CN110591986B - 一株可缓解类风湿性关节炎的干酪乳杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株可缓解类风湿性关节炎的干酪乳杆菌及其应用，属于微生物技术领域。本发明筛选出了一株干酪乳杆菌CCFM1074，此干酪乳杆菌CCFM1074具有缓解类风湿性关节炎的作用，具体体现在：显著缓解类风湿性关节炎大鼠的体重损失；显著降低类风湿性关节炎大鼠血清中促炎性细胞因子TNFα和IL‑1β的含量；显著调节类风湿性关节炎大鼠粪便中短链脂肪酸的含量；显著降低类风湿性关节炎大鼠肠系膜淋巴结中Th17和Treg细胞的比例；在属水平改善类风湿性关节炎大鼠的肠道菌群；在体外可显著抑制类风湿性关节炎致病菌普氏菌的生长。
Description
技术领域
本发明涉及一株可缓解类风湿性关节炎的干酪乳杆菌及其应用，属于微生物技术领域。
背景技术
类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是一种以对称性多关节炎为主要临床表现的自身免疫性疾病。该病以关节滑膜慢性炎症、关节的进行性破坏为特征，临床表现变化多端，预后往往较差，晚期可引起关节强直、畸形和功能严重受损，同时可造成心、肺、肾等多脏器、多系统损害，严重危害患者的健康和生存质量。
类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis，RA)在世界各地均有发病，我国北方地区为本病的高发区。因此，类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis，RA)的预防以及治疗具有重要的理论与社会意义。
目前，在治疗类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis，RA)方面，临床上局限于使用一些以炎性因子IL-6或TNFα等为靶标的生物制剂，这些生物制剂在临床短期应用中效果良好，但其只能暂时缓解和改善病情，很难从根本上控制病情的发展，具有复发性，并且，其造价昂贵，另外，生物制剂属于强行阻止体内免疫炎症的联级反应，长期使用会导致患者的免疫系统被过度抑制，会有诱发其他疾病的风险。
在预防类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis，RA)方面，临床上则尚不存在针对类风湿性关节炎的具有明确预防作用的药物，这主要是因为类风湿性关节炎的发病过程错综复杂，除涉及多种免疫细胞，如淋巴细胞、树突细胞、巨噬细胞等，还涉及到机体共生菌。例如，研究表明，CD4+T细胞及其亚型(Th1、Th2、Th17、Treg等细胞)的发育和分化会参与到类风湿性关节炎的免疫应答中，在类风湿性关节炎患者外周血中能检测到异常高的Th17细胞和减少的Treg细胞，二者细胞的失衡与疾病发生相关(具体可见文献：Komatsu,N.,etal.,Pathogenic conversion of Foxp3+Tcells into TH17 cells in autoimmunearthritis.Nat Med,2014.20(1):p.62-8.)。也有研究发现，类风湿性关节炎病人肠道内Prevotella、Parabacteroides、唾液乳杆菌等的丰度会上升，Prevotella copri具有诱发类风湿性关节炎的作用(具体可见文献：Pianta,A.,et al.,Evidence of the ImmuneRelevance of Prevotella copri,a Gut Microbe,in Patients With RheumatoidArthritis.Arthritis Rheumatol,2017.69(5):p.964-975.)。此外，口腔的牙龈卟啉单胞菌、肠道的分节丝状菌也会影响关节炎病情的发生和发展(具体可见文献：Sato,K.,etal.,Aggravation of collagen-induced arthritis by orally administeredPorphyromonas gingivalis through modulation of the gut microbiota and gutimmune system.Sci Rep,2017.7(1):p.6955.和Wu,H.J.,et al.,Gut-residingsegmented filamentous bacteria drive autoimmune arthritis via T helper17cells.Immunity,2010.32(6):p.815-27.)。
因此，仍需找到一种药物或治疗方式，既能够在预防和/或治疗类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis，RA)的方面发挥根本上的作用，同时，也不会给类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis，RA)患者带来任何潜在的安全隐患，并且，成本低廉。
发明内容
[技术问题]
本发明要解决的技术问题是提供一株可缓解类风湿性关节炎的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)。
[技术方案]
为解决本发明的技术问题，本发明提供了一株干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)CCFM1074，所述干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1074已于2019年09月05日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.60766，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
