BE1023643B1

BE1023643B1 - Vaginale preparaten voor het onderhouden en / of herstellen van een gezonde vrouwelijke microbiota

Info

Publication number: BE1023643B1
Application number: BE2016/5201A
Authority: BE
Inventors: Sarah Lebeer; Ingmar CLAERS; Eline OERLEMANS; DEN BROECK Marianne VAN
Original assignee: Yun NV
Priority date: 2016-03-21
Filing date: 2016-03-21
Publication date: 2017-06-01
Also published as: US20190054128A1; CA3018416A1; JP7150696B2; CN109562134A; EP3433384A1; CN109562134B; US11000558B2; WO2017162669A1; JP2019512553A

Abstract

De huidige uitvinding is gericht op de directe toepassing van nuttige of probiotische bacteriën in de vaginale niche voor het onderhouden van een gezond vaginale microbiota en het helpen herstellen van een onevenwichtige vaginale microbiota. De aanvraag is gebaseerd op het gebruik van geselecteerde Lactobacillus stammen als anti-pathogene agentia, in het bijzonder L. pentosus en/of L. plantarum, tegen veel voorkomende vaginale pathogenen, waarbij geproduceerd zuren zoals melkzuur belangrijke antimicrobiële factoren zijn.

Description

VAGINALE PREPARATEN VOOR HET ONDERHOUDEN EN / OF HERSTELLEN VAN EEN GEZONDE VROUWELIJKE MICROBIOTA

DOMEIN VAN DE UITVINDING

De huidige uitvinding is gericht op de directe topische toepassing van nuttige of probiotische bacteriën in de vaginale niche om te helpen bij het behoud van een gezonde vaginale microbiota en het herstellen van een onevenwichtige vaginale microbiota of vaginale dysbiose. Dit herstel van een gezonde microflora valt onder de term probiotherapie, gedefinieerd als het gebruik van nuttige micro-organismen of probiotica om een gezonde microflora te herstellen op de plaats waar de microbiële dysbiose zich situeert. Deze aanvraag is gebaseerd op het gebruik van geselecteerde Lactobacillus stammen als antipathogene agentia, in het bijzonder L. pentosus en/of L. plantarum, tegen veel voorkomende vaginale pathogenen, waarbij de geproduceerde zuren zoals melkzuur belangrijke antimicrobiële factoren zijn.

ACHTERGROND VAN DE UITVINDING

In tegenstelling tot de microbiota van het maag-darmkanaal is de samenstelling van de urogenitale microbiota veel minder complex. Deze microbiota ontwikkelt na de geboorte en is afkomstig van de vaginale microbiota van de moeder, de externe omgeving en het migreren van de microbiota van de huid en het maagdarmkanaal. Deze vaginale microbiota leeft in symbiose met zijn gastheer en heeft een belangrijke rol in ziekte en gezondheid. Hoewel de microbiële samenstelling bij gezonde vrouwen kan verschillen, is deze meestal gedomineerd door één van vier Lactobacillus species (L. crispatus, L. iners, L. gasseri, L. jensenii) die gewoonlijk worden aangetroffen bij gezonde individuen. In sommige gevallen is de microbiota gedomineerd door verscheidene facultatief anaerobe melkzuurbacteriën, zonder significante aanwezigheid van lactobacilli. Dus in plaats van de specifieke species, speelt vooral de functionele capaciteit, waaronder de productie van melkzuur, van de microbiota een belangrijke rol bij het handhaven van een gezonde toestand.

Verschillende vaginale ongemakken zijn het gevolg van een verstoorde microbiële samenstelling. Infecties met Candida albicans, bacteriële vaginose (BV) en aerobe vaginitis (AV) zijn de meest voorkomende problemen. Deze ziekten/infecties/dysbiosen worden gekenmerkt door een verlaging van de totale hoeveelheid lactobacilli en de overgroei van Candida (candidose), facultatief anaerobe bacteriën (BV) en aerobe Gramnegatieve bacteriën (AV), respectievelijk. Onder normale omstandigheden leeft de gist Candida albicans als commensaal in het maagdarmkanaal en het urogenitale kanaal. Wanneer de normale darmflora verstoord is, de epitheliale barrière verzwakt is of wanneer het immuunsysteem defect is, kan Candida albicans echter veranderen van een commensaal naar een pathogeen. Dit kan een breed spectrum van ziekten veroorzaken zoals huidinfecties, aantasting van de slijmvliezen en systemische infecties. De afgelopen jaren is dit organisme zelfs één van de meest voorkomende oorzaken van ziekenhuisinfecties. Veel van deze infecties worden veroorzaakt door biofilms op de oppervlakken van medische materialen zoals implantaten. Het belangrijkste kenmerk van Candida biofilm cellen is hun opmerkelijke resistentie tegen antimycotica. Vaak is de enige oplossing de mechanische verwijdering van het implantaat wat wordt geassocieerd met een verhoogde morbiditeit en medische kosten. Daarom is de ontwikkeling van nieuwe antischimmelmiddelen, naast alternatieven voor antibiotica, om deze infecties te behandelen van groot belang.

De productie van melkzuur in combinatie met het verlagen van de pH lijken te beschermen tegen de bovenvermelde infecties en dysbiosen. Melkzuur lijkt daarenboven werkzaam tegen bacteriën, schimmels en zelfs virale pathogenen. Het is om deze reden dat lactobacillen worden beschouwd als belangrijk in het behoud van de homeostase van het dynamische vaginale ecosysteem. Potentiële gezondheidsbevorderende mechanismen van lactobacillen zijn i) het onderhouden van een lage vaginale pH (<4,5), vooral door de productie van melkzuur; ii) productie van antimicrobiële stoffen en competitieve exclusie van pathogenen,· iii) modulatie van de immuunrespons en iv) versterking van de epitheliale barrière.

