BE1024425B9 - Dermatologische preparaten voor het onderhouden en/of herstellen van een gezonde huidmicrobiota - Google Patents

Abstract

De huidige uitvinding is gericht op de directe toepassing van nuttige of probiotische bacteriën op de huid om te helpen bij het behoud van een gezonde huidmicrobiota en het herstellen van een onevenwichtige huidmicrobiota. Deze aanvraag is gebaseerd op het gebruik van geselecteerde Lactobacillus stammen als antipathogene agentia, in het bijzonder L. plantarum, L. pentosus en/of L. rhamnosus tegen veel voorkomende huidpathogenen, waarbij de geproduceerde zuren zoals melkzuur belangrijke antimicrobiële factoren zijn.

Description

DERMATOLOGISCHE PREPARATEN VOOR HET ONDERHOUDEN ΕΝ/OF HERSTELLEN VAN EEN GEZONDE HUIDMICROBIOTA

DOMEIN VAN DE UITVINDING

De huidige uitvinding is gericht op de directe topicale toepassing van nuttige of probiotische bacteriën op de huid om te helpen bij het behoud van een gezonde huidmicrobiota en het herstellen van een onevenwichtige huidmicrobiota. Dit herstel van een gezonde microflora valt onder de term probiotherapie, gedefinieerd als het gebruik van nuttige micro-organismen of probiotica om een gezonde microflora te herstellen op de plaats waar het microbiële onevenwicht of dysbiose zich situeert. Deze aanvraag is gebaseerd op het gebruik van geselecteerde Lactobacillus stammen als antipathogene agentia, in het bijzonder L. plantarum, L. pentosus en/of L. rhamnosus tegen veel voorkomende huidpathogenen, waarbij de geproduceerd zuren zoals melkzuur belangrijke antimicrobiële factoren zijn.

ACHTERGROND VAN DE UITVINDING

Bijgevolg was het een doel van de huidige uitvinding om een oplossing te bieden aan personen die lijden aan huidaandoeningen die gelinkt worden een afwijkend microbieel evenwicht op de huid. Hiervoor werd vastgesteld dat de topische toepassing van L. plantarum, L. pentosus en/of L. rhamnosus op de huid zeer effectief is in het herstellen en/of handhaven van een gezonde huidmicrobiota, en dus zeer geschikt is voor het verbeteren van huidaandoeningen in patiënten die daaraan behoefte hebben.

Orale formuleringen met Lactobacillus stammen zijn eerder gebruikt bij de behandeling van huidaandoeningen zoals atopische dermatitis. Echter, orale toediening versus rechtstreekse lokale toediening zijn verschillende toedieningsroutes en hebben elk een heel ander onderliggend mechanisme. Bij orale toediening, wordt vooral een gunstig effect op de algemene gezondheid verwacht via immunostimulatie, in tegenstelling tot directe dermatologische of topische (huid) toediening waar concurrentie met 'ongewenste' micro-organismen zal optreden.

Net als het maagdarmkanaal, herbergt onze huid een unieke microbieel ecosysteem. Het type van micro-organismen dat op de huid voorkomt, hangt af van een combinatie van gastheerfactoren, omgevingsfactoren maar ook de topografische locatie. De rol van de microbiota in huidaandoeningen is nog steeds niet helemaal ontrafeld. Het lijkt echter dat sommige huidaandoeningen gelinkt zijn aan een verstoorde microbiota aangezien antimicrobiële behandelingen de klinische symptomen kunnen verbeteren (Grice & Segre 2011) . Bijvoorbeeld, bij acne vulgaris is een correlatie gevonden met de aanwezigheid van Propionibacterium acnes (Beylot et al. 2014). Hoewel acne vulgaris een multifactoriële aandoening is, onder andere beïnvloedt door hormonale factoren, lijkt deze P. acnes de ontsteking te induceren wat resulteert in ontstoken puistjes, ook wel papels of pustels genoemd. Aangezien P. acnes ook wordt aangetroffen op een gezonde huid waar de bacterie geen acne veroorzaakt, impliceert dit dat nog andere factoren een rol spelen, en samen zorgen voor het ontregelen van de samenstelling van de huidmicrobiota naar een overmatige groei van deze bacterie.

Een ander voorbeeld van een huidaandoening waarbij de microbiota belangrijk lijkt te zijn is roos (Wang et al 2015; Sugita et al 2015; Grice & Segre 2011) . Bij mensen met roos, is de schimmel Malassezia vaak oververtegenwoordigd. Aanwijzingen dat deze schimmel een mogelijke oorzaak van de aandoening is, zijn afkomstig uit het feit dat antimycotische behandeling de symptomen verbeteren. Daarentegen zorgen antibacteriële therapieën niet voor het verminderen van roos. Opnieuw worden verwacht dat andere factoren betrokken zijn bij deze huidaandoening, maar de correlatie met Malassezia is intrigerend. Gelijkaardig als bij roos, lijken schimmelinfecties van de huid met Candida albicans of dermatofyten zoals Trichophyton spp. Huidaandoeningen die gelinkt zijn aan een dysbiose van de huidmicrobiota aangezien deze soorten ook aanwezig zijn op gezonde proefpersonen. In het geval van Tinea pedis of "Atleetvoet" wordt vaak overgroei van Trichophyton rubrum en T. mentagrophytes waargenomen.

De productie van melkzuur in combinatie met eventueel andere antimicrobiële componenten zoals bacteriocines lijken te beschermen tegen bovengenoemde infecties en dysbioses en melkzuur lijkt hierbij werkzaam tegen bacteriën, schimmels en zelfs virale pathogenen. Het is om deze reden dat lactobacillen als belangrijk worden beschouwd in de homeostase van het dynamische dermatologische ecosysteem. Potentiële gezondheidsbevorderende mechanismen van lactobacillen zijn i) het behoud van een gezonde huid-pH ( + /- 5,5), met name door de productie van melkzuur; ii) de productie van antimicrobiële componenten en competitieve exclusie van pathogenen; iii) modulatie van de immuunrespons en iv) de versterking van de epitheliale barrière.

