CN110295130A - 一株鼠李糖乳杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于益生菌技术领域，具体涉及到一株具有调节肠道菌群和抗过敏功能的鼠李糖乳杆菌及其应用。所述鼠李糖乳杆菌具体为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)nbk‑W120，保藏编号为CGMCC No.16873，该菌株既可以维持机体肠道菌群的稳态，又具有抗过敏功能的鼠李糖乳杆菌及其应用，口服该鼠李糖乳杆菌一段时间，能有效调节机体肠道菌群，预防和控制过敏。
Description
技术领域：
本发明属于益生菌技术领域，具体涉及到一株具有调节肠道菌群和抗过敏功能的鼠李糖乳杆菌及其应用。
背景技术：
过敏反应是指已免疫的机体在再次接受相同抗原刺激时所发生的的组织损伤或功能紊乱的反应，常见症状有腹痛，腹泻，呕吐，或是皮肤奇痒难熬，更严重者会发生休克。近年来，过敏性疾病的发病率在全球范围内迅速上升，据世界过敏(变态反应)组织统计，过敏性疾病在全球的总患病率达到30％以上。传统的药物治疗存在治疗周期长、易复发、副作用大等不足之处。
一般认为，过敏反应的发生与机体自身免疫系统存在缺陷和过敏原长期反复的刺激导致免疫系统出现异常有关。随着对肠道菌群调控作用研究的不断深入，发现肠道微生态的稳态与过敏性疾病的发生存在密切关系。
肠道是人体最大的“免疫器官”，集结了人体约70％的免疫细胞。稳定的肠道菌群有助于维持和增强肠道粘膜屏障，抵抗外来大分子抗原等的侵袭，还能刺激免疫系统，却不引发对机体有害的炎症反应，减少过敏反应的发生。
中国发明专利申请CN 1272791 A公开了一种用于预防和/或治疗人和动物中胃肠道疾病的药物制剂，该制剂在至少一种药学上可接受的载体培养基中包含鼠李糖乳杆菌菌株LB21和/或其具有基本相似功能的一种或多种变体，其中微生物保持其存活。
刘颖等在《鼠李糖乳杆菌L T22对小鼠免疫功能的影响》中取SPF小鼠120只，分成3批，每批分为4个组。对照组小鼠灌服灭菌水；实验1组灌服自制发酵培养基；实验2组灌服鼠李糖乳杆菌LT22 37℃、48h培养物；实验3组灌服灭活的鼠李糖乳杆菌LT22培养物。所有小鼠均采用口腔灌服，0.5mL/只/d，连续接种7d或13d。通过测定巨噬细胞吞噬活性、T淋巴细胞数量、血清溶血素含量及器官指数来反映鼠李糖乳杆菌LT22对小鼠免疫功能的影响。结果表明：所有实验组均能显著增强小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬活性，均能促进IgM的生成及脾脏和胸腺的发育；实验2组能显著增加T淋巴细胞的数量及血清溶血素的含量。
多数益生菌都有调节肠道菌群的功能，也有不少研究报导益生菌有抗过敏的功效，然而却罕见兼顾两种功效的益生菌菌株。
发明内容：
本发明目的在于提供一株既可以维持机体肠道菌群的稳态，又具有抗过敏功能的鼠李糖乳杆菌及其应用，口服该鼠李糖乳杆菌一段时间，能有效调节机体肠道菌群，预防和控制过敏。
本发明解决问题所采用的技术方案之一，是提供一株既能调节肠道菌群，又具有抗过敏功效的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)nbk-W120，该菌株已于2018年12月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.16873。
所述的鼠李糖乳杆菌nbk-W120分离自健康的母乳喂养的婴儿粪便中。挑选革兰氏染色阳性、触媒实验阴性的菌株，经生理生化实验及分子生物学鉴定为鼠李糖乳杆菌，命名为鼠李糖乳杆菌nbk-W120。
