SE519648C2 - Ny stam av Lactobacillus plantarum - Google Patents

Description

519 648 medicinering, försämrad personlig hygien, eller förändringar ihndens mikroflora eller slemhinnor. Den normala floran i vagina domineras av LB och omgivande pI-I är lägre än 4,5. J äst och entobakterier har liten förekomst eller saknas (Redondo- Lopez et al., Rev. Inf. Dis. 1987; l2:856-872). Förändringar i den vaginala bakterie- floran kan påträffas i samband med olika patogena tillstånd. Det finns en ökad mängd enterobakterier i vagina och uretralöppningen hos kvinnor som lider av åter- kommande urinvägsinfektioner och de har även en urogenital flora som i princip saknar laktobaciller (Marrie et al. J. Clin. Microbiol. 1976, 8, 67-72). Det är även känt att infektionsfrekvensen ökar i samband med antibiotikabehandling av andra infektioner (Starney, Rev. Inf. Dis. l987:9 (suppl. 2): 195-208; Reid et al., Curr.

Opin. Inf. Dis. 1991; 4:3 7-41). Vidare har det visats att bam som tidigare upplevt upprepad antibiotikabehandling är mera benägna att drabbas av urinvägsinfektioner (Mårild et al., Ped. Inf. Dis. 1990; 22:43-47).

I bakteriell vaginos är mängden LB minskad och pH-värdet har ökat. Det finns även en dominans av Bacterioides-arter, Gardnerella vaginalis och Mobiluncus (Redon- do-Lopez, supra). Vaginit, vilket har samband med en ökad mängd enterobakterier, utgör ofta ett påtagligt problem i samband med antibiotikabehandling. Normal oral administrering av penicillin resulterar i ansamling av substansen i vaginal vätska (Sjöberg et al., Obstet. Gynecol. 1990; 75: 18-21) följt av kolonisering av entero- bakterier och jäst (Sjöberg et al., Gynecol. Obstet. Invest. 1992; 33142-46). Under- sökningar hos apor (Macacafascicularis) har avslöjat att vaginal administrering av amoxicillin försämrar förmågan hos den normala bakteriefloran att inhibera koloni- sering av en patogen bakterie i urinvägsornrådet, nämligen E. coli (Herthelius et al., Infection 1988; 161263-266).

Vid graviditet kan kompositionen hos den vaginala floran påverka morbiditeten hos fostret och bamet. Förekomsten av grupp B-streptokocker (GBS) i den fekala och vaginala floran är vanlig (upp till 30% hos alla gravida kvinnor). Dessa bakterier ut- gör normalt inte något hot mot kvinnans hälsa. Emellertid kan GBS förorsaka all- varliga infektioner hos det nyfödda bamet. I dessa fall överförs bakterier vertikalt 10 15 20 25 30 519 648 från moder till bam före eller i samband med födelsen. Andra bakterier kan även överföras denna väg och förorsaka infektion hos barnet. Det finns även ett starkt samband mellan bakteriell vaginos och för tidig födsel (Martins et al., Arch. Gyne- col. Obstet. 1990; 247: 1-13). Mekanismema bakom detta fenomen är inte kända.

Det har visats att en förändring av den vaginala floran mot dominans av gramnegati- va arter ökar mängden av enzymet fosfolipas A2, vilket i sin tur kan initiera pro- staglandinsyntes med utgångspunkt från arakidonsyra (Bejar et al., Obstet. Gynecol. 1981; 571479-482). Vaginosfloran producerar även stora mängder endotoxin (Sjö- berg et al., Obstet. Gynecol. 1991; 771265-266) vilket kan framkalla endogen pro- staglandinsyntes (Romero et al., Obstet. Gynecol. 1989; 7331-34), möjligen under påverkan av interleukiner.

