CN109010900A - 包含微生物抑制性组合物的卫生织物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及卫生织物(1)，如湿巾、干拭巾、毛巾、贴片、小毛巾、纸巾等，所述的卫生织物(1)包含微生物抑制性组合物(8)，所述的微生物抑制性组合物(8)包含至少一种益生菌的胞外产物和有机酸和/或其盐形式的至少一种添加物，所述有机酸的至少一个pKa值不超过5.5。

Description

包含微生物抑制性组合物的卫生织物
本申请是申请日为2006年11月17日，申请号为200680056409.9的中国专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及卫生织物(hygiene tissue)，如湿巾(wet wipe)、干拭巾(dry wipe)、毛巾(washcloth)、贴片(patch)、小毛巾(towelette)、纸巾(napkin)等，其包含对白色假丝酵母(Candida albicans)或其它不希望的微生物产生协同性抑制效果的至少一种益生菌的胞外产物和至少一种选择的添加物。
背景技术
泌尿生殖区藏有包含超过50个不同菌种的复杂微生态系统(Hill等，Scand.J.Urol.Nephrol.1984；86(suppl.)23-29)。对于育龄妇女而言，此区域内的优势种是属于乳杆菌属(Lactobacillus)的产乳酸细菌。这些产乳酸成员对保持这些区域中的有益微生物菌群重要，并且充当可拮抗致病微生物种的益生菌。产乳酸细菌通过如下方式抑制其它微生物的生长和建群，即通过占据适宜建群的小生境、通过形成生物膜并竞争可用营养物，因而排斥有害微生物建群。另外，产生过氧化氢、特异性抑制物质(如细菌素)和降低pH的有机酸(包括乳酸和乙酸)则抑制其它微生物的生长和建群。
健康个体的微生态系统可以因使用抗生素、处于激素变化期间(如妊娠期间)或使用含雌激素的避孕药、月经期间、闭经后、于糖尿病患者群中等被扰动。另外，微生物可以从肛门扩散至泌尿生殖区，这导致正常微生物菌群扰动并且使该个体易受微生物感染，如阴道炎、假丝酵母感染、尿道感染和皮肤感染。通常与这些感染类型相关的微生物属于埃希氏菌属(Escherichia)、肠球菌属(Enterococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、变形菌属(Proteus)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、链球菌属(Streptococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、加德纳氏菌属(Gardnerella)和假丝酵母属(Candida)。女性因其肛门与泌尿生殖道之间的较短距离而特别存在风险，尤其泌尿生殖区内的微菌落还未充分发育的年轻女性和在大多数情况下不再具有保护性菌落的年老女性尤其存在风险。
类似于泌尿生殖区，皮肤建群了一系列生物，这些生物形成皮肤正常菌群。所述生物的数量和特征在不同皮肤部位之间不同。这种正常菌群连同皮肤的结构性屏障为宿主提供针对侵入性微生物的极好防御。在皮肤上的细菌数从前臂和背部无毛表面上每cm2数百个至潮湿区域(如腋窝和腹股沟)的每cm2成千上万个不等。这种正常菌群在防止外来生物建群于皮肤的过程中发挥重要作用，但是正常菌群也需要加以约束以避免皮肤感染。
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是轻微皮肤感染(如疖或脓肿)及更严重的术后伤口感染的最常见病因。治疗包括引流并且这对于细微损伤通常是足够的，不过，当感染严重且患者发热时，可以额外地给予抗生素。
中毒休克综合征是由产生中毒休克综合征毒素的金黄色葡萄球菌(S.aureus)菌株引起的全身性感染。这种疾病因与健康女性使用月经棉塞有关而引人注目，然而，它不限于女性并且可以因非生殖器部位的金黄色葡萄球菌感染而发生。
其它皮肤感染由化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)(A链球菌群)引起。这种生物通过与具有受感染皮肤损伤的其它人接触而获得，并且可以首先在正常皮肤上建群及繁殖，随后通过上皮的微小破口侵入及发展损伤。
可能必需以青霉素或红霉素治疗来对付所述感染。
假丝酵母属喜好潮湿且温暖的皮肤部位并且也迅速地建群于破损的皮肤。故而，皮肤绝大部分区域的相对干燥性阻止假丝酵母属生长，因此假丝酵母以稀少的量在健康皮肤上存在。假丝酵母属也建群于口腔和阴道粘膜，并且其过度生长可以在这些部位引起疾病。白色假丝酵母(C.albicans)与尿布皮炎相关。一项研究已经证明白色假丝酵母引起的损伤受pH显著影响，较低的皮肤pH产生较少损伤(B.Runeman1Acta Derm Venereol 2000；80:421-424)。
