BR112019019734A2 - cepa probiótica de lactobacillus casei e usos da mesma - Google Patents
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Abstract
a presente invenção refere-se a uma cepa bacteriana isolada da espécie lactobacillus casei (l. casei). mais especificamente, a cepa da espécie lactobacillus casei depositada sob o número de acesso lmg p-30039. a presente invenção refere-se ainda à cepa de l. casei para uso no tratamento e/ou prevenção de infecções e/ou doenças imunorrelacionadas. também é descrito o uso da cepa isolada de l. casei ou de uma composição compreendendo a dita cepa como um adjuvante para promover uma resposta imune durante a vacinação. além disso, é descrito o uso da dita nova cepa de l. casei ou uma composição compreendendo a dita cepa na indústria de higiene pessoal, indústria de limpeza, produção de biomassa, purificação de ar e indústria de alimentos. em outro aspecto da presente invenção, é descrito o uso de uma espécie de l. casei que tem um teor de g / c do genoma completo de pelo menos 47,5% e expressa um ou mais genes de catalase ou uma composição compreendendo uma ou mais das ditas espécies de l. casei na indústria de higiene pessoal, indústria de limpeza, produção de biomassa, purificação de ar e indústria de alimentos.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “CEPA PROBIÓTICA DE LACTOBACILLUS CASEI E USOS DA MESMA”. CAMPO DA INVENÇÃO [0001] A presente invenção refere-se a uma nova cepa bacteriana isolada da espécie Lactobacillus casei (L. casei). A dita cepa da espécie Lactobacillus casei é depositada com o número de acesso LMG P30039. A nova cepa é caracterizada por um teor de G / C do genoma completo de 48,02%, e abriga um ou mais genes de catalase. A nova cepa é ainda caracterizada por uma identidade nucleotídica média do seu genoma com a sequência genômica da cepa conhecida L. casei ATOO 393 de 94%.
[0002] A presente invenção refere-se ainda à nova cepa de L. casei para uso no tratamento e/ou prevenção de infecções e/ou doenças imunorrelacionadas. Também é descrito a uso da nova cepa isolada de L. casei ou de uma composição compreendendo a dita cepa como um adjuvante para promover uma resposta imune durante a vacinação. Além disso, é descrito a uso da dita nova cepa de L. casei ou uma composição compreendendo a dita cepa na indústria de higiene pessoal, indústria de limpeza, produção de biomassa e purificação de ar.
[0003] Em outro aspecto da presente invenção, é descrito o uso de uma espécie de L. case/que tem um teor de G / C de genoma completo de pelo menos 47,5% e abriga um ou mais genes de catalase na indústria de higiene pessoal, indústria de limpeza, produção de biomassa e purificação de ar. Além disso, é descrito o uso de uma espécie de L. casei com um teor de G / C do genoma completo de pelo menos 47,5%, que abriga um ou mais genes de catalase e tem proteína de repetição robusta, rica em serina, glicosilada, fimbria de subunidade única com um comprimento médio de pelo menos 0,4 pm, para uso na indústria de higiene pessoal, indústria de limpeza, produção de
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2/52 biomassa, purificação de ar e indústria de alimentos. Além disso, é descrito o uso de uma composição compreendendo uma ou mais espécies de L. casei na indústria de higiene pessoal, indústria de limpeza, produção de biomassa, purificação de ar e indústria de alimentos.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO [0004] O gênero Lactobacillus é o maior gênero dentro das bactérias do ácido lático, compreendendo mais de 200 espécies. Os lactobacilos estão naturalmente presentes nas superfícies das mucosas humanas e animais (por exemplo, trato gastrointestinal e vaginal), e em muitos ambientes relacionados a alimentos, incluindo plantas (frutas, legumes, grãos de cereais), vinho, leite e carne, onde podem se tornar dominantes se forem capazes de fermentar altas doses de açúcar com produção concomitante de ácido lático e metabolites relacionados. Nos livros de microbiologia, eles são chamados de bactérias Gram-positivas em forma de bastonete, não esporulantes, não móveis, não patogênicas, citocromo-negativas e catalase-negativas. Com seu alto número de espécies GRAS (geralmente reconhecidas como seguras) pelo FDA nos EUA, ou QPS (presunção de segurança qualificada) pelo EFSA na Europa, elas atualmente são exploradas em muitas aplicações, desde o uso como culturas de partida, probióticos, produção de bioplásticos a carreadores de vacina, mostrando que elas também têm um alto valor comercial.
[0005] O grupo Lactobacillus casei, compreendendo as espécies Lactobacillus casei, L. paracasei e L. rhamnosus, está entre os grupos economicamente mais interessantes de espécies de Lactobacillus relacionadas filogeneticamente e fenotipicamente. No entanto, tanto a nomenclatura quanto a classificação desse grupo são objetos de discussão. Isso se reflete, por exemplo, na introdução das espécies relacionadas L. zeae em 1996 e subsequentemente rejeição das
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3/52 mesmas em 2008. Além disso, a genômica comparativa recente mostra que muitas cepas atualmente rotuladas como cepas de L. casei e L. paracaseisão, de fato, membros da mesma espécie. Além disso, muitos novos isolados são rotulados como L. casei, enquanto estão mais intimamente relacionados à cepa ATCC 334 do tipo L. paracaseido que à cepa ATCC 393 do tipo L. casei devido à alta heterogeneidade nos genes de rRNA 16S. Assim, muitas novas identificações não estão alinhadas com a atual classificação taxonômica. Diferentes esforços foram feitos de modo a facilitar a diferenciação entre os membros do grupo L. casei com base no uso de técnicas de PCR e/ou de impressão digital genética. Entretanto, com a redução de preço do sequenciamento de genoma completo, a crescente disponibilidade de genomas públicos (210 membros do grupo L. casei em 19/02/2017 no NCBI), bem como novos métodos de classificação taxonômica baseados em genômica, como ANI e TETRA, um uma visão mais aprofundada das diferenças genéticas e, portanto, da taxonomia dos membros do grupo L. casei pode ser obtida usando a genômica comparativa.
[0006] O grupo contém a bem estudada bactéria probiótica L. rhamnosus GG, bem como muitas cepas usadas para fermentações alimentares, tal como a cepa L. paracasei ATCC 334, um isolado de queijo Emmental. Comercialmente, os micróbios desse grupo são aplicados em produtos lácteos fermentados ou suplementos alimentares direcionados ao trato gastrointestinal e vaginal, mas há um interesse crescente em aplicá-los em outras formulações de produtos direcionadas a outros nichos corporais (humanos e animais).
[0007] Na presente invenção, uma nova cepa da espécie de Lactobacillus casei (L. casei) foi identificada (depositada sob o número de acesso LMG P-30039, aqui também indicado como AMBR2). Esta cepa é caracterizada por um alto teor de G / C no genoma completo superior a 47,5%, em particular um teor de G / C no genoma completo
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4/52 de 48,02% e abriga pelo menos dois genes de catalase. Além disso, a dita cepa tem uma identidade nucleotídica média do seu genoma em relação à sequência genômica da cepa conhecida de L. casei ATCC 393 de 94%. A cepa LMG P-30039 também é caracterizada pelo fato de que compreende fímbrias especiais com um comprimento médio de pelo menos 0,4 pm; em particular, fímbrias especiais, subunidades proteicas ricas em serina, glicosiladas, com um comprimento médio de pelo menos 0,4 pm. Também é fornecido o uso da dita nova cepa em aplicações médicas, bem como na indústria de higiene pessoal, indústria de limpeza, produção de biomassa, purificação de ar ou indústria de alimentos.
[0008] Outro aspecto da presente invenção é fornecer mais informações sobre a relação genética de cepas pertencentes ao grupo L. casei. Em particular, usando abordagens genômicas comparativas, foi identificada uma nova classificação para várias cepas de L. casei, incluindo as espécies de L. case/depositadas sob o número de acesso LMG P-30039. A presente invenção fornece, portanto, o uso de uma espécie Lactobacillus casei que tem um teor de G / C do genoma completo de 48,02% e abriga um ou mais genes de catalase na indústria de higiene pessoal, indústria de limpeza, produção de biomassa e purificação de ar. Além disso, é descrito a uso de uma composição compreendendo as ditas espécies de L. casei na indústria de higiene pessoal, indústria de limpeza, produção de biomassa e purificação do ar.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO [0009] A presente invenção é baseada na identificação de uma nova cepa isolada da espécie Lactobacillus casei (L. casei). A dita cepa foi depositada na Coleção Coordenada Belga de Microrganismos (BCCM), Universiteit Gent, K.L. Ledeganckstraat 35, 9000 Gent, Bélgica) em 21 de fevereiro de 2017 com o número de acesso LMG P
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30039 e aqui também indicada como cepa AMBR2. Típico para esta nova cepa isolada da espécie L. casei é que ela tem um alto teor de G / C no genoma completo de 48,02%. Além disso, a dita cepa isolada da espécie L. casei abriga um ou mais genes de catalase. Em particular, os ditos genes de catalase são selecionados a partir do grupo que consiste em heme-catalase e catalase de manganês. A nova cepa isolada é ainda caracterizada por uma identidade nucleotídica média com a sequência genômica da cepa ATCC 393 L. casei de 94%. Além disso, a nova cepa isolada também é caracterizada pelo fato de que compreende fímbrias especiais com um comprimento médio de pelo menos 0,4 μιτι; em particular, fímbrias especiais e robustas, de subunidade única, ricas em serina, glicosiladas com um comprimento médio de pelo menos 0,4 μιτι, aumentando assim a adesão nas células epiteliais.
[0010] Em outra modalidade, também é descrita uma composição compreendendo uma cepa bacteriana isolada da espécie L. casei depositada sob o número de acesso LMG P-30039. Em uma modalidade ainda mais adicional, a dita composição pode opcionalmente compreender outras bactérias probióticas.
[0011] A presente invenção é baseada ainda na constatação de que a cepa isolada da espécie L. case/depositada sob o número de acesso LMG P-30039 mostra forte capacidade de adesão em células epiteliais, em particular células epiteliais respiratórias (nicho de isolamento), como também outras células epiteliais humanas (cólon e vaginal). Portanto, em um aspecto adicional, a presente invenção fornece a dita cepa isolada de espécies de L. casei ou uma composição compreendendo a dita cepa para uso no tratamento e/ou prevenção de infecções e/ou doenças imunorrelacionadas. Ainda mais, a dita cepa isolada de espécies de L. casei ou uma composição compreendendo a dita cepa é descrita para uso no tratamento e prevenção de infecções
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6/52 oronasofaríngeas, em particular infecções da cavidade oronasofaríngea ou infecções orais, mais em particular infecções do trato respiratório superior selecionadas a partir do grupo que consiste em otite média, faringite, sinusite crônica, sinusite aguda, rinite, gripe, mucosite, cárie, gengivite ou halitose e similares.
[0012] Em outra modalidade, a nova cepa isolada de L. casei ou composição de acordo com a presente invenção é descrita para uso no tratamento e/ou prevenção de infecções de pele, em particular, acne vulgar, psoríase, queimaduras, celulite, impetigo, pés de atleta (tinea pedis), infecções por fungos nas unhas, ou verrugas, e similares.
[0013] Em uma outra modalidade, a nova cepa isolada de L. casei ou uma composição de acordo com a presente invenção é descrita para uso no tratamento e/ou prevenção de mastite.
[0014] Em ainda outra modalidade, a presente invenção descreve uma cepa isolada da espécie L. casei ou uma composição compreendendo a cepa para uso no tratamento e/ou prevenção de infecções urogenitais, em particular infecções vaginais e infecções na bexiga.
[0015] Em ainda outra modalidade, a presente invenção descreve uma cepa isolada da espécie L. casei depositada sob o número de acesso LMG P-30039, ou uma composição compreendendo a cepa para uso no tratamento e/ou prevenção de infecções gastrointestinais, em particular colite, infecções estomacais, doença inflamatória intestinal, síndrome do intestino irritável, e similares.
[0016] A presente invenção também fornece a cepa isolada da espécie L. case/depositada sob o número de acesso LMG P-30039 ou uma composição compreendendo a dita cepa para uso no tratamento e/ou prevenção de doenças alérgicas. As ditas doenças alérgicas são selecionadas a partir do grupo que consiste em febre do feno, rinite alérgica, sinusite alérgica, asma e similares.
[0017] Além disso, também é descrito a uso da cepa isolada da
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7/52 espécie L. case/depositada sob o número de acesso LMG P-30039, ou uma composição compreendendo a cepa como um adjuvante para promover uma resposta imune durante a vacinação.
[0018] Com base na constatação de que a cepa isolada da espécie L. casei com número de acesso LMG P-30039 mostra capacidade de adesão aprimorada às células epiteliais respiratórias, a presente invenção também fornece o uso da dita cepa isolada ou uma composição compreendendo a cepa isolada na indústria de higiene pessoal. Em particular, a indústria de higiene pessoal compreende a produção de tecidos, máscaras de proteção ou aspersões. Ainda mais em particular, os ditos tecidos, máscaras de proteção ou aspersões são direcionados para o tratamento e/ou prevenção de infecções respiratórias.
[0019] Em outra modalidade, o uso da dita nova cepa isolada com número de acesso LMG P-30039 ou uma composição compreendendo a dita cepa é descrito na indústria de limpeza, em particular na produção de um produto de limpeza.
[0020] Em ainda outra modalidade, a presente invenção fornece o uso da cepa bacteriana isolada com número de acesso LMG P-30039 ou o uso de uma composição compreendendo a dita cepa na purificação de ar, em particular, em filtros de purificação de ar.
[0021] Em outra modalidade, a presente invenção fornece o uso da cepa bacteriana isolada com número de acesso LMG P-30039 ou o uso de uma composição compreendendo a dita cepa na produção de biomassa.