Bijgevolg was het een doel van de huidige uitvinding een oplossing te bieden voor personen die lijden aan vaginale ongemakken veroorzaakt door een microbiële onbalans in de vagina. Hier werd vastgesteld dat het topisch vaginaal gebruik van L. pentosus zeer effectief is in het herstellen en/of handhaven van een gezonde microflora in de vagina en dus zeer geschikt is voor het verlichten van vaginale ongemakken in patiënten die daaraan behoefte heeft.

Orale formuleringen met Lactobacillus stammen zijn eerder gebruikt bij de behandeling van vaginale aandoeningen of voor het herstellen en/of handhaven van een gezonde microflora in de vagina. Echter, orale toediening versus rechtstreekse lokale toediening zijn verschillende toedieningswijzen en hebben elk een heel ander onderliggend mechanisme. Bij orale toediening, wordt vooral een gunstig effect op de algemene gezondheid verwacht via immunostimulatie, in tegenstelling tot directe vaginale toediening waar concurrentie met 'ongewenste' micro-organismen zal optreden.

Topische vaginale toediening van samenstellingen met levende Lactobacillus-stammen bleken bruikbaar bij de behandeling van vaginale infecties, zoals bijvoorbeeld vermeld in WO2012101550, WO15022297, WO03033681, WO0113956, WO20040350726. Echter, deze hebben geen betrekking tot het gebruik ervan in het herstel en/of het onderhouden van een gezonde vaginale microbiota.

Een zeer recente publicatie van Tomusiak et al. ondersteunt de relevantie van de huidige uitvinding (Tomusiak et al., 2015). Specifiek, vond Tomusiak et al. dat de vaginale toediening van Lactobacillus stammen zorgt voor een duurzaam herstel van de gezonde vaginale microbiota. Na de resultaten van Tomusiak die waren gebaseerd op L. fermentum, L. plantarum en L. gasseri, hebben wij gevonden dat L. pentosus bijzonder geschikt is in de context van de huidige uitvinding. Bovendien gebruikt Tomusiak intravaginale capsules met lactobacillen, daar waar wij vonden dat een vloeibare formulering veel effectiever is.

SAMENVATTING VAN DE UITVINDING

In een eerste aspect verstrekt de huidige uitvinding een topische vaginale formulering met één of meer levende Lactobacillus soorten (of species); waarbij ten minste één van de Lactobacillus soorten L. pentosus is; meer in het bijzonder een stam L. pentosus met ten minste 97% sequentiegelijkheid met SEQ ID N ° 1 in het 16S rRNA gen.

In een verder aspect verstrekt de huidige uitvinding een levende Lactobacillus soort voor toepassing bij het herstellen en/of onderhouden van een gezonde vrouwelijke microbiota, via een topische vaginale toediening, met L. pentosus als Lactobacillus species; meer in het bijzonder een stam L. pentosus met ten minste 97% sequentiegelijkheid met SEQ ID N ° 1 in het 16S rRNA gen.

Verder verstrekt de huidige uitvinding het gebruik van één of meer levende Lactobacillus species, in de bereiding van een topische vaginale formulering voor het herstellen en/of onderhouden van een gezonde vrouwelijke microbiota,· waarbij ten minste één van de Lactobacillus soorten L. pentosus is; meer in het bijzonder een stam L. pentosus met ten minste 97% sequentiegelijkheid met SEQ ID N ° 1 in het 16S rRNA gen.

De huidige uitvinding verstrekt ook een werkwijze voor het herstellen en/of onderhouden van een gezonde vrouwelijke microbiota; met ten minste één stap door toedienen via de topische vaginale weg van een effectieve hoeveelheid van één of meer levende Lactobacillus soorten aan een individu; waarbij ten minste één van de Lactobacillus soorten L. pentosus is; meer in het bijzonder een stam L. pentosus met ten minste 97% sequentiegelijkheid met SEQ ID N ° 1 in het 16S rRNA gen.

In nog een ander aspect verstrekt de huidige uitvinding een formulering die één of meer levende Lactobacillus soorten bevat voor gebruik bij het herstellen en/of onderhouden van een gezonde vrouwelijke microbiota, via topische vaginale toediening, waarbij Lactobacillus species worden gekozen uit de lijst met L. pentosus en L. plantarum, in het bijzonder L. pentosus; nog meer in het bijzonder een stam L. pentosus met ten minste 97% sequentiegelijkheid met SEQ ID N ° 1 in het 16S rRNA gen en een L. plantarum stam met ten minste 97% sequentiegelijkheid met SEQ ID N ° 4 in het 16S rRNA gen.

De huidige uitvinding voorziet verder een Lactobacillus-stam gekozen uit de lijst bestaande uit L. pentosus YUN-V1.0 gedeponeerd onder 'deposit number' LMG P-29455 (gedeponeerd bij BCCM op 9 maart 2016); en L. plantarum YUN-V2.0 gedeponeerd onder 'deposit number' LMG P-29456 (gedeponeerd bij BCCM op 9 maart 2016).

In een specifiek aspect verstrekt de huidige uitvinding een formulering die één of meer Lactobacillus-stammen bevat zoals hierboven gedefinieerd.

In een specifieke toedieningsvorm is de formulering van de huidige uitvinding een topisch vaginaal product, meer in het bijzonder in de vorm van een gel, crème, schuim, lotion of zalf.