减少与上文所述类型感染问题的一种方式是具有良好的个人卫生。然而，过度使用清洁剂不仅降低有害微生物的量，还可能损害有益微生物菌群，这再次使个体易受致病种建群并造成感染。备选地，已经发现治疗和预防微生物感染的一种成功方法是施用产乳酸细菌至泌尿生殖区和皮肤以竞争胜过致病种并促进有益微生物菌群在这些区域内的重新建立和维持。
已经提出可以通过吸收性产品(如尿布、卫生巾、失禁防护品、护垫和月经棉塞)送递产乳酸细菌，例如WO 92/13577、WO 97/02846、WO 99/17813、WO 99/45099和WO 00/35502中所描述。然而，吸收性物品可能并不总是最佳施用途径，因为携带吸收性物品经常被认为不舒服、紧密和暖和。这种施用途径也可以是不便的，原因是往往需要反复施用产乳酸细菌以保持该疗法的效力或预防效果。另外，这些产品不能用于送递所述细菌至身体中除泌尿生殖区之外的其它区域。因此，对于某些应用，可能更方便的是通过除吸收性产品之外的其它方式施用产乳酸细菌。伴随通过吸收性物品施用产乳酸细菌的第二个问题涉及制造此类产品，因为所述产品的全部可能品种和尺度均应当提供这种细菌。因此，通过无须个人调整即可使用的产品施用产乳酸细菌能够提供胜过所述吸收性产品的制造优势。
也提出通过允许清洁并护理皮肤及泌尿生殖区和送递产乳酸益生菌的卫生织物送递产乳酸细菌，例如WO 04/060416。
伴随提供旨在用于传递产乳酸细菌的产品的主要问题是：细菌必须在存该产品运输和储期间保持活力。产乳酸细菌在半潮湿环境下迅速丧失活力，并且因此产乳酸细菌在储存期间不暴露于潮气是重要的。一种部分解决在配备产乳酸细菌的吸收性产品中这个问题的方式是向该产品提供产乳酸细菌、干燥该产品以除去其中的绝大部分潮气并且在防潮包装物中提供该产品(W099/17813)。
WO 00/61201公开了含有有效量的有活力非致病性益生菌(如凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans))或其胞外产物的卫生产品。
EP 1140226描述了部分中和的超级吸收性材料形式的pH调节物质与产乳酸细菌的组合。
就现有技术而言，仍需要具有改善的益生元和/或益生菌效果、易于储存及运输的卫生织物。
发明内容
就现有技术而言，本发明的目的是提供一种卫生织物，其包含具有增强效果的微生物抑制性组合物。本发明的目的也是：容易运输和储存包含微生物抑制性组合物的所述卫生织物，同时所述微生物抑制性组合物不丧失其平衡微菌落及促进健康功能。
上述问题由本发明通过卫生织物如湿巾、干拭巾、毛巾、贴片、小毛巾、纸巾等解决，其中所述的卫生织物包含微生物抑制性组合物，所述的微生物抑制性组合物包含产生协同性益生元效果的至少一种益生菌的胞外产物和有机酸和/或其盐形式的至少一种添加物，所述有机酸具有不超过5.5的pKa值。
在一个方面，所述的pKa值不超过5。
根据本发明，所述的微生物抑制性胞外产物是通过过滤或离心益生菌培养物所获得的上清液。
在一个实施方案中，所述的微生物抑制性组合物基本上不含益生菌，所述益生菌的量优选不高于100CFU/ml并且更优选不高于10CFU/ml。
在本发明的另一个实施方案中，所述的微生物抑制性组合物包含至少一种益生菌、至少一种益生菌的胞外产物和至少一种所述添加物。
在本发明的一个方面，所述益生菌是产乳酸细菌。
在本发明的其它方面，所述产乳酸细菌是植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)LB931。在本发明的又一个方面，所述产乳酸细菌是发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)Ess-1。在本发明的又一个方面，所述产乳酸细菌是植物乳杆菌LB931和发酵乳杆菌Ess-1的组合。
在本发明的一个方面，所述的添加物选自乙酸、丙酸、乳酸、抗坏血酸、苯丙氨酸、柠檬酸、丁酸、戊酸、己酸、琥珀酸和/或其盐。所述添加物优选地选自乙酸、丙酸、乳酸、苯丙氨酸、柠檬酸或琥珀酸、抗坏血酸和/或其盐。所述添加物最优选地选自抗坏血酸、乙酸、丙酸、琥珀酸和/或其盐。
在本发明的另一个方面，所述的盐是钠盐；优选地是丙酸钠或乙酸钠。
由于组合有益生菌的胞外产物和添加物的本发明微生物抑制组合物在抑制致病微生物方面产生出乎意料的协同效果，因此包含这种微生物抑制性组合物的本发明卫生织物具有增强的益生元效果。此外，本发明的卫生织物容易运输及储存，同时所述微生物抑制性组合物不丧失其有益属性。附图简述
图1显示在LB931的胞外产物及添加(50mM)不同酸/盐的情况下白色假丝酵母(C.albicans)的生长。
图2a.显示在LB931的胞外产物及添加(50mM)不同酸/盐的情况下的大肠杆菌(E.coli)生长。
图2b.显示在LB931的胞外产物及添加(50mM)不同酸/盐的情况下的腐生葡萄球菌(S.Saprofyticus)生长。
图3a.显示当发酵乳杆菌Ess-1的胞外产物与添加物抗坏血酸组合时白色假丝酵母(Candida albicans)的生长。
