BR112016002888B1 - Uso de uma cepa de lactobacillus pentosus - Google Patents
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Abstract
cepa de lactobacillus pentosus, composição, método para obter um mutante da mesma e seu uso. a presente invenção refere-se à provisão de uma nova cepa de lactobacilli pentosus cect 7504. a cepa apresenta como vantagens-chave: uma alta sobrevivência aos fatores antimicrobianos encontrados em fluido vaginal, fatores que são frequentemente aumentados em um subconjunto de pacientes com candidíase, e que poderiam ser muito prejudiciais para muitos probióticos; a capacidade em inibir candida albicans e candida glabrata, desta maneira exibindo uma atividade de espectro mais amplo para ajudar a tratar infecções por candida tal como candidíase vulvovaginal; a capacidade em sobreviver contra altas concentrações de agentes antimicóticos tipicamente usados para tratar infecções por candida, desta maneira permitindo sua coadministração; e uma capacidade aumentada de acidificar o fluido vaginal, desta maneira exibindo um potencial alto para ajudar a tratar vaginose bacteriana. desta maneira, a cepa e os produtos compreendendo a mesma são úteis na prevenção e/ou no tratamento de candidíase (oral, intestinal e vaginal) e de vaginose bacteriana.
Description
[0001] A presente invenção refere-se aos campos de medicina, microbiologia e tecnologia de alimento e particularmente a uma nova cepa de Lactobacillus pentosus a ser usada como um probiótico para benefício da saúde humana.
[0002] O conceito de micro-organismos probióticos nasceu da hi pótese do Prêmio Nobel Elie Metchnikoff, que sugeriu que o consumo de bactérias capazes de produzir fermentação (Lactobacillus) tem um efeito positivo sobre a microbiota do cólon, reduzindo a presença de toxinas bacterianas e outras atividades microbianas que têm um impacto negativo sobre a saúde humana.
[0003] “Probióticos são micro-organismos vivos que após sua ad ministração conferem ao consumidor mais benefícios do que nutrição natural básica”. Hoje, há várias referências sobre a utilidade de probió- ticos para tratar vários distúrbios de saúde gastrintestinal, bem como estudos que sugerem sua utilidade para ativar o sistema imune e prevenir alergias.
[0004] Bactérias probióticas devem satisfazer várias exigências com relação à falta de toxidez, viabilidade, adesão e efeitos benéficos. As propriedades de cada cepa bacteriana são únicas e não podem ser extrapoladas para outras cepas da mesma espécie (Araya, M. e outros, Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food - Joint FAO/WHO Working Group. FAO/WHO. Editor 2002. Food and Agriculture Organization of the United Nations and World Health Organization: Ontario, Canadá). Desta maneira, é importante encontrar essas novas cepas que têm um melhor desempenho em todas as exigências pro- bióticas.
[0005] Embora o conceito de probióticos tenha sido associado à flora microbiana intestinal, estudos conduzidos já em 1980 mostraram que este conceito poderia ser também estendido para a flora vaginal de mulheres. Alguns grupos de cientistas têm desenvolvido esta ideia por alguns anos, que culminou na identificação de algumas cepas de Lactobacillus que são úteis para tratar complicações de saúde vaginal (Anukam, K.C. e outros. “Clinical Study comparing probiotic Lactobacillus GR-1 e RC-14 with metronidazole vaginal gel to treat symptomatic bacterial vaginosis”. Microbes and Infection. 2006, Vol. 8, Nos. 12-13, páginas 2772-2776; Larsson, P.G. e outros, ‘Human Lactobacillis as supplementation of clindamycin to patients with bacterial vaginosis reduce the recurrence rate; a 6-month, double-blind, randomized, placebo-controlled study”. BMC Women’s Health. 2008, Vol. 8, No. 1, página 3), desta maneira demonstrando o conceito de probiótico para saúde vaginal. Flora Vaginal Saudável
[0006] O aparecimento de secreções vaginais e coceira são as causas mais comuns de consultas ginecológicas. Isso pode ser devido a reações alérgicas, contato com agentes irritantes (fibra de roupa, sabão, spray, etc.) ou em muitos casos devido a uma infecção.
[0007] A flora vaginal saudável é composta principalmente de Lac tobacilli, que mantêm o pH ácido natural da vagina (entre 3,9 e 4,3), prevenindo sua colonização por outros micro-organismos. Quando sua flora natural está enfraquecida, por exemplo, por tratamentos antibióticos sistêmicos, infecção por espécies patogênicas se torna muito mais provável. As complicações mais frequentes de flora vaginal saudável são candidíase vulvovaginal e vaginose bacteriana. Candidíase Vulvovaginal
[0008] A Candida é uma levedura altamente prevalente que pode ser encontrada em números pequenos na flora vaginal sem quaisquer sintomas de doença. Os sintomas aparecem quando o equilíbrio da flora vaginal é perturbado e a população de Candida aumenta comparado com a quantidade de Lactobacilli protetores. Sintomas típicos de infecção por Candida incluem coceira e queimação vaginal, bem como dispareunia e vaginismo. Aproximadamente 75% dos casos da candi- díase vulvovaginal são devido à Candida albicans e mais 15% são devido à Candida glabrata (Ritcher, S.S. e outros, “Antifungal Susceptibi- lies of Candida Species Causing Vulvovaginits and Epidemilogy of Recurrent Cases”. J. Clin. Microbiol. 2005, Vol. 43, No. 5, páginas 21552162). É estimado que 75% de mulheres sofram pelo menos um episódio durante sua vida. Além disso, 25% dos casos são recorrentes com quatro ou mais episódios por ano.
[0009] A infecção ocorre frequentemente após tratamento com te rapia com antibiótico prescrito com um objetivo terapêutico diferente. Ela é também comum em mulheres que tomam contraceptivos orais contendo estrógenos, em mulheres grávidas e em mulheres com diabetes. Infecções por Candida são tratadas com antimicóticos, tais como fármacos triazol (por exemplo, fluconazol, clotrimazol, miconazol, itraconazol) ou nistatina. No entanto, é digno de atenção que cepas de Candida glabrata tendem a exibir uma resistência alta contra tais tratamentos, enquanto até 20% das cepas de Candida albicans isoladas em clínicas apresentam resistência a fluconazol, um dos tratamentos mais típicos, reforçando a importância de se encontrar novas ferramentas terapêuticas para o tratamento de candidíase vulvovaginal.
[00010] Em adição ao seu pH ácido, o fluido vaginal contém várias proteínas antimicrobianas, tais como lisozima, defensinas e lactoferri- na. Durante a candidíase vulvovaginal, a concentração dessas substâncias aumenta além dos níveis normais em aproximadamente 25% das mulheres (Valore, E. V. e outros, “Reversible Deficiency of Antimicrobial Polypeptides in Bacterial Vaginosis”, Infect. Imunn. 2006, Vol. 74, No. 10, páginas 5693-5702). Esta resposta é geralmente insuficiente para repelir leveduras tal como Candida, uma vez que o efeito dessas substâncias é mais bacteriostático ou bactericida do que anti- micótico. No entanto, uma vez que a flora vaginal saudável é principalmente composta de bactérias do gênero Lactobacillus, este aumento anormal em proteínas antimicrobianas pode contribuir para retardar mais a recuperação da flora saudável da vagina. Além disso, isto reforça a necessidade de considerar a resistência a esses fatores anti- microbianos quando pesquisando por Lactobacilli adequados para serem usados como probióticos. Vaginose Bacteriana
[00011] Vaginose bacteriana é causada por um crescimento exagerado de espécies bacterianas geralmente ausentes na flora vaginal ou encontradas em quantidades muito pequenas. As espécies mais comuns são Gardnerella vaginalis e Atopobium vaginale, mas um agente etiológico preciso não foi encontrado até agora. Cerca de 1 em 5 mulheres desenvolverá vaginose bacteriana ao longo de um intervalo entre 6 e 12 meses. Embora a vaginose bacteriana possa causar descargas vaginais incomuns e odor de peixe, a maioria dos casos é as- sintomático. Uma característica típica de vaginose bacteriana é o aumento do pH acima de 4,5, devido ao desaparecimento de Lactobacilli, que facilita mais o crescimento de outras espécies bacterianas.
[00012] A vaginose bacteriana é tratada com antibióticos, tais como metronidazol e clindamicina. No entanto, a vaginose bacteriana exibe uma taxa de recorrência alta, até 35% durante o primeiro mês e até 70% durante o primeiro ano. Foi também observado que o tratamento de vaginose com antibiótico pode levar à candidíase vulvovaginal como uma infecção secundária, uma vez que antibióticos, especialmente clindamicina, também afetam Lactobacilli.
[00013] Também, foi mostrado que mulheres que têm vaginose bacteriana tendem a ter bebês prematuros ou bebês com peso baixo - menos de 2,5 kg -. Algumas vezes, a infecção pode se espalhar para os tubos falopianos. Este tipo de infecção é chamado doença inflamatória pélvica (PID) (Pelvic Inflammatory Disease) e pode causar infertilidade e dano aos tubos falopianos, aumentando o risco de gravidez ectópica. A vaginose bacteriana também aumenta o risco de infecções do trato urinário e doenças sexualmente transmitidas. Probióticos para o tratamento de candidíase vulvovaginal e vagi- nose bacteriana
[00014] Há atualmente várias cepas de probióticos comercializadas para ajudar a tratar candidíase vulvovaginal, tais como Lactobacillus rhamnosus GR1, Lactobacillus fermentum RC14, Lactobacillus plantarum P17630 e Lactobacillus acidophilus NAS. No entanto, nenhuma delas foi testada quanto à sua habilidade em suportar as concentrações elevadas de fatores antimicrobianos que ocorrem em aproximadamente 1 em 4 casos de infecção. Ainda, há apenas uma solução probiótica (BION Flore Intime®, composta de cepas Lactobacillus rhamnosus GR1 e Lactobacillus reuteri RC14) para o tratamento de candidíase vulvovaginal cujas exigências de eficácia são apoiadas por um teste clínico controlado por placebo aleatorizado (Martinez, R.C.R e outros. “Improved treatment of vulvovaginal candidiasis with flucona- zol plus probiotic Lactobacillus rhamnosus GR-1 e Lactobacillus reuteri RC-14”. Letters in Applied Microbiology. 2009, Vol. 48, No. 3, páginas 269-274).