本发明解决问题所采用的技术方案之二，是提供一种鼠李糖乳杆菌菌粉，制备方法如下：
(1)将鼠李糖乳杆菌nbk-W120进行发酵培养，当发酵液中的活菌数≥1×109cfu/mL时，停止发酵；
(2)从步骤(1)的发酵液中收集菌体，将菌体与冻干保护剂混合后进行乳化包埋，得到乳化液，将乳化液冷冻干燥，粉碎，得到鼠李糖乳杆菌nbk-W120菌粉；
进一步地，所述菌体与冻干保护剂的质量比优选为1:0.9～1.8，更优选为1:1～1.6；
进一步地，所述乳化包埋的温度优选为10～25℃，更优选为15～20℃；
进一步地，所述乳化包埋时间为20～50min；
进一步地，所述冻干保护剂包括5～10％脱脂乳粉、2～8％糊精和余量的水；
进一步地，在获得乳化液后，对乳化液进行预冷冻、真空冷冻干燥、粉碎，得到鼠李糖乳杆菌nbk-W120菌粉；所述预冷冻的温度优选为-40～-35℃，更优选为-38℃；所述预冷冻的时间优选为1～3h，更优选为2h；所述真空冷冻干燥的温度优选为-40℃～37℃，更优选为-30℃～25℃；所述真空冷冻干燥的时间优选为12～60h，更优选为20～40h，最优选为25～35h；所述真空冷冻干燥的真空度优选为0.1～0.3mbar，更优选为0.2mbar；
进一步地，将鼠李糖乳杆菌nbk-W120接种至种子培养基中，活化后，得到一级种子液；将一级种子液接种至种子培养基中，厌氧培养，得到二级种子液；将二级种子液接种至发酵培养基中进行发酵，离心发酵液，得到菌体；
进一步地，所述种子培养基包括以下质量百分比含量的原料：1～3％葡萄糖、1～3％蛋白胨、0.5～3％酵母浸膏、0.5～1.5％牛肉膏、0.2～1％无水乙酸钠、0.02～0.08％硫酸镁、0.02～0.08％硫酸锰、0.08～0.15％吐温80和余量的水，pH值为6.2～6.6；
优选的，所述种子培养基组成如下：1.5～2.5％葡萄糖、2～2.5％蛋白胨、1～2％酵母浸膏、0.8～1.2％牛肉膏、0.4～0.8％无水乙酸钠、0.04～0.06％硫酸镁、0.03～0.05％硫酸锰、0.1～0.13％吐温80和余量的水；
进一步地，所述活化的时间优选为14～24h，更优选为16～20h；所述活化温度优选为30～42℃，更优选为35～37℃；所述活化时为厌氧条件；
进一步地，一级种子液接种至种子培养基中在厌氧条件下活化16～24h，得到二级种子液；所述一级种子液接种至种子培养基的接种量优选为2～8％(体积百分数)，更优选为3～6％(体积百分数)；一级种子液进行厌氧培养的温度优选为28～40℃，更优选为32～37℃；
进一步地，二级种子液进行厌氧发酵培养的时间优选为14～18h，更优选为15～16h，发酵温度为30～42℃，接种量为1％～8％。
进一步地，所述发酵培养基包括以下质量百分比含量的原料：1～3％葡萄糖、1～3％蛋白胨、0.5～2.5％酵母浸膏、0.3～0.8％无水乙酸钠、0.02～0.08％硫酸镁、0.02～0.08％硫酸锰、0.05～0.15％吐温80和余量的水，pH值为6.2～6.8；
优选的，所述发酵培养基组成如下：1.5～2.5％葡萄糖、2～2.8％蛋白胨、1～2％酵母浸膏、0.5～0.7％无水乙酸钠、0.04～0.06％硫酸镁、0.03～0.07％硫酸锰、0.08～0.10％吐温80和余量的水。
本发明解决问题所采用的技术方案之三，是提供了鼠李糖乳杆菌nbk-W120菌粉的应用，特别是在制备具有调节肠道菌群功能或抗过敏功效的药品、保健品、食品或饲料中的应用。
有益效果：
本发明提供了一株既能调节肠道菌群，又能预防及缓解由卵清蛋白、花生等多种过敏源导致的过敏反应的鼠李糖乳杆菌nbk-W120。能显著改善降低过敏反应评分，降低过敏模型小鼠血清IgE值，调节Th1/Th2细胞失衡，诱导调节性T细胞产生，增加模型小鼠体内的乳杆菌和双歧杆菌的比例，有效调节正常小鼠及过敏模型小鼠的肠道菌群。。
