CN116004464A - 一株植物乳杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分离的植物乳杆菌‑3(L.plantarum‑3)菌株、包含其的组合物及其用途。

Description

一株植物乳杆菌及其应用

发明领域

本发明涉及微生物领域，具体涉及分离的植物乳杆菌菌株，包含其的组合物及其应用。

背景技术

女性阴道系统有三道防线：解剖结构、阴道黏膜和微生态菌群，其中最关键的一道防线就是微生态菌群。健康女性阴道内有200多种微生物，其中95％为乳酸菌，包括卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)、格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、詹氏乳杆菌(Lactobacillus jensenii)和惰性乳杆菌(Lactobacillus iners)等在内的若干乳杆菌属(Lactobacillus)细菌占据主导地位。阴道内正常菌群与宿主、环境保持着协调、动态的平衡，即阴道微生态平衡。一旦乳酸菌数量减少，阴道微生态平衡被打破，致病菌数量增多或外源病原体侵入，阴道菌群异常和阴道pH值异常，就有可能导致炎症的发生。在细菌性阴道炎中，阴道内微生态的平衡朝向厌氧菌定殖转变，特别地，阴道加德纳耐药菌(Gardnerellavaginalis)和阴道阿托波氏菌(Atopobium vaginae)等较为常见(Srinivasan和Fredricks，2008)。若阴道内微生态长期处于失衡状态，阴道炎便会反复发作。大量文献表明，阴道炎会导致多种并发症和后遗症。例如，阴道炎会导致盆腔炎和宫颈炎，对孕妇健康也有更加严重的威胁，如增加怀孕前3个月流产的风险、胎膜早破、绒毛膜羊膜炎以及早产。此外，阴道微生态环境的改变与尿路感染也有关联。

目前，各国临床指南推荐的治疗阴道炎的一线用药方案是以甲硝唑或克林霉素为代表的抗生素药物疗法。但是，抗生素药物疗法可能会造成有益菌群的损伤，长期使用更有可能出现阴道菌群耐药的现象。

益生菌在治疗妇女阴道炎过程中发挥着重要的作用，其通过产生乳酸和多种抗菌化合物抑制病原微生物的生长，还通过竞争黏附激发免疫系统，从而达到治疗阴道炎的效果(Kurt Selle和Todd R.Klaenhammer，2013；Craig R.Cohen，2020；Charlotte van derVeer，2019)。外源性补充益生菌，通过益生菌来抑制致病菌等的繁殖生长成为预防或治疗阴道炎的一种新疗法。此外，通过益生菌的补充，也可以通过脑肠轴或者其它机制用于预防或治疗病原体相关的疾病或病症、免疫调节相关的疾病或病症(Wanil Kim等，2020；Petervan Baarlen等，2009；Sandra Voltan等，2008；F.Blanchet等，2021；Hirotaka Kawanabe-Matsuda等，2022；Kyosuke Kobayashi等，2019；Nuno R Nené等，2019；Paola Roggero等，2020；Luisa Cervantes-Barragan，2017)、骨质疏松相关的疾病或病症(Claes Ohlsson等，2014；Xin Xu等，2017；A.G.Nilsson等，2018；Abdul Malik Tyagi，2018)或者与缺铁性贫血(Susan C.Vonderheid等，2019；Stine Bering，2006；Zatollah Asemi和AhmadEsmaillzadeh，2013；Michael Hoppe等，2017；Ulrika Axling等，2021；Nathalie Scheers等，2016；Michael Hoppe等，2015)、更年期综合征或神经中枢系统疾病相关的疾病或病症。

发明内容

本发明提供了一株新的植物乳杆菌菌株，其在拮抗致病菌、耐受消化液、肠道定殖等方面具有改进性质。

一方面，本发明提供植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株，其保藏编号为CGMCCNo.19523。在一些实施方案中，本发明所提供的菌株分离自生殖道分泌物。

在一些实施方案中，本发明所提供的菌株具有如下一种或多种性质：(i)在模拟胃液中孵育3小时后存活率至少为50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％；(ii)在模拟肠液中孵育4小时后存活率至少为50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％或94％；(iii)相比于L.rhamnosus GR-1、L.reuteri RC-14或两者，其具有对Caco-2细胞、VK2/E6E7细胞或两者更高的粘附能力；(iv)相比于L.rhamnosus GR-1、L.reuteri RC-14或两者，其具有对铜绿假单胞菌、伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、阴道加德纳耐药菌、阿托波氏菌、糠秕马拉色菌或任意组合更高的抑菌能力；(v)对阴道加德纳菌、白色念珠菌或任意组合具有显著的抑制能力，而且将乳杆菌数量恢复到正常水平以上，同时缓解外阴水肿、分泌物多等症状，恢复阴道粘膜损伤；(vi)相比于L.rhamnosusGR-1，其对抗原诱导的组胺释放、Th2型细胞因子(IL-4和/或IL-5)的分泌和/或IgE的分泌具有更强的抑制作用；(vii)降低皮炎评分、抓挠时间和皮肤厚度，显著减轻特应性皮炎；(viii)对经卵清蛋白(OVA)诱导的过敏性哮喘具有治疗和预防作用，且通过抑制作为介导过敏性反应的Th2型细胞因子的IL-5和IL-13的分泌来发挥其对过敏性哮喘的治疗性和预防性作用；和(ix)在屋尘螨(HDM)诱导的过敏性哮喘中通过抑制气道高反应性和/或抑制炎性细胞(例如嗜酸性粒细胞、IL-5⁺CD4 T细胞和/或IL-13⁺CD4 T细胞)来发挥过敏性哮喘的治疗和预防作用。

另一方面，本发明提供一种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株，其包含核苷酸序列为SEQ ID NO:1的16S rRNA序列。

另一方面，本发明提供一种培养本发明所提供的菌株的方法，包括在培养基中培养所述菌株。在一些实施方案中，所述培养基是MRS培养基。在一些实施方案中，所述培养在厌氧条件下进行。在一些实施方案中，所述培养在37℃下进行。

另一方面，本发明提供一种本发明所提供的菌株的衍生物。在一些实施方案中，所述衍生物是本发明所提供的菌株的培养物、本发明所提供的菌株的裂解物、本发明所提供的菌株的提取物、本发明所提供的菌株的灭活产物或其组合。

另一方面，本发明提供一种培养基，其包含本发明所提供的菌株或其衍生物。

另一方面，本发明提供一种组合物，其包含有效量的第一组分，其中所述第一组分包括本发明所提供的菌株、其衍生物或包含其的培养基。在一些实施方案中，本发明所提供的组合物是食品组合物、保健食品组合物、药物组合物、特殊医学用途食品组合物、化妆品组合物、医疗器械组合物或饲料组合物。

在一些实施方案中，本发明所提供的组合物以丸剂、片剂、锭剂、冻干粉剂、颗粒剂、胶囊剂、水溶液、醇溶液、油溶液、糖浆剂、乳液、悬浮液、栓剂、注射或输注用溶液、软膏剂、凝胶、酊剂、霜剂、贴剂、洗剂、喷雾剂、气雾剂、粉雾剂、泡腾片、透皮治疗系统、微胶囊、植入物或棒的形式存在。

在一些实施方案中，本发明所提供的组合物被配制用于经眼、经耳、鼻内、舌下、口服、经皮、局部、经鼻、直肠或胃肠外施用。

在一些实施方案中，本发明所提供的组合物进一步包括第二组分。在一些实施方案中，所述第二组分包括益生菌、后生元、益生元、抗菌剂、免疫调节剂、抗癌剂、骨质疏松治疗剂、精神领域相关治疗剂、发育相关治疗剂或其组合。在一些实施方案中，所述第一组分与所述第二组分的重量比例为1:99至99:1。在一些实施方案中，所述第一组分于所述第二组分先、后或同时施用。

另一方面，本发明提供本发明所提供的菌株、其衍生物、包含其的培养基或包含其的组合物在制备用于拮抗病原体的药物中的用途。

另一方面，本发明提供本发明所提供的菌株、其衍生物、包含其的培养基或包含其的组合物在制备用于预防和/或治疗与病原体相关的疾病或病症的药物中的用途。

在一些实施方案中，所述病原体选自由以下组成的组：细菌、真菌、病毒、螺旋体、支原体、立克次氏体、衣原体和寄生虫。

在一些实施方案中，所述病原体选自由以下组成的组：分枝杆菌属(Mycobacterium)、沙门菌属(Salmonella)、大肠杆菌属(E.coli)、衣原体属(Chlamydia)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Psudomonas)、念珠菌属(Candida)、阿托波氏菌属(Atopobium)、加德纳菌属(Gardnerella)和马拉色菌属(Pityrosporum)。

在一些实施方案中，所述细菌包括大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、伤寒沙门氏菌、阴道阿托波氏菌、阴道加德纳耐药菌或其组合。

在一些实施方案中，所述真菌包括白色念珠菌、糠秕马拉色菌或其组合。

在一些实施方案中，所述寄生虫为滴虫。

在一些实施方案中，所述与病原体相关的疾病或病症选自由以下组成的组：女性生殖道感染和生殖道菌群紊乱。

在一些实施方案中，所述与病原体相关的疾病或病症为马拉色菌感染相关皮肤疾病。

另一方面，本发明提供本发明所提供的菌株、其衍生物、包含其的培养基或包含其的组合物在制备用于预防和/或治疗与免疫调节相关的疾病或病症的药物中的用途。

在一些实施方案中，所述与免疫调节相关的疾病或病症是癌症、过敏性疾病或自身免疫性疾病。

在一些实施方案中，所述癌症选自由以下组成的组：前列腺癌、胃-食道癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、乳腺癌、支气管癌、骨癌、肝脏和胆管癌症、卵巢癌、睾丸癌、肾癌、膀胱癌、头颈癌、脊柱癌、脑癌、宫颈癌、子宫癌、子宫内膜癌、结肠癌、结肠直肠癌、直肠癌、肛门癌、胃肠癌、皮肤癌、垂体癌、胃癌、阴道癌、甲状腺癌、神经胶母细胞瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤、骨髓发育不良综合症、肉瘤、畸胎瘤、神经胶质瘤、腺癌、白血病、淋巴瘤和骨髓瘤。

在一些实施方案中，所述过敏性疾病选自由以下组成的组：过敏性鼻炎、过敏性哮喘、特应性皮炎、过敏性角膜结膜炎、荨麻疹、食物过敏、药物过敏、尘螨过敏和花粉过敏。

在一些实施方案中，所述自身免疫性疾病选自由以下组成的组：类风湿性关节炎、风湿热、狼疮、系统性硬皮病、特应性皮炎、银屑病、银屑病关节炎、哮喘、吉兰-巴雷综合征、重症肌无力、皮肌炎、多肌炎、多发性硬化、自身免疫性脑脊髓炎、结节性多动脉炎、桥本甲状腺炎、颞动脉炎、青少年糖尿病、斑秃、天疱疮、口疮性口炎、自身免疫性溶血性贫血、韦氏肉芽肿病、舍格伦综合征、艾迪生病、克罗恩病、白塞病、水肿、结膜炎、牙周炎、鼻炎、中耳炎、慢性鼻窦炎、咽喉炎、扁桃体炎、支气管炎、肺炎、胃溃疡、胃炎、结肠炎、痛风、湿疹、痤疮、接触性皮炎、脂溢性皮炎、强直性脊柱炎、纤维肌痛、骨关节炎、肩周关节炎、腱炎、腱鞘炎肌炎、肝炎、膀胱炎、肾炎、脓毒症、血管炎和滑囊炎。

另一方面，本发明提供本发明所提供的菌株、其衍生物、包含其的培养基或包含其的组合物在制备用于预防和/或治疗与骨质疏松相关的疾病或病症的药物中的用途。

在一些实施方案中，所述与骨质疏松相关的疾病或病症选自由以下组成的组：青少年骨质疏松症、绝经期骨质疏松症、绝经后骨质疏松症、创伤后骨质疏松症，和由于年老、皮质激素治疗和不活动引发的骨质疏松症。

另一方面，本发明提供本发明所提供的菌株、其衍生物、包含其的培养基或包含其的组合物在制备用于预防和/或治疗与缺铁性贫血、更年期综合征或神经中枢系统疾病相关的疾病或病症的药物中的用途。

附图说明

图1显示与阴性对照组相比，L.plantarum-3和商业菌株L.rhamnosus GR-1显著抑制IL-4的分泌。

图2显示与阴性对照组相比，L.plantarum-3和商业菌株L.rhamnosus GR-1显著抑制IL-5的分泌。

图3显示与阴性对照组相比，L.plantarum-3和商业菌株L.rhamnosus GR-1显著抑制IgE的分泌。

图4显示与模型对照组相比，L.plantarum-3给药组小鼠的皮炎评分显著降低。

图5显示与模型对照组相比，L.plantarum-3给药组小鼠的抓挠时间显著降低。

图6A和6B显示与模型对照组相比，L.plantarum-3给药组和地塞米松组小鼠的耳厚度(图6A)和背皮肤厚度(图6B)均显著降低。

图7A和7B显示与模型对照组相比，L.plantarum-3给药组小鼠中的总IL-5(图7A)和总IL-13(图7B)水平均显著降低。

图8显示与哮喘模型对照组(HDM)相比，L.plantarum-3给药(HDM+L.plantarum-3)有效抑制引起哮喘的气道高反应性。

图9A-9C显示与哮喘模型对照组(HDM)相比，L.plantarum-3给药(HDM+L.plantarum-3)有效抑制嗜酸性粒细胞(Eos)、IL-5⁺CD4 T细胞和IL-13⁺CD4 T细胞。

具体实施方式

以下对本文的描述仅旨在说明本文的各种实施方式。因此，所论述的具体改造不应被解释为对本文范围的限制。所属领域的技术人员将显而易见的是，可以在不脱离本文的范围的情况下实行各种等效、变化和修改，并且应理解，此类等效实施例将包含在本文中。本文引用的所有参考文献，包含出版物、专利和专利申请，均以全文引用的方式并入本文中。

除非另外定义，本文所用的全部技术术语和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的意义相同。Singleton等人，《微生物学和分子生物学词典(Dictionaryof Microbiology and Molecular Biology)，第20版》(约翰威利父子公司(John Wileyand Sons)，纽约，1994)，以及Hale和Marham，《哈珀柯林斯生物学词典(the HarperCollins Dictionary of Biology)》(哈珀永久出版社(Harper Perennial)，纽约州，1991)等作为通用词典提供了本文所使用的许多术语的通常含义。

定义

如本文所使用的，冠词“一个(种)”和“所述”用于指一个(种)或多个(种)(即，至少一个(种))该冠词的语法对象。

除非明确规定或从上下文显而易见，否则如本文所用的，术语“约”应理解为在本领域的正常公差范围内，例如在平均值的2个标准偏差以内。“约”可以被理解为在所述值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％之内。

