TWI643626B - 作為益生菌之乳桿菌屬菌株 - Google Patents
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Abstract
提供新菌株戊糖乳桿菌CECT 7504(即BCRC 910650)。所述菌株呈現以下作為關鍵優點:在陰道液中發現之抗微生物因子下高度存活,所述因子在念珠菌病患者子集中時常增加且可對許多益生菌非常有害;能夠抑制白色念珠菌及光滑念珠菌,因此顯示更廣泛活性以幫助處理念珠菌屬感染,諸如外陰陰道念珠菌病;針對通常用以處理念珠菌屬感染之高濃度抗黴菌劑能夠存活,因此允許其共同投與;及酸化陰道液之能力提高,因此顯示幫助處理細菌性陰道炎之高潛能。因此,菌株及包括其之產品適用於預防及/或治療念珠菌病(口腔、腸及陰道)及細菌性陰道炎。
Description
本發明是關於醫學、微生物學及食品技術之領域,且特定言之,是關於待用作益於人類健康之益生菌的新穎戊糖乳桿菌(Lactobacillus pentosus)菌株。
益生菌微生物之概念出自於諾貝爾獎艾利梅契尼柯夫(Nobel Prize Elie Metchnikoff)之假設,其提出能夠產生醱酵之細菌(乳桿菌屬(Lactobacillus))的食用對結腸微生物群具有積極作用,減少細菌毒素之存在及減少對人類健康具有負面影響之其他微生物活性。
「益生菌為活微生物,在其投與之後,帶給消費者多於基本天然營養物質之益處」。時下,存在許多關於益生菌治療若干胃腸健康病症之適用性的參考文獻,以及提出其活化免疫系統且預防過敏症之效用的研究。
益生菌必須滿足若干與無毒性、存活力、黏附及有益作用相關之需求。各菌株之特性為獨特的且不能推廣至其他同菌種菌株(阿拉亞等人,食品中益生菌評估指南-FAO/WHO聯合工作組.FAO/WHO.編輯2002.聯合國糧食農業組織及世界衛生組織:加拿大安大略省(Araya,M.,et al.Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food-Joint
FAO/WHO Working Group.FAO/WHO.Editor 2002.Food and Agriculture Organization of the United Nations and World Health Organization:Ontario,Canada))。因此,重要的是尋找在所有益生菌需求中具有較佳效能之菌株。
雖然益生菌概念與腸微生物菌叢相關聯,但早在1988進行之研究即已展示此概念亦可擴展至女性陰道菌叢。幾個科研團隊已研發此觀點數年,其鑑別出一些可用於治療陰道健康併發症之乳桿菌菌株(安卡姆等人,比較益生菌乳桿菌屬GR-1及RC-14與甲硝噠唑陰道凝膠劑治療有症狀之細菌性陰道炎的臨床研究.微生物與感染.2006,第8卷,第12-13期,第2772-2776頁(Anukam,K.C.,et al.Clinical study comparing probiotic Lactobacillus GR-1 and RC-14 with metronidazole vaginal gel to treat symptomatic bacterial vaginosis.Microbes and Infection.2006,Vol.8,Nos.12-13,pages 2772-2776);拉爾森等人,作為投與細菌性陰道炎患者之克林達黴素補充之人類乳桿菌屬降低復發率;6個月、雙盲、隨機化、安慰劑對照之研究.BMC女性健康.2008,第8卷,第1期,第3頁(Larsson,P.G.,et al.Human lactobacilli as supplementation of clindamycin to patients with bacterial vaginosis reduce the recurrence rate;a 6-month,double-blind,randomized,placebo-controlled study.BMC Women's Health.2008,Vol.8,No.1,page 3)),因此證明用於陰道健康之益生菌概念。
出現陰道分泌物及發癢為婦科就診之最常見原
因。此可由過敏性反應、接觸刺激劑(纖維布、肥皂、噴霧劑等)引起,或在很多情況下由感染引起。
健康陰道菌叢大部分由乳桿菌屬構成,其維持陰道之天然酸性pH值(3.9與4.3之間),防止陰道經其他微生物移殖。當此天然菌叢例如因全身性抗生素治療而減弱時,更有可能經病原性菌種感染。最常見的健康陰道菌叢併發症為外陰陰道念珠菌病及細菌性陰道炎。
念珠菌屬(Candida)為一種極為普遍之酵母,其可少數見於陰道菌叢中,無任何疾病症狀。當陰道菌叢平衡打亂且與保護性乳桿菌屬之量相比,念珠菌屬群體增加時,出現症狀。念珠菌屬感染之典型症狀包含陰道發癢及灼燒,以及性交困難及陰道痙攣。大約75%外陰陰道念珠菌病病例由白色念珠菌(Candida albicans)引起,且另外15%由光滑念珠菌(Candida glabrata)引起(黎克特等人,引起外陰陰道炎之念珠菌屬菌種的抗真菌敏感性及復發病例之流行病學.臨床微生物學雜誌2005,第43卷,第5期,第2155-2162頁(Richter,S.S.,et al.Antifungal Susceptibilities of Candida Species Causing Vulvovaginitis and Epidemiology of Recurrent Cases.J.Clin.Microbiol.2005,Vol.43,No.5,pages 2155-2162))。據估計75%女性在其壽命過程中經歷至少一次發作。此外,25%病例每年復發四次或超過四次。
在用針對不同治療目標開處方之抗生素療法治療後時常發生感染。此在服用含有雌激素之口服避孕藥之女性、孕婦及患糖尿病之女性中亦為常見的。念珠菌屬感染用抗
黴菌劑治療,諸如三唑藥物(例如氟康唑(fluconazole)、克黴唑(clotrimazole)、咪康唑(myconazole)、伊曲康唑(itraconazole))或制黴菌素(nystatin)。然而,值得注意地,光滑念珠菌菌株傾向於對此類治療顯示高的抗性,而在臨床中分離之多達20%白色念珠菌菌株對氟康唑(最典型治療之一)呈現抗性,尋找用於處理外陰陰道念珠菌病之新治療工具極為重要。
除其酸性pH值外,陰道液含有若干抗微生物蛋白質,諸如溶菌酶、防衛素及乳鐵傳遞蛋白。在外陰陰道念珠菌病期間,大約25%女性中這些物質之濃度增加超出正常水準(瓦洛爾等人,細菌性陰道炎中抗微生物多肽之可逆缺乏.傳染與免疫2006,第74卷,第10期,第5693-5702頁(Valore,E.V.,et al.Reversible Deficiency of Antimicrobial Polypeptides in Bacterial Vaginosis.Infect.Immun.2006,Vol.74,No.10,pages 5693-5702))。此反應通常不足以抵擋酵母,諸如念珠菌屬,因為這些物質之作用比抗黴菌更抑菌或殺菌。然而,因為健康陰道菌叢大部分由乳桿菌屬細菌構成,所以抗微生物蛋白質之此異常增加可使得陰道健康菌叢恢復進一步延遲。此外,當尋找適於用作益生菌之乳桿菌屬時,此使得極為需要考慮對這些抗微生物因子之抗性。
細菌性陰道炎由陰道菌叢中通常不存在或極少量存在之細菌性菌種過度生長引起。最常見菌種為陰道加德納氏菌(Gardnerella vaginalis)及陰道阿托波氏菌(Atopobium vaginale),但迄今尚未發現準確發病原因。5名女性中約1名
女性將以6至12個月之間隔出現細菌性陰道炎。雖然細菌性陰道炎可引起異常陰道排出物及魚腥味,但大部分病例無症狀。細菌性陰道炎之一典型特性為因乳桿菌屬消失而使pH值升高超過4.5,此進一步促進其他細菌性菌種生長。
細菌性陰道炎用諸如甲硝噠唑(metronidazole)及克林黴素(clindamicyn)之抗生素治療。然而,細菌性陰道炎顯示高復發率,在第一個月期間高達35%且在第一年期間高達70%。亦已觀測到陰道炎之抗生素治療可引起作為繼發性感染之外陰陰道念珠菌病,因為抗生素、尤其克林黴素亦影響乳桿菌屬。