[0022] Em outra modalidade, a presente invenção fornece o uso da cepa bacteriana isolada com número de acesso LMG P-30039 ou o uso de uma composição compreendendo a dita cepa na indústria de alimentos.
[0023] Opcionalmente, a dita cepa isolada da espécie L. casei com
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8/52 número de acesso LMG P-30039 ou a composição compreendendo a dita nova cepa bacteriana isolada pode ser combinada com outras bactérias probióticas.
[0024] A presente invenção é baseada ainda na constatação de que várias cepas do grupo L. casei podem ser categorizadas em um grupo separado usando análises genômicas comparativas. Em particular, os membros do dito grupo têm um teor de G / C no genoma completo de pelo menos 47,5% e abrigam um ou mais, em particular, dois genes de catalase, ainda mais em particular, membros do dito grupo abrigam um ou mais, em particular, dois genes de catalase selecionados a partir de heme-catalase e catalase de manganês. Além disso, os membros do dito grupo têm um genoma com uma identidade nucleotídica média de pelo menos 93% com a sequência genômica da cepa de L. case/ATOO 393. Finalmente, os membros do dito grupo também são caracterizados por compreenderem fímbrias de subunidade única especiais e robustas, ricas em serina, glicosiladas, com um comprimento médio de pelo menos 0,4 pm. As ditas fímbrias estão envolvidas na adesão tecidoespecífica da espécie às células epiteliais, por exemplo, células epiteliais respiratórias.
[0025] A presente invenção fornece, portanto, uma espécie de L. case/para uso no tratamento e/ou prevenção de infecções e/ou doenças imunorrelacionadas, em que as ditas espécies de L. casei têm um teor de G / C do genoma completo de pelo menos 47,5%, e abriga um ou mais genes de catalase. Em uma modalidade adicional, as ditas espécies de L. case/podem compreender fímbrias de subunidade única robustas, ricas em serina, glicosiladas, com um comprimento médio de pelo menos 0,4 pm. Em ainda uma outra modalidade, a presente invenção fornece as ditas espécies de L. casei com um teor de G / C no genoma completo de pelo menos 47,5% e abrigando um ou mais genes de catalase para uso no tratamento e/ou prevenção de infecções
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9/52 oronasofaríngeas, em particular infecções da cavidade oronasofaríngea e infecções orais, mais particularmente infecções do trato respiratório superior selecionadas a partir do grupo que consiste em otite média aguda, faringite, sinusite crônica, sinusite aguda, rinite, gripe, mucosite, cárie, gengivite ou halitose e similares. Em uma outra modalidade, as ditas espécies de L. case/podem compreender fímbrias especiais com um comprimento médio de pelo menos 0,4 pm; em particular, fimbria especiais de subunidade única, robustas, ricas em serina, glicosiladas, e com um comprimento médio de pelo menos 0,4 pm.
[0026] Em outra modalidade, a presente invenção fornece uma espécie de L. casei com um teor de G / C do genoma completo de pelo menos 47,5% e abriga um ou mais, em particular, dois genes de catalase para uso no tratamento e/ou prevenção de infecções de pele, em particular acne vulgar, psoríase, queimaduras, celulite, impetigo, pés de atleta (tinea pedis), infecções por fungos nas unhas, ou verrugas, e similares. Em uma outra modalidade, as ditas espécies de L. casei podem compreender fimbria especiais com um comprimento médio de pelo menos 0,4 pm; em particular, fimbria especiais de subunidade única, robustas, ricas em serina, glicosiladas, e com um comprimento médio de pelo menos 0,4 pm.
[0027] Ainda em outra modalidade, a presente invenção fornece uma espécie de L. casei com um teor de G / C no genoma completo de pelo menos 47,5% e abrigando um ou mais, em particular, dois genes de catalase para uso no tratamento e/ou prevenção de mastite. As ditas espécies de L. case/podem ainda compreender fímbrias especiais com um comprimento médio de pelo menos 0,4 pm; em particular, fímbrias especiais de subunidade única, robustas, ricas em serina, glicosiladas, e com um comprimento médio de pelo menos 0,4 pm.
[0028] Em ainda outra modalidade, a presente invenção fornece uma espécie de L. casei com um teor de G / C no genoma completo de
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10/52 pelo menos 47,5% e abrigando um ou mais, em particular, dois genes de catalase para uso no tratamento e/ou prevenção de infecções urogenitais, em particular, infecções vaginais e infecções da bexiga. As ditas espécies de L. case/podem ainda compreender fímbrias especiais com um comprimento médio de pelo menos 0,4 μιτι; em particular, fímbrias especiais de subunidade única, robustas, ricas em serina, glicosiladas, e com um comprimento médio de pelo menos 0,4 μιτι.
[0029] Em ainda uma outra modalidade, a presente invenção fornece uma espécie de L. casei com um teor de G / C do genoma completo de pelo menos 47,5% e abrigando um ou mais, em particular, dois genes de catalase para uso no tratamento e/ou prevenção de doenças gastrointestinais, em particular colite, infecção estomacal, doença inflamatória intestinal, síndrome do intestino irritável e similares. As ditas espécies de L. casei podem ainda compreender fímbrias especiais com um comprimento médio de pelo menos 0,4 μιτι; em particular, fímbrias especiais de subunidade única, robustas, ricas em serina, glicosiladas, e com um comprimento médio de pelo menos 0,4 μιτι.
[0030] Em outra modalidade, a presente invenção fornece uma espécie de L. casei com um teor de G / C do genoma completo de pelo menos 47,5% e abrigando um ou mais, em particular, dois genes de catalase para uso no tratamento e/ou prevenção de doenças imunorrelacionadas, em particular doenças imunorrelacionadas selecionadas a partir do grupo que consiste em febre do feno, rinite alérgica, sinusite alérgica, asma e similares. As ditas espécies de L. case/podem ainda compreender fímbrias especiais com um comprimento médio de pelo menos 0,4 μιτι; em particular, fimbria especiais de subunidade única, robustas, ricas em serina, glicosiladas, e com um comprimento médio de pelo menos 0,4 μιτι.
[0031] A presente invenção descreve ainda o uso de uma espécie
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11/52 de L. casei com um teor de G / C no genoma completo de pelo menos 47,5% e abrigando um ou mais, em particular, dois genes de catalase na indústria de higiene pessoal. As ditas espécies de L. casei podem ainda compreender fímbrias especiais com um comprimento médio de pelo menos 0,4 pm; em particular, fimbria especiais de subunidade única, robustas, ricas em serina, glicosiladas, e com um comprimento médio de pelo menos 0,4 pm.
[0032] Também é descrito a uso de uma composição compreendendo as ditas espécies de L. casei na indústria de higiene pessoal. Em particular, é descrito o uso de espécies de L. casei com um teor de G / C no genoma completo de pelo menos 47,5% e abrigando um ou mais, em particular, dois genes de catalase ou uma composição compreendendo as ditas espécies de L. casei na produção de tecidos, máscaras de proteção ou aspersões. As ditas espécies de L. casei podem ainda compreender fímbrias especiais robustas de subunidade única, ricas em serina, glicosiladas, com um comprimento médio de pelo menos 0,4 pm. Ainda mais em particular, os ditos tecidos, máscaras de proteção ou aspersões são direcionados para o tratamento e/ou prevenção de infecções respiratórias.
[0033] Em outro aspecto, a presente invenção descreve o uso de uma espécie de L. casei ou uma composição compreendendo uma ou mais das ditas espécies de L. casei na purificação de ar, em particular em filtros de purificação de ar, em que as ditas espécies de L. casei têm todo u teor de G / C do genoma completo de pelo menos 47,5% e abrigam um ou mais, em particular, dois genes de catalase. As ditas espécies de L. case/podem ainda compreender fímbrias especiais com um comprimento médio de pelo menos 0,4 pm; em particular, fimbria especiais e robustas de subunidade única, ricas em serina, glicosiladas, e com um comprimento médio de pelo menos 0,4 pm.
[0034] Em um aspecto adicional, a presente invenção descreve o
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12/52 uso de uma espécie de L. casei ou uma composição compreendendo uma ou mais das ditas espécies de L. casei na produção de biomassa, em que as ditas espécies de L. casei têm um teor de G / C do genoma completo de pelo menos 47,5% e abrigam um ou mais, em particular, dois genes de catalase. A dita espécie de L. caseié ainda caracterizada pelo fato de que compreende fímbrias especiais com um comprimento médio de pelo menos 0,4 pm; em particular, fímbrias especiais, robustas, de subunidade única, ricas em serina, glicosiladas, e com um comprimento médio de pelo menos 0,4 pm.
[0035] Referindo-se ainda aos diferentes usos das espécies de L. casei de acordo com a presente invenção ou a composição compreendendo as espécies de L. casei de acordo com a presente invenção, as ditas espécies de L. casei abrigam um ou mais, em particular, dois genes de catalase, em que os um ou mais genes de catalase são selecionados a partir do grupo que consiste em heme-catalase e catálase de manganês. As ditas espécies de L. casei podem ainda compreender fímbrias especiais com um comprimento médio de pelo menos 0,4 pm; em particular, fimbria especiais, robustas, de subunidade única, ricas em serina, glicosiladas, e com um comprimento médio de pelo menos 0,4 pm.
[0036] Em ainda outra modalidade da presente invenção, e também com relação aos diferentes usos da espécie ou composição de L. casei compreendendo as ditas espécies de L. casei de acordo com a presente invenção, a dita espécie tem um genoma com uma identidade nucleotídica média com a sequência genômica da cepa ATOO 393 L. casei de pelo menos 93%. As ditas espécies de L. casei podem ainda compreender fímbrias especiais com um comprimento médio de pelo menos 0,4 pm; em particular, fímbrias especiais de subunidade única, robustas, ricas em serina, glicosiladas, e com um comprimento médio de pelo menos 0,4 pm.
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13/52 [0037] Em ainda outra modalidade da presente invenção, e ainda com relação aos diferentes usos das espécies L. casei ou da composição compreendendo as espécies L. casei, as ditas espécies mostram uma adesão aprimorada às células epiteliais, em particular células epiteliais respiratórias, devido à expressão de fímbrias especiais. Em particular, as ditas fímbrias especiais da espécie L. casei são tipicamente caracterizadas pelo fato de que o comprimento médio das fímbrias em uma cepa específica da dita espécie é de pelo menos 0,4 pm, sendo robustas (resistentes a forças de cisalhamento durante a centrifugação e secagem por aspersão). Em uma outra modalidade, as ditas fímbrias são de subunidade única, ricas em serina, glicosiladas.
[0038] No contexto da presente invenção, o termo “comprimento médio das fímbrias” entende-se baseado na análise por microscopia eletrônica de varredura (SEM) após a lavagem das bactérias com um tampão adequado (por exemplo, solução salina tamponada com fosfato), com centrifugação das células em min. 2000 g. O comprimento de pelo menos 10 fímbrias em uma ou duas células bacterianas é cuidadosamente determinado (expresso em pm) e a média é determinada.
[0039] Alguns dos aspectos da presente invenção podem ser resumidos nas seguintes modalidades enumeradas:
[0040] 1. Uma cepa bacteriana isolada da espécie de Lactobacillus casei (L. casei), dita cepa depositada sob o número de acesso LMG P30039.
[0041] 2. A cepa bacteriana isolada, de acordo com a modalidade
1, em que a dita cepa bacteriana isolada tem um teor de G / C do genoma completo de 48,02%.
[0042] 3. A cepa bacteriana isolada, de acordo com a modalidade 1 ou 2, em que a dita cepa bacteriana isolada abriga um ou mais genes de catalase.
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14/52 [0043] 4. A cepa bacteriana isolada, de acordo com a modalidade
3, em que os um ou mais genes de catalase são selecionados a partir do grupo que consiste em heme-catalase e catalase de manganês.
[0044] 5. A cepa bacteriana isolada, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 4, em que a dita cepa bacteriana isolada tem um genoma com uma identidade nucleotídica média com a sequência genômica da cepa ATCC393 L. casei de 94%.
[0045] 6. Composição, que compreende uma cepa bacteriana isolada da espécie L. casei, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 5.
[0046] 7. A cepa bacteriana, isolada de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 5, ou a composição de acordo com a modalidade 6, para uso no tratamento e/ou prevenção de infecções ou doenças imunorrelacionadas.
[0047] 8. A cepa ou composição bacteriana isolada para uso, de acordo com a modalidade 7, em que as ditas infecções são infecções oronasofaríngeas, em particular, infecções do trato respiratório superior selecionadas a partir do grupo que consiste em otite média, faringite, sinusite crônica, sinusite aguda, rinite, gripe, mucosite, cárie, gengivite ou halitose e similares.
[0048] 9. A cepa ou composição bacteriana isolada para uso, de acordo com a modalidade 7, em que as ditas infecções são infecções de pele, em particular, acne vulgar, psoríase, queimaduras, celulite, impetigo, pés de atleta (tinea pedis), infecções por fungos nas unhas ou verrugas, e similares.
[0049] 10. A cepa ou composição bacteriana isolada para uso, de acordo com a modalidade 7, em que as ditas infecções são mastite.
[0050] 11. A cepa ou composição bacteriana isolada para uso, de acordo com a modalidade 7, em que as infecções são infecções urogenitais, em particular, infecções vaginais e infecções da bexiga.
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15/52 [0051] 12. A cepa ou composição bacteriana isolada, de acordo com a modalidade 7, em que as infecções são infecções gastrointestinais, em particular, colite, infecção estomacal, doença inflamatória intestinal, síndrome do intestino irritável, e similares.
[0052] 13. A cepa ou composição bacteriana isolada, de acordo com a modalidade 7, em que as doenças imunorrelacionadas são selecionadas a partir do grupo que consiste em febre do feno, rinite alérgica, sinusite alérgica, asma e similares.