[00015] Por outro lado, há dois produtos probióticos para o tratamento de vaginose bacteriana cujas exigências de saúde são apoiadas por testes clínicos, controlados por placebo aleatorizados: BION Flore Intime® - Lactobacillus rhamnosus GR1 e Lactobacillus fermen- tum RC14 - e EcoVag® - Lactobacillus gasseri DSM 14869 e Lactobacillus rhamnosus DSM 14870 (Anukam, K.C. e outros, 2006, supra; Larsson, P.G. e outros, 2008, supra).
[00016] A arte descreve outras cepas como probióticos vaginais potenciais, tal como EP1436380 B1, que descreve a cepa Lactobacillus pentosus NCIMB 41114 isolada de uma cultura fecal obtida de um indivíduo adulto saudável e culturada na presença de tetraciclina. O documento descreve que devido à sua habilidade em suprimir o crescimento de espécies de Candida e que a cepa é resistente à tetraciclina e antibióticos relacionados, ela pode ser útil para combater crescimento indesejável de Candida em qualquer região do corpo, em particular em Síndrome do Intestino Irritável. Este documento não menciona a atividade inibidora da cepa contra Candida glabrata, nem demonstra a habilidade da cepa em aderir ao epitélio vaginal e sobreviver no ambiente vaginal ou resistir a substâncias antimicrobianas presentes nela, tal como lisozima.
[00017] Okkers, D.J. e outros 1999 descrevem que a cepa Lactobacillus pentosus TV35b, isolada das secreções do fórnix posterior da vagina de uma paciente pré-natal, produziu um peptídeo do tipo bacte- riocinas (pentocina TV35b), que é inibidora de Candida albicans e algumas espécies bacterianas. O documento não menciona a atividade inibidora das cepas contra Candida glabrata (Okkers, D.J. e outros, “Characterizatin of pentocin TV35b, a bacteriocin-like peptide isolated from Lactobacillus pentosus with a fungistatic effect on Candida albicans”, Journal of Applied Microbiology, 1999, Vol. 87, No. 5, páginas 726-734).
[00018] Por outro lado, a arte descreve cepas vaginais que não apresentam atividade inibidora contra Candida albicans. Por exemplo, em Dimitonova e outros, 2007, a atividade inibidora de 20 cepas de Lactobacilli, isoladas de esfregaços vaginais de mulheres Búlgaras saudáveis, foi avaliada. Nenhuma das 20 cepas inibiu o crescimento de Candida albicans (Dimitonova, S.P. e outros. “Antimicrobial activity and protective properties of vaginal Lactobacilli from healthy Bulgarian Women”. Anaerobe. 2007, Vol. 13, No. 5-6, páginas 178-184).
[00019] A arte também ensina a presença de atividade inibidora contra Candida albicans, não quer dizer que a cepa bacteriana seja também antagonista contra Candida glabrata. Por exemplo, em Pascual, L.M. e outros, 2008, uma cepa de Lactobacillus isolada da vagina de mulheres na pré-menopausa, saudáveis, não grávidas, foi identificada como Lactobacillus rhamnosus L60. Lactobacillus rhamnosus L60 exibiu um amplo espectro de atividade antimicrobiana contra pa- tógenos urogenitais, e resistência a antibióticos comumente prescritos para infecções causadas por esses patógenos. Esta cepa era antagonista contra 10 cepas de Candida albicans, mas não era antagonista contra as 3 cepas de Candida glabrata testadas [Pascual, L.M. e outros, “Lactobacillus rhamnosus L60, a potential probiotic isolated from the human vagina”. Journal of General and Applied Microbiology. 2008, Vol. 54, No. 3, páginas 141-148).
[00020] Desta maneira, o fato que os Lactobacilli descritos para uso como probiótico vaginal potencial são isolados da vagina não significa que eles apresentam atividade inibidora contra espécie de Candida. Além disso, o fato que uma cepa de Lactobacillus é antagonista contra Candida albicans não significa que também possui atividade contra outras espécies de Candida, tal como Candida glabrata. Desta maneira, ser antagonista para espécie Candida não é uma característica inerente de Lactobacilli.
[00021] O WO 2012/101500 A1 descreve uma composição efervescente em forma sólida para uso em aplicações vaginais para o tratamento de infecções vaginais. A composição efervescente compreende dentre componentes galênicos uma cepa bacteriana probiótica para redução e/ou eliminação da presença de agentes patogênicos no ambiente vaginal. A cepa é selecionada de uma longa lista de espécies mais comuns usadas como probióticos, dos gêneros Lactobacillus e Bifidobacterium. O documento não inclui um teste para avaliar as propriedades das cepas. A invenção é focada na composição galênica projetada para aumentar a sobrevivência dos probióticos durante sua fabricação e para aperfeiçoar administração. As cepas mencionadas no documento estão comercialmente disponíveis e os patógenos mencionados são comuns em patologias vaginais.
[00022] A JP 2008013502 A descreve o uso de um produto obtido através de um processo de fermentação de uma planta crucífera, tal como, por exemplo, brócolis, com bactérias do ácido láctico tal como Lactobacillus pentosus, para tratar ou prevenir infecções por Candida tal como vaginite. Testes são feitos com cepas depositadas de Candida albicans. O documento não menciona a atividade inibidora do produto fermentado contra Candida glabrata.
[00023] Por outro lado, conforme explicado acima, substâncias an- tibacterianas em fluido vaginal são aumentadas além dos níveis normais em aproximadamente 25% de mulheres sofrendo candidíase vulvovaginal. Essas substâncias têm um efeito inibidor significante sobre Lactobacilli. Alguns Lactobacilli são usados atualmente como probióti- cos vaginais; no entanto, nenhum deles foi testado quanto à capacidade de sobreviver nas condições onde fatores antimicrobianos são aumentados em fluido vaginal. Além disso, nenhum dos probióticos vaginais atuais foi testado quanto à sua atividade especificamente contra Candida glabrata. C. glabrata é responsável por uma fração significan- te de infecções por Candida e exibe uma resistência maior a tratamentos antimicóticos atuais, desta maneira apresentado um desafio tera-pêutico maior.
[00024] Os inventores proveem uma nova cepa de Lactobacillus pentosus adequada como um probiótico para o tratamento de infec- ções vaginais, como um resultado de extensos estudos de cepas de Lactobacilli diferentes isoladas de humanos saudáveis. A cepa I1001 foi isolada da flora vaginal de uma mulher jovem saudável vivendo sob condições higiênicas pobres. A cepa de Lactobacillus pentosus foi depositada em 06 de março de 2009 na Spanish Type Culture Collection (Colección Espanõla de Cultivos Tipo, CECT, Edificio 3 CUE, Parc Ci- entífic, Unversitat de València, Catedrático Agustín Escardino, 9, 46980-Paterna, Valencia, Espanha), pelo depositante AB-Biotics, S.A., situado em Edifici Eureka, office P1M1.1, Campus UAB, 08193- Bellaterra (Espanha). A cepa de L. pentosus recebeu o número de acesso CECT7504 após a International Authority of Deposit declarar a cepa como viável.
[00025] O depositante AB-Biotics, S.A. autorizou a Requerente, GYNEA Laboratories S.L., a se referir ao material biológico depositado mencionado acima no pedido de patente Europeu tendo o número de referência da representante P2723EP00 ou em qualquer pedido de patente subsequente derivado dele ou reivindicando prioridade dele, e deu seu consentimento sem reserva e irrevogável para que o material depositado fosse disponibilizado ao público de acordo com a Regra 33 EPC a partir da data de depósito do pedido de patente mencionado acima.
[00026] A cepa CECT7504 foi selecionada dentre 100 cepas de Lactobacilli isoladas devido às propriedades de distinção que seguem:
[00027] • Sobrevivência alta aos fatores antimicrobianos encontra dos em fluido vaginal, especialmente lisozima. Conforme acima explicado, esses fatores são frequentemente aumentados em um subconjunto de pacientes com candidíase (aproximadamente 25% de casos) e poderiam ser muito prejudiciais para muitos probióticos. Conforme indicado na seção de exemplos, apenas uma fração do Lactobacilli de origem vaginal pode sobreviver às concentrações aumentadas de liso- zima que podem ser encontradas em pacientes com candidíase vulvovaginal, mas não em pacientes saudáveis (vide EXEMPLO 3 abaixo, onde 10 cepas de Lactobacillus são testadas). Isto significa que resistência a essas proteínas não é uma característica inerente de Lactobacilli. Além disso, é acreditado que nenhuma técnica anterior descreva probióticos vaginais com capacidade de sobreviver nas condições onde a concentração de fatores antimicrobianos naturais é aumentada no fluido vaginal. Desta maneira, probióticos conhecidos não seriam eficazes para este subconjunto de pacientes. Surpreendentemente, a cepa CECT 7504 mostrou uma resistência aumentada a essas condições, desta maneira sendo especialmente indicada para este subconjunto de pacientes. Particularmente, a cepa CECT 7504 mostrou uma resistência alta a concentrações de lisozima até 16 mg/l (vide FIGURA 2). A lisozima é o fator antimicrobiano encontrado na concentração mais alta no fluido vaginal além de ácidos orgânicos, e o qual atividade é mais direcionada contra organismos Gram-positivos, tais como Lactobacilli. Por outro lado, a cepa comercial L. plantarum P17630 (ISA- DIN) mostrou uma diminuição notável em viabilidade (90%) quando exposta a concentrações de lisozima acima de 4 mg/l, como as que podem ser encontradas em alguns pacientes com candidíase vulvova-ginal.