Derhalve was het een doel van de huidige uitvinding om een oplossing te bieden voor personen die lijden aan dermatologische aandoeningen gelinkt aan een afwijkend microbiële evenwicht van de huid. Hiervoor werd vastgesteld dat topisch gebruik op de huid van L. plantarum, L. pentosus en/of L. rhamnosus soort zeer effectief is in het herstellen en/of handhaven van een gezonde microflora op de huid, en dus zeer geschikt is voor het verlichten van dermatologische aandoeningen in patiënten die daaraan behoefte hebben.

Orale formuleringen met Lactobacillus stammen zijn eerder gebruikt bij de behandeling van dermatologische aandoeningen. Echter, orale toediening versus rechtstreekse lokale toediening zijn verschillende toedieningsroutes en hebben elk een heel ander onderliggend mechanisme. Bij orale toediening, wordt vooral een gunstig effect op de algemene gezondheid verwacht via immunostimulatie, in tegenstelling tot directe dermatologische of topische (huid) toediening waar concurrentie met 'ongewenste' micro-organismen zal optreden.

SAMENVATTING VAN DE UITVINDING

In een eerste aspect verstrekt de huidige uitvinding een topische dermatologische formulering met één of meer levende Lactobacillus soorten; waarbij ten minste één van de Lactobacillus soorten L. plantarum is; meer in het bijzonder een L. plantarum stam met ten minste 97% sequentiegelijkheid met SEQ ID N ° 4 in het 16S rRNA gen.

In een verder aspect verstrekt de huidige uitvinding een levende Lactobacillus soort voor toepassing bij het herstellen en/of onderhouden van een gezonde huidmicrobiota, via topische toediening, met L. plantarum als Lactobacillus species; meer in het bijzonder een L. plantarum stam met ten minste 97% sequentiegelijkheid met SEQ ID N ° 4 in het 16S rRNA gen.

In nog een ander aspect verstrekt de huidige uitvinding het gebruik van één of meer levende Lactobacillus species, in de bereiding van een topische formulering voor de huid voor het herstellen en/of onderhouden van een gezonde huidmicrobiota; waarbij ten minste één van de Lactobacillus soorten L. plantarum is; meer in het bijzonder een L. plantarum stam met ten minste 97% sequentiegelijkheid met SEQ ID N ° 4 in het 16S rRNA gen.

De huidige uitvinding verstrekt ook een werkwijze voor het herstellen en/of onderhouden van een gezonde huidmicrobiota; met ten minste één stap door het toedienen via topische weg, aan een individu, van een effectieve hoeveelheid van één of meer levende Lactobacillus soorten; waarbij ten minste één van de Lactobacillus soorten L. plantarum is; meer in het bijzonder een L. plantarum stam met ten minste 97% sequentiegelijkheid met SEQ ID N ° 4 in het 16S rRNA gen.

In nog een ander aspect verstrekt de huidige uitvinding een formulering die één of meer levende Lactobacillus soorten bevat voor gebruik bij het herstellen en/of onderhouden van een gezonde huidmicrobiota, door topische weg, waarbij Lactobacillus species wordt gekozen uit de lijst met L. plantarum, L. pentosus en L. rhamnosus; meer in het bijzonder een L. plantarum stam met ten minste 97% sequentiegelijkheid met SEQ ID N ° 4 in het 16S rRNA gen, een L. pentosus stam met ten minste 97% sequentiegelijkheid met SEQ ID N ° 1 in het 16S rRNA gen en een L. rhamnosus stam met ten minste 97% sequentiegelijkheid met SEQ ID N 5 in het 16S rRNA gen.

De huidige uitvinding verstrekt verder een Lactobacillus stam die als L. rhamnosus YUN-S1.0 werd gedeponeerd onder toegangsnummer LMG P-29611 (gedeponeerd bij BCCM mei, 12 2016).

In een bepaald aspect verstrekt de huidige uitvinding een formulering die één of meer Lactobacillus-stammen bevat zoals hierboven gedefinieerd.

In een specifieke toedieningsvorm is de formulering van de huidige uitvinding een topische dermatologische samenstelling, meer in het bijzonder in de vorm van een gel, crème, schuim, lotion of zalf.

In een andere specifieke uitvoeringsvorm verstrekt de huidige uitvinding de Lactobacillus stam als hierboven gedefinieerd of een formulering zoals hierboven gedefinieerd; voor gebruik in het herstellen en/of onderhouden van een gezonde huidmicrobiota, via topische toediening.

In een bepaald aspect verstrekt de huidige uitvinding een topische toepassing op de huid van één of meer levende Lactobacillus soorten via probiotherapie; waarbij de genoemde Lactobacillus soorten worden gekozen uit de lijst bestaande uit L. plantarum, L. pentosus en L. rhamnosus; meer in het bijzonder bestaat de genoemde probiotherapie uit het herstellen en/of onderhouden van een gezonde huidmicrobiota bij een patiënt die daaraan behoefte heeft.

In een andere bijzondere toepassing zijn de genoemde Lactobacillus species in de topische toepassingen, werkwijzen en samenstellingen zoals hierin beschreven, Lactobacillus-stammen gekozen uit de lijst bestaande uit L. plantarum YUN-V2.0 gedeponeerd onder 'deposit number' LMG P-29456 (gedeponeerd bij BCCM op 9 maart 2016), L. pentosus YUN-Vl.0 gedeponeerd onder 'deposit number' LMG P-29455 (gedeponeerd bij BCCM op 9 maart 2016); en L. rhamnosus YUN-S1.0 gedeponeerd onder 'deposit number' LMG P-29611 (gedeponeerd bij BCCM op 12 mei 2016).

