JP4829349B2 - 微生物阻害組成物を含む衛生用テッシュ - Google Patents
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Description
本発明の文脈におけるプロバイオティクス/プロバイオティクスは、適切な量で宿主に投与された場合に健康上の利益をもたらす生きている微生物に関する。
本発明の目的は、皮膚及び泌尿生殖領域の拭き取り、クリーニング及びケアに好適な衛生用テッシュを提供し、同時に該皮膚に転送される微生物阻害阻害物を放出することである。
前記添加剤は、細胞外産物に対して、典型的には最終濃度5-100 mMで添加される。
衛生用テッシュがさらにプロバイオティクス細菌を含む場合、これらは、典型的には衛生用テッシュ1個当たり生存プロバイオティクス細菌が約106〜1011CFUという量で提供される。典型的には細菌は、細胞または胞子の形をとり、これが懸濁液として提供される。しかし、これらの量は、特定の用途、製品の製剤及び意図する用途に応じて変化し得る。
(試験1)
この試験の目的は、選択された添加剤がカンジダアルビカンスの成長に影響を及ぼすか否か、また添加剤をラクトバチルスプランタルムLB 931の細胞外産物に添加したときに改善された成長阻害を実現することができるか否かを決定することである。この試験で使用した添加剤は、アスコルビン酸、クエン酸、フェニルアラニン、酢酸、プロピオン酸、およびプロピオン酸ナトリウムであった。
(酵母株)
カンジダアルビカンスの臨床単離株(C.アルビカンス702と示す)を、試験株として使用した。膣カンジダ症に罹っている女性の膣から単離した。
対照として、純粋なdMRSブロス(酢酸ナトリウムを添加しないMRSブロス)を使用した。指定された体積を、マイクロタイタープレートのウェルに移し、空気乾燥した(45℃、最短で20時間)。
dMRSブロス中で成長させたLB 931の培養物を、遠心分離して細胞をペレットにし、LB 931細胞外産物を含むLB 931上清を得るために、0.22μmフィルタ(Milliporeフィルタ、Bedford、USA)を使用して滅菌濾過した。指定された体積の滅菌濾過済み上清を、マイクロタイタープレートのウェルに移し、空気乾燥し(45℃、最短で20時間)、その後、滅菌蒸留水に再懸濁して3倍の濃度にし、200μlを96ウェルマイクロタイタープレートに移した。
LB 931の滅菌濾過済み上清が入っている管に、添加剤を添加して50mMの最終濃度にした。指定された体積をマイクロタイタープレートのウェルに移し、空気乾燥し(45℃、最短で20時間)、その後、滅菌蒸留水に再懸濁して3倍の濃度にし(すなわち、滅菌蒸留水の体積は、空気乾燥前の指定体積の約3分の1である)、200μlを96ウェルマイクロタイタープレートに移した。
最終濃度が50mMになるように、添加剤をdMRSブロスに添加した。pHを、それぞれの添加剤ごとに添加剤を加えた細胞外産物の場合と同じpH値に調節した。指定された体積をマイクロタイタープレートのウェルに移し、空気乾燥し(45℃、最短で20時間)、その後、滅菌蒸留水に再懸濁して3倍の濃度にし、200μlを96ウェルマイクロタイタープレートに移した。
図1に見られるように、ごく僅かな添加剤そのものが、カンジダの成長に効果があることが判明したが、そのpHは非常に低かった。LB 931の細胞外産物は、カンジダの阻害に効果的であった。この効果は、LB 931の細胞外産物に添加剤を加えることによって、驚くほど高められた。LB 931の細胞外産物と組み合わせた全ての添加剤では、非常に良好な成長阻害効果が発揮された。最良の効果は、プロピオン酸をLB 931の細胞外産物に添加したときに発揮された(全く成長しなかった)。
これらの試験の目的は、選択された添加剤が細菌の成長に影響を及ぼすか否か、またラクトバチルスプランタルムLB 931の細胞外産物に添加したときに、改善された成長阻害を実現することができるか否かを決定することであった。この試験で使用された添加剤は、酢酸ナトリウム、コハク酸、プロピオン酸ナトリウム、酢酸であった。
