DE69831578T2

DE69831578T2 - Lactobacillus casei rhamnosus-haltige pharmazeutische formulierung

Info

Publication number: DE69831578T2
Application number: DE69831578T
Authority: DE
Inventors: Eva Grahn Hakansson; Stellan Hakansson
Original assignee: Essum AB
Current assignee: Essum AB
Priority date: 1997-06-02
Filing date: 1998-06-02
Publication date: 2006-04-27
Anticipated expiration: 2018-06-03
Also published as: EP1005353A1; ES2245801T3; NO326122B1; SE511524C2; DE69831578D1; CN1272791A; DK1005353T3; AU726217B2; CN1153575C; CA2291623A1; ATE304366T1; SE9702083D0; JP4350170B2; WO1998055131A1; NO995794L; EP1005353B1; NO995794D0; JP2002507200A; AU8046098A; SE9702083L

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zubereitung zur Prophylaxe gegen und/oder zur Behandlung von gastrointestinalen Störungen in Menschen und in Tieren.
Hintergrund
Ein Gesundheits-Problem, das in vielen Zusammenhängen weit verbreitet ist, ist Diarrhoe oder andere enterische bzw. intestinale Störungen, die durch verschiedene pathogene Mikroorganismen hervorgerufen werden. Die Probleme sind insbesondere verbreitet bei Menschen, die mit Antibiotika oder mit Strahlung bei einer Krebs-Behandlung behandelt wurden, bei Menschen, die unter Stress leiden, bei Touristen, die ins Ausland reisen, und in Kindertagesstätten. Beispiele intestinal pathogener Bakterien, die Diarrhoe hervorrufen, sind Salmonella, Shigella, Yersinia, E.coli, Pseudomonas, Clostridium difficile und sordelli, Staphylococcus aureus, Klebsiella, Helicobacter pylori und Campylobacter.
Es ist seit langer Zeit wohlbekannt, dass Mikroorganismen einander positiv oder negativ beeinflussen, indem sie das Wachstum des jeweils anderen fördern oder inhibieren. Dieses Phänomen der gegenseitigen Beeinflussung wurde vor allem bei der Haut-Flora, im Rachen (Pharynx) und in den Gedärmen des Menschen untersucht. Die diesem Phänomen unterliegenden Mechanismen sind nicht vollständig bekannt, doch wurde gefunden, dass die normale Bakterien-Flora sehr wichtig bei der Verteidigung gegen pathogene Bakterien ist. Einwandernde Bakterien werden durch die Bakterien in der normalen Flora auf verschiedenen Wegen inhibiert, von denen einer die Produktion von Antibiotikum-ähnlichen Substanzen ist, sog. Bakteriocinen. Im Gegensatz zu Antibiotika haben die Bakteriocine in den meisten Fällen eine sehr selektive Wirkung auf eine Gruppe von Bakterien, beeinträchtigen jedoch nicht die verbleibende Bakterien-Flora. Die Möglichkeit einer Verabreichung harmloser Bakterien mit einem derartigen Effekt auf Patienten, die unter Infektionen leiden, wurde nicht nur diskutiert, sondern es wurde von ihr auch in gewissem Ausmaß Gebrauch gemacht. Es versteht sich von selbst, dass die verabreichten Bakterien in der Lage sein müssen, sich selbst in der Umgebung, die beeinflusst werden soll, zu etablieren. Beispielsweise war dies die Idee bei der Abgabe von Sauermilch an Patienten, die eine gestörte Darm-Flora haben, die durch eine starke Diarrhoe hervorgerufen wurde, nachdem die Patienten mit Antibiotika behandelt wurden. Es wurde jedoch nicht wissenschaftlich analysiert, was in der Darm-Flora passierte, und die Wirkung – wenn überhaupt eine auftrat – war in den meisten Fällen unsicher. Dies ist wahrscheinlich auf die Tatsache zurückzuführen, dass keine Kolonisierung im Darm stattgefunden hat oder dass die zugesetzten Bakterien keine Möglichkeit hatten, mit den Bakterien in Wechselwirkung zu treten, die eine Diarrhoe hervorrufen. Es wurden auch Experimente gemacht, um die Bakterien-Flora in der Nasen-Schleimhaut-Membran, der Haut und dem Rachen durch harmlose Mikroorganismen zu ersetzen, und diese Experimente haben bewiesen, dass eine sog. Rekolonisierung möglich ist und die beabsichtigten Wirkungen ergeben kann.
Wie oben erwähnt, haben die Experimente, die durchgeführt wurden, um Bakterien an Patienten zu verabreichen, die unter verschiedenen Störungen leiden, die durch pathogene Mikroorganismen hervorgerufen werden, in den meisten Fällen keine schlüssigen Ergebnisse erbracht. Offensichtlich war die Kenntnis davon nicht ausreichend, welche Bakterien-Stämme am besten zum Erreichen einer Kolonisation und Wechselwirkung geeignet sind.
Dadurch, dass man unter definierten Bedingungen arbeitete, wurde es in den zurückliegenden Jahren möglich, wichtige grundlegende Prinzipien von Mechanismen zu etablieren, die die Wechselwirkung zwischen Mikroorganismen steuern, und auch Verfahren zum Untersuchen dieser Wechselwirkung zu entwickeln. Dies hat neue Möglichkeiten eröffnet, in diese Wechselwirkung in einer bedeutungsvollen, reproduzierbaren Weise einzugreifen und – folglich – dies bei der Behandlung von Infektionen therapeutisch-prophylaktisch einzusetzen.
Bei neugeborenen Babys sind es Lactobacillus-Stämme, die – zusammen mit Bifido-Bakterien – zuerst die sterilen Dämme kolonisieren. Auch bei Erwachsenen ist Lactobacillus eine dominierende normale Flora im Darm. Viele Lactobacillus-Stämme produzieren in der Tat Milchsäure, Essigsäure und Wasserstoffperoxyd, das einen inhibierenden Effekt auf mögliche Weise pathogene Bakterien im Darm hat. Einige von diesen haben eine Wirkung gegen spezielle Stämme, während andere eine breitere inhibitorische Wirkung aufweisen.