KORTE BESCHRIJVING VAN DE FIGUREN

Verwijzend naar de bij geleverde figuren wordt benadrukt dat de getoonde bijzonderheden enkel dienen als voorbeeld en ter illustratie voor de bespreking van de verschillende uitvoeringsvormen van de huidige uitvinding. Zij worden verschaft in de context van wat wordt beschouwd als de meest nuttige en gemakkelijke beschrijving van de principes en conceptuele aspecten van de uitvinding. In dit opzicht wordt niet geprobeerd structurele details van de uitvinding te tonen in meer detail dan noodzakelijk is voor een fundamenteel begrip van de uitvinding. De beschrijving met de tekeningen heeft als doel om deskundigen in het vakgebied te tonen hoe de verschillende vormen van de uitvinding in de praktijk kunnen worden uitgevoerd.

Fig. 1: Kenmerken van lactobacilli met betrekking tot groei, productie van D- en L-melkzuur (LA) en het verlagen van de pH van het medium.

Fig. 2: Analyse van het antipathogene effect van supernatans van culturen ( 'spent culture supernatant' of SCS) van geselecteerde lactobacilli tegen Propionibacterium acnes. Groei van de bacteriën (optische densiteit bij 600nm; Y-as) wordt gemeten in functie van de tijd (X-as) . Elke grafiek toont herhalingen van de groei van P. acnes. Er is duidelijk te zien dat zonder toevoeging van antibiotica of SCS, P. acnes snel begint te groeien (NC1).

Analoog als bij toevoeging van erythromycine aan 50yg/ml, zorgt SCS van alle lactobacilli voor inhibitie van groei van P. acnes in tegenstelling tot SCS van streptokokken en stafylokokken dat de groei van P. acnes niet inhibeert. *Erythromycine (50ug/ml); #Erythromycine (5ug/ml); §Minocycline (20 yg/ml) NCl=medium controle; NC2=MRS op pH4.3; Nummers 1 tot 22 = lactobacilli stammen (voor details zie tabel 1); St=Streptococcus thermophilus; Ss=Streptococcus salivarius; Se=Staphylococcus epidermidis; T0.5=0.5% Tween 80; Tl=l% Tween 80.

UITVOERIGE BESCHRIJVING VAN DE UITVINDING

De huidige uitvinding is gebaseerd op de ontdekking van specifieke Lactobacillus-stammen die kunnen concurreren met de groei van Propionibacterium acnes, Candida albicans, Malassezia spp., Trichophyton spp. en bacteriën of schimmels die verbonden zijn met huidaandoeningen zoals acne vulgaris, roos, tinea pedis of andere schimmel- of huidinfecties. De geselecteerde stammen worden hierin algemeen aangeduid als "YUN" stammen en kunnen concurreren met de huidpathogenen en daarmee een gezonde huidmicrobiota herstellen. Dit herstel van een gezonde microflora valt onder de term probiotherapie, gedefinieerd als het gebruik van nuttige micro-organismen of probiotica die een gezonde microflora herstellen op de plaats waar de microbiële dysbiose plaatsvindt

Bijgevolg verstrekt de huidige uitvinding in een eerste aspect een topische dermatologische formulering die één of meer levende Lactobacillus soorten bevat; waarbij ten minste één van de Lactobacillus soorten L. plantarum is; meer in het bijzonder een L. plantarum stam met ten minste 97% sequentiegelijkheid met SEQ ID N ° 4 in het 16S rRNA gen.

De samenstelling volgens de huidige uitvinding kunnen verder Lactobacillus soorten bevatten zoals bijvoorbeeld gekozen uit de niet-beperkende lijst: L. pentosus, L. gasseri, L. crispatus, L. acidophilus, L. jensenii, L. fermentum, L. rhamnosus.

In de context van de huidige uitvinding wordt onder de term "topisch(e)" begrepen: de lokale aflevering op een bepaalde plaats van het lichaam, vooral de toediening op een gespecifieerde plaats op of in het lichaam. In het bijzonder omvat ze de toepassingen via niet-vaste formuleringen zoals crèmes, schuimen, gels, lotions of zalven. De term "topische" is niet bedoeld om toedieningsvormen van vaste preparaten zoals capsules, tabletten te omvatten, ...

Bijgevolg wordt het volgende begrepen onder de term "topisch dermatologisch"; de lokale afgifte van niet-vaste formuleringen direct op de huid. Bij voorkeur worden de samenstellingen volgens de huidige uitvinding aangebracht over een groot oppervlak van de huid om het meest effectief te zijn.

In de context van de huidige uitvinding wordt met de term "levende Lactobacillus species" bedoeld: levensvatbare Lactobacillus soorten, en niet fragmenten, cultuursupernatans of gedode vormen hiervan.

In een verder aspect verstrekt de huidige uitvinding een levende Lactobacillus soort voor gebruik als probiotherapie van de huid, door topische weg, waarbij de Lactobacillus species L. plantarum is; meer in het bijzonder een L. plantarum stam met ten minste 97% sequentiegelijkheid met SEQ ID N ° 4 in het 16S rRNA gen. Zoals hierboven reeds gedefinieerd, waarbij probiotherapie is bedoeld voor het herstel en/of onderhoud van een gezonde huidmicrobiota in een patiënt die daaraan behoefte heeft.

Personen die voordeel kunnen hebben bij deze probiotherapie zijn bijvoorbeeld personen met huidaandoeningen gelinkt aan een verstoorde huidmicrobiota mogelijk door bacteriële of schimmelinfecties en/of dysbioses door overgroei van bepaalde pathogene micro-organismen, zoals acne vulgaris, tinea pedis, roos, rosaceae, impetigo, ...

Bijgevolg verstrekt de huidige uitvinding in een verder aspect het gebruik van één of meer levende Lactobacillus species, in de bereiding van een topische formulering voor de huid voor het herstellen en/of onderhouden van een gezonde huidmicrobiota; waarbij ten minste één van de Lactobacillus soorten L. plantarum is; meer in het bijzonder een L. plantarum stam met ten minste 97% sequentiegelijkheid met SEQ ID N ° 4 in het 16S rRNA gen.

De huidige uitvinding verstrekt ook een werkwijze voor het herstellen en/of onderhouden van een gezonde huidmicrobiota; met ten minste één stap door toedienen via topische weg van een effectieve hoeveelheid van één of meer levende Lactobacillus soorten aan een individu; waarbij ten minste één van de Lactobacillus soorten L. plantarum is; meer in het bijzonder een L. plantarum stam met ten minste 97% sequentiegelijkheid met SEQ ID N ° 4 in het 16S rRNA gen.