所述干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1074是从来源于无锡地区的健康人体粪便样本中分离得到的，该菌株经测序分析，其16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示，将测序得到的序列在NCBI中进行核酸序列比对，结果显示菌株为干酪乳杆菌，命名为干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1074。
所述干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1074在MRS培养基上的菌落呈现乳白色、表面光滑、圆形凸起。
本发明还提供了一种制备预防和/或治疗类风湿性关节炎的产品的方法，所述方法为使用上述干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1074。
在本发明的一种实施方式中，所述产品中，上述干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)CCFM1074的活菌数为不低于1×105CFU/mL或1×105CFU/g。
在本发明的一种实施方式中，所述产品包含食品或药品。
在本发明的一种实施方式中，所述药品含有上述干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)CCFM1074、药物载体和/或药用辅料。
本发明的一种实施方式中，所述食品包含含有上述干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)CCFM1074的保健食品；或所述食品包含使用含有上述干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)CCFM1074的发酵剂生产得到的乳制品、豆制品、肉制品或果蔬制品。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵剂的制备方法为将上述干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1074按照占培养基总质量2～4％的接种量接种到培养基中，于37℃下培养18h，得到培养液；将培养液离心，得到菌体；将菌体用生理盐水重悬，得到发酵剂。
在本发明的一种实施方式中，所述培养基为MRS培养基。
本发明还提供了一种用于预防和/或治疗类风湿性关节炎的产品，所述产品含有上述干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1074。
在本发明的一种实施方式中，所述产品中，上述干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)CCFM1074的活菌数为不低于1×105CFU/mL或1×105CFU/g。
在本发明的一种实施方式中，所述产品包含食品或药品。
在本发明的一种实施方式中，所述药品含有上述干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)CCFM1074、药物载体和/或药用辅料。
在本发明的一种实施方式中，所述食品包含含有上述干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)CCFM1074的保健食品；或所述食品包含使用上述干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)CCFM1074的发酵剂生产得到的乳制品、豆制品、肉制品或果蔬制品。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵剂的制备方法为将上述干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1074按照占培养基总质量2～4％的接种量接种到培养基中，于37℃下培养18h，得到培养液；将培养液离心，得到菌体；将菌体用生理盐水重悬，得到发酵剂。
在本发明的一种实施方式中，所述培养基为MRS培养基。
本发明还提供了上述干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)在制备抑制普氏菌(Prevotella copri)的产品中的应用。
[有益效果]
1、本发明筛选出了一株干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1074，此干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1074具有缓解类风湿性关节炎的作用，具体体现在：
(1)显著降低类风湿性关节炎大鼠的关节厚度、临床评分以及发病率；
(2)显著降低类风湿性关节炎大鼠血清中促炎性细胞因子TNFα和IL-1β的含量；
(3)显著调节类风湿性关节炎大鼠粪便中短链脂肪酸的含量；
(4)显著降低类风湿性关节炎大鼠肠系膜淋巴结中Th17和Treg细胞的比例；
(5)在属水平改善类风湿性关节炎大鼠的肠道菌群；
(6)在体外可显著抑制类风湿性关节炎致病菌普氏菌(Prevotella copri)的生长，
因此，干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1074在制备预防和/或治疗特应性皮炎的产品(如食品或药品等)中，具有巨大的应用前景。
2、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)是益生菌的一种，目前已被纳入卫生部下发的《可用于食品的菌种名单》，因此，本发明筛选得到的干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)CCFM1074不会给类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis，RA)患者带来任何潜在的安全隐患。
3、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)的培育过程仅需培养基以及一些培养条件的控制，成本相对低廉，与造价昂贵的生物制剂相比，不会对类风湿性关节炎(RheumatoidArthritis，RA)患者带来太大的经济负担。