其亦已展示患有細菌性陰道炎之女性傾向於生育早產嬰兒或低重量(小於2.5kg)之嬰兒。有時感染可擴散至輸卵管。此類型感染稱作盆腔炎(PID)且可引起不孕症且損害輸卵管,從而增加子宮外孕風險。細菌性陰道炎亦增加泌尿道感染及性傳播疾病之風險。
目前市場上存在若干益生菌菌株來幫助處理外陰陰道念珠菌病,諸如鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)GR1、醱酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)RC14、胚芽乳桿菌(Lactobacillus plantarum)P17630及嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)NAS。然而,尚未對其中一者測試其承受住在4個感染病例中約1個病例中出現之升高濃度之抗微生物因子的能力。加之,僅存在一種益生菌溶液(博恩福洛英姆®(BION Flore Intime®),由菌株鼠李糖乳桿菌GR1及羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)RC14構成)用於處理
外陰陰道念珠菌病,其功效主張由隨機化的安慰劑對照之臨床試驗(馬丁尼茲等人,使用氟康唑加上益生菌鼠李糖乳桿菌GR-1及羅伊氏乳桿菌RC-14對外陰陰道念珠菌病之改善之治療.應用微生物學通訊.2009,第48卷,第3期,第269-274頁(Martinez,R.C.R.,et al.Improved treatment of vulvovaginal candidiasis with fluconazole plus probiotic Lactobacillus rhamnosus GR-1 and Lactobacillus reuteri RC-14.Letters in Applied Microbiology.2009,Vol.48,No.3,pages 269-274))支持。
另一方面,存在兩種益生菌產品用於處理細菌性陰道炎,其健康主張由隨機化的安慰劑對照之臨床試驗支持:博恩福洛英姆®-鼠李糖乳桿菌GR1及醱酵乳桿菌RC14;及伊柯維格®(EcoVag®)-加氏乳桿菌(Lactobacillus gasseri)DSM 14869及鼠李糖乳桿菌DSM 14870(安卡姆等人,2006,上述(Anukam,K.C.,et al.2006,supra);拉爾森等人,2008,上述(Larsson,P.G.,et al.2008,supra))。
此項技術描述其他菌株作為有潛力的陰道益生菌,諸如EP 1436380 B1,其描述菌株戊糖乳桿菌NCIMB 41114,所述菌株自獲自健康成人個體且在四環素(tetracycline)存在下培養之糞便培養物分離。所述文獻描述由於其能夠抑制念珠菌屬菌種生長且菌株對四環素及相關抗生素具有抗性,所以其可用於對抗身體任何區域中不欲之念珠菌屬生長,尤其大腸急躁症中。此文獻未提及所述菌株針對光滑念珠菌之抑制活性,亦未證明所述菌株黏附於陰道上皮細胞且在陰道環境中存活或抵抗其中存在之抗微生物物質
(諸如溶菌酶)的能力。
歐可斯(Okkers,D.J.)等人1999年描述自產前患者之陰道之陰道後穹窿分泌物分離的菌株戊糖乳桿菌TV35b產生細菌素樣肽(戊糖乳桿菌素(pentocin)TV35b),其對白色念珠菌及一些細菌性菌種為抑制性的。所述文獻未提及菌株針對光滑念珠菌之抑制活性(歐可斯等人,對白色念珠菌具有抑真菌作用之戊糖乳桿菌素TV35b(自戊糖乳桿菌分離之細菌素樣肽)之表徵,應用微生物學雜誌.1999,第87卷,第5期,第726-734頁(Okkers,D.J.et al.Characterization of pentocin TV35b,a bacteriocin-like peptide isolated from Lactobacillus pentosus with a fungistatic effect on Candida albicans,Journal of Applied Microbiology.1999,Vol.87,No.5,pages 726-734))。
另一方面,此項技術描述未呈現針對白色念珠菌之抑制活性之陰道菌株。舉例而言,在迪米托瓦(Dimitonova)等人2007中,評估自健康保加利亞女性之陰道拭子分離的20個乳桿菌屬菌株之抑制活性。20個菌株中無一者抑制白色念珠菌生長(迪米托瓦等人,來自健康保加利亞女性之陰道乳桿菌屬之抗菌活性及保護特性.厭氧菌.2007,第13卷,第5-6期,第178-184頁(Dimitonova,S.P.et al.Antimicrobial activity and protective properties of vaginal lactobacilli from healthy Bulgarian women.Anaerobe.2007,Vol.13,No.5-6,pages 178-184))。
此項技術亦教示呈現針對白色念珠菌之抑制活性不意謂所述菌株亦拮抗光滑念珠菌。舉例而言,在帕斯卡
(Pascual L.M.)等人2008中,鑑別出自未懷孕、健康的絕經前女性之陰道分離的乳桿菌屬菌株為鼠李糖乳桿菌L60。鼠李糖乳桿菌L60顯示廣泛的針對泌尿生殖病原體之抗微生物活性,及對通常為由這些病原體引起之感染開出之抗生素的抗性。此菌株拮抗10個白色念珠菌菌株,但不拮抗3個測試之光滑念珠菌菌株(帕斯卡等人,鼠李糖乳桿菌L60,一種自人類陰道分離之有潛力的益生菌.普通與應用微生物學雜誌.2008,第54卷,第3期,第141-148頁(Pascual,L.M.et al.Lactobacillus rhamnosus L60,a potential probiotic isolated from the human vagina.Journal of General and Applied Microbiology.2008,Vol.54,No.3,pages 141-148))。
因此,用作有潛力的陰道益生菌之所述乳桿菌屬自陰道分離不意謂其對念珠菌屬菌種呈現抑制活性。此外,乳桿菌屬菌株拮抗白色念珠菌不意謂其亦對其他念珠菌屬菌種(諸如光滑念珠菌)具有活性。因此,拮抗念珠菌屬菌種不為乳桿菌屬之固有特徵。
WO 2012/101500 A1描述一種呈固體形式之起泡組合物,其用於陰道應用以治療陰道感染。起泡組合物尤其包括蓋倫組分,用於減少及/或消除陰道環境中病原體存在之一種益生菌菌株。所述菌株選自來自乳桿菌屬及雙岐桿菌屬(Bifidobacterium)的用作益生菌之最常見菌種的長清單。所述文獻不包含評估菌株特性之測試。本發明集中於蓋侖組合物,其設計成增強益生菌在其製造期間之存活及改善投藥。文獻中提及之菌株可購得且所提及之病原體在陰道病狀中常見。
JP 2008013502 A描述藉由使用諸如戊糖乳桿菌之乳酸菌的十字花科植物(諸如椰菜)之醱酵製程獲得的產物之用途,其用於治療或預防念珠菌屬感染,如陰道炎。測試用白色念珠菌之寄存菌株進行。所述文獻未提及醱酵產物針對光滑念珠菌之抑制活性。
另一方面,如上所說明,在大約25%經歷外陰陰道念珠菌病之女性中陰道液中抗細菌物質增加超出正常水準。這些物質對乳桿菌屬具有顯著抑制作用。目前幾種乳桿菌屬用作陰道益生菌;然而,尚未對其中一者測試在陰道液中抗微生物因子增加之條件下存活的能力。此外,尚未對當前陰道益生菌中一者測試其特別針對光滑念珠菌之活性。光滑念珠菌占念珠菌屬感染極大部分,且顯示對當前抗黴菌治療之更高抗性,因此呈現更大的治療挑戰。
本發明者提供一種新的戊糖乳桿菌菌株,作為自健康人類分離之不同乳桿菌屬菌株之廣泛研究的結果,其適合作為用於處理陰道感染之益生菌。菌株I1001自生活在不良衛生條件下之健康年輕女性之陰道菌叢分離。戊糖乳桿菌之菌株由寄存者位於貝亞特拉08193 UAB校園辦公室P1M1.1之埃迪瑞卡(Edifici Eureka,office P1M1.1,Campus UAB,08193-Bellaterra)(西班牙(Spain))的艾比生物技術有限公司(AB-Biotics,S.A.)於2009年3月6日寄存於西班牙菌種保存中心(Spanish Type Culture Collection)(Colección Española de Cultivos Tipo,CECT,Edificio 3 CUE,Parc Científic,Universitat de València,Catedrático Agustín
