IT201800005355A1 - Lactobacillus amylovorus SGL 14: attività probiotiche e riduzione dell’ossalato enterico - Google Patents
Lactobacillus amylovorus SGL 14: attività probiotiche e riduzione dell’ossalato enterico Download PDFInfo
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Classifications
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Description
Descrizione dell’invenzione industriale dal titolo:
Lactobacillus amylovorus SGL 14: attività probiotiche e riduzione dell’ossalato enterico
DESCRIZIONE
CAMPO DELL’INVENZIONE
La presente invenzione concerne un ceppo batterico con attività probiotica avente la capacità di ridurre le quantità di ossalato enterico. Vengono altresì descritte composizioni comprendenti tale ceppo batterico ed il loro uso alimentare e come medicamento.
STATO DELLA TECNICA
I probiotici sono microrganismi viventi in grado di apportare proprietà benefiche all’organismo, se inseriti nell’alimentazione in quantità adeguate. Un organismo per poter essere considerato “probiotico” deve poter disporre di studi scientifici che ne accertino da un lato la sicurezza per l’impiego nell’uomo e dall’altro la presenza di proprietà quali la resistenza all’aggressione dei succhi gastrici, pancreatici e biliari e la capacità di aderire fermamente alla mucosa intestinale colonizzandola.
I batteri lattici (LAB, Lactic Acid Bacteria), per la maggior parte rappresentati da lactobacilli e bifidobatteri, sono i più comuni tipi di microrganismi probiotici.
Tali microrganismi possono espletare il loro effetto a livello dell’organismo ospite direttamente o indirettamente, modulando l’ecosistema endogeno o la risposta immunitaria. Alcuni probiotici invece possono agire rinforzando la barriera intestinale in modo diretto, prevenendo la permeabilità e la conseguente perdita di macromolecole, che si osservano nelle infezioni intestinali e nelle intolleranze alimentari, oppure esercitando un’azione trofica sulla mucosa del colon o proteggendo il muco che riveste la parete intestinale. Altre specie ancora intervengono sulla barriera intestinale indirettamente, stimolando il sistema immunitario intestinale o Gut Associated Lymphoid Tissue (GALT), che costituisce una barriera di difesa immunitaria per l’organismo. In particolare i probiotici sono coadiuvanti della flora batterica endogena garantendo lo sviluppo delle cellule che producono IgA e dei linfociti epiteliali intestinali, nonché modulando la produzione di IgE ed interleuchine. Ricerche di base hanno anche dimostrato che i probiotici possono agire inibendo la sintesi di alcuni mediatori dell’infiammazione.
Recentemente gli studi in merito ai probiotici si sono focalizzati sulle loro proprietà benefiche indirizzate verso condizioni terapeutiche ben definite: attività ipocolesterolizzante, attività antistress, attività modulante nelle dermatiti…
L’applicazione che è stata già in parte studiata e chiarita è il ruolo dei lattobacilli nella riduzione dell’ossalato enterico. Infatti a livello intestinale essi sono in grado di consumare i Sali di ossalato ingeriti con la dieta e ridurne l’assorbimento, agendo preventivamente sull’insorgenza di patologie renali quali iperossaluria, litiasi e calcolosi.
L’accumulo di ossalato nell’uomo avviene su due livelli: produzione metabolica endogena a carico del sistema epatico e assorbimento dell’ossalato dalla dieta nel tratto gastrointestinale. Uno squilibrio tra produzione/assorbimento e escrezione può portare all’iperossaluria, che a sua volta è il fattore di rischio primario per la comparsa dei calcoli renali. Ad oggi non ci sono trattamenti farmacologici dedicati: si cerca di bilanciare la dieta in modo da ridurre al massimo l’assunzione di ossalato in modo da prevenirne la comparsa e in presenza di calcolosi renale si passa alle pratiche chirurgiche di rimozione dei calcoli stessi. Anche in questo caso il problema si ripresenta con frequenti recidive fino al 50% dei pazienti trattati.
Negli ultimi anni è emerso il ruolo cruciale del microbiota intestinale come fattore che influenza l’omeostasi intestinale di sali di ossalato. L’assenza di microrganismi ossalato-degradatori è sempre associata alla patologia e la manipolazione della composizione della microflora è stato proposto come approccio terapeutico di prevenzione e mantenimento.
Anche gli estratti vegetali sono stati studiati al fine di sfruttare le loro proprietà terapeutiche in questo ambito e gli effetti benefici del Phyllanto niruri sono stati dimostrati sul processo di formazione e sulla morfologia dei calcoli renali.
Scopo della presente invenzione è pertanto quello di fornire un ceppo batterico avente attività probiotica con attività di riduzione dell’ossalato enterico, permettendo dunque di evitare la necessità di intervento chirurgico e di utilizzo eccessivo di farmaci.