(細菌株)
大腸菌(E.coli 1と示す)およびスタフィロコッカスサプロフィティカス(S.saprophyticus 1)の臨床単離株を、試験株として使用した。これらは、尿路感染症に罹っている女性の生殖管から単離した。
対照として、純粋なdM17ブロス(MnSO4(最終濃度0.04g/l)、MgSO4(最終濃度0.2g/l)、およびグルコース(最終濃度20g/l)の添加によって変性させたM17ブロス)を使用した。200μlを、96ウェルマイクロタイタープレートに添加した。
LB 931細胞外産物を含むLB 931上清を得るために、dM17ブロス中で成長させたLB 931の培養物を遠心分離して、細胞をペレットにし、0.22μmフィルタ(Milliporeフィルタ、Bedford、USA)を使用して滅菌濾過した。200μlを、96ウェルマイクロタイタープレートに移した。
LB 931の滅菌濾過済み懸濁液が入っている管に、最終濃度が50mMになるように添加剤を添加した。200μlを96ウェルマイクロタイタープレートに移した。
添加剤を、最終濃度が50mMになるようにdM17ブロスに添加した。200μlを、96ウェルマイクロタイタープレートに添加した。
図2Aからわかるように、試験がなされた添加剤単独でE.coliの成長に影響を及ぼすものは無いことが判明した。LB 931の細胞外産物は、E.coliの阻害に効果的であった。この効果は、LB 931の細胞外産物に添加剤を加えることによって、驚くほど高められた。LB 931の細胞外産物と組み合わせた全ての添加剤で、非常に良好な成長阻害効果が発揮された。
この試験の目的は、ラクトバチルスファーメンタムEss-1の細胞外産物と、添加剤であるアスコルビン酸またはプロピオン酸とを組み合わせたときの、カンジダアルビカンスの阻害の亢進について評価することであった。
Ess-1を、dMRSブロス(酢酸ナトリウムを添加しないMRSブロス)中で静止期まで成長させた。細菌培養物を遠心分離して、細胞をペレットにし、0.22μmフィルタ(Milliporeフィルタ、Bedford、USA)を使用して滅菌濾過し、それによって細胞外産物を含む上清を得た。プロピオン酸およびアスコルビン酸を、最終濃度が50mMになるように、細胞外産物が入っている管に添加した。濾液を、それぞれの酸のpKa値まで(アスコルビン酸は4.2、プロピオン酸は4.87)pH調節し、200μlを96ウェルマイクロタイタープレートのウェルに移した。C.アルビカンスを、最終濃度が約5×104CFUml-1になるように、各ウェルに添加した。プレートを37℃で20時間インキュベートし、その成長について、計算した平均値を示している濁度の目視観察に基づいた5から0のスケール上で、テンプレートを使用して2名が評価し段階分けした。純粋なdMRSブロス中で強力に成長したカンジダを含有するウェルを、5に段階分けし、一方、成長が目視されなかったウェルを0に段階分けした。
図3Aおよび3Bからそれぞれわかるように、Ess-1からの上清をアスコルビン酸またはプロピオン酸のどちらかと組み合わせたときに、予期せぬ阻害の増大が得られた。
この試験の目的は、ラクトバチルスプランタルムLB 931の細胞成長と組み合わせた、酢酸Naからのカンジダ阻害の亢進について評価することであった。
2つのプレートをM17寒天で作製し、2つをMRS寒天で作製した。MRS培地(De Man、Rogosa、およびSharpeによって開発された)は、ラクトバチルスに一般に使用されている成長培地である。Merckから得たMRS寒天は、寒天1リットル当たり酢酸ナトリウムを5g含有する。M17(Oxoid)は、同様のラクトバチルス用の市販の基質であるが、酢酸ナトリウムは添加していない。これらの寒天は、パッケージ上に、記述されるように調製した。
ゾーンのサイズを表1に見ることができる。
