ITMI20110791A1 - Ceppi di batteri in grado di metabolizzare gli ossalati. - Google Patents
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Description
DESCRIZIONE
"Ceppi di batteri in grado di metabolizzare gli ossalati" .
La presente invenzione si riferisce a una selezione di ceppi di batteri lattici e bifidobatteri di origine intestinale umana in grado di metabolizzare gli ossalati. Inoltre, la presente invenzione si riferisce a una composizione alimentare o a un prodotto integratore o a una composizione farmacaeutica contenente detti ceppi di batteri.
L'ossalato (sale dell'acido ossalico) Ã ̈ un composto ubiquitario nel regno vegetale largamente presente in tutte le diete dell'uomo. La somministrazione giornaliero varia dai 70 ai 920 mg (media 495 mg ~ 5,6 mM) , tuttavia questi valori vengono facilmente superati nelle diete dei vegetariani.
L'acido ossalico (acido dicarbossilico) à ̈ uno dei composti organici più altamente ossidati e, pertanto, agisce come potente chelante di cationi, in particolar modo dello ione Ca2+. A causa di questa sua proprietà , i sali di ossalato risultano essere scarsissimamente impiegabili nei processi catabolici e di produzione energetica. Inoltre, l'acido ossalico, risulta essere tossico per la maggior parte degli esseri viventi ed in particolar modo per i mammiferi.
Infatti l'accumulo di acido ossalico nell'uomo può scatenare e/o aggravare una serie di condizioni patologiche tra cui l'iperossaluria, urolitiasi, insufficienza renale, cardiomiopatie ed altri disordini cardiaci. In particolar modo, l'acido ossalico si combina con il calcio a formare il corrispondente ossalato di calcio sale insolubile che à ̈ responsabile di oltre il 70% dei calcoli renali diagnosticati. Inoltre, l'acido ossalico à ̈ un potente agente infiammatorio delle mucose intestinali. Pertanto, la presenza in eccesso di tale acido nel lume, può compromettere la funzione di barriera naturale dell'epitelio alterandone la permeabilità e conseguentemente provocando un assorbimento maggiorato di ossalato. In particolare, il colon à ̈ il principale sito di assorbimento dell'ossalato con un intake del 3-5% in condizioni fisiologiche normali. Un eventuale riduzione dell'ossalato nel lumen intestinale potrebbe quindi potenzialmente ridurne l'assorbimento. Ciò comporterebbe, quindi, un abbassamento della concentrazione di ossalati nel plasma e nelle urine riducendone quindi la pericolosità .
Pertanto, à ̈ importante poter ridurre la quantità di ossalati nel lume intestinale, nel plasma e nelle urine in modo da evitare le complicazioni connesse con elevati valori di ossalati quali, ad esempio, l'iperossaluria, l'urolitiasi, l'insufficienza renale, le cardiomiopatie ed altri disordini cardiaci e i calcoli renali.
In particolare, Ã ̈ auspicabile poter ridurre i livelli di ossalato nelle urine di due tipologie di soggetti:
• Soggetti iperossalurici che non sono soggetti a diete ad alto contenuto di ossalati.
• Soggetti normoossalurici che sono soggetti a diete ad alto contenuto di ossalati.
La Richiedente ha dato risposta alle sopracitate necessità a seguito di un'intensa attività di ricerca al termine della quale ha individuato una selezione di ceppi di batteri appartenenti ai generi Lactobacillus e Bifidobacterium, detti ceppi presentano una spiccata capacità di degradare quantitativamente gli ossalati. I ceppi selezionati mostrano la capacita' di utilizzare l'ossalato come fonte di energia sottraendolo dall'ambiente in cui detto ossalato originariamente si trova .
Forma oggetto della presente invenzione un ceppo di batteri appartenenti ai generi Lactobacillus e Bifidobacterium avente l'abilità di degradare gli ossalati, come riportato nella unita rivendicazione indipendente .
Forma un altro oggetto della presente invenzione una composizione alimentare o un prodotto integratore o una composizione farmacaeutica contenente detti ceppi di batteri, come riportato nella unita rivendicazione indipendente.
Forme preferite della presente invenzione saranno riportate nella descrizione dettagliata che segue.
