DE69224814T2

DE69224814T2 - Den darm kolonisierende laktobacillen

Info

Publication number: DE69224814T2
Application number: DE69224814T
Authority: DE
Inventors: Siv S-237 00 Bjaerred Ahrne; Stig S-222 05 Lund Bengmark; Bengt S-222 47 Lund Jeppson; Goeran S-223 67 Lund Molin
Original assignee: Probi AB
Current assignee: Probi AB
Priority date: 1991-07-25
Filing date: 1992-07-24
Publication date: 1998-09-03
Anticipated expiration: 2012-07-25
Also published as: JPH06501624A; CA2091557C; NO931085D0; SE9102238L; WO1993001823A1; NO306699B1; US5587314A; CA2091557A1; DE69224814D1; FI110611B; SE469875C; AU2370992A; EP0554418A1; FI931260A0; EP0554418B1; NO931085L; JP2742962B2; FI109357B; SE469875B; US5591428A

Description

Die Erfindung bezieht sich auf neue Stämme von Lactobacillus, welche nach oraler Verabreichung die Fähigkeit besitzen, die Darmschleimhaut in vivo zu besiedeln und sich dort zu etablieren, auf ein Verfahren zur Isolierung dieser Stämme sowie auf deren Verwendung in einer Zusammensetzung für die Prophylaxe oder Behandlung von bakteriellen Infektionen, insbesondere in Form einer Zusammensetzung, welche eine Nährstofflösung auf Basis von Hafermehl, die von diesen Stämmen fermentiert wird, umfaßt.
Viele Menschen leiden an einer gestörten Darmmikroflora, d.h. die Balance zwischen nützlichen und schädlichen Darmbakterien ist gestört. Eine Reihe von Faktoren, u.a. Streß, das Auftreten von Gallensalzen, Diät etc., beeinflußt die bakterielle Flora. Am bedeutendsten ist jedoch eine moderne antibiotische Behandlung, welche die normale Flora für einen langen Zeitraum zerstören und so einen normalen Fermentationsprozeß eliminieren kann. Falls der Fermentationsprozeß gestört und die Zahl der nützlichen Bakterien reduziert ist, wird die Konsequenz sein, daß die Dickdarmschleimhaut abstirbt und zu der Zeit ihre Funktion einstellt, zu der die Zahl von potentiell bösartigen Bakterien stark zunimmt. Diese Bakterien dringen in die funktionsgestörte Dickdarmwand ein und infizieren die Organe des Körpers, was zu der sogenannten Intensivpflegekrankheit (intensive-care-disease) mit Eiterherden über den gesamten Körper führt und möglicherweise auch zu einer Nichtfunktion der meisten Körperorgane, d.h. einem Kollaps der Organe. Blutvergiftung, Sepsis, hervorgerufen durch Abszesse im Unterleibsraum, sind eine weitverbreitete, chirurgische Komplikation in Verbindung mit Unterleibsoperationen mit einer hohen Todesrate. Diese Patienten werden heute durch die Verabreichung von Antibiotika und durch chirurgische Behandlung des Abszesses, soweit dieses lokalisiert werden kann, behandelt. Verfügbare Antibiotika werden normalerweise vor der Darmoperation verabreicht, um das Risiko von postoperativen Infektionen und dadurch hervorgerufener Krankheit zu reduzieren.
Die Behandlung mit Antibiotika ist jedoch teuer und ferner mit dem Risiko von verschiedenen Komplikationen assoziiert, wie Allergie und Zerstörung der normalen Darmflora sowie Überwachsen mit noch pathogeneren Bakterien.
Die Tatsache, daß Lactobacilli einen günstigen Effekt auf die Darmschleimhaut besitzen sollen, ist eine alte Idee, die wieder hervorgebracht worden ist. Es gibt jedoch viele ungeklärte Punkte, z.B. welche Mikroorganismen beteiligt sind und wie die Ökologie der Därme beschaffen ist. Ein anderes Problem in diesem Zusammenhang besteht darin, daß die Klassifizierung der Gattung Lactobacillus nicht vollständig ist, wodurch es schwierig ist, solche Stämme zu identifizieren, die für die Funktion des Darmes günstig sind. Die folgenden Punkte scheinen jedoch heute allgemein akzeptiert zu sein:
- Bakterien der Gattung Lactobacillus haben eine eindeutige Fähigkeit bezüglich der Verhinderung der Etablierung von pathogenen Bakterien auf verschiedene Weise, und zwar unabhängig von den beteiligten Nahrungsmitteln oder Därmen;
- bestimmte Stämme von Lactobacillus sind effektiver als andere Stämme der gleichen Art bezüglich dem Schutz und der Aktivierung von Därmen;
- durch Lactobacilli fermentierte Nahrungsmittel haben, wie gezeigt werden konnte, einen Cholesterin reduzierenden Effekt, wahrscheinlich aufgrund einer Überprüfung der Cholesterinproduktion in den Därmen, aber vielleicht auch deswegen, daß die Bakterien Cholesterin für die Produktion von Steroiden verwenden;
- die Aufnahme von größeren Mengen von Lactobacilli verbessert die motorische Darmaktivität, wobei die Ursache für diesen Effekt unbekannt ist;
- ein großer Anteil an Lactobacilli in den Därmen verhindert Krebs, was verschiedene Gründe zu haben scheint. Erstens sind verschiedene Lactobacilli in der Lage, die Herstellung von Nitrosaminen in den Därmen durch das Enzym Nitritreduktase zu verhindern. Nitrosamine sind karzinogen. Zweitens können Lactobacilli bestimmte bakteriell hergestellte Enzyme in den Därmen daran hindern, potentiell karzinogene Substanzen zu aktivieren. Es gibt schließlich Hinweise darauf, daß Lactobacilli auf Krebstumore einen wachstumsreduzierenden Effekt ausüben, was gegebenenfalls auch die Aktivierung von Macrophagen des immunologischen Abwehrsystems durch die Gegenwart der Lactobacilli zurückzuführen ist.