[0053] 14. Uso da cepa bacteriana isolada, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 5, ou da composição de acordo com a modalidade 6, como um adjuvante para promover uma resposta imune durante a vacinação.
[0054] 15. Uso da cepa bacteriana isolada, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 5, ou uso da composição de acordo com a modalidade 6, na indústria de higiene pessoal, em particular, na produção de tecidos, máscaras de proteção ou aspersões.
[0055] 16. Uso da cepa bacteriana isolada, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 5, ou uso da composição de acordo com a modalidade 6, na indústria de limpeza, em particular, na produção de um produto de limpeza.
[0056] 17. Uso da cepa bacteriana isolada, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 5, ou uso da composição de acordo com a modalidade 6, na purificação de ar, em particular, em filtros de purificação de ar.
[0057] 18. Uso da cepa bacteriana isolada de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 5, ou uso da composição de acordo com a modalidade 6, na produção de biomassa.
[0058] 19. Uma espécie de L. casei com um teor de G / C no genoma completo de pelo menos 47,5% e abrigando um ou mais genes de catalase para uso no tratamento e/ou prevenção de infecções ou
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16/52 doenças imunorrelacionadas.
[0059] 20. Uma espécie de L. casei com um teor de G / C no genoma completo de pelo menos 47,5%, abrigando um ou mais genes de catalase e tendo fímbrias com um comprimento médio de pelo menos 0,4 pm para uso no tratamento e/ou prevenção de infecções ou doenças imunorrelacionadas.
[0060] 21. Uma composição compreendendo uma ou mais espécies de L. casei com um teor de G / C no genoma completo de pelo menos 47,5% e abrigando um ou mais genes de catalase para uso no tratamento e/ou prevenção de infecções ou doenças imunorrelacionadas.
[0061] 22. Composição que compreende uma ou mais espécies de
L. casei com um teor de G / C no genoma completo de pelo menos 47,5%, abrigando um ou mais genes de catalase e tendo fímbrias com um comprimento médio de pelo menos 0,4 pm para uso no tratamento e/ou prevenção de infecções ou doenças imunorrelacionadas.
[0062] 23. A espécie ou composição de L. casei para uso, de acordo com qualquer uma das modalidades 19 a 22, em que as ditas infecções são infecções oronasofaríngeas, em particular, infecções do trato respiratório superior selecionadas a partir do grupo que consiste em otite média, faringite, sinusite crônica, sinusite aguda, rinite, gripe, mucosite, cárie, gengivite ou halitose, e similares.
[0063] 24. A espécie ou composição de L. casei para uso, de acordo com qualquer uma das modalidades 19 a 22, em que as ditas infecções são infecções de pele, em particular, acne vulgar, psoríase, queimaduras, celulite, impetigo, pés de atleta (tinea pedis), infecções por fungos nas unhas, ou verrugas, e similares.
[0064] 25. A espécie ou composição de L. casei para uso, de acordo com qualquer uma das modalidades 19 a 22, em que as ditas infecções são mastite.
[0065] 26. A espécie ou composição de L. casei para uso, de acordo
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17/52 com qualquer uma das modalidades 19 a 22, em que as infecções são infecções urogenitais, em particular, infecções vaginais e infecções da bexiga.
[0066] 27. A espécie ou composição de L. casei para uso, de acordo com qualquer uma das modalidades 19 a 22, em que as infecções são infecções gastrointestinais, em particular, colite, infecção estomacal, doença inflamatória intestinal, síndrome do intestino irritável, e similares.
[0067] 28. A espécie ou composição de L. casei para uso, de acordo com qualquer uma das modalidades 19 a 22, em que as doenças imunorrelacionadas são selecionadas a partir do grupo que consiste em febre do feno, rinite alérgica, sinusite alérgica, asma, e similares.
[0068] 29. Uso de uma espécie de L. casei com um teor de G / C no genoma completo de pelo menos 47,5% e abrigando um ou mais genes de catalase como um adjuvante para promover uma resposta imune durante a vacinação.
[0069] 30. Uso de uma espécie de L. casei com um teor de G / C no genoma completo de pelo menos 47,5%, abrigando um ou mais genes de catalase e tendo fímbrias com um comprimento médio de pelo menos 0,4 pm como um adjuvante para promover uma resposta imune durante a vacinação.
[0070] 31. Uso de uma composição compreendendo uma ou mais espécies de L. casei com um teor de G / C no genoma completo de pelo menos 47,5% e abrigando um ou mais genes de catalase como um adjuvante para promover uma resposta imune durante a vacinação.
[0071] 32. Uso de uma composição compreendendo uma ou mais espécies de L. casei com um teor de G / C no genoma completo de pelo menos 47,5%, abrigando um ou mais genes de catalase como um djuvante para promover uma resposta imune durante a vacinação e com fímbrias com um comprimento médio de pelo menos 0,4 pm como um
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18/52 adjuvante para promover uma resposta imune durante a vacinação.
[0072] 33. Uso de uma espécie de L. casei com um teor de G / C no genoma completo de pelo menos 47,5% e abrigando um ou mais genes de catalase na indústria de higiene pessoal, em particular, na produção de tecidos, máscaras de proteção ou aspersões.
[0073] 34. Uso de uma espécie de L. casei com um teor de G / C do genoma completo de pelo menos 47,5%, abrigando um ou mais genes de catalase e tendo fímbrias com um comprimento médio de pelo menos 0,4 pm na indústria de higiene pessoal, em particular, na produção de tecidos, máscaras de proteção ou aspersões.
[0074] 35. Uso de uma composição compreendendo uma ou mais espécies de L. casei com um teor de G / C no genoma completo de pelo menos 47,5% e abrigando um ou mais genes de catalase; na indústria de higiene pessoal, em particular, na produção de tecidos, máscaras de proteção ou aspersões.
[0075] 36. Uso de uma composição compreendendo uma ou mais espécies de L. casei com um teor de G / C no genoma completo de pelo menos 47,5%, abrigando um ou mais genes de catalase e tendo fímbrias com um comprimento médio de pelo menos 0,4 pm; na indústria de higiene pessoal, em particular, na produção de tecidos, máscaras de proteção ou aspersões.
[0076] 37. Uso de uma espécie de L. casei com um teor de G / C no genoma completo de pelo menos 47,5% e abrigando um ou mais genes de catalase na indústria de limpeza, em particular, na produção de um produto de limpeza.
[0077] 38. Uso de uma espécie de L. casei com um teor de G / C no genoma completo de pelo menos 47,5%, abrigando um ou mais genes de catalase e com fímbrias com um comprimento médio de pelo menos 0,4 pm na indústria de limpeza, em particular, na produção de um produto de limpeza.
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19/52 [0078] 39. Uso de uma composição compreendendo uma ou mais espécies de L. casei com um teor de G / C no genoma completo de pelo menos 47,5% e abrigando um ou mais genes de catalase na indústria de limpeza, em particular na produção de um produto de limpeza.
[0079] 40. Uso de uma composição compreendendo uma ou mais espécies de L. casei com um teor de G / C do genoma completo de pelo menos 47,5%, abrigando um ou mais genes de catalase e tendo fímbrias com comprimento médio de pelo menos 0,4 pm n limpeza indústria, em particular, na produção de um produto de limpeza.
[0080] 41. Uso de uma espécie de L. casei com um teor de G / C no genoma completo de pelo menos 47,5% e abrigando um ou mais genes de catalase na purificação do ar, em especial, nos filtros de purificação de ar.
[0081 ] 42. Uso de uma espécie de L. casei com um teor de G / C no genoma completo de pelo menos 47,5%, abrigando um ou mais genes de catalase e tendo fímbrias com um comprimento médio de pelo menos 0,4 pm na purificação de ar, em particular, em filtros de purificação de ar.
[0082] 43. Uso de uma composição compreendendo uma ou mais espécies de L. casei com um teor de G / C no genoma completo de pelo menos 47,5% e abrigando um ou mais genes de catalase na purificação de ar, em particular, em filtros de purificação de ar.
[0083] 44. Uso de uma composição compreendendo uma ou mais espécies de L. casei com um teor de G / C no genoma completo de pelo menos 47,5%, abrigando um ou mais genes de catalase e tendo fímbrias com um comprimento médio de pelo menos 0,4 pm na purificação de ar, em particular, em filtros de purificação de ar.
[0084] 45. Uso de uma espécie de L. casei com um teor de G / C do genoma completo de pelo menos 47,5% e abrigando um ou mais genes de catalase na produção de biomassa.
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20/52 [0085] 46. Uso de uma espécie de L. casei com um teor de G / C no genoma completo de pelo menos 47,5%, abrigando um ou mais genes de catalase e tendo fímbrias com um comprimento médio de pelo menos 0,4 pm na produção de biomassa.
[0086] 47. Uso de uma composição compreendendo uma ou mais espécies de L. casei com um teor de G / C no genoma completo de pelo menos 47,5% e abrigando um ou mais genes de catalase na produção de biomassa.
[0087] 48. Uso de uma composição compreendendo uma ou mais espécies de L. casei com um teor de G / C no genoma completo de pelo menos 47,5%, abrigando um ou mais genes de catalase e tendo fímbrias com um comprimento médio de pelo menos 0,4 pm na produção de biomassa.
[0088] 49. Uso de uma espécie de L. casei de acordo com qualquer uma das modalidades 29, 30, 33, 34, 37, 38, 41, 42, 45 ou 46, ou uso de uma composição de acordo com qualquer uma das modalidades 31, 32, 35, 36, 39, 40, 43, 44, 47 ou 48, em que os um ou mais genes de catalase são selecionados a partir do grupo que consiste em hemecatalase e catalase de manganês.
[0089] 50. Uso de uma espécie de L. casei de acordo com as modalidades 29, 30, 33, 34, 37, 38, 41, 42, 45 ou 46, ou uso de uma composição de acordo com qualquer uma das modalidades 31,32, 35, 36, 39, 40, 43, 44, 47 ou 48, em que a dita espécie tem um genoma com uma identidade nucleotídica média com a sequência genômica da cepa de L. casei ATOO 393 de pelo menos 93%.
[0090] 51. Uso da cepa bacteriana isolada, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 5, ou uso da composição de acordo com a modalidade 6, na indústria de alimentos.
[0091 ] 52. Uso de uma espécie de L. casei com um teor de G / C no genoma completo de pelo menos 47,5% e abrigando um ou mais genes
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21/52 de catalase na indústria de alimentos.
[0092] 53. Uso de uma espécie de L. casei com um teor de G / C no genoma completo de pelo menos 47,5%, abrigando um ou mais genes de catalase e tendo fímbrias com um comprimento médio de pelo menos 0,4 pm na indústria de alimentos.
[0093] 54. Uso de uma composição compreendendo uma ou mais espécies de L. casei com um teor de G / C no genoma completo de pelo menos 47,5% e abrigando um ou mais genes de catalase na indústria de alimentos.
[0094] 55. Uso de uma composição compreendendo uma ou mais espécies de L. casei com um teor de G / C no genoma completo de pelo menos 47,5%, abrigando um ou mais genes de catalase e tendo fímbrias com comprimento médio de pelo menos 0,4 pm na indústria de alimentos.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [0095] Com referência específica agora às figuras, é enfatizado que os dados mostrados são a título de exemplo e para fins de discussão ilustrativa apenas das diferentes modalidades da presente invenção. Eles são apresentados com o fim de fornecer o que se acredita ser a descrição mais útil e prontamente dos princípios e aspectos conceituais da invenção. Nesse aspecto, não é feita nenhuma tentativa de mostrar detalhes estruturais da invenção em mais detalhes do que o necessário para uma compreensão fundamental da invenção. A descrição feita com os desenhos evidencia aos versados na técnica como as várias formas da invenção podem ser incorporadas na prática.
[0096] A Figura 1 é uma comparação de microbiomas entre o nariz (N) e a nasofaringe (NF) de indivíduos saudáveis (CON) e pacientes com rinossinusite crônica (CRS) quanto à presença (VERDADEIRA) ou ausência (FALSA) de lactobacilos em seu perfil microbiano.
[0097] A Figura 2 é uma comparação da abundância relativa de
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22/52 lactobacilos no nariz (N) e nasofaringe (NF) de indivíduos saudáveis (CON) e pacientes com rinossinusite crônica (CRS) no caso de lactobacilos estarem presentes no perfil.
[0098] A Figura 3 mostra as características de crescimento de diferentes espécies de Lactobacillus em meios MRS.
[0099] A Figura 4 mostra a atividade antipatogênica de diferentes cepas de Lactobacillus casei contra o crescimento de Staphylococcus aureus.
[0100] A Figura 5 mostra a capacidade de adesão de C. albicans em células epiteliais vaginais na presença ou ausência da cepa L. casei com número de acesso LMG P-30039.
[0101] A Figura 6 mostra a atividade anti-hifas de L. casei LMG P30039 (AMBR2).
[0102] A Figura 7 mostra a atividade antimicrobiana e antibiofilme da cepa de L. casei com número de acesso LMG P-30039 (AMBR2).
[0103] A Figura 8 mostra a capacidade de adesão de diferentes cepas de Lactobacillus e L. rhamnosus GG a células epiteliais das vias aéreas Calu-3.
[0104] A Figura 9 mostra a capacidade de adesão de diferentes cepas de Lactobacillus a células epiteliais vaginais VK2 E6 / E7.
[0105] A Figura 10 mostra a capacidade de adesão de cepas de L. casei e L. rhamnosus GG a células epiteliais do intestino Caco-2.
[0106] A Figura 11 mostra a capacidade de adesão de cepas de L. casei e outros lactobacilos relacionados em células epiteliais das vias aéreas Calu-3.