植物乳杆菌菌株

本发明提供一株分离的植物乳杆菌，其包含核苷酸序列为SEQ ID NO:1的16SrRNA序列(SEQ ID NO:1)：

TGCAGTCGAACGAACTCTGGTATTGATTGGTGCTTGCATCATGATTTACATTTGAGTGAGTGGCGAACTGGTGAGTAACACGTGGGAAACCTGCCCAGAAGCGGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACTTGGACCGCATGGTCCGAGTTTGAAAGATGGCTTCGGCTATCACTTTTGGATGGTCCCGCGGCGTATTAGCTAGATGGTGGGGTAACGGCTCACCATGGCAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTGTTAAAGAAGAACATATCTGAGAGTAACTGTTCAGGTATTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTCAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGTATGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATACCGTAAACGATGAATGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATACTATGCAAATCTAAGAGATTAGACGTTCCCTTCGGGGACATGGATACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTATCAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTGGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAACTCGCGAGAGTAAGCTAATCTCTTAAAGCCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCAAAGTCGGTGGGGTA。

本发明提供了一株分离的乳杆菌，其已于2020年03月30日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏编号：CGMCC No.19523。该分离的乳杆菌命名为植物乳杆菌-3(L.plantarum-3)，分类命名是植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。

本发明的乳杆菌菌株还包括上述乳杆菌菌株的突变体、变体和/或子代。

如本文所使用的，“突变体”是指由亲代菌株的修饰而产生的任何微生物。例如，突变体可能是通过对保藏菌株进行基因修饰而产生的微生物。

如本文所使用的，“变体”是指来源于亲代菌株的天然存在的微生物。例如，变体可能是适应特定细胞培养条件而产生的微生物。

如本文所使用的，“子代”是指由亲代菌株或其突变体、变体经繁殖或增殖而产生的任何微生物，所述子代菌株本身可以被识别为与亲代菌株相同或实质上相同的菌株。能够理解的是，鉴于无性繁殖过程，子代菌株在基因上与亲代菌株几乎完全相同。因此，在一个实施方案中，子代菌株在基因上与亲代菌株完全相同，并且可以被认为是亲代菌株的“克隆”。在另一个实施方案中，子代菌株在基因上与亲代菌株实质上完全相同。

在细菌全长基因组中，突变体、变体或子代与其亲代菌株相比具有至少90％、95％、98％、99％、99.5％或99.9％的序列同一性。此外，突变体、变体或子代将保留与亲代菌株相同的表型，例如，突变体、变体或子代可以表现出与亲代菌株相同或等效水平的拮抗致病菌、耐受消化液、肠道定殖等方面的能力。

与核苷酸序列(或氨基酸序列)有关的“序列同一性百分比(％)”是指在对准候选序列与参照序列，并在必要时引入空位以使一致核苷酸(或氨基酸)达到最大数量之后，该候选序列中与该参照序列中的核苷酸(或氨基酸)残基一致的核苷酸(或氨基酸)残基的百分比。氨基酸残基的保守取代可视为或可不视为一致残基。出于确定核苷酸(或氨基酸)序列同一性百分比的目的进行的比对可例如使用可公开获得的工具，如BLASTN、BLASTp(可见于美国国家生物技术信息中心(U.S.National Center for Biotechnology Information，NCBI)的网站，另参见Altschul S.F.等人,《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》，215:403-410(1990)；Stephen F.等人，《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》，25:3389-3402(1997))、ClustalW2(可见于欧洲生物信息研究所(European Bioinformatics Institute)网站，另参见Higgins D.G.等人，《酶学方法(Methods in Enzymology)》，266:383-402(1996)；Larkin M.A。等人，《生物信息学(Bioinformatics)》(英格兰牛津(Oxford,England))，23(21):2947-8(2007)))和ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件实现。本领域的普通技术人员可使用所述工具提供的默认参数，或可定制适于比对的参数，如通过选择适合算法进行。

【分离】

本发明提供的植物乳杆菌是分离的。

如本文所使用的，“分离的”是指物质已通过人工方式从天然状态改变。如果“分离的”组合物或物质存在于自然界中，则该组合物或物质已经从其原始环境改变或从其原始环境移出，或这两种情况都有。例如，天然地存在于活动物体内的菌株不是“分离”的，但如果该菌株与其天然状态的共存材料充分地分离，由此以大体上纯的状态存在，则该菌株是“分离的”。

本发明的乳杆菌菌株可以分离自生殖道，尤其是女性生殖道的分泌物。如本文所使用的，女性“生殖道”包括阴道、子宫、宫颈和卵巢等。在一个优选的实施方案中，本发明的乳杆菌菌株分离自阴道和/或宫颈的分泌物。

可以通过本领域的常规方式分离和纯化获得本发明的乳杆菌菌株，经分离和纯化步骤后的培养物基本上不含有除本发明的乳杆菌菌株之外的污染物，所述污染物包括微生物污染物和不需要的化学污染物。

在某些实施方案中，使用棉拭子采集健康受试者阴道侧壁1/3处的分泌物置入无菌管中，使用PBS冲洗拭子后的菌悬液作为母液，进一步使用PBS稀释到不同浓度，分别涂布于新鲜配制的Rogosa SL固体培养基上，厌氧培养。随后用接种环分别挑取不同形态的单菌落以划线法接种至新鲜配制的MRS固体培养基上，厌氧培养以获得纯化的单菌落。

【表征】

可以通过本领域的常规方法鉴定本发明的乳杆菌菌株，包括但不限于经典的形态学特征检测、生理生化特性检测和分子生物学检测。细菌的形态、染色、培养特性和菌落特征等是细菌鉴定的初步依据，细菌的生化反应可用于区别和鉴定细菌的种类。

在某些实施方案中，本发明的乳杆菌菌株通过如下方法鉴定：培养后观察培养基中的菌落形态，其菌落呈圆形；取所述菌株的纯培养物涂片进行革兰氏染色，呈现革兰氏阳性特性；显微镜镜检显示所述菌株呈短杆状，可连成长链。

基于上述染色和形态学特征，通过使用经典分类学，例如，通过参考《伯杰系统细菌学手册(Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology)》(威廉姆斯和威尔金斯公司(Williams&Wilkins Co.)，1984)中的相关描述，初步判定所述菌株属于乳杆菌属(Lactobacillus)。

进一步地，可以通过常规的16S rRNA基因序列检测方法来鉴定所述菌株。在某些实施方案中，所采用的16S rRNA基因序列检测方法如下：

(1)PCR扩增；

(2)取PCR产物进行凝胶电泳，确定16S rRNA基因片段；

(3)取PCR样品进行16S rRNA测序；

(4)将测序所得序列与NCBI数据库中的数据进行BLAST序列相似性比较分析，最高同源性分值大于97％时，可以判断菌株的种属(species)。

基于16S rRNA基因序列检测结果，可以判定本发明的菌株是植物乳杆菌。

在某些实施方案中，本发明要求保护的乳杆菌菌株包含与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列具有至少80％(例如至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的16S rRNA序列，同时保持植物乳杆菌-3(L.plantarum-3)的形态和功能特征。

【性质】

本发明的乳杆菌菌株不仅能够有效拮抗多种致病菌(包括但不限于大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、伤寒沙门氏菌、阴道阿托波氏菌、阴道加德纳耐药菌、白色念珠菌和糠秕马拉色菌)，而且具备良好的耐受胃酸、胆盐等消化液的能力，有助于其在胃肠道环境中的生存，特别适合用于制备成口服施用的产品。本发明的乳杆菌菌株还具有改进的定殖性能(例如肠道和阴道中的定殖)，能够长久地发挥其益生效果，是具有开发潜能的益生菌菌株。本发明的乳杆菌菌株对过敏性反应也有显著的治疗和/或预防作用。

本发明的乳杆菌菌株具有如下一种或多种有益特性：

酸耐受性：在模拟胃液中孵育3小时后，本发明的乳杆菌菌株存活率至少为50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。可以使用任何合适的酸耐受性测试方法来确定本发明的乳杆菌菌株的酸耐受性。在一个实施方案中，在体外模拟胃液中测定本发明的乳杆菌菌株的酸耐受性。在一个实施方案中，酸耐受性测试包括将待测试的菌体分别用模拟胃液(例如pH 3.0)和常规生理盐水重悬，37℃孵育3小时后，梯度稀释并涂板计数。可以使用如下公式计算酸耐受性：酸耐受性(％)＝(模拟胃液中的Log10 CFU/mL)/(生理盐水中的Log10 CFU/mL)×100。在一个实施方案中，模拟胃液的配制方法为：将胃蛋白酶(Sigma，P7000-25G，632U/mg)96.84mg粉末溶于32.3mL pH 3.0生理盐水，使其终浓度为3g/L；以0.22μm无菌滤膜过滤，现配现用。

胆汁耐受性：在模拟肠液中孵育4小时后，本发明的乳杆菌菌株存活率至少为50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％或94％。可以使用任何合适的胆汁耐受性测试方法来确定本发明的乳杆菌菌株的胆汁耐受性。在一个实施方案中，在体外模拟肠液中测定本发明的乳杆菌菌株的胆汁耐受性。在一个实施方案中，胆汁耐受性测试包括将待测试的菌体分别用模拟肠液(例如pH 8.0)和常规生理盐水重悬，37℃孵育4小时后，梯度稀释并涂板计数。可以使用如下公式计算胆汁耐受性：胆汁耐受性(％)＝(模拟肠液中的Log10CFU/mL)/(生理盐水中的Log10 CFU/mL)×100。在一个实施方案中，模拟肠液的配制方法为：在49mL pH 8.0生理盐水分别加入0.5mL 100×胰蛋白酶和胆盐母液，终浓度分别为1g/L胰蛋白酶和0.3％胆盐(即3mg/mL)；以0.22μm无菌滤膜过滤，现配现用。

定殖性能：相比于商业乳杆菌菌株L.rhamnosus GR-1和L.reuteri RC-14，本发明的植物乳杆菌菌株具有对Caco-2细胞、VK2/E6E7细胞或两者更高的定殖能力。可以使用任何合适的粘附能力测试方法来确定本发明的乳杆菌菌株的定殖性能。在一个实施方案中，将合适浓度的菌液(例如约2.5×10⁸CFU/mL、约5.0×10⁷CFU/mL或约5.0×10⁶CFU/mL)加入待粘附的细胞中，37℃静置粘附2小时，目标感染复数(Multiplicity of Infection，MOI，细菌：细胞)为10:1。孵育粘附结束后，清洗、裂解细胞，获取充分脱落的细胞及细菌，涂板计数。可以采用以下公式计算粘附率：粘附率％＝粘附的菌量CFU/接种的菌量CFU×100％。可以根据定殖的目标部位选用合适的细胞系进行实验。在一个实施方案中，定殖性能测试采用的是人肠道来源的细胞系Caco-2细胞。在一个实施方案中，定殖性能测试采用的是阴道上皮细胞VK2/E6E7细胞。

抑菌性能：相比于商业乳杆菌菌株L.rhamnosus GR-1和L.reuteri RC-14，本发明的植物乳杆菌菌株具有对铜绿假单胞菌、伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、阴道加德纳耐药菌、阿托波氏菌、糠秕马拉色菌或任意组合更高的抑菌能力。可以使用任何合适的测试方法来确定本发明的乳杆菌菌株的拮抗致病菌的性能，例如用于定性测定的扩散法和用于定量测定的稀释法。适合使用的具体方法包括但不限于双层平板法、菌饼法(例如倒置菌饼法和条带菌饼法)、纸片扩散法等。

在一个实施方案中，双层平板法的具体步骤如下：取致病菌(例如金黄色葡萄球菌)于冷却至约45℃的固体培养基中，倒在培养20-24小时的待测益生菌MRS琼脂上。待凝固后，将平板置于37℃大气条件下培养1天，直至出现抑菌圈。每个益生菌设置平行测试板。

在另一个实施方案中，双层平板法的具体步骤如下：将益生菌菌液点样(spot)到MRS固体培养基平板上，37℃厌氧培养24-48小时。将致病菌(例如糠秕马拉色菌)种子液接种于在有氧条件下制备的mYPG液体培养基中，37℃培养24-48小时。配制mYPG培养基，115℃，灭菌20分钟，待温度冷却到40℃左右，取2.5mL该培养基与500μL待用的致病菌培养液混合，将该混合液分别倒入到点样有益生菌的MRS固体培养基上，静置待培养基凝固。将已凝固的培养基平板有氧37℃培养24-48小时。通过测定抑菌圈直径来确定益生菌的抗菌活性。每个益生菌设置平行测试板。

在一个实施方案中，倒置菌饼法的具体步骤如下：取致病菌(例如大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌或伤寒沙门氏菌)涂布于NA或哥伦比亚血琼脂培养基+5％羊血平板上，待其充分吸收后，抠取益生菌菌饼倒置于致病菌平板上，置于37℃大气条件下培养1天，直至出现抑菌圈。每个益生菌设置平行测试板。

在一个实施方案中，条带菌饼法的具体步骤如下：用棉棒蘸取益生菌接种液，然后在MRS固体培养基平皿上，沿直径涂布成2cm宽的条带，将板子37℃厌氧培养24小时。取出板子，将融化的YM固体培养基倾注平板表面，待凝固薄层。用棉棒将致病菌菌液均匀涂布在YM固体培养基表面，待干后，先放在4℃培养4小时，然后37℃培养24小时，观察益生菌对致病菌的抑制效果。每个益生菌设置平行测试板。

本发明的乳杆菌菌株的拮抗致病菌的性能还可以通过任何合适的体内实验来确定。在一个实施方案中，通过例如灌注致病菌菌液的方式构造动物疾病模型，给药前后分别取样进行致病菌和益生菌(例如乳杆菌)菌落计数；还可以在给药前后分别进行外阴观察，记录外阴红肿、阴道分泌物多少等情况，并进行阴道灌洗液涂片(PAS染色)，从而确认本发明的乳杆菌调节阴道菌群、抑制致病菌生长和定殖的作用。在一个实施方案中，使用阴道加德纳菌构造细菌性阴道炎模型。在一个实施方案中，使用白色念珠菌构造念珠菌性阴道炎模型。

改善过敏性反应：相比于商业菌株L.rhamnosus GR-1，本发明的乳杆菌菌株对抗原诱导的组胺释放、Th2型细胞因子(IL-4和/或IL-5)的分泌和/或IgE的分泌具有更强的抑制作用，显著改善过敏性反应。可以使用任何合适的方法来评价本发明的乳杆菌菌株对过敏性反应的影响，包括但不限于对组胺分泌的抑制、对2型辅助T细胞(Th2)相关细胞因子(如IL-4和IL-5)分泌的抑制和/或对IgE分泌的抑制。