In een andere specifieke toedieningsvorm verstrekt de huidige uitvinding de Lactobacillus stam als hierboven gedefinieerd of een formulering zoals hierboven gedefinieerd; voor gebruik in het herstellen en/of onderhouden van een gezonde vrouwelijke microbiota, via een topische vaginale behandeling.

In een bepaald aspect verstrekt de huidige uitvinding een topisch vaginaal gebruik van één of meer levende Lactobacillus soorten via probiotherapie; waarbij de genoemde Lactobacillus soorten worden gekozen uit de lijst bestaande uit L. pentosus en L. plantarum; meer in het bijzonder bestaat de genoemde probiotherapie uit het herstellen en/of onderhouden van een gezonde vrouwelijke microbiota bij een patiënt die daaraan behoefte heeft.

In een andere bijzondere toepassing zijn de Lactobacillus soorten voor (topisch vaginaal) gebruik, werkwijzen en samenstellingen zoals hierin beschreven, Lactobacillus stammen gekozen uit de lijst bestaande uit L. pentosus YUN-V1.0 gedeponeerd onder 'deposit number' LMG P-29455 (gedeponeerd bij BCCM op 9 maart 2016); en L. plantarum YUN-V2.0 gedeponeerd onder 'deposit number' LMG P-29456 (gedeponeerd bij BCCM op 9 maart 2016).

KORTE BESCHRIJVING VAN DE FIGUREN

Verwijzend naar de bijgeleverde figuren wordt benadrukt dat de getoonde bijzonderheden enkel dienen als voorbeeld en ter illustratie voor de bespreking van de verschillende uitvoeringsvormen van de huidige uitvinding. Zij worden verschaft in de context van wat wordt beschouwd als de meest nuttige en gemakkelijke beschrijving van de principes en conceptuele aspecten van de uitvinding. In dit opzicht wordt niet geprobeerd structurele details van de uitvinding te tonen in meer detail dan noodzakelijk is voor een fundamenteel begrip van de uitvinding. De beschrijving met de tekeningen heeft als doel om deskundigen in het vakgebied te tonen hoe de verschillende vormen van de uitvinding kunnen worden uitgevoerd in de praktijk.

Fig. 1: Kenmerken van lactobacilli met betrekking tot groei, productie van D- en L-melkzuur (LA) en het verlagen van de pH van het medium.

Fig. 2: Relatieve groei van Candida na 24 uur in YPD-medium aangevuld met SCS van Lactobacillus vergeleken met een negatieve controle (MRS bij pH 4), zoals gemeten via spectrofotometrie (ODeoo).

Fig. 3: Verandering in expressie van interleukine 8 in VK2/E6E7 cellen na blootstelling aan lactobacilli.

UITVOERIGE BESCHRIJVING VAN DE UITVINDING

De huidige uitvinding is gebaseerd op de ontdekking van specifieke Lactobacillus-stammen die kunnen concurreren met de groei van Candida albicans en bacteriën die gerelateerd zijn met bacteriële vaginose en aerobe vaginitis. De geselecteerde stammen worden hierin algemeen aangeduid als "YUN" stammen en kunnen concurreren met vaginale pathogenen en op die manier een gezonde vaginale microbiota herstellen. Dit herstel van een gezonde microflora valt onder de term probiotherapie, gedefinieerd als het gebruik van nuttige micro-organismen of probiotica die een gezonde microflora herstellen op de plaats waar de microbiële dysbiose plaatsvindt.

Bijgevolg verstrekt de huidige uitvinding in een eerste aspect een topische vaginale formulering die één of meer levende Lactobacillus soorten bevat; waarbij ten minste één van de Lactobacillus soort L. pentosus is; meer in het bijzonder een stam L. pentosus met ten minste 97% sequentiegelijkheid met SEQ ID N ° 1 in het 16S rRNA gen.

De samenstelling volgens de huidige uitvinding kunnen verder Lactobacillus soorten bevatten zoals bijvoorbeeld gekozen uit de niet-beperkende lijst: L. plantarum, L. gasseri, L. crispatus, L. acidophilus, L. jensenii, L. fermentum, L. rhamnosus.

In de context van de huidige uitvinding wordt onder de term "topisch(e)" begrepen: de lokale aflevering op een bepaalde plaats van het lichaam, vooral de toediening op een gespecifieerde plaats op of in het lichaam. In het bijzonder omvat ze de toepassingen op slijmvliezen via niet-vaste formuleringen zoals crèmes, schuimen, gels, lotions of zalven. De term "topische" is niet bedoeld om toedieningsvormen van vaste preparaten zoals capsules, tabletten te omvatten, ...

Bijgevolg wordt het volgende begrepen onder de term "topisch vaginaal": de lokale afgifte van niet-vaste formuleringen direct in het vaginale kanaal van het lichaam. Bij voorkeur worden de samenstellingen volgens de huidige uitvinding aangebracht over een groot gebied van de slijmvliezen van de vagina om zo effectief mogelijk te zijn.

In de context van de huidige uitvinding wordt met de term "levende Lactobacillus species" bedoeld: levensvatbare Lactobacillus soorten, en niet fragmenten, cultuursupernatans of gedode vormen hiervan.

In een verder aspect verstrekt de huidige uitvinding een levende Lactobacillus soort voor gebruik als probiotherapie via topische vaginale toediening, waarbij de Lactobacillus species L. pentosus is; meer in het bijzonder een stam L. pentosus met ten minste 97% sequentiegelijkheid met SEQ ID N ° 1 in het 16S rRNA gen. Zoals hierboven reeds gedefinieerd, waarbij probiotherapie is bedoeld voor het herstel en/of onderhoud van een gezonde vrouwelijke microbiota in een patiënt die daaraan behoefte heeft.