[0107] A Figura 12 mostra a capacidade de adesão de cepas de L. casei e outros lactobacilos relacionados em células epiteliais intestinais Caco-2 (A) e células vaginais VK2 / E6E7 (B).
[0108] A Figura 13 mostra o comprimento médio das fímbrias de L. rhamnosus GG e da cepa de L. casei com número de acesso LMG PPetição 870190094581, de 20/09/2019, pág. 58/96
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30039 (AMBR2).
[0109] A Figura 14 mostra a comparação entre o polissacarídeo da parede celular (CW-PS) da cepa de L. rhamnosus GG e L. casei com o número de acesso LMG P-30039 (AMBR2) [0110] A Figura 15 mostra o efeito de CW-PS a partir da cepa de L. casei com número de acesso LMG P-30039 (AMBR2) ou da cepa de L. rhamnosus GG na resposta de citocinas em macrófagos THP1.
[0111] A Figura 16 mostra o rompimento da barreira epitelial induzida pela super toxina SEB de Staphylococcus e a contra-ação por L. casei LMG P-30039 (AMBR2).
[0112] A Figura 17 é uma árvore filogenética construída de todos os 184 conjuntos de genoma do grupo L. casei.
[0113] A Figura 18 mostra o teor de G / C do genoma completo dos conjuntos de genoma estudados.
[0114] A Figura 19 mostra os valores ANIb e TETRA em pares para todos os genomas estudados.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [0115] A presente invenção é baseada na identificação de uma nova cepa de L. casei a partir do trato respiratório superior humano, também indicada como cepa AMBR2 ou Lactobacillus AMBR2. A dita cepa foi depositada na Coleção Coordenada de Microrganismos Belga (BCCM) em 21 de fevereiro de 2017 com o número de acesso LMG P30039.
[0116] A capacidade de crescimento da nova cepa isolada de L. casei AMBR2 (LMG P-30039) foi comparada com a capacidade de crescimento de várias outras cepas de Lactobacillus, conforme indicado na Figura 3. Verificou-se que a capacidade de crescimento da nova cepa isolada de L. casei AMBR2 melhorou em comparação com a capacidade de crescimento de outras cepas da espécie Lactobacillus. Além disso, a nova cepa isolada também é caracterizada pelo fato de
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24/52 que compreende fímbrias especiais com um comprimento médio de pelo menos 0,4 pm, aumentando assim a adesão nas células epiteliais.
[0117] Típico desta nova cepa isolada é que ela tem um teor de G / C no genoma completo de 48,02%, que é superior ao teor de G / C esperado para o genoma completo em outras cepas de L. casei. Além disso, a dita nova cepa bacteriana isolada de L. casei com número de acesso LMG P-30039 abriga um ou mais genes de catalase, em particular, dois genes de catalase, em que os ditos genes de catalase são selecionados a partir do grupo que consiste em heme-catalase e catalase de manganês.
[0118] A catalase é um fator importante no estabelecimento de um fenótipo resistente ao estresse oxidativo. Embora as bactérias do ácido lático sejam geralmente definidas como catálase-negativas, a atividade da catalase foi encontrada em membros dos gêneros Lactobacillus, Pediococcus e Leuconostoc. Também, a nova cepa isolada de L. casei de acordo com a presente invenção expressa uma catalase hemedependente. A dita catalase heme-dependente mostra mais de 70% de identidade e mais de 80% de cobertura com a catalase hemedependente de L. plantarum WCSF1 (sequência NCBI YP_004891054), catalase heme-dependente de L. sakei (sequência NCBI WP_01137882) e catalase de L. brevis ATCC 367 (sequência NCBI WP_011667631) no nível da proteína. Além disso, também foi identificado um gene que codifica um manganês na nova cepa de acordo com a presente invenção. O dito manganês mostra mais de 70% de identidade e mais de 80% de cobertura com a catalase de manganês de L. plantarum ATCC 14431 (número de acesso 1JKU do banco de dados de proteínas RCSB) no nível de proteína. Como um resultado, esta nova cepa isolada abriga um fenótipo muito resistente à oxidação. Além disso, a nova cepa isolada de L. casei de acordo com a presente invenção mostra uma atividade antipatogênica melhorada contra
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Staphylococcus aureus (Figura 4) e Candida albicans (Figura 5 e 6). Além disso, a nova cepa de L. casei AMBR2 também mostra capacidade de adesão aprimorada às células epiteliais das vias aéreas, células epiteliais vaginais e células epiteliais intestinais (Figura 8 a 12).
[0119] Além disso, a nova cepa isolada também é caracterizada pelo fato de que compreende fímbrias especiais com um comprimento médio de pelo menos 0,4 μιτι; em particular, fímbrias de subunidade única robustas, ricas em serina, glicosiladas e, com um comprimento médio de pelo menos 0,4 μιτι, aumentando assim a adesão nas células epiteliais (Figura 13).
[0120] Em uma outra modalidade, a dita nova cepa de L. casei pode compreender fímbrias especiais com um comprimento médio de pelo menos 0,4 pm. Em outra modalidade, a dita cepa de L. casei produz mais exopolissacarídeos, em particular, polissacarídeos da parede celular, em comparação com a referência L. rhamnosus GG. Em uma modalidade ainda mais adicional, os exopolissacarídeos produzidos na cepa de L. case/podem ter uma forma diferente e/ou com uma atividade biológica diferente em comparação com os produzidos por L. rhamnosus GG.
[0121] Em ainda outra modalidade, a dita nova cepa de L. casei impede o rompimento da barreira epitelial, por exemplo, o rompimento da barreira epitelial induzida pela supertoxina SEB do Staphylococcus. [0122] Com base nessas descobertas, a nova cepa bacteriana isolada AMBR2 depositada sob o número de acesso LMG P-30039 ou uma composição compreendendo a dita cepa bacteriana isolada AMBR2 é fornecida para uso no tratamento e/ou prevenção de infecções ou doenças imunorrelacionadas. As ditas infecções são preferencialmente infecções oronasofaríngeas, infecções de pele, mastite, infecções urogenitais ou infecções gastrointestinais.
[0123] As infecções oronasofaríngeas são selecionadas a partir de
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26/52 infecções da cavidade oronasofaríngea ou infecções orais, preferencialmente selecionadas, mas não limitadas, a partir do grupo que consiste em otite média, faringite, sinusite crônica, sinusite aguda, rinite, gripe, mucosite, cárie, gengivite ou halitose, e similares. As infecções de pele são preferencialmente selecionadas a partir do grupo que consiste em acne vulgar, psoríase, queimaduras, celulite, impetigo, pés de atleta (tinea pedis), infecções por fungos nas unhas, ou verrugas, e similares. As infecções urogenitais são preferencialmente selecionadas a partir do grupo que consiste em infecções vaginais ou infecções da bexiga. As infecções gastrointestinais são preferencialmente selecionadas a partir do grupo que consiste em colite, infecção estomacal, doença inflamatória intestinal, síndrome do intestino irritável, e similares.
[0124] Como já indicado acima, a cepa bacteriana isolada AMBR2 ou composição compreendendo a cepa de acordo com a presente invenção também é fornecida para uso no tratamento e/ou prevenção de doenças imunorrelacionadas. As ditas doenças imunorrelacionadas podem ser selecionadas a partir do grupo que consiste em febre do feno, rinite alérgica, sinusite alérgica, asma, e similares.
[0125] Em outra modalidade, a presente invenção também fornece o uso da cepa bacteriana isolada ou uma composição compreendendo a cepa de acordo com a presente invenção como um adjuvante para promover uma resposta imune durante a vacinação.
[0126] Com base na constatação de que a nova cepa bacteriana isolada AMBR2 da espécie L. casei com número de acesso LMG P30039 mostra capacidade de adesão aprimorada às células epiteliais respiratórias e abriga um fenótipo muito resistente à oxidação, a presente invenção também fornece o uso da dita cepa bacteriana isolada ou uma composição compreendendo a dita cepa bacteriana na indústria de higiene pessoal, em particular, na produção de tecidos, máscaras de proteção ou aspersões; ainda mais em particular, na
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27/52 produção de tecidos, máscaras de proteção ou aspersões para o tratamento e/ou prevenção de infecções respiratórias.
[0127] Com base na sua capacidade antimicrobiana, a uso da nova cepa bacteriana isolada AMBR2 ou de uma composição compreendendo a cepa de acordo com a presente invenção é descrita na indústria de limpeza, em particular, na produção de um produto de limpeza. Os ditos produtos de limpeza são particularmente destinados ao tratamento e/ou desinfecção de superfícies.
[0128] Em ainda outra modalidade, o uso da nova cepa bacteriana isolada AMBR2 ou uma composição compreendendo a cepa de acordo com a presente invenção é descrita na purificação de ar, em particular, nos filtros de purificação de ar.
[0129] Além disso, e com base na sua capacidade de produzir ácido lático, também é descrito o uso da nova cepa bacteriana isolada AMBR2 ou de uma composição compreendendo a dita cepa na produção de biomassa. A dita produção de biomassa pode abranger, por exemplo, biomassa vegetal, biomassa animal e biomassa de resíduos municipais. [0130] Além disso, é descrito o uso da nova cepa bacteriana isolada AMBR2 ou de uma composição compreendendo a dita cepa na indústria de alimentos. A dita indústria de alimentos pode abranger produtos alimentícios fermentados (à base de lácteos, no valor de soja) ou os biorreatores e ambientes de processamento usados na indústria de alimentos, nos quais a cepa AMBR2 ou uma composição compreendendo a cepa pode ser usada para diminuir a formação de biofilme de organismos indesejados ou deteriorados. Assim, em uma modalidade adicional, é descrito o uso da nova cepa bacteriana isolada AMBR2 ou de uma composição compreendendo a dita cepa em produtos alimentícios fermentados, tais como lácteos, no valor de soja. Em outra modalidade, é descrito o uso da nova cepa bacteriana isolada AMBR2 ou de uma composição compreendendo a dita cepa em biorreatores e
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28/52 ambientes de processamento utilizados na indústria de alimentos.
[0131] Em outro aspecto da presente invenção, um novo grupo de espécies de Lactobacillus casei foi identificado usando diferentes abordagens genômicas comparativas. Com essa abordagem, 183 conjuntos de genomas do grupo L. casei publicamente disponíveis, compreendendo as espécies L. paracasei, L. casei, L. rhamnosus e L. zeae, juntamente com um isolado recém-sequenciado do trato respiratório humano (a cepa de L. casei AMBR2 analisada, depositada sob o número de acesso LMG P-30039) e três isolados de fermentações de suco de cenoura (Exemplo 2) foram analisados. Com essas abordagens, três diferentes ciados taxonômicos foram identificados com base em uma árvore filogenética construída no alinhamento de 776 genes (Figura 17), diferenças no teor do G / C do genoma completo (Figura 18) e valores ANI aos pares (Figura 19). Um desses ciados consiste em apenas isolados de L. casei (após a reclassificação de L. zeae a L. casei, Salvetti e outros, 2012), e cada membro é caracterizado por um alto teor de G / C no genoma completo, em particular um teor de G / C do genoma completo de pelo menos 47,5% e pela presença de um ou mais genes de catalase, em que os genes de catalase são selecionados a partir do grupo que consiste em heme-catalase e catálase de manganês. Além disso, cada membro deste ciado também é caracterizado por um valor de identidade nucleotídica média (ANI) de pelo menos 93% em comparação com a sequência genômica da cepa de L. casei ATCC 393.
[0132] Com base na identificação deste novo ciado, que também compreende a nova cepa isolada de L. casei AMBR2 (depositada sob o número de acesso LMG P-30039), a presente invenção fornece ainda uma espécie de L. casei ou uma composição que compreende uma ou mais espécies de L. casei para uso no tratamento e/ou prevenção de infecções e/ou doenças imunorrelacionadas, em que as ditas espécies
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29/52 de L. caseitêm um teor de G / C do genoma completo de pelo menos 47,5% e abrigam um ou mais, em particular, dois genes de catalase. As ditas espécies de L. case/podem ainda compreender fímbrias especiais com um comprimento médio de pelo menos 0,4 pm, em particular, fímbrias especiais de subunidade única, robustas, ricas em serina, glicosiladas, com um comprimento médio de pelo menos 0,4 pm. Em uma modalidade adicional, a presente invenção fornece as ditas espécies de L. casei com um teor de G / C do genoma completo de pelo menos 47,5% e abrigando um ou mais genes de catalase ou uma composição compreendendo uma ou mais das ditas espécies de L. casei para uso no tratamento e/ou prevenção de infecções oronasofaríngeas, em particular, infecções da cavidade oronasofaríngea ou infecções orais, mais em particular, infecções do trato respiratório superior selecionadas a partir do grupo que consiste em otite média aguda, faringite, sinusite crônica, sinusite aguda, rinite, gripe, mucosite, cárie, gengivite ou halitose, e similares.
[0133] Em uma modalidade adicional, a presente invenção fornece uma espécie de L. casei com um teor de G / C do genoma completo de pelo menos 47,5% e abrigando um ou mais genes de catalase ou uma composição compreendendo uma ou mais das ditas espécies de L. case/para uso no tratamento e/ou prevenção de infecções de pele, em particular, acne vulgar, psoríase, queimaduras, celulite, impetigo, pés de atleta (tinea pedis), infecções por fungos nas unhas, ou verrugas, e similares.
[0134] Em ainda outra modalidade, a presente invenção fornece uma espécie de L. casei com um teor de G / C do genoma completo de pelo menos 47,5% e abrigando um ou mais genes de catalase ou uma composição compreendendo uma ou mais das ditas espécies de L. casei para uso no tratamento e/ou prevenção de mastite.