生物材料保藏
一株干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1074，分类学命名为Lactobacilluscasei，已于2019年09月05日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNo.60766，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
附图说明
图1：干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1074对类风湿性关节炎大鼠关节厚度的影响。
图2：干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1074对类风湿性关节炎大鼠临床评分的影响。
图3：干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1074对类风湿性关节炎大鼠体重的影响。
图4：干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1074对类风湿性关节炎大鼠发病率的影响。
图5：干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1074对类风湿性关节炎大鼠血清中IL-1β含量的影响。
图6：干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1074对类风湿性关节炎大鼠血清中TNFα含量的影响。
图7：干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1074对类风湿性关节炎大鼠粪便中乙酸含量的影响。
图8：干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1074对类风湿性关节炎大鼠粪便中丙酸含量的影响。
图9：干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1074对类风湿性关节炎大鼠粪便中异丁酸含量的影响。
图10：干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1074对类风湿性关节炎大鼠粪便中丁酸含量的影响。
图11：干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1074对类风湿性关节炎大鼠粪便中戊酸含量的影响。
图12：干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1074对类风湿性关节炎大鼠肠系膜处Treg细胞比例的影响。
图13：干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1074对类风湿性关节炎大鼠肠系膜处Th17细胞比例的影响。
图14：干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1074对类风湿性关节炎大鼠粪便中副拟杆菌属(Parabacteroides)丰度的影响。
图15：干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1074对类风湿性关节炎大鼠粪便中梭菌属(Clostridium)丰度的影响。
图16：干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1074对类风湿性关节炎大鼠粪便中厌氧支原体属(Anaeroplasma)丰度的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明进行进一步的阐述。
下述实施例中涉及的胃蛋白酶(产品编号：A610411)、胰蛋白酶(产品编号：A610629)、胆盐(产品编号：A600225)购自生工生物工程(上海)股份有限公司；下述实施例中涉及的鼠李糖乳杆菌LGG(Lactobacillus rhamnosus GG)购自美国典型培养物菌种保藏中心(ATCC)；下述实施例中涉及的普氏菌(Prevotella copri)(产品编号：BNCC337399)购自北纳生物；下述实施例中涉及的牛II型胶原蛋白溶液以及氟氏不完全佐剂购自Chondrex公司；下述实施例中涉及的检测IL-1β(货号：DY501)和TNFα(货号：DY501)的ELISA试剂盒购自R&D公司。
MRS固体培养基(g/L)：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠2g/L、酵母粉5g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K2PO4·3H2O 2.6g/L、MgSO4·7H2O 0.1g/L、MnSO40.05 g/L、吐温801mL/L、琼脂20g/L、半胱氨酸氨酸盐0.5g/L。
MRS液体培养基(g/L)：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠2g/L、酵母粉5g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K2PO4·3H2O 2.6g/L、MgSO4·7H2O 0.1g/L、MnSO40.05 g/L、吐温801mL/L、半胱氨酸氨酸盐0.5g/L。
BHI培养基(g/L)：胰蛋白胨10g/L、牛心浸粉17.5g/L、氯化钠5g/L、葡萄糖2.0g/L、Na2HPO4·12H2O 2.5g/L。
BHI琼脂板(g/L)：胰蛋白胨10g/L、牛心浸粉17.5g/L、氯化钠5g/L、葡萄糖2.0g/L、Na2HPO4·12H2O 2.5g/L、琼脂20g/L。
实施例1：干酪乳杆菌的筛选及菌种鉴定
1、筛选