Escardino,9,46980-Paterna,Valencia,Spain)。在國際寄存權威機構(International Authority of Deposit)宣佈菌株為有活力之後,戊糖乳桿菌菌株接收寄存編號CECT 7504;並於2014年9月26日寄存於食品工業發展研究所,寄存編號為BCRC 910650。
寄存者艾比生物技術有限公司授權申請人吉納亞實驗室有限公司(GYNEA Laboratorios S.L.)在具有代表性參考號P2723EP00之歐洲專利申請案中或在來源於其或主張其優先權之任何隨後專利申請案中提及以上提及之寄存生物材料,且自以上提及之專利申請案申請日起根據法規33 EPC,無限制且不可撤銷地同意寄存材料公開可得。
在100個分離乳桿菌屬菌株中,由於以下區分特性,選擇菌株CECT 7504(即為寄存於食品工業發展研究所,寄存編號為BCRC 910650之菌株,以下亦同):
‧在陰道液中發現之抗微生物因子、尤其溶菌酶下高度存活。如上所說明,這些因子在念珠菌病患者子集(大約25%病例)中時常增加,且可對許多益生菌非常有害。如實例部分中所指示,僅一小部分陰道來源之乳桿菌屬在外陰陰道念珠菌病患者而非健康患者中可見之增加濃度之溶菌酶下可存活(參見以下實例3,其中測試10個乳桿菌屬菌株)。此意謂對這些蛋白質之抗性不為乳桿菌屬之固有特徵。此外,咸信無先前技術描述能夠在其中在陰道液中天然抗微生物因子濃度增加之條件下存活的陰道益生菌。因此,已知之益生菌對此子集患者無效。意外地,菌株CECT 7504展示對這些條件之顯著抗性,因此尤其指示針對此患者子集。特定言之,菌株CECT
7504展示對高達16毫克/公升之溶菌酶濃度的高度抗性(參見圖2)。溶菌酶為在陰道液中發現之除有機酸外的最高濃度之抗微生物因子,且為活性最針對革蘭氏陽性生物體(Gram-positive organism),諸如乳桿菌屬之因子。另一方面,商業菌株胚芽乳桿菌P17630(伊斯丁(ISADIN))在暴露於超過4毫克/公升之溶菌酶濃度(諸如在一些外陰陰道念珠菌病患者中可發現之溶菌酶濃度)時展示存活力明顯下降(90%)。
‧能夠抑制白色念珠菌與光滑念珠菌之生長,因此顯示廣泛範圍的幫助處理念珠菌屬感染(諸如外陰陰道念珠菌病)之活性。如背景技術及實例部分中所指示,一些陰道來源之乳桿菌屬針對一或兩個念珠菌屬分離株顯示顯著的拮抗活性,但僅一小部分針對一組若干白色念珠菌與光滑念珠菌菌種分離株顯示顯著的活性(參見實例4)。因此,如上所提及,抑制念珠菌屬分離株之能力並非乳桿菌屬之固有特徵。意外地,菌株CECT 7504在與商業益生菌菌株胚芽乳桿菌P17630相比時針對所測試之白色念珠菌之三個菌株展示較高的活性,且亦展示針對光滑念珠菌之一個菌株之高活性及針對不同光滑念珠菌菌株之一定活性,而胚芽乳桿菌P17630及其他野生型菌株展示針對前一菌株低活性及針對後一光滑念珠菌菌株無活性(表3)。
‧能夠針對通常用以處理念珠菌屬感染之高濃度抗黴菌劑存活,因此允許本發明之菌株與所述抗黴菌劑共同投與。
‧與其他分離株及商業對照株比,酸化陰道液之能力提高,因此顯示幫助處理細菌性陰道炎之高潛能。酸化陰道液之能力時常由酸化典型實驗室培養基或牛乳之能力推斷得出。然而,
陰道液之組成(低濃度養分)與富含養分之實驗室培養基或牛乳之組成非常不同。作為替代,已在模擬真實陰道液組成之培養基中測試本發明之菌株。
‧能夠強力黏附陰道上皮細胞。
‧在工業培養基中良好生長。
‧當在陰道刺激之動物模型中測試時耐受性良好。
‧當在人類自願者中測試時耐受性及移殖能力良好。
概言之,咸信無先前技術描述具有以上提及之特徵的乳桿菌屬菌株及尤其戊糖乳桿菌菌株。此項技術描述尤其在所述特徵之一上優良之其他乳桿菌屬菌株,但值得注意地,戊糖乳桿菌菌株CECT 7504同時擁有所有這些品質。除了擁有用於處理陰道炎之以上提及之關鍵特徵,本發明之菌株亦呈現優良的與無毒性、存活力、黏附及有益作用相關之益生菌特徵。以下實例提供(舉例而言)測定益生菌特徵每一者之方案且其亦證明菌株CECT 7504具有優良的益生菌特徵。
因此,在第一態樣中,本發明提供一種組合物,其包括有效量之戊糖乳桿菌CECT 7504。如本文所用之術語「有效量」意謂足夠高以傳遞所需益處,但足夠低以避免在醫學判斷範疇內之嚴重副作用的藥劑量。
多種乳酸細菌性菌種具有明顯使用安全之悠久歷史。歐洲食品安全局(European Food Safety Authority)已發展一種系統,將「安全資格認定(Qualified Presumption of Safety,QPS)」資格授與經證明具有明顯使用安全悠久歷史的分類單位。菌株CECT 7504屬於具有QPS資格之細菌性菌種(安德列特等人,有意添加至食品或飼料中的QPS微生物清
單之主張.問題號:EFSA-Q-2008-006;EFSA雜誌.2008,第923卷,第1-48頁(Andreoletti,O.,et al.The maintenance of the list of QPS microorganisms intentionally added to food or feed.Question no:EFSA-Q-2008-006;The EFSA Journal.2008,Vol.923,pages 1-48))。
細菌中對抗微生物劑之抗性的出現及擴展對人類及動物健康造成威脅,且代表一種主要的財政及社會費用。當對抗微生物劑之抗性為細菌性菌種所固有時,一般稱為『固有抗性』(有時稱為『自然抗性』)。假定固有抗性對水平擴展呈現最小潛能,而認為藉由添加基因介導之獲得抗性對橫向擴展具有高潛能。本發明之發明者已發現,根據歐洲食品安全局之指南,形成本發明組合物之菌株未顯示對人類及/或在獸醫學上重要之抗生素(安比西林(ampicillin)、慶大黴素(gentamicin)、鏈黴素(streptomycin)、紅黴素(erythromycin)、四環素、克林達黴素(clindamycin)及氯黴素(chloramphenicol))的任何顯著的抗性(博瑞斯等人,關於用於評估對在人類或獸醫學上重要之抗生素之細菌抗性的準則之更新.EFSA雜誌.2008,第732卷,第1-15頁(Bories,G.et al.Update on the criteria used in the assessment of bacterial resistance to antibiotics of human or veterinary importance.The EFSA Journal.2008,Vol.732,pages 1-15)),因此排除抗生素抗性可能轉移至病原性菌種之風險。
在另一個態樣中,本發明提供一種包括有效量之本發明菌株的組合物,其用作醫藥產品、藥劑、食品、可食用產品、食品增補劑、醫學食品或個人衛生產品。
如上所述,菌株CECT 7504顯示針對念珠菌屬菌種之顯著活性。因此,在第三態樣中,本發明提供如上定義之組合物,其用於預防及/或治療念珠菌病。或者,此態樣可闡述為如本發明之第一態樣中定義之組合物的用途,其用於製造供預防及/或治療念珠菌病之醫藥產品、藥劑、食品、可食用產品、食品增補劑、醫學食品或個人衛生產品。或者,此亦可闡述為用於預防及/或治療人類之念珠菌病的方法,其包括向有需要之所述人類投與有效量之如本發明之第一態樣中定義之組合物。
本發明之組合物尤其適用於預防性治療容易患念珠菌病之個體以及治療性處理感染念珠菌屬微生物之個體。特定言之,本發明之組合物可投與嬰兒、兒童及AIDS患者以預防或治療鵝口瘡(口腔念珠菌病)或念珠菌屬尿布疹。此外,AIDS患者將受益於本文揭露之組合物,因為獲得念珠菌屬感染之可能性將降低,且若獲得,則在經口攝取時,將經歷更少的念珠菌屬移位。組合物亦適用於預防危及孕婦之胎兒之感染、早產及泌尿道感染。
假定菌株CECT 7504之抗念珠菌屬活性,連同其黏附上皮細胞及承受住在陰道液中發現之抗微生物因子的能力,在一特定實施例中,本發明之組合物尤其適用於預防及/或治療陰道念珠菌病。在一更特定實施例中,念珠菌病由光滑念珠菌引起。如上所說明,本發明之菌株尤其適用於預防及/或治療具有高度發炎反應之陰道念珠菌病。