[0135] Em ainda outra modalidade, a presente invenção fornece
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30/52 uma espécie de L. casei com um teor de G / C do genoma completo de pelo menos 47,5% e abrigando um ou mais genes de catalase ou uma composição compreendendo uma ou mais das ditas espécies de L. case/para uso no tratamento e/ou prevenção de infecções urogenitais, em particular infecções vaginais e infecções da bexiga.
[0136] Em ainda uma outra modalidade, a presente invenção fornece uma espécie de L. casei com um teor de G / C do genoma completo de pelo menos 47,5% e abrigando um ou mais genes de catalase ou uma composição compreendendo uma ou mais das ditas espécies de L. casei para uso no tratamento e/ou prevenção de infecções gastrointestinais, em particular, colite, infecção estomacal, doença inflamatória intestinal, síndrome do intestino irritável, e similares. As ditas espécies de L. casei podem ainda compreender fímbrias especiais com um comprimento médio de pelo menos 0,4 pm; em especial fímbrias especiais de subunidade única, robustas, ricas em serina, glicosiladas, e com um comprimento médio de pelo menos 0,4 pm.
[0137] Em outra modalidade, a presente invenção fornece uma espécie de L. casei com um teor de G / C do genoma completo de pelo menos 47,5% e abrigando um ou mais genes de catalase ou uma composição compreendendo uma ou mais das ditas espécies de L. casei para uso no tratamento e/ou prevenção de doenças imunorrelacionadas, em particular, doenças imunorrelacionadas selecionadas a partir do grupo que consiste em febre do feno, rinite alérgica, sinusite alérgica, asma e similares. As ditas espécies de L. casei podem ainda compreender fímbrias especiais com um comprimento médio de pelo menos 0,4 pm; em especial, fímbrias especiais de subunidade única, robustas, ricas em serina, glicosiladas, com um comprimento médio de pelo menos 0,4 pm.
[0138] A presente invenção descreve ainda o uso de uma espécie
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31/52 de L. casei com um teor de G / C do genoma completo de pelo menos 47,5% e abrigando um ou mais genes de catalase na indústria de higiene pessoal. Também é descrito o uso de uma composição compreendendo uma ou mais das ditas espécies de L. casei na indústria de higiene pessoal. Em particular, é descrito o uso de espécies de L. casei com um teor de G / C no genoma completo de pelo menos 47,5% e abrigando um ou mais genes de catalase ou uma composição compreendendo uma ou mais das ditas espécies de L. casei na produção de tecidos, máscaras de proteção ou aspersões. Ainda mais em particular, os ditos tecidos, máscaras de proteção ou aspersões são direcionados para o tratamento e/ou prevenção de infecções respiratórias. As ditas espécies de L. case/podem ainda compreender fímbrias especiais com um comprimento médio de pelo menos 0,4 pm; em especial fímbrias especiais de subunidade única, robustas, ricas em serina, glicosiladas, com um comprimento médio de pelo menos 0,4 pm. [0139] Em outro aspecto, a presente invenção descreve o uso de uma espécie de L. casei ou uma composição compreendendo uma ou mais das ditas espécies de L. casei na purificação de ar, em particular em filtros de purificação de ar, em que as ditas espécies de L. casei têm um teor de G / C do genoma completo de pelo menos 47,5% e abriga um ou mais genes de catalase. As ditas espécies de L. casei podem ainda compreender fímbrias especiais com um comprimento médio de pelo menos 0,4 pm; em particular, fímbrias especiais de subunidade única, robustas, ricas em serina, glicosiladas, com um comprimento médio de pelo menos 0,4 pm.
[0140] Em um aspecto adicional, a presente invenção descreve o uso de uma espécie de L. casei ou uma composição compreendendo uma ou mais das ditas espécies de L. casei na produção de biomassa, em que as ditas espécies de L. casei têm um teor de G / C do genoma completo de pelo menos 47,5% e abriga um ou mais genes de catalase.
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As ditas espécies de L. casei podem ainda compreender fímbrias especiais com um comprimento médio de pelo menos 0,4 pm; em particular, fímbrias especiais de subunidade única, robustas, ricas em serina, glicosiladas, com um comprimento médio de pelo menos 0,4 pm. [0141] Além disso, é descrito o uso de uma espécie de L. casei ou uma composição compreendendo uma ou mais das ditas espécies de L. casei na indústria de alimentos, em que as ditas espécies de L. casei têm um teor de G / C do genoma completo de pelo menos 47,5% e abrigam um ou mais genes de catalase. As ditas espécies de L. casei podem ainda compreender fímbrias especiais com um comprimento médio de pelo menos 0,4 pm; em particular, fímbrias especiais de subunidade única, robustas, ricas em serina, glicosiladas com um comprimento médio de pelo menos 0,4 pm. A dita indústria de alimentos pode abranger produtos alimentícios fermentados (à base de lácteos, no valor de soja) ou os biorreatores e ambientes de processamento usados na indústria de alimentos, em que as espécies L. casei ou uma composição compreendendo a dita cepa podem ser usadas para diminuir a formação de biofilme de organismos de indesejados ou de deterioração. Assim, em uma modalidade adicional, é descrito o uso das ditas espécies de L. casei ou uma composição compreendendo uma ou mais das ditas espécies de L. casei em produtos alimentícios fermentados, tais à base de lácteos, no valor de soja. Em outra modalidade, é descrito o uso das ditas espécies de L. casei ou de uma composição compreendendo uma ou mais das ditas espécies de L. casei em biorreatores e ambientes de processamento utilizados na indústria de alimentos.
[0142] Com relação ainda aos diferentes usos das espécies de L. casei de acordo com a presente invenção ou da composição compreendendo uma ou mais das ditas espécies de L. casei de acordo com a presente invenção, as ditas espécies de L. casei abrigam um ou mais
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33/52 genes de catalase, em que o um ou mais genes de catalase são selecionados a partir do grupo que consiste em heme-catalase e catalase de manganês.
[0143] Em ainda outra modalidade da presente invenção, e também com relação aos diferentes usos da espécie de L. casei ou da composição compreendendo as ditas espécies de L. casei de acordo com a presente invenção, a dita espécie tem um genoma com uma identidade nucleotídica média com a sequência genômica da cepa de L. casei ATCC 393 de pelo menos 93%.
[0144] No contexto da presente invenção, o termo “comprimento médio das fímbrias” refere-se à análise por microscopia eletrônica de varredura (SEM) após três vezes de lavagem das bactérias com um tampão adequado (por exemplo, solução salina tamponada com fosfato), com centrifugação intermediária das células em min. 6000 g. O comprimento de pelo menos 10 fímbrias em uma ou duas células bacterianas é cuidadosamente determinado (expresso em pm) e a média é determinada.
EXEMPLOS
EXEMPLO 1: Isolamento da nova cepa de L. case/'(depositada sob o número de acesso LMG P-30039) e comparação de microbiomas entre o nariz (N) e a nasofarinqe (NF) de indivíduos saudáveis (CON) e pacientes com rinossinusite crônica (CRS) para a presença ou ausência de lactobacilos nos seus perfis de microbioma. Materiais e métodos [0145] As amostras foram coletadas no âmbito do ensaio clínico NCT 02 933983 (https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02933983)· O método para extração de DNA e sequenciamento de amplicons 16 S foi publicado recentemente em De Boeck e outros, Frontiers in Microbiology 2017· Resultados
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34/52 [0146] Pelo menos 66% dos indivíduos saudáveis (CON) contêm lactobacilos no nariz (N) e 59% na nasofaringe (NF), enquanto isso é drasticamente reduzido para menos de 15% e menos de 10% para pacientes com rinossinusite crônica (CRS) para nariz e nasofaringe, respectivamente (Figura 1). A comparação da abundância relativa de lactobacilos no nariz e nasofaringe de indivíduos saudáveis e pacientes com rinossinusite crônica quando os lactobacilos estão presentes no perfil, mostra que os lactobacilos não estão apenas mais presentes em controles saudáveis, mas também apresentam maiores abundâncias relativas em indivíduos saudáveis em comparação com pacientes com CRS (Figura 2).
EXEMPLO 2: Caracterização da nova cepa isolada de L. casei (depositada sob o número de acesso LMG P-30039).
Materiais e métodos [0147] Ensaios de crescimento bacteriano. As culturas durante a noite dos lactobacilos (± 2 x 109 CFU / ml) foram adicionadas aos poços de uma placa de microtitulação em uma diluição de 100 vezes. As culturas de Lactobacillus foram deixadas em crescimento em meio MRS (Difco, Bélgica) por 18 h e a densidade óptica foi medida a cada 15 minutos a 600 nm usando um leitor multimodo Synergy HTX (Biotek, Drogenbos, Bélgica).
[0148] Análise ao longo do tempo da atividade antimicrobiana do sobrenadante de Lactobacillus para o crescimento de S. aureus em suspensão. Para a análise ao longo do tempo, uma cultura durante a noite de S. aureus (± 4 x 109 CFU / ml) foi adicionada aos poços de uma placa de microtitulação em uma diluição de 100 vezes, suplementada com sobrenadante de Lactobacillus a 10%. A hexetidina (0,1 %) e o meio MRS a pH 3,6 foram utilizados como controles positivos. As culturas de S. aureus foram deixadas em crescimento por 72 h e a densidade óptica foi medida a cada 30 min a 600 nm usando um leitor
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35/52 multimode Synergy HTX (Biotek, Drogenbos, Bélgica). Cada condição foi medida pelo menos em triplicado e a OD média foi calculada.
[0149] Inibição da adesão de C. albicans às células epiteliais por espécies de Lactobacillus. A influência dos lactobacilos na adesão das espécies de Candida às células epiteliais vaginais VK2 / E6E7 foi investigada através da adição de um volume de 1 ml contendo células de Candida (106 CFU) e lactobacilos (108 CFU) simultaneamente a poços de placas de cultura de tecidos contendo monocamadas confluentes de células epiteliais, que foram incubadas a 37° C por 1 h para mediar a adesão. Após a incubação, as células foram lavadas três vezes com PBS de Dulbecco para remover todas as células não aderidas e o número de células de Candida aderidas às células VK2 / E6E7 foi determinado pelo método de macrodiluição em ágar Sabouraud (Carl Roth), que é seletivo para espécies de fungos. Cada condição foi realizada pelo menos em triplicado.
[0150] Isolamento de EPS. Os EPS das cepas de Lactobacillus foram isolados com o protocolo de extração descrito anteriormente (Lebeer e outros, 2007). Resumidamente, os lactobacilos foram deixados em crescimento até uma densidade óptica de 0,6 e lavados com solução salina tamponada com fosfato. O EPS foi então extraído por incubação em EDTA a 0,05 M (Sigma Aldrich, Diegem, Bélgica) (agitação, em gelo), seguido de precipitação com etanol e diálise contra água destilada (membrana de diálise Spectra / Por® [Spectrum Laboratories, Breda, Holanda]). Posteriormente, as amostras foram tratadas com ácido tricloroacético (Sigma Aldrich) para remover proteínas, dialisadas contra a água e esterilizadas por filtro (tamanho de poro 0,2 pm [VWR, Haasrode, Bélgica]). A quantidade total de carboidratos foi estimada pelo método do fenol-ácido sulfúrico (DuBois e outros, 1956). As amostras foram liofilizadas em um sistema de liofilização de bancada FreeZone de 1 litro (Modelo 7740030) (Labconco, MO, EUA) e
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36/52 armazenadas a 4o C até o uso. Antes do uso, os EPS foram dissolvidos em água pura. A produção de citocinas nos macrófagos THP-1 foi monitorada por RT-PCR quantitativa, conforme descrito por Vargas Garcia e outros, 2015; AEM.
[0151] Inibição da formação de hifas por C. albicans. As hifas de C. albicans (106 CFU / ml) foram induzidas pelo soro bovino fetal, enquanto incubadas com ou sem lactobacilos (108 CFU / ml). Após a incubação, foram contadas pelo menos cem células de levedura e/ou hifas em pelo menos três repetições biológicas e foi calculada a relação de hifas para células de levedura.
[0152] Adesão às células epiteliais. A capacidade de adesão dos isolados de Lactobacillus às células epiteliais vaginais VK2 / E6E7, células epiteliais intestinais Caco-2 e células epiteliais das vias aéreas Calu-3 foi investigada através da adição de lactobacilos (108 CFU / ml) às monocamadas epiteliais. Após uma incubação para mediar a adesão, as células foram lavadas três vezes com PBS de Dulbecco para remover todas as células não aderidas e as células restantes foram soltas e quantificadas pelo método de macrodiluição em ágar MRS.
[0153] Expressão de fimbria especiais. A presença de pilosou fímbrias (apêndices de superfície semelhantes a cabelos) na cepa de L. casei LMG P-30039 (AMBR2) e a cepa probiótica de referência de L. rhamnosus GG foi avaliada por microscopia eletrônica de varredura (SEM). As bactérias foram identificadas em uma membrana revestida com ouro e fixadas com glutaraldeído a 2,5% (em Na+-cacodilato a 0,1 M) por 1 hora em temperatura ambiente (RT), seguida de uma fixação durante a noite a 4o C. As bactérias foram então lavadas 3 vezes por 20 minutos e deixadas durante a noite em tampão de cacodilato (contendo 7,5% de sacarose) a 4o C. Posteriormente, as bactérias foram desidratadas em uma série ascendente de etanol (50%, 70%, 90%, 95%), cada uma por 30 minutos em temperatura ambiente e 3 x 30
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37/52 minutos em etanol a 100%, e o ponto crítico seco em um revestidor Leica EM Ace 600. As membranas foram montadas em um módulo e revestidas com 5 nM de carbono em um revestidor Leica EM Ace 600. A imagiologia SEM foi realizada com um sistema Quanta FEG250 SEM (Thermo Fischer, Asse, Bélgica).