在一个实施方案中，通过以下方法来测定各菌株抑制组胺分泌的能力：在培养RBL-2H3细胞系之后诱导脱颗粒，然后采用邻苯二醛柱后转化法，用高效液相色谱法测定滤液中组胺的含量。组胺释放抑制率可以按照如下公式计算：组胺抑制率＝(阴性对照滤液中组胺含量-处理组滤液中组胺含量)/阴性对照滤液中组胺含量。

在一个实施方案中，通过以下方法来测定各菌株抑制Th2相关细胞因子(如IL-4和IL-5)分泌的能力：采用EL4细胞系，通过试剂盒分别测定分泌的IL-4和IL-5的量。

在一个实施方案中，通过以下方法来测定各菌株抑制IgE分泌的能力：采用人B细胞U266B1，通过试剂盒测定IgE的水平。IgE抑制率可以按照如下公式计算：IgE抑制率＝(阴性对照滤液中IgE含量-处理组滤液中IgE含量)/阴性对照滤液中IgE含量。

减轻特应性皮炎：本发明的乳杆菌菌株显著减轻了特应性皮炎的症状，例如皮肤的干燥、水肿、红斑/出血(erythema/hemorrhage)、糜烂/脱落(erosion/excoriation)和发痒。可以使用任何合适的实验模型来确定本发明的乳杆菌菌株对特应性皮炎的影响。在一个实施方案中，使用的是特应性皮炎NC/Nga小鼠模型。可以使用任何合适的指标来评价本发明的乳杆菌菌株对特应性皮炎的影响，包括但不限于皮肤的干燥、水肿、红斑/出血(erythema/hemorrhage)、糜烂/脱落(erosion/excoriation)和发痒。可以使用任何合适的方式来获得前述指标，包括但不限于皮炎评分、抓挠时间测量、耳/背皮肤厚度测量等。

改善过敏性哮喘：本发明的乳杆菌菌株对经卵清蛋白(OVA)诱导的过敏性哮喘具有治疗和预防作用，且通过抑制作为介导变应性反应的Th2型细胞因子的IL-5和IL-13的分泌来发挥其对过敏性哮喘的治疗性和预防性作用；在屋尘螨(HDM)诱导的过敏性哮喘中通过抑制气道高反应性和/或抑制炎性细胞(例如嗜酸性粒细胞、IL-5⁺CD4⁺T细胞和/或IL-13⁺CD4⁺T细胞)来发挥过敏性哮喘的治疗和预防作用。可以使用任何合适的实验模型来确定本发明的乳杆菌菌株对过敏性哮喘的影响。在一个实施方案中，使用的是OVA诱导的哮喘模型。在一个实施方案中，使用的是HDM诱导的哮喘模型。可以使用任何合适的指标来评价本发明的乳杆菌菌株对过敏性哮喘的影响。在一个实施方案中，进行组织病理检查，观察炎性细胞浸润、支气管组织(支气管平滑肌)、上皮细胞等。在一个实施方案中，使用具有CD45和CD3ε作为标志物的淋巴细胞中产生IL-5或IL-13的细胞进行计数来确定IL-5⁺和IL-13⁺细胞。在一个实施方案中，检测气道高反应性(AHR)。在一个实施方案中，通过对表达常见白细胞标志物CD45的细胞中的Siglec-f⁺CD11b⁺细胞进行计数来确定嗜酸性粒细胞，并且通过对具有CD3ε、TCRβ和CD4作为标志物的CD4⁺T细胞中的产生IL-5或IL-13的细胞进行计数来确定IL-5⁺CD4⁺T和IL-13⁺CD4⁺T细胞数量。

【衍生物】

本发明还提供本发明所提供的菌株的衍生物。如本文所使用的，“衍生物”是指由菌株衍生获得的产物，包括培养物、裂解物、提取物、灭活产物等。

在一些实施方案中，所述衍生物是本发明所提供的菌株的培养物、本发明所提供的菌株的裂解物，本发明所提供的菌株的提取物、如本发明所提供的菌株的灭活产物或其组合。

如本文所使用的，“培养物”是指在培养基中培养菌株而获得的产物，该产物可以包括菌株本身。

如本文所使用的，“裂解物”是指菌株经过酶、超声、均质化等处理获得的产物。

如本文所使用的，“提取物”是指菌株经过溶剂提取等处理获得的产物。

如本文所使用的，“灭活产物”是指菌株经过加热、加压或药物等处理获得的产物。

【培养方法】

本发明还提供了培养本发明的乳杆菌菌株的方法，包括在培养基中培养所述菌株。本发明的乳杆菌菌株可以在任何适合于乳杆菌的培养基中生长，生长过程中所述菌株没有失去其遗传特性，也没有失去其表征和功能特性。根据细菌生长所需，培养基需要有碳源、氮源、生长因子、无机盐和水等基本营养成分，按照一定的配方和制法进行配制。具体而言，本发明的乳杆菌菌株可以生长在含有可同化有机碳源、可同化氮源、适当盐和痕量金属的培养基中。适合于本发明的乳杆菌菌株的优选培养基包括MRS培养基。MRS培养基的示例性成分包括蛋白胨、牛肉粉、酵母粉、葡萄糖、吐温80、磷酸氢二钾、乙酸钠、柠檬酸三铵、硫酸镁、硫酸锰、琼脂粉、蒸馏水等。

本发明的乳杆菌菌株可以在任何适合于乳杆菌的常规培养条件下，通过常规培养方式进行培养。具体而言，本发明的乳杆菌菌株可以通过肉汤发酵、琼脂表面培养等方法培养。培养基的温度可以是任何适合于乳杆菌生长的温度，优选在约35-40℃的温度下培养，更优选在约37℃的温度下培养。本发明的乳杆菌菌株可以在厌氧或微需氧条件下培养，优选在厌氧条件下培养。

在一个实施方案中，先在固体培养基上获得纯化的单菌落，再挑取单菌落接种至液体培养基中进一步扩增本发明的乳杆菌菌株。细胞生长至预期密度(例如10⁹CFU/ml)后，采用常规方法收获乳杆菌细胞，并相应冻存保藏或用于实验。优选采用离心法来收获本发明的乳杆菌细胞。

【培养基】

本发明还提供了一种培养基，其包含本发明所提供的菌株或其衍生物。

如本文所使用的，“培养基”是指用于生长和采集细胞和/或所述细胞所表达和/或分泌的产物的任何培养基。可以根据所要培养的细胞的类型、生长阶段、培养目标等选择具体的培养基类型。所述培养基包括但不限于溶液、固体、半固体或刚性支撑物。所述培养基包括用于分离的培养基、用于纯化的培养基、用于增殖的培养基、用于收获衍生物的培养基、用于分析的培养基等。培养基可以选自本领域已知的液体培养基或固体培养基。适用于本发明的示例性培养基包括但不限于：MRS培养基、GAM培养基、BL培养基或SL培养基。

组合物

本发明的乳杆菌菌株、其衍生物或包含其的培养基可以单独施用，也可以作为产品的一部分施用。所述产品可以含有本领域技术人员熟知的辅助组分。

本发明还提供了一种组合物，所述组合物包含有效量的第一组分，所述第一组分包括本发明所提供的菌株、其衍生物、包含其的培养基或前述组分的组合。

【组合物的用途】

所述组合物可以是食品组合物、保健食品组合物、药物组合物、特殊医学用途食品组合物、化妆品组合物、医疗器械组合物或饲料组合物。

本发明所提供的菌株、其衍生物或包含其的培养基可以单独用于食品、保健食品、药物、特殊医学用途食品、化妆品、医疗器械或饲料等方面的用途，也可以与本领域技术人员所熟知的合适组分混合用于食品、保健食品、药物、特殊医学用途食品、化妆品、医疗器械或饲料等方面的用途。

【施用方式、剂型】

本发明的组合物可以通过全身和/或局部施用发挥作用。在一些实施方案中，本发明的组合物被配制用于经眼、经耳、鼻内、舌下、口服、经皮、局部、经鼻、直肠或胃肠外施用。

本发明的组合物可以以本领域已知的合适的形式存在。在一些实施方案中，本发明的组合物可以以丸剂、片剂、锭剂、冻干粉剂、颗粒剂、胶囊剂、水溶液、醇溶液、油溶液、糖浆剂、乳液、悬浮液、栓剂、注射或输注用溶液、软膏剂、凝胶、酊剂、霜剂、贴剂、洗剂、喷雾剂、气雾剂、粉雾剂、泡腾片、透皮治疗系统、微胶囊、植入物或棒的形式存在。

具体地，对于特定的施用途径，本发明的组合物以相应的合适形式存在。

在一些实施方案中，本发明的组合物用于口服施用，可以将其配制成本领域已知的适合递送本发明的菌株的剂型，例如片剂(无包衣或包衣片剂，例如肠溶包衣或控释包衣)、胶囊剂(例如硬明胶胶囊或软明胶胶囊)、冻干粉剂、颗粒剂、丸剂、乳液、悬浮液、喷雾剂、气雾剂或溶液。

在一些实施方案中，本发明的组合物用于局部施用，可以将其配制成本领域已知的适合递送本发明的菌株的剂型，例如软膏、乳膏、悬浮剂、洗剂、粉剂、溶液剂、糊剂、凝胶剂、喷雾剂、气雾剂或油剂。

在一些实施方案中，本发明的组合物用于阴道施用，可以将其配制成本领域已知的适合递送本发明的菌株的剂型，例如阴道环、棉球、乳剂、凝胶剂、糊剂、泡沫或喷雾剂。

在一些实施方案中，本发明的组合物用于直肠施用，可以将其配制成本领域已知的适合递送本发明的菌株的剂型，例如栓剂或灌肠剂。

本发明的组合物可以每天一次或更多次以单位剂量的形式施用于受试者。如本文所使用的，“单位剂量”是指适合施用于受试者的物理上离散的单位，并且每个单位包含有效量的本发明的乳杆菌菌株或者相应量的衍生物以提供预期的作用，例如食用、治疗或保健作用。

【辅助组分】

本发明的菌株、其衍生物或包含其的培养基可以与合适的辅助组分混合，其可以通过本领域常规的方式实现。示例性的辅助组分包括：

填充剂，例如纤维素、微晶纤维素、乳糖、甘露醇和淀粉；

软膏基质，例如石油胶、石蜡、甘油三酯、蜡、羊毛蜡、羊毛蜡醇、羊毛脂、亲水软膏和聚乙二醇；

栓剂基质，例如聚乙二醇、可可脂和硬脂；

溶剂，例如水、乙醇、异丙醇、甘油、丙二醇、液体聚乙二醇和石蜡；

表面活性剂、乳化剂、分散剂或润湿剂，例如十二烷基硫酸钠、卵磷脂、磷脂、脂肪醇、山梨醇酐脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯、聚氧乙烯脂肪酸甘油酯、聚氧乙烯脂肪酸酯、聚氧乙烯脂肪醇醚、甘油脂肪酸酯和泊洛沙姆；

缓冲剂、酸和碱，例如磷酸盐、碳酸盐、柠檬酸、乙酸、盐酸、氢氧化钠溶液、碳酸铵、缓血酸胺和三乙醇胺；

等渗剂，例如葡萄糖和氯化钠；

吸附剂，例如高分散二氧化硅；

粘合剂，例如聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素钠、淀粉、卡波姆、明胶和阿拉伯树胶；

崩解剂，例如改性淀粉、羧甲基纤维素钠、羟基乙酸淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮和交联羧甲基纤维素钠；

润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸、滑石粉和高分散二氧化硅；

包衣材料，例如糖和虫胶；

成膜剂，例如聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、乙基纤维素、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素、乙酸纤维素、邻苯二甲酸乙酸纤维素、聚丙烯酸酯和聚甲基丙烯酸酯；

胶囊材料，例如明胶和羟丙基甲基纤维素；

合成聚合物，例如聚乳酸、聚乙交酯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯、聚环氧乙烷、聚乙二醇及其共聚物和嵌段共聚物；

增塑剂，例如聚乙二醇、丙二醇、甘油、三乙酸甘油酯、柠檬酸三乙酰酯和邻苯二甲酸二丁酯；

渗透促进剂，例如表面活性剂、二甲亚砜及其类似物、氮酮类化合物、吡咯酮衍生物、醇类化合物和脂肪酸类化合物；

稳定剂，例如抗氧化剂，如抗坏血酸、抗坏血酸棕榈酸酯、抗坏血酸钠、丁基羟基茴香醚、丁基羟基甲苯、没食子酸丙酯，防腐剂，如对羟基苯甲酸酯、山梨酸、硫柳汞、苯扎氯铵、乙酸氯己定和苯甲酸钠；

着色剂，例如无机颜料，如氧化铁和二氧化钛；

调味剂、甜味剂、风味和/或气味掩蔽剂。

应当理解的是，除了上述特别提及的成分之外，所述组合物还可以包含相应剂型中的其它常规组分。

【含量】

在一些实施方案中，本发明的组合物包含10⁶CFU/g至10¹²CFU/g的量的本发明的乳杆菌菌株及其相应量的衍生物，优选包含10⁶CFU/g至10¹¹CFU/g、10⁶CFU/g至10¹⁰CFU/g、10⁶CFU/g至10⁹CFU/g、10⁶CFU/g至10⁸CFU/g、10⁶CFU/g至10⁷CFU/g、10⁷CFU/g至10¹²CFU/g、10⁷CFU/g至10¹¹CFU/g、10⁷CFU/g至10¹⁰CFU/g、10⁷CFU/g至10⁹CFU/g、10⁷CFU/g至10⁸CFU/g、10⁸CFU/g至10¹²CFU/g、10⁸CFU/g至10¹¹CFU/g、10⁸CFU/g至10¹⁰CFU/g、10⁸CFU/g至10⁹CFU/g、10⁹CFU/g至10¹²CFU/g、10⁹CFU/g至10¹¹CFU/g、10⁹CFU/g至10¹⁰CFU/g、10¹⁰CFU/g至10¹²CFU/g、10¹⁰CFU/g至10¹¹CFU/g或10¹¹CFU/g至10¹²CFU/g的量的本发明的乳杆菌菌株或者相应量的衍生物。

如本文所使用的，“CFU”代表“菌落形成单位”。

【第二组分】

在一些实施方案中，本发明所提供的组合物进一步包括第二组分。在一些实施方案中，所述第二组分包括益生菌、后生元、益生元、抗菌剂、免疫调节剂、抗癌剂、骨质疏松治疗剂、精神领域相关治疗剂、发育相关治疗剂或其组合。