Personen die voordeel kunnen hebben bij deze probiotherapie zijn bijvoorbeeld vrouwelijke patiënten met een verstoorde vaginale microflora mogelijk als gevolg van een vaginale infectie, bacteriële vaginose, aerobe vaginitis en/of elke dysbiose veroorzaakt door overmatige groei van andere micro-organismen dan lactobacilli.

Bijgevolg verstrekt de huidige uitvinding in een verder aspect het gebruik van één of meer levende Lactobacillus species, in de bereiding van een topische vaginale formulering voor het herstellen en/of onderhouden van een gezonde vrouwelijke microbiota; waarbij ten minste één van de Lactobacillus soorten L. pentosus is; meer in het bijzonder een stam L. pentosus met ten minste 97% sequentiegelijkheid met SEQ ID N ° 1 in het 16S rRNA gen.

De huidige uitvinding verstrekt ook een werkwijze voor het herstellen en/of onderhouden van een gezonde vrouwelijke microbiota,· met ten minste één stap door toedienen via de topische vaginale weg van een effectieve hoeveelheid van één of meer levende Lactobacillus soorten aan een individu; waarbij ten minste één van de Lactobacillus soorten L. pentosus is; meer in het bijzonder een stam L. pentosus met ten minste 97% sequentiegelijkheid met SEQ ID N ° 1 in het 16S rRNA gen.

De uitvinding voorziet verder een Lactobacillus stam gekozen uit de lijst bestaande uit L. pentosus YUN-V1.0 gedeponeerd onder 'deposit number' LMG P-29455 (gedeponeerd bij BCCM op 9 maart 2016); en L. plantarum YUN-V2.0 gedeponeerd onder 'deposit number' LMG P-29456 (gedeponeerd bij BCCM op 9 maart 2016).

De microbiologische 'deposits' die hier worden genoemd, zijn gedaan bij BCCM/LMG of de Belgische gecoördineerde verzamelingen van micro-organisme met correspondentieadres: Laboratorium voor Microbiologie, Universiteit Gent, K.L. Ledeganckstraat 35, 9000 Gent, België

Lactobacillus pentosus YUN-V1.0 is een 'single colony' isolaat verkregen in ons labo na subcultivatie van een stam, oorspronkelijk een vaginale isolaat van een gezonde vrouw. De 16S rRNA gensequentie (SEQ ID N ° 1) voor stam L. pentosus YUN-V1.0 werd bepaald door PCR met primers 8F (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ’- SEQ ID N ° 2) en 1525R (5’- AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3 ’- SEQ ID N ° 3). YUN-V2.0 en YUN-V3.0 zijn 'single colony' isolaten in ons labo verkregen na subcultivatie van Lactobacillus plantarum stammen die oorspronkelijk werden geïsoleerd uit respectievelijk menselijk speeksel en een maissilo. De 16S rRNA gensequentie (SEQ ID N ° 4) voor L. plantarum stam YUN-V2.0 werd bepaald door PCR met primers 8F (5’- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ’- SEQ ID N ° 2) en 1525R (5’- AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3 ’- SEQ ID N ° 3).

Deze specifieke "YUN" stammen kunnen worden gebruikt als zodanig of bij voorkeur geformuleerd in producten met deze stammen. Genoemde producten zijn topische vaginale toedieningsvormen in het bijzonder in de vorm van niet-vaste formuleringen zoals crèmes, schuimen, gels, lotions of zalven.

In het bijzonder verstrekt de huidige uitvinding de boven gedefinieerde "YUN" stammen voor gebruik in probiotherapie, d.w.z. voor het herstellen en/of onderhouden van een gezonde vrouwelijke microbiota door topische vaginale toediening.

In nog een ander aspect verstrekt de huidige uitvinding een topisch vaginaal gebruik van één of meer levende Lactobacillus soorten als probiotherapie,· waarbij de genoemde Lactobacillus soorten worden gekozen uit de lijst bestaande uit L. pentosus en L. plantarum; meer in het bijzonder omvat de genoemde probiotherapie het herstellen en/of onderhouden van een gezonde vrouwelijke microbiota bij een patiënt die daaraan behoefte heeft.

In een specifieke toepassing zijn de Lactobacillus soorten voor (topisch vaginaal) gebruik, werkwijzen en samenstellingen zoals hierin beschreven, Lactobacillus stammen gekozen uit de lijst bestaande uit L. pentosus YUN-V1.0 gedeponeerd onder 'deposit number' LMG P-29455 (gedeponeerd bij BCCM op 9 maart 2016); en L. plantarum YUN-V2.0 gedeponeerd onder 'deposit number' LMG P-29456 (gedeponeerd bij BCCM op 9 maart 2016).

VOORBEELDEN

MATERIAAL EN METHODEN

Bacteriële stammen en groeicondities

Lactobacillus stammen (Tabel 1) werden opgegroeid bij 37°C in de Man, Rogosa en Sharpe (MRS) medium (Carl Roth). Alle bacteriën werden niet-schuddend gekweekt en geïnoculeerd uit glycerol stocks (-80 °C). Vaste media bevatten 1,5% (w/v) agar.