在本說明書中術語「高度發炎反應」應理解為在外陰陰道念珠菌病期間觀測到的陰道液中所含之抗微生物蛋
白質(諸如溶菌酶、防衛素及乳鐵傳遞蛋白)之濃度增加(瓦洛爾等人,上述(Valore,E.V.,et al.supra))。溶菌酶為在陰道液中濃度較高之抗細菌物質之一。在健康女性及患有細菌性陰道炎之女性中其濃度在1毫克/公升與4毫克/公升之間變化,但在經歷外陰陰道念珠菌病之女性中可達到16毫克/公升或超過16毫克/公升。因此,根據本說明書之「高度發炎反應」之定義可基於溶菌酶之含量制定。難以建立可用於判定存在「高度發炎反應」之溶菌酶含量,因為此項技術未描述其。在本說明書中,可認為當溶菌酶濃度等於或超過4毫克/公升時存在「高度發炎反應」。
念珠菌屬感染亦可發生在陰道外之其他上皮細胞中,諸如腸上皮細胞或口腔上皮細胞。因此,菌株CECT 7504之抗念珠菌屬活性及其黏附上皮細胞之能力可用於治療及/或預防腸或口腔中之念珠菌屬感染。因此,在另一態樣中,本發明提供如上定義之組合物,其用於預防及/或治療口腔念珠菌病及/或腸念珠菌病。或者,此態樣可闡述為如本發明之第一態樣中定義之組合物的用途,其用於製造供預防及/或治療口腔及/或腸念珠菌病之醫藥產品、藥劑、食品、可食用產品、食品增補劑、醫學食品或個人衛生產品。或者,此亦可闡述為用於預防及/或治療人類之口腔及/或腸念珠菌病的方法,其包括向有需要之所述人類投與有效量之如本發明之第一態樣中定義之組合物。
最終,如上所述,菌株CECT 7504顯示高的酸化陰道培養基之能力。因此,在另一態樣中,本發明提供如本發明之第一態樣中定義之組合物,其用於預防及/或治療細菌性
陰道炎。或者,此態樣可闡述為如本發明之第一態樣中定義之組合物的用途,其用於製造供預防及/或治療細菌性陰道炎之醫藥產品、藥劑、食品、可食用產品、食品增補劑、醫學食品或個人衛生產品。或者,此亦可闡述為用於預防及/或治療人類之細菌性陰道炎的方法,其包括向有需要之所述人類投與有效量之如本發明之第一態樣中定義之組合物。
本發明之組合物可呈任何不負面影響形成本發明組合物之菌株之存活力的適合形式製備。鑒於組合物之特定目的,賦形劑及最適當調配方法之選擇在一般熟習製藥技術者之能力範疇內。組合物可經口、經陰道或經直腸投與,或使用不同投藥形式同時(例如經口與經陰道)投與。
在此意義上,本發明之組合物呈固體或液體形式,且可尤其呈散劑、錠劑或口含錠、吸吮錠劑、膜製劑、溶液、氣溶膠、顆粒、丸劑、懸浮液、乳液、膠囊、腸溶包衣錠劑及膠囊、糖漿、液體、酏劑、糖果、口嚼錠、栓劑、微型灌腸劑、陰道錠劑、陰道明膠膠囊、乳膏、凝膠、軟膏、洗劑、棉塞、月經帶、襯墊、熔融帶、避孕套、子宮托、噴霧劑、酊劑或流浸膏劑之形式。
根據本發明之組合物可調配成一種形式,其中本發明之菌株為唯一活性劑或與一或多種其他活性劑混合及/或在食品或可食用產品的情況下與醫藥學上可接受之賦形劑或足夠添加劑或成分混合。在本發明之一個特定實施例中,組合物另外含有一或多種其他活性劑。較佳地,另一或其他活性劑為不對形成本發明組合物之菌株拮抗之其他益生菌。由於本發明菌株能夠在高濃度之通常用以處理念珠菌屬感染之抗黴
菌劑下存活,所以在一個特定實施例中,本發明之組合物可與三唑抗黴菌藥物或制黴菌素組合投與以預防及/或治療念珠菌病。其相容性已在以下實例中予以證明。視調配物而定,菌株可呈純化之細菌、呈細菌培養物、呈細菌培養物之部分、呈已進行後處理之細菌培養物添加,且可單獨或連同適合的載劑或成分一起添加。亦可添加益菌助生質。
術語「醫藥產品」在本說明書中以其廣泛含義來理解,包含包括活性成分,在此情況下較佳呈組合物形式之本發明菌株,連同醫藥學上可接受之賦形劑一起的任何組合物。術語「醫藥產品」不侷限於藥劑。如本文所用,術語「醫藥學上可接受」是指在合理醫學判斷範疇內,適於與個體(例如人類)之組織接觸使用而無過度毒性、刺激、過敏反應或其他問題或併發症,與合理益處/風險比率相當的化合物、物質、組合物及/或劑型。各載劑、賦形劑等在與調配物的其他成分相容的意義上亦必須為「可接受的」。適合的載劑、賦形劑等可見於標準醫藥教科書中。
醫藥產品可採用不同的形式或名稱,視產品批准途徑而定以及視國家而定。舉例而言,藥劑為特定醫藥產品。醫學食品為另一特定醫藥產品。術語「醫學食品」或「用於特殊醫學目的之食品」在一些國家用以指特別調配之食品且意欲用於具有無法為單獨正常膳食滿足之特殊營養需求之疾病的飲食管理。其在諸如美國食品與藥物管理局之1988年孤兒藥物法修正案(Food and Drug Administration's 1988 Orphan Drug Act Amendments in the United States,)及歐盟指令1999/21/EC(Commission Directive 1999/21/EC in Europe)的
法規中予以定義。醫學食品不同於更寬類別之食品增補劑及具有健康宣稱之傳統食品。因此,在一個特定實施例中,本發明之組合物為醫學食品。
時常,認為諸如本文揭露之組合物的益生菌細菌性組合物為食品增補劑。認為亦稱為飲食增補劑或營養增補劑之食品增補劑為另一特定醫藥產品。此為意欲補充飲食且提供在正常飲食中通常未攝取到或無法以足夠量消耗之養分或有益成分的製劑。食品增補劑大多被認為是食品,但有時其定義為藥物、天然保健品或保健食品產品。在本發明意義上,食品增補劑亦包含保健食品。食品增補劑通常「在櫃檯上(over the counter)」,亦即非處方出售。若食品增補劑採用丸劑或膠囊形式,則其包括與藥劑中所用相同之賦形劑。然而,食品增補劑亦可採用用一些養分(例如棒條或酸酪乳)強化之食品形式。
因此,在一個特定實施例中,本發明之組合物為食品增補劑。
若根據本發明之組合物為食品增補劑,則其可原樣投與,可與適合的可飲用液體,諸如水、酸酪乳、牛乳或果汁混合,或可與固體或液體食品混合。在此上下文中,食品增補劑可呈錠劑或口含錠、丸劑、膠囊、顆粒、散劑、懸浮液、藥囊、糖果、棒條、糖漿之形式及相對應投藥形式、通常呈單位劑量形式。較佳地,包括本發明組合物之食品增補劑呈在製備飲食增補劑之習知方法中製造之錠劑、口含錠、膠囊或散劑形式投與。
本發明之菌株亦可包含在多種食品或可食用產
品內,諸如乳製品(酸酪乳、乾酪、醱酵乳、乳粉、基於牛乳之醱酵產品、冰淇淋、基於醱酵穀物之產品、基於牛乳之散劑)、麵包、棒條、塗抹食品、餅乾及穀物、飲料或調味品。術語「可食用產品」在本文中以其最廣泛含義使用,包含任何類型產品、呈任何呈現形式,其可由動物攝取,亦即器官感覺上可接受之產品。術語「食品」應理解為可食用產品,其亦提供身體之營養支持。其他食品之實例為肉製品(例如香腸或肉醬)、巧克力醬、填充物及糖霜、巧克力、蜜餞、烘烤商品(蛋糕、糕點)、調味汁及湯、果汁及咖啡奶精。尤其關注之食品為食品增補劑及嬰兒配方食品。食品較佳包括載劑物質,諸如燕麥粉粥、乳酸醱酵食品、抗性澱粉、食用纖維、碳水化合物、蛋白質及糖基化蛋白質。在一特定實施例中,本發明之菌株經囊封或塗佈。
因此,在一特定實施例中,本發明之組合物為食品或可食用產品。
一些以上提及之形式在一些國家中視為醫學裝置;例如陰道膠囊、棉塞或其他類型塗藥器。因此,在一特定實施例中,本發明之組合物為醫學裝置。
在另一特定實施例中,本發明之組合物為個人衛生產品,其可在超級市場中或在藥店中「在櫃檯上」出售。個人衛生產品之實例為棉塞、衛生棉、衛生墊、尿布、肥皂、洗髮精、凝膠、軟膏、乳膏、噴霧劑及洗劑。
特定言之,本發明之組合物呈可分解之黏膜黏附的陰道內錠劑形式,其使用塗藥器裝置陰道內塗覆。700毫克錠劑特定包括羥丙基甲基纖維素、無水乳糖及檸檬酸以及100
毫克(1-2x109菌落形成單位)之菌株CECT 7504(參見實例8)。
因此,必須瞭解本發明之組合物適用於處理念珠菌病及細菌性陰道炎,無論組合物形式如何;亦即無論為醫藥產品、藥劑、食品、可食用產品、食品增補劑、醫學食品還是個人衛生產品。
本發明之菌株藉由在適合培養基中及適合條件下培養細菌來產生。菌株可單獨培養,形成純培養物,或呈連同其他微生物一起之混合培養物,或藉由分別培養不同類型細菌,接著按所需比例將其組合。培養後,回收細胞懸浮液且原樣使用,或例如藉由濃縮或冷凍乾燥,以所需方式處理,以進一步用於醫藥或可食用產品之製備。有時益生菌製劑經受固定或封裝製程以延長存放期。若干用於固定或封裝細菌之技術為此項技術中已知。