图3b.显示当发酵乳杆菌Ess-1的胞外产物与添加物丙酸组合时白色假丝酵母(Candida albicans)的生长。
图4-6显示本发明卫生织物的透视图。
定义
“益生菌”在本文中涉及以足够量施用至宿主时赋予健康益处的活微生物。
“产乳酸细菌”意指产生乳酸的细菌。为本发明目的，优选的产乳酸细菌包括来自乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)和片球菌属(Pediococcus)的细菌。优选地，使用的所选细菌来自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、发酵乳杆菌、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)或植物乳杆菌。更优选地，所述菌株选自植物乳杆菌或发酵乳杆菌。甚至更优选地，所述产乳酸细菌是植物乳杆菌931(保藏号(DSMZ):DSM 11918)和发酵乳杆菌Ess-1(保藏号(DSMZ):DSM17851)。
“益生元”在本文中涉及以足够量施用至宿主时促进微菌落平衡的物质。此类物质的实例是用于益生菌的营养物，即促进粘附至益生菌宿主的物质、pH调节物质和来自益生菌的胞外产物。
“微生物抑制性”意指抑制其它微生物的生长、建群和/或存活。
“胞外产物”意指分泌在益生菌培养基中的产物，其中所述胞外产物具有抗微生物效果。所述胞外产物通过例如过滤、离心或这两种方法从所述细菌细胞培养物中获得，并且包含这种胞外产物的所得上清液具有用于微生物抑制性组合物中的抗微生物活性。
术语“卫生织物”意指用于擦拭、清洁和护理皮肤和泌尿生殖区的任何装置，其中所述装置可以用来送递微生物抑制性组合物至这些区域，例如湿巾、干拭巾、毛巾、贴片、小毛巾、纸巾等。
脂质在本上下文中意指不溶于水但溶于有机溶剂的物质。
具体实施方式
本发明的目的是提供这样的卫生织物，其适用于擦拭、清洁和护理皮肤和泌尿生殖区并同时释放将被转移至所述皮肤上的微生物抑制性组合物。
本发明涉及通过使用所述卫生织物解决泌尿生殖区内和皮肤上致病微生物的生长、建群和/或存活问题。这个问题通过施加包含至少一种益生菌的胞外产物和有机酸和/或其盐形式的至少一种添加物的卫生织物而在本发明中加以解决，其中所述的有机酸具有不超过5.5的pKa值。
通过组合所述添加物与所述胞外产物，对白色假丝酵母和其它几种微生物例如大肠杆菌及腐生葡萄球菌的抑制作用获得出乎意料的明显增加。
应当指出当然可以使用两种或更多种益生菌菌株的组合来产生本发明的胞外产物。此外，当然可以在本发明的微生物抑制性组合物中使用至少两种益生菌菌株的组合。
图4-6显示含有微生物抑制性组合物8的卫生织物1的优选实施方案。提供的卫生织物1可以由基质组成，其中所述的基质包含任何天然纤维或合成纤维，如人造丝、纤维素、再生纤维素、聚酯、聚烯烃纤维、纺织品等，或泡沫、无纺布、毛毡或棉絮、或其组合。
应当理解上文所述和附图中所示的卫生织物仅代表非限制性实例并且本发明不受其限制，不过所述卫生织物可以在如上文定义的任何类型卫生织物中使用。
在本发明的一个实施方案中，当所述微生物抑制性组合物包含所述胞外产物和所述添加物时,该组合物基本上不含益生菌。应当指出制造完全不含益生菌的组合物是极端困难的，因此所述益生菌的量优选不高于100CFU/ml并且更优选不高于10CFU/ml。这种组合物具有对储存条件严格性要求较低的优点，因为所述胞外产物比活微生物更耐久。
在本发明的另一个实施方案，所述的微生物抑制性组合物包含至少一种益生菌、至少一种益生菌的胞外产物和至少一种所述添加物。在这种实施方案中当所述的微生物抑制性组合物也包含至少一种益生菌时，称所述效果是益生元效果和益生菌效果。
适用于本发明中的益生菌在大多数情况下产生酸，并且在任何情况下是非致病的。存在下文所确定的多种合适细菌，不过本发明不限于当前已知的菌种和菌株，只要满足益生菌的上述功能和目的即可。
产乳酸益生菌的重要特征是它们产生乳酸并且在一些情况下还产生其它酸的能力。所述乳酸提高皮肤粘膜的酸度，这有助于阻止不期望的真菌和细菌生长、建群及存活。因此，通过产酸机制，这些益生菌抑制竞争性及有害细菌和真菌的生长。所述产乳酸益生菌的其它重要特征是它们产生过氧化氢和其它微生物抑制性物质的能力以及粘附至细胞表面并因而阻止其它有害细菌和真菌粘附至这些表面的能力。
用于本发明微生物抑制性组合物中的常见益生菌是作为高效乳酸产生者的乳杆菌属、乳球菌属和片球菌属的全部成员，并且也包括芽孢杆菌属(Bacillus)的非致病性成员、双歧杆菌属(Bifidobacterium)的全部成员和Pseudomonas limbergii，不过如下所述，某些种是特别优选的。