[0154] Melhora da integridade da barreira epitelial. O efeito de L. case/LMG P-30039 (AMBR2) na restauração da barreira epitelial nasal foi determinado como descrito por Steelant e outros (2018; Journal of Allergy & Clinical Immunology). Camundongos BALB/c machos (6 a 8 semanas) foram obtidos a partir de Harlan (Horst, Holanda) e foram mantidos em condições convencionais. Camundongos M4 foram instilados endonasalmente 3 vezes com SEB (10 pg / ml) ou solução salina em intervalos de 1 hora. Uma hora após a última instilação endonasal, 20 pL de fluoresceína isotiocianato - dextrano a 4 kDa (FD4) (50 mg / mL) foram aplicados endonasalmente, permitindo avaliar a permeabilidade da mucosa nasal. Uma hora depois, o soro e a mucosa nasal foram coletados para análise adicional.
Resultados [0155] A capacidade de crescimento da nova cepa isolada de L. casei AMBR2 (LMG P-30039) foi comparada com a capacidade de crescimento de várias outras cepas de Lactobacillus, conforme indicado na Figura 3. Verificou-se que a capacidade de crescimento da nova cepa isolada de L. casei AMBR2 melhorou em comparação com a capacidade de crescimento de outras cepas da espécie Lactobacillus. [0156] Além disso, a nova cepa isolada de L. casei de acordo com a presente invenção mostra uma atividade antipatogênica melhorada contra Staphylococcus aureus (Figura 4) e Candida albicans (Figura 5 e 6). Além disso, a cepa de L. casei AMBR2 mostra excelentes atividades antimicrobianas contra patógenos respiratórios, tal como Moraxella catarrhalis, Haemophilus influenzae, Staphylococcus aureus, Shigella
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38/52 flexneri, Shigella sonnei, Escherichia coli e Candida albicans. Além disso, seu sobrenadante mostra uma atividade antibiofilme exclusiva contra Stenotrophomonas maltophila (Figura 7).
[0157] Além disso, a nova cepa de L. casei AMBR2 também mostra capacidade de adesão aprimorada às células epiteliais das vias aéreas, células epiteliais vaginais e células epiteliais intestinais (Figura 8 a 12). [0158] A nova cepa isolada de L. casei mostra ainda a expressão de fímbrias ou pilos que são em média claramente mais longas em comparação com as fímbrias que são expressas na cepa de referência de Lactobacillis rhamnosus GG (Tabela 1 e Figura 13).
[0159] Tabela 1 - Comparação de propriedades das fímbrias com base em SEM
Análise SEM | L. rhamnosus GG | L. casei LMG P-30039 (AMBR2) |
Número de fímbrias em células (piliados) | 14 | 6,25 |
Comprimento das fímbrias | Muito variável: entre 0,1 pm e 1 um, em média 0,25 um | Em média 0,5 um, mais robustas, menos variação de comprimento |
“Estiramento” | De preferência “fraco” | Completamente estiradas |
“Substrato” | Outras células LGG | A membrana |
Presença após secagem por aspersão | Removida | Ainda presente |
[0160] Além disso, a nova cepa de L. casei LMG P-30039 (AMBR2) produz mais exopolissacarídeo, que também é de forma diferente e com atividade biológica diferente em comparação com o L. rhamnosus GG e qualquer outro Lactobacillus. A extração do EPS da parede celular (CWPS) de L. casei AMBR2 produz aproximadamente 25 mg / ml, que é mais do que o dobro do rendimento de CW-PS de L. rhamnosus GG (Figura 14).
[0161] Estes dados mostram ainda que CW-PS de L. casei LMG P30039 (AMBR2) pode modular a resposta de citocinas em macrófagos THP1. Após diferenciação celular com forbol miristato acetato, os macrófagos THP1 foram estimulados com 500 pg / ml de CW-PS a partir de L. caseiAMBR2 e L. rhamnosus GG. Com base em qPCR, observouse uma indução de citocina similar para ambos os tipos de EPS, embora
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IL-6 pareça ser mais induzido pela cepa de L. casei AMBR2.
[0162] Finalmente, a cepa de L. casei AMBR2 evita o rompimento da barreira epitelial induzido pela supertoxina SEB de Staphylococcus (Figura 16).
EXEMPLO 2: Caracterização de um novo grupo de membros da espécie L. casei
Materiais e métodos
Sequenciamento de isolados bacterianos e montagens de genomas de NCBI [0163] O sequenciamento de genoma completo foi realizado usando o kit de preparação de amostras de DNA Nextera XT (Illumina), e sequenciado por meio da plataforma Illumina MiSeq usando 2 x 250 ciclos no Centro de Genética Médica de Antuérpia (Universidade de Antuérpia). A montagem foi realizada usando o SPAdes 3.8.0 (Bankevich e outros, 2012). Todas as montagens de genomas classificadas como L. casei, L. paracasei, L. rhamnosus e L. zeae (210 no total) foram transferidas do NCBI em 19/02/2017, usando scripts internos. Além disso, todas as montagens não classificados de Lactobacillus (anotadas como Lactobacillus sp.; 28 no total) foram tríadas quanto aos membros do grupo L. case/por blasting (Camacho e outros, 2009) em um banco de dados RDP filtrado (v11) (Cole e outros, 2014) que continham apenas sequências de rRNA de Lactobacillus 16S de boa qualidade, superiores a 1200 nt, a partir de isolados cultivados. Isso resultou em 15 montagens adicionais que foram submetidas ao controle de qualidade.
Controle de qualidade e Anotação [0164] A qualidade das montagens de genomas foi avaliada usando a saída gerada por Quast 4.3 (Gurevich e outros, 2013). Após a visualização de diferentes parâmetros de controle de qualidade, os genomas com N75 < 10.000 pb e um número de N’s por 100.000 bases
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40/52 superiores a 500 foram descartados. Subsequentemente, uma montagem de genoma (GCA_001063295) foi removida por ter um tamanho de genoma de 5,8 Mbp e foi identificada como uma montagem híbrida. Em seguida, foi criado um banco de dados BLAST específico de gênero personalizado, usando todos os genomas completos de Lactobacillus encontrados em NCBI. Esse banco de dados foi usado em Prokka (Seemann, 2014) com a opção -usegenus, para anotar todas as montagens de genomas.
Construção de árvore filogenética [0165] A geração dos conjuntos de genes usados como entrada para a construção da árvore filogenética foi feita usando Roary (Page e outros, 2015) com uma identidade percentual mínima blastp de 70 e um limite de 96 como porcentagem de isolados em que um gene deve estar para ser definido como um gene core. Esses genes core foram traduzidos e comparados com um banco de dados BLAST das proteínas do genoma do grupo externo GCA_000026065 (L. sakei). Todos as correspondências com cobertura > 75% e identidade percentual > 50% foram adicionados ao alinhamento usando scripts internos. Esse alinhamento foi usado em RaxML 8.2.9 (Stamatakis, 2014) para construir uma árvore filogenética de máxima probabilidade com a opção -a, que combina um algoritmo de autoinicialização rápida com uma extensa busca no espaço da árvore a partir de múltiplas árvores de partida diferentes. A árvore principal foi representada em iTOL (Letunic e Bork, 2016), enquanto as subárvores foram feitas usando o pacote R (R Core Team, 2015) ggtree (Yu e outros, 2016).
Teor de G/C [0166] O teor de G / C do genoma completo e o teor de G / C por gene foram calculados usando Quast 4.3 (Gurevich e outros, 2013) e infoseq a partir de EMBOSS 6.6.0.0 (Rice e outros, 2000), respectivamente. A visualização foi feita em R usando ggplot2 (Wickham, 2009).
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ANIb, ANIm e TETRA [0167] Todos os valores ANIb, ANIm e TETRA em pares foram calculados usando o pacote Python pyani e visualizados usando ggtree (Yu e outros, 2016).
Abordagens orientadas a interesses [0168] Para todas as abordagens orientadas a interesses, três métodos diferentes foram usados. Primeiro, a presença dos genes de interesse, tal como o gene de catalase, foi avaliada com base em suas anotações. Em segundo lugar, a literatura foi pesquisada manualmente quanto a variantes conhecidas dos genes de interesse. Esses genes foram então blasted contra os genes core representativos de cada ciado e as correspondências foram avaliadas. Finalmente, como uma terceira abordagem, se possível, o banco de dados PFAM foi usado para fazer a transferência de HMMs das famílias de proteínas do gene de interesse. Hmmer (Finn e outros, 2011) foi então usado para escanear os genes core representativos de cada ciado contra esses HMMs.
Resultados [0169] A Tabela 2 fornece uma visão geral de todos os genomas públicos disponíveis (NCBI; 19/02/2017) pertencentes ao grupo L. casei que foram utilizados neste estudo. No total, 183 montagens de genomas públicas passaram no QC (valor de N75 < 10.000 bp e um número de Ns por 100.000 bases inferiores a 500). Desses genomas, 92 foram classificados como L. rhamnosus, 36 como L. casei, 38 como L. paracasei e 2 como L. zeae. Além dos genomas públicos classificados como grupo L. casei, examinou-se todos os genomas de Lactobacillus não classificados (categorizados como Lactobacillus sp. no NCBI) para os membros do grupo L. casei comparando suas sequências de rDNA 16S com uma versão filtrada do banco de dados RDP (v11) (Cole e outros, 2014). Isso resultou em mais 15 genomas. Além disso, uma cepa de Lactobacillus casei (AMBR2) recentemente sequenciada, isolada de
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URT humana, foi adicionada à análise. Isso levou a um total de 184 cepas do grupo L. case/estudadas.
Estrutura taxonômica
Teor G / C [0170] O teor de G / C de todas as montagens é mostrado na Figura
18. Essa figura mostra que o teor de G / C das espécies L. paracasei, L. rhamnosus e L. zeae é estável em uma espécie com os respectivos valores médios de 46,3, 46,7 e 47,8. A sobreposição entre essas espécies é pequena ou inexistente. Em contraste, os genomas de L. case/podem ser divididos em dois grupos. Um grande grupo mostra um valor de teor de G / C na faixa da de L. paracasei, enquanto cinco genomas mostram um teor de G / C muito maior, similar ao dos genomas de L. zeae. Quanto às montagens não classificadas (classificadas como Lactobacillus sp.), dois genomas mostram um teor de G / C tão alto quanto os genomas de L. zeae, enquanto o restante está dentro da faixa de L. rhamnosus / L. paracasei. A sequência genômica do novo isolado, que designou-se L.casei AMBR2, mostra um teor de G / C similar a outros genomas de L. zeae.
Tabela 2 - Uma visão geral de todos os genomas publicamente disponíveis pertencentes ao grupo L. casei que foram utilizados neste estudo. Se disponível, o nome da cepa é fornecido na segunda coluna.