很明顯,藉由使用寄存菌株作為起始物質,熟習此項技術者可通常藉由習知突變誘發或再分離技術,獲得其他突變體或其衍生物,所述突變體或衍生物保持或增強形成本發明組合物之菌株的本文所述之相關特徵及優點。在本發明之第一態樣之一實施例中,突變體藉由使用重組DNA技術獲得。在本發明之第一態樣之另一實施例中,突變體藉由隨機突變誘發獲得。在本發明之第一態樣之第三實施例中,變異體為天然存在之變異體。因此,本發明之另一態樣是關於一種獲得寄存在西斑牙菌種保存中心寄存編號CECT 7504之戊糖乳桿菌菌株之突變體的方法(即為寄存於食品工業發展研究所,寄存編號為BCRC 910650之菌株,以下亦同),其包括使用寄
存菌株作為起始物質且提供突變誘發,其中所得突變體保持或增強抗黴菌及/或抗細菌活性及/或移殖於親本寄存菌株之陰道的能力。
組合物中菌株之菌落形成單位(cfu)有效量將由熟習此項技術者測定且將視最終調配物而定。舉例而言,當經口投與時,本發明之菌株以根據當前法規,給與107菌落形成單位至1012菌落形成單位,較佳109菌落形成單位至1011菌落形成單位之有效日劑量之量,且當經陰道或經直腸投與時,以給與103菌落形成單位至1012菌落形成單位、較佳105菌落形成單位至1010菌落形成單位之有效日劑量之量存在於組合物中。術語「菌落形成單位」(「cfu」)定義為如由瓊脂板上微生物數所揭露的細菌細胞數目。食品增補劑通常含有在107菌落形成單位/公克與1012菌落形成單位/公克範圍內之量的益生菌菌株。在一個特定實施例中,本發明之組合物為包括109菌落形成單位/公克-1011菌落形成單位/公克之間的食品增補劑。
菌株CECT 7504之一般使用呈活細胞形式。然而,其亦可擴展至非活細胞,諸如滅活培養物或細胞溶解產物(藉由例如暴露於改變之pH值、音波處理、輻射、溫度或壓力,尤其殺死或溶解細菌之方式而獲得),或含有藉由菌株CECT 7504產生之有益因子之組合物。
本說明書及申請專利範圍中,單詞「包括」及其變化形式不欲排除其他技術特徵、添加劑、組分或步驟。本發明之其他目標、優點及特徵將為熟習此項技術者在檢查本描述後顯而易見或可藉由實施本發明來學習。此外,本發明覆蓋
本文所述之特定及較佳實施例之所有可能組合。本文提供以下實例及圖式以達成例示性目的且不欲限於本發明。
圖1.以下各物(自左至右)之Sma-I及Sfi-I限制基因組DNA的脈衝場電泳圖譜:戊糖乳桿菌CECT 7504(I1001)、胚芽乳桿菌P17630及DNA分子標記物(M)。
圖2展示乳桿菌屬菌株在補充有溶菌酶(0毫克/公升、4毫克/公升及16毫克/公升最終濃度)之陰道液模擬物中的生長。「Lys」意謂「溶菌酶」。I1001為菌株CECT 7504且P17630為對照菌株胚芽乳桿菌P17630。
圖3展示菌株戊糖乳桿菌CECT 7504(I1001)如何顯示在模擬工業培養基之培養基中與熟知之益生菌鼠李糖乳桿菌GG相當的生長;「t」代表「時間」且菌落形成單位/毫升為活細胞數目。
圖4展示在產品最後投藥後在參與研究之女性自願者之陰道液中發現的菌種戊糖乳桿菌及胚芽乳桿菌的DNA之量。資料描繪平均值及SEM值。時間以最後投藥後之小時數指示;每毫升陰道液之DNA複本數呈對數標度。開圓對應於來自連續5天服用產品之自願者的資料,且閉圓對應於來自連續3天服用產品之自願者的資料。
如本文所用,I1001對應於戊糖乳桿菌CECT 7504。
菌株CECT 7504自來自14-21歲生活在較差衛生條件下之健康年輕女性之陰道拭子分離。樣品溶於pH 7.4 PBS緩衝液中,等分樣品且塗鋪在不同培養基上以在不同條件下培育。培育時間視菌株生長速率而定且通常歷經24小時至3天。個別菌株之分離用相同選擇培養基進行,接著進行革蘭氏染色(Gram staining)及顯微鏡檢查測試以對其進行初始表徵。
菌株最初在補充有100微克/公升新生黴素(novobiocin)(西格馬(Sigma))、5微克/公升制黴菌素、5微克/公升環己醯胺(cyclohexamide)(西格馬)、1毫克/公升安比西林及10微克/公升萬古黴素(vancomycin)的MRS培養基中生長,且在30℃下在缺氧條件及pH 6.4下培育。革蘭氏染色展示清晰的革蘭氏陽性染色以及非孢子形成桿菌形態。
收穫細菌,洗滌且在37℃下再懸浮於預溶解緩衝液(480毫升EDTA 50毫莫耳濃度,pH 8.0;120毫升溶菌酶10毫克/毫升)中,歷時60分鐘。使用威澤德(Wizard)基因組DNA純化套組(普洛麥格(Promega))提取DNA。經預處理之細菌在14000g下離心2分鐘以移除上清液後,根據普洛麥格之方案。簡言之,將細菌再懸浮於核溶解溶液(Nuclei Lysis Solution)中且在80℃下培育5分鐘,接著冷卻至室溫。細胞溶解產物在核糖核酸酶溶液中在37℃下培育60分鐘且藉由添加蛋白質沈澱溶液且高速旋渦使蛋白質沈澱。樣品冷卻且在15000g下離心3分鐘。將含有DNA之上清液轉移至
乾淨1.5毫升微量離心管且與600毫升異丙醇反向混合。藉由在15000g下離心2分鐘且小心傾出上清液來收集DNA。藉由輕輕倒置管若干次,將DNA樣品用600毫升70%乙醇洗滌。在15000g下離心2分鐘後藉由抽吸移除乙醇。最終,藉由在65℃下培育1小時,DNA離心塊再懸浮於100毫升再水合溶液中。將樣品儲存在2-8℃下。
2.1.種屬及菌種鑑別
藉由PCR,使用通用引子Eub27f及Eub1492r擴增16S rRNA,產生幾乎為16S rRNA基因之完整序列(超過1,400個核苷酸)之片段(表1)。接著,使用套組恰曲克(Qiaquick)(凱傑(Qiagen))洗滌DNA。
在遺傳學分析儀3130(應用生物系統(Applied Biosystems))中使用比格迪(BigDye)套組3.1版及表1中所示之引子,針對各樣品,進行四種連續定序反應。使用DNA序列分析5.2版軟體(應用生物系統)收集數據及建立層析譜,且藉由用科麥斯(Chromas)(特科皮有限公司(Technelysium Pty Ltd.))及百伊迪(BioEdit)(伊比斯生物科學(Ibis Biosciences))目視分析來檢查。SEQ ID NO:7為菌株CECT 7504之16S rRNA基因之序列。
使用核糖體資料庫工程(RDP)工具,進行種屬鑑別(王等人,用於將rRNA序列快速分配至新細菌分類之首批貝斯分類器.應用與環境微生物2007,第73卷,第16期,第5261-5267頁(Wang Q.,et al.Naive Bayesian Classifier for Rapid Assignment of rRNA Sequences into the New Bacterial Taxonomy.Appl.Environ.Microbiol.2007,Vol.73,No.16,pages 5261-5267))。在核糖體資料庫工程中,藉由比較由典型菌株之16S rRNA序列得到的序列,進行菌種鑑別(考樂等人,核糖體資料庫工程(RDP-II):引入myRDP空間及品質控制之公共數據.核酸研究2007,第35卷(增刊1),第D169-172頁)。最靠近匹配為戊糖乳桿菌菌株JCM 1558(100%最大相似性評分),其為菌種戊糖乳桿菌之典型菌株。亦使用BLAST,將菌株CECT 7504之16S rRNA序列與NCBI序列資料庫比對,產生與胚芽乳桿菌菌株KLDS1.0676最靠近之匹配。由於序列資料庫藉由連續併入新的遺傳序列而為動態的,所以菌株CECT 7504可分為戊糖乳桿菌或胚芽乳桿菌類。已知胚芽乳桿菌、類胚芽乳桿菌及戊糖乳桿菌菌種密切相關,因此實際上為可互換的。
2.2.菌株基因型分析
藉由基因組消化及脈衝場凝膠電泳(PFGE)進行表徵。CECT 7504菌株進行先前描述之方案(羅達斯等人,酒乳桿菌屬菌株之多相研究:分類學推斷.國際系統與進化微生物學雜誌2005,第55卷,第1期,第197-207頁(Rodas,A.M.,et al.Polyphasic study of wine Lactobacillus strains:taxonomic implications.Int J Syst Evol Microbiol.2005,Vol.