Die Signifikanz von Lactobacillus-Stämmen in der Darm-Flora wurde in vielen verschiedenen Untersuchungen gezeigt (siehe die grundlegenden Literatur-Schriften (1) bis (8)). Beispielsweise ist gezeigt worden, dass bestimmte Lactobacillus-Stämme gegen eine Kolonisierung pathogener Bakterien schützen, Bakteriocine und andere antimikrobielle Komponenten produzieren, das Immunsystem stimulieren, das Risiko von Tumoren und Dickdarm-Krebs senken, den Serum-Cholesterin-Gehalt verringern, die gastrointestinale Mobilität bei alten Menschen verbessern, die Lactose-Toleranz verbessern usw.. Es gibt auch Studien, bei denen es nicht möglich war, diese Wirkungen zu zeigen, und zwar abhängig von der Tatsache, dass alle Lactobacillus-Stämme nicht in der getesteten Hinsicht funktionieren. In einigen Studien wurde Gebrauch gemacht von einer ungeeigneten Lactobacillus-Zubereitung, z. B. gefriergetrocknet in pulverförmigem Zustand oder in Form unbeschichteter Kapseln.
Die Druckschrift WO 96/38,159 (Lafor Lab Ltd.) offenbart eine pharmazeutische Zubereitung zur Behandlung von mit Antibiotika-assoziierter Diarrhoe, wobei die Zusammensetzung unter anderem lebensfähige Lactobacillus rhamnosus-Stämme enthält.
Die japanische Patentanmeldung Nr. 172,949 (von Jakult Honsa KK) offenbart – neben anderen Dingen – Lactobacillus rhamnosus und Lactobacillus casei als aktive Komponente in einem antiallergischen Mittel.
Die Druckschrift WO 93/01,823 betrifft ein Verfahren zum Isolieren eines Stamms von Lactobacillus, der das Vermögen der Kolonisierung in menschlichen Därmen aufweist.
Beispielsweise wurde der Stamm L. casei sp. rhamnosus 271 isoliert, und es wurde gesagt, dass er nützlich für eine Prophylaxe oder eine Behandlung bakterieller Infektionen ist, insbesondere in Form von einer fermentierten Nahrungsmittel-Zusammensetzung. Der in diesem Dokument angesprochene Stamm wurde isoliert vom Darm von Erwachsenen.
Die Druckschrift EP-A 0 271 364 betrifft eine Zubereitung zur Behandlung oder Prophylaxe von enterischen bzw. intestinalen Störungen bei Tieren. Diese Zubereitung umfasst ein oder mehrere Milchsäure-Bakterien, die gewählt sind von den Phenotypen von – unter anderem – Lactobacillus casei spp. rhamnosus. Die Zubereitung ist eine nichtspezifische Mischung einer Mehrzahl von Stämmen und ist darüber hinaus nicht zur Verwendung in Menschen vorgesehen. Die Stämme gemäß der Offenbarung scheinen von Rindern und Schafen isoliert worden zu sein und sind daher nicht beim Menschen anurendbar. Darüber hinaus sind Experimente nur an Rindern und Schafen durchgeführt worden.
Die Druckschrift DT-A1 2,421,066 betrifft eine Zubereitung zur Wiederherstellung einer gestörten Darm-Flora in einem normalen Zustand, wobei die Zubereitung eine Mischung von Bifido-Bakterien und möglicherweise auch einen Lactobacillus casei var. rhamnosus-Stamm umfasst.
In unseren Analysen der Wechselwirkung zwischen verschiedenen Bakterien haben wir unter anderem untersucht, wie bestimmte Lactobacillus-Stämme gegen Diarrhoe wirken können, die im Hinblick auf die Aufnahme von Antibiotika aufgetreten ist, und das Wachstum pathogener Bakterien wie beispielsweise Helicobacter verhindern können. Im Laboratoriums-Maßstab wurden Kulturen von Lactobacillus getestet, von denen eine große Zahl von Klonen mit variierenden biologischen Eigenschaften isoliert wurde. Einer dieser Stämme, Lactobacillus casei rhamnosus LB21, nachfolgend auch bezeichnet als „LB21" wurde von Faeces von Kindern isoliert, und es wurde gezeigt, dass er einen besonders hervorragenden inhibitorischen Effekt auf die Mehrzahl der Bakterien hat, die bei verschiedenen Typen von Infektionen im Menschen wichtig sind, wie beispielsweise Staphylococcus aureus, verschiedene Spezies von Salmonella, Shigella Pseudomonas, Klebsiella-Enterobacter, Campylobactus, Clostridium difficile, Helicobacter pylori usw.. Der stark inhibierende Effekt von genau LB21 auf pathogene Darm-Bakterien ist wahrscheinlich auf die Tatsache zurückzuführen, dass der Stamm ein spezifisches, niedermolekulares Protein oder ein spezifisches, niedermolekulares Peptid produziert, das thermisch stabil ist, ein Molekulargewicht unter 5000 Dalton aufweist und das in einer einzigartigen Weise eine schädliche Wirkung auf Darm-pathogene Bakterien hat.
Jedoch beschreibt keine der oben genannten Publikationen den speziellen Stamm Lactobacillus casei rhamnosus LB21, der von Faeces von Kindern isoliert wurde und der eine erheblich verbesserte Wirkung auf gastrointestinale Störungen hat, verglichen mit nahe verwandten Stämmen.
Aufgabe der Erfindung
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, die oben genannten Gesundheitsprobleme noch wirksamer zu erleichtern, als dies durch Behandlungsverfahren des Standes der Technik erlaubt wurde. Diese Aufgabe wird gelöst durch eine pharmazeutische Zubereitung des Typs, der im Rahmen der Einführung genannt wurde, die darüber hinaus die Merkmale aufweist, die im kennzeichnenden Teil des nachfolgenden Patentanspruchs 1 definiert sind. Bevorzugte Ausführungsformen sind in den beigefügten Unteransprüchen angegeben.
Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zubereitung zur Prophylaxe gegen und/oder Behandlung von gastrointestinalen Störungen bei Menschen und Tieren, wobei die Zubereitung dadurch gekennzeichnet ist, dass sie einen lebensfähigen Mikroorganismus-Stamm in Form des Lactobacillus casei rhamnosus-Stamms LB21 umfasst, und zwar in wenigstens einem pharmazeutisch annehmbaren Träger-Medium, in dem der Mikroorganismus seine Lebensfähigkeit beibehält. Noch spezieller betrifft die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zubereitung zur Prophylaxe gegen und/oder Behandlung von – unter anderem – mit Antibiotika-assoziierter Diarrhoe, Helicobacter-Infektion im Magen, Touristen-Diarrhoe und Stress-induzierten gastrointestinalen Störungen.
Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung den Lactobacillus casei rhamnosus-Stamm NCIMB 40564, der in der Lage ist, gastrointestinale Störungen im Menschen und in Tieren zu verhindern und/oder zu heilen und der isoliert wurde von Faeces eines etwa ein bis acht Tage alten Kindes.
Die pharmazeutische Zubereitung gemäß Erfindung enthält den Mikroorganismus-Stamm Lactobacillus casei rhamnosus LB21 in einer Menge von 10² bis 10¹², vorzugsweise von 10⁶ bis 10¹⁰, Kolonie-bildenden Einheiten pro ml einer gebrauchsfertigen Zubereitung.
Mit dem Ausdruck „Kolonie-bildende Einheiten" ist Zahl von Kolonien gemeint, die ein oder mehrere Bakterien enthalten, die auf einem Substrat wachsen.
Mit dem Ausdruck „Helicobacter-Infektion" sind Symptome eines Magengeschwürs gemeint, bei dem Helicobacter als im Magen oder im oberen Teil des Dünndarms vorhanden identifiziert wurde.
Mit dem Ausdruck „Touristen-Diarrhoe" ist eine Diarrhoe gemeint, die auftritt, wenn sich die Gastrointestinal-Flora ändert, beispielsweise im Ausland und auch im Fall einer Infektion, die durch beispielsweise Salmonella und E.coli hervorgerufen wurde.
Mit dem Ausdruck „durch Stress induzierte gastrointestinale Störungen" wird eine Unausgewogenheit in der Gastrointestinal-Flora gemeint, die Magenschmerzen, Diarrhoe, Gas-Bildung usw. hervorruft.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der Träger von LB21 ein gesäuertes oder fermentiertes Milch-Produkt wie beispielsweise gesäuerte Milch, Joghurt, Milch, oder er ist ein Fruchtsaft, eine Eiscreme, eine Suppe oder ein Frucht-Getränke. Der Bakterien-Stamm kann als Start-Kultur bei der Herstellung derartiger Milch-Produkte verwendet werden, was zu gesäuerten oder fermentierten Milch-Produkten führt, die eine erhöhte Menge des vorteilhaften Stamms aufweisen. Natürlich ist es auch möglich, LB21 zubereiteten Milch-Produkten oder Fruchtsaft, Suppe oder Eiscreme zuzusetzen und so auf diese Weise eine größere Menge wünschenswerter Bakterien in dem Medium zu erhalten. Diese Ausführungsform ist hochgradig wichtig, da die so erhaltene Zubereitung ein gesundes und geschätztes Lebensmittel ist. Solch eine Zubereitung kann prophylaktisch oder heilend gegen Diarrhoe und andere Darm-Infektionen gegeben werden, die häufig Kinder beeinträchtigen. Darüber hinaus kann sie an Menschen abgegeben werden, die mit Antibiotika oder Strahlung bei der Krebs-Behandlung behandelt wurden, an Menschen, die eine Helicobacter-Infektion im Magen haben, und an Touristen, die ins Ausland reisen, wo eine Bakterien-Flora, die für den Gastrointestinal-Gang ungewohnt ist, häufig angetroffen wird.
Die Zubereitung kann auch in trockener Form für eine orale Verabreichung zugegen sein, beispielsweise in Form von Kapseln, Tabletten oder Pulver oder in Form einer Suspension, gegebenenfalls gefroren, wie beispielsweise in Form einer NaCl-Lösung, Glucose-Lösung oder Magermilch. Die hier verwendeten Träger-Medien sind solche des herkömmlichen Typs und sind Fachleuten in diesem technischen Bereich wohlbekannt. Die Kapseln können von dem Typ sein, der gegenüber dem Magensaft resistent ist, so dass die Bakterien gegen den Magensaft geschützt sind und nur im Gedärm freigesetzt werden. Aus demselben Grund können Tabletten mit einer Beschichtung des aus dem Stand der Technik bekannten Typs verabreicht werden, die gegenüber Magensaft beständig ist. Pulver können so vorgesehen werden, dass sie in eine wässrige Flüssigkeit vor der Verabreichung eingerührt werden, beispielsweise in Wasser, Fruchtsaft oder irgendein Milch-Produkt.
Es wurde so gefunden, dass die Zubereitung ein besonders großes Potential als prophylaktisches Mittel gegen und/oder als Mittel zum Behandeln von mit Antibiotika-assoziierter Diarrhoe aufweist.
Die Zubereitung kann auch in vorteilhafter Weise zur Prophylaxe gegen und/oder zur Behandlung von Helicobacter-Infektionen im Magen und im oberen Dünndarm beim Menschen und bei Tieren verwendet werden, jedoch auch gegen sog. Touristen-Diarrhoe und gegen Stress-induzierte Magenstörungen.
In die pharmazeutische Zubereitung gemäß der vorliegenden Erfindung kann irgendein anderes Milchsäure-Bakterium möglicherweise auch eingearbeitet werden, wie beispielsweise ein oder mehrere Lactococcus- oder Lactobacillus-Stamm/Stämme, jedoch wird vorzugsweise auch der Stamm Lactococcus lactis L1A eingearbeitet.
Die pharmazeutische Zubereitung gemäß der vorliegenden Erfindung ist – wie auch gefunden wurde – besonderes vorteilhaft bei der Prophylaxe und/oder Behandlung von Kindern in den folgenden Situationen:

(a) Neugeborene Babys und vorzeitig geborene Babys, die einer intensiven Pflege bedürfen.

Eine derartige Intensiv-Pflege kann zu der Tatsache führen, dass die normale Kolonisation des Darms mit Lactobacilli und Bifido-Bakterien nicht stattfindet, was das Risiko einer Dominanz pathogener Bakterien erhöht. Dies erhöht auch das Risiko von Infektionen und erfordert die Verwendung von Antibiotika. Das Verabreichen von LB21 kann die Intestinal-Flora bei diesen Babys normalisieren und der unvorteilhaften Entwicklung, wie sie oben beschrieben wurde, entgegen wirken.

(b) Babys, die einem erhöhten Risiko ausgesetzt sind, Typ 1-Diabetis, Zöliakie (Gluten-Allergie) und verschiedene Autoimmun-Zustände zu bekommen.

Ein Faktor, der diese Störungen verursacht, ist wahrscheinlich eine gestörte Immun-Kontrolle im Darm, so dass Antigene (Substanzen, die nicht natürlich im Körper vorkommen) aus Lebensmitteln, Intestinal-Bakterien, Viren oder anderen Mikroorganismen eine Immun-Reaktion gegen die eigenen Gewebe des Körpers hervorrufen können. Eine Verabreichung von LB21 kann die Intestinal-Flora normalisieren und so dem Auftreten dieser Störungen entgegen wirken.

(c) Kinder, die einer Operation wegen Gallengang-Atresie unterzogen wurden (angeborene Missbildung mit vollständigem oder teilweisem Verlust von Gallengängen innerhalb und/oder außerhalb der Leber) und Kinder, die einer Leber-Transplantation unterzogen wurden.

Diese Kategorien von Kindern erleben ein erhöhtes Risiko, von Infektionen befallen zu werden, die die Leber/die Gallengänge nach der Operation beeinträchtigen. Das Zuführen von LB21 kann das Risiko solcher Komplikationen dadurch reduzieren, dass das Wachstum der Bakterien inhibiert wird, die üblicherweise diese Arten von Infektionen hervorrufen.
Die pharmazeutische Zubereitung gemäß der Erfindung ist auch nützlich in Verbindung mit einer cytotoxischen Behandlung. Patienten mit Krebs-Krankheiten werden häufig mit Cytotoxinen behandelt, die einen negativen Effekt auf die Funktion des Darms haben und eine nachteilige Wirkung auf die Struktur und das neue Wachstum der Darm-Schleimhaut-Membran haben. Folglich verursacht dieser Typ Behandlung oft eine verringerte Assimilation von Nahrungsmitteln sowie eine Diarrhoe. Eine weitere Folge ist, dass sich Darm-Bakterien durch die geschwächte Darm-Schleimhaut-Membran in die Blutgefäße ausbreiten und ernsthafte Infektionen hervorrufen. Dies führt zu einer erhöhten Konsumierung von Antibiotika, was seinerseits weiter die Funktion des Darms verschlechtert und implizieren kann, dass verschiedene Darm-Bakterien Resistenz gegen Antibiotika entwickeln.
Durch Zufuhr von LB21 in Verbindung mit der Behandlung mit Cytotoxinen können die negativen Wirkungen auf die Funktion und Struktur der Darm-Schleimhaut-Membran reduziert werden, wodurch seinerseits das Risiko ernsthafter Infektionen reduziert wird, die durch Bakterien im Darm hervorgerufen werden.
Darüber hinaus ist die pharmazeutische Zubereitung gemäß der vorliegenden Erfindung nützlich zum Verhindern von Allergien bei Kindern, z. B. von atopischem Ekzem, und zum Verhindern und Behandeln von Verstopfung, vor allem bei alten Menschen.
Wenn die pharmazeutische Zubereitung gemäß der Erfindung für eine Behandlung von Tieren vorgesehen ist, ist der Träger ein geeignetes Futter, wie beispielsweise in Form von Molke, Trockenfutter oder einer konzentrierten Suspension.
Der Mikroorganismus sollte in einem gefriergetrockneten Zustand gelagert werden, vorzugsweise in Magermilch an einem dunklen und trockenen Platz, kann jedoch auch bei einer Temperatur von –70° C gefroren werden.
Die notwendige Dosis der Zubereitung gemäß der Erfindung kann in Abhängigkeit von solchen Faktoren wie dem Alter des Patienten und dem Zustand des Patienten sowie dem Typ und dem Grad der Schwere der Krankheit eingestellt werden. Liegt innerhalb der Kompetenz einer in diesem technischen Bereich mit Sachverstand versehenen Person, eine geeignete Dosis im Blick auf diesen Hintergrund zu bestimmen. Ein weiterer Vorteil der Erfindung ist, dass eine große Überdosis der pharmazeutischen Zubereitung kaum ein Risiko für den Patienten bedeutet.
Mikroorganismus gemäß der Erfindung
Der oben genannte Mikroorganismen-Stamm Lactusbacillus casei rhamnosus LB21 wurde als einer von etwa 100 Lactobacillus-Stämmen von Faeces eines etwa fünf Tage alten gesunden Babys isoliert und wurde dann so ausgewählt, dass er der am meisten wirksame Stamm für die Zwecke gemäß der Erfindung ist. Es ist sehr wichtig, dass LB21 von dem Baby in der ersten Woche isoliert wird, wie beispielsweise in einem Zeitraum vom ersten bis zum achten Tag des Lebens, vorzugsweise etwa am fünften Tag des Lebens. LB21 wird von anderen Lactobacillus casei rhamnosus-Stämmen durch Verwendung der Puls-Feld-Gel-Elektrophorese (pulsated field gel electrophoresis; PFGE) gemäß dem Verfahren nach Fasola und BioRad unterschieden. LB21 ist vorher nicht isoliert und definiert worden und ist ein früher vollständig unbekannter Lactobacillus casei rhamnosus-Stamm, von dem gefunden wurde, dass er besonders vorteilhafte Wirkungen auf die oben genannten Gesundheitsprobleme und Zustände schlechter Gesundheit hat.
Die folgende Tabelle zeigt die Testergebnisse vom Anfangsstadium der Selektion, wo LB21 mit anderen Lactobacillus-Stämmen verglichen wird, die von Faeces von Babys isoliert wurden, und zwar im Hinblick auf die inhibitorische Wirkung auf einige Pathogene.
Wechselwirkungs-Tabelle
Wie oben angegeben, wird der LB21-Stamm als aktive Komponente in die Zubereitung gemäß der Erfindung eingeschlossen und wurde am 11. Juni 1993 am Institut The National Collection of Industrial and Marine Bacteria (NCIMB), 23 St. Machar Drive, Aberdeen AB2 1RY, Großbritannien, hinterlegt. Seine Zugangs-Nr. ist NCIMB 40564. Es sollte angemerkt werden, dass der Stand mit der Identifikations-Referenz Lactobacillus casei rhamnosus L20 05 hinterlegt wurde, dass jedoch die übliche Bezeichnung des Stamms später geändert wurde nach Lactobacillus casei rhamnosus LB21. Der Stamm ist typifiziert oder klassifiziert nach dem API 50CH-System (API-System, La Balme les Grottes, 38390 Montalieu, Vercieu), wie es sich offensichtlich aus der folgenden Typifizierungs-Tabelle ergibt: API 50 CL 37° C, CO₂ Blut-Agar