Tabel 1: De gebruikte bacteriële stammen in dit onderzoek

Bereiding van 'spent culture supernatant' (SCS) van de geselecteerde stammen

Om cultuursupernatans (SCS) te verkrijgen met de gesecreteerde actieve antimicrobiële componenten, werd

groeimedium specifiek voor elke soort geïnoculeerd vanuit een precultuur en geïncubeerd gedurende 24 uur. SCS werd verkregen door centrifugatie gedurende 30 min. aan 6797 g (8000 rpm) bij 4 °C. Daarna werd het SCS gefiltersteriliseerd (0,20 μm celluloseacetaat, VWR).

Antimicrobiële activiteit van levende lactobacilli in coculturen met Candida, BV en AV indicatororganismen

De antimicrobiële activiteit van de geselecteerde bacteriën werd onderzocht door middel van standaard antimicrobiële testen met enkele kleine wijzigingen. Voor de 'streak line assay' werden lactobacilli via een streepenting geïnoculeerd van een kolonie op een starterplaat (MRS) naar een testplaat (medium van pathogeen) en geïncubeerd bij 37°C gedurende 54h. Vervolgens werden de pathogenen eveneens via een streepenting geïnoculeerd van een kolonie op een starterplaat naar de testplaten in drievoud. De platen werden geïncubeerd bij 37 °C gedurende 24 uur en de inhibitiezone werd gemeten zoals eerder beschreven (Hütt et al. 2006). Bovendien werd de antimicrobiële activiteit van de geselecteerde bacteriën onderzocht via een 'spot assay' (Schillinger en Lücke 1989). Kort samengevat werd 1-3 μ! van elke cultuur gespot op een agarplaat. Deze platen werden gedurende 24 tot 72 uur geïncubeerd afhankelijk van de stam. Vervolgens werd een overnachtcultuur van de pathogeen verdund in 7 ml 'soft agar' van het medium van de pathogeen en over de platen met de 'spots' van de geselecteerde stammen gegoten. De platen werden overnacht geïncubeerd bij 37°C, waarna de inhibitiezones werden gemeten. Een 'spot' van miconazol en/of 0,1% hexetidine werd toegevoegd aan de testplaat als positieve controle voordat de 'soft agar' werd gegoten. 'Radial diffusion' test van SCS van lactobacilli

Bovendien werd de antimicrobiële activiteit van het cultuursupernatans (SCS) onderzocht met een protocol zoals eerder beschreven voor competitie-testen tussen lactobacilli en gastro-intestinale pathogenen (Coconnier et al. 1997). Miconazol werd gebruikt als een positieve controle. Steriel groeimedium werd gebruikt als een negatieve controle.

Antimicrobiële activiteit van SCS van de geselecteerde stammen tegen Candida, BV en AV indicatororganisme met behulp van spectrofotometrische bepalingen in de tijd

Spectrofotometrische bepalingen in de tijd werd uitgevoerd zoals eerder beschreven (De Keersmaecker et al. 2006) met kleine aanpassingen. Kort samengevat werd een overnachtcultuur van C. albicans, Gardnerella vaginalis (BV) of Streptococcus agalactiae (AV) toegevoegd aan de 'wells' van een microplaat gevuld met 50-80% van het gepaste medium en 50-5% SCS lactobacillen. MRS bij pH 4,3 en miconazol (0,02 μg/ml finale concentratie) werden respectievelijk als negatieve en positieve controle gebruikt. Bacteriën werden gekweekt en de optische dichtheid (OD) werd elke 30 min gemeten bij 590nm gedurende 3 dagen met een Synergy HTX multimodus spectrofotometer (Biotek). Elke test werd ten minste in drievoud gemeten en de gemiddelde OD werd berekend. De antimicrobiële activiteit werd uitgedrukt als de relatieve optische dichtheid bereikt na 24 uur (stationaire fase) in vergelijking met de negatieve controles.

Analyze van de veiligheid van probiotherapie op basis van in vitro celculturen

Als een eerste indicatie voor de veiligheid werd de capaciteit getest van de Lactobacillus stammen om een pro-inflammatoire reactie in de vorm van een opregulatie van interleukine 8 op te wekken in de VK2/E6E7 cellijn, een geïmmortaliseerde vaginale epitheel cellijn wekken. VK2/E6E7 cellen werden gekweekt tot een confluente monolaag en blootgesteld aan 1,5 x 107 CFU of miconazol (0,2 μg/ml finale concentratie) gedurende ongeveer 90 minuten, waarna RNA werd geëxtraheerd. RT-qPCR werd gebruikt om de relatieve expressieniveaus van IL-8 te bepalen in vergelijking met die van referentiegenen voor β-actine (ACTb) en glyceraldehyde 3-fosfaat dehydrogenase (GAPDH).

Klinische studie ('proof-of-concept') bij patiënten met vaginale candidose

Een 'proof-of-concept' klinische studie werd uitgevoerd op 20 patiënten met vaginale candidose. De patiënten waren tussen de 18-45 jaar oud en had ernstige ontsteking (vaginitis). Het doel van deze 'proof-of-concept' studie was om het effect van een vaginale zalf te beoordelen (fit-for-purpose vaginaal watervrij systeem: met +-1011 kolonievormende eenheden (CFU) van L. pentosus YUN-V1.0 en +-1011 CFU van L. plantarum YUN-V2.0 per toediening van 22.5ml van een watervrij systeem) op de vaginale microbiota en op de Candida-infectie. Patiënten werden gevraagd om de zalf dagelijkse intravaginaal te gebruiken met behulp van een applicator gedurende 10 dagen. De patiënten werden gezien door een gynaecoloog op dag 0 (vóór de therapie), dag 1, dag 5 en dag 10. Een vaginale spoeling werd genomen bij elk bezoek. Bacterieel DNA werd geïsoleerd uit deze stalen door de commerciële Mobio Powersoil kit (cfr. Human Microbiome Project). Het geïsoleerde DNA werd geanalyseerd via 16S rRNA amplicon sequencing met MiSeq Illumina en een bioinformatische analyse werd uitgevoerd. Dezelfde stalen werden ook gebruikt om Candida albicans aantallen te bepalen door uit te platen op selectieve agars (Sabouraud

Dextrose agar en evenwaardig). Bovendien werd een klinische score verricht bij elk visite.