55,No.1,pages 197-207)),略有修改。菌株在MRS瓊脂板上生長且在37℃、5% CO2下培育18小時。收穫細胞且在8毫升PET(10毫莫耳濃度Tris pH 7.6、1莫耳濃度NaCl)中洗滌3次,接著在6000轉/分下離心10分鐘。離心塊再懸浮於700毫升溶解緩衝液(6毫莫耳濃度Tris、1莫耳濃度NaCl、0.1莫耳濃度EDTA、0.5% SLS、0.2%去氧膽酸;1毫克/毫升溶菌酶;40單位/毫升變溶菌素(mutanolysin);20毫克/毫升核糖核酸酶)中。將等體積1.6%低熔點瓊脂糖(美國緬因州洛克蘭郡的FMC生物產品公司(FMC BioProducts,Rockland,ME,USA))添加至再懸浮細胞中且使其在4℃下凝固1小時。將插入物轉移至2毫升溶解緩衝液II(0.5莫耳濃度EDTA pH 9.2、1% N-月桂基肌胺酸及1毫克/毫升鏈黴蛋白酶(pronase))中且在50℃下培育48小時。接著插入物在室溫下用TE緩衝液(10毫莫耳濃度Tris、1毫莫耳濃度EDTA pH 8.0)洗滌。總DNA消化分別藉由Sfi-I及Sma-I限制酶(羅氏診斷產品有限公司(Roche Diagnostics))進行。商業益生菌菌株胚芽乳桿菌P17630用作對照。
使用CHEF DRIII裝置(伯樂實驗室(BioRad Laboratories))進行脈衝場凝膠電泳。插入物負載於1%瓊脂糖凝膠(美國緬因州FMC生物產品公司的西科姆瓊脂糖(SeaKem ME agarose,FMC BioProducts,ME,USA))中。表2描述各酶之電泳條件。DNA MW標記物為λ梯PFG標記物及低限PFG標記物(新英格蘭生物實驗室(New England Biolabs))。電泳後,凝膠用溴化乙錠及UV使用格爾道科系統(GelDoc System)(伯樂)染色。結果描繪於圖1中。
如圖1中所示,對於本發明之菌株戊糖乳桿菌CECT 7504(I1001)及屬於密切相關菌種胚芽乳桿菌之商業對照菌株(P17630),脈衝場凝膠電泳Sfi-I及Sma-I限制圖譜為不同的。PFGE允許區分相同菌種之菌株,且因此可用於獨特鑑別細菌性菌種內之給定菌株(羅達斯等人,2005上述(Rodas,A.M.,et al.2005 supra))。
陰道液含有各種抗微生物因子,其藉由不同機制起作用,諸如酸性pH值、溶菌酶、乳鐵傳遞蛋白及防衛素。
因此,證明菌株能夠在酸性環境中存活(迪歐等人,陰道栓劑中所含之胚芽乳桿菌P17630的微生物特徵.GIMMOC.2003.第VII卷,第2期,第102-8頁(Dho,G.,et al.Microbial characteristics of Lactobacillus plantarum P17630 contained in vaginal suppositories.GIMMOC.2003.Vol.VII,No.2,pages 102-8))不足以保證此菌株將能夠在陰道環境中存活,因為陰道環境含有除酸性pH值外的其他抗微生物因子。
陰道液(合成)
使用陰道液模擬劑(歐文等人,陰道液模擬劑.避孕.1999,第59卷,第2期,第91-5頁(Owen,D.H.et al.A vaginal fluid simulant.Contraception.1999,Vol.59,No.2,
pages 91-5)),向其中添加抗細菌蛋白質及肽:3.5公克/公升NaCl、1.4公克/公升KOH、0.22公克/公升Ca(OH)2、0.02公克/公升BSA、2公克/公升乳酸、1公克/公升乙酸、0.16公克/公升甘油、0.4公克/公升尿素及5公克/公升葡萄糖。使用乳酸進一步調節pH值至4.2。
抗細菌蛋白質
溶菌酶為陰道液中濃度較高之抗細菌物質之一。在健康女性及患有細菌性陰道炎之女性中其濃度在1毫克/公升與4毫克/公升之間變化,但在經歷外陰陰道念珠菌病之女性中可達到16毫克/公升或超過16毫克/公升(瓦洛爾等人,2006上述(Valore,E.V.,et al.2006,supra))。溶菌酶具有廣泛抗菌活性,但針對諸如乳桿菌屬之細菌尤其具有活性。因此,確保選擇能夠在高濃度溶菌酶下存活之菌株非常重要,從而獲得可有益於所有患有外陰陰道念珠菌病之女性的益生菌。
抗細菌肽
已充分證明防衛素β-2及β-3針對乳桿菌屬之活性。然而,發現防衛素β-2濃度為防衛素β-3之1/30(歌西等人,體液中人類β-防衛素-2及β-防衛素-3之定量:用於研究先天性免疫之應用.臨床化學2007,第53卷,第4期,第757-765頁(Ghosh,S.K.,et al.Quantification of Human beta-defensin-2 and -3 in Body Fluids:Application for Studies of Innate Immunity.Clin Chem.2007,Vol.53,No.4,pages 757-765))。陰道液中防衛素β-3之濃度可位於1毫克/公升與5毫克/公升之間。
相反地,諸如乳鐵傳遞蛋白之其他抗微生物蛋白質針對乳桿菌屬具有很小活性,例如乳鐵傳遞蛋白之抗菌活性主要基於破壞細菌性鐵之代謝且乳桿菌屬不需要鐵生長(阿奇博爾德,錳:其藉由乳酸細菌之獲取及在其中功能.微生物學關鍵評論1986,第13卷,第1期,第63-109頁(Archibald,F.,Manganese:its acquisition by and function in the lactic acid bacteria.Crit Rev Microbiol.1986,Vol.13,No.1,pages 63-109))。
乳桿菌屬菌株在MRS肉湯中生長隔夜。細胞藉由離心收穫且以107菌落形成單位/毫升再懸浮於PBS中。20微升細胞懸浮液接種於200微升補充有溶菌酶(0毫克/公升、4毫克/公升及16毫克/公升最終濃度)或4毫克/公升溶菌酶加上β-3防衛素(0毫克/公升、2毫克/公升及4毫克/公升最終濃度)的陰道液模擬劑中。微量滴定板在37℃下培育3小時且藉由連續稀釋且塗鋪在MRS瓊脂中來計數各孔中剩餘之活細胞數目。所有實驗均一式三份進行。
10個分離之乳桿菌屬菌株中,菌株CECT 7504處於展示對溶菌酶與β-3防衛素之抗性的五個菌株中。菌株CECT 7504展示對高達16毫克/公升之溶菌酶濃度的高度抗性(參見圖2)。另一方面,對照菌株胚芽乳桿菌P17630(伊斯丁)在暴露超過4毫克/公升之溶菌酶濃度(諸如在顯著部分之外陰陰道念珠菌病患者中可發現之溶菌酶濃度)時展示存活力明顯下降(90%)。
值得注意地,菌株CECT 7504與菌株胚芽乳桿菌P17630對單獨或與4毫克/公升溶菌酶組合之2毫克/公升及
4毫克/公升之β-3防衛素濃度均具有抗性,指示兩者準備好在健康陰道環境中存活。
4.1.針對白色念珠菌及光滑念珠菌之活性
針對白色念珠菌及光滑念珠菌之活性使用瓊脂覆層方法測試。簡言之,乳桿菌屬菌株在MRS瓊脂(薩勞(Scharlab))中生長隔夜且用無菌細菌環呈兩條交叉直線塗鋪。板在37℃下培育24小時,且隨後用6毫升在YM肉湯中接種有20微升念珠菌屬隔夜培養物之熔融YM培養基(薩勞)覆蓋。使板冷卻且再次培育14小時,且在三個不同點量測抑制區域。乳桿菌屬菌株最初針對一個白色念珠菌菌株(CECT 1392)測試。隨後針對四個念珠菌屬菌株再測試顯示顯著活性之菌株:白色念珠菌CECT 1472及CECT 1002以及光滑念珠菌CECT 1448及CECT 1900。所有實驗均一式三份進行。
在46個自陰道樣品分離之乳桿菌屬菌株中,35個展示針對白色念珠菌CECT 1392之顯著活性。然而,僅8個乳桿菌屬菌株顯示針對所有三個白色念珠菌菌株之顯著活性。此外,僅3個乳桿菌屬菌株顯示針對白色念珠菌菌株與光滑念珠菌菌株之顯著活性。結果樣品展示於表3中。
菌株CECT 7504展示與商業益生菌菌株胚芽乳桿菌P17630相比,針對三個白色念珠菌菌株之活性較高。大部分測試之野生型乳桿菌屬展示至多針對兩個菌株之活性。此外,菌株CECT 7504展示針對一個光滑念珠菌菌株之高活性及針對第二菌株之一定活性,而胚芽乳桿菌P17630及其他野生型菌株展示針對第一菌株之低活性及針對第二菌株無活性(表3)。
4.2.陰道環境之酸化
公認健康陰道菌叢之基本功能之一為大多經由乳酸及乙酸之產生,酸化陰道液以防止不希望之細菌性菌種過度生長,亦即細菌性陰道炎。因此,大量產生乳酸為用於處理細菌性陰道炎之益生菌菌株之所希望特性。
酸化陰道液之能力時常由菌株酸化典型實驗室培養基或牛乳之能力推斷而得。然而,陰道液之組成(低濃度養分)與富含養分之典型實驗室培養基或牛乳之組成非常不同。因此,由於能夠存活、生長及酸化具有不同組成之培養基而假定菌株具有優良的存活、生長及酸化陰道液之能力至少為冒險的。
為偵測酸化陰道液之潛能,使用改質之陰道液模擬劑(歐文等人1999,上述(Owen,D.H.et al.1999,supra)),補充有4毫克/公升溶菌酶(在細菌性陰道炎中觀測到之最高