G: = grüne Farbe
+: = vollständige Änderung in gelbe Farbe
–: = ursprüngliche blau-lila Farbe

Es ist hier wichtig, zu betonen, dass es einen großen Unterschied zwischen den verschiedenen Lactobacillus-Stämmen gibt, wie dies auch der Fall ist bei der Subspezies Lactobacillus casei rhamnosus (LB21). LB21 in der pharmazeutischen Zubereitung gemäß der vorliegenden Erfindung wurde sicher als ein Lactobacillus casei rhamnosus-Stamm identifiziert, jedoch bedeutet dies überhaupt nicht, dass der in Rede stehende Stamm identisch mit oder ähnlich zu anderen Lactobacillus casei rhamnosus-Stämmen ist, die in der Literatur beschrieben wurden, wie beispielsweise in der Druckschrift WO 93/01823. Diese Subspezies wachsen beispielsweise unterschiedlich gut in Sauerstoff-Umgebung und bei verschiedenen Temperaturen. Es ist offensichtlich, dass es nicht eine Frage identischer Stämme ist, und eine detaillierte Charakterisierung der jeweiligen Subspezies (siehe oben), zeigt, dass sie verschiedene Eigenschaften haben, was eine in diesem technischen Bereich mit üblichem Sachverstand versehene Person realisiert. Ein großer Unterschied besteht z. B. darin, dass LB21 von Faeces eines Babys isoliert wurde, während der Stamm 271 in der Druckschrift WO 93/01823 aus dem Darm von Erwachsenen isoliert wurde.
Durchgeführte Experimente
Passage des Gastrointestinal-Gangs
Ein Erfordernis für probiotische Stämme von Milchsäure-Bakterien, wie beispielsweise LB21 in der Zubereitung gemäß der Erfindung, mit dem Ziel, in der Lage zu sein, im Dünndarm und Dickdarm von Menschen und Tieren zu wirken, besteht darin, dass sie die Passage durch die saure Umgebung des Magens überleben müssen. Es wurde eine Untersuchung durchgeführt, um zu zeigen, dass Lactobacilllus casei rhamnosus LB21 die Passage durch den Magen überleben kann und im Faeces von gesunden Freiwilligen gefunden werden kann. Darüber hinaus haben wir untersucht, wie lange dieser Stamm im Faeces gefunden werden kann, nachdem die Personen des Experiments die orale Aufnahme des Mikroorganismus beendet hatten.
In einem Teil-Experiment A lieferten 25 gesunde freiwillige Menschen eine Probe von Faeces in einem sterilen Plastikrohr. Diese Probe wurde an einen kalten Platz (4° C maximal) bis zur Gelegenheit einer Kultivierung gelagert. Vor der Kultivierung wurde die Probe in einer 0,9%-igen Salzlösung in einem Verhältnis 1:10 eingemischt, und dann wurden 10 μl der Probe auf Rogosa-Platten mit 128 μ/ml Vancomycin kultiviert. Die Platten wurden bei 37° C in CO₂-Umgebung inkubiert und wurden nach 48 h ausgelesen. Der Grenzwert für eine Teilnahme am Teil-Experiment B wurde so festgesetzt, dass er bei höchstens 4 × 10⁴ Kolonie-bildenden Einheiten von Vancomycin-resistenten Lacobacilli pro g Faeces lag.
Am Teil-Experiment B nahmen 13 der 25 oben genannten Personen teil, die eine relativ Vancomycin-empfindliche Lactobacillus-Flora im Darm hatten. Die Personen wurden instruiert, keine Nahrung zu essen, die Lactobacillus enthielt, und zwar von einem Zeitpunkt 2 Wochen vor dem Start der Untersuchung bis einschließlich des letzten Tages der Untersuchung. Jede Person nahm in Verbindung mit einer Mahlzeit eine 10 ml umfassende Salzlösung mit 10¹¹ Kolonie-bildenden Einheiten von lebensfähigem LB21 pro Tag für fünf Tage auf. Diese Personen lieferten eine Faeces-Probe am Tag vor dem Aufnehmen von Lactobacillus (0-Probe) und dann vom vierten Tag der LB21-Aufnahme an bis zu (und einschließlich) 12 Tage nach der vollständigen Beendigung der Behandlung. Die Probenabnahme und Kultivierung der Proben wurde nach demselben Verfahren wie im Teil-Experiment A durchgeführt. Die Identifikation von Lactobacillus casei rhamnosus LB21 erfolgte mittels einer Gram-Färbung und der API-Klassifikation (CHL-Medien).
Es sollte angemerkt werden, dass Person Nr. 8 Penicillin im Verlauf der Studie einnahm. Diese Person nahm daher LB21 für 10 Tage auf, beginnend zum selben Zeitpunkt wie der Rest der Gruppe von Personen.
Teil-Experiment B wurde 12 Tage nach dem Zeitpunkt unterbrochen, nachdem die Aufnahme von LB21 beendet worden war. Dies erfolgte, obwohl LB21 noch in Faeces von 4 der 13 Personen gefunden werden konnte. Bei den verbleibenden 9 Personen konnte LB21 von dem Faeces im Mittel fünf Tage nach dem Zeitpunkt isoliert werden, nachdem die Aufnahme beendet worden war. Bei der Person Nr. 8, die Penicillin eingenommen hatte, wurde LB21 in dem Faeces während der gesamten Penicillin-Behandlung und zwei Tage nach dem Zeitpunkt gefunden, nachdem die Aufnahme abgeschlossen worden war. In den Faeces-Proben wurde LB21 in der Größenordnung von 1 × 10³ bis 5 × 10⁵ Kolonie-bildenden Einheiten pro g Faeces gefunden.