如本发明所使用的，“益生菌”是指对宿主的健康或良好状态具有有益效果的微生物、包含其的制剂或保留其基本性质的培养物、裂解物、提取物、灭活产物、代谢物等。优选地，益生菌可以选自双歧杆菌(Bifidobacterium)、乳杆菌(Lactobacillus)、乳球菌(Lactococcus)、肠球菌(Enterococcus)、链球菌(Streptococcus)、克鲁维酵母(Kluyveromyces)、酵母(Saccharoymces)、假丝酵母(Candida)或其混合物。更优选地，益生菌选自双歧杆菌(Bifidobacterium)、乳杆菌(Lactobacillus)或其混合物。

在一些实施方案中，所述属于乳杆菌属的菌株可以是任何具有益生菌效应的乳杆菌，包括但不限于：卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)、格氏乳杆菌(Lactobacillusgasseri)、詹氏乳杆菌(Lactobacillus jensenii)、惰性乳杆菌(Lactobacillus iners)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。

在一些实施方案中，所述属于双歧杆菌属的菌株可以是任何具有益生菌效应的双歧杆菌，包括但不限于：长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)、动物双岐杆菌(Bifidobacterium animalis)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)和青春双岐杆菌(Bifidobacterium adolescentis)。

如本文所使用的，“后生元”是指在宿主中具有生物活性的益生菌微生物的无活力细菌产物和/或代谢产物。后生元主要包括代谢产物和菌体成分两大类物质。所述代谢产物可以选自有机酸、短链脂肪酸、细胞内多糖、维生素、蛋白质、酵素、脂质或其混合物。所述菌体成分可以选自脂壁酸、磷壁酸、肽聚醣、细胞表面蛋白、多醣、细胞膜蛋白、细胞外多糖或其混合物。

如本文所使用的，“益生元”是指用于支持或增强益生菌的健康效果或有利于益生菌生长和/或活性的任何化合物、营养素或者另外的微生物。益生元的典型示例是碳水化合物(例如寡糖)，但也不排除非碳水化合物。益生元的最普遍形式在营养上被归类为可溶性纤维，多种形式的膳食纤维表现出一定水平的益生元作用。

益生元可以选自低聚糖(例如果糖、半乳糖和甘露糖)、膳食纤维(例如可溶性纤维和大豆纤维)、菊粉或其混合物。益生元的一些实例包括低聚果糖(FOS)、低聚半乳糖(GOS)、低聚异麦芽糖(IMO)、低聚甘露糖(MOS)、低聚木糖(XOS)、低聚阿拉伯木聚糖(AXOS)、菊粉、大豆低聚葡聚糖、乳果糖(LA)、糖基蔗糖(GS)、乳蔗糖(LS)、低聚帕拉金糖(PAO)、低聚麦芽糖、树胶和/或其水解产物、果胶和/或其水解产物。

在本文中，“抗菌剂”是指能够杀灭微生物或者抑制微生物的生长和/或活性的物质或物质组合。可以用于本发明的示例性抗菌剂包括但不限于：

大环内酯类或酮内酯类，例如红霉素、阿奇霉素、克拉霉素和泰利霉素；

β-内酰胺类，例如青霉素(如青霉素G、青霉素V、甲氧西林、苯唑西林、氯唑西林、双氯西林、萘夫西林、氨苄西林、阿莫西林、羧苄西林、替卡西林、美洛西林、哌拉西林、阿洛西林和替莫西林)、头孢菌素(如头孢噻吩、头孢匹林、头孢拉定、头孢噻肟、头孢唑啉、头孢孟多、头孢呋辛、头孢氨苄、头孢罗齐、头孢克洛、氯碳头孢、头孢西丁、头孢美唑、头孢噻肟、头孢唑肟、头孢曲松、头孢哌酮、头孢他啶、头孢克肟、头孢泊肟、头孢布丁、头孢替尼、头孢匹罗和头孢吡肟)和碳青霉烯类(如碳青霉烯、亚胺培南、美罗培南和PZ-601)；

单环β-内酰胺类，例如氨曲南；

喹诺酮类，例如萘啶酸、奥曲酸、诺氟沙星、培氟沙星、依诺沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星、环丙沙星、替马沙星、洛美沙星、氟罗沙星、格雷沙星、司帕沙星、曲伐沙星、克林沙星、加替沙星、莫西沙星、西他沙星、吉非沙星、吉米沙星和帕珠沙星；

抗菌磺胺和抗菌磺酰胺类，例如对氨基苯甲酸、磺胺嘧啶、磺胺异唑、磺胺甲唑和酞酰磺胺噻唑；

氨基糖苷类，例如链霉素、新霉素、卡那霉素、巴龙霉素、庆大霉素、妥布霉素、阿米卡星、奈替米星、壮观霉素、西索米星、比卡林和异帕米星；

四环素类，例如四环素、金霉素、地美环素、米诺环素、土霉素、美他环素、多西环素和替加环素；

利福霉素类，例如利福平、利福喷丁、利福布丁、苯并嗪利福霉素和利福昔明；

林可霉素类，例如林可霉素和克林霉素；

糖肽类，例如万古霉素和替考拉宁；

链霉素类，例如奎奴普丁和达洛普汀；

唑烷酮类，例如利奈唑酮和特地唑胺；

多粘菌素、粘菌素和粘杆菌素；

甲氧苄氨嘧啶和杆菌肽；

流出泵抑制剂等。

如本文所使用的，“免疫调节剂”是指调节免疫应答的物质、试剂、信号传导途径或其组分，例如免疫抑制剂和免疫刺激剂等。“调节”免疫应答是指免疫系统的细胞类型或细胞活性的任何改变，包括相对参考水平的增加或减少。所述调节包括免疫系统的刺激或抑制，其可以通过各种类型细胞的数目的增加或减少、细胞活性的增加或减少或通过在免疫系统内发生的任何其它变化来体现。

示例性免疫调节剂包括但不限于检查点调节剂、过继性细胞转移、细胞因子、溶瘤病毒和治疗性疫苗。

检查点调节剂可干扰癌细胞逃避免疫系统攻击的能力，并且帮助免疫系统对肿瘤做出更强烈的反应。免疫检查点分子可以介导共刺激信号以增强免疫反应，或者可以介导共抑制信号以抑制免疫反应。检查点调节剂的实例包括但不限于PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、TIM-3、LAG3、A2AR、CD160、2B4、TGFβ、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、OX40、CD2、CD27、CD28、CD30、CD40、CD47、CD122、ICAM-1、IDO、NKG2C、SLAMF7、SIGLEC7、NKp80、CD160、B7-H3、LFA-1、1COS、4-1BB、GITR、BAFFR、HVEM、CD7、LIGHT、IL-2、IL-7、IL-15、IL-21、CD3、CD16和CD83的调节剂。在某些实施方案中，免疫检查点调节剂包含PD-1/PD-L1轴抑制剂。

过继性细胞转移试图增强T细胞对抗癌症的天然能力。在这种治疗方式中，T细胞取自患者，并且在体外扩增和激活。在某些实施方案中，T细胞在体外被修饰为CAR-T细胞。在体外大批量培养抗癌最活跃的T细胞或CAR-T细胞持续2至8周。在此期间，患者将接受治疗，如化学疗法和放射疗法以降低身体的免疫力。在这些治疗之后，体外培养的T细胞或CAR-T细胞将被回输给患者。在某些实施方案中，过继性细胞转移为CAR-T疗法。

细胞因子用于增强肿瘤抗原向免疫系统的呈递。用于治疗癌症的两种主要类型的细胞因子为干扰素和白细胞介素。细胞因子的实例包括但不限于干扰素(如干扰素-α、干扰素-β和干扰素-γ)、集落刺激因子(如巨噬细胞CSF、粒细胞巨噬细胞CSF和粒细胞CSF)、胰岛素生长因子(IGF-1)、血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子(TGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、白细胞介素(如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11和IL-12)、肿瘤坏死因子(如TNF-α和TNF-β)或其任何组合。

溶瘤病毒为可以杀死癌细胞的基因修饰的病毒。溶瘤病毒可以特异性地感染肿瘤细胞，从而导致肿瘤细胞裂解，随后释放大量的肿瘤抗原，触发免疫系统靶向并且消除具有这类肿瘤抗原的癌细胞。溶瘤病毒的实例包括但不限于talimogene laherparepvec(T-Vec，Imlygic)。

治疗性疫苗通过增强免疫系统对癌细胞的反应来对抗癌症。治疗性疫苗可包含非致病性微生物、靶向肿瘤细胞的基因修饰的病毒或一种或多种免疫原性组分。

如本文所使用的，“抗癌剂”是指具有抗肿瘤特性或抑制细胞生长或增殖能力的试剂(例如化合物、药物、拮抗剂、抑制剂、调节剂)。在一些实施方案中，抗癌剂是化疗剂。在一些实施方案中，抗癌剂是生物制剂。在一些实施方案中，抗癌剂是免疫疗法制剂。在一些实施方案中，抗癌剂是由食品药品监督管理机构批准的用于治疗癌症的药剂。

可用于本发明的抗癌剂的实例包括但不限于：阿那曲唑、比卡鲁胺、硫酸博来霉素、白消安、卡培他滨、N4-戊氧羰基-5-脱氧-5-氟胞苷、卡铂、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、环磷酰胺、阿糖胞苷、胞嘧啶阿拉伯糖苷、阿糖胞苷脂质体注射液、达卡巴嗪、更生霉素(放线菌素D、Cosmegan)、盐酸柔红霉素、柠檬酸柔红霉素脂质体注射液、地塞米松、多西他赛、盐酸多柔比星、依托泊苷、磷酸氟达拉滨、5-氟尿嘧啶、氟他胺、替扎西他滨(tezacitabine)、吉西他滨(二氟脱氧胞苷)、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、伊立替康、L-天冬酰胺酶、亚叶酸钙、美法仑、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、麦罗塔、紫杉醇、nab-紫杉醇、喷司他丁、聚苯丙生20与卡莫司汀的植入物、枸橼酸他莫昔芬、替尼泊苷、6-硫代鸟嘌呤、噻替派、替拉扎明、注射用盐酸托泊替康、长春花碱、长春新碱和长春瑞滨。

可用于本发明的特别感兴趣的抗癌剂包括但不限于：抗肿瘤抗生素、酪氨酸激酶抑制剂、烷基化剂、抗微管或抗有丝分裂剂和溶瘤细胞病毒。

示例性抗肿瘤抗生素包括但不限于：多柔比星、博莱霉素、柔红霉素(盐酸柔红霉素、道诺霉素和盐酸红比霉素、柔红霉素脂质体(柠檬酸柔红霉素脂质体)、米托蒽醌、表柔比星、伊达比星、丝裂霉素C、格尔德霉素和除莠霉素。

示例性酪氨酸激酶抑制剂包括但不限于：盐酸埃罗替尼、苹果酸舒尼替尼、柏舒替尼、达沙替尼、帕唑帕尼、索拉非尼、凡德他尼、伊马替尼和甲磺酸伊马替尼。

示例性烷基化剂包括但不限于：奥沙利铂、替莫唑胺、更生霉素(也称为放线菌素-D)、美法仑(也称为L-PAM、L-溶肉瘤素或苯丙氨酸氮芥)、六甲蜜胺(也称为六甲基三聚氰胺(HMM))、卡莫司汀、苯达莫司汀、盐酸苯达莫司汀、白消安、卡铂、洛莫司汀、顺铂、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、达卡巴嗪、丙卡巴肼、氮芥、盐酸氮芥、链脲佐菌素和噻替哌。

示例性抗微管或抗有丝分裂剂包括但不限于：长春花生物碱(如酒石酸长春瑞滨、长春新碱和长春地辛)、紫杉烷(如紫杉醇和多西他赛)和雌莫司汀。

如本文所使用的，“骨质疏松治疗剂”是指能够预防、减轻、延迟或消除与骨质疏松相关的症状、降低罹患与骨质疏松相关的疾病的风险、治愈与骨质疏松相关的疾病或其组合的试剂。可用于本发明的示例性骨质疏松治疗剂包括但不限于：双磷酸盐类(例如阿仑膦酸盐、利塞膦酸盐、伊班膦酸盐和唑来膦酸)、雷洛昔芬、地舒单抗和特立帕太。

如本文所使用的，“精神领域相关治疗剂”是指能够预防、减轻、延迟或消除与精神领域相关的症状、降低罹患与精神领域相关的疾病的风险、治愈与精神领域相关的疾病或其组合的试剂。

如本文所使用的，“发育相关治疗剂”是指能够预防、减轻、延迟或消除与发育相关的症状、降低罹患与发育相关的疾病的风险、治愈与发育相关的疾病或其组合的试剂。

在一些实施方案中，所述第一组分与所述第二组分的重量比例为1:99至99:1。在某些实施方案中，所述第一组分与所述第二组分的重量比例为1:99、5:95、10:90、15:85、20:80、25:75、30:70、35:65、40:60、45:55、50:50、55:45、60:40、65:35、70:30、75:25、80:20、85:15、90:10、95:5或99:1。

在一些实施方案中，在施用所述第二组分之前施用所述第一组分。在一些实施方案中，在施用所述第二组分之后施用所述第一组分。在一些实施方案中，所述第一组分与所述第二组分同时施用。在一些实施方案中，以交替的方式施用所述第一组分和第二组分。

在一些实施方案中，将本发明提供的第一组分和第二组分配制成单一治疗组合物，并且同时施用所述第一组分和第二组分。在一些实施方案中，将本发明提供的第一组分和第二组分彼此分开，例如，各自配制成单一治疗组合物，并且同时施用所述第一组分和第二组分。在一些实施方案中，将本发明提供的第一组分和第二组分彼此分开，例如，各自配制成单一治疗组合物，并且在不同时间施用所述第一组分和第二组分，例如，在施用所述第二组分之前施用所述第一组分，或者在施用所述第二组分之后施用所述第一组分，或者以交替的方式施用所述第一组分和第二组分。所述第一组分和第二组分可以以单剂量或多剂量施用。

治疗方法

本发明还提供治疗方法，所述治疗方法包括向有需要的受试者施用有效量的本发明所提供的菌株、其衍生物、包含其的培养基或包含其的组合物，从而用于预防和/或治疗受试者的疾病或病症。

如本文所使用的，“有效量”是指能够提供预期的效果但同时不产生在医学判断下严重的副作用的量。考虑施用途径、受试者个体差异等，可以适当地调整通过本发明的组合物施用于受试者的微生物的量。

在某些实施方案中，施用剂量可以在使用过程中改变。例如，在某些实施方案中，初始施用剂量可以高于后续施用剂量。在某些实施方案中，取决于受试者的反应，可以在使用过程中改变施用剂量。

能够理解的是，本发明的乳杆菌菌株或其衍生物的有效量取决于本领域中已知的各种因素，例如受试者的体重、年龄、既往病史、当前药物治疗、健康状态以及发生交叉反应的可能性、过敏、敏感性和不良副作用，以及施用途径和疾病发展程度。本领域技术人员能够考虑例如上述的因素减少或增加剂量。以上剂量范围并不会对本发明的范围构成任何形式的限制。