Antibiogram met behulp van Kirby-Bauer test

Gevoeligheid voor antibiotica werd geëvalueerd met behulp van de Kirby-Bauer diffusietest. In het kort werden antibiotica gespot op papieren schijfjes en werd de bacteriële inhibitiezone gemeten op agarplaten. De geteste antibiotica waren erythromycine, normocin, tetracycline, ampicilline en clindamycine bij relevante concentraties.

RESULTATEN

Groeikarakteristieken en lactaatproductie

Mogelijk nuttige of probiotische stammen werden gekarakteriseerd in termen van groeikarakteristieken, lactaatproductie (op basis van D- en L-melkzuur) en de mogelijkheid van het verlagen van de pH van het medium. Deze kenmerken zijn waarschijnlijk belangrijk bij het onderhoud en/of herstel van een gezonde vaginale microbiota. Deze gegevens tonen aan dat Lactobacillus pentosus YUN-V1.0 en L. plantarum YUN-V2.0 en YUN-V3.0 de hoogste hoeveelheid melkzuur produceren, vooral door een aanzienlijke toename van D-melkzuur productie (zie figuur 1).

Antipathogene testen

In een volgende fase werden de gunstige of probiotische bacteriën gescreend op het antipathogene effect tegen Candida albicans. De resultaten van de 'radial diffusion' test zijn weergegeven in tabel 2. Cultuursupernatans (SCS) van L. pentosus YUN-V1.0 vertoonde een superieure inhibitie van groei van Candida albicans. L. plantarum YUN-V2.0 en Yun-V3.0 toonden inhibitie in mindere mate, maar nog altijd beter of gelijkaardig aan de meeste andere Lactobacillus stammen.

Tabel 2: 'Radial diffusion test' met supernatans (SCS) van lactobacilli om de groei van Candida albicans te inhiberen

De 'spot'-gebaseerde antipathogene test werd ook uitgevoerd om de antipathogene activiteit van de geselecteerde levende Lactobacillus species tegen Candida albicans te onderzoeken. De geselecteerde stammen remden allen enigszins de groei van Candida maar de meest efficiënte stammen waren L. plantarum YUN-V2.0 en L. plantarum YUN-V3.0 (zie tabel 3).

Tabel 3: 'Spot assay' van verschillende Lactobacillus stammen met behulp van een overlay van Candida albicans.

Ten derde werden spectrofotometrische bepalingen in de tijd uitgevoerd om de antimicrobiële werking van SCS van de geselecteerde stammen tegen Candida na te gaan. Opnieuw remde SCS van alle geteste stammen de groei van Candida tot op zekere hoogte, maar de meeste effectieve stammen waren L. plantarum YUN-V1.0, L. plantarum YUN-V2.0 en L. plantarum YUN-V3.0 (zie figuur 2).

Analyze van de veiligheid van probiotherapie op basis van in vitro celculturen

Als een indicatie voor veiligheid werd de capaciteit van de stammen om het pro-inflammatoire chemokine interleukine 8 (IL-8) te induceren onderzocht. Sommige stammen vertoonden een relatief kleine toename in expressie, maar zoals gewenst veroorzaakte geen van de geselecteerde stammen een sterke IL-8 respons. Er werd wel een duidelijke IL-8 opregulatie waargenomen voor L. reuteri RC-14 (Figuur 3). Het is belangrijk op te merken dat de resultaten met miconazol kunnen worden beïnvloed door een effect van miconazol op de celviabiliteit. Onder de microscopie werd vastgesteld dat een groot aantal cellen tijdens de behandeling was afgestorven, vergeleken met de negatieve controle.

Antibiogram met behulp van Kirby-Bauer test

De geselecteerde bacteriën werden ook getest op hun gevoeligheid voor antibiotica om verspreiding te voorkomen van antibioticaresistentiegenen. Alle lactobacilli waren gevoelig voor erytromycine, normocin, tetracycline, ampicilline en clindamycine, behalve L. plantarum 5057, die niet gevoelig bleek voor tetracycline. Daarom werd stam L. plantarum 5057 niet geschikt bevonden als een stam voor probiotherapie.

REFERENTIES

Chan, R.C. et al., 1985. Competitive exclusion of uropathogens from human uroepithelial cells by Lactobacillus whole cells and cell wall fragments. Infection and immunity, 47(1), pp.84-9.

Chan, R.C., Bruce, A.W. & Reid, G., 1984. Adherence of cervical, vaginal and distal urethral normal microbial flora to human uroepithelial cells and the inhibition of adherence of gram-negative uropathogens by competitive exclusion. The Journal of urology, 131(3), pp.596-601.

Coconnier, M.H. et al., 1997. Antibacterial effect of the adhering human Lactobacillus acidophilus strain LB. Antimicrobial agents and chemotherapy, 41(5), pp.1046-52.

Doron, S., Snydman, D.R. & Gorbach, S.L., 2005.

Lactobacillus GG: bacteriology and clinical applications. Gastroenterology clinics of North America, 34(3), pp.48398, ix. Hütt, P. et al., 2006. Antagonistic activity of probiotic lactobacilli and bifidobacteria against entero- and uropathogens. Journal of applied microbiology, 100(6), pp.1324-32.