SOMMARIO DELL’INVENZIONE
L’invenzione pertanto concerne un ceppo batterico appartenente alla specie Lactobacillus amylovorus, in cui detto ceppo è L. amylovorus SGL 14 depositato con il numero di accesso DSM 27014 in data 18/03/2013 presso il Centro Internazionale di deposito Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH.
Il ceppo L. amylovorus SGL 14 DSM 27014, è stato depositato a nome di MD’E srl, via Nazionale 339, Castelnuovo Vomano (TE) 64020 Italia, che insieme a Sintal Dietetics fa parte della medesima rete di imprese.
Sotto un ulteriore aspetto l’invenzione concerne una composizione comprendente il ceppo batterico L. amylovorus SGL 14, opzionalmente addizionata di eccipienti farmacologicamente accettabili.
L’invenzione concerne ulteriormente una composizione comprendente il ceppo batterico L. amylovorus SGL 14, e un estratto vegetale di Phyllanto niruri opzionalmente addizionata di eccipienti farmacologicamente accettabili.
In un ulteriore aspetto l’invenzione riguarda una composizione comprendente il ceppo batterico L. amylovorus SGL 14, e il ceppo batterico L. gasseri SGL 18 depositato con il numero di accesso DSM 32802 in data 20 Aprile 2018 presso il Centro Internazionale di deposito Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH opzionalmente addizionata di eccipienti farmacologicamente accettabili.
Sotto un ulteriore aspetto l’invenzione concerne la composizione comprendente il ceppo batterico L. amylovorus SGL 14, per l’uso come medicamento.
In particolare detto medicamento è per l’uso nel trattamento e nella prevenzione delle calcolosi scelte dal gruppo consistente in: calcolosi renale, calcolosi biliare e calcolosi della cistifellea e per l’uso nel trattamento e nella prevenzione delle iperossalurie e delle litiasi.
La presente invenzione concerne ulteriormente la composizione comprendente il ceppo batterico L. amylovorus SGL 14, la composizione comprendente il ceppo batterico L. amylovorus SGL 14, un estratto vegetale di Phyllanto niruri e la composizione comprendente il ceppo batterico L. amylovorus SGL 14 e il ceppo batterico L. gasseri SGL 18 depositato con il numero di accesso DSM 32802 in data 20 Aprile 2018 per l’uso alimentare.
In un ulteriore aspetto l’invenzione riguarda il ceppo batterico L. gasseri SGL 18 depositato con il numero di accesso DSM 32802 in data 20 aprile 2018 presso il Centro Internazionale di deposito Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH. Il ceppo L. gasseri SGL 18 DSM 32802, è stato depositato a nome di MD’E srl, via Nazionale 339, Castelnuovo Vomano (TE) 64020 Italia, che insieme a Sintal Dietetics fa parte della medesima rete di imprese.
DESCRIZIONE DELLE FIGURE
L’invenzione verrà ora descritta in dettaglio e facendo riferimento alle Figure allegate in cui:
la Figura 1 riporta il grafico dei risultati ottenuti dalle misure della concentrazione di ossalato nei terreni di coltura riportati nella tabella 6 e descritti nell’esempio 5; la Figura 2A e 2B riportano i grafici dei risultati mostrando sia i valori di mM di ossalato consumati nei 27 giorni di monitoraggio che i valori percentuali derivati descritti nell’esempio 5.
la Figura 3 riporta il grafico relativo al calo dell’ossalato urinario in modelli animali trattati con un prototipo di integratore composto dall’associazione di L. amylovorus SGL 14 e estratto secco di Phyllanto niruri. Il grafico riporta 4 curve in cui: la curva 1 corrisponde al gruppo di controllo negativo alimentato con dieta normale, la curva 2 al gruppo test tossicità alimentato con dieta normale e prototipo integratore ad alto dosaggio, la curva 3 al gruppo di controllo positivo alimentato con dieta high-ox e la curva 4 al gruppo test efficacia alimentato con dieta high-ox, con l’aggiunta del prototipo integratore ad alto dosaggio.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL’INVENZIONE
L’invenzione pertanto concerne un ceppo batterico appartenente alla specie Lactobacillus amylovorus, in cui detto ceppo è L. amylovorus SGL 14 depositato con il numero di accesso DSM 27014 in data 18/03/2013 presso il Centro Internazionale di deposito Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH.
Vantaggiosamente gli inventori hanno dimostrato che il ceppo L. amylovorus SGL 14 ha attività probiotica e apporta beneficio all’organismo. In particolare detto ceppo permette la riduzione dell’ossalato enterico, favorendo l’omeostasi intestinale di sali di ossalato, prevendendo l’accumulo e la formazione di calcoli renali.
Nella presente invenzione quando si impiega la definizione:
- “probiotico” o “attività probiotica” si intende un microorganismo vivo, non patogeno, presente negli alimenti o aggiunti ad essi che, somministrato in quantità adeguata, apporta un beneficio alla salute dell'ospite. I batteri lattici (LAB, Lactic Acid Bacteria), per la maggior parte rappresentati dai lactobacilli, e i bifidobatteri sono i più comuni tipi di microrganismi probiotici.