In nog een ander aspect verstrekt de huidige uitvinding een formulering die één of meer levende Lactobacillus soorten bevat voor gebruik bij het herstellen en/of onderhouden van een gezonde huidmicrobiota, via topische toediening, waarbij Lactobacillus species worden gekozen uit de lijst bestaande uit L. plantarum, L. pentosus en L. rhamnosus; meer in het bijzonder een L. plantarum stam met ten minste 97% sequentiegelijkheid met SEQ ID N ° 4 in het 16S rRNA gen; een L. pentosus stam met ten minste 97% sequentiegelijkheid met SEQ ID N ° 1 in het 16S rRNA gen en een L. rhamnosus stam die ten minste 97% sequentiegelijkheid met SEQ ID N ° 5 in het 16S rRNA gen.

De uitvinding voorziet verder een Lactobacillus stam gekozen uit de lijst bestaande uit L. pentosus YUN-V1.0 gedeponeerd onder 'deposit number' LMG P-29455 (gedeponeerd bij BCCM op 9 maart 2016); L. plantarum YUN-V2.0 gedeponeerd onder 'deposit number' LMG P-29456 (gedeponeerd bij BCCM op 9 maart 2016); en L. rhamnosus YUN-S1.0 gedeponeerd onder 'deposit number' LMG P-29611 (gedeponeerd bij BCCM op 12 mei 2016).

De microbiologische 'deposits' die hier worden genoemd, zijn gedaan bij BCCM/LMG of de Belgische gecoördineerde verzamelingen van micro-organisme met correspondentieadres: Laboratorium voor Microbiologie, Universiteit Gent, K.L. Ledeganckstraat 35, 9000 Gent, België.

Lactobacillus pentosus YUN-V1.0 is een 'single colony' isolaat verkregen in ons labo na subcultivatie van een stam, oorspronkelijk een vaginale isolaat van een gezonde vrouw. De 16S rRNA gensequentie (SEQ ID N 1) voor stam L. pentosus YUN-V1.0 werd bepaald door PCR met primers 8F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 SEQ ID N ° 2) en 1525R (5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3 SEQ ID N ° 3). YUN-V2.0 en YUN-V3.0 zijn 'single colony' isolaten in ons labo verkregen na subcultivatie van Lactobacillus plantarum stammen die oorspronkelijk werden geïsoleerd uit respectievelijk menselijk speeksel en een maissilo. De 16S rRNA gensequentie (SEQ ID N ° 4) voor L. plantarum stam YUN-V2.0 werd bepaald door PCR met primers 8F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 SEQ ID N ° 2) en 1525R (5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3 SEQ ID N ° 3). YUN-S1.0 is een 'single colony' isolaat verkregen in ons labo na subcultivatie van een Lactobacillus rhamnosus stam die oorspronkelijk werd geïsoleerd uit een gezonde persoon. De 16S rRNA gensequentie (SEQ ID Nr 5) voor stam L. rhamnosus YUN-S1.0 werd bepaald door PCR met primers 8F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 SEQ ID N ° 2) en 1525R (5' -AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3 SEQ ID N ° 3).

Deze specifieke "YUN" stammen kunnen worden gebruikt als zodanig of bij voorkeur geformuleerd in producten met deze stammen. Genoemde producten zijn dermatologische toedieningsvomen in het bijzonder in de vorm van niet-vaste formuleringen zoals crèmes, schuimen, gels, lotions of zalven.

In het bijzonder verstrekt de huidige uitvinding de boven gedefinieerde "YUN" stammen voor gebruik in probiotherapie, d.w.z. voor het herstellen en/of onderhouden van een gezonde huidmicrobiota.

In nog een ander aspect verstrekt de huidige uitvinding een topische toepassing van één of meer levende Lactobacillus soorten als probiotherapie van de huid; waarbij genoemde Lactobacillus soorten worden gekozen uit de lijst bestaande uit L. plantarum, L. pentosus en L. rhamnosus; meer in het bijzonder omvat de genoemde probiotherapie het herstellen en/of onderhouden van een gezonde huidmicrobiota bij een patiënt die daaraan behoefte heeft.

In een specifieke toepassing zijn de Lactobacillus species in de topische toepassingen, werkwijzen en samenstellingen zoals hierin beschreven, Lactobacillus stammen gekozen uit de lijst bestaande uit L. plantarum YUN-V2.0 gedeponeerd onder 'deposit number' LMG P-29456 (gedeponeerd bij BCCM op 9 maart 2016); L. pentosus YUN-V1.0 gedeponeerd onder 'deposit number' LMG P-29455 (gedeponeerd bij BCCM op 9 maart 2016); en L. rhamnosus YUN-S1.0 gedeponeerd onder 'deposit number' LMG P-29611 (gedeponeerd bij BCCM op 12 mei 2016).

VOORBEELDEN

MATERIAAL EN METHODEN

Bacteriële stammen en groeicondities

Lactobacillus stammen (Tabel 1) werden opgegroeid bij 37°C in de Man, Rogosa en Sharpe (MRS) medium (Carl Roth) . Alle bacteriën werden niet-schuddend gekweekt en geinoculeerd uit glycerol stocks (-80 °C) . Vaste media bevatten 1,5% (w/v) agar.

Tabel 1: De gebruikte bacteriële stammen in dit onderzoek

Bereiding van 'spent culture supernatant' (SCS) van de geselecteerde stammen

Om cultuursupernatans (SCS) te verkrijgen met de

gesecreteerde actieve antimicrobiële componenten, werd groeimedium specifiek voor elke soort geïnoculeerd vanuit een precultuur en geïncubeerd gedurende 24 uur. SCS werd verkregen door centrifugatie gedurende 30 min. aan 6797 g (8000 rpm) bij 4 °C. Daarna werd het SCS gefiltersteriliseerd (0,20 ym celluloseacetaat, VWR).

