuva ravintoliuos.

10 PATENTKRAV