De Keersmaecker, S.C.J. et al., 2006. Strong antimicrobial activity of Lactobacillus rhamnosus GG against Salmonella typhimurium is due to accumulation of lactic acid. FEMS microbiology letters, 259(1), pp.89-96.

Reid, G., 1999. The scientific basis for probiotic strains of Lactobacillus. Applied and environmental microbiology, 65(9), pp.3763-6.

Reid, G. & Bruce, A.W., 2001. Selection of lactobacillus strains for urogenital probiotic applications. The

Journal of infectious diseases, 183 Suppl , pp.S77-80.

Schillinger, U. & Lücke, F.K., 1989. Antibacterial activity of Lactobacillus sake isolated from meat. Applied and environmental microbiology, 55(8), pp.1901-6.

Tomusiak, A. et al., 2015. Efficacy and safety of a vaginal medicinal product containing three strains of probiotic bacteria: a multicenter, randomized, double-blind, and placebo-controlled trial. Drug design, development and therapy, 9, pp.5345-54.

LIJST MET SEQUENTIES

<110> Yun NV

<120> VAGINALE PREPARATEN VOOR HET ONDERHOUDEN EN / OF HERSTELLEN VAN EEN GEZONDE VROUWELIJKE MICROBIOTA <130> AXC-006 <160> 4 <170> BiSSAP 1.3

<210> 1 <211> 1406 <2 12> RNA <213> Lactobacillus pentosus <220> <223> 16S rRNA sequentie <400> 1 cttaggcggc tggttcctaa aaggttaccc caccgacttt gggtgttaca aactctcatg 60 gtgtgacggg cggtgtgtac aaggcccggg aacgtattca ccgcggcatg ctgatccgcg 120 attactagcg attccgactt catgtaggcg agttgcagcc tacaatccga actgagaatg 180 gctttaagag attagcttac tctcgcgagt tcgcaactcg ttgtaccatc cattgtagca 240 cgtgtgtagc ccaggtcata aggggcatga tgatttgacg tcatccccac cttcctccgg 300 tttgtcaccg gcagtctcac cagagtgccc aacttaatgc tggcaactga taataagggt 360 tgcgctcgtt gcgggactta acccaacatc tcacgacacg agctgacgac aaccatgcac 420 cacctgtatc catgtccccg aagggaacgt ctaatctctt agatttgcat agtatgtcaa 480 gacctggtaa ggttcttcgc gtagcttcga attaaaccac atgctccacc gcttgtgcgg 540 gcccccgtca attcctttga gtttcagcct tgcggccgta ctccccaggc ggaatgctta 600 atgcgttagc tgcagcactg aagggcggaa accctccaac acttagcatt catcgtttac 660 ggtatggact accagggtat ctaatcctgt ttgctaccca tactttcgag cctcagcgtc 720 agttacagac cagacagccg ccttcgccac tggtgttctt ccatatatct acgcatttca 780 ccgctacaca tggagttcca ctgtcctctt ctgcactcaa gtttcccagt ttccgatgca 840 cttcttcggt tgagccgaag gctttcacat cagacttaaa aaaccgcctg cgctcgcttt 900 acgcccaata aatccggaca acgcttgcca cctacgtatt accgcggctg ctggcacgta 960 gttagccgtg gctttctggt taaataccgt caatacctga acagttactc tcagatatgt 1020 tcttctttaa caacagagtt ttacgagccg aaacccttct tcactcacgc ggcgttgctc 1080 catcagactt tcgtccattg tggaagattc cctactgctg cctcccgtag gagtttgggc 1140 cgtgtctcag tcccaatgtg gccgattacc ctctcaggtc ggctacgtat cattgccatg 1200 gtgagccgtt accccaccat ctagctaata cgccgcggga ccatccagaa gtgatagccg 1260 aagccatctt tcaaactcgg accatgcggt ccaagttgtt atgcggtatt agcatctgtt 1320 tccaggtgtt atcccccgct tctgggcagg tttcccacgt gttactcacc agttcgccac 1380 tcactcaaat gtaaatcatg atgcaa 1406

<210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Kunstmatige Sequentie <220> <223> Primer 8F <400> 2 agagtttgat cctggctcag 20

<210> 3 <211> 20 <2 12> DNA <213> Kunstmatige Sequentie <220> <223> Primer 1525R <400> 3 aaggaggtga tccagccgca 20