Antimicrobiële activiteit van levende lactobacilli in coculturen met Malassezia furfur, Trichophyton rubrum, Propionibacterium acnes en Candida albicans.

De antimicrobiële activiteit van de geselecteerde bacteriën werd onderzocht door middel van standaard antimicrobiële testen met enkele kleine wijzigingen. De antimicrobiële activiteit van de geselecteerde bacteriën werd onderzocht door een 'spot assay' (Schillinger en Lücke 1989). Kort samengevat, 1-3 μΐ van elke kweek werd gespot op een agarplaat. Deze platen werden gedurende 24 tot 72 uur geïncubeerd afhankelijk van de stam. Vervolgens werd een overnachtcultuur van de pathogeen verdund in 7 ml 'soft agar' van het medium van de pathogeen en uitgegoten over de platen met de 'spots' van de geselecteerde stammen. De platen werden overnacht geïncubeerd bij 30-37 °C, waarna de inhibitiezones werden gemeten. Een 'spot' van miconazol (voor schimmels) en/of 0,1% hexetidine en/of tetracycline (voor Propionibacterium acnes) werd toegevoegd aan de plaat als positieve controle vooraleer de 'soft agar' werd gegoten. 'Radial diffusion' test van SCS van lactobacilli

Bovendien werd de antimicrobiële activiteit van het cultuursupernatans (SCS) onderzocht met een protocol zoals eerder beschreven voor competitie-testen tussen lactobacilli en gastro-intestinale pathogenen (Coconnier et al. 1997). Miconazol (voor schimmels) en tetracycline (voor Propionibacterium acnes) werden gebruikt als een positieve controle. Steriel groeimedium werd gebruikt als negatieve controle.

Antimicrobiële activiteit van SCS van de geselecteerde stammen tegen Candida, Propionibacterium acnes, Malassezia furfur and Trichophyton spp (verder aangehaald als 'pathogenen') met behulp van spectro fotometrische bepalingen in de tijd

Spectrofotometrische bepalingen in de tijd werden eveneens uitgevoerd zoals eerder beschreven (De Keersmaecker et al. 2006) met kleine modificaties. Kort samengevat werd een overnachtcultuur van de bacterie toegevoegd aan de 'wells' van een microtiterplaat gevuld met 50-80% van het gepaste medium en 50-5% SCS lactobacillen. MRS bij pH 4,3 en antibiotica en antimycotica in de juiste concentratie werden respectievelijk gebruikt als negatieve en als positieve controle. Bacteriën of schimmels werden gekweekt en de optische dichtheid (OD) werd gemeten bij 590 nm elke 30 min gedurende 3 dagen met een Synergy HTX multimodus reader (Biotek) . Elke test werd ten minste in drievoud gemeten en de gemiddelde OD werd berekend. De antimicrobiële activiteit werd uitgedrukt als de relatieve optische densiteit bereikt na 24 uur (stationaire fase) in vergelijking met de negatieve controles.

Antibiogram met behulp van Kirby-Bauer test

Gevoeligheid voor antibiotica werd geëvalueerd met behulp van de Kirby-Bauer diffusietest. In het kort werden antibiotica gespot op papieren schijfjes en werd de bacteriële inhibitiezone gemeten op agarplaten. De geteste antibiotica waren erythromycine, normocin, tetracycline, ampicilline en clindamycine bij relevante concentraties.

Klinische studie ('proof-of-concept') bij patiënten met acne vulgaris

Een 'proof-of-concept' klinische studie werd uitgevoerd op 20 patiënten met acne vulgaris. De patiënten waren mannen tussen 12-25 jaar met milde inflammatoire acne. Het doel van deze 'proof-of-concept' studie was om het effect van een topische probiotische crème (met +-10-8 kolonievormende eenheden (CFU) van L. pentosus YUN-V1.0, +-10-8 CFU L. plantarum YUN-V2.0 en +-10-8 CFU L. rhamnosus YUN-S1.0 per toepassing van lg van de topische crème ACN) te beoordelen op de huidmicrobiota en op de acne. Patiënten werden gevraagd om de crème tweemaal daags aan te brengen gedurende 56 dagen (8 weken). De patiënten werden gezien door een dermatoloog bij de start (voor de therapie) en op week 4, week 8 en week 10. Een huiduitstrijkje werd genomen bij elk bezoek. Bacterieel DNA werd geïsoleerd uit deze monsters door de commerciële Mobio Powersoil kit (cfr. 'Human Microbiome Project'). Geïsoleerd DNA werd geanalyseerd via 16S rRNA amplicon sequencing met MiSeq Illumina en een bio-informatische analyse werd uitgevoerd. Bovendien werd een klinische scoring uitgevoerd en een foto genomen bij elk bezoek.

Klinische studie ('proof-of-concept') bij patiënten met tinea pedis ( ’zwemmerseczeem')

Een 'proof-of-concept' klinische studie werd uitgevoerd op 20 patiënten met tinea pedis. De patiënten waren tussen de 18-65 jaar met tinea pedis. Het doel van deze 'proof-of-concept' studie was om het effect van een topische probiotische crème (met +-10-8 kolonievormende eenheden (CFU) van L. pentosus YUN-V1.0, +-10-8 CFU L. plantarum YUN-V2.0 en +-10-8 CFU L. rhamnosus YUN-S1.0 per toepassing van lg van de actueel crème FNG) te beoordelen op de huidmicrobiota en de Trichophyton-infectie. Patiënten werden gevraagd om de crème tweemaal daags aanvragen 56 dagen (8 weken). De patiënten werden gezien door een dermatoloog bij de start (voor de therapie) en op week 4, week 8 en week 10. Een huiduitstrijkje werd genomen bij elk bezoek. Bacterieel DNA werd geïsoleerd uit deze monsters door de commerciële Mobio Powersoil kit (cfr. 'Human Microbiome Project'). Geïsoleerd DNA werd geanalyseerd via 16S rRNA amplicon sequencing met MiSeq Illumina en een bio-informatische analyse werd uitgevoerd. Voor analyse van de aanwezigheid van de schimmels werden de uitstrijkjes ook uitgeplaat op Trichophyton-specifiek medium (medium voorgesteld door BCCM). Kolonie PCR werd uitgevoerd met behulp van universele ITS ( 'internal transcribed region') primers ITS1 (SEQ ID Nr 6) (5' -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3' ) en ITS4 (SEQ ID Nr 7) (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 '), gevolgd door sequentiebepaling om de schimmels te identificeren. Bovendien werd een klinische scoring uitgevoerd en werd een foto genomen bij elk bezoek.