濃度(瓦洛爾等人2006,上述(Valore,E.V.,et al.2006,supra)):3.5公克/公升NaCl、1.4公克/公升KOH、0.22公克/公升Ca(OH)2、0.02公克/公升BSA、2公克/公升乳酸、1公克/公升乙酸、0.16公克/公升甘油及0.4公克/公升尿素。使用1當量濃度NaOH將pH值調至5.5,且添加20公克/公升之葡萄糖以能夠偵測由醱酵引起之pH值下降。
乳桿菌屬菌株在MRS肉湯中生長隔夜且將50微升接種於3毫升改質之陰道液模擬劑中。在37℃下培育隔夜後量測pH值。所有實驗均一式三份進行。
菌株CECT7504顯示在所測試之乳桿菌屬菌株中最高的酸化陰道液之能力,其顯著高於對照菌株P17630所展示之能力(表4)。菌株CECT 7504之酸化能力亦為針對念珠菌屬具有最高活性之分離株中最佳的。
標記有氚化胸腺嘧啶之乳桿菌屬菌株與海拉細胞(HeLa cell)之匯合培養物一起培育,海拉細胞為獲自陰道子宮頸上皮之細胞株,先前用以評估乳桿菌屬對陰道上皮之黏附(阿塔斯等人,自健康女性之陰道微生物叢分離之乳桿
菌屬菌株抑制共培養物與細胞培養物中二路普雷沃爾菌及陰道加德納氏菌.FEMS免疫學與醫學微生物學.2006,第48卷,第3期,第424-432頁(Atassi,F.,et al.Lactobacillus strains isolated from the vaginal microbiota of healthy women inhibit Prevotella bivia and Gardnerella vaginalis in coculture and cell culture.FEMS Immunology & Medical Microbiology.2006,Vol.48,No.3,pages 424-432);馬斯特羅馬里諾等人,用於製備陰道錠劑之陰道乳桿菌屬菌株之表徵及選擇.應用微生物學雜誌2002,第93卷,第5期,第884-893頁(Mastromarino,P.,et al.Characterization and selection of vaginal Lactobacillus strains for the preparation of vaginal tablets.Journal of Applied Microbiology.2002,Vol.93,No.5,pages 884-893))。此方法允許計數所有黏附乳桿菌屬細胞而非取上皮細胞之部分樣品,且藉由顯微鏡術對黏附乳桿菌屬進行目視計數,使得計數更可靠。
實驗展示在酸性培養基(諸如陰道液)中預培育可改變細菌黏附,主要歸因於HSP蛋白質在膜中表現。此外,重要的是注意到,本發明之研究已在模擬上皮真實條件的匯合單層上皮細胞上進行,而非在如針對其他益生菌所報導之溶液中之個別上皮細胞上進行(庫里西等人,胚芽乳桿菌P17630對陰道上皮細胞之黏附及其對白色念珠菌黏附之影響.GIMMOC.2004,第8卷,第1期,第34-41頁(Culici,M.,et al.Adhesion of Lactobacillus plantarum P17630 to vaginal epithelial cells and its influence on Candida albicans adhesion.GIMMOC.2004,Vol.8,No.1,pages 34-41))。
海拉細胞在24孔板中生長至95%-100%匯合。乳桿菌屬菌株在10毫升具有氚化胸腺嘧啶(10微居里)之MRS培養基中培養隔夜。接著,藉由離心收穫細菌細胞且在37℃下以5x108菌落形成單位/毫升再懸浮於pH值使用乳酸調至5之陰道液模擬劑中,歷時15分鐘。0.5毫升等分樣品在PBS中稀釋,以獲得2x107菌落形成單位/毫升及2.5x106菌落形成單位/毫升之懸浮液,其分別約等於200:1及25:1之細菌性細胞與海拉細胞比率。
一半毫升數之細菌懸浮液添加至含有海拉細胞之匯合培養物之孔中且在37℃下共培育45分鐘。接著,孔用PBS洗滌兩次以移除鬆散黏附細菌。最終,孔棄去且內含物置放於閃爍瓶中以定量氚化胸腺嘧啶之量。此外,在24孔板中接種之細菌懸浮液等分樣品置放於閃爍瓶中以計算各菌株之放射性與細菌細胞之間的比率。所有實驗均一式兩份進行。
菌株CECT 7504顯示比對照菌株P17630高的對陰道上皮細胞之黏附,如下表(表5)中所示:
將待測試之各菌株隔夜培養物之0.5%接種物接種於100毫升在37℃下預熱之一般可食用培養基(薩里拉等人,固定相酸及熱處理以提高益生菌乳桿菌屬及雙歧桿菌之存活力.應用微生物學雜誌.2004,第96卷,第6期,第1205-1214頁(Saarela,M.,et al.Stationary-phase acid and heat
treatments for improvement of the viability of probiotic lactobacilli and bifidobacteria.Journal of Applied Microbiology.2004,Vol.96,No.6,pages 1205-1214))中,其用作工業培養基之替代品。此培養基由以下構成:20公克/公升葡萄糖、30公克/公升大豆蛋白腖、7公克/公升酵母提取物、1公克/公升MgSO4.7H2O,於0.01莫耳濃度磷酸鉀緩衝液(pH 6.3)。菌株在37℃下培育且在不同時間點(0小時、3小時、6小時及23小時)提取100微升等分樣品以藉由平板計數定量活細胞數目。熟知之益生菌菌株鼠李糖乳桿菌GG(維利奧有限公司(Valio Ltd))用作對照。
菌株戊糖乳桿菌CECT 7504(11001)顯示在模擬工業培養基之培養基中與熟知之益生菌鼠李糖乳桿菌GG相當的生長,在由106菌落形成單位/毫升之接種物開始之隔夜培養後達到109菌落形成單位/毫升之濃度。
在菌株CECT 7504以兩種不同濃度(20毫克/毫升及100毫克/毫升,以5x107菌落形成單位/毫克)投與後,根據ISO 10993-10:2002指南,與對照組(僅媒劑)相比,測定陰道黏膜中之耐受性。9-11週齡、重量為2.1-2.5公斤之紐西蘭雌性白兔隨機化在三組中,每組6隻兔,且維持於個別籠中17℃-20℃及50%-70%相對濕度下,且供給標準塔克蘭德(Teklad)2030C兔飲食且自來水隨意取食。每隻兔藉由通向兔陰道之局部途徑,以1毫升/天之劑量投與,一天一次,連續7天。含1%羧甲基纖維素鈉之蒸餾水用作媒劑。對於僅媒劑,調配物之pH值為7.6,對於20毫克/毫升劑量,為5.8,
且對於100毫克/毫升劑量,為5.6。
每天檢查死亡兩次且每天檢查臨床徵象一次。在環境適應期間、即將第一次及第四次投與之前及在處死之前檢查體重兩次。在最後投與後24小時,藉由靜脈內注射以每公斤體重60毫克之劑量及1毫升/公斤體積投與耳靜脈之戊巴比妥鈉,處死所有動物,且屍檢。檢查每隻動物之生殖器,其中特別強調陰道表面。
分離脂肪與相鄰組織後,每隻動物之卵巢、陰道及子宮固定在10%中性緩衝福馬林中。陰道之遠端、中間及近端區域之切片包埋,以4微米之厚度切割,且用蘇木精及曙紅染色,且在顯微鏡下檢驗,根據以下評估量表(表6)將觀測到之變化分級:
測試條目之耐受性及刺激性特性之評估基於所得平均分數進行。測試組中所有動物之顯微評估等級相加且總和除以觀測數目,從而獲得測試組平均值、刺激平均值(MVI)。最大評分為16。針對對照組重複。對照組平均值減去測試組平均值,獲得刺激指數,且其根據以下量表(表7)分類:
臨床徵象
在研究期期間既未觀測到死亡,亦未觀測到全身性毒性之臨床徵象,且所有動物存活直至計劃屍檢。在第2組(20毫克/毫升劑量)中未觀測到體重或體重增加之顯著差異。在來自第3組(100毫克/毫升劑量)之兩隻雌性中記錄體重減輕。然而,相對於對照組,差異並非統計上顯著的(頓那特檢驗)。
宏觀及微觀發現
在以20毫克/毫升及100毫克/毫升(5x107菌落形成單位/毫克)之濃度局部投與菌株CECT 7504 7天後觀測到與對照組相比,陰道黏膜之微紅變色之發生率增加。觀測到陰道黏膜下層中之發炎以及由免疫反應引起之血管充血及白細胞浸潤之發生率及/或嚴重程度增加。然而,反應為劑量依賴性的,且變化在20毫克/公斤下嚴重程度最小且在100毫
克/公斤下輕微。整體而言,第2組中獲得之平均刺激值(MIV)為0.83,指示在20毫克/毫升濃度下無刺激性反應。第3組中獲得之平均刺激值(MIV)為2.33,指示在100毫克/毫升濃度下刺激最小。人們認為兔中生殖道黏膜微生物菌叢非常缺乏,基本上含有葡萄球菌(Staphylococcus)、微球菌屬(Micrococcus)及假單胞菌屬(Pseudomonas)(雅克等人,雌性兔生殖道之正常微生物菌叢.加拿大獸醫研究雜誌.1986,第50卷,第272-4頁(Jacques,M.,et al.The normal microflora of the female rabbit's genital tract.Can J Vet Res.1986,Vol.50,pages 272-4))。因此,不同於人類陰道菌叢,幾乎不存在乳桿菌屬且因此,投與戊糖乳桿菌CECT 7504後觀測到對外來物之免疫反應。