Eine entscheidende Schwäche der heute in den meisten konventionellen Nahrungsmitteln verwendeten Lactobacilli ist deren geringe Überlebensrate während der Passage durch den Magen und den Zwölffingerdarm. Dies führte zu der Entwicklung eines Produktes, welches "acidofilusfil", Acidophilus- Sauermilch, genannt wird, wobei die Milch durch einen Stamm von Lactobacillus acidophilus fermentiert wird, der direkt aus dem menschlichen Kot isoliert wurde. L. acidophilus überlebt die Passage durch den oberen Teil des Gastromtestinaltraktes gut. Um jedoch einen Effekt auf die Mikroflora in den Därmen über einen längeren Zeitraum zu besitzen, ist es wichtig, daß Lactobacillus in der Lage ist, sich in den Därmen zu etablieren. Gemäß Lidbeck, A. et al, Scand J Infect Dis, 4, Seiten 531-537, 1987, nimmt der Zuwachs der Zahl der Lactobacilli in der Mikroflora der Därme, der nach Aufnahme einer Lactobacillus acidophilus enthaltenden Präparation auftritt, langsam ab, wenn die entsprechende Aufnahme gestoppt wird. Demgemäß hat die bakterielle Flora nach neun Tagen ohne weitere Zuführung ihre ursprüngliche Zusammensetzung wieder erreicht.
Die EP-A2-0 199 535 beschreibt eine biologisch reine Kultur von Lactobacillus acidophilus, ATCC Annahme Nr. 53 103, die aus menschlichem Kot isoliert wurde und die in der Lage ist, sich in vitro bei Tests an Schleimhautzellen anzu heften. Eine Anhaftung in vivo wurde jedoch nicht gezeigt.
Die WO 89/05849 beschreibt Milchsäurebakterien, die aus dem Gastrointestinaltrakt von Schweinen isoliert wurden und die unter anderem durch die Adhäsion in vitro an gastromtestinalen Epithelzellen des Schweines sowie durch die Toleranz gegenüber Säure und Galle selektiert wurden. Diese Bakterien können für die Fermentierung von Milch verwendet werden, die dann Ferkel gegeben wird, um eine E. Coli-Diarrhoe zu verhindern oder zu behandeln.
Die EP-A-0 271 364 offenbart ein Verfahren für das Sammeln des Inhaltes des Verdauungstraktes von Widerkäuern und für dessen Kultivierung und Anreicherung bezüglich Milchsäurebakterien. Die erzielte kultivierte Mischung von verschiedenen Lactobacillus-Stämmen, die nicht hinterlegt worden sind und die somit nicht spezifisch identifiziert werden können, wird für die Behandlung oder Prophylaxe von Darmstörungen bei Tieren verwendet.
Die WO 91/05850 und die WO 91/05851 beziehen sich auf zwei verschiedene Stämme von Lactobacillus, L. plantarum 38 bzw. L. casei 37, die für die Korrektur und Stabilisierung der Verdauungstrakt-Mikroflora im Falle einer Dysbakteriose nützlich sein soll. Die Stämme wurden aus menschlichem Kot isoliert und sind von den Stämmen nach den Erfindungen verschieden, z.B. bezüglich ihres Gehaltes an Plasmiden. Es ist gut bekannt, daß es eine große Zahl von verschiedenen Unterstämmen und Varianten der phenotypisch beschriebenen Stämme, wie L. planatrum und L. casei, mit verschiedenen Chromosomenprofilen gibt.
J. Paediatr. Gastroenterol. Nutr. 1984, 3 (5), 683-686, bezieht sich auf eine bakteriologische Studie der unkontaminierten, oberen jejunalen Flüssigkeit in gesunden dänischen Kindern, die durchgeführt wurde, um die quantitativen und qualitativen Grenzen der normalen Flora zu bestimmen. Lactobacillus wurde aus wenigstens 10 % der getesteten Kindern isoliert, wobei aber keine Anstrengungen unternommen wurden, um zwischen den unterschiedlichen Stämmen zu differenzieren.
Die Stämme von Lactobacillus, die heute kommerziell verwendet werden, sind vor allen Dingen hinsichtlich ihrer Fähigkeit des Wachstums in üblichen Primärprodukten, wie z.B. Milch, selektiert worden. Falls ein bestimmter Stamm einen günstigen Einfluß ausübt, ist es ohne Zweifel notwendig, daß dieser Stamm in der Lage ist, sich in den Därmen zu etablieren und mit der dort existierenden Mikroflora zu konkurrieren. Kenntnisse darüber, welche Eigenschaften für einen bestimmten Lactobacillus-Stamm notwendig sind, damit er in der Lage ist, in diesem Wettbewerb zu bestehen, sind größtenteils unbekannt.
Die Erfindung bezieht sich auf neue Lactobacillus-Stämme mit der Eigenschaft der in vivo-Besiedlung von menschlicher Darmschleimhaut, wobei die Stämme gemäß dem Budapester Abkommen bei der DSM - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH -, Braunschweig, Deutschland, am 2. Juli 1991 hinterlegt worden sind, und zwar
Lactobacillus plantarum 299 DSM 6595
Lactobacillus casei ssp. rhamnosus 271 DSM 6594.