[00028] • A capacidade em inibir o crescimento de ambas C. albi cans e C. glabrata, desta maneira exibindo uma atividade de espectro mais amplo para ajudar a tratar infecções por Candida tais como can- didíases vulvovaginais. Conforme indicado na técnica anterior e na seção de exemplos, alguns Lactobacilli de origem vaginal exibem atividade antagonística significante contra um ou dois isolatos de Candida, mas apenas uma pequena fração exibe uma atividade significante contra um painel de vários isolatos de ambas as espécies de Candida albicans e Candida glabrata (vide EXEMPLO 4). Desta maneira, confor- me mencionado antes, a capacidade de inibição de isolatos de Candida não é uma característica inerente de Lactobacilli. Surpreendentemente, a cepa CECT 7504 mostrou atividade maior contra as três cepas de C. albicans testadas quando comparado com a cepa probiótica comercial Lactobacillus plantarum P17630 e também mostrou atividade alta contra uma cepa de C. glabrata e alguma atividade contra uma cepa de C. glabrata diferente, enquanto ambas a L. plantarum P17630 e outras cepas do tipo selvagem mostraram atividade baixa contra a primeira cepa e nenhuma atividade contra a última cepa de C. glabrata (TABELA 3).
[00029] • A capacidade de sobreviver contra concentrações altas de agentes antimicóticos tipicamente usados para tratar infecções por Candida, desta maneira permitindo que a cepa bacteriana da presente invenção seja coadministrada com os ditos agentes antimicóticos.
[00030] • Uma capacidade aperfeiçoada em acidificar fluido vaginal comparado com outros isolatos e controle comercial, desta maneira exibindo um potencial alto para ajudar a tratar vaginose bacteriana. A habilidade em acidificar o fluido vaginal é frequentemente extrapolada da habilidade em acidificar meios de cultura de laboratório típicos ou leite. No entanto, a composição do fluido vaginal (concentração de nutrientes baixa) é bem diferente da composição de meios de laboratório ou leite, que são ricos em nutriente. Ao invés disso, a cepa da invenção foi testada em um meio simulando a composição real de fluido vaginal.
[00031] • A habilidade em aderir fortemente às células epiteliais vaginais.
[00032] • Um bom crescimento em meio industrial.
[00033] • Boa tolerabilidade quando testada em um modelo animal de irritação vaginal.
[00034] • Boa tolerabilidade e capacidade de colonização quando testada em voluntários humanos.
[00035] Em suma, é acreditado que nenhuma técnica anterior descreva uma cepa de Lactobacillus e particularmente uma cepa de Lactobacillus pentosus com as características mencionadas acima. A arte descreve outras cepas de Lactobacillus particularmente boas para uma das ditas características, mas o que é notavel é que a cepa de Lactobacillus pentosus CECT 7504 satisfaz todas tais qualidades sozinha. Ainda, para satisfazer as características-chave mencionadas acima para o tratamento de infecções vaginais, a cepa da invenção também apresenta boas características probióticas relacionadas à falta de toxidez, viabilidade, adesão e efeitos benéficos. Os exemplos abaixo proveem (a título de exemplo) protocolos para determinar cada uma das características probióticas e é também demonstrado que a cepa CECT 7504 tem excelentes características probióticas.
[00036] Desta maneira, em um primeiro aspecto a presente invenção provê uma composição compreendendo uma quantidade eficaz de Lactobacillus pentosus CECT 7504. O termo “quantidade eficaz” conforme aqui usado significa um agente em quantidade suficiente para fornecer o benefício desejado, mas baixa o suficiente para evitar efeitos colaterais sérios dentro do escopo de julgamento médico.
[00037] Uma ampla variedade de espécies bacterianas do ácido láctico tem uma longa história de uso seguro aparente. A European Food Safety Authority desenvolveu um sistema concedendo o estado “Qualified Presumption of Safety” (QPS) a unidades taxonômicas com uma história longa provada de uso seguro aparente. A cepa CECT 7504 pertence a uma espécie bacteriana que tem estado QPS (Andre- oletti, O. e outros. “The maintenance of the list of QPS microorganisms intentionally added to food or feed. Question no: EFSA-Q-2008-006”; The EFSA Journal. 2008, Vol. 923, páginas 1-48).
[00038] A emergência e a disseminação de resistência a antimicro- bianos em bactérias representam um risco à saúde humana e à saúde animal e representam um custo financeiro e social grande. Quando resistência a um agente antimicrobiano é inerente a uma espécie bac- teriana, ela é geralmente referida como ‘resistência intrínseca’ (algumas vezes chamada ‘resistência natural’). Resistência intrínseca é presumida apresentar um potencial mínimo para disseminação horizontal, enquanto resistência adquirida mediada por genes adicionados é considerada ter um potencial alto para disseminação lateral. Os in-ventores da presente invenção constataram que a cepa formando a composição da invenção não exibe nenhuma resistência significante a antibióticos de importância humana e/ou veterinária (ampicilina, gen- tamicina, estreptomicina, eritromicina, tetraciclina, clindamicina e clo- ranfenicol) de acordo com as orientações do European Food Safety Authority (Bories, G. e outros. “Update on the criteria used in the assessment of bacterial resistance to antibiotics of human or veterinary importance”. The EFSA Journal, 2008, Vol. 732, páginas 1-15), desta maneira precludindo o risco de uma transferência potencial de resistência a antibiótico para espécies patogênicas.
[00039] Em outro aspecto, a invenção provê uma composição compreendendo uma quantidade eficaz da cepa da invenção para uso como um produto farmacêutico, um medicamento, um produto alimentício, um produto comestível, um suplemento alimentar, um alimento médico ou um produto de higiene pessoal.
[00040] Como dito acima, a cepa CECT 7504 exibe uma atividade significante contra espécie Candida. Desta maneira, em um terceiro aspecto, a invenção provê a composição como acima definido para uso na prevenção e/ou tratamento de candidíase. Este aspecto pode ser alternativamente formulado como o uso de uma composição conforme definido no primeiro aspecto da invenção para a fabricação de um produto farmacêutico, um medicamento, um produto alimentício, um produto comestível, um suplemento alimentar, um alimento médico ou um produto de higiene pessoal para a prevenção e/ou tratamento de candidíase. Isso pode ser também alternativamente formulado como um método para a prevenção e/ou tratamento de candidíase em um humano compreendendo administrar ao dito humano com necessidade do mesmo uma quantidade eficaz da composição conforme definido no primeiro aspecto da invenção.
[00041] A composição da invenção é particularmente útil para o tratamento profilático de indivíduos suscetíveis à candidíase e também para o tratamento terapêutico de indivíduos infectados com microorganismos do gênero Candida. Particularmente, a composição da invenção pode ser administrada a bebês, crianças e pacientes com AIDS para prevenção ou tratamento de afta (candidíase oral) ou assadura por Candida. Ainda, pacientes com AIDS se beneficiariam da composição revelada aqui uma vez que a probabilidade de adquirir uma infecção por Candida seria diminuída, e se adquirida, sofreria menos translocação de Candida quando oralmente ingerida. A composição é também útil para prevenir infecções que põem o feto em perigo em mulheres grávidas, trabalho de parto prematuro e infecção do trato urinário.
[00042] Dada a atividade anti-Candida da cepa CECT 7504, junto com sua habilidade em aderir às células epiteliais e resistir aos fatores antimicrobianos encontrados no fluido vaginal, em um modalidade particular, a composição da invenção é especialmente útil na prevenção e/ou tratamento de candidíase vaginal. Em uma modalidade mais particular, a candidíase é causada por Candida glabrata. Como explicado acima, a cepa da invenção é especialmente útil na prevenção e/ou tratamento de candidíase vaginal com uma resposta inflamatória alta.
[00043] O termo “alta resposta inflamatória” na presente descrição é compreendida como o aumento observado durante candidíase vulvo vaginal nas concentrações de proteínas antimicrobianas contidas no fluido vaginal, tais como lisozima, defensinas e lactoferrina (Valore, E.V. e outros, supra). A lisozima é uma das substâncias antibacteria- nas em uma concentração maior em fluido vaginal. Sua concentração varia entre 1 e 4 mg/ml em mulheres saudáveis e mulheres afetadas por vaginose bacteriana, mas pode atingir 16 m/l ou mais em mulheres sofrendo candidíase vulvovaginal. Desta maneira, a definição de “alta resposta inflamatória” de acordo com a presente descrição pode ser feita com base nos níveis de lisozima. É difícil estabelecer os níveis de lisozima a partir dos quais pode ser considerado que há “uma alta resposta inflamatória” porque a arte não os descreve. Nesta descrição pode ser considerado que “uma alta resposta inflamatória” está presente quando concentrações de lisozima são iguais ou maiores do que 4 mg/l.