De teoretiskt positiva egenskapema hos LB har motiverat deras användning i kom- mersiella preparationer med den avsedda användningen att komplettera och stärka den vaginala floran. Framgången har varierat och ofta innehåller de tillgängliga pre- parationema väsentligen lägre mängder LB än vad som angetts. Några preparationer har även kontaminerats (Hughes et al., Obstet. Gynecol., 1990; 75(2):244-248). För att komplementera och förbättra den normala bakteriefloran i den urogenitala regio- nen genom tillsats av LB, är det nödvändigt att noga välja de bakteriestammar som skall användas. En LB-stam som lämpar sig för detta ändamål bör uppfylla följande kriterier: 1. LB-stammen bör producera stora mängder lösliga substanser med tillväxtinhibe- rande förmåga på enterobakterier, grupp B-streptokocker, stafylokocker och jäst- svampar. 2. LB-stammen bör ha förmåga att överföras till huden och slemhinneytor i den urogenitala regionen. 3. LB-stammen bör ha förmåga att vidhäfta till epitelytor i den urogenitala regionen. 4. LB-stammen bör ha förmåga att uthärda lagring under en lång tidsperiod, och det måste vara möjligt att införa stammen i olika slags preparationer. 10 15 20 25 30 519 648 4 5. LB-stamrnen bör ha förmåga att bibehålla sin viabilitet och sina egenskaper i en artikel eller preparation vid användning. 6. LB-stammen bör inte vara känslig för sperrnacidala preparationer innehållande nonoxynol-9. 7. LB-stammen bör isoleras från den urogenitala regionen hos kvinnan. 8. LB-stammen bör möjliggöra existens av den humana urogenitala LB-floran.

Följaktligen, finns det ett behov av stammar som uppfyller dessa krav.

Sammandrag av uppfinningen En ny stam av Lactobacillus plantarum, benämnd LB93 1, har isolerats, och denna uppfyller de krav som räknats upp ovan. Stammen har deponerats vid Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, Braunschweig, DE. Den har tilldelats registre- ringsnummer DSMI 1918. Följaktligen kan LB93 I användas för att behandla och/eller förebygga urogenitala infektioner. LB93 1 kan med fördel ingå i farmako- logiska kompositioner och i produkter för personlig hygien, såsom blöjor och bin- dor.

Definitioner Den här använda termen ”LB” hänför sig till bakterier av släktet Lactobacillus.

Den här använda termen ”urogenital region” hänför sig till perineum, urinröret och vagina.

Den här använda termen ”absorberande artikel” hänför sig till produkter som lämpar sig för absorption av en kroppsvätska, såsom blod eller urin. Exempel på sådana ar- tiklar är hygienprodukter för kvinnor, inkontinensskydd, och blöjor.

Den här använda termen ”GBS” hänför sig till grupp B-streptokocker. 10 15 20 25 30 519 648 Den här använda termen ”mjölksyrabakterier” hänför sig till bakterier som fram- ställer mjölksyra, såsom bakterier tillhörande släktena Lactobacillus och Lactococ- CMS.

Den här använda termen ”cfu” hänför sig till kolonibildande enheter.

Detalierad beskrivning av uppfinningen Denna uppfinning hänför sig till en ny stam av Lactobacillus plantarum, benämnd LB93l (DSMI 1918). Denna bakteriestam är värdefull i samband med förebyggande och/eller behandling av urogenitala infektioner då den inhiberar tillväxt för ett stort antal patogena mikroorganismer. Stammen är uthållig och överlever enkelt långa pe- rioder av lagring vid rumstemperatur. Följaktligen har produkter innehållande LB93l en lång hållbarhetstid. Starnmen kan enkelt överföras till mänsklig hud och vaginalt epitel. LB93l är motståndskraftigt mot terapeutiska koncentrationer av någ- ra antibiotiska substanser och spennacidala föreningar. lnhibitionsegenskapen hos LB93l har undersökts. Exempel på bakteriearter som framgångsrikt inhiberas är Escherichia, Klebsiella, Proteus, Staphylococcus och Streptococcus från grupp B. LB93l är således användbar för att förebygga och/eller behandla infektioner som förorsakas av dessa mikroorganismer.