Sotto un ulteriore aspetto l’invenzione concerne una composizione comprendente il ceppo batterico L. amylovorus SGL 14, opzionalmente addizionata di eccipienti farmacologicamente accettabili.
Il ceppo batterico L. amylovorus SGL 14 viene vantaggiosamente preparato sotto forma di composizione. Idonee composizioni possono essere in forma di polveri, capsule, compresse, granulato, gocce e sciroppi, chewing gum. I range di utilizzo del fermento vanno da 1 miliardo/dose a 20 miliardi/dose, preferibilmente tale range va da 200 miliardi/dose a 20 miliardi/dose, più preferibilmente da 50 miliardi/dose a 40 miliardi/dose.
L’invenzione concerne ulteriormente una composizione comprendente il ceppo batterico L. amylovorus SGL 14, e un estratto vegetale di Phyllanto niruri opzionalmente addizionata di eccipienti farmacologicamente accettabili. Le possibili composizioni possono essere: semplici polveri premiscelate, forme farmaceutiche finite: capsule, compresse, bustine, gocce e sciroppi, chewing gum. I range di utilizzo del fermento vanno da 1 miliardo/dose a 20 miliardi/dose per il fermento e da 0.5 g/dose a 10 g/dose per l’estratto di Phyllanto niruri.
In un ulteriore aspetto l’invenzione riguarda una composizione comprendente il ceppo batterico L. amylovorus SGL 14, e il ceppo batterico L. gasseri SGL 18 depositato con il numero di accesso DSM 32802 in data 20 aprile 2018 presso il Centro Internazionale di deposito Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH opzionalmente addizionata di eccipienti farmacologicamente accettabili.
La presente invenzione concerne ulteriormente la composizione comprendente il ceppo batterico L. amylovorus SGL 14, la composizione comprendente il ceppo batterico L. amylovorus SGL 14, un estratto vegetale di Phyllanto niruri e la composizione comprendente il ceppo batterico L. amylovorus SGL 14 e il ceppo batterico L. gasseri SGL 18 depositato con il numero di accesso DSM 32802 in data 20 Aprile 2018 per l’uso alimentare.
La presente invenzione concerne una bevanda contenete la composizione comprendente il ceppo batterico L. amylovorus SGL 14, la composizione comprendente il ceppo batterico L. amylovorus SGL 14, un estratto vegetale di Phyllanto niruri e la composizione comprendente il ceppo batterico L. amylovorus SGL 14 e il ceppo batterico L. gasseri SGL 18 depositato con il numero di accesso DSM 32802. Preferibilmente detta bevanda è un succo di frutta, caffè, tè e un soft drink.
Vantaggiosamente la composizione comprendente:
- il ceppo batterico L. amylovorus SGL 14;
- il ceppo batterico L. amylovorus SGL 14 e un estratto vegetale di Phyllanto niruri; - il ceppo batterico L. amylovorus SGL 14 e il ceppo batterico L. gasseri SGL 18; e - il ceppo batterico L. amylovorus SGL 14, un estratto vegetale di Phyllanto niruri e il ceppo batterico L. gasseri SGL 18, hanno attività probiotica.
Le composizioni secondo l’invenzione possono essere in forma solida o liquida. Nelle composizioni secondo la presente invenzione i dosaggi sono in un range che va da 1 miliardo/dose a 20 miliardi/dose per i fermenti, preferibilmente tale range va da 200 miliardi/dose a 20 miliardi/dose, più preferibilmente da 50 miliardi/dose a 40 miliardi/dose, SGL 14 e SGL 18, e in un range che va a da 0.5 g/dose a 10 g/dose per l’estratto di Phyllanto niruri.
Idonee composizioni possono essere in forma di polveri, capsule, compresse, granulati, gocce e sciroppi, chewing gum. Sotto un ulteriore aspetto, l’invenzione concerne la composizione comprendente il ceppo batterico L. amylovorus SGL 14, per l’uso come medicamento.
In particolare detto medicamento è per l’uso nel trattamento e nella prevenzione delle calcolosi scelte dal gruppo consistente in: calcolosi renale, calcolosi biliare e calcolosi della cistifellea e per l’uso nel trattamento delle iperossalurie, condizione clinica in cui vi è un'aumentata escrezione urinaria di ossalato di calcio che può portare alla formazione di calcoli renali, e delle litiasi.
Le composizioni secondo la presente invenzione hanno sorprendente attività nel trattamento delle calcolosi e delle litiasi, che richiedono molto spesso interventi chirurgici e/o trattamenti farmacologici. Mediante l’uso del ceppo batterico secondo la presente invenzione si possono prevenire e trattare queste patologie in modo più naturale.
In un ulteriore aspetto l’invenzione riguarda il ceppo batterico L. gasseri SGL 18 depositato con il numero di accesso DSM 32802 in data 20 aprile 2018 presso il Centro Internazionale di deposito Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH.