附图说明：
图1实施例4试验前后小鼠粪便乳酸杆菌数
其中，A空白对照组；B鼠李糖乳杆菌nbk-W120菌粉组；
图2实施例4试验前后小鼠粪便双歧杆菌数
其中，A空白对照组；B鼠李糖乳杆菌nbk-W120菌粉组；
图3实施例4试验前后小鼠粪便大肠杆菌数
其中，A空白对照组；B鼠李糖乳杆菌nbk-W120菌粉组；
图4实施例7nbk-W120菌粉对IgE、IgA含量的作用
其中，A空白对照组；B模型组；C鼠李糖乳杆菌nbk-W120菌粉组；
图5实施例7各组小鼠粪便内乳酸杆菌含量变化
其中，A空白对照组；B模型组；C鼠李糖乳杆菌nbk-W120菌粉组；
图6实施例7各组小鼠粪便内双歧杆菌含量变化
其中，A空白对照组；B模型组；C鼠李糖乳杆菌nbk-W120菌粉组；
图7实施例7各组小鼠粪便内大肠杆菌含量变化
其中，A空白对照组；B模型组；C鼠李糖乳杆菌nbk-W120菌粉组。
具体实施方式：
为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利，并不用于限定本发明。
实施方案中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，指质量百分比；溶液的百分比“％(m/v)”指100mL溶液中含有溶质的克数。
本发明所提供的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)nbk-W120，是一株既能调节肠道菌群，又具有抗过敏功效的菌株，该菌株已于2018年12月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.16873。
所述的鼠李糖乳杆菌nbk-W120分离自健康的母乳喂养的婴儿粪便中。采用梯度稀释法用生理盐水将无菌采集到的新鲜粪便稀释至10-2-10-6倍，用四区划线法划线于MRS琼脂平板上，在30-37℃培养箱中厌氧培养48-72h。挑选单菌落，革兰氏染色后镜检，挑选革兰氏阳性菌继续纯化，直至得到单菌落，用接种环挑取单菌落涂布于无菌载玻片上，滴加预先配制好的浓度为3％的H2O2溶液，观察结果。挑选革兰氏染色阳性、触媒实验阴性的菌株，经生理生化实验及分子生物学鉴定为鼠李糖乳杆菌，命名为鼠李糖乳杆菌nbk-W120。
本发明提供了所述鼠李糖乳杆菌菌粉的制备工艺，将鼠李糖乳杆菌nbk-W120接种至种子培养基中，活化后，得到一级种子液；将一级种子液接种至种子培养基中，厌氧培养，得到二级种子液；将二级种子液接种至发酵培养基中进行发酵，离心发酵液，得到菌体；将菌体与冻干保护剂混合后进行乳化包埋，得到乳化液，将乳化液真空冷冻干燥，粉碎，得到鼠李糖乳杆菌nbk-W120菌粉。
所述种子培养基包括以下质量百分比含量的原料：1～3％葡萄糖、1～3％蛋白胨、0.5～3％酵母浸膏、0.5～1.5％牛肉膏、0.2～1％无水乙酸钠、0.02～0.08％硫酸镁、0.02～0.08％硫酸锰、0.08～0.15％吐温80和余量的水，pH值独立为6.2～6.6；优选的包括：1.5～2.5％葡萄糖、2～2.5％蛋白胨、1～2％酵母浸膏、0.8～1.2％牛肉膏、0.4～0.8％无水乙酸钠、0.04～0.06％硫酸镁、0.03～0.05％硫酸锰、0.1～0.13％吐温80和余量的水。
在本发明中，所述活化时间优选为14～24h，更优选为16～20h；所述活化温度优选为30～42℃，更优选为35～37℃。在本发明中，所述活化时为厌氧条件。