如本文所使用的，“受试者”是指任何动物，优选为哺乳动物，例如人、猴、小鼠、大鼠、兔，更优选为人。

如本文所使用的，疾病或病症的“预防和/或治疗”包含预防或减轻病状，减缓病状的发作或发展速度，降低罹患病状的风险，预防或延迟与病状相关的症状的发展，减少或结束与病状相关的症状，产生病状的完全或部分消退，治愈病状或其某一组合。

【与病原体感染相关的疾病】

本发明还提供治疗方法，所述治疗方法包括向有需要的受试者施用本发明所提供的菌株、其衍生物、包含其的培养基或包含其的组合物，从而用于拮抗受试者体内的病原体，或是用于预防和/或治疗与病原体相关的疾病或病症。

所述病原体的实例包括但不限于细菌、真菌、病毒、螺旋体、支原体、立克次氏体、衣原体和寄生虫。

在一些实施方案中，所述病原体选自由以下组成的组：分枝杆菌属(Mycobacterium)、沙门菌属(Salmonella)、大肠杆菌属(E.coli)、衣原体属(Chlamydia)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Psudomonas)、念珠菌属(Candida)、阿托波氏菌属(Atopobium)、加德纳菌属(Gardnerella)和马拉色菌属(Pityrosporum)。

在一些实施方案中，所述细菌包括大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、伤寒沙门氏菌、阴道阿托波氏菌、阴道加德纳耐药菌或其组合。

在一些实施方案中，所述真菌包括白色念珠菌、糠秕马拉色菌或其组合。

在一些实施方案中，所述寄生虫为滴虫。

在一些实施方案中，所述与病原体相关的疾病或病症包括女性生殖道感染和生殖道菌群紊乱。

所述与病原体相关的疾病或病症包括与阴道炎症相关的疾病或病症，包括但不限于细菌性阴道炎、真菌性阴道炎(例如念珠菌性阴道炎)、病毒性阴道炎、酵母性阴道炎、滴虫性阴道炎、阴道中的感染、诸如HIV和衣原体感染的性传播疾病、危及孕妇中胎儿的感染、早产和泌尿道感染。

在一些实施方案中，所述与病原体相关的疾病或病症包括马拉色菌感染相关疾病。

所述马拉色菌感染相关疾病包括但不限于头皮屑、脂溢性皮炎、特应性皮炎和银屑病。

【与免疫调节相关的疾病】

本发明还提供治疗方法，所述治疗方法包括向有需要的受试者施用本发明所提供的菌株、其衍生物、包含其的培养基或包含其的组合物，从而用于预防和/或治疗与免疫调节相关的疾病或病症。

在一些实施方案中，与免疫调节相关的疾病或病症是癌症或自身免疫性疾病。

如本文所使用的，“癌症”是指以恶性细胞生长或赘瘤、异常增殖、浸润或转移为特征的任何医学状态。

癌症的实例包括但不限于前列腺癌、胃-食道癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、乳腺癌、支气管癌、骨癌、肝脏和胆管癌症、卵巢癌、睾丸癌、肾癌、膀胱癌、头颈癌、脊柱癌、脑癌、宫颈癌、子宫癌、子宫内膜癌、结肠癌、结肠直肠癌、直肠癌、肛门癌、胃肠癌、皮肤癌、垂体癌、胃癌、阴道癌、甲状腺癌、神经胶母细胞瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤、骨髓发育不良综合症、肉瘤、畸胎瘤、神经胶质瘤、腺癌、白血病、淋巴瘤和骨髓瘤。

如本文所使用的，“过敏性疾病”是指由过敏引起的任何症状、组织损害或组织功能丧失。

过敏性疾病包括但不限于过敏性鼻炎、过敏性哮喘、特应性皮炎、过敏性角膜结膜炎、荨麻疹、食物过敏、药物过敏、尘螨过敏和花粉过敏。

如本文所使用的，“自身免疫性疾病”是指哺乳动物的免疫系统针对哺乳动物自身的组织、或者针对哺乳动物本身无害的抗原产生体液免疫应答或细胞免疫应答，从而在该哺乳动物中产生组织损伤的疾病。症状和严重程度因患者而异，每个患者的临床特征也随时间变化很大。

自身免疫性疾病的实例包括但不限于类风湿性关节炎、风湿热、狼疮、系统性硬皮病、特应性皮炎、银屑病、银屑病关节炎、哮喘、吉兰-巴雷综合征、重症肌无力、皮肌炎、多肌炎、多发性硬化、自身免疫性脑脊髓炎、结节性多动脉炎、桥本甲状腺炎、颞动脉炎、青少年糖尿病、斑秃、天疱疮、口疮性口炎、自身免疫性溶血性贫血、韦氏肉芽肿病、舍格伦综合征、艾迪生病、克罗恩病、白塞病、水肿、结膜炎、牙周炎、鼻炎、中耳炎、慢性鼻窦炎、咽喉炎、扁桃体炎、支气管炎、肺炎、胃溃疡、胃炎、结肠炎、痛风、湿疹、痤疮、接触性皮炎、脂溢性皮炎、强直性脊柱炎、纤维肌痛、骨关节炎、肩周关节炎、腱炎、腱鞘炎肌炎、肝炎、膀胱炎、肾炎、脓毒症、血管炎和滑囊炎。

【与骨质疏松相关的疾病】

本发明还提供治疗方法，所述治疗方法包括向有需要的受试者施用本发明所提供的菌株、其衍生物、包含其的培养基或包含其的组合物，从而用于预防和/或治疗与骨质疏松相关的疾病或病症。

如本文所使用的，“骨质疏松”是指以因骨量的减少和/或骨质的劣化而造成的骨强度恶化，从而导致骨折的风险增加为特征的骨疾病，包括原发性和继发性。

与骨质疏松相关的疾病或病症的实例包括但不限于青少年骨质疏松症、绝经期骨质疏松症、绝经后骨质疏松症、创伤后骨质疏松症，和由于年老、皮质激素治疗和不活动引发的骨质疏松症。

【其它用途】

本发明还提供治疗方法，所述治疗方法包括向有需要的受试者施用本发明所提供的菌株、其衍生物、包含其的培养基或包含其的组合物，从而用于预防和/或治疗与缺铁性贫血、更年期综合征、神经中枢系统疾病相关的疾病或病症。

制药用途

本发明还提供了本发明的菌株、其衍生物、包含其的培养基或包含其的组合物在制备用于拮抗病原体的药物中的用途。

本发明还提供了本发明的菌株、其衍生物、包含其的培养基或包含其的组合物在制备用于预防和/或治疗与病原体相关的疾病或病症的药物中的用途。

本发明还提供了本发明的菌株、其衍生物、包含其的培养基或包含其的组合物在制备用于预防和/或治疗与免疫调节相关的疾病或病症的药物中的用途。

本发明还提供了本发明的菌株、其衍生物、包含其的培养基或包含其的组合物在制备用于预防和/或治疗与骨质疏松相关的疾病或病症的药物中的用途。

本发明还提供了本发明的菌株、其衍生物、包含其的培养基或包含其的组合物在制备用于预防和/或治疗与缺铁性贫血、更年期综合征或神经中枢系统疾病相关的疾病或病症的药物中的用途。

治疗用途

本发明还提供了本发明的菌株、其衍生物、包含其的培养基或包含其的组合物在拮抗病原体中的用途。

本发明还提供了本发明的菌株、其衍生物、包含其的培养基或包含其的组合物在预防和/或治疗与病原体相关的疾病或病症中的用途。

本发明还提供了本发明的菌株、其衍生物、包含其的培养基或包含其的组合物在预防和/或治疗与免疫调节相关的疾病或病症中的用途。

本发明还提供了本发明的菌株、其衍生物、包含其的培养基或包含其的组合物在预防和/或治疗与骨质疏松相关的疾病或病症中的用途。

本发明还提供了本发明的菌株、其衍生物、包含其的培养基或包含其的组合物在预防和/或治疗与缺铁性贫血、更年期综合征或神经中枢系统疾病相关的疾病或病症中的用途。

提供以下实施例是为了更好地说明所要求保护的发明，而不应理解为限制本发明的范围。以下描述的所有特定组合物、材料和方法(包括整体或部分)涵盖在本发明的范围内。这些特定组合物、材料和方法不意在限制本发明，而仅用于说明在本发明的范围内的特定实施例。在不脱离本发明范围的情况下，本领域技术人员无需发明创造的能力即可开发出等效组合物、材料和方法。应理解，可对本文所描述的程序作出许多变化，但仍在本发明的界限内。发明人意在将此类变化形式包含在本发明的范围内。

实施例

实施例1.植物乳杆菌菌株的分离、纯化、增菌培养

1.乳杆菌菌株的分离、纯化和增菌培养

招募数名没有阴道感染或者任何肠道疾病的健康育龄期女性参与提供样品，参与者均通过了体检中心的健康检查，并通过调查问卷提供了关于她们的年龄(21-30)、月经周期以及其他健康行为等的信息。样品采集前2周开始，所有参与者避免所有类型的含有益生菌的配方，样品收集采用美国BD公司的Port.A-Cd系统，用两个无菌棉拭子采集受试者阴道侧壁1/3处的分泌物，放入无菌管中，迅速用冰袋运送到实验室生物安全柜中，用少量无菌PBS冲洗拭子后的菌悬液作为母液，然后用无菌PBS稀释到不同浓度，涂布于新鲜配制好的Rogosa SL固体培养基上，标记信息，将培养皿置于培养盒中，并放入厌氧产气袋，置于37℃培养箱，培养48-72小时。

从培养好的Rogosa SL平板上，用接种环分别挑取不同形态(表面、边缘、颜色、大小等)的单菌落，按八区划线法接种至新鲜配制的MRS固体培养基上，将培养皿置于培养盒中，并放入厌氧产气袋，置于37℃培养箱，培养24-72小时，获得纯化的单菌落，用接种环挑取单菌落接种至MRS液体培养基，置于37℃培养箱，厌氧培养24小时，得到植物乳杆菌菌株。

从某淘宝店购买到科立纯女性私护益生菌产品。在生物安全柜中打开包装盒，取一粒胶囊并打开胶囊壳，将胶囊壳内的菌粉倒入10mL无菌PBS溶液中，涡旋振荡混匀，记为10^-1稀释度，然后继续进行10倍梯度稀释至10^-4，从10^-3和10^-4稀释度各取100μL分别涂布于MRS固体培养基平板，37℃，厌氧培养24-48小时；待MRS固体培养基上长出单菌落，发现科立纯产品的MRS固体培养基上有2种不同的菌落形态，用接种环分别挑取不同形态的单菌落接种至MRS液体培养基，置于37℃培养箱，厌氧培养16-24小时；培养结束后，分别离心，去掉部分上清，将菌体重悬，再加入等体积的20％甘油，涡旋振荡混匀，分装到冻存管中，-80℃保藏，同时送菌株样品进行16S rRNA测序，鉴定菌株，获得商业菌株罗伊氏乳杆菌RC-14(L.reuteri RC-14)和鼠李糖乳杆菌GR-1(L.rhamnosus GR-1)。

2.乳杆菌的鉴定及保藏

(1)培养特性、染色镜检及形态学特征

针对本发明的植物乳杆菌：培养后得到的乳杆菌菌落，菌落呈圆形，取该菌纯培养物涂片进行革兰氏染色，呈现革兰氏阳性，短杆状，可连成长链，初步判定为乳杆菌属。

(2)16S rRNA基因序列鉴定

采用直接进行PCR扩增的试剂盒，引物采用27F(5'AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG3')和1492R(5'TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T 3')进行PCR扩增，取PCR产物进行凝胶电泳，确定16S rRNA基因片段，若凝胶电泳结果表明PCR成功，则将PCR样品送到基因测序公司进行16S rRNA测序。测序得到的序列与NCBI数据库中的数据进行BLAST序列相似性比较分析，根据最高同源性分值大于97％，确定分离所得的菌株是植物乳杆菌，命名为植物乳杆菌-3，即L.plantarum-3。

实施例2.植物乳杆菌L.plantarum-3的耐胃酸和胆盐特性研究

口服的益生菌进入到肠道才能发挥其益生作用，因此考察益生菌菌株的耐受胃酸、胆盐等消化液的能力非常必要。为了验证L.plantarum-3是否满足条件，本发明通过体外模拟胃肠液法测定其耐酸和耐胆盐特性。

用接种环将L.plantarum-3、L.rhamnosus GR-1和L.reuteri RC-14(对照菌，商业菌株)分别从甘油管接种至MRS液体培养基，于厌氧工作站中37℃培养18-24小时，8000rpm，5分钟离心后，收集菌体。用浊度仪分别将各菌株调整到合适的浓度(约5×10⁸CFU/mL)。按5％接种量接种到新鲜的MRS液体培养基，37℃厌氧培养6小时至对数生长期。6小时后取出，8000rpm，5分钟离心，去除培养基，加入生理盐水重悬至一定浓度。用浊度仪调节该重悬液使得细菌浓度约为1×10⁹CFU/mL。将此重悬液10倍梯度稀释，取100μL涂板计数。

1.耐胃酸试验

配制灭菌的生理盐水：0.9％w/v，盐酸调pH至3.0。

配制模拟胃液：将胃蛋白酶(Sigma，P7000-25G，632U/mg)96.84mg粉末溶于32.3mLpH 3.0生理盐水，使其终浓度为3g/L。以0.22μm无菌滤膜过滤，现配现用。

一般而言，人的胃酸pH为3.0-3.5。取2mL调好浓度的菌悬液再次离心去上清，一式两份。将一份菌体用等体积pH 3.0的模拟胃液重悬，另一份菌体用等体积常规生理盐水重悬，37℃孵育3小时后，将各益生菌进行梯度稀释，涂板计数。耐酸性计算公式如下：

酸耐受性(％)＝(模拟胃液中的Log10 CFU/mL)/(生理盐水中的Log10 CFU/mL)×100。

2.耐胆酸盐试验

配制灭菌的生理盐水：0.9％w/v，NaOH调pH至8.0。

配制100×胰蛋白酶(生工生物工程(上海)股份有限公司，A003702-0100，204U/mgprotein)母液：100mg溶于1mL pH 8.0生理盐水。配制100×胆盐(Oxoid，LP0055)母液：192.54mg溶于0.642mL pH 8.0生理盐水。

配制模拟肠液：在49mL pH 8.0生理盐水分别加入0.5mL 100×胰蛋白酶和胆盐母液，终浓度分别为1g/L胰蛋白酶和0.3％胆盐(即3mg/mL)。以0.22μm无菌滤膜过滤，现配现用。