来源于无锡地区的健康人体粪便样本于30％的甘油中保存于-80℃冰箱。将样本取出低温解冻后，混匀样本吸取0.5mL样本加到4.5mL，以含有0.05％半胱氨酸的0.9％生理盐水进行梯度稀释，选择合适的梯度稀释液涂布在加了0.05％半胱氨酸的MRS固体培养基上，于37℃培养48h，挑取典型菌落至MRS固体培养基上划线纯化，挑取单菌落转接至MRS液体培养基(含0.05％半胱氨酸)中进行培养，将培养得到的菌体于30％的甘油中保存，得到菌株CCFM1074、L1和L2。
2、鉴定
提取CCFM1074、L1、L2的基因组，将CCFM1074、L1、L2的16S rDNA进行扩增和测序(由华大基因科技有限公司进行，其中，CCFM1074的16S rDNA扩增的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示)，将该序列在NCBI中进行核酸序列比对，结果显示菌株为干酪乳杆菌，命名为干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1074、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)L1和干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)L2。
实施例2：干酪乳杆菌的培养
将干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1074接入MRS固体培养基(含0.05％半胱氨酸)中于37℃培养48h后，观察其菌落，发现其菌落呈现乳白色、表面光滑、圆形凸起。
将干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1074接入MRS液体培养基(含0.05％半胱氨酸)中于37℃厌氧培养24h后，转入新鲜的MRS液体培养基(含0.05％半胱氨酸)中，同样条件培养24h，6000g离心菌体15min，0.9％生理盐水洗涤菌体后6000g再次离心10min，得到菌体，用30％蔗糖溶液重悬，冻存在-80℃待用。
实施例3：不同干酪乳杆菌对模拟胃肠液的耐受性
1、不同干酪乳杆菌对模拟胃液的耐受性
将实施例1获得的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1074、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)L1、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)L2分别接入MRS液体培养基中于37℃培养18h后，离心收集细胞，将收集到细胞经生理盐水洗涤，洗涤结束后，再次离心收集细胞，将收集到的细胞分别重悬于pH为3(pH由HCl调节)的含有3g/L胃蛋白酶的生理盐水中，保持干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1074、干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)L1、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)L2在生理盐水中的初始浓度一致，取0.1mL菌液通过倾注法进行平板活菌计数作为菌液中干酪乳杆菌的原始活菌数，将剩余菌液置于37℃培养3h后，取0.1mL菌液通过倾注法进行平板活菌计数作为耐受模拟胃液后菌液中干酪乳杆菌的活菌数，检测结果见表1。
其中，耐受胃液后的存活率(％)＝(耐受模拟胃液后菌液中干酪乳杆菌的活菌数/菌液中干酪乳杆菌的原始活菌数)×100％。
2、不同干酪乳杆菌对模拟肠液的耐受性
将实施例1获得的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1074、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)L1、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)L2分别接入MRS液体培养基中于37℃培养18h后，离心收集细胞，将收集到细胞经生理盐水洗涤，洗涤结束后，再次离心收集细胞，将收集到细胞分别重悬于pH为8(pH由NaOH调节)的含有1g/L胰蛋白酶和0.3g/L胆盐的生理盐水中，保持干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1074、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)L1、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)L2在生理盐水中的初始浓度一致，取0.1mL菌液进行平板活菌计数作为菌液中干酪乳杆菌的原始活菌数，将剩余菌液置于37℃培养4h后，取0.1mL菌液通过倾注法进行平板活菌计数作为耐受模拟肠液后菌液中干酪乳杆菌的活菌数，检测结果见表1。
其中，耐受肠液后的存活率(％)＝(耐受模拟肠液后菌液中干酪乳杆菌的活菌数/菌液中干酪乳杆菌的原始活菌数)×100％。
由表1可知，干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1074对人工模拟胃液、人工模拟肠液的耐受能力均较强，而干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)L1、L2对人工模拟胃液、人工模拟肠液的耐受能力均远低于干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1074。
表1不同干酪乳杆菌对人工模拟胃液、人工模拟肠液的耐受性
| 组别 | 模拟胃液存活率(％) | 模拟肠液存活率(％) |
| CCFM1074 | 80.3±8.6 | 41.9±5.5 |
| L1 | 50.3±5.6 | 13.6±6.2 |
| L2 | 37.5±7.3 | 21.5±6.7 |