[00044] Infecções por Candida também podem ocorrer em outros epitélios fora do trato vaginal, tal como o epitélio intestinal ou o epitélio da cavidade oral. Desta maneira, a atividade anti-Candida da cepa CECT 7504 e sua habilidade em aderir ao epitélio podem ser úteis para o tratamento e/ou prevenção de infecções por Candida no intestino ou na cavidade oral. Desta maneira, em um outro aspecto, a invenção provê a composição conforme acima definido para uso na prevenção e/ou tratamento de candidíase oral e/ou candidíase intestinal. Este aspecto pode ser alternativamente formulado como o uso de uma composição conforme definido no primeiro aspecto da invenção para a fa-bricação de um produto farmacêutico, um medicamento, um produto alimentício, um produto comestível, um suplemento alimentar, um alimento médico ou um produto de higiene pessoal para a prevenção e/ou tratamento de candidíase oral e/ou intestinal. Este pode ser alternativamente formulado como um método para a prevenção e/ou tratamento de candidíase oral e/ou intestinal em um humano compreen- dendo administrar ao dito humano com necessidade do mesmo uma quantidade eficaz da composição conforme definido no primeiro aspecto da invenção.
[00045] Finalmente, como dito acima, a cepa CECT 7504 exibe uma alta capacidade de acidificar o meio vaginal. Desta maneira, em outro aspecto, a invenção provê a composição conforme definido no primeiro aspecto da invenção para uso na prevenção e/ou tratamento de vaginose bacteriana. Este aspecto pode ser alternativamente formulado como o uso de uma composição conforme definido no primeiro aspecto da invenção para a fabricação de um produto farmacêutico, um medicamento, um produto alimentício, um produto comestível, um suplemento alimentar, um alimento medicinal ou um produto de higiene pessoal para a prevenção e/ou tratamento de vaginose bacteriana. Este pode ser alternativamente formulado como um método para a prevenção e/ou tratamento de vaginose bacteriana em um humano, compreendendo administrar ao dito humano com necessidade do mesmo uma quantidade eficaz da composição conforme definido no primeiro aspecto da invenção.
[00046] A composição da presente invenção pode ser preparada em qualquer forma adequada que não afete negativamente a viabilidade da cepa formando a composição da invenção. Seleção dos exci- pientes e dos métodos mais apropriados para formulação em vista do propósito particular da composição está dentro do escopo de pessoas de habilidade comum em tecnologia farmacêutica. A composição pode ser administrada oralmente, vaginalmente ou retalmente ou usando formas de administração diferentes simultaneamente (por exemplo, oralmente e vaginalmente).
[00047] Neste sentido, a composição da invenção está em forma sólida ou líquida e pode estar, inter alia, na forma de pós, comprimidos ou pastilhas, comprimidos mastigáveis, preparações de película, solu- ções, aerossóis, grânulos, pílulas, suspensões, emulsões, cápsulas, comprimidos e cápsulas enterorrevestidos, xaropes, líquidos, elixires, doces, goma de mascar, supositórios, microenemas, comprimidos vaginais, cápsulas de gelatina vaginais, cremes, géis, pomadas, loções, tampões, lenços, chumaços, tiras de fusão, preservativos, pessários, sprays, tintura ou extratos de fluido.
[00048] A composição de acordo com a invenção pode ser formulada em uma forma onde a cepa da invenção é o único agente ativo ou é misturado com um ou mais outros agentes ativos e/ou é misturado com excipientes farmaceuticamente adequados ou aditivos ou ingredientes adequados no caso de um produto alimentício ou um produto comestível. Em uma modalidade particular da invenção, a composição contém ainda um ou mais agentes ativos adicionais. Preferivelmente, o agente ou agentes ativos adicionais são outras bactérias probióticas que não são antagonísticas para a cepa formando a composição da invenção. Devido à capacidade da cepa da invenção em sobreviver em concentrações altas de agentes antimicóticos tipicamente usados para tratar infecções por Candida, em uma modalidade particular, a composição da invenção pode ser administrara em combinação com fármacos antimicóticos triazol ou nistatina na prevenção e/ou tratamento de candidíase. Sua compatibilidade foi demonstrada nos exemplos abaixo. Dependendo da formulação, a cepa pode ser adicionada como bactérias purificadas, como uma cultura bacteriana, como parte de uma cultura bacteriana, como uma cultura bacteriana que foi pós- tratada e sozinha ou junto com carreadores ou ingredientes adequados. Prebióticos poderiam ser também adicionados.
[00049] O termo “produto farmacêutico” é compreendido em seu significado mais amplo na presente descrição, incluindo qualquer composição que compreenda um ingrediente ativo, neste caso, a cepa da invenção preferivelmente em forma de composição, junto com exci- pientes farmaceuticamente aceitáveis. O termo “produto farmacêutico” não é limitado a medicamentos. O termo “farmaceuticamente aceitável” conforme aqui usado se refere a compostos, materiais, composições e/ou formas de dosagem que são, dentro do escopo de julgamento médico importante, adequados para uso em contato com os tecidos de um indivíduo (por exemplo, humano) sem toxidez excessiva, irritação, resposta alérgica ou outro problema ou complicação, comensurado com uma razão risco/benefício razoável. Cada carreador, exci- piente, etc, deve também ser “aceitável” no sentido de ser compatível com os outros ingredientes da formulação. Carreadores, excipientes, etc, adequados podem ser encontrados em textos farmacêuticos padrão.
[00050] O produto farmacêutico pode adotar formas ou nomes diferentes dependendo da via de aprovação do produto e também dependendo do país. Por exemplo, um medicamento é um produto farmacêutico particular. Um alimento medicinal é outro produto farmacêutico particular. Os termos “alimento medicinal” e “alimento para propósitos medicinais especiais” são usados em alguns países para se referir a um alimento especialmente formulado e pretendido para o tratamento alimentar de uma doença que tem necessidades nutricionais distintas que não podem ser satisfeitas por dieta normal sozinha. Eles são definidos em regulamentações tais como o Food and Drug Administration’s 1988 Orphan Drug Act Amendments nos Estados Unidos e o Commission Directive 1999/21/EC na Europa. Alimentos medicinais são distintos da categoria mais ampla de suplementos alimentares e de alimentos tradicionais que carregam uma alegação de saúde. Desta maneira, em uma modalidade particular, a composição da invenção é um alimento medicinal.
[00051] Frequentemente, composições bacterianas probióticas, tal como a revelada aqui, são consideradas suplementos alimentares. Um suplemento alimentar, também conhecido como suplemento alimentar ou suplemento nutricional, é considerado outro produto farmacêutico particular. Esta é uma preparação pretendida suplementar a dieta e prover nutrientes ou ingredientes benéficos que não são geralmente ingeridos na dieta normal ou podem não ser consumidos em quantidades suficientes. Na maioria das vezes, suplementos alimentares são considerados produtos alimentícios, mas algumas vezes eles são definidos como fármacos, produtos naturais para a saúde ou produtos nu- tracêuticos. No entendimento da presente invenção, suplementos alimentares também incluem nutracêuticos. Suplementos alimentares são geralmente vendidos “no balcão”, isto é, sem prescrição. Se o suplemento alimentar adotar a forma de uma pílula ou uma cápsula, ele compreende excipientes que são os mesmos que os usados em medi-camentos. Um suplemento alimentar, no entanto, pode também adotar a forma de um produto alimentício que é fortificado com alguns nutrientes (por exemplo, uma barra ou iogurte).
[00052] Desta maneira, em uma modalidade particular, a composição da invenção é um suplemento alimentar.
[00053] Se a composição de acordo com a invenção for um suplemento alimentar, ela pode ser administrada como é, pode ser misturada com um líquido potável adequado, tal como água, iogurte, leite ou suco de fruta ou pode ser misturada com alimento sólido ou líquido. Neste contexto o suplemento alimentar pode estar na forma de comprimidos ou pastilhas, pílulas, cápsulas, grânulos, pós, suspensões, sachês, doces, barras, xaropes e formas de administração correspondentes, geralmente na forma de uma dose unitária. Preferivelmente, o suplemento alimentar compreendendo a composição da invenção é administrado na forma de comprimidos, pastilhas, cápsulas ou pós, fabricado em processos convencionais de preparação de suplementos alimentares.
[00054] A cepa da invenção pode ser também incluída em uma variedade de produtos alimentícios ou produtos comestíveis, tais como produtos de leite (um iogurte, um queijo, um leite fermentado, um leite em pó, um produto fermentado à base de leite, um sorvete, um produto baseado em cereal fermentado, um pó à base de leite), pão, barras, pasta para espalhar sobre o pão, biscoitos e cereais, uma bebida ou um molho. O termo “produto comestível” é usado aqui em seu significado mais amplo, incluindo qualquer tipo de produto, em qualquer forma de apresentação, que pode ser ingerido por um animal, isto é, um produto que é organolepticamente aceitável. O termo “produto alimentício” é compreendido como um produto comestível que também provê um apoio nutricional para o corpo. Exemplos de outros produtos alimentícios são produtos de carne (por exemplo, molhos ou pastas de carne), pastas de chocolate, recheios e glacês, chocolate, doces, produtos de padaria (tortas, massa folhada), molhos e sopas, sucos de fruta e branqueadores para café. Produtos alimentícios particularmente interessantes são suplementos alimentares e fórmulas para bebê. O produto alimentício compreende preferivelmente um material carreador tal como sopa de aveia, alimentos fermentados de ácido láctico, amido resistente, fibras alimentares, carboidratos, proteínas e proteínas gli- cosiladas. Em uma modalidade particular a cepa da invenção é encapsulada ou revestida.
[00055] Desta maneira, em uma modalidade particular, a composição da invenção é um produto alimentício ou um produto comestível.
[00056] Algumas das formas mencionadas acima são consideradas dispositivos médicos em alguns países, por exemplo, cápsulas vaginais, um tampão ou outros tipos de aplicadores. Desta maneira, em uma modalidade particular, a composição da invenção é um dispositivo médico.