取2mL调好浓度的菌悬液离心去除上清，一式两份。将一份菌体用等体积pH 8.0的模拟肠液重悬，另一份菌体用等体积常规生理盐水重悬，37℃孵育4小时后，将各益生菌进行梯度稀释，涂板计数。胆酸盐耐受性计算公式如下：

胆酸盐耐受性(％)＝(模拟肠液中的Log10 CFU/mL)/(生理盐水中的Log10CFU/mL)×100。

3.实验结果

本发明采用商业菌株L.rhamnosus GR-1和L.reuteri RC-14作为对照。实验结果如表1和表2所示，商业菌株L.rhamnosus GR-1、L.reuteri RC-14和L.plantarum-3在模拟胃液中孵育3小时后存活率约为100％，说明它们均具有良好的胃酸耐受性；而2株菌分别在模拟肠液中孵育4小时后，L.rhamnosus GR-1和L.reuteri RC-14的存活率均低于L.plantarum-3的存活率，说明L.plantarum-3具有良好的胆盐耐受性。综上所述，L.plantarum-3具有良好的耐胃酸和胆盐特性。

表1.植物乳杆菌菌株耐胃酸实验结果

表2.植物乳杆菌菌株耐胆盐实验结果

实施例3.植物乳杆菌L.plantarum-3的定殖性能研究

益生菌到达肠道和阴道后若能在其中定殖才能长久地发挥益生效果，所以本发明采用人肠道来源的细胞系Caco-2和阴道上皮细胞VK2/E6E7对L.plantarum-3进行肠道定殖性能评价。

Caco-2细胞的培养基采用完全培养基EMEM(杭州吉诺生物医药技术有限公司，GNM11700)，添加10％的胎牛血清。将Caco-2细胞保存管盖子稍拧松，于37℃水浴锅中迅速(2分钟内)融化。用75％乙醇消毒保存管外壁。用移液枪将细胞冻存液转移至含9mL培养基的离心管中，1000rpm离心3-5分钟，去除上清，加入合适量的培养基轻轻重悬。放入CO₂培养箱培养。当生长汇合率达到80％-90％，将细胞传代。传代培养2-3次后，吸除旧培养基，用DPBS(不含钙镁离子)清洗2次，向瓶中加入2mL胰酶轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍所有细胞表面。在37℃，消化2-5分钟后，把培养瓶放置在显微镜下进行观察，发现胞质回缩，细胞间隙增大后，轻拍培养瓶侧壁，待细胞脱离培养瓶底壁，立即加入3倍胰酶体积的完全培养基终止消化。用移液枪反复轻轻吹打瓶底壁，使细胞脱离瓶壁后形成单个细胞悬液。1000rpm，离心3-5分钟。弃去上清，重悬于新鲜培养基，并取部分细胞悬液于自动细胞计数仪确定实际活细胞数。根据活细胞计数结果，用培养基稀释至细胞密度为5×10⁵cell/mL，96孔板每孔加入100μL细胞悬液，则每孔含有5×10⁴cell/well。37℃，5％ CO₂培养箱培养20-24小时，待用。

VK2/E6E7细胞培养基采用500mL无血清角质细胞基础培养液K-SFM(Invitrogen，10744-019)，添加1mL角质细胞生长补液。使用前置于37℃预热。

用接种环将L.plantarum-3、L.rhamnosus GR-1和L.reuteri RC-14从甘油管接种至MRS液体培养基，于厌氧工作站中37℃培养12-18小时。8000rpm，5分钟离心后，收集菌体。用浊度仪分别将各益生菌调整到合适的浓度(约5×10⁸CFU/mL)。按5％接种量接种到新鲜的MRS液体培养基，37℃厌氧培养6小时至对数生长期。8000rpm，5分钟离心，去除培养基，加入生理盐水重悬至一定浓度。用浊度仪调节该重悬液，使益生菌的浓度约为1.0×10⁹CFU/mL。在重悬菌液中加入等体积的40％甘油，混匀，转移1mL/支至细胞冻存管，置于干冰上。凝固后转移至-80℃冰箱，长期保存。待实验开始前，取1管冻存菌置于37℃水浴锅融化后，进行10倍梯度稀释，10μL涂板计数，3个重复。

实验当天，将冻存管取出，立即置于37℃水浴锅融化。转移至2mL离心管，8000rpm，5分钟离心后，去除上清，用培养基重悬。将此细菌悬液用相应的培养基先稀释至约2.5×10⁸CFU/mL，再稀释5倍，再稀释10倍，分别得到约5.0×10⁷CFU/mL及约5.0×10⁶CFU/mL的菌悬液，待用。

实验当天，将细胞从培养箱中取出，弃去培养基，加入相应的培养基清洗1次。将准备好的各个浓度的菌液分别取100μL加到细胞中。将板子置于37℃，CO₂培养箱静置粘附2小时，目标感染复数(Multiplicity of Infection,MOI，细菌：细胞)为10:1。孵育粘附结束后，用洗板机(BioTek，405TS)清洗3次(清洗体积200μL，最低清洗速度)，加入200μL含0.05％ Triton X-100的DPBS裂解细胞，并用移液枪吹吸，使得细胞及细菌充分脱落。用生理盐水10倍梯度稀释并取100μL涂板计数，计数平板为MRS琼脂，3个重复。采用以下公式计算粘附率

粘附率％＝粘附的菌量CFU/接种的菌量CFU×100％

表3植物乳杆菌L.plantarum-3对Caco-2细胞和VK2/E6E7细胞的粘附能力

实验结果如表3所示，对于人结肠癌细胞Caco-2和阴道上皮细胞VK2/E6E7，L.plantarum-3的粘附力都高于商业菌株，表明L.plantarum-3是具有开发潜能的益生菌菌株。

实施例4.植物乳杆菌L.plantarum-3拮抗致病菌的效果研究

乳杆菌拮抗致病菌的能力也是其发挥益生功效的机理之一，因此，本发明通过双层平板法和菌饼法研究了L.plantarum-3拮抗致病菌的能力，商业菌株L.rhamnosus GR-1和L.reuteri RC-14作为对照菌。

用接种环将L.plantarum-3、L.rhamnosus GR-1和L.reuteri RC-14从甘油管接种至MRS液体培养基，于厌氧工作站中37℃培养12-18小时。8000rpm，5分钟离心后，收集菌体。用浊度仪分别将各益生菌调整到合适的浓度(约5×10⁸CFU/mL)。按5％接种量接种到新鲜的MRS液体培养基，37℃厌氧培养6小时至对数生长期。6小时后取出，8000rpm，5分钟离心，去除培养基，加入生理盐水重悬至一定浓度。用浊度仪调节该重悬液使得细菌浓度约为1.0×10⁸CFU/mL。将此重悬液10倍梯度稀释，取10μL涂板计数。用移液枪取5μL调整好的菌液点到事先准备好的MRS琼脂培养基上(1个菌/平板，3个平行)。待平板吹干后置于37℃厌氧条件下培养20-24小时后待用。

将7株致病菌(大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、伤寒沙门氏菌、白色念珠菌、阴道阿托波氏菌和阴道加德纳耐药菌)按表4提前一天接种各自固体培养基，37℃，过夜培养。测试方法汇总见表5。

表4培养植物乳杆菌菌株和各致病菌菌株所使用的培养基

表5菌饼法测试方法及条件

实验当天，将致病菌取出。对于5株致病菌，用接种环挑取3-6个单菌落至生理盐水中，制备菌悬液。用浊度仪调节至约0.2，细菌浓度约1.0×10⁸CFU/mL；白色念珠菌浊度约0.2，浓度约为2.0×10⁶CFU/mL。

双层平板法：取调好的1株致病菌(金黄色葡萄球菌)100μL于5mL冷却至约45℃的固体培养基(见表4)中，倒在培养20-24小时的待测益生菌MRS琼脂上。待凝固后，将平板置于37℃大气条件下培养1天，直至出现抑菌圈。每个益生菌3个平行测试板。

倒置菌饼法：取调好的致病菌100μL(大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌和伤寒沙门氏菌)，分别涂布于NA或哥伦比亚血琼脂培养基+5％羊血平板上，待其充分吸收后，抠取各益生菌菌饼倒置于致病菌平板上。将大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌和伤寒沙门氏菌平板置于37℃大气条件下培养1天，直至出现抑菌圈。每个益生菌3个平行测试板。

条带菌饼法：用棉棒蘸取益生菌接种液，然后在含10mL MRS固体培养基平皿上，沿直径涂布成2cm宽的条带。然后将板子37℃厌氧培养24小时。取出板子，将融化的5mL YM固体培养基倾注平板表面，待凝固薄层。用棉棒将白色念珠菌液均匀涂布在YM固体培养基表面，待干后，先放在4℃培养4小时，然后37℃培养24小时，观察益生菌对白色念珠菌的抑制效果。每个益生菌3个平行测试板。

用游标卡尺或菌落计数仪测量抑菌圈直径。

用GraphPad Prism软件进行统计学分析。每组数据采用One-way ANOVA计算，并采用Dunnett's multiple comparisons test对各益生菌分别进行比较。当P-value<0.05时，被认为有显著差别。

L.plantarum-3对7株致病菌的抑制作用如表6-10所示。L.plantarum-3抑制铜绿假单胞菌、伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、阴道加德纳耐药菌和阿托波氏菌的作用均强于商业菌株L.rhamnosus GR-1和L.reuteri RC-14；L.plantarum-3以及商业菌株L.rhamnosus GR-1和L.reuteri RC-14对白色念珠菌的生长均有显著抑制作用。

表6植物乳杆菌对铜绿假单胞菌的抑菌圈直径(mm)

表7植物乳杆菌对伤寒沙门氏菌和大肠杆菌的抑菌圈直径(mm)

表8植物乳杆菌对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径(mm)

表9植物乳杆菌对白色念珠菌的抑制作用

注：“-”表示没有抑制；“+/-”表示部分抑制；”+”表示明显抑制。

表10植物乳杆菌对阴道加德纳耐药菌和阿托波氏菌的抑制作用

实施例5.对小鼠阴道加德纳菌模型的影响

取SPF级4-6周ICR雌性小鼠40只，随机分为4组：健康对照组、感染对照组、甲硝唑组和植物乳杆菌L.plantarum-3组，每组10只。定义感染当天为day 0，在day3和day 0给小鼠皮下注射一定浓度雌二醇，感染当天腹腔注射一定量盐酸氯胺酮麻醉小鼠，然后给小鼠阴道注入20μL阴道加德纳菌液(5×10⁷CFU/mL)，每天1次，连续接种3天，第4天用无菌拭子从小鼠阴道蘸取少量粘液，检测加德纳菌，确保每个小鼠阴道中都有加德纳菌持续定殖，健康对照组每天每次注入相同体积的生理盐水。

从MRS平板上挑取新鲜培养的植物乳杆菌L.plantarum-3单菌落接种至MRS液体培养基中，37℃，静置厌氧培养24小时，离心，将菌泥用PBS重悬，用流式细胞仪调整浓度为1×10⁹CFU/mL。感染后第1天，给植物乳杆菌L.plantarum-3组小鼠阴道分别灌注新鲜制备的菌液20μL，连续3天，每天1次；甲硝唑组小鼠阴道注入20μL甲硝唑溶液，连续3天，每天1次；健康对照组和感染对照组的小鼠每天阴道给予相同体积的生理盐水，连续3天，每天1次。

1.小鼠阴道菌群的测定与分析

用微量加样器取50μL生理盐水，分别于造模后给药前、给药结束后第1天、给药结束后第6天反复冲洗小鼠阴道5-6次，取30μL上述阴道灌洗液分别做阴道加德纳菌和乳杆菌的菌落计数，结果见表11。阴道加德纳菌的计数采用加有硫酸庆大霉素(4mg/L)、萘啶酮酸(30mg/L)和两性霉素B(2mg/L)的哥伦比亚血平板。

依选择性培养基菌落形态，涂片染色镜检，进行初步鉴定。

表11各组灌洗液菌落计数结果

由上表可知，植物乳杆菌L.plantarum-3组小鼠在治疗后第一天，其阴道内加德纳菌定殖的数量与感染对照组相比显著降低，乳杆菌的数量比甲硝唑组和感染对照组高出约3个数量级；治疗后第6天植物乳杆菌L.plantarum-3组小鼠阴道内定殖的加德纳菌数量略高于甲硝唑组，但比感染对照组低2个数量级，而乳杆菌的数量仍然高出甲硝唑组和感染对照组约3个数量级；说明植物乳杆菌L.plantarum-3能很好地定殖在阴道内并将阴道内乳杆菌数量恢复到正常水平以上，同时可以稳定地抑制阴道加德纳菌的繁殖。

2.治疗前后小鼠外阴观察

观察并记录各组小鼠外阴红肿、阴道分泌物多少的情况，并取各组典型小鼠做阴道灌洗液涂片(PAS染色)。

表12治疗后小鼠外阴红肿及分泌物等炎症情况

表12显示了阴道加德纳菌定殖在小鼠阴道引起的炎症反应情况，感染对照组小鼠外阴出现大量的水肿、分泌物多且呈稀薄泡沫状，PAS染色结果显示阴道粘膜表层出现炎症细胞浸润，表明造模成功；经过植物乳杆菌L.plantarum-3菌液治疗后小鼠外阴水肿和分泌物多等症状均有明显缓解，阴道灌洗液PAS染色结果显示小鼠阴道分泌物中白细胞数目明显减少，大部分是阴道上皮细胞，说明小鼠阴道粘膜的损伤已经得到了很大程度的恢复。

上述结果表明，本发明中的植物乳杆菌L.plantarum-3具有调节阴道菌群平衡、抑制阴道加德纳菌生长和定殖的作用，可用于预防与治疗细菌性阴道炎。

实施例6.对小鼠阴道白色念珠菌模型的影响

取SPF级6-8周的C57BL/6雌性小鼠40只，随机分为4组：健康对照组、感染对照组、克霉唑组和植物乳杆菌L.plantarum-3组，每组10只。除健康对照组外，其它各组用微量加样器取50μL一定浓度的盐酸林可霉素溶液进行小鼠阴道冲洗，每天1次，连续5天，之后用微量加样器取白色念珠菌(2.5×10⁷CFU/mL)20μL接种小鼠阴道内，连续接种6天，每天1次，造成小鼠阴道白色念珠菌感染模型。健康对照组每天每次注入相同体积的生理盐水，连续11天。

将新鲜培养的植物乳杆菌L.plantarum-3从MRS平板上挑取单菌落接种至MRS液体培养基中，37℃，静置厌氧培养24小时，离心，将菌泥用PBS重悬，用流式细胞仪调整浓度为1×10⁹CFU/mL。给植物乳杆菌L.plantarum-3组小鼠灌注菌液20μL，连续3天，每天1次；克霉唑组小鼠阴道注入20μL克霉唑溶液，连续3天，每天1次；健康对照组和感染对照组的小鼠每天阴道给予相同体积的生理盐水，连续3天，每天1次。