II胶原诱导的关节炎模型(Collagen-induced arthritis，CIA)是一类经典的RA动物模型，CIA的发作与类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis，RA)有许多相似之处，如滑膜增生、血管翳形成以及软骨破坏等。目前，在RA临床上主要使用鼠李糖乳杆菌LGG(Lactobacillus rhamnosus GG)治疗类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis，RA)。因此，实施例3～8中，以II胶原诱导的关节炎模型(Collagen-induced arthritis，CIA)作为RA动物模型，以鼠李糖乳杆菌LGG(Lactobacillus rhamnosus GG)为阳性对照组。
实施例3：干酪乳杆菌CCFM1074对类风湿性关节炎大鼠体重、关节厚度、临床评分以及发病率的影响
取7周龄的SPF(Specific Pathogen Free)级雌性Wistar大鼠60只，于饲养室温为22～24℃，湿度为40～60％，12h/12h昼夜交替，自由进食及饮水的条件下饲养1周后，随机分为4组，每组15只，4组分别为：正常组、模型组、灌胃鼠李糖乳杆菌LGG(Lactobacillusrhamnosus GG)的阳性对照组、灌胃干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1074的CCFM1074组。
实验共四周：从造模前两周开始，一直持续到实验结束，正常组和模型组每只每天灌胃1.5mL浓度为3％(w/w)的无菌蔗糖溶液，阳性对照组每只每天灌胃1.5mL浓度为5×109CFU/mL的鼠李糖乳杆菌LGG(Lactobacillus rhamnosus GG)菌液，CCFM1074组每只每天灌胃1.5mL浓度为5×109CFU/mL的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1074菌液；第三周到第四周为造模期，造模第一天时，将牛II型胶原蛋白溶液(Chondrex，20022)与氟氏不完全佐剂(Chondrex，7002)等体积混合、乳化，形成完全乳化液，使用异氟烷麻醉大鼠，固定大鼠并用75％酒精对大鼠尾根部整体进行消毒后，对大鼠进行初次免疫，初次免疫精确吸取0.15mL完全乳化液在距离大鼠尾根部1.5cm处进行皮下注射，一周后采用相同的处理方法进行加强免疫，即准确吸取0.15mL完全乳化液在距离大鼠尾根部2.0cm处进行皮下注射，正常组大鼠仅采用同样的方法注射相同体积的无菌生理盐水。
造模结束后，通过体重计测定每组大鼠体重，通过螺旋测微器测定每组大鼠关节厚度，通过观察踝和指关节的肿胀、红肿程度测定每组大鼠临床评分(具体可见参考文献：Shan,J.,et al.,Integrated Serum and Fecal Metabolomics Study of Collagen-Induced Arthritis Rats and the Therapeutic Effects of the ZushimaTablet.Front Pharmacol,2018.9:p.891.)，并且，通过观察发病动物只数测定每组大鼠风湿性关节炎的发病率，测定结果分别见图1-4。
由图1可知，在首次免疫后2周开始关节发生肿胀，第3周时模型组大鼠的关节厚度显著高于正常组大鼠，CCFM1074组大鼠和阳性对照组大鼠的关节厚度均低于模型组大鼠，其中，CCFM1074组、LGG组和模型组大鼠的关节厚度分别为3.6、4.3和5.1mm。
由图2可知，每组大鼠临床评分的变化与关节厚度的变化曲线相似，第2周时临床评分开始增加，模型组的最高，CCFM1074组大鼠和LGG组相接近，而在第5周时，LGG组的临床评分与模型组接近，高于CCFM1074组。
由图3可知，模型组大鼠的体重从第3周开始显著低于正常组，CCFM1074组大鼠体重与模型组相似，疾病发生后体重不再明显增加。
由图4可知，模型组大鼠的风湿性关节炎的发病率高达92％，而CCFM1074组大鼠和LGG组大鼠的分别为65％和79％。
可见，干酪乳杆菌CCFM1074可治疗以及预防风湿性关节炎，其中，干酪乳杆菌CCFM1074在治疗方面的效果与鼠李糖乳杆菌LGG相近，但预防疾病发生的效果强于鼠李糖乳杆菌LGG。
实施例4：干酪乳杆菌CCFM1074对类风湿性关节炎大鼠血清中IL-1β和TNFα含量的影响
取7周龄的SPF(Specific Pathogen Free)级雌性Wistar大鼠60只，于饲养室温为22～24℃，湿度为40～60％，12h/12h昼夜交替，自由进食及饮水的条件下饲养1周后，随机分为4组，每组15只，4组分别为：正常组、模型组、灌胃鼠李糖乳杆菌LGG(Lactobacillusrhamnosus GG)的阳性对照组、灌胃干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1074的CCFM1074组。
实验共四周：从造模前两周开始，一直持续到实验结束，正常组和模型组每只每天灌胃1.5mL浓度为3％(w/w)的无菌蔗糖溶液，阳性对照组每只每天灌胃1.5mL浓度为5×109CFU/mL的鼠李糖乳杆菌LGG(Lactobacillus rhamnosus GG)菌液，CCFM1074组每只每天灌胃1.5mL浓度为5×109CFU/mL的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1074菌液；第三周到第四周为造模期，造模第一天时，将牛II型胶原蛋白溶液(Chondrex，20022)与氟氏不完全佐剂(Chondrex，7002)等体积混合、乳化，形成完全乳化液，使用异氟烷麻醉大鼠，固定大鼠并用75％酒精对大鼠尾根部整体进行消毒后，对大鼠进行初次免疫，初次免疫精确吸取0.15mL完全乳化液在距离大鼠尾根部1.5cm处进行皮下注射，一周后采用相同的处理方法进行加强免疫，即准确吸取0.15mL完全乳化液在距离大鼠尾根部2.0cm处进行皮下注射，正常组大鼠仅采用同样的方法注射相同体积的无菌生理盐水。
造模结束后，取血并处死大鼠，取大鼠血清，通过ELISA试剂盒测定每组大鼠血清中IL-1β和TNFα的含量，检测结果见图5-6。