RESULTATEN

Groeikarakteristieken en lactaatproductie

Mogelijk nuttige of probiotische stammen werden gekarakteriseerd in termen van groeikarakteristieken, lactaatproductie en de mogelijkheid van het verlagen van de pH van het medium. Deze eigenschappen worden verwacht van belang te zijn voor de antipathogene activiteit. Deze gegevens tonen aan dat Lactobacillus pentosus YUN-V1.0, L. plantarum YUN-V2.0 en L. rhamnosus YUN-S1.0 de hoogste hoeveelheid melkzuur produceren (Fig 1) .

Antipathogene activiteit tegen Propionibacterium acnes

Kinetische experimenten werden uitgevoerd voor de analyse van de antimicrobiële activiteit van cultuurnsupernatans (SCS) van de geselecteerde stammen tegen Propionibacterium acnes. SCS van alle geteste lactobacilli remde de groei van Propionibacterium acnes terwijl SCS van andere bacteriesoorten zoals Streptococcus thermophilus en S. salivarius, beiden ook melkzuurbacteriën, en Staphyloccus epidermidis de groei van P. acnes niet inhibeerden. Dit suggereert dat de soort- en stam-specifieke eigenschappen van de geselecteerde lactobacillen belangrijk zijn voor de antipathogene activiteit tegen P. acnes (Fig 2).

Antipathogene activiteit tegen Malassezia, Trichophyton and Candida

In een volgende fase werden de gunstige of probiotische bacteriën gescreend op het antipathogene effect tegen specifieke huidpathogenen. De resultaten van de 'spot assays' tegen Malassezia furfur, Trichophyton rubrum en Candida albicans worden weergegeven in tabel 2, 3 en 4 respectievelijk.

Tabel 2: 'Spot assay' van de geselecteerde lactobacilli tegen Malassezia furfur. *arie onatnanKeii]Ke nernaiingen

Tabel 3: 'Spot assay' van de geselecteerde lactobacilli tegen Trichophyton rubrum.

*drie onafhankelijke herhalingen

Tabel 4: 'Radial diffusion assay' van de geselecteerde lactobacilli tegen Candida albicans.

*drie onafhankelijke herhalingen

Cultuursupernatans van L. pentosus YUN-V1.0 en L. plantarum YUN-V2.0 werd ook getest in 'radial diffusion assays' en bleek efficiënt in het inhiberen van de groei van Malassezia, Trichophyton en Candida. L. rhamnosus YUN-S1.0 bleek niet zo efficiënt bij het remmen van de groei van Malassizia maar wel van Trichophyton en Candida.

Antibiogram met behulp van Kirby-Bauer test

De geselecteerde bacteriën werden ook getest op hun gevoeligheid voor antibiotica om verspreiding te voorkomen van antibioticaresistentiegenen. Alle lactobacilli waren gevoelig voor erythromycine, normocin, tetracycline, ampicilline en clindamycine, behalve L. plantarum 5057, die niet gevoelig bleek voor tetracycline. Daarom werd stam L. plantarum 5057 niet geschikt bevonden als een stam voor probiotherapie.

REFERENTIES

Beylot, C. et al., 2014. Propionibacterium acnes: an update on its role in the pathogenesis of acne. Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology : JEADV, 28(3), pp.271-8.

Chan, R.C. et al., 1985. Competitive exclusion of uropathogens from human uroepithelial cells by

Lactobacillus whole cells and cell wall fragments. Infection and immunity, 47(1), pp.84-9.

Chan, R.C., Bruce, A.W. & Reid, G., 1984. Adherence of cervical, vaginal and distal urethral normal microbial flora to human uroepithelial cells and the inhibition of adherence of gram-negative uropathogens by competitive exclusion. The Journal of urology, 131(3), pp.596-601.

Grice, E.A. & Segre, J.A., 2011. The skin microbiome.

Nature revlews. Microbiology, 9(4), pp.244-53.

Reid, G., 1999. The Scientific Basis for Probiotic Strains of Lactobacillus. Appl. Envir. Mlcrobiol., 65(9), pp.3763-3766.

Reid, G. & Bruce, A.W., 2001. Selection of lactobacillus strains for urogenital probiotic applications. The Journal of infectlous dlseases, 183 Suppl , pp.S77-80.

Sugita, T. et al., 2015. Temporal changes in the skin Malassezia microbiota of members of the Japanese Antarctic Research Expedition (JARE): A case study in Antarctica as a pseudo-space environment. Medical mycology, 53(7), pp.717-24.

Wang, L. et al., 2015. Characterization of the major bacterial-fungal populations colonizing dandruff scalps in Shanghai, China, shows microbial disequilibrium. Experimental dermatology, 24(5), pp.398-400.