Die Erfindung bezieht sich ferner auf Varianten davon mit einem im wesentlichen korrespondierenden REA-Muster. Ein REA-Muster bezieht sich auf auf ein in der Elektrophorese auf Agargel gebildetes DNA-Muster, wobei die DNA mit einem Restriktionsenzym gemäß dem unten beschriebenen Verfahren abgebaut worden ist. Durch Charakterisierung der Stämme mittels ihres REA- Musters konnte die Identität der verwendeten Isolate etabliert werden, was zuvor nicht möglich war. Nahe verwandte Stämme von Lactobacillus mit Unterschieden im REA-Muster zeigen auch Unterschiede bezüglich ihrer Fähigkeit der Haftung am Darmepithel.
Die Erfindung bezieht sich ferner auf ein Verfahren zur Isolierung von Stämmen von Lactobacillus, welche die Fähigkeit der Besiedlung und der Etablierung auf der menschlichen Darmschleimhaut in vivo besitzen, dadurch gekennzeichnet, daß die Lactobacilli aus der menschlichen Darmschleimhaut isoliert werden, in einem geeigneten Nährmedium reinkultiviert werden und dann auf ihre Fähigkeit, sich in dem Darm anzusiedeln und dort zu etablieren, selektiert werden.
Die Fähigkeit der Stämme zur Ansiedlung in den Därmen wird vorzugsweise durch orale Verabreichung getestet, wobei eine anschließende Überprüfung ihres Auftretens an der Darmschleimhaut wenigstens 10 Tage nach Vollendung der Verabreichung durchgeführt wird.
Eine komplementäre Selektion von isolierten Stämmen kann vor oder nach dem Test auf Ansiedlung stattfinden, wobei verschiedene funktionale und technische Eigenschaften überprüft werden, wie Galleresistenz, pH-Resistenz, Fähigkeit zur Fermentation von angebotenem Substrat, vorzugsweise Hafermehl, und die Erzeugung von Geschmack, die Fähigkeit einer Gefriertrocknung zu widerstehen, Antibiotika-Resistenz, etc.
Um eine Passage durch den Gastrointestinaltrakt zu überleben, sollten die ausgewählten Stämme in der Lage sein, einen pH von 1,0 für 30 Minuten zu überleben und auch in Gegenwart von 0,1 % Galle zu wachsen.
Die Erfindung bezieht sich ferner auf eine Zusammensetzung für die Prophylaxe oder Behandlung von Infektionen im Gastrointestinaltrakt, die einen Lactobacillus-Stamm, welcher die Fähigkeit zur Ansiedelung und zur Etablierung in der menschlichen Darmschleimhaut in vivo besitzt, d.h.
Lactobacillus plantarum 299 DSM 6595
Lactobacillus casei ssp. rhamnosus 271 DSM 6594,
oder eine Variante davon mit einem im wesentlichen korrespondierenden REA- Muster, in Kombination mit einem konventionellen Träger umfaßt.
Konventionelle Träger sind beispielsweise physiologisch akzeptable Substrate, die von dem fraglichen Bakterium fermentiert werden, sowie Nahrungsmittel von verschiedener Art, insbesondere solche, die auf Stärke oder Milch basieren, aber auch inerte feste oder flüssige Substanzen, wie Salz oder Wasser. Ein geeignetes Substrat sollte flüssige oder feste Fasern enthalten, die in dem Gastrointestinaltrakt nicht resorbiert werden und die bei Fermentation durch Lactobacillus kurze Fettsäuren bilden. Als Beispiel für geeignete, stärkehaltige Substrate können Getreide erwähnt werden, wie Hafer und Weizen, Mais, Wurzelgemüse, wie Kartoffeln, sowie bestimmte Früchte, wie grüne Bananen.
Eine moderne medizinische Versorgung von Patienten in Verbindung mit Krankheit und Operation basiert zu einem großen Teil auf der Zuführung von Nahrung über die Venen, wodurch die Därme nicht mit Material für die Fermentation versorgt werden, was die folgenden Konsequenzen hat. Die Dickdarmfunktionen können als ein körpereigener Fermentationstank verstanden werden, wobei dessen Zweck die Herstellung von nützlichen Nahrungsstoffen ist, unter anderem für die Funktion des Darmdarms selbst, wobei die Funktionen aber auch die Eliminierung von schädlichen Substanzen umfassen, wie beispielsweise Schwermetalle, überschüssige Mengen an Cholesterin etc. Um eine Funktion des Dickdarmes zu gewährleisten, muß eine Zufuhr an geeigneten Bakterien und Substraten vorliegen, insbesondere von Stärke und Ballastfasern. Etwa die Hälfte des Inhaltes des Dickdarms besteht aus Bakterien, insbesondere von dem anaeroben Typ. Die wichtigsten Bakterien sind solche, die auf der Dickdarmschleimhaut angeordnet sind. Unter den Bakterien des Dickdarms gibt es eine Minderheit von potentiell schädlichen Typen. Solange nützliche Bakterien vorhanden sind, wird die schädliche Bakterienflora unterdrückt. Neuere Studien haben gezeigt, daß die Dickdarmschleimhaut das meiste für ihre Ernährung aus Fermentationsprodukten bezieht, insbesondere in Form von kurzen Fettsäuren. Ein normales Fermentationsverfahren erfordert die Zuführung von etwa 30 g Diätfasern täglich sowie die Gegenwart von geeigneten Bakterien.