Si riportano di seguito Esempi di realizzazione della presente invenzione forniti a titolo illustrativo.
ESEMPI
Esempio 1
Isolamento del ceppo
Il ceppo è stato isolato da feci a partire da feci di maiale in condizioni di salute su MRS in condizioni di anaerobiosi a 37°C per 48 ore. Le colonie di L. amylovorus SGL 14 risultano di colore bianco crema, non troppo piccole con aspetto stellato. La morfologia del microrganismo al microscopio può essere descritta come microrganismi a forma di bastoncino di media lunghezza, regolari tra loro, piuttosto spesso.
Materiali e metodi
Il ceppo di L. amylovorus SGL 14 è stato isolato a partire da feci di animale in condizioni di salute.
Inizialmente è stata preparata una sospensione di feci fresche omogeneizzate in terreno complesso de Man, Rogosa and Sharpe (MRS) broth (Oxoid, Basingstoke, UK) al 50% addizionato dello 0.05% di L-cisteina come agente riducente. Dopo incubazione dei campioni a 37°C per 30 minuti, si è passati all’isolamento in terreno MRS.
Esempio 2
Identificazione tassonomica: Caratterizzazione molecolare
Il ceppi di lattobacilli selezionati mediante isolamento con il terreno MRS sono stati classificati tassonomicamente inequivocabilmente mediante lo studio dell’intero gene 16S; una regione lunga circa 1500 bp è stata amplificata con primer generici per eubatteri, sequenziata e poi allineata mediante BLAST con banche dati pubbliche. I risultati hanno permesso la classificazione certa del ceppo con la sua ascrizione alla specie Lactobacillus amylovorus. A supporto ed identificazione del ceppo si sono aggiunti i risultati di Maldi Tof di seguito mostrati.
Il ceppo di L. amylovorus SGL 14 è stato depositato presso la collezione internazionale europea DSMZ, struttura che possiede lo status di IDA (International Depositary Authority), con un “patent deposit” avente i seguenti dati: L. amylovorus SGL 14 DSM 27014 in data 18/03/2013.
Materiali e metodi
Identificazione tassonomica
Il ceppo isolato è stato identificato inizialmente mediante crescita su terreno MRS come descritto nell’Esempio 1 e osservazione diretta della morfologia delle colonie cresciute in piastra e della morfologia cellulare in seguito ad osservazione al microscopio ottico.
L’attribuzione certa del genere e della specie è stata effettuata invece mediante tecniche di analisi del DNA ribosomiale 16S e caratterizzazione biochimica.
Analisi della sequenza 16S
Il genoma del microrganismo è stato estratto mediante kit commerciali (Macherey Nagel, Düren, Germania seguendo quanto indicato dalla ditta produttrice. Il DNA è stato utilizzato nella concentrazione di 50-100 ng per la reazione di amplificazione del gene 16S. Le reazioni di amplificazione sono state effettuate con il termociclatore Biometra T-professional (Biometra, Göttingen, Germania). Le condizioni di amplificazione usate sono state quelle che hanno dato le migliori rese di amplificato. Tutte le reazioni sono state condotte in un volume finale di 25 l. I componenti utilizzati in tutte le reazioni di amplificazione sono:
• DyNAzyme (Finnzymes, Espoo, Finland) come DNA polimerasi termostabile (1 U per reazione) e il suo tampone di reazione 10× Optimized DyNAzyme buffer (100 mM Tris-HCl, 500 mM KCl, 15 mM MgCl2, 0,1% Triton X-100, pH 8,8 a 25°C);
• miscela di nucleotidi trifosfato (8 mM, Euroclone, Siziano, Italy).
• set di primer (100 M, Eurofins MWG Operon, Ebersberg, Germany);
• DNA genomico;
• acqua sterile.
Di seguito sono riportati i primer utilizzati, il termociclo e l’amplicone atteso.
Primer: 16S-27 For 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ SEQ ID NO:1
16-1552 Rev 5’-AAGGAGGTGWTCARCCGCA-3’ SEQ ID NO:2
Termociclo: 95°C 5’
Amplicone: 1552 bp
Il frammento di circa 1550 bp è stato sequenziato (MWG Biotech, Ebersberg, Germany) ed è stato allineato con la banca dati di Blast (NCBI, nucleotide blast) per ottenere la corretta identificazione della specie.
Profilo del ceppo in MALDI-TOF MS
Per ottenere un profilo di Maldi Tof identificativo il campione è stato così preparato: una coltura batterica di L. amylovorus SGL 14 cresciuta overnight è stata raccolta in modo da avere un quantitativo di cellule sufficienti alla rilevazione (5 miliardi). Il pellet cellulare è stato lavato con soluzione fisiologica per rimuovere residui di terreno fermentato e risospeso in 300 µl di acqua distillata e 900 µl di etanolo puro. La sospensione è stata ben omogenizzata. Il campione è stato poi centrifugato a 13.000 rpm per 2 min e seccato all’aria dopo aver rimosso il surnatante. Il campione è stato conservato a -20°C in attesa dell’analisi.