Espécie de Lactobacillus | Cepa | Número de acesso | Ciado |
Lactobacillus casei | Zhang | GCA 000019245 | ciado A |
Lactobacillus casei | BL23 | GCA 000026485 | ciado A |
Lactobacillus casei | BD-II | GCA 000194765 | ciado A |
Lactobacillus casei | LC2W | GCA 000194785 | ciado A |
Lactobacillus casei | 12A | GCA 000309565 | ciado A |
Lactobacillus casei | 42756 | GCA 000309585 | ciado A |
Lactobacillus casei | 32G | GCA 000309605 | ciado A |
Lactobacillus casei | A2-362 | GCA 000309625 | ciado A |
Lactobacillus casei | CRF28 | GCA 000309645 | ciado A |
Lactobacillus casei | M36 | GCA 000309665 | ciado A |
Lactobacillus casei | T71499 | GCA 000309685 | ciado A |
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Lactobacillus casei
Lactobacillus casei
Lactobacillus casei
Lactobacillus casei
Lactobacillus casei
Lactobacillus casei
Lactobacillus casei
Lactobacillus casei
Lactobacillus casei
Lactobacillus casei
Lactobacillus casei
Lactobacillus casei
Lactobacillus casei
Lactobacillus casei
Lactobacillus casei
Lactobacillus casei
Lactobacillus casei
Lactobacillus casei
Lactobacillus casei
Lactobacillus casei
Lactobacillus casei
Lactobacillus casei
Lactobacillus casei
Lactobacillus casei
Lactobacillus casei
Lactobacillus paracasei
Lactobacillus paracasei
Lactobacillus paracasei
Lactobacillus paracasei
Lactobacillus paracasei
Lactobacillus paracasei
Lactobacillus paracasei
Lactobacillus paracasei
Lactobacillus paracasei
Lactobacillus paracasei
Lactobacillus paracasei
Lactobacillus paracasei
Lactobacillus paracasei
Lactobacillus paracasei
Lactobacillus paracasei
Lactobacillus paracasei
Lactobacillus paracasei
Lactobacillus paracasei
Lactobacillus paracasei
Lactobacillus paracasei
UCD174 | GCA 000309705 | clado A |
UW1 | GCA 000309725 | clado A |
UW4 | GCA 000309745 | clado A |
Lc-10 | GCA 000309765 | clado A |
Lpc-37 | GCA 000309785 | clado A |
W56 | GCA 000318035 | clado A |
UW4 | GCA 000376145 | clado A |
LcY | GCA 000388095 | clado A |
LcA | GCA 000400585 | clado A |
LOCK919 | GCA 000418515 | clado A |
5b | GCA 000474615 | clado A |
A2-362 | GCA 000510825 | clado A |
JCM 1134 | GCA 000615205 | clado B |
ATCC 393 | GCA 000829055 | clado B |
N87 | GCA 001013375 | clado B |
1316.rep1_LPAR | GCA 001062665 | clado A |
1316.rep2_LPAR | GCA 001062695 | clado A |
844LCAS | GCA 001066565 | clado A |
867LCAS | GCA 001066695 | clado B |
DSM 20011 | GCA 001433735 | clado A |
DPC6800 | GCA 001469115 | clado A |
Lc1542 | GCA 001540885 | clado A |
BM-LC14617 | GCA 001636215 | clado A |
Z11 | GCA 001885295 | clado A |
B900021 | GCA 001940585 | clado B |
ATCC 334 | GCA 000014525 | clado A |
362,5013889 | GCA 000155515 | clado A |
Lpp230 | GCA 000409815 | clado A |
Lpl7 | GCA 000409835 | clado A |
Lpp122 | GCA 000409855 | clado A |
Lpp46 | GCA 000409875 | clado A |
Lpp226 | GCA 000409895 | clado A |
Lpp120 | GCA 000409935 | clado A |
Lpp223 | GCA 000409955 | clado A |
Lpp228 | GCA 000409995 | clado A |
Lpp221 | GCA 000410015 | clado A |
Lpp49 | GCA 000410035 | clado A |
Lpp17 | GCA 000410135 | clado A |
Lpp22 | GCA 000410155 | clado A |
Lpp225 | GCA 000410175 | clado A |
Lpp219 | GCA 000410195 | clado A |
Lpp74 | GCA 000410235 | clado A |
Lpl14 | GCA 000410335 | clado A |
Lpp37 | GCA 000410415 | clado A |
Lpp43 | GCA 000410455 | clado A |
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Lactobacillus paracasei | Lpp125 | GCA 000410475 | ciado A |
Lactobacillus paracasei | COM0101 | GCA 000508845 | ciado A |
Lactobacillus paracasei | N1115 | GCA 000582665 | ciado A |
Lactobacillus paracasei | JCM 8130 | GCA 000829035 | ciado A |
Lactobacillus paracasei | DSM 20207 | GCA 000949485 | ciado A |
Lactobacillus paracasei | NRIC1917 | GCA 000958505 | ciado A |
Lactobacillus paracasei | NRIC0644 | GCA 000958525 | ciado A |
Lactobacillus paracasei | 275_LPAR | GCA 001076595 | ciado A |
Lactobacillus paracasei | 525_LPAR | GCA 001076935 | ciado A |
Lactobacillus paracasei | CAUH35 | GCA 001191565 | ciado A |
Lactobacillus paracasei | L9 | GCA 001244395 | ciado A |
Lactobacillus paracasei | DSM 5622 | GCA 001436385 | ciado A |
Lactobacillus paracasei | KL1 | GCA_001514415 | ciado A |
Lactobacillus paracasei | L9D | GCA 001858275 | ciado A |
Lactobacillus paracasei | LC-lkematsu | GCA 001895185 | ciado A |
Lactobacillus paracasei | RI-210 | GCA 001981715 | ciado A |
Lactobacillus paracasei | RI-194 | GCA 001982085 | ciado A |
Lactobacillus paracasei | RI-195 | GCA 001982095 | ciado A |
Lactobacillus rhamnosus | ATCC 53103 | GCA 000011045 | ciado C |
Lactobacillus rhamnosus | GG (ATCC 53103) | GCA 000026505 | ciado C |
Lactobacillus rhamnosus | Lc 705 | GCA 000026525 | ciado C |
Lactobacillus rhamnosus | HN001 | GCA 000173255 | ciado C |
Lactobacillus rhamnosus | CASL | GCA 000226235 | ciado C |
Lactobacillus rhamnosus | ATCC 8530 | GCA 000233755 | ciado C |
Lactobacillus rhamnosus | R0011 | GCA 000235785 | ciado C |
Lactobacillus rhamnosus | ATCC 21052 | GCA 000235865 | ciado C |
Lactobacillus rhamnosus | LRHMDP2 | GCA 000311945 | ciado C |
Lactobacillus rhamnosus | LRHMDP3 | GCA 000311965 | ciado C |
Lactobacillus rhamnosus | CRL1505 | GCA 000414365 | ciado C |
Lactobacillus rhamnosus | LGCK900 | GCA 000418475 | ciado C |
Lactobacillus rhamnosus | LOCK908 | GCA 000418495 | ciado C |
Lactobacillus rhamnosus | 2166 | GCA 000466865 | ciado C |
Lactobacillus rhamnosus | LR231 | GCA 000508405 | ciado C |
Lactobacillus rhamnosus | JCM 1136 | GCA 000615245 | ciado C |
Lactobacillus rhamnosus | 51B | GCA 000699985 | ciado C |
Lactobacillus rhamnosus | E800 | GCA 000712495 | ciado C |
Lactobacillus rhamnosus | PEL5 | GCA 000712505 | ciado C |
Lactobacillus rhamnosus | PEL6 | GCA 000712515 | ciado C |
Lactobacillus rhamnosus | K32 | GCA 000735255 | ciado C |
Lactobacillus rhamnosus | 24 | GCA 000743075 | ciado C |
Lactobacillus rhamnosus | L34 | GCA 000784375 | ciado C |
Lactobacillus rhamnosus | L35 | GCA 000784395 | ciado C |
Lactobacillus rhamnosus | L31 | GCA 000784405 | ciado C |
Lactobacillus rhamnosus | 116 | GCA 000801045 | ciado C |
Lactobacillus rhamnosus | 308 | GCA 000814485 | ciado C |
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Lactobacillus rhamnosus | CLS17 | GCA 000932035 | ciado C |
Lactobacillus rhamnosus | CNCM-l-3698 | GCA 001005625 | ciado C |
Lactobacillus rhamnosus | Lr108 | GCA 001044025 | ciado C |
Lactobacillus rhamnosus | 40f | GCA 001044405 | ciado C |
Lactobacillus rhamnosus | 313 | GCA 001044415 | ciado C |
Lactobacillus rhamnosus | 186_LRHA | GCA 001062885 | ciado C |
Lactobacillus rhamnosus | 214LRHA | GCA 001062955 | ciado C |
Lactobacillus rhamnosus | 526_LRHA | GCA 001063655 | ciado C |
Lactobacillus rhamnosus | 319_LRHA | GCA 001064515 | ciado C |
Lactobacillus rhamnosus | 541_LRHA | GCA 001065365 | ciado C |
Lactobacillus rhamnosus | 870_LRHA | GCA 001066715 | ciado C |
Lactobacillus rhamnosus | 699_LRHA | GCA 001066975 | ciado C |
Lactobacillus rhamnosus | 708_LRHA | GCA 001067025 | ciado C |
Lactobacillus rhamnosus | 769_LRHA | GCA 001067215 | ciado C |
Lactobacillus rhamnosus | 784 LRHA | GCA 001067335 | ciado C |
Lactobacillus rhamnosus | 893_LRHA | GCA 001067625 | ciado C |
Lactobacillus rhamnosus | 906_LRHA | GCA 001067885 | ciado C |
Lactobacillus rhamnosus | 979 LRHA | GCA 001068015 | ciado C |
Lactobacillus rhamnosus | 988_LRHA | GCA 001068045 | ciado C |
Lactobacillus rhamnosus | 943_LRHA | GCA 001068195 | ciado C |
Lactobacillus rhamnosus | 944 LRHA | GCA 001068215 | ciado C |
Lactobacillus rhamnosus | DSM 20021 | GCA 001435405 | ciado C |
Lactobacillus rhamnosus | ASCC 290 | GCA 001590655 | ciado C |
Lactobacillus rhamnosus | R19-3 | GCA 001645615 | ciado C |
Lactobacillus rhamnosus | Lrh8 | GCA 001656535 | ciado C |
Lactobacillus rhamnosus | Lrh32 | GCA 001656545 | ciado C |
Lactobacillus rhamnosus | Lrh31 | GCA 001656575 | ciado C |
Lactobacillus rhamnosus | Lrh26 | GCA 001656605 | ciado C |
Lactobacillus rhamnosus | Lrh23 | GCA 001656635 | ciado C |
Lactobacillus rhamnosus | Lrh22 | GCA 001656655 | ciado C |
Lactobacillus rhamnosus | Lrh20 | GCA 001656675 | ciado C |
Lactobacillus rhamnosus | Lrh19 | GCA 001656685 | ciado C |
Lactobacillus rhamnosus | Lrh15 | GCA 001656715 | ciado C |
Lactobacillus rhamnosus | Lrh11 | GCA 001656735 | ciado C |
Lactobacillus rhamnosus | Lrh34 | GCA 001656765 | ciado C |
Lactobacillus rhamnosus | Lrh9 | GCA 001656785 | ciado C |
Lactobacillus rhamnosus | Lrh7 | GCA 001656815 | ciado C |
Lactobacillus rhamnosus | Lrh6 | GCA 001656835 | ciado C |
Lactobacillus rhamnosus | Lrh5 | GCA 001656845 | ciado C |
Lactobacillus rhamnosus | Lrh4 | GCA 001656875 | ciado C |
Lactobacillus rhamnosus | Lrh30 | GCA 001656895 | ciado C |
Lactobacillus rhamnosus | Lrh28 | GCA 001656925 | ciado C |
Lactobacillus rhamnosus | Lrh27 | GCA 001656945 | ciado C |
Lactobacillus rhamnosus | Lrh25 | GCA 001656975 | ciado C |
Lactobacillus rhamnosus | Lrh21 | GCA 001656995 | ciado C |
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Lactobacillus rhamnosus | Lrh18 | GCA 001657055 | ciado C |
Lactobacillus rhamnosus | Lrh17 | GCA 001657075 | ciado C |
Lactobacillus rhamnosus | Lrh16 | GCA 001657085 | ciado C |
Lactobacillus rhamnosus | Lrh14 | GCA 001657115 | ciado C |
Lactobacillus rhamnosus | Lrh13 | GCA 001657135 | ciado C |
Lactobacillus rhamnosus | Lrh10 | GCA 001657165 | ciado C |
Lactobacillus rhamnosus | Lrh33 | GCA 001657195 | ciado C |
Lactobacillus rhamnosus | Lrh42 | GCA 001657205 | ciado C |
Lactobacillus rhamnosus | LRB | GCA 001721925 | ciado C |
Lactobacillus rhamnosus | HCT70 | GCA 001756565 | ciado C |
Lactobacillus rhamnosus | ASCC 3018 | GCA 001831215 | ciado C |
Lactobacillus rhamnosus | ASCC 3016 | GCA 001831225 | ciado C |
Lactobacillus rhamnosus | ASCC 3029 | GCA 001831235 | ciado C |
Lactobacillus rhamnosus | ASCC 1521 | GCA 001831275 | ciado C |
Lactobacillus rhamnosus | RI-004 | GCA 001981725 | ciado C |
Lactobacillus rhamnosus | AMC143 | GCA 001982425 | ciado C |
Lactobacillus rhamnosus | AMC010 | GCA 001982435 | ciado C |
Lactobacillus rhamnosus | BFE5264 | GCA 001988935 | ciado C |
Lactobacillus rhamnosus | L156.4 | GCA 001991035 | ciado C |
Lactobacillus rhamnosus | BPL5 | GCA 900070175 | ciado C |
Lactobacillus sp. | FMNP02 | GCA 000814185 | ciado B |
Lactobacillus sp. | HMSC17G08 | GCA 001807635 | ciado C |
Lactobacillus sp. | HMSC072E07 | GCA 001809485 | ciado C |
Lactobacillus sp. | HMSC068B07 | GCA 001809645 | ciado C |
Lactobacillus sp. | HMSC064F12 | GCA 001809765 | ciado C |
Lactobacillus sp. | HMSC077C11 | GCA 001809975 | ciado C |
Lactobacillus sp. | HMSC078F07 | GCA001810115 | ciado C |
Lactobacillus sp. | HMSC066G01 | GCA001812155 | ciado C |
Lactobacillus sp. | HMSC068F07 | GCA 001812525 | ciado B |
Lactobacillus sp. | HMSC061B07 | GCA 001812685 | ciado C |
Lactobacillus sp. | HMSC073B09 | GCA 001813825 | ciado C |
Lactobacillus sp. | HMSC075D02 | GCA 001814335 | ciado C |
Lactobacillus sp. | HMSC056D05 | GCA_001814405 | ciado C |
Lactobacillus sp. | HMSC073D04 | GCA 001815435 | ciado C |
Lactobacillus sp. | HMSC25A02 | GCA 001816065 | ciado A |
Lactobacillus zeae | KCTC 3804 | GCA 000260435 | ciado B |
Lactobacillus zeae | DSM 20178 | GCA 001433745 | ciado B |
Filogenia [0171] A fim de estudar a relação genética das montagens de genomas, construiu-se uma árvore filogenética de probabilidade máxima de alta qualidade do grupo L. casei usando 776 Cluster of Orthologous Groups (COGs). Esses COGs contêm genes com pelo
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47/52 menos 70% de identidade blastp e presença em 96% dos genomas estudados. Além disso, o genoma de Lactobacillus nasuensis JCM 17158 (GCA_001434705) foi adicionado ao alinhamento para servir como um grupo externo. Essa cepa foi escolhida porque tem a montagem de melhor qualidade dentre as três cepas que estão intimamente relacionadas ao grupo L. casei (Sun e outros, 2015). A árvore resultante é mostrada na Figura 8. A estrutura da árvore revela três ciados separados, com comprimentos de ramos muito pequenos dentro de cada ciado, em comparação com os comprimentos de ramos entre os ciados. O ciado A contém a maioria dos genomas de L. casei e todos os genomas de L. paracasei, bem como uma montagem L. sp. não classificada. O Ciado B contém os dois genomas de L. zeae, cinco genomas de L. casei (incluindo a cepa de L. casei do tipo ATCC 393), dois lactobacilos não classificados, e o novo isolado URT (L casei AMBR2). Curiosamente, todos esses membros também são aqueles com um teor elevado de G / C, como mostrado na Figura 18. Finalmente, o ciado C consiste em todos os genomas de L. rhamnosus, bem como os restantes 12 genomas de L. sp.