Som noterats ovan tillhandahåller denna uppfinning även ett antal farrnakologiska kompositioner, som företrädesvis lämpar sig för topisk administrering, och som in- nehåller LB93l tillsammans med fannakologiskt eller fysiologiskt godtagbara bära- re, fyllmedel och/eller utspädningsmedel. I allmänhet bör sådana bärare vara icke- toxiska för mottagarna med utnyttjade doseringsnivåer och koncentrationer. Normalt omfattar framställning av sådana kompositioner kombination av det terapeutiska medlet med buffertsubstanser, förtjockningsmedel eller gelbildande medel såsom glycerin, polyetylenglykol, etc. Antioxidanter såsom askorbinsyra, polypeptider med 10 15 20 25 30 519 648 6 låg molekylvikt (mindre än omkring 10 aminosyrarester), proteiner, kolhydrater in- klusive glukos, sukros och dextriner, och andra stabiliseringsmedel och fylhnedel kan ingå. Möjliga farmakologiska kompositioner är salvor, krämer, flytande lös- ningar, stolpiller eller kapslar.

Denna uppfinning hänför sig även till absorberande artiklar innehållande LB931. En sådan artikel kan innefatta ett perrneabelt yttre skikt vilket är avsett att stå i nära kontakt med bärarens hud, ett företrädesvis vätskeogenomträngligt bakre skikt vilket är avsett att ligga distalt från bäraren vid användning, och en absorberande struktur som placerats mellan det yttre skiktet och det bakre skiktet. I en del fall kan ytterli- gare ett skikt i fonn av exempelvis vadd eller liknande material placeras mellan det yttre skiktet och den absorberande strukturen. De mikroorganismer som uppvisar antagonistiska egenskaper kan placeras i olika delar av den absorberande artikeln, exempelvis i det yttre skiktet, i den absorberande strukturen hos den absorberande artikeln, mellan två av skikten i den absorberande artikeln, i en separat insättnings- produkt i den absorberande artikeln, eller på något annat sätt.

Denna uppfinning kommer nu att beskrivas med hänvisning till bifogade figurer i vilka: Fig. l är ett diagram som visar stabiliteten hos frystorkad LB93 lvid rumstemperatur (+22°C) och vid +6°C; Fig. 2 är ett diagram som visar stabiliteten hos LB93 I som impregnerats i en absor- berande artikel; Fig. 3 och 4 avslöjar mängden LB93l som överförts till urinrörsöppningen och hu- den i perineum hos unga flickor efter att ha använt ett trosskydd innehållande LB93 l. 10 15 20 25 30 519 648 Denna uppfinning kommer nu att beskrivas med hänvisning till följande exempel.

Exempel 1: Isolering och tvpbestämning av Lactobacillus plantarum, stam LB931 Bakterieprover togs från friska kvinnor. Från dessa prover isolerades bakteriestam- mar och dessa stammar sållades med hänsyn till deras förmåga att inhibera tillväxt av enterobakterier (data visas inte). Den bästa stammen, vilken isolerats från en frisk gravid kvinna, klassificerades som Lactobacillus plantarum enligt testsatsen API 50 CH (API systems, BioMerieux, FR), och benämndes LB931. Stammen typ- bestämdes vidare genom DNA-analys med SDS-page vid BCCM/LMG (Belgien) att vara Lactobacillus plantarum-pentosus-paraplantarum.

Exempel 2: Inhiberingskapacitet hos stam LB931 Ändamålet med detta experiment var att illustrera fönnågan hos stam LB931 att in- hibera tillväxt av andra bakterier. LB931 odlades i MRS-buljong (Merck, DE) vid en temperatur av 37°C i 5% C02 över natten. 1 ml, vilken innehöll 108 bakterier, sattes till 25 ml smält 2% agar i MRS-buljong. Blandningen hälldes i Petri-skålen, och tilläts bilda gel och inkuberades såsom beskrivits ovan under 24 timmar. En an- nan portion på 25 ml M17-agar (Merck, DE) hälldes ovanpå det första skiktet och plattoma fick stå vid rumstemperatur under 4 timmar. Liknande agarplattor utan LB931 framställdes också och användes som kontrollplattor.