[00057] Em outra modalidade particular, a composição da invenção é um produto de higiene pessoal, que pode ser vendido “no balcão” em um supermercado ou em uma farmácia. Exemplos de produtos de higiene pessoal são tampões, papéis higiênicos, absorventes, fraldas, sabões, xampus, géis, pomadas, cremes, sprays e loções.
[00058] Particularmente, a composição da invenção está na forma de comprimidos intravaginais mucoadesivos desintegráveis que são aplicados intravaginalmente usando um dispositivo aplicador. Os comprimidos de 700 mg compreendem particularmente hidroxipropilmetil- celulose, lactose anidra e ácido cítrico e 100 mg (1-2x109 cfu) de cepa CECT 7504 (vide EXEMPLO 8).
[00059] Desta maneira, deve ser compreendido que a composição da invenção é útil no tratamento de candidíase e vaginose bacteriana sem importar a forma da composição, isto é, sem importar se é um produto farmacêutico, um medicamento, um produto alimentício, um produto comestível, um suplemento alimentar, um alimento medicinal ou um produto de higiene pessoal.
[00060] As cepas da invenção são produzidas cultivando as bactérias em um meio adequado e sob condições adequadas. As cepas podem ser cultivadas sozinhas para formar uma cultura pura ou como uma cultura misturada com outros micro-organismos ou cultivando as bactérias de tipos diferentes separadamente e então combinando-as nas proporções desejadas. Após cultivo, a suspensão celular é recuperada e usada assim ou tratada da maneira desejada, por exemplo, através de concentração ou secagem por congelamento, para ser empregada adicionalmente na preparação de produtos farmacêuticos ou comestíveis. Algumas vezes a preparação probiótica é submetida a um processo de imobilização ou encapsulação a fim de aperfeiçoar a vida de prateleira. Várias técnicas para imobilização ou encapsulação de bactérias são conhecidas na arte.
[00061] Está claro que usando a cepa depositada como material de partida, o versado na técnica pode rotineiramente, através de técnicas de mutagênese ou reisolamento convencionais, obter mutantes adicionais ou derivados dos mesmos que retêm ou aumentam as características e vantagens descritas aqui da cepa formando a composição da invenção. Em uma modalidade do primeiro aspecto da invenção, o mutante é obtido usado tecnologia de DNA recombinante. Em outra modalidade do primeiro aspecto da invenção, o mutante obtido através de mutagênese aleatória. Em uma terceira modalidade do primeiro aspecto da invenção, a variante é uma variante de ocorrência natural. Desta maneira, outro aspecto da invenção se refere a um método para obter um mutante da cepa de Lactobacillus pentosus depositada no Spanish Type Culture Collection sob número de acesso CECT 7504 compreendendo uso da cepa depositada como material de partida e aplicação de mutagênese, onde o mutante obtido retém ou aumenta as atividades antimicótica e/ou antibacteriana e/ou a capacidade de colonizar o trato vaginal da cepa parental depositada.
[00062] A quantidade eficaz de unidades de formação de colônia (cfu) para a cepa na composição será determinada pelo versado na técnica e dependerá da formulação final. Por exemplo, quando administrada oralmente, a cepa da invenção está presente na composição em uma quantidade dando uma dose diária eficaz de a partir de 107 a 1012 cfu, de acordo com a legislação atual, preferivelmente de a partir de 109 a 1011 cfu e, quando administrada vaginalmente ou retalmente, em uma quantidade dando uma dose diária eficaz de a partir de 103 a 1012 cfu, preferivelmente de a partir de 105 a 1010 cfu. O termo “unidade de formação de colônia” (“cfu”) é definido como número de células bacterianas conforme revelado pelas contagens microbiológicas em placas de ágar. Suplementos alimentares geralmente contêm cepas probióticas em uma quantidade variando de 107 e 1012 cfu/g. Em uma modalidade particular, a composição da invenção é um suplemento alimentar compreendendo entre 109-1011 cfu/g.
[00063] O uso geral da cepa CECT 7504 é na forma de células viáveis. No entanto, ele pode ser também estendido para células não viáveis tais como culturas mortas ou lisatos de célula (obtidos através de, por exemplo, exposição a pH alterado, sonificação, radiação, temperatura ou pressão, dentre outros meios de morte ou lise bacteriana) ou composições contendo fatores benéficos produzidos pela cepa CECT 7504.
[00064] Em todo o relatório descritivo e reivindicações a palavra “compreende” e suas variações não pretendem excluir outras características técnicas, aditivos, componentes ou etapas. Objetos, vantagens e características adicionais da invenção se tornarão aparentes àqueles de habilidade na técnica quando do exame do relatório descritivo ou podem ser aprendidos através de prática da invenção. Ainda, a presente invenção compreende todas as combinações possíveis de modalidades particulares e preferidas descritas aqui. Os exemplos e desenhos que seguem são providos aqui para propósitos ilustrativos e sem intenção de serem limitantes da presente invenção.
[00065] A FIGURA 1. Padrões de eletroforese de campo pulsante de DNA genômico restrito a Sma-I e Sfi-I de (da esquerda para a direita): Lactobacillus pentosus CECT 7504 (I1001), Lactobacillus plantarum P17630 e marcador molecular de DNA (M).
[00066] A FIGURA 2 mostra o crescimento de cepas de Lactobacilli em simulador de fluido vaginal suplementado com lisozima (concentração final de 0,4 e 16 mg/l). “Lys” significa “Lisozima”. I1001 é a cepa CECT 7504 e P17630 é a cepa de controle L. plantarum P17630.
[00067] A FIGURA 3 mostra como a cepa L. pentosus CECT 7504 (I1001) exibe um crescimento comparável àquele de probiótico bem conhecido L. rhamnosus GG em meio de cultura simulando meio in dustrial; “t” significa “tempo” e cfu / ml é o número de células viáveis.
[00068] A FIGURA 4 mostra a quantidade de DNA das espécies L. pentosus e L. plantarum encontradas no fluido vaginal de voluntários do sexo feminino participando no estudo após a última administração do produto. Os dados mostram valores médio e SEM. Tempo é indicado em horas após a última administração; cópias de DNA por ml de fluido vaginal estão em uma escala logarítmica. Círculos abertos correspondem a dados de voluntários tomando o produto por 5 dias consecutivos e círculos fechados correspondem a dados de voluntários tomando o produto por 3 dias consecutivos. EXEMPLOS
[00069] Conforme aqui usado, I1001 corresponde a Lactobacillus pentosus CECT 7504. EXEMPLO 1. Isolamento do micro-organismo
[00070] A cepa CECT 7504 foi isolada de esfregaços vaginais de mulheres jovens saudáveis de 14-21 anos vivendo sob condições higiênicas pobres. As amostras foram dissolvidas em tampão de PBS pH 7,4, separadas em alíquotas e plaqueadas em meios diferentes para incubação sob condições diferentes. O tempo de incubação dependia da taxa de crescimento da cepa e transcorreu normalmente de 24 h a 3 dias. Isolamento de cepas individuais prosseguiu com os mesmos meios de seleção, então testes de tingimento Gram e exame microscópio foram realizados para sua caracterização inicial.
[00071] A cepa foi inicialmente cultivada em meio MRS suplementado com 100 μg/l de novobiocina (Sigma), 5 μg/l de nistatina, 5 μg/l de cicloexamida (Sigma), 1 mg/l de ampicilina e 10 μg/l de vancomicina e incubada a 30° C sob condições anaeróbicas e pH 6,4. Tingimento Gram mostrou um tingimento Gram positivo claro, bem como morfologia de bacilos não formadores de esporo. EXEMPLO 2. Caracterização taxonômica de cepa
[00072] As bactérias foram coletadas, lavadas e ressuspensas em tampão de pré-lise (480 ml de EDTA 50 mM, pH 8,0; 120 ml de liso- zima 10 mg/ml) a 37° C por 60 min. DNA foi extraído usando o estojo de purificação de DNA genômico Wizard (Promega). Após centrifugação das bactérias pré-tratadas a 14000 g por 2 min para remover o sobrenadante, o protocolo da Promega foi seguido. Em suma, as bactérias foram ressuspensas em Nuclei Lysis Solution e incubadas a 80° C por 5 min, então esfriadas para a temperatura ambiente. Os lisatos de célula foram incubados em solução de RNase a 37° C por 60 min e as proteínas foram precipitadas através da adição da Solução de Precipitação de Proteína e vórtex em velocidade alta. As amostras foram esfriadas e centrifugadas a 15000 g por 3 min. Os sobrenadantes contendo o DNA foram transferidos para tubos mi- crofuge de 1,5 ml limpos e misturados com 600 ml de isopropanol através de inversão. DNA foi coletado através de centrifugação a 15000 g por 2 min e cuidadosamente despejando o sobrenadante. Amostras de DNA foram lavadas com 600 ml de etanol 70% invertendo suavemente o tubo várias vezes. Etanol foi removido através de aspiração, após centrifugação a 15000 g por 2 min. Finalmente, o pelete de DNA foi ressuspenso em 100 ml de Solução de Reidrata- ção através de incubação a 65° C por 1 h. As amostras foram armazenadas a 2-8° C. 2.1. Identificação de gênero e espécie
[00073] O rRNA 16S foi amplificado através de PCR usando o primers universais Eub27f e Eub1492r, que produzem um fragmento de sequência quase integral do gene 16S (mais de 1.400 nucleotídeos) (TABELA 1). Então, o DNA foi lavado usando o estojo Qiaquick (Qiagen). TABELA 1. Primers usados para amplificação e sequenciamento do gene 16S
[00074] Quatro reações de sequenciamento consecutivas foram realizadas para cada amostra em um Genetic Analyzer 3130 (Applied Biosystems) usando BigDye kit v.3.1 e os primers mostrados na TABELA 1. Coleta de dados e cromatogramas foram construídos usando software DNA Sequence Analysis v.5.2 (Applied Biosystems) e checados através de análise visual com Chromas (Technelysium Pty Ltd.) e BioEdit (Ibis Biosciences). SEQ ID NO:7 é a sequência do gene 16S de cepa CECT 7504.