1.小鼠阴道菌群的测定与分析

用微量加样器取50μL生理盐水，取部分小鼠分别于造模后给药前、给药结束后第1天、给药结束后第6天反复冲洗小鼠阴道5-6次，取30μL上述阴道灌洗液分别做白色念珠菌和乳杆菌的菌落计数，结果见表13。

依选择性培养基菌落形态，涂片染色镜检，进行初步鉴定。

表13各组灌洗液菌落计数结果

从上表可以看出：

植物乳杆菌L.plantarum-3组的小鼠在治疗后第一天，其阴道内白色念珠菌定殖的数量与感染对照组相比均降了一个数量级，但其引导内乳杆菌的数量比感染对照组和克霉唑组均高出约3个数量级；治疗后第6天，植物乳杆菌L.plantarum-3组小鼠阴道内定殖的白色念珠菌数量均与克霉唑组相当，远小于感染对照组，而小鼠阴道内乳杆菌的数量仍然高出克霉唑组和感染对照组约3个数量级；说明植物乳杆菌L.plantarum-3能很好地定殖在阴道内并将阴道内乳杆菌数量恢复到正常水平以上，同时可以稳定地抑制白色念珠菌的繁殖。

2.治疗前后小鼠外阴观察

观察并记录各组小鼠外阴红肿、阴道分泌物多少的情况，并取各组典型小鼠做阴道灌洗液涂片(PAS染色)。

表14治疗后小鼠外阴红肿及分泌物等炎症情况

表14显示了白色念珠菌定殖在小鼠阴道引起的炎症反应情况，感染对照组小鼠外阴出现较大程度的红肿、分泌物多且成块状、阴道充血严重等典型的念珠菌症状，表明造模成功；经植物乳杆菌L.plantarum-3菌液治疗后，小鼠外阴红肿、阴道充血和分泌物等症状均有明显减轻。

同时，阴道灌洗液PAS染色结果显示健康对照组的小鼠阴道上皮细胞占多数，白细胞数目较少，而白色念珠菌定殖的感染对照组小鼠阴道上皮细胞较少，白细胞数目较多，说明小鼠的阴道粘膜被严重破坏，经植物乳杆菌L.plantarum-3菌液治疗后小鼠阴道的白细胞数目明显减少，并且上皮细胞占多数，说明小鼠阴道粘膜的破损已经得到了恢复。

以上结果表明，本发明中的植物乳杆菌L.plantarum-3具有调节阴道菌群、抑制阴道白色念珠菌生长和定殖的作用，可用于预防与治疗念珠菌性阴道炎。

实施例7.植物乳杆菌抗糠秕马拉色菌作用的分析

通过双层平板法测定L.plantarum-3的抗真菌作用，商业菌株L.rhamnosus GR-1作为对照菌。将L.plantarum-3和商业菌株L.rhamnosus GR-1按3％(V/V)接种MRS液体培养基，37℃，厌氧培养8-16小时，待用。将10μL菌液点样(spot)到MRS固体培养基平板上，37℃，厌氧培养24-48小时。将1％糠秕马拉色菌(ATCC14521)种子液接种于在有氧条件下制备的mYPG液体培养基中，37℃培养24至48小时，待用。配制mYPG培养基，115℃，灭菌20分钟，待温度冷却到40℃左右，取2.5mL该培养基与500μL待用的糠秕马拉色菌(M.furfur)培养液混合，将该混合液分别倒入到点样有L.plantarum-3和商业菌株L.rhamnosus GR-1的MRS固体培养基上，静置至培养基凝固。将已凝固的培养基平板有氧、37℃培养24至48小时。通过测定抑菌圈直径来确定L.plantarum-3和商业菌株L.rhamnosus GR-1抗糠秕马拉色菌的活性，三个平行重复实验。实验结果如表15所示，表明L.plantarum-3抑制糠秕马拉色菌生长的作用强于商业菌株L.rhamnosus GR-1。

表15植物乳杆菌对糠秕马拉色菌的抑菌圈直径(mm)

实施例8.植物乳杆菌抑制抗原诱导的组胺释放作用研究

在变应性反应中，组织中会释放出大量组胺，进而引起炎性反应，临床上通过阻断组胺的分泌进而改善患者变应性反应的症状。为了筛选可抑制组胺分泌的益生菌菌株，本发明评价了来源于人阴道的植物乳杆菌L.plantarum-3的抑制组胺分泌的能力，用商业菌株L.rhamnosus GR-1作为对照菌株。各菌株抑制组胺分泌的能力通过以下方法来测定：在培养RBL-2H3细胞系之后诱导脱颗粒，然后采用邻苯二醛柱后转化法，用高效液相色谱法测定滤液中组胺的含量。

将L.plantarum-3和商业菌株L.rhamnosus GR-1分别在MRS培养基中培养，活化传代培养2-3次后待用。在37℃、5％CO₂，将RBL-2H3细胞(ATCC NO.CRL-2256，购自南京科佰生物科技有限公司)在添加10％FBS胎牛血清(FBS)、青霉素100μg/mL、链霉素100μg/mL的α-MEM培养基中进行培养，传代培养2-3次后，取0.5mL新鲜培养的RBL-2H3细胞接种到24孔板上，接种浓度为1×10⁵个/孔，37℃、5％CO₂，培养24小时，去掉上清，然后加入含5％FBS的α-MEM培养基和IgE(0.1-0.7μg/mL)，孵育1至8小时，15000g离心3分钟，去掉上清液，用1mL的HEPES缓冲液(140mM NaCl，5mM KCl，0.6mM MgCl₂，1.0mM CaCl₂，5.5mM葡萄糖，0.1％牛血清白蛋白，5mM HEPES)洗涤细胞2-4次，每孔加入100-400μL先前制备的益生菌培养液或阳性对照组酮替芬(5-40μg/mL)/孔处理5-30分钟，然后用100μL的抗原(DNP-BAS，100μg/mL)在37℃处理20-40分钟，通过抗原-抗体反应诱导脱颗粒。用100μL的HEPES缓冲液代替抗原处理诱导脱颗粒，作为阴性对照。抗原处理结束后，将24孔板放在冰水浴中，加入0.6mL冰HEPES缓冲液终止反应，每孔取上清液，加入20μL高氯酸，12000rpm离心30分钟后，上清液通过0.45μm滤膜过滤。采用邻苯二醛柱后转化法，用高效液相色谱法测定滤液中组胺的含量。

植物乳杆菌处理后的组胺含量与阴性对照组进行比较，组胺释放抑制率按照如下公式计算：

组胺抑制率＝(阴性对照滤液中组胺含量-处理组滤液中组胺含量)/阴性对照滤液中组胺含量。

实验结果如表16所示，与酮替芬和L.rhamnosus GR-1相比，L.plantarum-3显示出更高的组胺释放抑制率，进而可有效地减轻由过度的组胺分泌引起的变应性症状。

表16植物乳杆菌的组胺释放抑制率

实施例9.植物乳杆菌抑制T细胞中Th2型细胞因子的作用分析

2型辅助T细胞(Th2)相关的细胞因子(如，IL-4和IL-5)，能够通过Th2相关的免疫反应提高IgE的产生，从而促进慢性变应性反应。本发明进一步采用EL4细胞系评价L.plantarum-3对慢性变应性反应的抑制作用，商业菌株L.rhamnosus GR-1作为对照菌株。

在37℃、5％CO₂条件下将EL4细胞(ATCC TIB 181，购自南京科佰生物科技有限公司)在添加10％胎牛血清(FBS)、青霉素100μg/mL、链霉素100μg/mL DMEM培养基中进行培养，传代培养2-3次后待用；将L.plantarum-3和商业菌株L.rhamnosus GR-1分别在MRS培养基中培养，传代2-3次，发酵培养液以12000g离心5分钟，弃掉上清并用PBS洗涤沉淀物，用流式细胞仪测定活细菌的数目，待用。

将活力良好的EL4细胞以1×10⁵个细胞/孔的浓度接种到48孔板上，37℃、5％CO₂，培养12至24小时，然后加入PMA(终浓度10ng/mL)，再加入200μL先前制备的植物乳杆菌菌液进行共培养，在37℃、5％CO₂培养箱孵育24小时之后，收集上清液，并使用Mouse IL-4ELISAkit(PI613，Beyotime)和Mouse IL-5ELISA kit(PI620，Beyotime)测定分泌的IL-4和IL-5的量。

结果如图1和2中所示，L.plantarum-3抑制IL-4和IL-5分泌的作用稍强于商业菌株L.rhamnosus GR-1，该菌株可通过抑制介导变应性反应的Th2型细胞因子的分泌而发挥治疗和预防变态反应的作用。

实施例10.植物乳杆菌抑制IgE的作用分析

免疫球蛋白E(IgE)是免疫球蛋白的一种，是参与变应性疾病的主要因子。一般情况下，可以通过测量血清中IgE的总量作为诊断变应性疾病的方法之一。因此，本发明通过使用人B细胞U266B1来验证L.plantarum-3对IgE分泌的抑制作用，商业菌株L.rhamnosusGR-1作为对照菌株。

在37℃、5％CO₂培养条件下，在添加了10％FBS、青霉素(100μg/mL)和链霉素(100μg/mL)的RPMI-1640培养基中培养U266B1细胞(ATCC NO.TIB-196，购自南京科佰生物科技有限公司)，传代培养2-3次。将U266B1细胞以5×10⁵个细胞/孔的浓度接种到24孔板上，然后将其培养12至18小时待用。

在已接种U266B1细胞的24孔板中，每个孔添加100μL的LPS(10μg/mL)和IL-4(5ng/mL)进行处理。然后，在24孔板中每孔中加入300μL先前制备的植物乳杆菌菌株溶液或者PBS，5％CO₂、37℃下共孵育。孵育24-48小时后，收集上清液，并使用Human IgE ELISA试剂盒(70-EK175-48，MultiSciences)测定IgE水平。

植物乳杆菌处理后的IgE水平与阴性对照组进行比较，IgE抑制作用按照如下公式计算：

IgE抑制率＝(阴性对照滤液中IgE含量-处理组滤液中IgE含量)/阴性对照滤液中IgE含量。

实验结果如图3所示，与阴性对照组相比，L.plantarum-3和商业菌株L.rhamnosusGR-1均显示出显著抑制IgE分泌的作用，且L.plantarum-3的抑制作用强于商业菌株L.rhamnosus GR-1。

实施例11.植物乳杆菌L.plantarum-3减轻特应性皮炎的作用

根据以上体外研究的结果，本发明采用动物模型进一步研究L.plantarum-3减轻特应性皮炎的作用。采用特应性皮炎NC/Nga小鼠模型，将15只NC/Nga小鼠随机分成3组，模型对照组、阳性对照组和L.plantarum-3给药组，每组各5只，脱去每只小鼠从双耳及背部的毛。然后，将200μL的1％DNCB(二硝基氯苯)溶液(丙酮∶橄榄油＝1∶3)涂抹到小鼠脱毛部分，每周1次，共6次，以诱导特应性皮炎。自皮炎诱导的前一周起，每天向模型对照组中的小鼠灌胃200μL的PBS；每天向给药组的小鼠灌胃L.plantarum-3 1x10⁸ CFU/只；同时，给阳性对照组中的小鼠涂抹200μL的地塞米松(dexamethasone，60μg/mL)。在实验期间，每周测量对照组和L.plantarum-3给药组中小鼠的皮炎评分，并且在灌胃益生菌之后的第3、7周分别测量小鼠的抓挠时间和皮肤厚度。

自灌胃益生菌第3周起，每间隔1周拍照1次监测皮肤状况，持续4周。检查皮肤的干燥、水肿、红斑/出血(erythema/hemorrhage)和糜烂/脱落(erosion/excoriation)四个指标。没有病变的状况评分为0分，轻度状况评分为1分，中度状况评分为2分，严重状况评分为3分，并对总评分进行评价。结果如图4中所示，与模型对照组相比，L.plantarum-3给药组的皮炎评分显著降低，说明L.plantarum-3具有治疗特应性皮炎的作用。

为了进一步验证灌胃L.plantarum-3后，是否能减轻模型小鼠的发痒症状，在灌胃益生菌3周之后通过拍摄持续30分钟的小鼠模型视频来测量抓挠时间。结果如图5所示，与模型对照组相比，L.plantarum-3灌胃组小鼠的抓挠时间显著降低，说明灌胃L.plantarum-3大大减轻了特应性皮炎的发痒症状。

在灌胃L.plantarum-3第4周后，用卡尺(caliper)测量小鼠的耳厚度和背皮肤厚度，并观察各组小鼠水肿症状的缓解情况。实验结果如图6A-6B所示，与模型对照组相比，L.plantarum-3组和地塞米松组小鼠的耳厚度(图6A)和背皮肤厚度(图6B)均显著降低。

实施例12.采用经卵清蛋白(OVA)诱导的哮喘小鼠模型评估L.plantarum-3对哮喘的治疗和预防作用

为了验证L.plantarum-3对过敏性哮喘的作用，采用OVA诱导的哮喘小鼠模型，进行组织病理检查，同时测定IL-5和IL-13的表达水平。

选用5-7周龄Balb/c小鼠，适应1周，随机分为3组，即正常对照组(对照组-PBS；未吸入OVA)、OVA哮喘模型对照组(OVA-PBS；吸入OVA)以及益生菌给药组(OVA-1)，每组10只。在从实验开始至第31天将小鼠处死之前，每天向正常对照组和哮喘诱导的对照组灌胃200μL PBS，每天向给药组灌胃200μL L.plantarum-3菌液。

小鼠适应1周后开始正式实验，正式实验第一天记为day 1，分别在day 7和day21，给小鼠腹膜内注射混悬了2mg氢氧化铝(ImjectTM Alum Adjuvant，Thermofisher)和20μg OVA(卵清蛋白，Sigma-aldrich)的200μL磷酸缓冲液(pH 7.4)进行致敏。在day 28-day30，通过鼻内滴用1％的OVA吸入肺部队小鼠造成刺激，共进行3次。在最后一次刺激之后经过24小时(即day 31)时进行戊巴比妥处理，并随后进行支气管切口以收集肺组织样品。

在抗原处理的支气管中观察到由嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和巨噬细胞组成的炎性细胞的浸润。为了验证L.plantarum-3对哮喘的作用，对每组肺组织样品进行组织病理学检查。病理结果显示在OVA哮喘模型对照组(OVA-PBS)中，许多炎性细胞包括嗜酸性粒细胞浸润到细支气管周围，并且还发现过度增殖的上皮细胞和增厚的支气管平滑肌；而L.plantarum-3给药组(OVA-1)中，炎性细胞的浸润明显降低，支气管组织的厚度也降低，上皮细胞也几乎未受损，说明L.plantarum-3对经OVA诱导的过敏性哮喘具有预防和治疗作用。