Indikatorbakterien odlades separati TY-medium (Holm et al., APMIS 1967; 69, 264) vid 37°C i luft. Odlingama överfördes till en Beitani-bricka med 25 rum, där varje rum innehöll 0,25 ml (106 bakterier/ml). Från var och en av dessa brickor överfördes bakteriema och stämplades på agarplattorna innehållande lactobacillema, genom att använda Steers stålnålsreplikator (Steers et al., J. Antibiot. Chemother. 1979, 9, 307). Plattoma inkuberades vid 37°C över natten. Plattoma avlästes och det fastställes huruvida a) indikatorbakteriema hade växt; b) tillväxten hos indikator- 519 648 bakterierna hade inhiberats; eller c) ingen tillväxt av indikatorbakteriema hade skett. pH hos var och en av plattorna följdes också.

Resultaten av interferenstestema visas i Tabell I.

Tabell I lnhibering Art av indikatorbakterie % Ingen/total Koagulasnegativa 90 9/ 10 stafylokocker Streptococcus typ B 100 19/19 Lactobacillus sp. 7 1/14 Klebsiella sp. 100 50/50 E. coli 100 50/50 Proteus sp. 100 50/50 Resultaten visar att Lactobacillus plantarum, LB931 inhiberar eller förhindrar till- växt av ett stort antal baktefiestammar, och att andra Lactobacillus-stammar för det mesta är opåverkade.

Exempel 3: Överlevnadsfönnågan hos LB931 i olika preparationer: a) LB931 löst i en suspension av lika delar skummjölk och 0,9% NaCl LB931 löstes i skummjölk innehållade 0,9% NaCl. De lösta bakteriema inkuberades därefter vid olika temperaturer. Mängden bakterier följdes kontinuerligt genom cell- räkning. Resultaten avslöjas i Tabell Il nedan. 10 15 519 648 Resultaten visar att LB93l är stabil i en blandning av skummjölk och NaCl under en tidsperiod av l månad vid +4°C. b) En skummjäölkspreparation av LB93l frystorkades enligt standardförfaranden.

Det erhållna pulvret lagrades i Petri-skålar vid rumstemperatur och vid 6°C. Antalet bakterier bestämdes efter 7 dygn resp. 25 dygn. Resultaten avslöjas i Tabell III ned- all.

Tabell 111 Antal bakterier (CFU) Temperatur (°C) Dag 0 Dag 7 Dag 25 6 42x10* 22x1N Lzxim 22 5 azxiw L9x1N L4x1m Antal bakterier i det frystorkade pulvret mättes även var 4:e vecka upp till 68 veck- or. Dessa resultat visas i Fig. 1. Det visas tydligt i figuren att LB93l är stabil vid både rumstemperatur och +6°C under 22 veckor. Efter 1 år vid +6°C är mer än 105 cfu/mg LB93l fortfarande livskraftiga. 9 Antal bakterier (CFU) Temperatur (°C) Dag O Dag 2 Dag 5 Dag 32 4 7,8 x 10'° 2,2 x 10” 20 1,8 x 10” 2,2 x 10'° 27 1,8 x 10'° 1,2 x 10'° 3,3 x 10” 37 1,8x101° 5,8x10° 1,0x105 10 15 20 25 30 519 648 10 c) Förmågan hos LB93l att överleva i syntetisk urin, pH 6,6, undersöktes. Den syntetiska urinen innehåller mono-, en divalent katjon och anjoner såväl som urea och framställes enligt anvisningar i Geigy, Scientific Tables, Vol. 2, 8:e uppl. 1981 sid. 53. Till den sterila syntetiska urinen sattes näringsmedium för mikroorganismer.