Ein bevorzugtes Substrat für die Zusammensetzung nach der Erfindung, was der Zusammensetzung auch einen guten Nahrungswert vermittelt, ist eine Nährlösung auf Basis von Hafermehl. Es wurde gezeigt, daß Hafer ein gutes Substrat für die Fermentation unter verschiedenen Aspekten ist. Hafer ist reich an Proteinen, Kohlenhydraten, Fett, Diätfasern und auch wasserlöslichen Fasern, sogenannten β-Glucanen. Ferner besitzt das Fett von Hafer oder Hafermehl einen sehr hohen Gehalt an oberflächenaktiven Phosphorlipiden, die als eine Magenschleimhautbarriere, "Korrosionsinhibitoren", wirken und so einen Schleimhautschutz bewirken. Schließlich entspricht die Aminosäurezusammensetzung der Haferproteine zu einem großen Teil den Bedürfnissen des menschlichen Körpers. In WO 89/08405 wird eine für die Darmfütterung geeignete Nahrungszusammensetzung beschrieben, die durch die Kombination eines enzymatischen Abbaues von Hafermehl mit α-Amalyse, gegebenenfalls Protease, und β-Glucanase und Hitzebehandlung sowie durch Fermentation mit einem Lactobacillus erzielt wird, der die Fähigkeit zur spontanen Haftung an den Därmen besitzt. Die in dieser Patentanmeldung beschriebene Nährstoffzusammensetzung ist in Kombination mit einem Lactobacillus-Stamm nach der Erfindung eine ausgezeichnete Zusammensetzung für eine Nährstoffzufuhr für Patienten in Verbindung mit einer normalen Behandlung nach großen Operationen, für die spezielle Behandlung von Patienten, die Opfer der Intensivpflegekrankheit oder eines Organkollapses sind, und für die Behandlung von verschiedenen Darmerkrankungen, z.B. die Colitis ulcerosa.
Um in einer Nährstoffzusammensetzung auf Basis von Hafermehl nach der Erfindung nützlich zu sein, sollte ein Lactobacillus die folgenden Bedingungen erfüllen:
- gute Fermentation von Hafer;
- Überleben bei einem pH von 1,0 (dies entspricht dem pH im Magen) für 30 Minuten;
- Überleben und Wachstum in Gegenwart von Gallensalzen;
- Fähigkeit der Besiedlung und der Etablierung auf der Darmschleimhaut.
Es ist auch wichtig, daß der pH-Wert während der Fermentation schnell reduziert wird, um das Wachstum von anderen Bakterien zu stoppen.
Die Erfindung bezieht sich auch auf eine Zusammensetzung für die Prophylaxe oder Behandlung von Infektionen in dem Gastrointestinaltrakt, geeignet für eine orale, enterale oder rektale Verabreichung, wobei die Zusammensetzung eine auf Hafermehl basierende Nährstofflösung ist, die durch die Lactobacillus- Stämme fermentiert wird.
Es konnte gezeigt werden, daß die Verabreichung von Lactobacilli mit der Fähigkeit zur Ansiedelung in oder Anhaftung an den Därmen eine andere bakterielle Flora hinsichtlich der Besiedlung der Därme unterdrücken kann, und daß so das Risiko einer Sepsis in Verbindung mit bakteriellen Infektionen reduziert werden kann, wie z. B. Komplikationen nach Unterleibsoperationen. Diese Behandlung scheint so effizient wie eine konventionelle Behandlung zu sein, die heute mittels Antibiotika durchgeführt wird. Es erscheint somit angemessen, Patienten, die einer Darmoperation unterworfen werden, zuvor mit Lactobacilli und nicht mit Antibiotika zu behandeln. Dies bedeutet, daß eine billigere Form der Therapie mit potentiell geringeren Sekundäreffekten etabliert werden könnte, da die normale Darmflora nicht zerstört werden würde.
Die Erfindung bezieht sich ferner auf die Verwendung eines Lactobacillus- Stamms nach der Erfindung für die Herstellung eines Medikamentes für die Prophylaxe oder Behandlung von bakteriellen Infektionen in Verbindung mit chirurgischen Operationen, nachchirurgischen Rehabilitationen etc.
Eine bevorzugte, auf Hafermehl basierende Nährlösung wird durch Lactobacillus plantarum 299 fermentiert.
Experimente mit Testtieren haben ein statistisch abgesichertes Überleben in solchen Tieren ergeben, die mit einer Zusammensetzung behandelt wurden, welche einen Lactobacillus-Stamm umfaßte, der aus der Darmschleimhaut eines Tieres der gleichen Art isoliert wurde. Untersuchungen mit Ratten haben gezeigt, daß eine gute Verhinderung und ein schnelleres Heilen von experimentell induzierter Kolitis und induziertem Ulcus in den Därmen stattfindet.
Die Zusammensetzung nach der Erfindung kann auf jedem geeigneten Weg verabreicht werden, vorzugsweise oral oder rektal, z.B. in Form eines Einlaufs. Die Zusammensetzung kann auch enteral über einen Katheter verabreicht werden, der über den Bauch in die Därme oder direkt in die Därme eingeführt wird. Untersuchungen haben ergeben, daß der Effekt verbessert wird, wenn Diätfasern beispielsweise in Form von Hafermehlschleim oder von β-Glucanen zugeführt werden. Die Behandlung sollte einmal oder mehrmals täglich über eine Zeitraum von 1-2 Wochen stattfinden.
Die beigefügten Abbildungen 1-2 zeigen die REA-Muster der neuen Lactobacillus-Stämme 299 und 271. Abbildung 3 zeigt die Konzentration der Lactobacilli im Ileum vor, direkt anschließend bzw. ein paar Tage nach einer oralen Verabreichung eines Hafermehlschleims, der von Lactobacillus fermentiert wurde.