如图5所示，模型组大鼠血清中IL-1β的浓度为835ng/L，比正常组(143ng/L)显著升高；相比于模型组大鼠，阳性对照组大鼠和CCFM1074组大鼠血清中IL-1β水平显著降低，分别为145ng/L、73ng/L。
如图6所示，阳性对照组大鼠和CCFM1074组大鼠血清中TNFα的含量分别为12ng/L和11ng/L，均较模型组大鼠阳性对照组大鼠(14ng/L)有所降低，其中，CCFM1074组大鼠血清中TNFα的含量降低更为明显。
可见，干酪乳杆菌CCFM1074和鼠李糖乳杆菌LGG均可降低类风湿性关节炎大鼠血清中促炎因子IL-1β和TNFα的水平，但干酪乳杆菌CCFM1074抑制促炎性细胞因子的作用是强于鼠李糖乳杆菌LGG的。
实施例5：干酪乳杆菌CCFM1074对类风湿性关节炎大鼠粪便中短链脂肪酸含量的影响
取7周龄的SPF(Specific Pathogen Free)级雌性Wistar大鼠60只，于饲养室温为22～24℃，湿度为40～60％，12h/12h昼夜交替，自由进食及饮水的条件下饲养1周后，随机分为4组，每组15只，4组分别为：正常组、模型组、灌胃鼠李糖乳杆菌LGG(Lactobacillusrhamnosus GG)的阳性对照组、灌胃干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1074的CCFM1074组。
实验共四周：从造模前两周开始，一直持续到实验结束，正常组和模型组每只每天灌胃1.5mL浓度为3％(w/w)的无菌蔗糖溶液，阳性对照组每只每天灌胃1.5mL浓度为5×109CFU/mL的鼠李糖乳杆菌LGG(Lactobacillus rhamnosus GG)菌液，CCFM1074组每只每天灌胃1.5mL浓度为5×109CFU/mL的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1074菌液；第三周到第四周为造模期，造模第一天时，将牛II型胶原蛋白溶液(Chondrex，20022)与氟氏不完全佐剂(Chondrex，7002)等体积混合、乳化，形成完全乳化液，使用异氟烷麻醉大鼠，固定大鼠并用75％酒精对大鼠尾根部整体进行消毒后，对大鼠进行初次免疫，初次免疫精确吸取0.15mL完全乳化液在距离大鼠尾根部1.5cm处进行皮下注射，一周后采用相同的处理方法进行加强免疫，即准确吸取0.15mL完全乳化液在距离大鼠尾根部2.0cm处进行皮下注射，正常组大鼠仅采用同样的方法注射相同体积的无菌生理盐水。
造模结束后，大鼠禁食不禁水12h，收集粪便置于液氮中，后转移至-80℃冰箱，在进行短链脂肪酸含量的检测前取出，进行真空冷冻干燥，准确称取0.05g冻干后的粪便样品溶解于0.5mL饱和氯化钠溶液中，浸泡30min，组织匀浆机匀浆，加入0.02mL浓度为10％的硫酸，震荡30s，在通风橱内向粪便溶液中准确加入0.8mL乙醚溶液，震荡30s后离心15min(8000g、4℃)，移取上清液至含有0.3g无水硫酸钠的离心管中，震荡均匀，离心15min(8000g、4℃)，取上清至气质容量瓶中，通过GCMS检测短链脂肪酸含量，检测结果见图7-11。
如图7-11所示，模型组大鼠粪便中乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸和戊酸的含量较正常组大鼠分别下降到76％，87％，52％，64％和84％，其中，异丁酸含量下降最为显著；CCFM1074组大鼠粪便中乙酸、丙酸和丁酸的含量与模型组相比显著上调，分别是13、6.4、16μmol/g，分别为模型组的1.78、1.88、2.88倍；阳性对照组大鼠粪便中乙酸、丙酸和丁酸的含量则分别是模型组的1.12，1.20，1.92倍。可见，干酪乳杆菌CCFM1074和鼠李糖乳杆菌LGG均可提高类风湿性关节炎大鼠粪便中短链脂肪酸的含量，但干酪乳杆菌CCFM1074提高短链脂肪酸含量的作用是强于鼠李糖乳杆菌LGG的。
实施例6：干酪乳杆菌CCFM1074对类风湿性关节炎大鼠肠系膜淋巴结中Treg和Th17细胞比例的影响
取7周龄的SPF(Specific Pathogen Free)级雌性Wistar大鼠60只，于饲养室温为22～24℃，湿度为40～60％，12h/12h昼夜交替，自由进食及饮水的条件下饲养1周后，随机分为4组，每组15只，4组分别为：正常组、模型组、灌胃鼠李糖乳杆菌LGG(Lactobacillusrhamnosus GG)的阳性对照组、灌胃干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1074的CCFM1074组。
实验共四周：从造模前两周开始，一直持续到实验结束，正常组和模型组每只每天灌胃1.5mL浓度为3％(w/w)的无菌蔗糖溶液，阳性对照组每只每天灌胃1.5mL浓度为5×109CFU/mL的鼠李糖乳杆菌LGG(Lactobacillus rhamnosus GG)菌液，CCFM1074组每只每天灌胃1.5mL浓度为5×109CFU/mL的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1074菌液；第三周到第四周为造模期，造模第一天时，将牛II型胶原蛋白溶液(Chondrex，20022)与氟氏不完全佐剂(Chondrex，7002)等体积混合、乳化，形成完全乳化液，使用异氟烷麻醉大鼠，固定大鼠并用75％酒精对大鼠尾根部整体进行消毒后，对大鼠进行初次免疫，初次免疫精确吸取0.15mL完全乳化液在距离大鼠尾根部1.5cm处进行皮下注射，一周后采用相同的处理方法进行加强免疫，即准确吸取0.15mL完全乳化液在距离大鼠尾根部2.0cm处进行皮下注射，正常组大鼠仅采用同样的方法注射相同体积的无菌生理盐水。
造模结束后，异氟烷麻醉大鼠并对大鼠进行心脏采血，将采集的血液浸泡在75％的酒精中15min，无菌取肠系膜淋巴结，将肠系膜淋巴结制备成细胞浓度为2×106CFU/mL的单细胞悬浮液，将单细胞悬浮液经CD4-FITC和CD25-APC表面染色和Foxp3-PE核染色后，通过流式细胞仪检测Treg细胞比例，将单细胞悬浮液加入刺激剂在37℃细胞培养箱中培养刺激6h，将刺激后的细胞经CD4-FITC抗体表面染色和IL-17A-PE胞内染色，通过流式细胞仪检测Th17细胞比例，检测结果见图12-13。