乳杆菌属的优选成员包括嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌(Lactobacillusbulgaricus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、Lactobacillus cereale、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrukeii)、发酵乳杆菌、加氏乳杆菌(Lactobacillus gaserii)、詹氏乳杆菌(Lactobacillus jensenii)、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、嗜热乳杆菌(Lactobacillus thermophilus)、类干酪乳杆菌类干酪亚种(Lactobacillus paracasai sp.paracasai)、卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、乳乳杆菌(Lactobacilluslactis)等。
特别优选新细菌-发酵乳杆菌Ess-1和植物乳杆菌LB931。先前已经发现LB931具有预防和/或治疗泌尿生殖器感染的价值，因为它抑制种类繁多的致病微生物生长，如EP1060240中描述。发酵乳杆菌Ess-1(保藏号(DSMZ):DSM 17851)根据布达佩斯公约保藏在德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und ZellkulturenGmbH(Mascheroder Weg 1b,D-38124Branuschweig))(保藏人Essum AB1Box 3160,SE90304Umea,瑞典，2006年1月6日保藏)。
应当指出尽管在下文仅使用两种乳杆菌属菌株的实施例中，这些菌株仅应当视为用于实施本发明的益生菌的范例。因此，下文的实施例不应当视为限制本发明。意图是可以在所述组合物中使用益生菌的任何产乳酸种。
本发明的胞外产物从细菌培养物获得。适用于本发明的细菌分泌可用于本发明目的的具有抗微生物活性的产物。为了获得这种胞外产物，如下文所述收集细胞培养物，并且通过离心法或过滤法或这两种方法获得上清液。如此所得的上清液因其中包含的胞外产物而具有微生物抑制活性。在实施例3中描述如何可以制备这种胞外产物的实例。
此胞外产物可以是直接从细菌培养物中获得时的形式，不过也可以进一步浓缩和/或纯化所述上清液。“纯化”指其中某些微生物抑制性物质通过例如层析、结晶或蒸馏进行分离并且单独地或与其它分离物质组合地使用。
添加至本发明的益生菌和/或胞外产物的添加物是有机酸或其盐形式。当选择所述添加物时，当然应该从产品安全观点出发进行选择。所述有机酸或其相应盐应当具有这样的性质，从而在施加至所述卫生用品时，它们不应当造成对所述卫生织物的使用者的任何皮肤刺激，因此在25℃于水中进行测量时，所述有机酸的pKa应当优选地不低于2。若所述pKa值太高，则所述有机酸或其盐主要处于其酸形式。这意味着该添加物不会充分解离成氢离子及此添加物的去质子化阴离子形式，据信所述的去质子化阴离子形式是用益生菌和/或其胞外产物获得所述协同性微生物抑制效果的前提。因此，适用于本发明的有机酸的pKa值应当低于5.5，优选地低于5。若适用于本发明的有机酸具有不止一个pKa值，则这些值中至少之一应当低于5.5、优选低于5。
当所述胞外产物是上清液形式时，这些有机酸或相应盐的溶解度应当是足够地高，从而所述添加物可以溶解在所述上清液中。
在本发明优选的实施方案中，该添加物选自乙酸、丙酸、乳酸、抗坏血酸、苯丙氨酸、柠檬酸、丁酸、戊酸、己酸、琥珀酸和/或其盐。所述添加物优选地选自乙酸、丙酸、乳酸、抗坏血酸、苯丙氨酸、柠檬酸或琥珀酸和/或其盐。所述添加物最优选地选自抗坏血酸、乙酸、丙酸、琥珀酸和/或其盐。
在本发明的一个实施方案中，所述盐是钠盐。尤其优选的盐是丙酸钠和乙酸钠。
所述产品通常包含约0,5-100ml并优选含有1-10ml所述胞外产物。所述添加物一般以5-100mM的终浓度添加至所述胞外产物。若所述卫生织物还包含益生菌，则这些益生菌一般以每个卫生织物约106-1011CFU的量提供。一般，所述细菌是在混悬液中提供的细胞或孢子形式。这些量可以根据具体应用、产品形式和预期用途而变化。
所述微生物抑制性组合物可以直接施加至本发明的卫生织物或在可药用载体中提供的卫生织物，其中所述的可药用载体可以增强所述微生物抑制性组合物的传递，此类载体的实例包括脂质。适用于本发明的脂质的实例包括石油衍生脂质，如液体石蜡(矿物油、石腊油和凡士林油)、矿脂(凡士林和石油凝胶)、微晶蜡、地蜡(ozokerite)、提纯地蜡(ceresine)和石蜡(paraffin)。或者，可以使用合成性脂质，如聚甲基硅氧烷(methicone)、环聚甲基硅氧烷(cyclomethicone)和硅酮酯、如鲸蜡硬脂基聚甲基硅氧烷(ascetearylmethicone)。第三种选择是使用动物或植物衍生的脂质，其通常是甘油三酯。