LIJST MET SEQUENTIES

<110> YUN NV

<120> DERMATOLOGISCHE PREPARATEN VOOR HET ONDERHOUDEN ΕΝ/OF HERSTELLEN VAN EEN GEZONDE HUIDMICROBIOTA <130> AXC-007 <160> 7 <170> BiSSAP 1.3

<210> 1 <211> 1406 <212> RNA <213> Lactobacillus pentosus <220> <223> 16S rRNA sequentie <400> 1 cttaggcggc tggttcctaa aaggttaccc caccgacttt gggtgttaca aactctcatg 60 gtgtgacggg cggtgtgtac aaggcccggg aacgtattca ccgcggcatg ctgatccgcg 120 attactagcg attccgactt catgtaggcg agttgcagcc tacaatccga actgagaatg 180 gctttaagag attagcttac tctcgcgagt tcgcaactcg ttgtaccatc cattgtagca 240 cgtgtgtagc ccaggtcata aggggcatga tgatttgacg tcatccccac cttcctccgg 300 tttgtcaccg gcagtctcac cagagtgccc aacttaatgc tggcaactga taataagggt 360 tgcgctcgtt gcgggactta acccaacatc tcacgacacg agctgacgac aaccatgcac 420 cacctgtatc catgtccccg aagggaacgt ctaatctctt agatttgcat agtatgtcaa 480 gacctggtaa ggttcttcgc gtagcttcga attaaaccac atgctccacc gcttgtgcgg 540 gcccccgtca attcctttga gtttcagcct tgcggccgta ctccccaggc ggaatgctta 600 atgcgttagc tgcagcactg aagggcggaa accctccaac acttagcatt catcgtttac 660 ggtatggact accagggtat ctaatcctgt ttgctaccca tactttcgag cctcagcgtc 720 agttacagac cagacagccg ccttcgccac tggtgttctt ccatatatct acgcatttca 780 ccgctacaca tggagttcca ctgtcctctt ctgcactcaa gtttcccagt ttccgatgca 840 cttcttcggt tgagccgaag gctttcacat cagacttaaa aaaccgcctg cgctcgcttt 900 acgcccaata aatccggaca acgcttgcca cctacgtatt accgcggctg ctggcacgta 960 gttagccgtg gctttctggt taaataccgt caatacctga acagttactc tcagatatgt 1020 tcttctttaa caacagagtt ttacgagccg aaacccttct tcactcacgc ggcgttgctc 1080 catcagactt tcgtccattg tggaagattc cctactgctg cctcccgtag gagtttgggc 1140 cgtgtctcag tcccaatgtg gccgattacc ctctcaggtc ggctacgtat cattgccatg 1200 gtgagccgtt accccaccat ctagctaata cgccgcggga ccatccagaa gtgatagccg 1260 aagccatctt tcaaactcgg accatgcggt ccaagttgtt atgcggtatt agcatctgtt 1320 tccaggtgtt atcccccgct tctgggcagg tttcccacgt gttactcacc agttcgccac 1380 tcactcaaat gtaaatcatg atgcaa 1406

<210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Kunstmatige Sequentie <220> <223> Primer 8F <400> 2 agagtttgat cctggctcag 20

<210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Kunstmatige Sequentie <220> <223> Primer 1525R <400> 3 aaggaggtga tccagccgca 20

<210> 4 <211> 1425 <212> RNA <213> Lactobacillus plantarum <220> <223> 16S rRNA <400> 4 ggttcctaaa aggttacccc accgactttg ggtgttacaa actctcatgg tgtgacgggc 60 ggtgtgtaca aggcccggga acgtattcac cgcggcatgc tgatccgcga ttactagcga 120 ttccgacttc atgtaggcga gttgcagcct acaatccgaa ctgagaatgg ctttaagaga 180 ttagcttact ctcgcgagtt cgcaactcgt tgtaccatcc attgtagcac gtgtgtagcc 240 caggtcataa ggggcatgat gatttgacgt catccccacc ttcctccggt ttgtcaccgg 300 cagtctcacc agagtgccca acttaatgct ggcaactgat aataagggtt gcgctcgttg 360 cgggacttaa cccaacatct cacgacacga gctgacgaca accatgcacc acctgtatcc 420 atgtccccga agggaacgtc taatctctta gatttgcata gtatgtcaag acctggtaag 480 gttcttcgcg tagcttcgaa ttaaaccaca tgctccaccg cttgtgcggg cccccgtcaa 540 ttcctttgag tttcagcctt gcggccgtac tccccaggcg gaatgcttaa tgcgttagct 600 gcagcactga agggcggaaa ccctccaaca cttagcattc atcgtttacg gtatggacta 660 ccagggtatc taatcctgtt tgctacccat actttcgagc ctcagcgtca gttacagacc 720 agacagccgc cttcgccact ggtgttcttc catatatcta cgcatttcac cgctacacat 780 ggagttccac tgtcctcttc tgcactcaag tttcccagtt tccgatgcac ttcttcggtt 840 gagccgaagg ctttcacatc agacttaaaa aaccgcctgc gctcgcttta cgcccaataa 900 atccggacaa cgcttgccac ctacgtatta ccgcggctgc tggcacgtag ttagccgtgg 960 ctttctggtt aaataccgtc aatacctgaa cagttactct cagatatgtt cttctttaac 1020 aacagagttt tacgagccga aacccttctt cactcacgcg gcgttgctcc atcagacttt 1080 cgtccattgt ggaagattcc ctactgctgc ctcccgtagg agtttgggcc gtgtctcagt 1140 cccaatgtgg ccgattaccc tctcaggtcg gctacgtatc attgccatgg tgagccgtta 1200 ccccaccatc tagctaatac gccgcgggac catccaaaag tgatagccga agccatcttt 1260 caagctcgga ccatgcggtc caagttgtta tgcggtatta gcatctgttt ccaggtgtta 1320 tcccccgctt ctgggcaggt ttcccacgtg ttactcacca gttcgccact cactcaaatg 1380 taaatcatga tgcaagcacc aatcaatacc agagttcgtt cgact 1425