如图12所示，Treg细胞在正常组大鼠肠系膜淋巴结中的比例约为6.8％，在模型组大鼠肠系膜淋巴结中的比例降低至5.6％；鼠李糖乳杆菌LGG会将大鼠肠系膜淋巴结中Treg的比例上调至6.3％；而CCFM1074组大鼠肠系膜淋巴结中Treg的比例恢复至正常组水平，达到6.7％。
如图13所示，与正常组大鼠相比，模型组大鼠肠系膜淋巴结中Th17细胞的比例显著升高，是正常组的11.67倍，CCFM107组和阳性对照组大鼠肠系膜淋巴结中Th17细胞比例显著下降，分别低至正常组的2.16和1.44倍。
可见，类风湿性关节炎会导致大鼠肠系膜处Treg和Th17细胞的比例失衡，干酪乳杆菌CCFM1074和鼠李糖乳杆菌LGG则可提高类风湿性关节炎大鼠肠系膜处Treg细胞的比例，降低风湿性关节炎大鼠肠系膜处Th17细胞的比例，使之恢复平衡，但干酪乳杆菌CCFM1074对此的调节作用是强于鼠李糖乳杆菌LGG的。
实施例7：干酪乳杆菌CCFM1074对类风湿性关节炎大鼠粪便中菌群丰度的影响
取7周龄的SPF(Specific Pathogen Free)级雌性Wistar大鼠60只，于饲养室温为22～24℃，湿度为40～60％，12h/12h昼夜交替，自由进食及饮水的条件下饲养1周后，随机分为4组，每组15只，4组分别为：正常组、模型组、灌胃鼠李糖乳杆菌LGG(Lactobacillusrhamnosus GG)的阳性对照组、灌胃干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1074的CCFM1074组。
实验共四周：从造模前两周开始，一直持续到实验结束，正常组和模型组每只每天灌胃1.5mL浓度为3％(w/w)的无菌蔗糖溶液，阳性对照组每只每天灌胃1.5mL浓度为5×109CFU/mL的鼠李糖乳杆菌LGG(Lactobacillus rhamnosus GG)菌液，CCFM1074组每只每天灌胃1.5mL浓度为5×109CFU/mL的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1074菌液；第三周到第四周为造模期，造模第一天时，将牛II型胶原蛋白溶液(Chondrex，20022)与氟氏不完全佐剂(Chondrex，7002)等体积混合、乳化，形成完全乳化液，使用异氟烷麻醉大鼠，固定大鼠并用75％酒精对大鼠尾根部整体进行消毒后，对大鼠进行初次免疫，初次免疫精确吸取0.15mL完全乳化液在距离大鼠尾根部1.5cm处进行皮下注射，一周后采用相同的处理方法进行加强免疫，即准确吸取0.15mL完全乳化液在距离大鼠尾根部2.0cm处进行皮下注射，正常组大鼠仅采用同样的方法注射相同体积的无菌生理盐水。
造模结束后，收集大鼠的粪便，提取粪便中基因组DNA，对V3-V4区进行特异性PCR扩增，16S rDNA测序，分析粪便菌群变化，分析结果如图14-16所示。
如图14-16所示，与正常组大鼠相比，模型组大鼠粪便中微生物菌群发生了显著的变化，其中，模型组大鼠粪便中副拟杆菌属(Parabacteroides)和梭菌属(Clostridium)的相对丰度较正常组大鼠显著升高，厌氧支原体属(Anaeroplasma)的相对丰度较正常组大鼠显著降低；干酪乳杆菌CCFM1074可将大鼠粪便中副拟杆菌属(Parabacteroides)和梭菌属(Clostridium)的相对丰度下调至正常组水平，并且，将大鼠粪便中厌氧支原体属(Anaeroplasma)的相对丰度由0.0006％上调至0.02％，略低于正常组的0.03％；鼠李糖乳杆菌LGG则可将大鼠粪便中副拟杆菌属(Parabacteroides)和梭菌属(Clostridium)的相对丰度分别调至0.13％和0.75％，并且，使得大鼠粪便中厌氧支原体属(Anaeroplasma)的相对丰度恢复至0.065％。可见，类风湿性关节炎会导致大鼠粪便中副拟杆菌属(Parabacteroides)、梭菌属(Clostridium)以及厌氧支原体属(Anaeroplasma)丰度失衡，干酪乳杆菌CCFM1074和鼠李糖乳杆菌LGG则可降低类风湿性关节炎大鼠粪便中副拟杆菌属(Parabacteroides)和梭菌属(Clostridium)的相对丰度，提高风湿性关节炎大鼠粪便中厌氧支原体属(Anaeroplasma)的相对丰度，使之恢复平衡，但干酪乳杆菌CCFM1074对此的调节作用是强于鼠李糖乳杆菌LGG的。
实施例8：干酪乳杆菌CCFM1074对类风湿性关节炎致病菌普氏菌(Prevotellacopri)的影响
将25支装有4.8mL的BHI培养基的试管分为5组，分别为干酪乳杆菌CCFM1074对照组、鼠李糖乳杆菌LGG对照组、普氏菌(Prevotella copri)对照组、实验组1：CCFM1074+Prevotella copri以及实验组2：LGG+Prevotella copri，实验组每组5只试管。
在干酪乳杆菌CCFM1074对照组中分别加入100μL浓度为1×106CFU/mL的干酪乳杆菌CCFM1074菌液和100μL的无菌生理盐水，在鼠李糖乳杆菌LGG对照组中分别加入100μL浓度为1×106CFU/mL的鼠李糖乳杆菌LGG菌液和100μL的无菌生理盐水，在普氏菌(Prevotella copri)对照组中分别加入100μL浓度为1×106CFU/mL的普氏菌菌液和100μL的无菌生理盐水，在实验组1中分别加入100μL浓度为1×106CFU/mL的干酪乳杆菌CCFM1074菌液和100μL浓度为1×106CFU/mL的普氏菌菌液，在实验组2中分别加入100μL浓度为1×106CFU/mL的鼠李糖乳杆菌LGG菌液和100μL浓度为1×106CFU/mL的普氏菌菌液，混匀之后，置于厌氧工作站于37℃培养18h，得到培养液。
将培养液梯度稀释，分别吸取100μL稀释至合适的浓度梯度的培养液，将对照组在BHI琼脂板中浇注，将实验组在添加和不添加10％胆盐的BHI琼脂板浇注，分别计算干酪乳杆菌CCFM1074、鼠李糖乳杆菌LGG以及普氏菌的活菌数，计数结果见表2。