在一个优选的实施方案中，所述微生物抑制组合物是混悬液形式，其中所述混悬液可以通过浸渗、喷洒、印制等直接施加至所述卫生用品上，此后将卫生用品干燥，例如通过热干燥法进行干燥。
在另一个优选的实施方案中，所述微生物抑制组合物是粉末形式。所述粉末可以混入如上所述的可药用载体或作为散剂直接施加至所述卫生织物上。在该粉末混入可药用载体的情况下，这种混合物可以通过浸渗、喷洒、印制等施加至所述卫生织物上，此后可以将卫生织物干燥。一种送递装置，即与所述卫生织物的顶层相连的单独的袋，也是送递所述微生物抑制性组合物的可能方式。
上文的粉末可以通过蒸发如上所述的混悬液而获得，例如通过热干燥法、对流干燥法、喷雾干燥法、冷冻干燥法等获得。可能必须进一步模制(mould)所述干燥的微生物抑制性组合物以获得精细粉末。优选地冻干所述益生菌。
在一个优选实施方案中，所述卫生织物可以是干式卫生织物，也即该卫生织物包含作为粉末的所述微生物抑制性组合物或该卫生织物在施加含有所述微生物抑制性组合物的混悬液后已经被干燥。在这种情况下，所述卫生织物将在使用前打湿，并且添加物的溶解度因而应当应当具有如下性质：该添加物在接触例如水时迅速形成溶液。
在又一个优选实施方案中，所述卫生织物可以是湿式卫生织物，也即例如该卫生织物用以上的混悬液或包含所述微生物抑制性组合物的可药用载体浸渗。
当所述卫生织物包含活的益生菌时，必须保护此细菌免受潮气影响。该卫生织物因而可以密封地包裹在防潮包装物内。WO 00/76878给出这种防潮包装物的实例。如何可以保护该细菌的另一个实例是使用例如WO 02/28446中例举的送递系统。
本发明在一些实施方案中也旨在减少与储存期间保留所述效果有关的问题。由于在一些实施方案中的全部效果和其它实施方案中至少部分的所述效果来自基本不包含活生物的组合物，从而消除了保持微生物活力及因而保持其功能的问题。
现有技术披露了仅包含益生菌或其胞外产物的吸收性物品。然而，微生物抑制效果，尤其针对假丝酵母的抑制效果，以及益生菌从所述卫生用品至穿戴者的传递并不总是完全令人满意，并且当生产和储存含有活微生物的卫生产品时，还存在众多待克服的问题。
一种提供本发明卫生织物的有利方式因此是作为含吸收性物品的试剂盒。定期使用吸收性物品对泌尿生殖区微气候产生影响，这可以导致泌尿生殖区微菌群失衡。添加微生物抑制性组合物可以改善这种平衡。由于吸收性物品定期使用者可能存在额外风险并且因为所述吸收性物品的更换定期进行，因此，这可能是接近目的群体和建立所述微生物抑制性组合物施用途径的有效方式。
又一种可能是单独地送递处在便于使用者直接施加至卫生组织的形式下的微生物抑制性组合物，其中所述的形式例如是其液体形式，作为粉末，分散于洗剂中，分散在油剂中。用于施加所述微生物抑制性组合物的工具可以是喷雾器、滚涂(roll-on)装置、管、瓶、安瓿、条或棒。
在本发明的又一个方面，所述微生物抑制性组合物与本发明的卫生织物组合使用。
本发明的另一个方面是制备卫生织物，包括施加所述的微生物抑制性组合物至所述卫生织物。
实验部分
试验l
本试验的目的是确定所选的添加物是否影响白色假丝酵母生长以及当添加至植物乳杆菌LB931的胞外产物时，所选添加物是否可以实现改善的生长抑制作用。本试验中所用的添加物是抗坏血酸、柠檬酸、苯丙氨酸、乙酸、丙酸和丙酸钠。
方法
酵母株
使用白色假丝酵母临床分离株(命名为白色假丝酵母702)作为试验菌株。该菌株从阴道假丝酵母菌病女性患者的阴道分离。
对照
作为对照，使用纯dMRSs肉汤(不添加乙酸钠的MRS肉汤)。将指定体积转移至微量滴定板的各孔内并且使其风干(45℃，最少20小时)。
胞外产物(ECP)
将dMRSs肉汤中培育的LB931培养物离心以沉淀细胞，并且使用0.22μm滤器(Millipore filter,Bedford,USA)进行无菌过滤，以获得包含LB931胞外产物的LB931上清液。将指定体积无菌过滤的上清液转移至微量滴定板的各孔内并且使其风干(45℃，最少20小时)，并且此后重悬于无菌蒸馏水至三倍浓度高，并且将200μl转移至96-孔微量滴定板内。
含有添加物的胞外产物
向含有无菌过滤的LB931上清液的管内添加所述添加物至终浓度50mM。将指定体积转移至微量滴定板的各孔内并且使其风干(45℃，最少20小时)，并且此后重悬于无菌蒸馏水至三倍浓度高(即无菌蒸馏水的体积是风干前所述指定体积的约三分之一)，并且将200μl转移至96-孔微量滴定板内。
含有添加物的肉汤
在dMRSs肉汤添加所述添加物至终浓度50mM。将pH调节至与含有对应添加物的胞外产物相同的pH值。将指定体积转移至微量滴定板的各孔内并且使其风干(45℃，最少20小时)，并且此后重悬于无菌蒸馏水至三倍浓度高，并且将200μl转移至96-孔微量滴定板内。
添加假丝酵母至终浓度约104个细胞/孔并将微量滴定板在37℃温育24小时。
用于不同添加物的pH在3.4±0.2间变动。pH对于含有添加物的肉汤和含有添加物的胞外产物而言总是相同的。