Person Zahl von Tagen nach Beendigung der Behandlung, bei der LB21 in dem Faeces zugegen war

1 3

2 6

3 3

4 12

5 12

6 3

7 5

8 2

9 7

10 12

11 3

12 7

13 12
Zusammengefasst konnte ermittelt werden, dass der Lactobacillus casei rhamnosus-Stamm LB21 die Passage durch den Magen überlebte und im Faeces aller Personen gefunden werden konnte, auch bei der Person, die eine Penicillin-Behandlung vorgenommen hatte. 4 der 13 Personen hatten LB21 im Faeces noch 12 Tage nach Beendigung der oralen Aufnahme von LB21. Die verbleibenden 9 Personen hatten LB21 im Mittel immer noch fünf Tage nach dem Zeitpunkt, nach dem die Aufnahme von LB21 beendet worden war. Die mittlere Zahl für die gesamte Gruppe von 13 Personen war sechs Tage.
Inhibitorische Wirkung von Lactobacillus casei rhamnosus LB21
Das oben beschriebene Milchsäure-Bakterium LB21 wurde auf seine inhibitorische Wirkung auf eine große Zahl von intestinal pathogenen Bakterien getestet. Es wurde gefunden, dass es eine zufriedenstellende inhibitorische Wirkung hat, und ein Experiment wurde auch mit dem Ziel durchgeführt, zu untersuchen, ob es auch E.coli 0-157, Clostridium difficile und Helicobacter pylori inhibieren kann.
Zwei Stämme von E.coli 0-157, von denen einer tox– und der andere tox+ war, wurden von Patienten isoliert. Fünf Stämme von Clostridium difficile von Patienten, die unter einer mit Antibiotika verbundenen Diarrhoe litten, und drei Stämme von Helicobacter pylori von klinischem Material (Biopsien) wurden ebenfalls getestet. Bei dem durchgeführten Beeinflussungs-Test wurde Gebrauch gemacht von der Agar-Schicht-Methode, die auf die getesteten Bakterien eingestellt wurde. Diese Methode bedeutet, dass die Lactobacillus-Stämme in einer MRS-Brühe (Merck) bei 37° C in 5 % CO₂ über Nacht kultiviert wurden. Jeder Stamm wurde dann getrennt in MRS-Agar eingeformt (25 ml Agar). Die Agar-Platten wurden unter den oben beschriebenen Bedingungen für 24 h inkubiert. Eine neue Agar-Schicht (M17 Agar, Firma Merck, 25 ml) oder Blut-Agar (BHI + Pferde-Blut) wurde über die erste Schicht gegossen, und man ließ dann die zweite Schicht 4 h sich verfestigen. Die Test-Bakterien wurden dann getrennt in TY-Medium (S E Holm und E Falsen, APMIS 1967, 69, 264) bei 37° C kultiviert. Die Bakterien wurden in Bertani-Vertiefungen (Tröge) (0,25 ml, 10⁶ Bakterien pro ml) überführt. Die Bakterien wurden auf ein Verhältnis 1:10 in NaCl in einer neuen Bertani-Vertiefung verdünnt. Von diesen Vertiefungen wurden die Test-Stämme (25 pro Vertiefung) dann auf die Agar-Platte mittels eines Steers-Stahl-Stift-Replikators aufgebracht. Die Platten wurden bei 37° C (E.coli), bei 37° C und anaerob (für Clostridium difficile) und bei 37° C in einer mikroaerophilen Umgebung (für Helicobacter pylori) inkubiert (E. Steers et al., J. Antibiot. Chemoter. 179, 9, 307). Zur Kontrolle wurden Platten ohne LB verwendet.
Der LB21-Stamm inhibierte alle getesteten Bakterien.
Das Endergebnis zeigte, dass der LB21-Stamm eine exzellent zufriedenstellende inhibitorische Wirkung auf diese Darm-Pathogene hat, was sich aus der folgenden Tabelle ergibt.
Inhibitorische Wirkung von Lactobacillus LB21
Die Tests wurden durchgeführt gemäß dem Agar-Schicht-Verfahren sowie in einer Kultur-Brühe. Sie wurden wiederholt und bei einigen unterschiedlichen pH-Werten durchgeführt.
Vermögen von Lactobacillus casei rhamnosus LB21 eine mit Antibiotikaassoziierte Diarrhoe zu inhibieren
31 gesunde Personen nahmen an der Untersuchung teil, 16 Männer und 15 Frauen. Die Personen wurden nach Geschlecht getrennt und dann statistisch in eine Testgruppe oder eine Kontrollgruppe eingeteilt. Die Testgruppe schloss 16 Personen, die Kontrollgruppe schloss 15 Personen ein. Das mittlere Alter in der Testgruppe lag bei 24,6 Jahren, im Bereich von 19 bis 31 Jahren. Das mittlere Alter der Kontrollgruppe betrug 24,4 Jahre, im Bereich von 20 bis 33 Jahren. Zwei Personen in der Kontrollgruppe fielen im Verlauf der Untersuchung aufgrund von Schwangerschaft und Störungen aus, die durch die Einnahme von Antibiotika hervorgerufen wurden. Der Ausfall ergab so eine Menge von 6,5 %. Für den letzten Faeces-Test fiel eine weitere Person in der Kontrollgruppe aufgrund einer Sport-Verletzung aus. Keine der Personen war Raucher oder Schnupftabak-Konsument oder hatte während der letzten sechs Monate vor der Untersuchung Antibiotika eingenommen. Kein Medikament mit der Ausnahme von Kavepenin war im Verlauf der Studie erlaubt. Den Personen war es nicht gestattet, irgendwelche fermentierten Produkte innerhalb eines Zeitraums von zwei Wochen vor dem Start der Aufnahme von Penicillin und im Verlauf der Untersuchung zu sich zu nehmen. Das Experiment wurde als Placebo-kontrollierter Doppel-Blind-Test durchgeführt und wurde vom Untersuchungs-Ethik-Komitee der Fakultät für Medizin der Universität von Umea (Umea) genehmigt.