Näringsmediumet framställdes enligt data från sammansättning av familjema Hook och FSA. Till 1 ml syntetisk urin sattes 103 LB93 1-bakterier, och provema inkube- rades under 18 timmar vid 32°C. Efter inkubationen uppgick antalet bakterier i pro- vet till mer än l05/m1. LB93l har förmåga att överleva och växa i syntetisk urin. d) Förmågan hos LB93l att överleva i en absorberande artikel (trosskydd) under- söktes. En suspension av LB93l (150 ul) sattes till den absorberande artikeln och denna artikel lagrades därefter i en tät förpackning upp till 9 månader. Resultaten visas i Fig. 2. Ett stort antal bakterier överlevde under 7 månader. e) Slutligen undersöktes LB93l med avseende på sina egenskaper under en tids od- ling och lagring, LB93l odlades i MRS-buljong och en ny passage gjordes var tredje dag under 3 månader. Efter detta jämfördes startprovet av LB93l och den sista pas- sagen i API-testet, PGFE och interferenstestet. De två provema var identiska i alla testema. Det är visat att LB93l är mycket stabil efter lagring och flera passager i odlingsmedium.

Exempel 4: Överföring av LB93l till hud i perineum och urinrörsöppningen hos kvinnor För att undersöka överföring av LB931 till perineum vid användning av ett tross- kydd utfördes följande undersökning. Alla testpersoner var kvinnor i en ålder mellan 12 och 60 år, och testema utfördes mellan menstruationsperioder då så var lämpligt.

Testproduktema framställdes med utgångspunkt från konventionella trosskydd om- fattande ett vätskepermeabelt ytterskikt, ett vätsketätt bakre skikt och mellan dessa ett absorberande skikt med 100-200 g/mz kemisk cellulosamassa. På den absorbe- l0 15 20 519 648 ll rande sidan av testprodukten sprejades en suspension av LB93 l-bakterier i en mängd av 109 kolcnifonnandc cnhctcr per produkt.

För att bestämma närvaron av LB93l i perineum hos de 13 försökspersonema utför- des ett s k svabbtest. Bakterier samlades upp genom att gnida en steril sticka omfat- tande en bomullstopp som nedsänkts i steril natriumkloridlösning på en definierad hudyta. Förekomsten av LB93! och andra LB på huden i perineum och vid urinöpp- ningen bestämdes. Försökspersonema bestämdes på detta sätt för att fastställa ett nollprov. Därefter bar försökspersonema trosskydd under 5 timmar på morgonen.

Trosskyddet avlägsnades och förekomsten av tillsatta mjölksyrabakterier resp. na- turliga mjölksyrabakterier bestämdes på nytt, direkt efter det att trosskyddet avlägs- nats. Detta prov benämndes som prov l. Efter 4-5 ytterligare timmar togs ytterligare ett prov, och detta benämndes som prov 2. Mjölksyrabakterietypen identifierades genom att använda Rogosa-agar med vancomycin vad gäller LB93l och Rogosa- agarplattor inkuberades anaerobt vad gäller andra LB. Ytterligare identifiering ut- fördes genom APl (BioMerieux, FR) och PFGE (elektrofores med pulsfalt). Resul- taten visas i Tabell IV. LB93] kunde påträffas på huden i perineum eller vid urin- rörsöppningen hos alla kvinnor efter användning av ett trosskydd som sprejats med LB93 1. 12 519 648 N. w n. m. ä>m.ooo-.momo 832.4 o o o o så oo .sooooo .o. x ß mo. x ß mo. x ß mo. x m .momo m. o o o o så oo .sooooo _o. x. o mo. x o _o. x ß .momo N.

+ + + + Som mo oowooom mo.xN mo.xm mo. xo mo. xN .Momo _. o o o o Som mo :owoocm mo. x w mo. x ß mo. x N mo. x m .momo o.

+ + + + Som mo :owoocm _o.xw o mo. xN _o. xo .momo o o o o o så oo .aooooo _o.xw o mo. xw oo. xN .Momo w + + + + Som mo oowoocm _o.xß mo.x. mo. xw mo. xN .momo ß + + + + Som mo oowoocm .ooxß .oo x. mo. xm mo. x. .oooo o + + o + Som mo :owoocm .o. x. .o. x N mo. x m mo. x N .Momo m + + + + Som mo :owoocm mo. x. oo. x m mo. x m mo. x. .momo w o o o o eå oo ooooooo oo. x w oo. x. mo. x. mo. x. .momo m o o o o så oo šoooëo mo. x N o mo. x ß _o. x o .momo N o o o o så oo ooooooo o o oo. x w mo. x N .Momo .