La figura 1 mostra il confronto tra il cromatogramma relativo al mezzo colturale contenente 5 mM di ossalato prima della purificazione SPE (A) e dopo (B)
La figura 2 mostra un cromatogramma relativo al mezzo colturale contenente 5 mM di ossalato (riferimento positivo) .
La figura 3 mostra un cromatogramma relativo al ceppo batterico B. breve BR03 DSM 16604.
La figura 4 mostra un cromatogramma relativo al ceppo batterico L. paracasei spp . paracasei LPC09 DSM 24243.
La Richiedente ha messo a punto una metodica per in grado di identificare e quantificare la capacità degradativa dell 'ossalato da aprte di colture di ceppi appartenenti ai generi Lactobacillus e Bifidobacterium.
La Richiedente ha trovato che i seguenti ceppi di batteri si sono dimostrati in grado di utilizzare gli ossalati quale fonte energetica:
(i) L. paracasei spp. paracasei LPC 09, depositato dalla Società Probiotical SpA di Novara (Italia) in data 23.11.2010 con numero di deposito DSM 24243.
(ii) L. gasseri LGS 01, depositato dalla Società Probiotical SpA di Novara (Italia) in data 24.05.2006 con numero di deposito DSM 18299.
(iii) L. gasseri LGS 02, depositato dalla Società Probiotical SpA di Novara (Italia) in data 24.05.2006 con numero di deposito DSM 18300.
(iv) L. acidophilus LA 07, depositato dalla Società Probiotical SpA di Novara (Italia) in data 23.11.2010 con numero di deposito DSM 24303.
(v) L. acidophilus LA 02, depositato dalla Società Probiotical SpA di Novara (Italia) in data 06.08.2008 con numero di deposito DSM 21717.
(vi) L. plantarum LP 01, depositato dalla Società Mofin Srl di Novara (Italia) in data 16.10.2001 con numero di deposito LMG-P-21021, presso l'Istituto di Deposito BCCM-LMG (Belgio).
(vii) L. reuteri LRE 03, depositato dalla Società Probiotical SpA di Novara (Italia) in data 05.08.2010 con numero di deposito DSM 23879.
(vili) L. reuteri LRE 02, depositato dalla Società Probiotical SpA di Novara (Italia) in data 05.08.2010 con numero di deposito DSM 23878.
(ix) B. breve BR 03, depositato dalla Società Probiotical SpA di Novara (Italia) in data 16.07.2004 con numero di deposito DSM 16604.
(x) B. longum BL 03, depositato dalla Società Probiotical SpA di Novara (Italia) in data 20.07.20004 con numero di deposito DSM 16603.
(xi) L. rhamnosus GG, ATCC 53103 disponibile presso la collezione pubblica ATCC.
(xii) L. reuteri LRE 04, depositato dalla Società Probiotical SpA di Novara (Italia) in data 05.08.2010 con numero di deposito DSM 23880.
(xiii) L. rhamnosus LR 06, depositato dalla Società Probiotical SpA di Novara (Italia) in data 14.11.2008 con numero di deposito DSM 21981.
(xiv) B. lactìs BA 05, depositato dalla Società Probiotical SpA di Novara (Italia) in data 15.06.2006 con numero di deposito DSM 18352.
(xv) L. casei spp. rhamnosus LR 04, depositato dalla Società Probiotical SpA di Novara (Italia) in data 20.07.2004 con numero di deposito DSM 16605.
In una realizzazione preferita, la composizione comprende o alternativamente consiste di almeno un ceppo scelto tra quelli sopra indicati da (i) a (xv), preferibilmente i ceppi sono scelti tra quelli indicati sopra da (i) a (viii).
Nel contesto della presente invenzione per "ceppo di batteri" si intendono le cellule vive e/o morte e/o loro parti e/o loro componenti/derivati e/o loro enzimi.
In una realizzazione preferita, la composizione comprende o alternativamente consiste di almeno due ceppi scelti tra quelli sopra indicati da (i) a (xv), preferibilmente i ceppi sono scelti tra quelli indicati sopra da (i) a (viii).
In una realizzazione preferita, la composizione comprende o alternativamente consiste di almeno due ceppi scelti tra quelli sopra indicati da (i) a (v).
In una realizzazione preferita, la composizione comprende o alternativamente consiste di:
(a) L. paracasei spp . paracasei LPC 09 -DSM 24243. (b) L. paracasei spp. paracasei LPC 09 -DSM 24243 e L. gasseri LGS 01 -DSM 18299.