Al momento dell’analisi il campione è stato risospeso con 50 µl di acido formico al 70%. Dopo risospensione sono stati aggiunti altri 50 µl di acetonitrile e il tutto è stato mescolato vigorosamente. Il campione è stato così centrifugato per 2 min una centrifuga da tavolo a 13.000 rpm.1 µl del surnatante è stato posto al centro di uno spot di un target plate monouso e fatto asciugare all’aria. L’aggiunta di 1µl di matrice realizzata in materiali organici (acido -ciano-4-idrossicinnamico) ha determinato l’avvio dell’analisi in Maldi Tof.
Il Maldi Tof MS è stato effettuato con un sistema MicroFlex LT usando le condizioni indicate dal manuale d’uso. Gli ioni generati laser ad azoto alla lunghezza d’onda di 337 nm sono stati catturati in maniera lineare in un range di massa da 2 a 20 KDa Lo strumento è collegato al software Biotyper 2.0(Bruker Daltonics) in grado di acquisire i dati in arrivo, elaborarli in spettri di massa e confrontarli con spettri di riferimento presenti nel database interno (3.740 spettri di 319 generi e 1.946 specie diverse). Per ogni plate da 24 campioni uno standard test è stato incluso per calibrare e validare l’analisi.
Il grado di corrispondenza con lo spettro tipico di ogni microrganismo presente nel database determina l’attribuzione di un cosiddetto “score value” che esprime il grado di certezza con cui viene proposta l’identificazione per la specie in esame. Score con valore superiore a 2,000 sono considerati affidabili nell’identificazione a livello di specie, valori compresi tra 1,700 e 1,900 danno un’identificazione certa a livello di genere.
Il ceppo è stato analizzato in triplo su 3 diverse colture batteriche.
Esempio 3:
Identificazione tassonomica: Caratterizzazione biochimica
Il ceppo di L. amylovorus SGL 14 è stato analizzato anche sul profilo biochimico mediante colorazione di Gram, test dell’ossidasi, test della catalasi e sistema API 50CH.
I risultati ottenuti hanno confermato che: il ceppo è gram positivo, catalasi e ossidasi negativo e fermenta gli zuccheri secondo il profilo sotto riportato.
Tabella 1:
Materiali e metodi
Colorazione di Gram
La colorazione di Gram è un tipo di colorazione differenziale che permette di classificare i batteri in Gram-positivi e Gram-negativi.
Questo test d’identificazione, che è stato realizzato mediante il Gram Color Kit (Liofilchem, Teramo, Italia), è suddiviso in 4 step, intervallati da lavaggi con acqua distillata, ognuno dei quali prevede il trattamento con un particolare reagente che è stato lasciato agire per circa 1 min su un’ansata di cellule prelevate da una coltura su terreno solido, stemperata con una goccia d’acqua sterile su un vetrino, e fissata a calore con un becco Bunsen.
I reagenti utilizzati in ordine di applicazione sono:
• cristalvioletto,
• liquido di Lugol,
• soluzione decolorante (alcool etilico),
• safranina.
Alla fine, i batteri Gram-positivi appaiono colore violetto, mentre i Gram-negativi rosso o rosa.
Profilo fermentazione degli zuccheri (API)
Per la caratterizzazione biochimica di L. amylovorus SGL 14 è stata utilizzata la galleria API 50 CH con il terreno di inoculo API 50 CHL (BioMérieux, Milano, Italy). La galleria è composta da 50 microprovette contenenti substrati disidratati per la rilevazione dell’attività enzimatica e della fermentazione degli zuccheri. La sospensione batterica con una torbidità di 2 McFarland è stata distribuita nelle microprovette, e l’anaerobiosi è stata ottenuta ricoprendole con olio di paraffina sterile. Il metabolismo del substrato ad opera del batterio durante il periodo di incubazione a 37°C è evidenziato da un viraggio cromatico del terreno in seguito all’acidificazione del mezzo. La lettura delle reazioni è stata effettuata sulla base di una tabella di lettura, dove sono stati registrati i risultati, e l’identificazione è stata eseguita utilizzando un software informatico (www.apiweb.biomerieux.com).
Saggio della catalasi
Tale saggio serve a verificare la presenza dell’enzima catalasi, in grado di detossificare il perossido di idrogeno, in una coltura batterica.
Un’ansata di cellule prelevate da una coltura su terreno solido è stata stemperata in una goccia di perossido d’idrogeno al 30%, l’immediata comparsa di effervescenza è indice della presenza di catalasi.