用流式细胞仪(FACSAria III，BD)测定来自从每组收集的肺组织样品的免疫细胞数量。采用针对数种标志物的抗体(抗小鼠CD45，BioLegend；抗小鼠CD3ε，BD；抗小鼠/人IL-5，BioLegend；抗小鼠IL-13，Invitrogen)染色IL-5⁺CD4⁺T、IL-13⁺CD4⁺T细胞。通过对具有CD45和CD3ε作为标志物的淋巴细胞中产生IL-5或IL-13的细胞进行计数来确定IL-5⁺和IL-13⁺细胞。

实验结果如图7A和7B所示，与正常对照组(PBS)相比，OVA哮喘模型对照组(OVA-PBS)的小鼠中的IL-5和IL-13水平均显著提高；与哮喘模型对照组相比，L.plantarum-3给药组(OVA-1)的小鼠中的总IL-5和总IL-13水平均显著降低，说明本发明的L.plantarum-3菌株可通过抑制作为介导变应性反应的Th2型细胞因子的IL-5和IL-13的分泌来发挥其对过敏性哮喘的治疗性和预防性作用。

实施例13.采用屋尘螨(HDM)诱导的哮喘模型评估L.plantarum-3对哮喘的治疗和预防的作用

屋尘螨是作为外源性哮喘的主要原因的变应原。为研究L.plantarum-3对过敏性哮喘的作用，采用HDM诱导的哮喘小鼠模型，评价气道超敏反应，并且确定CD45⁺细胞中嗜酸性粒细胞的比例，CD4⁺T细胞中IL-5⁺CD4 T细胞的比例以及CD4⁺T细胞中IL-13⁺CD4 T细胞的比例。

购买5-7周龄Balb/c小鼠，适应1周，随机分为3组，分别为正常对照组(鼻滴PBS)、哮喘诱导的对照组(鼻滴HDM-PBS)以及益生菌给药组(HDM-1)，每组中取6只小鼠用于评价气道高反应性(AHR)，每组中取10只小鼠用于评价肺中的免疫细胞。

小鼠适应1周后，在整个实验期间，给正常对照组和哮喘模型对照组小鼠每天灌胃PBS(day 1-18)，而给药组小鼠则每天灌胃L.plantarum-3(day 1-18)，在day 7给小鼠鼻内滴混悬了10μg HDM的50μL磷酸缓冲液(pH 7.4)进行致敏。自致敏之后1周，通过鼻内滴混悬了10μg HDM的50μL磷酸缓冲液吸入肺，持续5天(day14-18)。在最后一次刺激致敏后24小时(day 19)用戊巴比妥处理小鼠，并随后评价气道高反应性(AHR)以及进行支气管切口以收集肺组织样品。

将用戊巴比妥麻醉的小鼠与动物肺功能-气道阻力和肺顺应性系统(FinePointeResistance and Compliance，DSI-Buxco)连接，并给小鼠施用不同浓度的乙酰甲胆碱PBS溶液(0、5、10、20和40mg/mL)。然后，测量通过气道的空气体积来计算AHR值。

实验结果如图8所示，随着乙酰甲胆碱浓度提高，正常对照组(CTRL)中AHR(R_L)缓慢提高，而模型对照组(HDM)中AHR迅速提高；与哮喘模型对照组(HDM)相比，L.plantarum-3灌胃组(HDM+L.plantarum-3)中，AHR明显降低，且在用高浓度的乙酰甲胆碱处理时，AHR的降低具有显著性，说明可有效抑制引起哮喘的AHR，从而可有效地用于治疗和预防过敏性哮喘。

使用流式细胞仪(FACSAria III，BD)测定肺中的免疫细胞。使用鼠源抗体(抗小鼠CD45，BioLegend；大鼠抗小鼠Siglec-F，BD；抗小鼠CD11b，BD；抗小鼠CD3ε，BD；抗小鼠TCRβ，BioLegend；抗小鼠CD4，BioLegend；抗小鼠IL-5，BioLegend；抗小鼠IL-13，Invitrogen)对嗜酸性粒细胞和IL-5⁺CD4⁺T、IL-13⁺CD4⁺T细胞进行染色。通过对表达常见白细胞标志物CD45的细胞中的Siglec-f+CD11b⁺细胞进行计数来确定嗜酸性粒细胞，并且通过对具有CD3ε、TCRβ和CD4作为标志物的CD4⁺T细胞中的产生IL-5或IL-13的细胞进行计数来确定IL-5⁺CD4⁺T、IL-13⁺CD4⁺T细胞数量。

实验结果如图9A-9C所示，与正常对照组(PBS)相比，哮喘模型对照组(HDM)小鼠肺部组织中的免疫细胞，即嗜酸性粒细胞、IL-5⁺CD4⁺T细胞和IL-13⁺CD4⁺T细胞的比例均显著提高；而与哮喘模型对照组相比，灌胃L.plantarum-3组中嗜酸性粒细胞、IL-5⁺CD4⁺T细胞和IL-13⁺CD4⁺T细胞的比例均显著降低，说明L.plantarum-3可通过抑制嗜酸性粒细胞、IL-5⁺CD4⁺T细胞和IL-13⁺CD4⁺T细胞等炎性细胞来发挥对过敏性哮喘的治疗和预防作用。

Claims (36)

1.一种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株，其保藏编号为CGMCC No.19523。

2.如权利要求1所述的菌株，其分离自生殖道分泌物。

3.如权利要求1所述的菌株，其具有如下一种或多种性质：(i)在模拟胃液中孵育3小时后存活率至少为50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％；(ii)在模拟肠液中孵育4小时后存活率至少为50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％或94％；(iii)相比于L.rhamnosus GR-1、L.reuteriRC-14或两者，其具有对Caco-2细胞、VK2/E6E7细胞或两者更高的粘附能力；(iv)相比于L.

rhamnosus GR-1、L.reuteriRC-14或两者，其具有对铜绿假单胞菌、伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、阴道加德纳耐药菌、阿托波氏菌、糠秕马拉色菌或任意组合更高的抑菌能力；(v)对阴道加德纳菌、白色念珠菌或任意组合具有显著的抑制能力，而且将乳杆菌数量恢复到正常水平以上，同时缓解外阴水肿、分泌物多等症状，恢复阴道粘膜损伤；(vi)相比于L.rhamnosus GR-1，其对抗原诱导的组胺释放、Th2型细胞因子(IL-4和/或IL-5)的分泌和/或IgE的分泌具有更强的抑制作用；(vii)降低皮炎评分、抓挠时间和皮肤厚度，显著减轻特应性皮炎；(viii)对经卵清蛋白(OVA)诱导的过敏性哮喘具有治疗和预防作用，且通过抑制作为介导过敏性反应的Th2型细胞因子的IL-5和IL-13的分泌来发挥其对过敏性哮喘的治疗性和预防性作用；和(ix)在屋尘螨(HDM)诱导的过敏性哮喘中通过抑制气道高反应性和/或抑制炎性细胞(例如嗜酸性粒细胞、IL-5⁺CD4⁺T细胞和/或IL-13⁺CD4⁺T细胞)来发挥过敏性哮喘的治疗和预防作用。

4.如权利要求1所述的菌株，其包含核苷酸序列为SEQ ID NO:1的16S rRNA序列。

5.一种培养如权利要求1-4中任一项所述的菌株的方法，包括在培养基中培养所述菌株。

6.如权利要求5所述的方法，其中所述培养基是MRS培养基。

7.如权利要求5所述的方法，其中所述培养在厌氧条件下进行。

8.如权利要求5所述的方法，其中所述培养在37℃下进行。

9.一种如权利要求1-4中任一项所述的菌株的衍生物。

10.如权利要求9所述的衍生物，所述衍生物是培养物、裂解物、提取物、灭活产物或其组合。

11.一种培养基，其包含如权利要求1-4中任一项所述的菌株或如权利要求9或10所述的衍生物。

12.一种组合物，其包含有效量的第一组分，其中所述第一组分包括如权利要求1-4中任一项所述的菌株、如权利要求9或10所述的衍生物或如权利要求11所述的培养基。

13.如权利要求12所述的组合物，其中所述组合物是食品组合物、保健食品组合物、药物组合物、特殊医学用途食品组合物、化妆品组合物、医疗器械组合物或饲料组合物。

14.如权利要求12所述的组合物，其中所述组合物以丸剂、片剂、锭剂、冻干粉剂、颗粒剂、胶囊剂、水溶液、醇溶液、油溶液、糖浆剂、乳液、悬浮液、栓剂、注射或输注用溶液、软膏剂、凝胶、酊剂、霜剂、贴剂、洗剂、喷雾剂、气雾剂、粉雾剂、泡腾片、透皮治疗系统、微胶囊、植入物或棒的形式存在。

15.如权利要求12所述的组合物，其中所述组合物被配制用于经眼、经耳、鼻内、舌下、口服、经皮、局部、经鼻、直肠或胃肠外施用。

16.如权利要求12所述的组合物，其中所述组合物进一步包括第二组分。

17.如权利要求16所述的组合物，其中所述第二组分包括益生菌、后生元、益生元、抗菌剂、免疫调节剂、抗癌剂、骨质疏松治疗剂、精神领域相关治疗剂、发育相关治疗剂或其组合。

18.如权利要求16所述的组合物，其中所述第一组分与所述第二组分的重量比例为1:99～99:1。

19.如权利要求16所述的组合物，其中所述第一组分于所述第二组分先、后或同时施用。

20.如权利要求1-4中任一项所述的菌株、如权利要求9或10所述的衍生物、如权利要求11所述的培养基或如权利要求12-19中任一项所述的组合物在制备用于拮抗病原体的药物中的用途。

21.如权利要求1-4中任一项所述的菌株、如权利要求9或10所述的衍生物、如权利要求11所述的培养基或如权利要求12-19中任一项所述的组合物在制备用于预防和/或治疗与病原体相关的疾病或病症的药物中的用途。

22.如权利要求20或21所述的用途，其中所述病原体选自由以下组成的组：细菌、真菌、病毒、螺旋体、支原体、立克次氏体、衣原体和寄生虫。

23.如权利要求22所述的用途，其中所述病原体选自由以下组成的组：分枝杆菌属(Mycobacterium)、沙门菌属(Salmonella)、大肠杆菌属(E.coli)、衣原体属(Chlamydia)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Psudomonas)、念珠菌属(Candida)、阿托波氏菌属(Atopobium)、加德纳菌属(Gardnerella)和马拉色菌属(Pityrosporum)。

24.如权利要求22所述的用途，其中所述细菌包括大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、伤寒沙门氏菌、阴道阿托波氏菌、阴道加德纳耐药菌或其组合。

25.如权利要求22所述的用途，其中所述真菌包括白色念珠菌、糠秕马拉色菌或其组合。

26.如权利要求22所述的用途，其中所述寄生虫为滴虫。

27.如权利要求21所述的用途，其中所述与病原体相关的疾病或病症选自由以下组成的组：女性生殖道感染和生殖道菌群紊乱。

28.如权利要求21所述的用途，其中所述与病原体相关的疾病或病症为马拉色菌感染相关皮肤疾病。

29.如权利要求1-4中任一项所述的菌株、如权利要求9或10所述的衍生物、如权利要求11所述的培养基或如权利要求12-19中任一项所述的组合物在制备用于预防和/或治疗与免疫调节相关的疾病或病症的药物中的用途。

30.如权利要求29所述的用途，其中所述与免疫调节相关的疾病或病症是癌症、过敏性疾病或自身免疫性疾病。

31.如权利要求30所述的用途，其中所述癌症选自由以下组成的组：前列腺癌、胃-食道癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、乳腺癌、支气管癌、骨癌、肝脏和胆管癌症、卵巢癌、睾丸癌、肾癌、膀胱癌、头颈癌、脊柱癌、脑癌、宫颈癌、子宫癌、子宫内膜癌、结肠癌、结肠直肠癌、直肠癌、肛门癌、胃肠癌、皮肤癌、垂体癌、胃癌、阴道癌、甲状腺癌、神经胶母细胞瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤、骨髓发育不良综合症、肉瘤、畸胎瘤、神经胶质瘤、腺癌、白血病、淋巴瘤和骨髓瘤。

32.如权利要求30所述的用途，其中所述过敏性疾病选自由以下组成的组：过敏性鼻炎、过敏性哮喘、特应性皮炎、过敏性角膜结膜炎、荨麻疹、食物过敏、药物过敏、尘螨过敏和花粉过敏。

33.如权利要求30所述的用途，其中所述自身免疫性疾病选自由以下组成的组：类风湿性关节炎、风湿热、狼疮、系统性硬皮病、特应性皮炎、银屑病、银屑病关节炎、哮喘、吉兰-巴雷综合征、重症肌无力、皮肌炎、多肌炎、多发性硬化、自身免疫性脑脊髓炎、结节性多动脉炎、桥本甲状腺炎、颞动脉炎、青少年糖尿病、斑秃、天疱疮、口疮性口炎、自身免疫性溶血性贫血、韦氏肉芽肿病、舍格伦综合征、艾迪生病、克罗恩病、白塞病、水肿、结膜炎、牙周炎、鼻炎、中耳炎、慢性鼻窦炎、咽喉炎、扁桃体炎、支气管炎、肺炎、胃溃疡、胃炎、结肠炎、痛风、湿疹、痤疮、接触性皮炎、脂溢性皮炎、强直性脊柱炎、纤维肌痛、骨关节炎、肩周关节炎、腱炎、腱鞘炎肌炎、肝炎、膀胱炎、肾炎、脓毒症、血管炎和滑囊炎。

34.如权利要求1-4中任一项所述的菌株、如权利要求9或10所述的衍生物、如权利要求11所述的培养基或如权利要求12-19中任一项所述的组合物在制备用于预防和/或治疗与骨质疏松相关的疾病或病症的药物中的用途。

35.如权利要求34所述的用途，其中所述与骨质疏松相关的疾病或病症选自由以下组成的组：青少年骨质疏松症、绝经期骨质疏松症、绝经后骨质疏松症、创伤后骨质疏松症，和由于年老、皮质激素治疗和不活动引发的骨质疏松症。

36.如权利要求1-4中任一项所述的菌株、如权利要求9或10所述的衍生物、如权利要求11所述的培养基或如权利要求12-19中任一项所述的组合物在制备用于预防和/或治疗与缺铁性贫血、更年期综合征或神经中枢系统疾病相关的疾病或病症的药物中的用途。

Images