(c) L. paracasei spp. paracasei LPC 09 -DSM 24243, L.
gasseri LGS 01 -DSM 18299 e L. gasseri LGS 02 -DSM 18300.
(d) L. paracasei spp. paracasei LPC 09 -DSM 24243, L.
gasseri LGS 01 -DSM 18299, L. gasseri LGS 02 -DSM 18300 e L. acidophilus LA 07 -DSM 24303.
(e) L. paracasei spp. paracasei LPC 09 -DSM 24243, L.
gasseri LGS 01 -DSM 18299, L. gasseri LGS 02 -DSM 18300, L. acidophilus LA 07 -DSM 24303 e L. acidophilus LA 02 -DSM 21717.
Parte sperimentale
1. Ceppi batterici analizzati
Sono stati studiati circa 70 ceppi provenienti dalla
ceppoteca interna della Società Probiotical SpA di
Novara, da collezioni internazionali quale, ad esempio
DSMZ -Germania e da letteratura, appartenenti al genere
Bifidobacterium e Lactobacillus . I ceppi selezionati
sono riportati in Tabella 1 che riporta la percentuale di
degradazione dell'ossalato da parte dei ceppi batterici
testati. La sperimentazione à ̈ stata condotta in mezzo
colturale contenente 5 mM di ammonio ossalato.
Tabella 1
N. Deposito Specie/ceppo
Degradazione DSM 24243 L. paracasei LPC 09 73,50 DSM 18299 L. gasseri LGS 01 73,40 DSM 18300 L. gasseri LGS 02 71,20 DSM 24303 L. acidophilus LA 07 59,25 DSM21717 L. acidophilus LA 02 56,35 LMG P-21021 L. plantarum LP 01 40,31 DSM 23879 L. reuteri LRE 03 33,86 DSM 23878 L. reuteri LRE 02 31,42 DSM 16604 B. breve BR 03 28,16 DSM 16603 B. longum BL 03 25,29 ATCC 53103 L. rhamnosus GG 23,59 DSM 23880 L. reuteri LRE 04 16,79 DSM 21981 L. rhamnosus LR 06 15,70 DSM 18352 B. lactis BA 05 15,45 DSM 16605 L. rhamnosus LR 04 12,89
I ceppi di batteri riportati in Tabella 1 da (i) a (v), da
(vii) a (x) e da (xii) a (xv) sono stati depositati dalla
Società ' Probiotical SpA di Novara (Italia). Il ceppo (vi) e"stato depositato dalla Società ' Mofin Srl di Novara (Italia). Il ceppo (xi) e' disponibile da collezione ATCC. Tutti i ceppi sono disponibili e accessibili al pubblico alle condizioni stabile dal Trattato di Budapest.
2.Condizioni culturali adottate
La preparazione dei ceppi da sottoporre all'analisi à ̈ consistita in una serie di tre subcolture sequenziali in MRS brodo (+1% cys-HCl, anaerobiosi, per i bifidi) incubate a 37 °C fino a sviluppo adeguato. Questa
strategia colturale permette la completa attivazione del ceppo. Successivamente i ceppi sono stati inoculati alla medesima percentuale di inoculo (2%) in un terreno
sperimentale, opportunamente studiato per assicurare la massima crescita di lattobacilli e bifidobatteri , addizionato di 5mM di ammonio ossalato (quantità media di assunzione giornaliera di acido ossalico). Le colture così preparate sono state incubate per 24 ore a 37° C.
3, Purificazione dei campioni tramite SPE (Solid Phase Extraction)
Al termine del periodo di incubazione, le brodocolture sono state quindi centrifugate ed il surnatante filtrato 0.22 Î1⁄4τη. Tali campioni iniettati in HPLC hanno messo in
luce un profilo cromatografico poco chiaro. In particolare il picco cromatografico dell'acido ossalico appariva sovrapposto a quello del glucosio presente nei campioni . Per ovviare al suddetto problema i campioni sono stati purificati utilizzando colonnine SPE (solid phase extraction) specifiche per gli acidi organici.