得到一级种子液后，本发明将一级种子液接种至种子培养基中在厌氧条件下活化16～24h，得到二级种子液。本发明采用的种子培养基与制备一级种子液时的相同。在本发明中，所述一级种子液接种至种子培养基的接种量优选为2～8％(体积百分数)，更优选为3～6％(体积百分数)。在本发明中，获得二级种子液培养温度优选为28～40℃，更优选为32～37℃。
在本发明中，将二级种子液接种至发酵培养基中进行厌氧发酵的培养时间优选为14～18h，更优选为15～16h；发酵温度为30～42℃，接种量为1％～8％。本发明将二级种子液进行厌氧发酵是为了进一步扩大鼠李糖乳杆菌的活菌数。
所述发酵培养基包括以下质量百分比含量的原料：1～3％葡萄糖、1～3％蛋白胨、0.5～2.5％酵母浸膏、0.3～0.8％无水乙酸钠、0.02～0.08％硫酸镁、0.02～0.08％硫酸锰、0.05～0.15％吐温80和余量的水，pH值为6.2～6.8；优选的包括1.5～2.5％葡萄糖、2～2.8％蛋白胨、1～2％酵母浸膏、0.5～0.7％无水乙酸钠、0.04～0.06％硫酸镁、0.03～0.07％硫酸锰、0.08～0.10％吐温80和余量的水。
按质量百分比计，所述冻干保护剂包括5～10％脱脂乳粉、2～8％糊精和余量的水，所述乳化包埋时间为20～50min，所述乳化包埋的温度优选为10～25℃，更优选为15～20℃。
本发明具体实施过程中，所述发酵液中的活菌数≥1×109cfu/mL时，即可停止发酵；所述发酵液中活菌数的测定方法优选的依据GB4789.35-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》绘制生长曲线，根据生长曲线进行判定；所述测定的频率优选为发酵开始后每小时测定一次。
本发明中所述制剂中，将得到的菌体与冻干保护剂混合，进行乳化包埋，得到乳化液；所述菌体与冻干保护剂的质量比优选为1:0.9～1.8，更优选为1:1～1.6；所述乳化包埋的温度优选为10～25℃，更优选为15～20℃。
本发明中，将菌体进行乳化包埋的目的在于保护植物乳杆菌的活性，降低后续的冷冻干燥步骤对鼠李糖乳杆菌活菌数和活性的影响。
本发明在获得乳化液后，对乳化液进行预冷冻、真空冷冻干燥、粉碎，得到鼠李糖乳杆菌nbk-W120菌粉；所述预冷冻的温度优选为-40～-35℃，更优选为-38℃；所述预冷冻的时间优选为1～3h，更优选为2h；所述真空冷冻干燥的温度优选为-40℃～37℃，更优选为-30℃～25℃；所述真空冷冻干燥的时间优选为12～60h，更优选为20～40h，最优选为25～35h；所述真空冷冻干燥的真空度优选为0.1～0.3mbar，更优选为0.2mbar。
本发明还提供了鼠李糖乳杆菌nbk-W120菌粉在制备具有调节肠道菌群功能或抗过敏功效的药品、保健品、食品或饲料中的应用。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1：鼠李糖乳杆菌nbk-W120菌粉的制备方法
本实施例所使用的培养基及冻干保护剂如下：
按质量百分比计，种子培养基组成为：2.2％葡萄糖、2％蛋白胨、1％酵母浸膏、0.8％牛肉膏、0.8％无水乙酸钠、0.06％硫酸镁、0.05％硫酸锰、0.1％吐温80和余量的水，pH值6.6；
按质量百分比计，发酵培养基组成为：1.5％葡萄糖、2％蛋白胨、0.75％酵母浸膏、0.6％无水乙酸钠、0.07％硫酸镁、0.05％硫酸锰、0.1％吐温80和余量的水，pH值为6.4；
按质量百分比计，冻干保护剂组成为：10％脱脂乳，7％糊精和余量的水。
1)将鼠李糖乳杆菌nbk-W120接种到装有种子培养基的试管中活化(37℃，18h)，得到一级种子液；
2)将一级种子液按照质量百分比为3.5％的接种量转接至种子培养基中培养得到二级种子液，培养条件为37℃，厌氧培养16h；