[00075] Identificação de gênero foi realizada usando as ferramentas Ribosomal Database Project (RDP) (Wang, Q. e outros. “Naive Bayesian Classifier for Rapid Assignment of rRNA Sequences into the New Bacterial Taxonomy”. Appl. Environ. Microbiol. 2007, Vol. 73, No. 16, páginas 5261-5267). Identificação de espécie foi realizada através de comparação da sequência obtida com as sequências de 16S cepas de tipo, no Ribossomal Database Project (Cole, J.R. e outros. “The Ri- bossomal Database Project (RDP-II): introducing myRDP space and quality controlled public data”. Nucl. Acids Res. 2007, Vol. 35 (supl_1), páginas D169-172). Compatibilidade mais próxima foi com a cepa de Lactobacillus pentosus JCM 1558 (100% de score de similaridade máxima) que é a cepa de tipo da espécie Lactobacillus pentosus. A sequência de 16S da cepa CECT 7504 foi também alinhada com o banco de dados de sequência NCBI usando BLAST resultando em uma com-patibilidade mais próxima com a cepa Lactobacillus plantarum KLDS1.0676. Devido ao fato dos bancos de dados de sequência serem dinâmicos através de incorporação contínua de novas sequências genéticas, a cepa CECT 7504 pode ser classificada como Lactobacillus pentosus ou Lactobacillus plantarum. É conhecido que as espécies Lactobacillus plantaruam, paraplantarum e pentosus são intimamente relacionadas, desta maneira sendo intercomutáveis na prática. 2.2 Genotipificação de cepa
[00076] Caracterização foi realizada através de digestão genômica e eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE). A cepa CECT 7504 foi submetida a um protocolo anteriormente descrito (Rodas, A.M. e outros, “Polyphasic study of wine Lactobacillus strains: taxonomic implications”, Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2005, Vol. 55, No. 1, páginas 197-207) com pequenas modificações. As cepas foram cultivadas em placas de ágar MRS e incubadas a 37° C, CO2 5% por 18 h. As células foram coletadas e lavadas 3 vezes em 8 ml de PET (Tris 10 mM pH 7,6, NaCl 1 M), então centrifugadas a 6000 rpm por 10 min. Peletes foram ressuspensos em 700 ml de tampão de lise (Tris 6 mM, NaCl 1 M, EDTA 0,1 M, SLS 0,5%, ácido desoxicólico 0,2%; lisozima 1 mg/ml); mutanolisina 40 U/ml; RNase 20 mg/ml). Um volume igual de 1,6% de agarose de ponto de fusão baixo (FMC BioProducts, Rockland, ME, USA) foi adicionado às células ressuspensas e solidificação foi permitida a 4° C por 1 h. Os in- sertos foram transferidos para tampão de lise II 2 ml (EDTA 0,5 M pH 9,2, N-lauril sarcosina 1% e 1 mg/ml de pronase) e incubados a 50° C por 48 h. Então os insertos foram lavados em temperatura ambiente com tampão TE (Tris 10 mM, EDTA 1 mM pH 8,0). Digestão de DNA total foi realizada separadamente pelas enzimas de restrição Sfi-I e Sma-I (Roche Diagnostics). A cepa probiótica comercial L. plantarum P17630 foi usada como controle.
[00077] Eletroforese em gel de campo pulsado foi realizada usando aparelho CHEF DRIII (BioRad Laboratories). Insertos foram carregados em um gel de agarose 1% (SeaKem ME agarose, FMC BioProducts, ME, USA). A TABELA 2 descreve condições de eletroforese para cada enzima. Marcadores de DNA MW foram Lambda ladder PFG Marker e Low Range PFG Marker (New England Biolabs). Após eletroforese, os géis foram tingidos com brometo de etídio e UV usando GelDoc System (BioRad). Os resultados são mostrados na FIGURA 1. TABELA 2. Condições de eletroforese para este estudo
[00078] Conforme mostrado na FIGURA 1, padrões de restrição de Sfi-I e Sma-I de eletroforese em gel de campo pulsado foram diferentes para a cepa da invenção L. pentosus CECT 7504 (I1001) e uma cepa controle comercial pertencente a espécie intimamente relacionada L. plantarum (P17630). PFGE permite distinguir entre as cepas da mesma espécie, e então pode ser usado para identificar unicamente uma dada cepa bacteriana dentro de uma espécie bacteriana (Rodas, A.M. e outros, 2005, supra). EXEMPLO 3. Resistência ao fluido vaginal
[00079] O fluido vaginal contém uma grande variedade de fatores antimicrobianos que agem através de mecanismos diferentes, tal como pH ácido, lisozima, lactoferrina e defensinas. Desta maneira, demonstração que uma cepa bacteriana é capaz de sobreviver em um ambiente ácid”o (Dho, G. e outros, Microbiol characteristics of Lactobacillus plantarum P17630 contained in vaginal suppositories ”. GIMMOC. 2003, Vol. VII, No. 2, páginas 102-8) não é garantia suficiente que esta cepa será capaz de sobreviver em ambiente vaginal, porque ela contém outros fatores antimicrobianos em adição ao pH ácido. Fluido Vaginal (Sintético)
[00080] Um simulador de fluido vaginal foi usado (Owen, D. H. e outros, “A vaginal fluid simulante”. Contraception. 1999, Vol. 59, No. 2, páginas 91-5), ao qual proteínas antibacterianas e peptídeos foram adicionados: 3,5 g/l de NaCl, 1,4 g/l de KOH, 0,22 g/l devCa(OH)2, 0,02 g/l de BSA, 2 g/l de ácido láctico, 1 g/l de ácido acético, 0,16 g/l de glicerol, 0,4 g/l de ureia e 5 g/l de glicose. O pH foi ajustado mais para 4,2 usando ácido láctico. Proteínas Antibacterianas
[00081] A lisozima é uma das substâncias antibacterianas em uma concentração mais alta em fluido vaginal. Sua concentração varia entre 1 e 4 mg/ml em mulheres saudáveis e mulheres afetadas por vagi- nose bacteriana, mas pode atingir 16 mg/ml ou mais em mulheres sofrendo de candidíase vulvovaginal (Valore, E.V. e outros. 2006, supra). A lisozima tem atividade antibacteriana de amplo espectro, mas ela é especialmente ativa contra bactérias tal como Lactobacilli. Desta maneira é de grande importância assegurar a seleção de uma cepa capaz de sobreviver a concentrações altas de lisozima a fim de obter um probiótico que possa beneficiar todas as mulheres com candidíase vulvovaginal. Peptídeos Antibacterianos
[00082] A atividade de defensinas β-2 e β-3 contra Lactobacillus foi bem documentada. No entanto, a defensina β-2 é encontrada em uma concentração 30 vezes menor do que a defensina β-3 (Ghosh, S.K. e outros, “Quantification of Human beta-defensin-2- and -3 in Body Fluids: Application for Studies of Innate Immunity”. Clin. Chem. 2007, Vol. 53, No. 4, páginas 757-765). A concentração de defensina β-3 em fluido vaginal pode se encontrar entre 1 e 5 mg/l.
[00083] Por outro lado, outras proteínas antimicrobianas tal como lactoferrina têm pouca atividade contra Lactobacillus, por exemplo, atividade antibacteriana de lactoferrina é principalmente baseada em rompimento do metabolismo de ferro bacteriano e Lactobacilli não necessitam ferro para crescer (Archibald, F., “Manganess: Its acquisition by and function in the lactic acid bactéria”. Crit. Rev. Microbiol. 1986, Vol. 13, No. 1, páginas 63-109).
[00084] As cepas de Lactobacilli foram cultivadas de um dia para o outro em caldo MRS. As células foram coletadas através de centrifugação e ressuspensas em PBS a 107 cfu/ml. 20 μ da suspensão celular foram inoculados em 200 μl de simulador de fluido vaginal suplementado com lisozima (0, 4 e 16 mg/l de concentração final) ou 4 mg/l de lisozima mais defensina β-3 (0, 2 e 4 mg/l de concentração final). Placas de microtitulação foram incubadas por 3 h a 37° C e o número de células viáveis restante em cada cavidade foi contado através de diluição serial e plaqueamento em ágar MRS. Todos os experimentos foram realizados em triplicata.
[00085] De 10 cepas de Lactobacilli isoladas, a cepa CECT 7504 estava dentre as cinco cepas mostrando resistência a ambas a lisozi- ma e defensina β-3. A cepa CECT 7504 mostrou uma resistência alta a concentrações de lisozima de até 16 mg/l (vide FIGURA 2). Por outro lado, a cepa de controle L. plantarum P17630 (ISADIN) mostrou uma diminuição notável em viabilidade (90%) quando exposta a concentrações de lisozima acima de 4 mg/l, tais como aquelas que podem ser encontradas em uma fração significante de pacientes com candidíase vulvovaginal.