Comparação de genomas em pares [0172] Na era atual do sequenciamento de genoma completo, as métricas de comparação de genoma aos pares são frequentemente usadas como um método operacional para detectar os limites das espécies. Richter e Rosselló-Móra (2009) sugerem o uso da métrica de identidade nucleotídica média (ANI) para delimitação de espécies procarióticas, possivelmente em combinação com a métrica TETRA. A ANI é baseada no alinhamento em pares de quadros de leitura abertos ou fragmentos genômicos. A métrica TETRA é a correlação entre frequências de tetranucleotídeos em dois genomas.
[0173] A Figura 10 mostra as distâncias de ANIb (ANI calculada usando uma implementação blast) e TETRA entre todos os genomas do
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48/52 grupo L. casei. Os genomas são mostrados na mesma ordem que na árvore filogenética. Ambas as métricas de distância suportam o agrupamento dos genomas nos três ciados definidos pela árvore filogenética na Figura 17. Para delimitação de espécies, Richter e outros (2009) recomendam um valor de corte ANI de 95% a 96%, embora observe-se que valores de 94% a 95% em uma espécie também não são incomuns. Observa-se um valor mínimo de ANI de 96,05% no Ciado A, 93,64% no Ciado B e 96,26% no Ciado C, sugerindo que esses três ciados podem ser vistos como três espécies bacterianas separadas. Esta conclusão também é suportada por valores TETRA muito altos em cada ciado; 0,9941 ou superior no ciado A, 0,9872 ou superior no Ciado B e 0,9882 ou superior no Ciado C.
Teor genético [0174] Como descrito acima, o grupo L. casei consiste em 776 COGs core, que foram usados para construir a árvore filogenética. Além disso, identificou-se 16.636 COGs acessórios e um número médio de 2.786 genes por genoma.
[0175] Como o teor de G / C (Figura 18), a árvore filogenética (Figura 17) e os valores de ANI (Figura 19) suportam o agrupamento de três diferentes ciados, calculou-se o genoma core e acessório de cada ciado usando roary (Page e outros 2015). Ao comparar os ciados A, B e C, parece não haver grandes diferenças no número médio de genes por genoma (Tabela 3). No entanto, o ciado C parece ter um número elevado de genes core em comparação aos ciados A e B. O número de genes acessórios é menor para o Ciado B, que também tem o menor número de genomas. O ciado A tem o maior genoma acessório, enquanto o ciado C está representado mais abundantemente nestes dados.
Tabela 3 - Visão geral dos três ciados definidos pela árvore filogenética. Um gene core é definido como um gene presente em
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49/52 mais de 96% dos genomas.
Ciado | Número de genomas | Genes por genoma | Genes no genoma core | Genes no genoma acessório |
Grupo Casei | 184 | 2.786 ± 133 | 776 | 16.636 |
Ciado A | 70 | 2.744 ± 125 | 1.878 | 5.398 |
Ciado B | 10 | 2.708 ± 116 | 1.874 | 2.349 |
Ciado C | 104 | 2.667 ± 82 | 2.070 | 4.014 |
Capacidade funcional
Potencial respiratório [0176] Os resultados acima mostram que o novo isolado URT, L. casei LMG P-30039 (AMBR2), pertence ao ciado menor B do grupo L. casei. Curiosamente, todos os membros deste ciado mostram um teor de G / C elevado em comparação com o resto do grupo L. casei. Além do AMBR2, esse ciado contém os dois conjuntos de L. zeae, duas espécies não classificadas de Lactobacillus e cinco genomas de L. casei, incluindo a cepa de L. casei do tipo ATCC 393 e a cepa de L. casei N87 competente para a respiração (Zotta e outros, 2016).
[0177] Como L. casei LMG P-30039 (AMBR2) foi isolado do trato respiratório superior de uma pessoa saudável, o que não é um nicho típico de fermentação anaeróbia, e como as cepas competentes para respiração da cepa de L. casei N87 dentro do mesmo ciado, avaliou-se o potencial respiratório do ciado B juntos em relação aos demais membros do grupo L. casei. Portanto, triou-se os genomas quanto à presença do operon cydABCD, codificando o citocromo bd oxidase, a única oxidase terminal conhecida na cadeia de transferência de elétrons das bactérias do ácido lático (Pedersen e outros, 2012; lanniello e outros, 2015). Descobriu-se que esse operon está presente em todos os membros do grupo casei, sugerindo que todos estão geneticamente equipados com um mecanismo respiratório mínimo. Além deste
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50/52 componente principal da respiração, avaliou-se a presença de outros componentes acessórios da respiração (conforme descrito em Pedersen e outros, 2012). Com base em pesquisas de homologia, não conseguiu-se encontrar genes que codificam a captação de heme (operon fhuDBAR), efluxo de heme (operon hrtRBA e operon pefAB / pefRCD), degradação de heme (ortólogos yfeX) e biossíntese de menaquinona (operon menFDXBEC). No entanto, um ortólogo da alquil hidroperóxido redutase (AhpC) de Streptococcus agalactiae foi identificado em todos os genomas estudados, que se propõe ser uma proteína de ligação a heme, protegendo o heme intracelular da degradação (Pedersen e outros, 2012; Lechardeur e outros, 2011). Estes resultados indicam que L. casei AMBR2 é capaz de respiração, como todos os membros do grupo L. casei.
Resistência ao estresse oxidativo [0178] A respiração vem com um aumento no estresse oxidativo. Como todos os membros do grupo L. casei estão geneticamente equipados para respiração, avaliou-se se os diferentes ciados mostram diferentes mecanismos de estresse para lidar com o estresse oxidativo. [0179] Acredita-se que o antioxidante superóxido dismutase (SOD), que sequestra O2- em O2 e H2O2 está ausente no gênero Lactobacillus. Entretanto, recentemente, a análise do genoma revelou a presença de genes SOD em L. casei e L. sakei (Liu e outros, 2011; Zotta e outros, 2014). Portanto, rastreou-se todo 0 grupo case/em busca de genes SOD, revelando-os presentes apenas nas cepas do ciado A (69 de 70 genomas). Curiosamente, 0 mapeamento para quatro famílias diferentes de SOD Pfam (PF00080, PF00081, PF02777, PF09055) usando Hmmer, levou a duas correspondências diferentes, uma correspondência esperada com PF00081 representando 0 SOD de ferro / manganês (encontrado em 69 dos 70 genomas do ciado A) e uma correspondência inesperada com 0 SOD de cobre (4 dos 70 genomas
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51/52 do ciado A), que é o SOD mais comumente usado pelos eucariotas. Os SODs de cobre são todos anotados como proteínas hipotéticas e a inspeção usando um buscador de genoma mostrou que são encontrados em pequenos contigs, cercados por transposases.
[0180] A catalase, que catalisa a decomposição de H2O2 em H e O2, também desempenha um papel importante na proteção da célula contra 0 estresse oxidative. Embora 0 gênero Lactobacillus seja definido como catalase-negativo, estudos recentes mostraram atividade da catalase em várias cepas, incluindo a cepa de L. casei N87, competente para a respiração. Portanto, a presença de genes de catalase foi avaliada em todo 0 grupo casei. Curiosamente, os ORFs anotados como genes de catalase foram identificados apenas em cepas pertencentes ao ciado B, e em um único genoma do ciado C. Dois tipos diferentes foram encontrados, um anotado como heme-catalase (comprimento = 1461 bp) e 0 outro como uma catalase de manganês (comprimento = 807 pb). O gene heme-catalase foi encontrado em todas as 10 montagens de genomas do ciado B, enquanto 0 gene catalase de manganês estava presente em apenas 7 dos 10 genomas do ciado B.
[0181] Além disso, dois genes foram anotados como catalase em uma cepa de um ciado C (Lactobacillus rhamnosus CRL1505). Um dos dois ORFs mostrou uma notável alta similaridade de sequência com a primeira parte do gene heme-catalase identificada em todos os genomas do ciado B, enquanto 0 outro gene mostrou alta similaridade com a segunda parte do gene heme-catalase. A visualização em um buscador de genoma revelou que os dois genes estavam diretamente próximos um do outro, sugerindo que ele costumava ser um gene hemecatalase completo, mas foi dividido em duas sequências de codificação separadas devido a um deslocamento de quadros.
[0182] Genes adicionais relacionados ao estresse oxidative, como tioredoxina redutase, NADH peroxidase, foram encontrados em todos
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52/52 os genomas do grupo casei. MutT, uma 8-oxoG trifosfatase, também é encontrada em todas as montagens estudadas. Ela hidrolisa 8-oxoGTP, a forma oxidada de GTP, em 8-oxoGMP, evitando assim a incorporação incorreta de 8-oxoGTP no DNA durante a replicação (Veen e Tang, 2015), o que ajuda a reduzir mutações devido ao estresse oxidativo. Descobriu-se que todos os genomas contêm 1 cópia única do gene MutT, enquanto 7 de cada 10 membros do ciado B possuem 2 cópias diferentes. Curiosamente, esses sete membros são as mesmas montaagens que abrigam dois genes de catalase. Todos esses resultados sugerem que a presença de um gene da catalase é uma característica exclusiva do ciado B filogenético separado dentro do grupo casei, enquanto o SOD parece ser encontrado exclusivamente no ciado A.
Claims (18)
- REIVINDICAÇÕES1. Cepa bacteriana isolada da espécie Lactobacillus casei (L. casei), caracterizada pelo fato de que é depositada sob o número de acesso LMG P-30039.
- 2. Cepa bacteriana isolada da espécie Lactobacillus casei (L. casei), de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a dita cepa bacteriana isolada tem um teor de G / C do genoma completo de 48,02% e abriga um ou mais genes de catalase.
- 3. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende uma cepa bacteriana isolada da espécie Lactobacillus casei, como definida na reivindicação 1 ou 2.
- 4. Cepa bacteriana isolada, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, ou a composição de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de ser para uso no tratamento e/ou prevenção de infecções ou doenças imunorrelacionadas.
- 5. Cepa bacteriana isolada ou composição para uso, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que as ditas infecções são infecções oronasofaríngeas, infecções de pele, infecções urogenitais, infecções gastrointestinais ou mastite.
- 6. Cepa bacteriana isolada ou composição, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que as doenças alérgicas são selecionadas a partir do grupo que consiste em febre do feno, rinite alérgica, sinusite alérgica, asma e similares.
- 7. Uso da cepa bacteriana isolada, como definida na reivindicação 1 ou 2, ou da composição como definida na reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que é como um adjuvante para promover uma resposta imune durante a vacinação.
- 8. Uso da cepa bacteriana isolada, como definida na reivindicação 1 ou 2, ou uso da composição como definida na reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que na indústria de higiene pessoal,Petição 870190094581, de 20/09/2019, pág. 89/962/3 indústria de limpeza ou purificação de ar.
- 9. Uso da cepa bacteriana isolada, como definida na reivindicação 1 ou 2, ou uso da composição como definida na reivindicação 3, caracterizado pelo fato de ser na produção de biomassa.
- 10. Uso da cepa bacteriana isolada, como definida na reivindicação 1 ou 2, ou uso da composição como definida na reivindicação 3, caracterizado pelo fato de ser na indústria alimentar.
- 11. Uso de uma espécie de L. casei com um teor de G / C no genoma completo de pelo menos 47,5%, caracterizado pelo fato fato de que abriga um ou mais genes de catalase e tendo fímbrias com comprimento médio de pelo menos 0,4 pm, na indústria de higiene pessoal, indústria de limpeza ou purificação de ar.
- 12. Uso de uma composição, caracterizado pelo fato de que compreende uma ou mais espécies de L. casei com um teor de G / C no genoma completo de pelo menos 47,5%, abrigando um ou mais genes de catalase e tendo fímbrias com um comprimento médio de pelo menos 0,4 pm, na indústria de higiene pessoal, indústria de limpeza ou purificação de ar.
- 13. Uso de uma espécie de L. casei com um teor de G / C, no genoma completo de pelo menos 47,5%, caracterizado pelo fato fato de que abriga um ou mais genes de catalase e tendo fímbrias com um comprimento médio de pelo menos 0,4 pm, na produção de biomassa.
- 14. Uso de uma composição, caracterizado pelo fato fato de que compreende uma ou mais espécies de L. casei com um teor de G / C no genoma completo de pelo menos 47,5%, abrigando um ou mais genes de catalase e tendo fímbrias com um comprimento médio de pelo menos 0,4 pm na produção de biomassa.
- 15. Uso de uma espécie de L. casei com um teor de G / C no genoma completo de pelo menos 47,5%, caracterizado pelo fato fato de que abriga um ou mais genes de catalase e tendo fímbrias com umPetição 870190094581, de 20/09/2019, pág. 90/963/3 comprimento médio de pelo menos 0,4 pm, na indústria de alimentos.
- 16. Uso de uma composição, caracterizado pelo fato fato de que compreende uma ou mais espécies de L. casei com um teor de G / C no genoma completo de pelo menos 47,5%, abrigando um ou mais genes de catalase e tendo fímbrias com comprimento médio de pelo menos 0,4 pm na indústria de alimentos.
- 17. Uso de uma espécie de L. casei, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11, 13 ou 15, ou uso de uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 12, 14 ou 16, caracterizado pelo fato fato de que um ou mais genes de catalase são selecionados a partir do grupo que consiste em heme-catalase e catalase de manganês.
- 18. Uso de uma espécie de L. casei, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11, 13 ou 15, ou uso de uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 12, 14 ou 16, caracterizado pelo fato fato de que a dita espécie tem um genoma com uma identidade nucleotídica média com a sequência genômica da cepa de L. casei ATCC 393 de pelo menos 93%.
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