3)将二级种子液接入发酵培养基中进行高密度发酵，二级种子液接至发酵培养基中的接种量为5％(质量百分比)，培养条件为37℃，厌氧培养15h，待发酵液中菌体密度达到1×109cfu/mL，收集发酵液，离心(8000r/min，20min)获得菌体；
4)将菌体加入冻干保护剂(菌体：保护剂质量比为1：1)进行乳化包埋，乳化温度20℃，乳化时间30min；
5)将乳化液在-38℃下预冷冻2h，将预冷冻后的乳化液进行真空冷冻干燥(-40℃到25℃，时间30h)，真空度为0.25mbar；真空冷冻干燥后将其粉碎得到鼠李糖乳杆菌nbk-W120菌粉，所得菌粉的活菌数为3.7×1011cfu/g。
实施例2：鼠李糖乳杆菌nbk-W120菌粉耐酸特性研究
将实施例1得到的鼠李糖乳杆菌nbk-W120菌粉以1％(w/v)的接种量分别接种于pH为6.0和pH为2.0的MRS培养基中培养4h后采用平板计数法进行活菌计数，结果参见下表。
可以看出，在pH 2.0的条件下，鼠李糖乳杆菌nbk-W120在4h后仍有足够数量的活菌可以通过胃部环境。
实施例3：鼠李糖乳杆菌nbk-W120菌粉耐胆盐特性研究
将实施例1得到的nbk-W120菌粉以1％(w/v)的接种量分别接于胆盐浓度为0％(w/v)和胆盐浓度为0.3％的MRS培养基中培养4h后采用平板计数法进行活菌计数，结果参见下表。
可以看出，在0.3％的胆盐浓度下，植物乳杆菌nbk-W120有较好的胆盐耐受性。
实施例4：鼠李糖乳杆菌nbk-W120菌粉在调节小鼠肠道菌群中的应用
菌粉：实施例1所得鼠李糖乳杆菌nbk-W120菌粉；
试验动物：20只SPF级昆明小鼠，雄性，体重18-22g；
小鼠适应一周后，按体重随机分为2组，每组10只，按如下方式进行灌胃：
A空白对照组：自由饮水自由进食，每天灌胃0.2mL生理盐水，连续灌胃14天；
B鼠李糖乳杆菌nbk-W120菌粉组：自由饮水自由进食，将0.1g实施例1所得的nbk-W120菌粉溶于1mL生理盐水中，取0.2mL灌胃小鼠，每天一次，连续灌胃14天；
无菌收集小鼠试验第0天和第14天的新鲜粪便，采用平板计数法计算小鼠粪便中的乳酸杆菌、双歧杆菌和大肠杆菌数，试验前后小鼠粪便乳酸杆菌数如图1，试验前后小鼠粪便双歧杆菌数如图2，试验前后小鼠粪便大肠杆菌数如图3(*表示相比于空白对照组，差异显著(P<0.05),**表示相比于空白对照组，差异极显著(P＜0.01))。
从图1到图3的结果可以看出，鼠李糖乳杆菌nbk-W120菌粉能增加小鼠体内的乳酸杆菌和双歧杆菌的丰度，减少大肠杆菌的丰度，有调节小鼠肠道菌群的功效。
实施例5：鼠李糖乳杆菌nbk-W120菌粉在缓解卵清蛋白小鼠过敏反应中的应用
菌粉：实施例1所得鼠李糖乳杆菌nbk-W120菌粉；
试验动物：SPF级BALB/C小鼠，雄性，体重18-20g。
造模与分组：
致敏溶液：浓度为100μg/mL OVA(卵清蛋白)和10mg/mL Al(OH)3(氢氧化铝)混合溶液；
空白对照组：自由饮食自由进水，分别在试验开始第1天、7天、14天和21天腹腔注射0.2mL生理盐水，在第2天、8天、15天和22天尾部静脉采血，离心取血清，通过ELISA试剂盒测定血清IgE浓度；
过敏模型组：自由饮食自由进水，分别在试验开始第1天、7天、14天和21天腹腔注射0.2mL致敏溶液，在第2天、8天、15天和22天尾部静脉采血，离心取血清，通过ELISA试剂盒测定血清IgE浓度，当过敏模型组血清IgE浓度显著高于空白组血清IgE浓度时则判定为造模成功。
将3组小鼠按照如下方式进行灌胃(每组10只小鼠)：
A空白组：对空白对照组小鼠继续灌胃0.2mL生理盐水，每天一次；
B模型组：对过敏模型组小鼠继续灌胃0.2mL生理盐水，每天一次；