L’effervescenza è dovuta all’ossigeno che si sviluppa nella reazione:
Il saggio dell’ossidasi
Il saggio dell’ossidasi è un test enzimatico utilizzato per individuare la presenza nei batteri dell’enzima citocromo-ossidasi, quindi risulta positivo per i batteri aerobi e anaerobi facoltativi. Sono stati utilizzati gli Oxidase Test Discs (Liofilchem, Teramo, italia), ovvero dischi di carta di 3 mm di diametro imbibiti con tetrametil-pfenilendiammina cloridrato (reattivo di Kovacs). Il disco è stato inumidito con 2 gocce di acqua distillata e strisciato con un’ansata di una colonia pura.
Lo sviluppo di una colorazione blu entro 30 secondi, dimostra l’ossidazione del substrato contenuto nel disco, quindi il microrganismo è ossidasi positivo, se invece non avviene alcun sviluppo di colore il microrganismo sarà ossidasi negativo.
Esempio 4
Tolleranza all’ambiente gastro-intestinale
Il microrganismo è stato testato al fine di assicurare il suo transito gastro-intestinale e garantire la sua sopravvivenza e il raggiungimento in piena vitalità della sezione intestinale dove deve esplicare l’attività fisiologica.
Tale ceppo è stato quindi saggiato nelle seguenti condizioni ambientali:
1. resistenza alla pepsina in ambiente acido
2. resistenza alla pancreatina in ambiente basico
3. resistenza ad alte concentrazioni su sali biliari
4. resistenza ad ambiente acido
5. resistenza ad elevate concentrazioni saline
L. amylovorus SGL 14 ha mostrato una buona tolleranza all’ambiente gastrointestinale. In particolare i risultati hanno evidenziato una buona percentuale di sopravvivenza dopo 1h e anche dopo 4h di incubazione in presenza di pancreatina a pH 8. Si osserva solo un leggero calo a 4 ore sia nel test che nel controllo indicando che l’effetto è dovuto al pH. Analoghi risultati sono stati ottenuti dopo 1 ora e 30 minuti e dopo 2 ore e 30 minuti di incubazione in presenza di pepsina a pH 3. Di seguito in Tabella 2 e 3 vengono riportati i risultati ottenuti.
Tabella 2:
Resistenza alla pepsina e alla pancreatina
Tabella 3:
Resistenza ai Sali biliari
Il microrganismo risente leggermente della presenza di sali biliari a concentrazioni superiori allo 0.5% (circa 2.5 volte superiori a quelle fisiologiche), mostrando comunque una buona sopravvivenza anche in presenza del 3%. Ciò lo rende idoneo all’utilizzo di probiotico.
Tabella 4:
L. amylovorus SGL 14 mostra una bassa tolleranza al pH acido, la sua sopravvivenza è compromessa a pH inferiore a 3. Ugualmente risente della presenza di NaCl nel terreno di coltura, la sua sopravvivenza è garantita fino al 2% di NaCl, a concentrazioni superiori il microrganismo cessa di crescere.
Materiali e metodi
Caratterizzazione delle caratteristiche probiotiche di L. amylovorus SGL 14 -Test di Resistenza al Tratto Gastrointestinale
Al fine di valutare la tolleranza ai succhi gastro-intestinali, è stata determinata la vitalità nel tempo mediante conteggio su piastra del ceppo isolato, dopo essere stato messo a contatto con:
• pepsina sintetica;
• pancreatina sintetica;
• diverse concentrazioni di sali biliari;
• diverse concentrazioni di NaCl;
• terreni di crescita a pH acido.
-Test di resistenza alla pepsina
La pepsin solution costituita da 3 g/L di pepsina derivata dalla membrana mucosa dello stomaco di maiale (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), è stata ottenuta solubilizzando la polvere in soluzione salina sterile allo 0.5% di NaCl (p/v), e il pH e stato aggiustato a 3. Partendo da colture sviluppate overnight in 10 ml di terreno MRS broth addizionato dello 0.05% di L-cisteina a 37°C per circa 18 ore, in presenza di O2, sono state raccolte circa 10<9>cellule/ml per centrifugazione a 4000 rpm per 10 minuti e, con lo stesso ciclo di centrifugazione, sono state lavate con una soluzione salina sterile allo 0.09% di NaCl (p/v).
Le cellule sono state poi lavate una seconda volta con la soluzione salina allo 0.09% (p/v) e, per simulare il passaggio attraverso il tratto gastrico, sono state risospese 10 ml di pepsin solution a pH3. La sospensione così preparata è stata incubata a 37°C in anaerobiosi per 2 ore, misurando il numero di CFU/ml a 0, 90 e 120 minuti, mediante conteggio in piastra.
Per monitorare la crescita in assenza degli enzimi, il ceppo in esame è stato inoculato in due soluzioni saline sterili allo 0.5% (p/v), una a pH 3 e incubato alle stesse condizioni, da utilizzare come controllo nei calcoli di resistenza.
La resistenza del ceppo trattato è stata espressa come percentuale di sopravvivenza rispetto al controllo.