:Eošoom _ .EE :omicnoooooo-.ÉD Eno-zoom . .EI :owE-.flåmooo-:SD .É m 2:.. _ 2:.. 5:3.. 10 15 20 25 30 519 648 13 Exempel 5: Överföring av LB931 till huden i perineum och urinrörsöppningen hos flickor 13 unga flickor i en ålder av från 3 till 12 år ingick i studien. Bakterieprover från huden i perineum och urinrörsöppningen erhölls genom att först nedsänka en bomullstopp i MRS-buljong, och därefter försiktigt gnida toppen på huden eller epitelytan. Slutligen nedsänktes toppen i ett provrör innehållande MRS-buljong.

Prover erhölls enligt följande schema: Prov 0: Ett nollprov erhölls kvällen före studiens inledning och detta omfattade en LB931-bakterie. På kvällen dag l sattes ett trosskydd på.

Prov l: Morgonen dag 2. Ett nytt trosskydd bärs under dagen.

Prov 2: Ett prov togs på kvällen före ett frivilligt bad och innan ett nytt trosskydd togs på. Kvällen, dag 2.

Prov 3: Samma förfarande som för prov 1. Morgonen, dag 3.

Prov 4: Samma förfarande som för prov 2. Kvällen, dag 3.

Prov 5: Samma förfarande som för prov l. Morgonen. dag 4.

Prov 6: Ett prov tas kvällen före ett eventuellt bad. lnget trosskydd bärs under natten. Kvällen, dag 4.

Prov 7: Ett prov tas på morgonen dag 5. lnget trosskydd bärs under dagen.

Prov 8: Det sista provet tas på kvällen dag 5.

Resultaten presenteras i Fig. 3 (urinrörsöppning) och Fig. 4 (huden i perineum). Re- sultaten visar att LB931 kan överföras från en absorberande artikel.

Exempel 6: Känslighet för antibiotikasubstanser och spennacidala medel MIC-värden för Lactobacillus' planrarum LB931 bestämdes genom att använda E- -testet (Brown et al. J. Antimicrob. Chemother. 1991; 27: 185-190). Resultaten av- slöjas i Tabell V nedan. 10 15 20 519 Tabell V Antiobíotikasubstans Ampicillin Cefotaxim Cefuroxim Gentamycin lmipenem Metronidazol Erytromycin Vancomycin Piperazin/Tazobactam Tetracyklin Trimetoprim Bensylpenicillin Känsligheten för antibiotikasubstanser bestämdes även genom att utnyttja SIR- 648 14 MIC pg/ml 0,19 0,094 0,38 0,25 0,016 > 32 0,25 > 256 0,016 05 -systemet. l Tabell VI nedan betyder S känslig och R resistent.

Tabell Vl Antibiotikasubstans Cefadroxil Clindamycin Tri/sulfametoazol Ceftazidim Amikacin Aztreonam Mecillnam Zon (mm) 24 35 43 35 30 lndikation yøçomwcnww l0 15 20 519 648 šïïåfïfi.i'Äëiš-íšflšeëïïfiffiï l5 Nalidixinsyra 0 R Netilmycin 0 R Nitrofuantin 3 6 S Norfloxacin 0 R Tobramycin 32 S Mecillinarn/Ampicillin 4l S Cefipirome 47 S Oxacillin O R Cefalotin 22 S LB93I är känsligt för några antibiotikasubstanser som vanligen föreskrivs i samband med urinvägsinfektioner men LB93 l år även resistent mot exempelvis nalidixinsyra och norfloxacin. LB93l är även resistent mot vancomycin.