C鼠李糖乳杆菌nbk-W120菌粉组：将0.1g实施例1所得的nbk-W120菌粉溶于1mL生理盐水中，取0.2mL对过敏模型小鼠灌胃，每天一次；
指标测定：共灌胃3周，采用如下过敏反应评分表评判各组小鼠过敏症状，采用ELISA试剂盒测定灌胃前后小鼠血清IgE水平：
| 症状 | 评分 |
| 无症状 | 0 |
| 骚扰头和鼻 | 1 |
| 腹泻，眼周、唇部水肿，毛发直立，活动频率下降 | 2 |
| 口周紫绀，呼吸困难 | 3 |
| 刺激后无反应或仅有轻度反应，震颤及痉挛 | 4 |
| 死亡 | 5 |
试验结果：
试验结束时，各组小鼠过敏反应评分：
| 分组 | 评分 |
| A | O<sup>c</sup> |
| B | 4.17±0.58<sup>a</sup> |
| C | 2.11±0.73<sup>b</sup> |
注：a，b，c表示同列内字母相同者差异不显著(p>0.05)，同列内字母不同者差异显著(p<0.05)。
灌胃前后各组小鼠血清中IgE浓度：
| 组别 | 灌胃前血清中IgE浓度(ng/mL) | 灌胃后血清中IgE浓度(ng/mL) |
| A | 9.87±1.25<sup>b</sup> | 9.34±1.17<sup>c</sup> |
| B | 61.09±2.15<sup>a</sup> | 78.51±3.28<sup>a</sup> |
| C | 62.85±3.49<sup>a</sup> | 40.07±2.41<sup>b</sup> |
注：a，b，c表示同列内字母相同者差异不显著(p>0.05)，同列内字母不同者差异显著(p<0.05)
IgE在食物过敏反应中起重要作用，本次试验通过测定试验小鼠血清IgE含量结合过敏反应评分评估鼠李糖乳杆菌nbk-W120菌粉对过敏模型小鼠过敏症状的缓解，可以看出，鼠李糖乳杆菌nbk-W120菌粉能显著缓解过敏反应症状，降低血清IgE值，有较为显著的抗过敏效果。
实施例6：鼠李糖乳杆菌nbk-W120菌粉在预防卵清蛋白小鼠过敏反应中的应用
菌粉：实施例1所得鼠李糖乳杆菌nbk-W120菌粉；
试验动物：SPF级BALB/C小鼠，雄性，体重18-20g。
造模与分组(每组10只小鼠)：
致敏溶液：浓度为100μg/mL OVA(卵清蛋白)和10mg/mL Al(OH)3(氢氧化铝)混合溶液；
A空白组：适应1周后，每天灌胃0.2mL生理盐水，连续灌胃14天后，每周腹腔注射0.2mL生理盐水一次，连续注射3周；
B模型组：适应1周后，每天灌胃0.2mL生理盐水，连续灌胃14天后，每周腹腔注射0.2mL致敏溶液一次，连续注射3周；
C鼠李糖乳杆菌nbk-W120菌粉组：小鼠适应1周后，将0.1g实施例1所得的nbk-W120菌粉溶于1mL生理盐水中，取0.2mL对小鼠进行灌胃，每天一次，连续灌胃14天后，每周腹腔注射0.2mL致敏溶液一次，连续注射3周；
指标测定：试验结束后，采用如实施例5的评分表评判各组小鼠过敏症状
试验结果：试验结束时，各组小鼠过敏反应评分
| 分组 | 评分 |
| A | O<sup>c</sup> |
| B | 4.22±0.24<sup>a</sup> |
| C | 2.91±0.53<sup>b</sup> |
注：a，b，c表示同列内字母相同者差异不显著(p>0.05)，同列内字母不同者差异显著(p<0.05)。
本次试验根据过敏反应评分表评估鼠李糖乳杆菌nbk-W120菌粉预防由卵清蛋白导致的小鼠过敏反应，结果可以看出，鼠李糖乳杆菌nbk-W120菌粉有较好地预防过敏的效果。
实施例7：鼠李糖乳杆菌nbk-W120菌粉在缓解花生蛋白过敏小鼠反应中的应用
菌粉：实施例1所得鼠李糖乳杆菌nbk-W120菌粉；