<210> 5 <211> 1403 <212> RNA <213> Lactobacillus rhamnosus <220> <223> 16S rRNA <400> 5 gtcgacgagt tctgattatt gaaaggtgct tgcatcttga tttaattttg aacgagtggc 60 ggacgggtga gtaacacgtg ggtaacctgc ccttaagtgg gggataacat ttggaaacag 120 atgctaatac cgcataaatc caagaaccgc atggttcttg gctgaaagat ggcgtaagct 180 atcgcttttg gatggacccg cggcgtatta gctagttggt gaggtaacgg ctcaccaagg 240 caatgatacg tagccgaact gagaggttga tcggccacat tgggactgag acacggccca 300 aactcctacg ggaggcagca gtagggaatc ttccacaatg gacgcaagtc tgatggagca 360 acgccgcgtg agtgaagaag gctttcgggt cgtaaaactc tgttgttgga gaagaatggt 420 cggcagagta actgttgtcg gcgtgacggt atccaaccag aaagccacgg ctaactacgt 480 gccagcagcc gcggtaatac gtaggtggca agcgttatcc ggatttattg ggcgtaaagc 540 gagcgcaggc ggttttttaa gtctgatgtg aaagccctcg gcttaaccga ggaagtgcat 600 cggaaactgg gaaacttgag tgcagaagag gacagtggaa ctccatgtgt agcggtgaaa 660 tgcgtagata tatggaagaa caccagtggc gaaggcggct gtctggtctg taactgacgc 720 tgaggctcga aagcatgggt agcgaacagg attagatacc ctggtagtcc atgccgtaaa 780 cgatgaatgc taggtgttgg agggtttccg cccttcagtg ccgcagctaa cgcattaagc 840 attccgcctg gggagtacga ccgcaaggtt gaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca 900 caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgaa gaaccttacc aggtcttgac 960 atcttttgat cacctgagag atcaggtttc cccttcgggg gcaaaatgac aggtggtgca 1020 tggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct 1080 tatgactagt tgccagcatt tagttgggca ctctagtaag actgccggtg acaaaccgga 1140 ggaaggtggg gatgacgtca aatcatcatg ccccttatga cctgggctac acacgtgcta 1200 caatggatgg tacaacgagt tgcgagaccg cgaggtcaag ctaatctctt aaagccattc 1260 tcagttcgga ctgtaggctg caactcgcct acacgaagtc ggaatcgcta gtaatcgcgg 1320 atcagcacgc cgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacaccatga 1380 gagtttgtaa cacccgaagc cgg 1403

<210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Kunstmatige Sequentie <220> <223> Primer Sequentie <400> 6 tccgtaggtg aacctgcgg 19

<210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Kunstmatige Sequentie <220> <223> Primer Sequentie <400> 7 tcctccgctt attgatatgc 20

Claims (13)

1. Een topische dermatologische formulering die één of meer levende Lactobacillus soorten bevat; waarbij ten minste één van de Lactobacillus species een L. plantarum stam is met ten minste 97% sequentiegelijkheid met SEQ ID N ° 4 in het 16S rRNA gen.

2. Een levende Lactobacillus species voor gebruik bij het herstellen en/of onderhouden van een gezonde huidmicrobiota, door topische toediening, waarbij het Lactobacillus species een L. plantarum stam is met ten minste 97% sequentiegelijkheid met SEQ ID N ° 4 in het 16S rRNA gen.

3. Gebruik van één of meer levende Lactobacillus species, in de bereiding van een topische dermatologische formulering voor het herstellen en/of onderhouden van een gezonde huidmicrobiota; waarbij ten minste één van de Lactobacillus species een L. plantarum stam is met ten minste 97% sequentiegelijkheid met SEQ ID N ° 4 in het 16S rRNA gen.

4. Methode voor het herstellen en/of onderhouden van een gezonde huidmicrobiota; met ten minste één stap door toediening via topische weg van een effectieve hoeveelheid van één of meer levende Lactobacillus soorten aan een individu; waarbij ten minste één van de Lactobacillus species een L. plantarum stam is met ten minste 97% sequentiegelijkheid met SEQ ID N ° 4 in het 16S rRNA gen.

5. Een formulering die één of meer levende Lactobacillus soorten bevat voor gebruik bij het herstellen en/of onderhouden van een gezonde huidmicrobiota, door topische toediening, waarbij een Lactobacillus species wordt gekozen uit de lijst bestaande uit L. plantarum, L. pentosus en L. rhamnosus; waarbij de L. plantarum een L. plantarum stam is met ten minste 97% sequentiegelijkheid met SEQ ID N ° 4 in het 16S rRNA gen, waarbij de L. pentosus een L. pentosus stam is met ten minste 97% sequentiegelijkheid met SEQ ID N 1 in het 16S rRNA gen en de L. rhamnosus een L. rhamnosus stam is met ten minste 97% sequentiegelijkheid met SEQ ID N ° 5 in het 16S rRNA gen.

6. Een Lactobacillus stam die L. rhamnosus YUN-S1.0 is die gedeponeerd werd onder 'deposit number' LMG P-29611 (gedeponeerd bij BCCM op 12 mei 2016).

7. Een formulering die een Lactobacillus stam bevat zoals gedefinieerd in claim 6.

8. De formulering volgens claim 7; waarbij de formulering een topische dermatologische formulering is .

9. Het gebruik volgens claim 3 of de formulering volgens een van de claims 1, 5, 7 of 8 waarbij de formulering een topische dermatologische formulering is in de vorm van een gel, crème, ovule, zetpil, schuim, lotion of zalf.

10. Een Lactobacillus stam volgens claim 6 of een formulering volgens één der claims 7 of 8; voor gebruik in het herstellen en/of onderhouden van een gezonde huidmicrobiota, door topische toediening.

11. Topische toepassing van één of meer levende Lactobacillus soorten in probiotherapie van de huid; waarbij de genoemde Lactobacillus soorten worden gekozen uit de lijst bestaande uit L. plantarum, L. pentosus en L. rhamnosus.

12. Topische toepassing volgens claim 11; waarbij probiotherapie bestaat uit het herstellen en/of onderhouden van een gezonde huidmicrobiota bij een patiënt die daaraan behoefte heeft.

13. Topisch gebruik volgens één van de claims 11 of 12, het gebruik volgens claim 3, met de werkwijze zoals gedefinieerd in claim 4, de levende Lactobacillus soorten zoals gedefinieerd in claim 2, of de formulering volgens claim 5; waarbij de genoemde Lactobacillus soort een Lactobacillus stam is gekozen uit de lijst bestaande uit L. plantarum YUN-V2.0 gedeponeerd onder 'deposit number' LMG P-29456; L. pentosus YUN-V1.0 met 'deposit number' LMG P-29455; en L. rhamnosus YUN-S1.0 met 'deposit number' LMG P-29611.