MIC-tester utfördes också för det speimacidala medlet Tergitol. LB93l odlades på MRS-agar i 5% C02, 37°C under 48 timmar. Bakteriema ympades i 3 ml MRS- -buljong och inkuberades under l0 timmar under samma förhållanden som tidigare angetts. l,5% av odlingen återympades till 3 ml MRS-buljong och inkuberades un- der samma förhållanden under 18 timmar. NP-(J-Tergitol (Sigma, USA) sats 47F0002 späddes i MRS-buljong med en temperatur på 37°C (reducerad viskositet) till en lagerlösning på 40%. Genom att använda denna lagerlösning framställdes 3 ml lösningar med följande koncentrationer: 0%, 5%, 10%, 20%, 30% och 40%. 10 ul bakterieodling sattes till varje lösning. Nollösningen blandades och sattes till MRS-agarplattor. Plattorna odlades i 5% C02, 37°C under 48 timmar för att be- stämma celltätheten. Resten av lösningama inkuberades utan omblandning i 5% C02, 37°C under 18 timmar. Lösningen innehållande 30% och 40% NP-9 späddes i 37°C MRS-buljong (reducerad viskositet). Alla lösningama omblandades kraftigt, späddes i steril O,9% NaCl och sattes till MRS-agarplattor. Plattoma inkuberades i 5% C02, 37°C under 48 timmar för att bestämma cfu/ml. 10 15 20 25 v. 11-.- 519 648 16 Resultaten avslöjas i Tabell Vll nedan.

Ympad mängd LB931 var 1,0 x 109 cfu Tergitol NP-9 Cfu/ml LB931 0% 2,6 x 109 1% 2,5 x 109 5% 2,5 x 109 10% 1,6 x 109 20% 1,4 x 109 30% 1,0 x 109 40% 6,9 x 109 Resultaten visar att LB931 väl klarar av att överleva i 40% Tergitol NP-9.

Exempel 7: Vidhäftning av LB931 till vaginala epitelceller a) Framställning av en suspension av LB93l LB93l odlades på MRS-agar (5% C02, 37°C; 48 timmar). Odlingen ympades till 3 ml buljong (5% C02; 37°C; 8 timmar). 2% av den resulterande odlingen återym- pades till 10 ml MRS-buljong (5% C02; 37°C; 18 timmar). Den resulterande od- lingen centrifugerades under 8 minuter vid 20°C och vid 2 000 vpm i en utsväng- ningsrotor (820 x g). Den erhållna cellkakan tvättades i 5 ml mjölksyrabuffert (10 mM mjölksyra, pH 4,5, 0,15 M NaCl). Bakterierna späds i mjölksyrabuffeit till dess ODSOO ligger på omkring 1,0 (omkring 108 cfu/ml). 10 15 20 25 30 519 648 17 b) Framställning av vaginala epitelceller Vaginala epitelceller skördades genom att använda en steril bomullspinne, och cel- lema överfördes till 4 ml mjölksyrabuffert eller PBS i ett litet rör. Röret blandades och bomullspinnen avlägsnades. Röret cennifugerades vid 700 vpm och 20°C under 8 minuter i en J ouan CR.-12 utsvängningsrotor (ungefär 100 x g), och de erhållna cellkakoma tvättades i 3 ml mjölksyrabuffert eller PBS. Cellema räknades i en he- maatocytometer och koncentrationen justerades till 105 till 106 celler/ml genom att utnyttja mjölksyrabuffert eller PBS. 25 ul celler spreds ut på ett mikroskoptäckt glas för att kontrollera tvättförfarandet (se nedan). c) Vidhäftningstester 0,5 ml LB93 l-suspension och 0,5 ml eellsuspension blandades snabbt i ett 1,5 ml Eppendorf-rör. Ett kontrollprov preparerades genom att blanda 0,5 ml cellsuspen- sion och 0,5 ml buffert. Rören centrifugerades vid 20°C och 2 000 vpm (z 720 x g), och inkuberades därefter under 1 timme vid 37°C. Efter inkubationstiden centrifuge- rades rören under 8 minuter vid 20°C och 700 vpm (z 90 x g). Cellkakoma tvättades i 1 ml mjölksyrabuffert eller PBS. Slutligen suspenderades cellkakoma i 400-500 ul mjölksyrabuffert eller PBS. d) Analys 25 ul av en suspenderad cellkaka tilläts lufttorka på ett mikroskoptäckt glas, följt av fixering och gramfargning. I varje prov analyserades 50 epitelceller. Antalet LB93l som vidhäftat till cellema räknas och resultaten delas in i fem grupper (0-10, 11-30, 31-50, 51-100, > 100 bakterier/cell).