试验动物：SPF级BALB/C小鼠，雄性，体重18-20g。
造模与分组：
致敏溶液：浓度为200μg/mL CPE(花生粗蛋白，蛋白含量为65％)和1mg/mL Al(HO)3(氢氧化铝)混合溶液；
激发溶液：浓度为2mg/mL CPE溶液；
空白对照组：适应1周后，每周皮下注射0.2mL生理盐水一次，连续注射3周后，间隔一周后皮下注射0.2mL生理盐水；
过敏模型组：适应1周后，每周皮下注射0.2mL致敏溶液一次，连续注射3周后，间隔一周后皮下注射激发溶液0.2mL；
分别在第一次注射(模型组是注射致敏溶液，空白组是注射生理盐水)和激发第2天尾静脉取血测定小鼠血清中IgE含量，当激发后模型组小鼠血清IgE含量相比于空白组有显著性差异则表明造模成功。
造模成功后将小鼠按如下方式进行分组与灌胃(每组10只小鼠)：
A空白对照组：空白组小鼠每天灌胃0.2mL生理盐水一次，连续灌胃14天；
B模型组：过敏模型组小鼠每天灌胃0.2mL生理盐水一次，连续灌胃14天；
C鼠李糖乳杆菌nbk-W120菌粉组：将0.1g实施例1所得的nbk-W120菌粉溶于1mL生理盐水中，取0.2mL对过敏模型小鼠进行灌胃，每天一次，连续灌胃14天；
在实验过程中，无菌收集小鼠造模前后及灌胃前后的新鲜粪便。
指标测定：试验结束后，采用如实施例5的评分表评判各组小鼠过敏症状，采用ELISA试剂盒测定小鼠血清细胞因子含量，采用平板计数法计算小鼠在造模前后以及灌胃前后粪便内乳酸杆菌、双歧杆菌和大肠杆菌的丰度。
试验结果：试验结束时，各组小鼠过敏反应评分
| 分组 | 评分 |
| A | O<sup>c</sup> |
| B | 3.72±0.35<sup>a</sup> |
| C | 1.94±0.29<sup>b</sup> |
注：a，b，c表示同列内字母相同者差异不显著(p>0.05)，同列内字母不同者差异显著(p<0.05)。
可以看出，鼠李糖乳杆菌nbk-W120菌粉可有效减轻模型小鼠过敏反应症状。
试验结束后，各组小鼠血清抗体浓度如图4所示，血清中IgE抗体是过敏反应发生的关键作用因子，当过敏原刺激机体后会产生IgE，使机体呈致敏状态；IgA能降低验证反应的发生和由IgE介导的过敏性疾病的发生。从图中的结果可以看出，鼠李糖乳杆菌nbk-W120菌粉有降低过敏模型小鼠血清中IgE含量，增加IgA含量的作用。
试验结束后，各组小鼠血清细胞因子含量如下表：
| 分组 | IL-4(pg/mL) | IL-10(pg/mL) | IFN-γ(pg/mL) |
| A | 100.3±23.4<sup>c</sup> | 387.5±20.4<sup>a</sup> | 787.9±54.8<sup>a</sup> |
| B | 297.8±15.2<sup>a</sup> | 244.6±19.6<sup>c</sup> | 364.8±63.2<sup>b</sup> |
| C | 177.1±16.2<sup>b</sup> | 335.7±21.4<sup>b</sup> | 792.6±55.7<sup>a</sup> |
注：a，b，c表示同列内字母相同者差异不显著(p>0.05)，同列内字母不同者差异显著(p<0.05)
当机体发生食物过敏时，Th1/Th2细胞失衡，表现为IL-4水平升高，IFN-γ水平降低，从表中的结果可以看出，鼠李糖乳杆菌nbk-W120菌粉有升高血清IFE-γ含量，降低血清IL-4含量的作用，可通过调节Th1/Th2平衡来缓解机体过敏反应；IL-10是由诱导调节性T细胞分泌而来，对于建立免疫稳态至关重要。可见，鼠李糖乳杆菌nbk-W120菌粉有诱导过敏模型小鼠体内产生调节性T细胞的作用。