此试验以盲试方式进行，从而不会存在歪曲结果的预想评价。对假丝酵母的抑制作用由两个人使用样板基于肉眼观察浊度以5-0级进行评价并评级，同时提供计算的平均值。在纯dMRSs肉汤中含有假丝酵母强烈生长的孔评级为5，而没有可见生长的孔评级为0。
结果
如图1中可见，证明极少添加物自身影响假丝酵母生长，尽管pH极低。LB931的胞外产物有效抑制假丝酵母。这种效果出人意料地因添加所述添加物至LB931的胞外产物而增强。对于与LB931胞外产物组合的全部添加物，实现了极优异的生长抑制效果。将丙酸添加至LB931的胞外产物时，实现最佳效果(根本无生长)。
试验2
这些试验的目的是确定所选的添加物是否影响细菌生长以及当所选添加物添加至植物乳杆菌LB931的胞外产物时，是否可以实现改善的生长抑制作用。本试验中所用的添加物是乙酸钠、琥珀酸、丙酸钠、乙酸。
方法
菌株
使用大肠杆菌(命名为大肠杆菌1)和腐生葡萄球菌(腐生葡萄球菌1)的临床分离株作为试验菌株。它们从患有尿道感染的女性的生殖道分离。
对照
作为对照，使用纯dM17s肉汤(通过添加MnSO4(终浓度0.04g/l)、MgSO4(终浓度0.2g/l)和葡萄糖(终浓度20g/l)而改良的M17肉汤)。将200μl加入96-孔微量滴定板。
胞外产物(ECP)
将dM17s肉汤中培育的LB931培养物离心以沉淀细胞，并且使用0.22μm滤器(Millipore filter,Bedford,USA)进行无菌过滤，以获得包含LB931胞外产物的LB931上清液。将200μl转移至96-孔微量滴定板。
含有添加物的胞外产物
向含有无菌过滤的LB931混悬液的管内添加所述添加物至终浓度50mM。将200μl转移至96-孔微量滴定板。
含有添加物的肉汤
在dM17s肉汤中添加所述添加物至终浓度50mM。将200μl添加至96-孔微量滴定板。
10μl大肠杆菌过夜培养物及10μl腐生葡萄球菌过夜培养物(均稀释100倍)添加至微量滴定板的孔内，其中所述的微量滴定板在37℃温育过夜。
全部试验中pH调节至6.9。
此试验以盲试方式进行，从而不会存在歪曲结果的预想评价。对大肠杆菌和腐生葡萄球菌的抑制作用由两个人使用样板基于肉眼观察浊度以5-0级进行评价并评级，同时提供计算的平均值。在纯dM17s肉汤中各自具有大肠杆菌和腐生葡萄球菌强烈生长的孔评级为5，而没有可见生长的孔评级为0。
结果
如2A图中可见，证明单独的试验添加物均不影响大肠杆菌生长。LB931的胞外产物有效抑制大肠杆菌。这种效果出人意料地因添加所述添加物至LB931的胞外产物而增强。对于与LB931胞外产物组合的全部添加物，实现了极优异的生长抑制效果。
如2B图中可见，证明单独的试验添加物均不影响腐生葡萄球菌生长。LB931的胞外产物有效抑制腐生葡萄球菌。这种效果出人意料地因添加所述添加物至LB931的胞外产物而增强。对于与LB931胞外产物组合的全部添加物，实现了极优异的生长抑制效果。
试验3
本试验的目的是评价当发酵乳杆菌Ess-1的胞外产物与添加物抗坏血酸或丙酸组合时，对白色假丝酵母的增强抑制作用。
方法
Ess-1在dMRSs肉汤(不添加乙酸钠的MRS肉汤)中培育至稳定期。将细菌培养物离心以沉淀细胞，并且当获得了包含所述胞外产物的上清液时，使用0.22μm滤器(Milliporefilter,Bedford,USA)进行无菌过滤。向含有所述胞外产物的管内添加丙酸和抗坏血酸至终浓度50mM。将滤液的pH调节至相应酸的pKa值(对于抗坏血酸，pKa是4.2，而对于丙酸，pKa是4.87)，并且将200μl转移至96-孔微量滴定板的各孔内。向每个孔添加白色假丝酵母至终浓度约5×104CFU ml-1。将该平板在37℃温育20小时，并且细菌生长由两个人使用样板基于肉眼观察浊度以5-0级进行评价并评级，同时提供计算的平均值。在纯dMRSs肉汤中含有假丝酵母强烈生长的孔评级为5，而没有可见生长的孔评级为0。
结果
如可以分别在图3A和3B中看到，当来自Ess-1的上清液与抗坏血酸或丙酸组合时，获得意料之外的增强抑制作用。
试验4
本试验的目的是评价因乙酸钠与植物乳杆菌LB931的生长细胞组合时增强的白色假丝酵母抑制作用。
方法
用M17琼脂制备两块培养平板并且用MRS琼脂制备两块培养平板。MRS培养基(由DeMan、Rogosa和Sharpe开发)是通常用于乳杆菌的生长培养基。来自Merck的MRS琼脂含有5g乙酸钠/每升琼脂。M17(Oxoid)是用于乳杆菌的相似商品基质，但未添加乙酸钠。琼脂如包装物上所述进行制备。
植物乳杆菌LB931在MRS肉汤中于37℃，5％CO2下培育24小时。白色假丝酵母702在M17肉汤中于37℃培育24小时。
在平板中打出孔并填以250μl琼脂混合物填料，所述的琼脂混合物填料含有MRS琼脂中的约107个LB931。将平板静置30分钟并随后在37℃，5％CO2下温育24小时。M17肉汤中白色假丝酵母的过夜培养物稀释10倍并且将100μl涂布在每块平板的表面上。平板随后在37℃温育24小时。作为对照，仅用MRS琼脂填充各孔