Resultaten avslöjas i Tabell VIII nedan: 519 648 « 18 Tabell VIII Antal försökspersoner: 5 Provtagningstillfállen: före menstruation (bm); ägglossning (ov) Epitelceller Vidhäftade LB931/epitelcell prover 0-10 11-30 31-50 51-100 > 100 (bm) inkuberad med 17,2* 24,8 14,4 15,6 28,0 LB93 1, pH 4,5 (bm) inkuberade med 99,6 0,4 kontrollceller, pH 4,5 (ov) inkuberade med 8,4 22,8 19,2 20,0 29,6 LB93 1, pH 4,5 (ov) inkuberade med 98,4 1,6 kontrollceller, pH 4,5 * siffror anges i procent Resultaten visar tydligt att LB93 I -bakterier vidhäftar väl till vaginala epitelceller oberoende av när cellprovema tas.

Claims (11)

10 15 20 25 30 u» 1.. 1 . 1» .s u .- » » » . .e 1 1. t. .. ., . . ._ . . . > 1 -~ .v 1- v, s v _. , . , _ .U 1.. . u 1 1.. a . . s » 1 . .. . ,. 11 i. .1 19 Patentkrav

1. Lactobacillus plantarum, stam LB93 l, vilken deponerats vid Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, och tilldelats registreringsnummer DSMl 1918.

2. Lactobacillus plantarum, stam LB93 1, vilken deponerats vid Deutsche Sammlung von Mikroorganismen och tilldelats registreringsnummer DSMl 1918, för medicinsk användning.

3. Farmakologisk komposition innehållande Lactobacillus' plantarum, stam LB93 l, vilken deponerats vid Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, och tilldelats re- gistreringsnummer DSMl 1918, tillsammans med en fannakologiskt godtagbar bära- re och/eller fyllmedel.

4. Farmakologisk komposition enligt krav 3, kännetecknad av att den även inne- håller andra mjölksyrabakterier.

5. Farmakologisk komposition enligt krav 3 innehållande 104 till 10" cfu, företrä- desvis 105 1111 109, C111 L13931.

6. Farmakologisk komposition enligt krav 3 vilken är en suspension, sprej, gel, kräm, pulver, kapsel eller ett vaginaliiilägg.

7. Absorberande produkt, såsom en produkt för kvinnlig hygien, blöja, binda, tross- kydd eller inkontinensskydd, kännetecknad av att det innehåller Lactobacillus plantarum, stam LB93 l, vilken deponerats vid Deutsche Sammlung von Mikroorga- nismen, och tilldelats registreringsnummer DSMl 1918.

8. Absorberande produkt enligt krav 7 innehållande 104 till 10” cfu, företrädesvis 105 1111 109 cfu, LB931. 10 519 648

9. Farmakologisk komposition enligt krav 5 där nämnda farmakologiskt godtagbara bärare är skummjölk eller en tillväxtfaktor för lactobacillus i pulverforrn eller någon annan form.

10. Användning av Lactobacillus plantarum, stam LB93 l, vilken deponerats vid Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, och tilldelats registreringsnummer DSMl 1918, för att framställa en farmakologisk komposition för att förhindra och/eller behandla urogenitala infektioner, såsom kolonisering av enterobakterier.

11. Användning av Lactobacillus' planlarum, stam LB931, vilken deponerats vid Deutsche Sammlung von Mikroorganismen och tilldelats registreringsnummer DSMl 1918, för framställning av en absorberande artikel, såsom en blöja, binda, trosskydd eller ett inkontinensskydd, som lämpar sig för att förebygga och/eller be- handla urogenitala infektioner, såsom kolonisering av enterobakterier.