-Test di resistenza alla pancreatina
La pancreatin solution costituita da1 g/L di pancreatina da pancreas di maiale (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), è stata ottenuta solubilizzando la polvere in soluzione salina sterile allo 0.5% di NaCl (p/v), e il pH è stato aggiustato a 8. Partendo da colture sviluppate overnight in 10 ml di terreno MRS broth addizionato dello 0.05% di L-cisteina, a 37°C per circa 18h, in presenza di O2, sono state raccolte circa 10<9>cellule/ml per centrifugazione a 4000 rpm per 10 min e, con lo stesso ciclo di centrifugazione, sono state lavate con una soluzione salina sterile allo 0.09% di NaCl (p/v).
Le cellule sono state poi neutralizzate mediante un lavaggio con tampone fosfato salino (PBS - 8 g/l NaCl, 0.2 g/L KCl, 1.44 g/L Na2HPO4, 0.24 g/L KH2PO4) a pH 7 sterile e, per simulare il passaggio attraverso l’intestino, sono state risospese in 10 ml di pancreatin solution pH 8. La sospensione è stata incubata a 37°C in anaerobiosi per 4 ore, facendo la stima del numero di CFU/ml a 0, 60 e 240 minuti mediante conteggio in piastra.
Per monitorare la crescita in assenza degli enzimi, il ceppo in esame è stato inoculato in due soluzioni saline sterili allo 0.5% (p/v), a pH 8 rispettivamente, e incubati alle stesse condizioni, da utilizzare come controllo nei calcoli di resistenza. La resistenza dei ceppi trattati è stata espressa come percentuale di sopravvivenza rispetto al controllo.
-Test di resistenza a sali biliari, pH e NaCl
L’analisi è stata effettuata su colture batteriche cresciute overnight. Sono state raccolte approssimativamente 10<9>cellule/ml per centrifugazione a 4000 rpm per 10 minuti. Le cellule sono state poi lavate con 2 ml di soluzione fisiologica sterile (NaCl 9g/l) e, dopo centrifugazione a 4000 rpm per 10 minuti, sono state risospese in MRS broth contenente:
• 0%, 0.5%, 1%, 2%, 3% di sali biliari (p/v);
• 0%, 2%, 6%, 10% di NaCl (p/v);
• pH 6.3, 3, 2, 1.5 aggiustato con HCl 4 N.
Le soluzioni sono state incubate a 37°C in anaerobiosi per 24h, per ogni inoculo la densità ottica a 600 nm è stata registrata a 0h, 2h e 24h, mentre la stima del numero di CFU/ml è stata effettuata a 0h e 24h, mediante conteggio in piastra.
Esempio 5
Profilo di resistenza agli antibiotici
Di seguito viene riportata una tabella che mostra il profilo di resistenza agli antibiotici testati sul ceppo L. amylovorus SGL 14, mediante l’utilizzo delle MIC Test Strip.
Tabella 5:
Materiali e metodi
Profilo di resistenza agli antibiotici
La sensibilità agli agenti antimicrobici del ceppo di L. amylovorus SGL 14 è stata saggiata mediante le MIC Test Strip (Liofilchem, Teramo, Italia), un metodo quantitativo per la determinazione della concentrazione minima inibente (MIC) di un singolo agente antimicrobico nei confronti dei microrganismi. Il kit è costituito da strisce di carta impregnate con un gradiente di concentrazioni predefinite dell’antibiotico, costituito da 15 diluizioni comprese nell’intervallo delle diluizioni usato nei metodi convenzionali per la determinazione della MIC.
Le colture in fase stazionaria sono state diluite in terreno MRD (Liofilchem) in modo da avere una torbidità pari allo standard McFarland 3. 100 µl di questa soluzione sono stati spatolati sulla superficie di terreno MRS agar addizionato dello 0.05% di L-cisteina in piastra, in modo da produrre una crescita omogenea. Dopo aver lasciato asciugare completamente la superficie dell’agar, la strip è stata depositata al centro della piastra con i valori di MIC rivolti verso l’alto. Le piastre così allestite sono state incubate con il coperchio rivolto verso l’alto a 37°C in anaerobiosi per 48 ore.
Quando la striscia del kit viene applicata sulla superficie inoculata del terreno agarizzato in piastra, il gradiente predefinito è rilasciato dalla striscia al terreno stesso, così, dopo l’incubazione, si può osservare una zona di inibizione ellittica, simmetrica e centrata lungo la striscia. Il valore di MIC, espresso in µg/ml, è stato letto nel punto di intersezione tra il bordo dell’ellisse di inibizione e la striscia di carta. Esempio 6
Adesione al monostrato di cellule intestinali
L’attività di adesione del ceppo L. amylovorus SGL 14 alla linea enterocitaria umana HT29 è stata valutata contando il numero di microrganismi adesi alle cellule HT29 tramite Real time PCR. Il risultato ottenuto è stato 2.39E+3/100 cellule HT29, pertanto L. amylovorus SGL 14 può essere considerato un ceppo mediamente adesivo (valore di riferimento adesione Salmonella 6.77E+5/100 cellule HT29 e 157 di E. coli B44/100 cellule HT29).