[00086] De importância, ambas a cepa CECT 7504 e a cepa de L. plantarum P17630 eram resistentes a concentrações de β-3 defensina de 2 mg/ml e 4 mg/ml, ou sozinha ou combinada com 4 mg/ml de liso- zima, indicando que ambas são preparadas para sobreviver no ambiente de vagina saudável. EXEMPLO 4. Propriedades antimicrobianas 4.1 . Atividade contra C. albicans e C. glabrata
[00087] Atividade contra C. albicans e C. glabrata foi testada usando o método de revestimento de ágar. Em suma, as cepas de Lactobacilli foram cultivadas de um dia para o outro em ágar MRS (Schar- lab) e plaqueadas com uma alça de bactéria estéril como duas linhas retas se cruzando. As placas foram incubadas por 24 h a 37° C e subsequentemente revestidas com 6 ml de meio YM derretido (Scharlab) inoculado com 20 μl de uma cultura de um dia para o outro de Candida em caldo YM. As placas foram deixadas esfriar e foram incubadas novamente por 14 h e a zona de inibição foi medida em três pontos diferentes. As cepas de Lactobacilli foram inicialmente testadas contra uma cepa de C. albicans (CECT 1392). As cepas exibindo atividade significante foram subsequentemente testada contra mais quatro cepas de Candida: C. albicans CECT 1472 e CECT 1002 e C. glabrata CECT 1448 e CECT 1900. Todos os experimentos foram realizados em triplicata.
[00088] De 46 cepas de Lactobacilli isoladas de amostras vaginais, 35 mostraram atividade significante contra C. albicans CECT 1392. No entanto, apenas 8 cepas de Lactobacilli exibiram atividade significante contra todas as três cepas de C. albicans. Além disso, apenas 3 cepas de Lactobacilli exibiram atividade significante contra ambas as cepas de C. albicans e C. glabrata. Uma amostra dos resultados é mostrada na Tabela 3. TABELA 3
[00089] A cepa CECT 7504 mostrou atividade maior contra as três cepas de C. albicans quando comparada com a cepa probiótica comercial Lactobacillus plantarum P17630. A maioria dos Lactobacilli do tipo selvagem testados mostrou atividade contra duas cepas no máximo. Também, a cepa CECT 7504 mostrou atividade alta contra uma cepa de C. glabrata e algumas atividade contra uma segunda cepa, enquanto ambas L. plantarum P17630 e outras cepas do tipo selvagem mostraram baixa atividade contra a primeira cepa e nenhuma atividade contra a segunda cepa (TABELA 3). 4.2 Acidificação do ambiente vaginal
[00090] É amplamente aceito que uma das funções fundamentais da flora vaginal saudável é a acidificação do fluido vaginal para prevenir crescimento em excesso de espécies bacterianas indesejáveis, isto é, vaginose bacteriana, principalmente através da produção de ácidos láctico e acético. Desta maneira, produção alta de ácido láctico é uma característica desejável para uma cepa probiótica para o tratamento de vaginose bacteriana.
[00091] A habilidade em acidificar o fluido vaginal é frequentemente extrapolada da habilidade das cepas em acidificar meios de cultura de laboratório típicos ou leite. No entanto, a composição do fluido vaginal (baixa concentração de nutrientes) é bastante diferente da composição de meios de cultura de laboratório típicos ou leite, que são ricos em nutriente. Desta maneira supor que uma cepa tenha uma boa capacidade em sobreviver, crescer e acidificar o fluido vaginal devido à sua habilidade em sobreviver, crescer e acidificar um meio com uma composição diferente é pelo menos arriscado.
[00092] A fim de detectar o potencial em acidificar o fluido vaginal, um simulador de fluido vaginal modificado foi usado (Owen, D.H. e outros, 1999, supra) suplementado com 4 mg/l de lisozima (a concentração mais alta observada em vaginose bacteriana (Valore, E.V. e outros, 2006, supra): 2,5 g/l de NaCl, 1,4 g/l de KOH, 0,22 g/l de Ca(OH)2, 0,02 g/l de BSA, 2 g/l de ácido láctico, 1 g/l de ácido acético, 0,16 g/l de glicerol e 0,4 g/l de ureia. O pH foi ajustado para 5,5 usando NaOH 1N e glicose foi adicionada a 20 g/l para ser capaz de detectar uma queda em pH causado pela fermentação.
[00093] As cepas de Lactobacilli foram culturadas de um dia para o outro em caldo MRS e 50 μL foram inoculados em 3 ml de simulador de fluido vaginal modificado. O pH foi medido após incubação de um dia para o outro a 37° C. Todos os experimentos foram realizados em triplicata.
[00094] A cepa CECT 7504 exibiu a capacidade mais alta em acidificar o fluido vaginal as cepas de Lacobacilli testadas, que foi signifi- cantemente maior do que a capacidade exibida pela cepa controle P17630 (TABELA 4). A capacidade de acidificação da cepa CECT 7504 foi também a melhor dentre os isolatos com a atividade mais alta contra Candida. TABELA 4
EXEMPLO 5. Adesão a células do epitélio vaginal
[00095] Cepas de Lactobacilli marcadas com timidina tritiada foram incubadas com culturas confluentes de células HeLa, uma linhagem de célula obtida do epitélio de cérvice vaginal anteriormente usada para avaliar a aderência de Lactobacilli ao epitélio vaginal (Atassi, F. e outros, “Lactobacillus strains isolated from the vaginal microbiota of healthy women inhibit Prevotella bivia e Gardnerella vaginalis in coculture and cell culture”. FEMS Immunology & Medical Microbiology. 2006, Vol. 48, No. 3, páginas 424-432; Mastromarino, P. e outros. “Characterization and selection of vaginal Lactobacillis strains for the preparation of vaginal tablets”. Journal of Applied Microbiology. 2002, Vol. 93, No. 5, páginas 884-893). Esta metodologia permite contagem de todas as células de Lactobacilli aderidas ao invés de considerar amostras parciais de células epiteliais e realização de contagens visuais de Lactobacilli aderido através de microscopia, resultando em contagens mais confiáveis.
[00096] A experiência da requerente mostra que a pré-incubação em meio ácido (tal como o fluido vaginal) poderia alterar a aderência de bactérias, principalmente devido à expressão de proteínas HSP na membrana. Além disso, é importante notar que os presentes estudos foram realizados em uma monocamada confluente de células epiteliais para simular as condições reais do epitélio, não em células epiteliais individuais em solução conforme relatado para outros probióticos (Cu- lici, M. e outros, “Adhesion of Lactobacillus plantarum P17630 to vaginal epitelial cells and its influence on Candida albicans adhesion”. GIMMOC. 2004, Vol. 8, No. 1, páginas 34-41).
[00097] Células HeLa foram cultivadas para 95-100% de confluência em placas de 24 cavidades. Cepas de Lactobacilli foram culturadas de um dia para o outro em 10 m de meio MRS com timi- dina tritiada (10 μCi). Então, as células bacterianas foram coletadas através de centrifugação e ressuspensas a 5 x108 cfu/ml em simulador de fluido vaginal com pH ajustado para 5 usando ácido láctico por 15 minutos a 37° C. Alíquotas de 0,5 ml foram diluídas em PBS para obter suspensões de 2x107 cfu/ml e 2,5x106 cfu/m, que são mais ou menos equivalentes à razão bacteriana para célula HeLa de 200:1 e 25:1, respectivamente.
[00098] Meio ml das suspensões bacterianas foi adicionado às cavidades contendo culturas confluentes de células HeLa e coincubado por 45 min a 37° C. Então, as cavidades foram lavadas duas vezes com PBS para remover bactérias fracamente aderentes. Finalmente, as cavidades foram raspadas e o teor foi posto em frascos de cintilação para quantificar a quantidade de timidina tritiada. Também, alíquotas das suspensões bacterianas inoculadas nas placas de 24 cavidades foram postas em frascos de cintilação para calcular a razão entre radioatividade e células bacterianas para cada cepa. Todos os experimentos foram realizados em duplicata.
[00099] A cepa CECT 7504 exibiu aderência maior a células epiteli- ais vaginais do que a cepa controle P17630 como é mostrado na tabela abaixo (TABELA 5). TABELA 5 EXEMPLO 6. Crescimento em Meio Industrial
[000100] Um inóculo de 0,5% de uma cultura de um dia para o outro de cada cepa a ser testada foi inoculado em 100 ml de General Edible Medium (Saarela, M. e outros, “Stationary-phase acid and heat treatments for improvement of the viability of probiotic Lactobacilli and bifidobacteria”. Journal of Applied Microbiology. 2004, Vol. 96, No. 6, páginas 1205-1214) preaquecido a 37° C, que foi usado como um substituto de meios industriais. Este médio é composto por 20 g/l de glicose, 30 g/l de peptona de soja, 7 g/l de extrato de levedura, 1 g/l de MgSO4 x 7 H2O em tampão de K-fosfato 0,01M (pH 6,3). As cepas foram incubadas a 37° C e alíquotas de 100 μl foram extraídas em pontos de tempo diferentes (0, 3, 6 e 23 horas) a fim de quantificar o número de células viáveis através de contagem de placa. A cepa Lactobacillus rhamnosus GG (Valio Ltd.), um probiótico bem conhecido, foi usada como um controle.
[000101] A cepa L. pentosus CECT 7504 (I1001) exibe um crescimento comparável àquele do probiótico bem conhecido L. rhamnosus GG em meio simulando meios industriais, atingindo concentrações de 109 cfu/ml após uma cultura de um dia para o outro partindo de um inóculo de 106 cfu/ml. EXEMPLO 7. Tolerância Vaginal em Coelhos após Administração Repetida
[000102] A tolerabilidade na mucosa vaginal foi determinada após administração da cepa CECT 7504 em duas concentrações diferentes (20 e 100 mg/ml, a 5x107 cfu/mg) comparado com um grupo controle (veículo apenas), seguindo as orientações da ISO 10993-10:2002. Coelhos fêmeas Brancos Neo Zelandeses de 9-11 semanas de vida, pesando 2,1-2,5 kg, foram aleatorizados em três grupos de 6 coelhos cada e mantidos em gaiolas individuais a 17-20° e 50-70% de umidade relativa, e alimentados com dieta para coelho Teklad 2030C padrão e água da torneira ad libitum. Cada coelho foi administrado em uma dose de 1 ml/dia uma vez por dia por 7 dias consecutivos através de via tópica à vagina do coelho. Carboximetil Celulose de Sódio 1% em água destilada foi usada como veículo. O pH da formulação foi 7,6 para veículo sozinho, 5,8 para a dose de 20 mg/ml e 5,6 para a dose de 100 mg/ml.