Il protocollo di purificazione tramite colonne SPE ha richiesto una fase di ottimizzazione per ottenere la migliore resa finale. In particolare sono stati testati differenti reattivi in relazione alla fase di condizionamento della colonna e di eluizione finale dell 'analita. Tale purificazione su fase solida ha permesso di ottenere un picco cromatografico dell'acido ossalico nettamente più pulito come si può constatare nella figura 1 A-B. Il protocollo utilizzato à ̈ stato il seguente :
Tipo di colonna SPE: Phenomenex Strata-XA Attivazione: 1 mi di metanolo
Condizionamento: 2 mi di sodio formiato 20 mM Caricamento campione: 1 mi di campione
Lavaggio delle impurezze: 1 mi acetato di ammonio 25 mM 1 mi di metanolo
Eluizione: 2x500 Î1⁄4l di Hcl 1 M 2x500 Î1⁄4Î di HCl 3 M
4. Analisi HPLC
La quantità di ossalato degradato da ogni singolo ceppo à ̈ stata calcolata analizzando, tramite HPLC, facendo la differenza tra la concentrazione di ossalato presente nel mezzo colturale (5 mM) a TO (prima della fermentazione) e la concentrazione residua dopo crescita del microorganismo. Considerata 100 la concentrazione di ossalato a TO, i risultati dei singoli ceppi sono espressi in percentuale. Ad esempio il risultato del ceppo L. paracasei spp . paracasei LPC 09 DSM 24243 pari a circa 70% indica che lo stesso à ̈ stato in grado di utilizzare una quantità di ossalato pari a circa 3,5 mM di ossalato (70% di 5 mM). Il protocollo HPLC utilizzato à ̈ stato il seguente:
Tipo di colonna: Phenomenex Hydro-RP 250 x 4.6 mm
Tipo di detector: Uv-Vis con lettura a 220 nm
Flusso di eluizione: 0.7 ml/min
Volume di iniezione: 20 Î1⁄4l
Temperatura colonna: 30°C
Tipo di eluizione: isocratica
Fase mobile: 20 mM Potassio fosfato pH 2.0
I ceppi di batteri appartenenti al genere Lactobacillus che hanno mostrato un'elevata attività di degradazione nei confronti dell'acido ossalico sono quelli indicati sopra da (i) a (v).
Claims (10)
- RIVENDICAZIONI 1 . Un ceppo di batteri appartenente al genere Lactobacillus avente la capacità di utilizzare l'ossalato come fonte di energia, detta capacità essendo maggiore del 50%.
- 2. Il ceppo secondo la rivendicazione 1, in cui detta capacità à ̈ maggiore del 60%; preferibilmente à ̈ maggiore del 70%.
- 3. Il ceppo secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui detto ceppo appartiene alla specie Lactobacillus paracasei; preferibilmente detto ceppo à ̈ il L. paracasei spp . paracasei LPC 09 DSM 24243.
- 4. Il ceppo secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui detto ceppo appartiene alla specie Lactobacillus gasseri; preferibilmente detto ceppo à ̈ scelto nel gruppo comprendente il L. gasseri LGS 01 DSM 18299 e il L. gasseri LGS 02 DSM 18300.
- 5. Il ceppo secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui detto ceppo appartiene alla specie Lactobacillus acidophilus ; preferibilmente detto ceppo à ̈ scelto nel gruppo comprendente il L. acidophilus LA02 DSM 21717 e L. acidophilus LA 07 DSM 24303.
- 6. Una composizione comprendente una composizione batterica, detta composizione batterica comprende almeno un ceppo di batteri secondo una delle rivendicazioni 1-5, per uso nel trattamento dell 'iperossaluria , dell'urolitiasi, dell'insufficienza renale, delle cardiopatie e dei calcoli renali.
- 7. La composizione per uso secondo la rivendicazione 6, in cui detta composizione batterica comprende il L. paracasei spp. paracasei LPC 09 DSM 24243.
- 8. La composizione per uso secondo la rivendicazione 7, in cui detta composizione batterica inoltre comprende il L. acidophilus LA02 DSM 21717 e L. acidophilus LA 07 DSM 24303 .
- 9 . La composizione per uso secondo una delle rivendicazioni 6-8, in cui detta composizione batterica à ̈ costituita da L. paracasei spp. paracasei LPC 09 DSM 24243, L. acidophilus LA02 DSM 21717 e L. acidophilus LA 07 DSM 24303.
- 10. La composizione per uso secondo una delle rivendicazioni 6-9, in cui detta composizione à ̈ una composizione alimentare o un prodotto integratore o una composizione farmaceutica.
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