Beispiele

Isolierung von Lactobacillus-Stämmen vom Menschen

Um Stämme zu isolieren, welche die Fähigkeit zur Ansiedelung und zur Etablierung der menschlichen Darmschleimhaut besitzen, wurden Stämme von Lactobacillus aus der menschlichen Schleimhaut entnommen. Biopsien aus dem Dickdarm wurden mittels Enteroskopie entnommen und Stücke der Darmschleimhaut aus dem Dünndarm (Jejunum und Ileum) wurden im Zusammenhang mit chirurgischen Eingriffen entfernt. Die Schleimhautproben wurden sofort in einem Spezialmedium angeordnet (0,9 % NaCl; 0,1 % Pepton; 0,1 % Tween 80 und 0,02 % Cystin; alle Werte beziehen sich auf Gewichtsprozent/Volumen), im Ultraschallbad für 2 Minuten homogenisiert und für 1 Minute gerührt. Die Proben wurden anschließend auf Rogosa-Agar gegeben (Difco Laboratories, Detroit, Michigan, USA). Die Platten wurden anaerob bei 37ºC für 2 Tage inkubiert (Gas Pak Anaerobic System, BBL). Ein bis drei Kolonien wurden zufallsmäßig von jeder Platte gepickt und in Reinkultur 5 bis 9 mal auf Rogosa-Agar angezogen und als verdichtete Kulturen in gefrorenem Puffer bei -80ºC gehalten. Von etwa 61 verschiedenen Individuen wurden insgesamt 209 Lactobacillus-Stämme isoliert. Mittels API 50 CH, ein kommerzielles Testkit von API, Montalieu Verceu, Frankreich, wurden alle Isolate auf ihre Fähigkeit zur Fermentierung von 49 verschiedenen Kohlenhydraten charakterisiert. Es konnten keine signifikanten Unterschiede in der Zusammensetzung der Lactobacilli-Flora zwischen dem Dünndarm und dem Dickdarm gefunden werden.
Repräsentative Stämme aus den verschiedenen Gruppen wurden bezüglich ihrer pH-Resistenz, der Fähigkeit zum Wachstum in Gegenwart von Galle und auf ihre Fähigkeit zur Fermentierung von Hafermehlschleim geprüft.
Die pH-Resistenz wurde getestet durch die Zugabe von 0,1 ml Bakteriensuspension (10&sup9; CFU (koloniebildende Ein heit)/ml, kultiviert in Rogosa-Nährlösung, zentrifugiert und resuspendiert in einer physiologischen Salzlösung) zu 2 ml Phosphatpuffer bei pH 1,0. Nach 30 Minuten wurden die Rogosa-Agarplatten inokuliert. Der Test wurde als positiv gewertet, wenn ein Wachstum nach einer Inkubation von 3 Tagen bei 37ºC erkennbar war. Nur wenige der getesteten Stämme bestanden diesen Test.
Ein Wachstum in Gegenwart von Galle wurde getestet durch ein Wachstumtest von Isolaten von Lactobacillus in Gegenwart von 0,1 % bzw. 0,15 % Rindergalle in Rogosa-Agarplatten, die anaerob für 3 Tage bei 37ºC inkubiert wurden. Etwa 80 % der Stämme waren fähig, in Gegenwart von 0,1 % Galle zu wachsen, während nur 18 % der Stämme in Gegenwart von 0,15 % Galle wuchsen.
Basierend auf den Ergebnissen von diesen Tests wurden 20 verschiedene Lactobacillus-Stämme für die weiteren Untersuchungen ausgewählt.

In vivo Darmansiedelung beim Menschen

Gesunden Testpersonen wurden für einen bestimmten Zeitraum täglich fermentierter Hafermehlschleim gegeben, der eine Mischung der 20 verschiedenen Stämme von Lactobacillus umfaßte, die sorgfältig gemäß den obigen Darstellungen ausgewählt wurden. Es wurde dann untersucht, welcher der aufgenommenen Stämme auf der Schleimhaut des Dünndarms und des Dickdarms gefunden werden konnte.
Fermentierter Hafermehlschleim wurde gemäß dem unten beschriebenen Protokoll hergestellt. Mit jedem der Stämme von Lactobacillus in der Studie, wie unten in der Tabelle 1 gezeigt, wurde dies durchgeführt. Die verschiedenen Präparationen wurden in solchen Anteilen miteinander gemischt, daß das Endprodukt 8 x 10&sup7; CFU pro Gramm gefriergetrocknetes Produkt enthielt.
In einer Studie mit 12 Freiwilligen zwischen 31 und 56 Jahren erhielt jeder Freiwillige zehn Flaschen mit 100 ml flüssigem Hafermehlschleim auf Basis von 1 g gefriergetrocknetem Produkt pro ml Wasser. Proben von der Darmschleimhaut wurden vor Beginn der Aufnahme des Hafermehlschleims, 11 Tage, nachdem die Testpersonen täglich über einen Zeitraum von 10 Tagen 100 ml Hafermehlschleim zum Frühstück zu sich genommen hatten, sowie nach weiteren 10 Tagen, d.h. 11 Tage nach Vollendung der Hafermehlschleim- Aufnahme, genommen. Die Darmproben wurden als Biopsien aus dem Dünndarm (Ileum) mittels einer Watson-Kapsel sowie vom Rektum mit einem Rektoskop genommen. Die Biopsien wurden, wie oben beschrieben, präpariert und bezüglich ihres Inhaltes auflebende Lactobacilli analysiert. Von jeder Probe wurden etwa 10 Kolonien von der Rogosa-Agarplatte gepickt, die dann als Reinkulturen herangezogen und bei -80ºC gefriergetrocknet wurden, bis sie identifiziert wurden.
Alle Isolate wurden auf API 50 CH, wie oben dargestellt, getestet. Die Isolate, die mit einem der Teststämme zu korrespondieren schienen oder hauptsächlich korrespondierten, wurden ferner mittels Plasmidanalyse und Restriktionendonudease-Analyse gemäß den unten beschriebenen Verfahren getestet.
Als genereller Trend wurde beobachtet, daß die Menge an Lactobacilli auf der Darmschleimhaut während der Verabreichung des fermentierten Hafermehlschleims zunahm und daß diese Zunahme über 11 Tage nach Abschluß der Aufnahme anhielt. In Abbildung 3 ist die Iogarithmische Konzentration der Lactobacilli im Ileum mittels eines Säulendiagramms dargestellt, und zwar vor Beginn des Testes (t= 0), am Tag nach Abschluß des Testes (t = 1) sowie nach weiteren 10 Tagen (t = 11). Die Zunahme war im Dünndarm stärker ausgebildet, während andererseits die Menge der Lactobacilli insgesamt im Dickdarm größer war. Es konnte ferner beobachtet werden, daß die Mengen an anaeroben, gramnegativen Bakterien im Dickdarm nach der Aufnahme des fermentierten Hafermehlschleims reduziert war.
Die folgenden Stämme waren auf der Darmschleimhaut 10 Tage nach Vollendung der Verabreichung der Lactobacilli dominierend:
Lactobacillus plantarum 299 wurde in elf Testpersonen gefunden (bei fünf Testpersonen nur auf dem Dünndarm und bei weiteren fünf Testpersonen nur auf dem Dickdarm);
Lactobacillus casei ssp. rhamnosus 271 wurde in vier Testpersonen gefunden (bei einer Testperson nur auf dem Dünndarm und bei zwei weiteren nur auf dem Dickdarm);
Lactobacillus reuten 108 wurde in vier Testpersonen gefunden (bei einer Testperson nur auf dem Dünndarm und bei einer weiteren Testperson nur auf dem Dickdarm);
Lactobacillus murinus/casei ssp. toleranz 294 wurde in zwei Testpersonen gefunden.
Die Stämme, die 11 Tage nach vollendeter Verabreichung reisoliert wurden, wurden auf der Schleimhaut mit einer ungefähren Konzentration von 3 x 10³ bis 10&sup5; CFU/g Schleimhaut bezüglich des Dünndarms und in einer Konzentration von 10³ bis 3 x 10&sup7; CFU/g Schleimhaut bezüglich des Dickdarms gefunden.