平板就假丝酵母生长抑制作用进行评价。测量填料周围无假丝酵母生长的环带
结果
环带大小可以在表1见到。
表1
LB931在已经接种LB931的全部填料中生长良好。在含M17琼脂的平板上全部环带均有假丝酵母生长。在MRS琼脂平板上，在LB931填料周围存在清亮环带，但在仅含琼脂的填料周围没有环带。
LB931以相当低的量施加至平板上，这可以解释为何在M17琼脂平板上基本上看不到对假丝酵母的抑制。然而，这显示了因LB931与所述添加物即本例中MRS培养基内所包含的乙酸钠的协同效果而高效抑制假丝酵母。
实施例
以下与本发明相关的实施例是说明性的，并且当然不应解释为具体限制本发明。
实施例1:Ess-1的分离和分型
本研究的初始目的是分离与其它乳杆菌菌株相比极大程度地抑制白色假丝酵母和光滑假丝酵母(Candida glabrata)生长的乳杆菌菌株并对其分型。
方法
酵母株
使用白色假丝酵母和光滑假丝酵母的临床分离株作为试验菌株。这些菌株从阴道假丝酵母菌病女性患者的阴道和从健康女性分离。
筛选I
来自人皮肤、喉、牙齿、婴儿粪便、植物和种子的约140种乳杆菌菌株在MRS肉汤中培养并涂布至MRS琼脂平板上。所述琼脂平板在厌氧条件下于37℃温育。此外，将SAB(Sabouraud)琼脂(LAB M,Bury,UK)倾倒在所述MRS琼脂上并允许其凝固。白色假丝酵母培养物接种至所述琼脂上并将平板在37℃好氧方式温育。肉眼评价抑制作用。选择与参考菌株植物乳杆菌LB931相比同等程度或更大程度地抑制白色假丝酵母的菌株用于进一步筛选(筛选II)。
筛选II
将dMRSs肉汤(不添加乙酸钠的MRS肉汤)中培育的乳杆菌的混悬液离心并无菌过滤。滤液随后称作乳杆菌无细胞滤液LCF。将指定体积转移至微量滴定板的各孔内并且使其风干，并且此后重悬于无菌蒸馏水至三倍浓度高并转移至96-孔微量滴定板内。将假丝酵母添加至全部管形瓶内(分别使用白色假丝酵母和光滑假丝酵母的三个分离株)。所述抑制作用通过肉眼观察浊度评价并且由两个人使用样板以5-0级进行评级。在纯dMRSs肉汤中含有假丝酵母强烈生长的孔评级为5，而没有可见生长的孔评级为0。
API分型和遗传分型
使用API 50CHL系统(bioMérieux,France)，按照制造商说明书进行种水平的鉴定。使用API Lab Plus软件分析来自发酵试验的数据。遗传分型由通过DSMZ(德国微生物菌种保藏中心)对16S rRNA的部分序列分析进行。
结果
全部菌株根据在筛选I中针对白色假丝酵母的生长抑制能力进行评价。选择了其结果可比或胜过LB931结果的23个乳杆菌菌株用于筛选II。在这23个乳杆菌菌株中，三个菌株是参考菌株并且这些菌株的大部分从口道分离。
证明Ess-1具有广泛抑制假丝酵母生长的能力。就对白色假丝酵母和光滑假丝酵母的影响方面而言，试验的乳杆菌菌株均不具有类似于Ess-1的活性。Ess-1的糖发酵模式和遗传分型显示Ess-1属于发酵乳杆菌。
Ess-1的表征
来自菌株Ess-1(DSM 17851)的16S rDNA由DSMZ(德国微生物菌种保藏中心)通过对PCR扩增的16S rDNA中约450个核苷酸直接测序而进行分析。基因组DNA提取、PCR介导的16S rDNA扩增和PCR产物的纯化如前所述(Rainey,F.A.等Int.J.Sys.Bacteriol.1996(46):1088-1092)实施。纯化的PCR产物使用CEQTMDTCS-Quickstart试剂盒(BeckamnCoulter)，按照制造商说明书进行测序。序列反应产物使用CEQTM8000遗传分析系统进行电泳。
所得的序列数据输入比对编辑器ae2(Maidak,B.L.等Nucl.Acids Res.1999(27):171-173)、手工比对并与归属厚壁菌门(Firmicutes)的生物的代表性16S rRNA基因序列比较(Maidak,B.L.等)。从EMBL数据库或RDP(Maidak,B.L.等)获得16S rRNA用于比较。
作为这种分析的结果，下表2列出其16S rRNA基因序列与Ess-1的16SrDNA序列相比显示最高相似性值的那些生物。
表2
菌株Ess-1的部分16S rDNA基因序列显示与发酵乳杆菌的最高相似性。因此，菌株Ess-1可以代表发酵乳杆菌，不过也可以代表乳杆菌属的一个新种。
实施例2:益生性乳杆菌的产生
在实验室规模上，含有例如纯MRS肉汤的无菌容器接种想要的乳杆菌菌株的纯接种物。含细菌的肉汤在37℃并且优选在5％CO2气氛下温育过夜。随后，可以利用离心和无菌盐水洗涤细胞。可以添加保护性糖、淀粉或蛋白质并将细胞物质冻干和磨碎。
在生产规模上，工作种子批(sead lot)在不同步骤中进行发酵直至生产规模。对待生产的具体菌株控制并优化产生过程。在发酵后，将培养物洗涤和/或仅使用错流微过滤法或离心法浓缩。添加上文的保护性物质并且可以将细胞冻干并磨碎或喷雾干燥。
实施例3:产生来自例如乳杆菌的胞外产物