[000103] A mortalidade foi checada duas vezes por dia e sinais clínicos uma vez por dia. O peso do corpo foi checado duas vezes durante aclimatação, imediatamente antes das primeira e quarta administrações e antes do sacrifício. Todos os animais foram sacrificados 24 horas após a última administração através de injeção intravenosa de pentobarbital de sódio na veia da orelha em uma dose de 60 mg/kg de peso do corpo e um volume de 1 mg/kg e necropsiados. O aparelho genital de cada animal foi examinado com ênfase especial na superfície da vagina.
[000104] Após separação da gordura e dos tecidos adjacentes, os ovários, a vagina e o útero de cada animal foram fixados em formalina tamponada neutra 10%. Seções das zonas distal, média e proximal da vagina foram incrustradas, cortadas em uma espessura de 4 micrometros e tingidas com hematoxilina e eosina, e foram microscopicamente examinadas, graduando as alterações observadas de acordo com a escala de avaliação que segue (TABELA 6): TABELA 6
[000105] A avaliação da tolerabilidade e propriedades irritantes do item de teste é feita com base nos scores médios obtidos. Os graus de avaliação microscópica para todos os animais no grupo de teste são somados e a soma é dividida pelo número de observações para obter uma média do grupo de teste, valor médio de irritação (MVI). O score máximo é 16. Ele é repetido para o grupo Controle. A média do grupo Controle é subtraída da média do grupo de teste para obter o Índice de Irritação, e é classificado de acordo com a escala que segue (TABELA 7): TABELA 7 Sinais Clínicos
[000106] Nem mortalidade nem sinais clínicos de toxidez sistêmica foram observados durante o período de estudo, e todos os animais sobreviveram à necropsia programada. Quaisquer diferenças notáveis em peso do corpo ou ganho de peso do corpo foram observadas no Grupo 2 (dose de 20 mg/ml). Perda de peso do corpo foi registrada em duas fêmeas do Grupo 3 (dose de 100 mg/ml). No entanto, as diferenças não foram estatisticamente significantes (Teste de Dunnett)) com relação ao grupo Controle. Constatações Macroscópicas e Microscópicas
[000107] Uma incidência aumentada de descoloração avermelhada da mucosa vaginal comparado com o grupo Controle foi observada após 7 dias de administração tópica de cepa CECT 7504 nas concentrações de 20 mg/ml e 100 mg/ml (5x107 cfu/mg). Inflamação na mucosa vaginal bem como incidência e/ou severidade aumentada de congestão vascular e infiltração de leucócito devido a uma resposta imune foi observada. No entanto, a resposta foi dependente da dose e as alterações foram de severidade mínima a 20 mg/kg e leve a 100 mg/kg. No geral, o valor de irritação médio (MIV) (Mean Irritation Value) obtido no Grupo 1 foi 0,83 não indicando nenhuma resposta irritante na concentração de 20 mg/ml. O valor de irritação média (MVI) obtido no Grupo 3 foi 2,33 indicando irritação mínima na concentração e 100 mg/ml. Deve ser considerado que a microflora mucosal do trato genital é muito escassa, contendo basicamente Staphylococcus, Micrococcus e Pseudomonas (Jacques, M. e outros, The normal microflora of the female rabbit’s genital tract. Can J. Vet. Res. 1986, Vol. 50, páginas 272-4). Desta maneira, diferente da flora vaginal humana, não há quase nenhum Lactobacilli e, então, uma reação imune a corpo estranho foi observada após a admi-nistração de Lactobacilli pentosus CECT 7504. EXEMPLO 8. Colonização Vaginal e Tolerabilidade em Voluntários Fêmea após Administração Repetida
[000108] Um teste clínico aberto foi conduzido em 10 voluntários fêmea saudáveis de 18-40 anos de idade, a fim de determinar a habilidade da cepa CECT 7504 em colonizar o epitélio vaginal (como ponto final primário) e avaliar a tolerabilidade do produto (um segundo ponto final). A administração foi testada por 3 e 5 dias para avaliar se a duração da exposição ao probiótico influenciou a sua habilidade em colonizar o epitélio vaginal. Critérios de inclusão foram ter menstruação regular e complacência em abster-se de atividade sexual durante os dias de administração do produto e na noite antes dos dias de amostragem. As mulheres usando produtos intravaginais, tendo infecção vaginal ou tomando antibióticos 15 dias antes do início do estudo foram excluídas, bem como mulheres imunossuprimidas, amamentando ou grávidas. O protocolo foi revisado e aprovado pelo comitê ético do Hospital Vall d’Hebron (Barcelona) e foi conduzido de acordo com as orientações da Helsinki Declaration and Good Clinical Practice.
[000109] Comprimidos mucoadesivos intravaginais desintegráveis de 700 mg feitos de hidroxipropilmetilcelulose (HPMC), lactose anidra e ácido cítrico e contendo 100 mg (1-2x109 cfu) de cepa CECT 7504 foram preparados, com uma força de compressão de 60 N. Voluntários (21-36 anos de idade, média de 29 anos de idade) foram aleatorizados para receber comprimidos ou por 3 dias consecutivos (5 mulheres) ou 5 dias consecutivos (5 mulheres). Os comprimidos foram aplicados intravaginalmente pelos voluntários antes de irem dormir, usando um dispositivo aplicador. Esfregaços estéreis foram usados para coletar amostras de fluido vaginal um pouco antes da primeira administração e nos dias 1, 3 e 8 após a última administração. As amostras foram armazenadas a 4° C até serem analisadas. Para avaliar a tolerabilida- de, os voluntários registraram sintomas vaginais por 3 semanas a partir do primeiro dia de administração dos comprimidos vaginais.
[000110] DNA foi extraído das amostras usando EasyMag automated system (Biomerleux) e as amostras foram testadas quanto à presença de cepa CECT 7504 usando uma PCR quantitativa específica para as espécies L. pentosus e L. plantarum. Amplificação foi direcionada para uma região de 144 pares de base dentro da região intergênica de rRNA 16S-23S. A sonda foi marcada 5’ com FAM e marcada 3’ com NFQ-MGB (Applied Biosystems). Amplificação foi conduzida usando o TaqMan Universal Master Mix (Applied Biosystems) segundo as instruções do fabricante. O aquecimento consistia em 2 minutos a 50° C e 10 minutos a 95° C. Desnaturação foi realizada a 95° C por 15 segundos seguindo por anelamento e extensão a 60° C por 60 s, por 45 ciclos. A sequência dos primers e da sonda são indicadas abaixo (TABELA 8). TABELA 8
[000111] O pro biótico foi verificado ser bem tolerado. Descarga vagi- nal leve foi relatada por alguns voluntários, mas em outros estudos ela foi mostrada ser atribuível à introdução do produto não vagina e não à cepa do probiótico, uma vez que este efeito é também observado em voluntários recebendo produto de placebo (Stapleton A.E. e outros, “Randomized, Placebo-Controlled Phase 2 Trial of a Lactobacillus cris- patus Probiotic Given Intravaginally for Prevention of Recurrent Urinary Tract Infection”. Clinical Infectious Diseases, 2011, Vol. 52, Vol. 10, páginas 1212-17). Nenhum DNA detectável de cepas L. pentosus ou L. plantarum foi encontrado em uma linha de base nos voluntários. No entanto, 106 cópias de DNA por ml de fluido vaginal foram encontradas em média na manhã após a última administração do probiótico (FIGURA 4). Dois dias depois, o probiótico ainda era detectável sem importar o grupo. Em 2 de 5 pacientes no grupo que recebeu o comprimido por 5 dias consecutivos o probiótico era ainda detectável 8 dias após a última administração, mas não naqueles recebendo o produto por 3 dias. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Araya, M., e outros. Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food - Joint FAO/WHO Working Group, FAO/WHO. Editor 2002. Food and Agriculture Organization of the United Nations and World Health Organization: Ontario, Canada. Anukam, K.C., e outros. Clinical study comparing probiotic Lactobacillus GR-1 and RC-14 with metronidazole vaginal gel to treat symptomatic bacterial vaginosis. Microbes and Infection. 2006, Vol. 8, Nos. 12-13, páginas 2772-2776. Larsson, P.G., e outros. Human Lactobacilli as supplementation of clindamycin to patients with bacterial vaginosis reduce the recurrence rate; a 6-month, double-blind, randomized, placebo-controlled study. BMC Women's Health. 2008, Vol. 8, No. 1, page 3. Richter, S.S., e outros. 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1. Uso de uma cepa de Lactobacillus pentosus depositada na Spanish Type Culture Collection sob o número de acesso CECT 7504, caracterizado pelo fato de que é para o preparo de uma composição ou medicamento para prevenção e/ou no tratamento de candidí- ase; e/ou de candidíase vaginal; e/ou de candidíase vaginal com uma alta resposta inflamatória, e/ou de candidíase em combinação com fármacos antimicóticos triazol ou nistatina; e/ou de candidíase oral ou intestinal; e/ou vaginose bacteriana.
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