Die Testgruppe wie auch die Kontrollgruppe nahm 500 mg Kavepenenin in Kapseln peroral zweimal am Tag für die Zeit von zehn Tagen auf (Phenoxymethyl-Penicillin-Kalium, Firma Astra Läkemedel, Södertälje).
Der Testgruppe wurde gefrorene Magermilch mit LB21 (Firma Essum, Umea) in einer Konzentration von 10¹¹ Kolonie-bildenden Einheiten (cfu; colony-forming units) pro ml gegeben. Der Kontrollgruppe wurde Magermilch als Placebo gegeben. Die Personen in der Testgruppe nahmen 5 ml gefrorene Magermilch mit LB21 oder Placebo zweimal am Tag zu sich. Die Aufnahme begann gleichzeitig mit der Penicillin-Verabreichung und dauerte 15 Tage.
Proben von Faeces wurden vor der Aufnahme von Kavepinin am Tag 0, während der Einnahme von Kavepenin und LB21 oder Placebo am Tag 10 und am Tag 15 während der Einnahme von LB21/Placebo nach der abgeschlossenen Kavepenin-Behandlung gesammelt. Die Proben wurden an einem kalten Platz (+4 bis 8° C) gelagert, bevor sie zum Labor gegeben wurden, wo sie gefroren und bei –20° C vor einer Analyse gelagert wurden. Alle Proben wurden innerhalb von 24 h der Probenabnahme gefroren.
Die Personen nahmen die Zahl der Stuhlgänge pro Tag und die Konsistenz der Faeces in Form eines Protokolls von einer Woche vor der Einnahme von Kavepenin bis zu (und einschließlich) fünf Tage nach der abgeschlossenen Behandlung auf. Magenschmerzen und andere subjektive Symptome wurden ebenfalls aufgezeichnet.
Die Faeces-Proben wurden gewogen und mit sterilem Wasser in einem Verhältnis 1:10 verdünnt. Der pH-Wert wurde mit einem Indikator-Papier (Merck, pH 5–10) in der Mitte der Mischung gemessen. LB21 wurde kultiviert, nachdem die Probe mit sterilem Wasser verdünnt worden war, und zwar auf Rogosa-Platten mit 128 μg Vancomycin. Die Proben wurden bei 37° C in CO₂-Umgebung für 48 h inkubiert.
Alle Lactobacilli wurden auf Rogosa-Platten kultiviert, nachdem sie mit sterilem Wasser verdünnt worden waren. Die Proben wurden anaerob bei 37° C für 48 h inkubiert. Dann wurden die Proben bei –20° C gelagert.
Tests auf Clostridium difficile-Toxin wurden durchgeführt entsprechend der Vorschrift von Aronsson et al..
Die Häufigkeit der Stuhlgänge, die Konsistenz der Faeces, Magenschmerzen und andere subjektive Symptome wurden aufgezeichnet, und es wurden die Werte, Median-Werte und der Bereich berechnet.
Statistische Berechnungen wurden mit dem Programm SPSS für Windows durchgeführt. Die Ergebnisse wurden als mittlere Werte und Median-Werte präsentiert. Die Werte der Lactobacilli wurden logarithmiert (log 10), bevor die statistische Berechnung durchgeführt wurde. Der Median-Wert und der Bereich zwischen dem Maximum-Wert und dem Minimum-Wert wurden auf der Basis der Zahl der Stuhlgänge, der Konsistenz der Faeces und des pH-Werts berechnet. Statistische Vergleiche zwischen den Gruppen, bei denen ein Normal-Bereich nicht gefunden werden konnte oder unzuverlässig war, wurden mit einem Mann-Whitney-U-Test (Zahl der Stuhlgänge, Konsistenz der Faeces, Lactobacilli, pH-Wert) durchgeführt. Ein pH-Wert von weniger als 0,05 wurde als statistisch signifikant gesehen.
Ergebnisse
Die Personen, die LB21 aufnahmen, hatten deutlich weniger Stuhlgänge/Diarrhoe während der Einnahme von Phenoxymethyl-Penicillin, verglichen mit der Placebo-Gruppe, z. B. 0,24 bzw. 0,98 (p<0,05). Darüber hinaus stieg die Häufigkeit der Stuhlgänge und das Auftreten von Magenschmerzen während der Penicillin-Behandlung in der Placebo-Gruppe in einem erheblichen Ausmaß an, verglichen mit der Situation vor der Einnahme von Penicillin. Es gab auch eine erheblich Erhöhung der Menge an Lactobacillus casei rhamnosus in den Faeces in der Gruppe, die mit LB21 versorgt worden war. Es gab jedoch keine deutlichen Unterschiede in der Häufigkeit der Stuhlgänge oder in Bezug auf die Gesamt-Zahl von Lactobacilli in den Proben von Faeces in den beiden Gruppen. Weiter gab es keine Fälle von Clostridium difficile-Toxin in einer der beiden Gruppen.
Literatur-Referenzen:

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Claims

Pharmazeutische Zubereitung zur Prophylaxe gegen und/oder Behandlung von gastrointestinalen Störungen im Menschen und in Tieren, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen lebensfähigen Mikroorganismus-Stamm in Form der Lactobacillus casei rhamnosus-Stämme LB21 mit der Zugangs-Nr. NCIMB 40564 in wenigstens einem pharmazeutisch annehmbaren Träger-Medium umfasst, in dem der Mikroorganismus seine Lebensfähigkeit beibehält.
Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus-Stamm in einer Menge von 10² bis 10¹² Kolonie-bildenden Einheiten pro ml der für eine Verwendung fertigen Zubereitung zugegen ist.
Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus-Stamm in einer Menge von 10⁶ bis 10¹⁰ Kolonie-bildenden Einheiten pro ml der für eine Verwendung fertigen Zubereitung zugegen ist.
Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das pharmazeutisch annehmbare Träger-Medium ein gesäuertes oder fermentiertes Milch-Produkt ist, vorzugsweise Sauermilch, Joghurt und Milch, oder Fruchtsaft, Eiscreme, Suppe und Frucht-Getränke ist.
Pharmazeutische Zubereitung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das pharmazeutisch annehmbare Träger-Medium ein geeignetes Tierfutter, vorzugsweise Molke, Trockenfutter oder eine konzentrierte Suspension ist, wenn die Zubereitung gemäß der Erfindung an Tiere verabreicht wird.
Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Bakterienstamm dem Träger-Medium als Start-Kultur zugesetzt wurde und/oder der für die Verwendung fertigen Zubereitung zugesetzt wurde.
Pharmazeutische Zubereitung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass sie in trockener Form wie beispielsweise in Form von Kapseln, Tabletten oder Pulver, oder in Form einer Suspension, gegebenenfalls gefroren, vorzugsweise als NaCl-Lösung, Glucose-Lösung oder als Magermilch, zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger-Material vorliegt.
Pharmazeutische Zubereitung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens ein anderer Lactococcus-, Lactobacillus- oder Bifidobacterium-Stamm, vorzugsweise Lactococcus lactis L1a, ebenfalls in die Zubereitung eingearbeitet ist.
Lactobacillus casei rhamnosus-Stamm, der in der Lage ist, gastrointestinale Störungen im Menschen und in Tieren vorzubeugen und/oder diese zu heilen, worin der Stamm die Zugangs-Nr. NCIMB 40564 aufweist.
Verwendung eines Lactobacillus casei rhamnosus-Stamms gemäß Anspruch 9 für die Herstellung eines Medikaments zur Prophylaxe gegen und/oder Behandlung von Antibiotika-assoziierter Diarrhoe, Helicobacter-Infektion im Magen und im oberen Dünndarm, Touristen-Diarrhoe, Stress-induzierter gastrointestinaler Störungen, Cytotoxin-induzierter Einflüsse auf den Darm, Allergien bei Kindern, Verstopfung und/oder zur Prophylaxe gegen Darm-Infektionen bei Kindern, die sich einer Leber-Transplantation unterzogen haben oder wegen einer Gallengang-Atresie operiert wurden, oder bei Babys, die frisch geboren oder vorzeitig geboren wurden.
Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zubereitung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, worin der Lactobacillus casei rhamnosus-Stamm LB21 mit der Zugangs-Nr. NCIMB 40564, der von Faeces eines ein bis acht Tage alten Babys isoliert wurde, vorzugsweise eines fünf Tage alten Babys isoliert wurde, einem pharmazeutisch annehmbaren Träger-Medium zugesetzt wird, in dem der Mikroorganismus seine Lebensfähigkeit beibehält.