Ess-1の単離および類別
この研究の最初の目的は、他のラクトバチルス株に比べてかなりの程度までカンジダアルビカンスおよびカンジダグラブラタ(Candida glabrata)の成長を阻害するラクトバチルス株を、単離し類別することである。
(酵母株)
カンジダアルビカンスおよびカンジダグラブラタの臨床単離株を、試験株として使用した。これらを、膣カンジダ症に罹っている女性の膣から、および健康な女性から単離した。
ヒトの皮膚、喉、歯、乳児の便、野菜、および種子由来の、約140のラクトバチルス株を、MRSブロスで培養し、MRS寒天プレート上にスタンプした。この寒天プレートを、37℃の嫌気性条件下でインキュベートした。さらにSAB(Sabouraud)寒天(LAB M、Bury、UK)をMRS寒天上に注ぎ、凝結させた。C.アルビカンス培養物を寒天上に播き、プレートを、37℃で好気的にインキュベートした。阻害の視覚的評価を行った。参照株であるラクトバチルスプランタルムLB 931に等しくまたはそれよりも大量にC.アルビカンスを阻害する株を選択し、さらなるスクリーニング(スクリーニング2)にかけた。
dMRSブロス(酢酸ナトリウムが添加されないMRS)で成長したラクトバチルスの懸濁液を、遠心分離し、滅菌濾過した。濾液を、以後、ラクトバチルス無細胞濾液、LCFと呼ぶ。指定された体積をマイクロタイタープレートのウェルに移し、空気乾燥させ、その後、滅菌蒸留水に再懸濁して3倍の濃度にし、96ウェルマイクロタイタープレートに移した。カンジダを、全てのバイアルに添加した(それぞれC.アルビカンスおよびC.グラブラタの3つの単離株を使用した)。阻害を、濁度の目視観察によって評価し、5から0のスケールでテンプレートを使用して、2名により段階分けした。純粋なdMRSブロスで強力に成長したカンジダ種を含有するウェルを、5に段階分けし、一方、成長が目視されなかったものを0に段階分けした。
種のレベルの同定を、API 50 CHLシステム(bioMerieux、フランス)を使用して、製造業者の取扱い説明書に従って行った。発酵試験から得たデータを、API Lab Plusソフトウェアを使用して分析した。遺伝子型類別は、16S rRNAの部分配列決定分析により、DSMZ(Deutsche Sammlung von Microorganismen und Zellkulturen GmbH)によって行った。
全ての株を、スクリーニング1でのC.アルビカンスに対する成長阻害能力に応じて評価した。LB 931の場合に匹敵しまたはそれを超える結果を有する23のラクトバチルス株を、スクリーニング2用に選択した。それらの23のラクトバチルス株の中で、3つは参照株であり、大多数の株は口道から単離したものであった。
株Ess-1(DSM 17851)から得た16S rDNAを、PCR増幅16S rDNAの約450ヌクレオチドの直接的な配列決定によって、DSMZ(Deutsche Sammlung von Microorganismen und Zellkulturen GmbH)により分析した。ゲノムDNA抽出、16S rDNAのPCR媒介型増幅、およびPCR産物の精製を、前述のように実施した(Rainey,F.A.他、Int. J. Sys. Bacteriol. 1996 (46): 1088〜1092)。精製したPCR産物について、CEQ(商標)DTCS-Quickstart Kit (Beckamn Coulter)を使用し、製造業者の取扱い説明書に従って配列決定した。配列反応産物を、CEQ(商標)8000遺伝子分析システムを使用して電気泳動させた。
プロバイオティクスラクトバチルスの産生
実験室規模において: ex. MRSブロスが入っている滅菌容器に、所望のラクトバチルス株の純粋な接種物を接種する。細菌を含むブロスを、好ましくは5%CO2の雰囲気と共に、37℃で一晩インキュベートする。次いで細胞を、遠心分離および滅菌生理食塩液を使用して洗浄してよい。保護糖、デンプン、またはタンパク質を添加し、細胞集団を凍結乾燥し、ミリング処理してよい。