<210> 4 <211> 1425 <212> RNA <213> Lactobacillus plantarum <220> <223> 16S rRNA <400> 4 ggttcctaaa aggttacccc accgactttg ggtgttacaa actctcatgg tgtgacgggc 60 ggtgtgtaca aggcccggga acgtattcac cgcggcatgc tgatccgcga ttactagcga 120 ttccgacttc atgtaggcga gttgcagcct acaatccgaa ctgagaatgg ctttaagaga 180 ttagcttact ctcgcgagtt cgcaactcgt tgtaccatcc attgtagcac gtgtgtagcc 240 caggtcataa ggggcatgat gatttgacgt catccccacc ttcctccggt ttgtcaccgg 300 cagtctcacc agagtgccca acttaatgct ggcaactgat aataagggtt gcgctcgttg 360 cgggacttaa cccaacatct cacgacacga gctgacgaca accatgcacc acctgtatcc 420 atgtccccga agggaacgtc taatctctta gatttgcata gtatgtcaag acctggtaag 480 gttcttcgcg tagcttcgaa ttaaaccaca tgctccaccg cttgtgcggg cccccgtcaa 540 ttcctttgag tttcagcctt gcggccgtac tccccaggcg gaatgcttaa tgcgttagct 600 gcagcactga agggcggaaa ccctccaaca cttagcattc atcgtttacg gtatggacta 660 ccagggtatc taatcctgtt tgctacccat actttcgagc ctcagcgtca gttacagacc 720 agacagccgc cttcgccact ggtgttcttc catatatcta cgcatttcac cgctacacat 780 ggagttccac tgtcctcttc tgcactcaag tttcccagtt tccgatgcac ttcttcggtt 840 gagccgaagg ctttcacatc agacttaaaa aaccgcctgc gctcgcttta cgcccaataa 900 atccggacaa cgcttgccac ctacgtatta ccgcggctgc tggcacgtag ttagccgtgg 960 ctttctggtt aaataccgtc aatacctgaa cagttactct cagatatgtt cttctttaac 1020 aacagagttt tacgagccga aacccttctt cactcacgcg gcgttgctcc atcagacttt 1080 cgtccattgt ggaagattcc ctactgctgc ctcccgtagg agtttgggcc gtgtctcagt 1140 cccaatgtgg ccgattaccc tctcaggtcg gctacgtatc attgccatgg tgagccgtta 1200 ccccaccatc tagctaatac gccgcgggac catccaaaag tgatagccga agccatcttt 1260 caagctcgga ccatgcggtc caagttgtta tgcggtatta gcatctgttt ccaggtgtta 1320 tcccccgctt ctgggcaggt ttcccacgtg ttactcacca gttcgccact cactcaaatg 1380 taaatcatga tgcaagcacc aatcaatacc agagttcgtt cgact 1425

Claims

CONCLUSIES

1. Een topische vaginale formulering die één of meer levende Lactobacillus species bevat; waarbij ten minste één van de species een L. pentosus stam is met ten minste 97% sequentiegelijkheid met SEQ ID N ° 1 in het 16S rRNA gen.
2. Een levend Lactobacillus species voor gebruik in het herstellen en/of onderhouden van een gezonde vrouwelijke microbiota, door topische vaginale toediening, waarbij de Lactobacillus een L. pentosus stam is met ten minste 97% sequentiegelijkheid met SEQ ID N ° 1 in het 16S rRNA gen.
3. Gebruik van één of meer levende Lactobacillus species, in de bereiding van een topische vaginale formulering voor het herstellen en/of onderhouden van een gezonde vrouwelijke microbiota; waarbij ten minste één van de Lactobacillus species een L. pentosus stam is met ten minste 97% sequentiegelijkheid met SEQ ID N ° 1 in het 16S rRNA gen.
4. Methode voor het herstellen en/of onderhouden van een gezonde vrouwelijke microbiota; omvattende ten minste één stap tot toedienen via de topische vaginale weg van een effectieve hoeveelheid van één of meer levende Lactobacillus species aan een individu; waarbij ten minste één van de Lactobacillus species een L. pentosus stam is met ten minste 97% sequentiegelijkheid met SEQ ID N ° 1 in het 16S rRNA gen.
5. Een formulering die één of meer levende Lactobacillus species bevat voor gebruik bij het herstellen en/of onderhouden van een gezonde vrouwelijke microbiota door topische vaginale toediening, waarbij de Lactobacillus species worden gekozen uit de lijst met L. pentosus en L. plantarum, waarbij L. pentosus een L. pentosus stam is met ten minste 97% sequentiegelijkheid met SEQ ID N ° 1 in het 16S rRNA gen, en de L. plantarum een L. plantarum stam met ten minste 97% sequentiegelijkheid met SEQ ID N ° 4 in de 16S rRNA gen.
6. Een Lactobacillus stam gekozen uit de lijst bestaande uit L. pentosus YUN-V1.0 gedeponeerd onder 'deposit number' LMG P-29455; en L. plantarum YUN-V2.0 gedeponeerd onder 'deposit number' LMG P-29456.
7. Een formulering die één of meer Lactobacillus stammen bevat zoals gedefinieerd in claim 6.
8. De formulering volgens claim 7; waarbij de formulering een topische vaginale formulering is.
9. Het gebruik volgens claim 3 of de formulering volgens een van de claims 1, 5, 7 of 8 waarbij de formulering een topische vaginale formulering is in de vorm van een gel, crème, ovule, zetpil, schuim, lotion of zalf.
10. Een Lactobacillus stam volgens claim 6 of een formulering volgens claim 7 of 8; voor gebruik in het herstellen en/of onderhouden van een gezonde vrouwelijke microbiota, door topische vaginale toediening.
11. Topisch vaginaal gebruik van één of meer levende Lactobacillus soorten als probiotherapie; waarbij de genoemde Lactobacillus soorten worden gekozen uit de lijst bestaande uit L. pentosus en L. plantarum.
12. Topisch vaginaal gebruik volgens claim 11; waarbij probiotherapie bestaat uit het herstellen en/of onderhouden van een gezonde vrouwelijke microbiota bij een patiënt die daaraan behoefte heeft.
13. Topisch vaginaal gebruik volgens één van de claims 11 of 12, het gebruik volgens claim 3, de werkwijze zoals gedefinieerd in claim 4, de levende Lactobacillus soorten zoals gedefinieerd in claim 2, of de formulering volgens claim 5; waarbij de genoemde Lactobacillus species een Lactobacillus stam is, gekozen uit de lijst bestaande uit L. pentosus YUN-V1.0 gedeponeerd onder 'deposit number' LMG P-29455; en L. plantarum YUN-V2.0 gedeponeerd onder 'deposit number' LMG P-29456.