Herstellung von Hafermehlschleim

Fermentierter Hafermehischleim wurde in drei Schritten hergestellt:
(i) 1295 g Hafermehl (MP-450, Nord-Mills, Järna; Proteingehalt 14,2 % und Aschengehalt 2,1 %), 129,5 g Enzymmischung (Nord Malt, Söderhamn) sowie 5390 g Leitungswasser wurden gemischt und bei leichtem Rühren auf 95ºC erhitzt. Der Schleim wurde auf 50ºC abgekühlt und es wurde 1 % β-Glucanase (Gewicht/Volumen) zugefügt (GV-L; Grindsted Products A/S, Braband, Dänemark). Es folgte dann eine Inkubation für zwei Stunden bei 50ºC.
(ii) Der Schleim wurde mit frischen Lactobacilli inokuliert und bei 37ºC für 15 bis 20 Stunden fermentiert. Der pH betrug 3,4 bis 3,9. Die Fermentation wurde jeweils getrennt mit verschiedenen Stämmen durchgeführt. Die Zahl der koloniebildenden Einheiten, CFU, pro ml Produkt variierte zwischen 6 x 10&sup6; und 2 x 10&sup8; auf dem Rogosa-Agar (anaerob bei 37ºC für 20 Stunden).
(iii) Der fermentierte Schleim wurde gefriergetrocknet. Die verschiedenen Produkte wurden in solch einem Verhältnis gemischt, daß der gleiche Wert an CFU/g für alle Stämme erzielt wurde. Die Mischung wurde mit 20 % (Gewichtigewicht) Sojabohnenmehl (Protein 51 %, Aschengehalt 5,5 %, Fett 1 %) ergänzt. Die angereicherte Mischung enthielt 2 x 10&sup7; CFU/g und wurde bei -18ºC aufbewahrt. Nicht-fermentierter Hafermehlschleim wurde in der gleichen Weise, wie oben beschrieben, hergestellt, aber ohne Fermentierung.
Hafermehlschleim wurde mit allen 20 Stämmen, die für den oben beschriebenen Darmansiedlungstest ausgewählt wurden, hergestellt. Die Konzentration vor und nach der Gefriertrocknung sowie der Geschmack wurden bestimmt. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1 Ausgewählte Stämme von Lactobacillus für klinische Tests
* nach Gefriertrocknung
** die Cluster-Numerierung bezieht sich auf eine Arbeit in der numerischen Taxonomie bzgl. Darm-assoziierten Lactobacilli von Mohn G. et al (zur Veröffentlichung)
*** auf einer Skala 5-1
Die Fähigkeit, dem Hafermehlschleim durch die Fermentation einen positiven Geschmack zu verleihen, wurde von einer "Expertengruppe" beurteilt, die aus vier Personen bestand und die die Hafermehlschleime, die von den verschiedenen Stämmen fermentiert wurden, beurteilten. Der Geschmack wurde gemäß einer abfallenden Wertung von 5 bis 1 eingeordnet, wobei 5 die Beurteilung "sehr gut" und 1 die Beurteilung "nicht-schmackhaft" bezeichnet. Die Werte für die 20 ausgewählten Teststämme sind in der obigen Tabelle 1 dargestellt.