由表2可知，干酪乳杆菌CCFM1074和鼠李糖乳杆菌LGG与普氏菌共培养时对普氏菌的抑制率分别为80.9％和54.7％。可见，干酪乳杆菌CCFM1074和鼠李糖乳杆菌LGG与普氏菌共培养时，均可抑制普氏菌的生长，但干酪乳杆菌CCFM1074对普氏菌的抑制作用明显强于鼠李糖乳杆菌LGG。
表2不同组别中干酪乳杆菌CCFM1074、鼠李糖乳杆菌LGG以及普氏菌的活菌数(单位：108CFU/mL)
注：“——”表示未测定。
实施例9：干酪乳杆菌CCFM1074的应用
将干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1074接入MRS液体培养基(含0.05％半胱氨酸)中于37℃厌氧培养24h后，转入新鲜的MRS液体培养基(含0.05％半胱氨酸)中，同样条件培养24h，6000g离心菌体15min，0.9％生理盐水洗涤菌体后6000g再次离心10min，得到菌体；将菌体用pH为7.2～7.4的磷酸盐缓冲液清洗3次后用海藻糖浓度为100g/L的海藻糖冻干保护剂(冻干保护剂和菌体的质量比为2:1)重悬至浓度为5×1010CFU/mL，得到重悬液；将重悬液采用真空冷冻法进行冻干，得到干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1074的冻干粉。
取1g上述冻干粉每天灌胃类风湿性关节炎大鼠，连续三周，可有效缓解大鼠类风湿性关节炎的症状，在预防和/或治疗类风湿性关节炎上有极好的效果。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 江南大学
<120> 一株可缓解类风湿性关节炎的干酪乳杆菌及其应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 971
<212> DNA
<213> 干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）
<400> 1
gctataatgc agtcgacgag ttctcgttga tgatcggtgc ttgcaccgag attcaacatg 60
gaacgagtgg cggacgggtg agtaacacgt gggtaacctg cccttaagtg ggggataaca 120
tttggaaaca gatgctaata ccgcatagat ccaagaaccg catggttctt ggctgaaaga 180
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agaagaatgg tcggcagagt aactgttgtc ggcgtgacgg tatccaacca gaaagccacg 480
gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtaggtggc aagcgttatc cggatttatt 540
gggcgtaaag cgagcgcagg cggtttttta agtctgatgt gaaagccctc ggcttaaccg 600
aggaagcgca tcggaaactg ggaaacttga gtgcagaaga ggacagtgga actccatgtg 660
tagcggtgaa atgcgtagat atatggaaga acaccagtgg cgaaggcggc tgtctggtct 720
gtaactgacg ctgaggctcg aaagcatggg tagcgaacag gattagatac cctggtagtc 780
catgccgtaa acgatgaatg ctacgtgttg gagggtttcc gcccttcagt gacgcagcta 840
acgcattaag tattccgcct ggggagtacg accgccaggt tgaaactcac aggaattgac 900
gggtgcccgc acaaacgggg gagcatgtgg tgtaattcaa agtaacgcga agaaccttac 960
cagggtcttg g 971
Claims (8)
1.一株干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)，其特征在于，所述干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)已于2019年09月05日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.60766，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
2.一种制备预防和/或辅助治疗类风湿性关节炎的食品或药品的方法，其特征在于，使用权利要求1所述干酪乳杆菌。
3.如权利要求2所述的一种制备预防和/或辅助治疗类风湿性关节炎的食品或药品的方法，其特征在于，所述食品或药品中，权利要求1所述干酪乳杆菌的活菌数为不低于1×105CFU/mL或1×105CFU/g。
4.如权利要求3所述的一种制备预防和/或辅助治疗类风湿性关节炎的食品或药品的方法，其特征在于，所述药品含有权利要求1所述干酪乳杆菌、药物载体和/或药用辅料。
5.一种用于预防和/或辅助治疗类风湿性关节炎的食品或药品，其特征在于，所述食品或药品含有如权利要求1所述的干酪乳杆菌。
6.如权利要求5所述的一种用于预防和/或辅助治疗类风湿性关节炎的食品或药品，其特征在于，所述食品或药品中，权利要求1所述干酪乳杆菌的活菌数为不低于1×105CFU/mL或1×105CFU/g。
7.如权利要求5或6所述的一种用于预防和/或辅助治疗类风湿性关节炎的食品或药品，其特征在于，所述药品含有权利要求1所述干酪乳杆菌、药物载体和/或药用辅料。
8.权利要求1所述干酪乳杆菌在制备抑制普氏菌(Prevotella copri)的食品或药品中的应用。
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