例えばラクトバチルスから得た細胞外産物の生成
実験室規模では、プロバイオティクス株を一晩培養したものを、実施例2のように生成する。濾過または遠心分離の後、上清を収集する。上清は、蒸発によって濃縮してもよく、または例えば乾燥空気中での対流乾燥、凍結乾燥、または噴霧乾燥によって、完全に乾燥してもよい。
配合物
生殖衛生の改善のための衛生用テッシュ
Ess-1及びLB931の両方由来の上清の形態での細胞外産物を伴った、LB931細胞とEss-1細胞の一晩の培養物を酢酸と混合させて最終濃度を50 mMにした。pHを4.9に調節した。混合物をトレハロースで凍結乾燥させて細粒の粉末が形成されるまで細かくした。この粉末10グラムを120 mlのオリーブオイル(Filippo BERIO extra virgin olive oil)に添加し、均一の溶液が形成されるまで撹拌した。オリーブオイルをさらに80 mlのアリコートで添加し、最終量200 mlの溶液を約2分間ボルテックスした。細菌懸濁液を室温で3時間保持し、その間1時間に2回撹拌した。組織用シート(Spun Lace Dupont)を6 x 8 cm の四角形に切り出して無菌のステンレス製スチールのトレイに設置した。各組織用シート上に、4 mlの細菌懸濁液を、組織を覆うように滴下した。組織用シートを中央で折り畳み、ついで長い側から中央に再び折り畳んで、端が溶接されている
フォイルバッグ中にパックした。
図4−図6の8 微生物阻害組成物
Claims (10)
- 微生物阻害組成物(8)を含む、おしぼり、ペーパータオル、洗面タオル、パッチ、ウェットティッシュ、ナプキンなどの衛生用テッシュ(1)であって、前記微生物阻害組成物(8)が、少なくとも1種のプロバイオティクス細菌の細胞外産物、ならびに有機酸および/またはそれの塩の形態で、5.5を超えないpKa値を有する少なくとも1種の添加剤を含み、前記細胞外産物が、前記少なくとも1種のプロバイオティクス細菌の培養物の濾過または遠心分離によって得られる上清の形をとる、衛生用テッシュ。
- 前記pKa値が5を超えない、請求項1に記載の衛生用テッシュ。
- 前記微生物阻害組成物(8)が、乳酸産生細菌を実質的に含まず、好ましくは100 CFU/mlよりも高い量で存在せず、より好ましくは10 CFU/mlよりも高くない、請求項1または2に記載の衛生用テッシュ。
- 前記微生物阻害組成物(8)がさらにプロバイオティクス細菌を含む、請求項1または2に記載の衛生用テッシュ。
- 前記プロバイオティクス細菌が乳酸産生細菌である、請求項1、2及び4のいずれか一項に記載の衛生用テッシュ。
- 前記乳酸産生細菌が、ラクトバチルスプランタルムLB 931またはラクトバチルスファーメンタムEss-1またはこれらの組合せである、請求項5に記載の衛生用テッシュ。
- 前記添加剤が、酢酸、プロピオン酸、乳酸、アスコルビン酸、フェニルアラニン、クエン酸、酪酸、吉草酸、カプロン酸、コハク酸および/またはこれらの塩から選択され、好ましくは前記添加剤が、酢酸、プロピオン酸、乳酸、アスコルビン酸、フェニルアラニン、クエン酸、またはコハク酸および/またはこれらの塩から選択され、最も好ましくは前記添加剤が、アスコルビン酸、酢酸、プロピオン酸、コハク酸および/またはこれらの塩から選択される、請求項1から6のいずれか一項に記載の衛生用テッシュ。
- 前記塩がナトリウム塩であり、好ましくはプロピオン酸ナトリウムまたは酢酸ナトリウムである、請求項7に記載の衛生用テッシュ。
- 衛生用テッシュ(1)と組み合わせた、請求項1から8のいずれか一項に記載の微生物阻害組成物の使用。
- 前記微生物阻害組成物(8)を前記衛生用テッシュ(1)に適用させる工程を含む、請求項1から8のいずれか一項に記載の衛生用テッシュの製造方法。
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