Fermentierung des Hafermehlschleims

Die vier Stämme, die auf der Darmschleimhaut in einer dominierenden Anzahl vorgefunden wurden, wurden weiter bezüglich ihrer Fähigkeit zur Fermentierung von Hafermehlschleim, ihrer Fähigkeit der Resistenz bei der Gefriertrocknung sowie bezüglich der Entwicklung eines Geschmackes in dem Hafermehlschleim untersucht.
Die Fähigkeit zur Fermentierung von Hafermehlschleim wurde beurteilt durch die Fähigkeit zur Reduktion des pH unter 4,0 und CFU in einer Menge von > 10&sup8; CFU/g Naßgewicht zu bilden.
Die Fähigkeit zur Resistenz gegenüber der Gefriertrocknung in dem Hafermehlschleim war ein weiteres Selektionskriterium. In diesem Zusammenhang wurde die CFU-Konzentration nach der Gefriertrocknung bestimmt.
Die Ergebnisse der obigen Tests mit dem Hafermehlschleim sind in der folgenden Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2 Fermentation von Hafermehlschleim mit ausgewählten Stämmen von Lactobacillus
Zusätzlich wurde der Geschmack der vier ausgewählten Stämme bestimmt, und zwar einerseits im Vergleich mit einer kommerziellen Joghurtkultur (Streptococcus thermopilus und Lactobacillus bulgaricus) und andererseits mit einer kommerziellen Kultur von Acidophilus-Sauermilch (Lactobacillus acidophilus), wobei die gleichen Bestimmungssymbole, wie oben, verwendet wurden. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3 Geschmack von Hafermehlschleim, fermentiert mit Stämmen von Lactobacillus
Auf Basis dieser Werte wurden die Stämme 299 und 271 als besonders interessant eingestuft und werden im folgenden im Detail beschrieben.

Beschreibung der Lactobacillus-Stämme 299 und 271

Die Stämme 299 und 271, die beide aus gesunder menschlicher Darmschleimhaut isoliert wurden, wurden bei der Deutschen Sammlung von Mikroorgsanismen und Zellkulturen Gmbh am 2. Juli 1991 hinterlegt und erhielten die Hinterlegungsnummern DSM 6595 (299) und DSM 6594 (271).

Phänotyp-Beschreibung

Die Stämme 299 und 271 sind grampositiv und Katalase-negative Stäbchen, die auf Rogosa-Agar bei pH 5,5 wachsen. Die Fähigkeit dieser Stämme bezüglich der Fermentation von verschiedenen Kohlenhydraten ist in der Tabelle 4 gezeigt. Diese Tests wurden mittels API 50 CH gemäß den Angaben des Herstellers durchgeführt. Tabeile 4 Fähigkeit zur Bildung von Säure aus verschiedenen Kohlenhydraten Tabelle 4 (Fortsetzung)
Phänotypisch kann der Stamm 299 als Lactobacillus plantarum identifiziert werden (nur Raffinose weicht von dem Testmuster für L. plantarum ATCC 14917T ab; dies ist der Artenstamm für die Art L. plantarum, d.h. der Stamm, der die Art definiert). 271 kann als Lactobacillus casei subsp. rhamnosus identifiziert werden (entspricht vollständig dem Artenstamm für diese Art).

Genotyp-Beschreibung

Die beiden Stämme wurden bezüglich ihres Spaltungsmusters der chromosomalen DNA in Verbindung mit der Spaltung durch EcoRI mittels Restriktionsendonuklease-Analyse - REA - untersucht (Verfahren gemäß Stahl M, Mohn G, Persson A, Ahrné S & Stahl S, International Journal of Systematic Bacteriology, 40:189-193, 1990). Schematisch kann die REA wie folgt beschrieben werden:
(1) Chromosomale DNA wird aus den Stämmen, die an der Studie beteiligt waren, isoliert;
(2) die DNA wird mit Restriktionsenzymen geschnitten;
(3) die geschnittenen DNA-Fragmente werden mit der Agarosegel- Electrophorese der Größe nach aufgetrennt;
(4) die Bandenmuster der verschiedenen Stämme werden registriert und mit einem Laserdensitometer und zugehörigen Programmen interpretiert. Die Unterschiede zwischen den Stämmen bezüglich des REA-Musters kann mathematisch mit der Hauptkomponentenanalyse (1990) gezeigt werden.
Es wurde ferner eine Untersuchung bezüglich des Plasmidgehaltes durchgeführt (Methode nach Ahrné S, Mohn G & Stahl S, Systematic and Applied Microbiology 11:320-325, 1989).
Stamm 299: Dieser Stamm enthielt vier Plasmide, welche die Größen 4 MDal, 9 MDal, 20 MDal bzw. 35 MDal aufwiesen. Das Spaltungsmuster der chromosomalen DNA ist in der Abbildung 1 gezeigt. Die mit 299 markierte Spur zeigt das Muster des Stammes 299 und die mit a und v bezeichneten Spuren stellen eine genetische Variante des Stammes 299 aus zwei verschiedenen Isolaten dar. Diese Variante war einer der 20 Stämme, die beim Menschen getestet wurden und die in der Tabelle 1 als AI bezeichnet ist. Die Spur s bezeichnet den Standard, Hoch MWDNA-Marker (AEH; BRL, Bethesda Research Laboratories, Life Technologies, Inc.). Die Variante von 299 kann mit den gebräuchlichen Phänotyp-Tests nicht von 299 getrennt werden. 299 und 299v sind auch genetisch sehr eng verwandt. Die Variante hat ferner die gleiche Fähigkeit zur Etablierung in der menschlichen Darmschleimhaut.
Stamm 271: Dieser Stamm enthält zwei Plasmide mit einer Größe von 3 MDal bzw. 5 MDal. Das Spaltungsmuster der chromosomalen DNA des Stammes ist in der Abbildung 2 als Spur A gezeigt. Die Spur v zeigt eine genetische Variante des Stammes 271. Die Spur s bezeichnet den gleichen Standard wie in der Abbildung 1. Die Variante von 271 kann mit gebräuchlichen Phänotyp- Tests nicht von 271 getrennt werden. Auch genetisch sind 271 und 271v sehr eng verwandt. Die Variante hat ferner auch die gleiche Fähigkeit zur Ansiedelung auf der menschlichen Darmschleimhaut wie der Schwesterstamm.
Genetisch unterscheiden sich die zwei untersuchten Stämme entscheidend. Sie unterscheiden sich auch signifikant von dem entsprechenden Artenstamm.