实验室规模上，如实施例2中那样产生所述益生菌株的过夜培养物。在过滤或离心后，收集上清液。此上清液可以通过蒸发加以浓缩或通过例如干燥空气中对流干燥法、冷冻干燥法或喷雾干燥法而彻底干燥。
在生产规模上，所述细菌培养物根据实施例2进行发酵。胞外产物使用错流微过滤法作为滤液获得或使用离心法作为上清液获得。通常在这种情况下，胞外产物可以利用蒸发法进一步浓缩或因例如喷雾干燥法而彻底干燥。
实施例3:配方
用于改善性器官卫生的卫生织物
LB931和Ess-1细胞的过夜培养物以及来自Ess-1和LB931的上清液形式的胞外产物与乙酸混合至终浓度50mM。pH调节至4,9。将所述混合物随海藻糖冷冻干燥并粉碎直至形成精细粒子粉末。将10克所述粉末添加至120ml橄榄油(Filippo BERIO特级初榨橄榄油)，并振荡直至形成均质溶液。添加额外份的80ml橄榄油，并且将所得200ml溶液涡旋混合大约2分钟。将细菌混悬液在室温保持3小时，一小时混合两次。将织物层(Spun Lace Dupont)切割成6×8cm矩形并置于无菌不锈钢托盘内。在每片织物层上，滴加4ml细菌混悬液以覆盖此织物层。该织物层从中间折叠，随后从长边至中央再次折叠并包装在箔袋内，将箔袋边缘熔接。
应当指出即便配方中全部三个实施例仅包含植物乳杆菌LB931和/或发酵乳杆菌Ess-1作为益生菌，然而，也可以使用如前所述适用于本发明的全部益生菌。

Claims (26)

1.卫生织物(1)，包含微生物抑制性组合物(8)，所述微生物抑制性组合物(8)包含至少一种益生菌的胞外产物以及有机酸和/或其盐形式的至少一种添加物，所述有机酸具有不超过5.5的pKa值。
2.权利要求1的卫生织物(1)，其选自湿巾、干拭巾、毛巾、贴片、小毛巾和纸巾。
3.权利要求1的卫生织物(1)，其中所述胞外产物通过包含过滤或离心所述益生菌的培养物的方法而获得。
4.权利要求1的卫生织物(1)，其中所述微生物抑制性组合物(8)包含1-10ml通过过滤或离心所述益生菌的培养物所获得的上清液形式的所述胞外产物。
5.权利要求1的卫生织物(1)，其中所述添加物选自乙酸、丙酸、乳酸、抗坏血酸、苯丙氨酸、柠檬酸、丁酸、戊酸、己酸、琥珀酸和/或其盐，且其中所述添加物在所述胞外产物中的终浓度为1-100mM。
6.权利要求1的卫生织物(1)，其中所述有机酸具有不低于2.0且不超过5.0的pKa值。
7.权利要求1的卫生织物(1)，其中所述益生菌包含产乳酸细菌。
8.权利要求7的卫生织物(1)，其中所述产乳酸细菌是植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)LB931或发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)Ess-1或其组合。
9.权利要求1的卫生织物(1)，其中所述微生物抑制性组合物(8)是粉末的形式。
10.权利要求1-9任一项的卫生织物(1)，其中所述盐是钠盐。
11.权利要求10的卫生织物(1)，其中所述钠盐是丙酸钠和/或乙酸钠。
12.制备卫生织物产品的方法，包括将微生物抑制性组合物(8)施加至卫生织物(1)上，其中所述微生物抑制性组合物(8)包含至少一种益生菌的胞外产物以及有机酸和/或其盐形式的至少一种添加物，所述有机酸具有不超过5.5的pKa值。
13.权利要求12的方法，其中所述卫生织物(1)选自湿巾、干拭巾、毛巾、贴片、小毛巾和纸巾。
14.权利要求12的方法，其中所述胞外产物通过包含过滤或离心所述益生菌的培养物的方法而获得。
15.权利要求12的方法，其中所述微生物抑制性组合物(8)包含1-10ml通过过滤或离心所述益生菌的培养物所获得的上清液形式的所述胞外产物。
16.权利要求12的方法，其中所述添加物选自乙酸、丙酸、乳酸、抗坏血酸、苯丙氨酸、柠檬酸、丁酸、戊酸、己酸、琥珀酸和/或其盐，且其中所述添加物在所述胞外产物中的终浓度为1-100mM。
17.权利要求12的方法，其中所述有机酸具有不低于2.0且不超过5.0的pKa值。
18.权利要求12的方法，其中所述益生菌包含产乳酸细菌。
19.权利要求18的方法，其中所述产乳酸细菌是植物乳杆菌LB931或发酵乳杆菌Ess-1或其组合。
20.权利要求12的方法，其中所述微生物抑制性组合物(8)是粉末的形式。
21.权利要求12-20任一项的方法，其中所述盐是钠盐。
22.权利要求21的方法，其中所述钠盐是丙酸钠和/或乙酸钠。
23.发酵乳杆菌菌株，其是保藏号为DSM 17851的发酵乳杆菌Ess-1。
24.权利要求23的发酵乳杆菌菌株的胞外产物。
25.试剂盒，其包含卫生织物(1)和权利要求1-11中定义的微生物抑制性组合物(8)，其中所述微生物抑制性组合物(8)和所述卫生用品(1)是分开提供的。
26.权利要求25的试剂盒，其中所述微生物抑制性组合物(8)作为棒剂或喷雾剂置于安瓿、瓶、管、或滚涂装置中。
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