在10名18-40歲健康雌性自願者中進行開放標記之臨床試驗,以測定菌株CECT 7504移殖陰道上皮(作為主要終點)之能力及評估產品之耐受性(作為次要終點)。測試投與3天及5天以評估持續暴露於益生菌是否影響其移殖陰道上皮之能力。入選標準為精神正常且願意在產品投與天數期間及取樣前夜避免性活動。排除使用陰道內產品、具有陰道炎或自研究發作前15天服用抗生素之女性,以及免疫抑制、哺乳期或懷孕女性。評述方案且經瓦爾德希布倫醫院道德委員會(ethics committee of Hospital Vall d'Hebron)(巴塞隆納(Barcelona))批准,且根據赫爾辛基宣言(Helsinki Declaration)及優良臨床實習指南(Good Clinical Practice guidelines)進行。
製備700毫克可分解的黏膜黏附性陰道內錠劑,由羥丙基甲基纖維素(HPMC)、無水乳糖及檸檬酸製成且含有100毫克(1-2x109菌落形成單位)菌株CECT 7504,壓縮力為60牛頓。自願者(21-36歲、中位值29歲)隨機化以連續3天(5名女性)或者連續5天(5名女性)接收錠劑。錠劑藉由自願者在臨睡前使用塗藥器裝置陰道內施加。在正好第一次投與前及最後投與後第1天、第3天及第8天使用無菌拭子收集陰道液樣品。將樣品儲存在4℃下直至分析。為評估耐受性,自陰道錠劑投與之第一天,自願者每天記錄陰道症狀,持續3週。
使用伊斯麥(EasyMag)自動化系統(生物梅里埃(Biomerieux))自樣品提取DNA,且使用對戊糖乳桿菌及胚芽乳桿菌菌種具有特異性之定量PCR測試樣品中CECT 7504菌株之存在。擴增靶向16S-23S rRNA基因間區域內之144鹼基對區域。探針在5'經FAM標記且在3'經NFQ-MGB(應用生物系統)標記。使用塔克曼(TaqMan)通用母混合物(應用生物系統)根據製造商說明書進行擴增。加熱由50℃下2分鐘及95℃下10分鐘組成。在95℃下進行變性15秒,接著在60℃下退火及延伸60秒,循環45次。引子及探針之序列指示於下文中(表8)。
發現益生菌非常耐受。一些自願者報導有輕度陰
道排出物,但在其他研究中,已證明可歸因於產品引入陰道中而非益生菌菌株,因為在接收安慰劑產品之自願者中亦觀測到此效果(斯特普爾頓等人,陰道內給與以預防復發性泌尿道感染之捲曲乳桿菌益生菌的隨機化、安慰劑對照之2期試驗.臨床傳染病.2011,第52卷,第10卷,第1212-17頁(Stapleton A.E,et al.Randomized,Placebo-Controlled Phase 2 Trial of a Lactobacillus crispatus Probiotic Given Intravaginally for Prevention of Recurrent Urinary Tract Infection.Clinical Infectious Diseases.2011,Vol.52,Vol.10,pages1212-17))。在自願者中基線處未發現戊糖乳桿菌或胚芽乳桿菌菌株之可偵測DNA。然而,在最後投與益生菌後早晨發現每毫升陰道液平均106個DNA複本(圖4)。兩天後,無論哪個組,益生菌仍然可偵測。在連續5天接收錠劑之組中5名患者中有2名,益生菌在最後投與後8天仍可偵測,但持續3天接收產品之組中並非如此。
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EP 1436380 B1
國內寄存資訊【請依寄存機構、日期、號碼順序註記】
財團法人食品工業發展研究所、2014/9/26、BCRC 910650
國外寄存資訊【請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記】
西班牙、COLECCIÓN ESPAŃOLA DE CULTIVOS TIPO(CECT)、2009/3/6、CECT 7504
<110> 巨妮亞實驗室有限公司
<120> 作為益生菌之乳桿菌屬菌株
<130> P2723PC00
<150> EP13382326
<151> 2013-08-01
<160> 10
<170> BiSSAP 1.2
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<222> 1..19
<223> /分子類型=「未分配DNA」 /注意=「擴增正向引子」
/生物體=「人工序列」
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<210> 4
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<212> DNA
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<222> 1..57
<223> /分子類型=「未分配DNA」 /注意=「定序正向引子357f」 /生物體=「人工序列」
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<222> 1..20
<223> /分子類型=「未分配DNA」 /注意=「定序反向引子907r」 /生物體=「人工序列」
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<220>
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<222> 1..19
<223> /分子類型=「未分配DNA」 /注意=「定序反向引子1492r」 /生物體=「人工序列」
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<212> DNA
<213> 戊糖乳桿菌
<220>
<221> source
<222> 1..1384
<223> /分子類型=「未分配DNA」 /注意=「菌株CECT 7504之16S rRNA基因之序列」 /生物體=「戊糖乳桿菌」
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<223> /分子類型=「未分配DNA」 /注意=「即時PCR定量之正向引子」 /生物體=「人工序列」
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<223> /分子類型=「未分配DNA」 /注意=「即時PCR定量之反向引子」 /生物體=「人工序列」
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<223> /分子類型=「未分配DNA」 /注意=「即時PCR定量之探針」 /生物體=「人工序列」
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Claims (13)
- 一種組合物,包括寄存在食品工業發展研究所寄存編號BCRC 910650下之戊糖乳桿菌(Lactobacillus pentosus)菌株。
- 如申請專利範圍第1項所述之組合物,其用於預防及/或治療念珠菌病。
- 如申請專利範圍第2項所述之組合物,其用於預防及/或治療陰道念珠菌病。
- 如申請專利範圍第3項所述之組合物,其用於預防及/或治療由光滑念珠菌(Candida glabrata)引起之陰道念珠菌病。
- 如申請專利範圍第3項所述之組合物,其用於預防及/或治療具有高度發炎反應之陰道念珠菌病。
- 如申請專利範圍第2項所述之組合物,其與三唑抗黴菌劑(triazole antimycotic)或制黴菌素(nistatin)組合用於預防及/或治療念珠菌病。
- 如申請專利範圍第2項所述之組合物,其用於預防及/或治療口腔或腸念珠菌病。
- 如申請專利範圍第1項所述之組合物,其用作藥劑。
- 如申請專利範圍第1項所述之組合物,其為醫藥產品。
- 如申請專利範圍第1項所述之組合物,其為食品或可食用產品。
- 如申請專利範圍第1項所述之組合物,其為食品增補劑。
- 如申請專利範圍第1項所述之組合物,其為個人衛生產品。
- 一種戊糖乳桿菌菌株,其寄存在食品工業發展研究所寄存編號BCRC 910650下。
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