Kultivierung von Lactobacillus 299

- Ein Inoculat von -80ºC aus dem Gefrierschrank wird zu 50 ml Lactobacillus-Tragemedium (LCM, Efthymiou & Hansen, J. lnfect. Dis., 110:258-267, 1962) oder Rogosa gegeben,
- wird für etwa 40 Stunden bei 37ºC inkubiert,
- 50 ml werden in 500 ml LCM inokuliert,
- wird für etwa 40 Stunden bei 37ºC inkubiert,
- 500 ml werden in 5 Liter inokuliert,
- wird für etwa 25-30 Stunden bei 37ºC inkubiert,
- wird bei 10.000 Upm für 10 Minuten zentrifugiert,
- wird in einer physiologischen Salzlösung einmal gewaschen,
- das Pellet wird in etwa 1 Liter physiologischer Salzlösung gelöst.
Die erzielte Menge ist ausreichend für etwa 400-500 l Hafermehlschleim. Die Kulturmedien sind nicht optimiert. Rogosa arbeitet besser als LCM, wobei dies wahrscheinlich auf einer besseren Pufferfunktion beruht. 2 % Glukose wurden zu LCM hinzugefügt. Das gleiche Verfahren kann für die Herstellung des anderen Lactobacillus-Stammes verwendet werden.

Biologischer Test mit Ratten

Ratten mit einem Gewicht von 250-300 g wurden einer Standardoperation unterworfen, um einen Abszess in der Unterleibshöhle durch Isolierung und Punktierung eines Teils des Dickdarms zu entwickeln, wodurch ein konstantes Auslaufen des Darminhaltes in die Unterleibshöhle erzielt wird, was zur Bildung eines Abszesses innerhalb von 24 Stunden, einer Sepsis und einer anschließenden hohen Sterberate führt. Es wurden drei Gruppen von jeweils 30 Tieren verwendet. Die Gruppe 1 war eine nicht behandelte Kontrollgruppe. Gruppe 2 wurde mit Antibiotika durch Injektion behandelt. Gruppe 3 erhielt Lactobacilli in Form eines fermentierten Hafermehlschleims in den Magen. Der Lactobacillus-Stamm, der verwendet wurde, war aus einer Rattenschleimhaut isoliert. In Tests hat sich gezeigt, daß dieser Stamm Rattendärme besiedeln und sich dort etablieren kann.
Die Auswertung des Tests wurde durch Analyse der Bakterienmenge in dem Blut durchgeführt, was etwa äquivalent zur Sepsis ist, sowie durch Kulturen aus der Unterleibshöhle und den Därmen. Die Ergebnisse zeigen, daß alle Tiere in der Gruppe 1 Bakterien im Blut aufwiesen, was zu einer sehr hohen Sterberate führen sollte. In den Gruppen 2 und 3 wurden ähnliche Ergebnisse erzielt, wobei Bakterien in drei von 30 Tieren auftraten, jedoch in einer wesentlich niedrigeren Menge als in Gruppe 1.

Claims

1. Lactobacillus-Stamm mit der Fähigkeit, die menschliche Darmschleimhaut in vivo zu besiedeln, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um

Lactobacillus plantarum 299 DSM 6595,

Lactobacillus casei ssp. rhamnosus 271 DSM 6594

oder eine Variante davon handelt, die ein wesentlichen korrespondierendes REA- (DNA-Elektrophorese) Muster aufweist.

2. Verfahren zur Isolierung eines Lactobacillus-Stamms gemäß Anspruch 1 mit der Fähigkeit, sich in vivo in der menschlichen Darmschleimhaut anzusiedeln und dort zu etablieren, bei dem es sich um

Lactobacillus plantarum 299 DSM 6595,

Lactobacillus casei ssp. rhamnosus 271 DSM 6594

oder eine Variante davon mit einem im wesentlichen korrespondierenden REA- Muster handelt, dadurch gekennzeichnet, daß die Lactobacilli aus der menschlichen Darmschleimhaut isoliert werden und in einem geeigneten Nährmedium reinkultiviert werden und dann auf ihre Fähigkeit, sich im Darm anzusiedeln und dort zu etablieren, selektiert werden.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Fähigkeit, sich anzusiedeln und zu etablieren, durch orale Verabreichung und Nachweis des Auftretens in der Darmschleimhaut 10 Tage nach Abschluß der Verabreichung überprüft wird.

4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß eine Selektion auch durch Bewertung der Galleresistenz, der pH-Resistenz, der Fähigkeit zur Fermentation von Hafermehl und Erzeugung von Geschmack durchgeführt wird.

5. Zusammensetzung für die Prophylaxe oder Behandlung von Infektionen im Gastrointestinaltrakt, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen Stamm nach Anspruch 1 umfaßt, d.h.

Lactobacillus plantarum 299 DSM 6595,

Lactobacillus casei ssp. rhamnosus 271 DSM 6594

oder eine Variante davon, die ein wesentlichen korrespondierendes REA-Muster aufweist, in Kombination mit einem konventionellen Träger.

6. Zusammensetzung nach Anspruch 5 für die orale, enterale oder rektale Verabreichung, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um eine auf Hafermehl basierende Nährlösung handelt, die durch den Lactobacillus-Stamm fermentiert wird.

7. Verwendung eines Lactobacillus-Stamms nach Anspruch 1 für die Herstellung eines Medikaments für die Prophylaxe oder Behandlung bakterieller Infektionen im Zusammenhang mit chirurgischen Operationen.