试验过程中，各组小鼠粪便内乳酸杆菌含量变化如图5所示，各组小鼠粪便内双歧杆菌含量变化如图6所示，各组小鼠粪便内大肠杆菌含量变化如图7所示(注：a，b，c表示同列内字母相同者差异不显著(p>0.05)，同列内字母不同者差异显著(p<0.05))。
从图5-7的结果可以看出，过敏模型小鼠体内乳酸杆菌和双歧杆菌的丰度显著降低，大肠杆菌的丰度显著增加，肠道菌群严重失衡，表明过敏反应的发生与肠道菌群失调存在密切关系。而经鼠李糖乳杆菌nbk-W120菌粉干预后，可有效刺激模型小鼠体内乳酸杆菌和双歧杆菌增殖，抑制大肠杆菌增长，可通过调节过敏模型小鼠的肠道菌群缓解过敏反应。
综上所述，鼠李糖乳杆菌nbk-W120菌粉可从调节血清IgE含量，调节Th1/Th2细胞失衡，诱导调节性T细胞产生以及调节肠道菌群缓解小鼠过敏反应症状。
实施例8鼠李糖乳杆菌nbk-W120菌粉在制备调节肠道菌群功能性食品中的应用
将麦芽糊精44％，赤藓糖醇30％，低聚果糖10％，低聚木糖10％，豌豆肽5％和实施例1所得的鼠李糖乳杆菌nbk-W120菌粉1％在无菌条件下混匀，可得具有调节肠道菌群功效的益生菌固体饮料。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。
Claims (9)
1.一株鼠李糖乳杆菌，其特征在于，具体为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)nbk-W120，保藏编号为CGMCC No.16873。
2.包含权利要求1所述鼠李糖乳杆菌nbk-W120的菌剂。
3.如权利要求2所述的菌剂，其特征在于，是将鼠李糖乳杆菌nbk-W120菌体与与冻干保护剂混合后进行乳化包埋并冷冻干燥，粉碎获得的。
4.如权利要求3所述的菌剂，其特征在于，制备方法如下：
(1)将鼠李糖乳杆菌nbk-W120进行发酵培养，当发酵液中的活菌数≥1×109cfu/mL时，停止发酵；
(2)从步骤(1)的发酵液中收集菌体，将菌体与冻干保护剂混合后进行乳化包埋，得到乳化液，将乳化液冷冻干燥，粉碎，得到鼠李糖乳杆菌nbk-W120菌粉。
5.如权利要求4所述的菌剂，其特征在于，所述冻干保护剂包括5～10％脱脂乳粉、2～8％糊精和余量的水；所述菌体与冻干保护剂的质量比为1:0.9～1.8；乳化包埋的温度为10～25℃，时间为20～50min。
6.如权利要求3所述的菌剂，其特征在于，是通过发酵培养获得，具体如下：将鼠李糖乳杆菌nbk-W120接种至种子培养基中活化后，得到一级种子液；将一级种子液接种至种子培养基中，厌氧培养，得到二级种子液；将二级种子液接种至发酵培养基中进行发酵，离心发酵液，得到菌体；
所述种子培养基包括以下质量百分比含量的原料：1～3％葡萄糖、1～3％蛋白胨、0.5～3％酵母浸膏、0.5～1.5％牛肉膏、0.2～1％无水乙酸钠、0.02～0.08％硫酸镁、0.02～0.08％硫酸锰、0.08～0.15％吐温80和余量的水，pH值为6.2～6.6；
所述发酵培养基包括以下质量百分比含量的原料：1～3％葡萄糖、1～3％蛋白胨、0.5～2.5％酵母浸膏、0.3～0.8％无水乙酸钠、0.02～0.08％硫酸镁、0.02～0.08％硫酸锰、0.05～0.15％吐温80和余量的水，pH值为6.2～6.8。
7.权利要求1所述鼠李糖乳杆菌的应用。
8.权利要求2所述包含鼠李糖乳杆菌nbk-W120的菌剂的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，具体是在制备具有调节肠道菌群功能或抗过敏功效的药品、保健品、食品或饲料中的应用。
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