Materiali e metodi
Adesione al monostrato di cellule intestinali
Per valutare l’attività di adesione del ceppo L. amylovorus SGL 14 alla linea enterocitaria umana HT29, 1 x 10<8>cellule batteriche sono state addizionate ad un monostrato epiteliale di cellule HT29 (1.23 x 10<6>cellule) e incubate per 1,5 h. Al termine dell’incubazione, il monostrato cellulare è stato lavato per 4 volte e le cellule batteriche adese sono state quantificate mediante Real Time PCR, con l’utilizzo di primer genere-specifici.
Come controllo positivo sono stati utilizzati gli enteropatogeni aderenti Salmonella typhimurium e E. coli ETEC H10407, mentre come controllo negativo il ceppo non aderente E. coli B44.
Esempio 7
Valutazione dell’attività degradativa dell’ossalato in ceppi probiotici in vitro Utilizzando il kit diagnostico della Trinity Biotech per la valutazione della concentrazione dell’ossalato nelle urine, è stata messa a punto una metodica per la misura della concentrazione di ossalato nei terreni di coltura. I ceppi di Lactobacillus sono stati così sviluppati in presenza di ossalato di sodio 5 mM e dopo 5 giorni di incubazione è stata misurata la concentrazione di ossalato nei terreni colturali. Il terreno di coltura utilizzato è stato MRS poiché questi ceppi non erano in grado di sviluppare in un terreno, in cui l’ossalato fosse l’unica fonte di carbonio. I risultati ottenuti dalle misure della concentrazione di ossalato nei terreni di coltura sono riportati nella tabella 6 ed in Figura 1.
Tabella 6:
Il kit utilizzato per questo screening non rappresenta un metodo accurato e preciso per la determinazione dell’ossalato. Infatti nelle prove di recupero sono stati ottenute determinazioni di ossalato con valori di recupero dell’ossalato del 93%-107% rispetto alla quantità aggiunta al terreno, dimostrando quindi un errore piuttosto elevato di 15% circa. Questo errore comunque non invalida l’andamento degradativo evidenziato dallo screening fatto sui ceppi di Lactobacillus. I ceppi analizzati hanno dimostrato un diverso grado di metabolizzare l’ossalato e L. amylovorus SGL 14 era il più efficace, presentando una degradazione di circa il 99,79% dell’ossalato aggiunto al terreno (tabella). Essendo questo ceppo di grande interesse industriale abbiamo ritenuto opportuno sceglierlo per gli studi successivi e caratterizzarlo mediante tecnica HPLC in una curva che descriva il consumo di ossalato nel tempo.
I grafici ottenuti sono riportati in Figura 2A e 2B, mostrando sia i valori di mM di ossalato consumati nei 27 giorni di monitoraggio che i valori percentuali derivati. Materiali e metodi
Valutazione dell’attività degradativa dell’ossalato in ceppi probiotici in vitro Per valutare l’attività degradativa dell’ossalato in L. amylovorus SGL 14, quest’ultimo è stati fatto sviluppare per 5 giorni nel terreno MRS addizionato con 5 mM di ossalato di sodio. Dopo lo sviluppo le cellule sono state raccolte e trattate come segue per rimuovere tutte le eventuali sostanze interferenti con le misure successive:
� aggiunta di 2.7 mM EDTA, in grado di chelare gli ioni
� aggiunta di 10 mM acido tricloroacetico, che precipita le proteine
� sterilizzazione e centrifugazione, per rimuovere le cellule batteriche vive
� aggiunta di carbone attivo, per eliminare i derivati fenolici.
La concentrazione di ossalato nel surnatante è stata misurata utilizzando il kit Trinity Biotech per la valutazione della concentrazione dell’ossalato nelle urine. Tale kit sfrutta le seguenti reazioni:
(ossalato ossidasi)
(perossidasi)
L’ossalato viene convertito in anidride carbonica e perossido di idrogeno, dalla ossalato ossidasi e facendo reagire il perossido di idrogeno con 3-metil-2-benzotiazolinone idrazone (MBTH) e con l’acido 3-(dimetilamino) benzoico (DMAB) in presenza di perossidasi è possibile ottenere un prodotto colorato, indamina, (λ =590 nm) il cui valore di assorbanza è direttamente proporzionale alla concentrazione di ossalato nel campione.
I campioni sono stati letti allo spettrofotometro dopo un tempo di incubazione di 5 min necessario per lo sviluppo del colore. Le miscele di reazione erano così composte:
• 1 ml reagente A (DMAB 3.2 mmol/L, MBTH 0.22 mmol/L, buffer pH 3.1)
• 50 µl del campione (trattato come descritto sopra)
• 100 µl reagente B (ossalato ossidasi 3000 U/L, per ossidasi 100000 U/L)
Per ciascun esperimento è stata costruita una curva di calibrazione con concentrazioni note di ossalato standard, dalla quale estrapolare i valori delle concentrazioni dei campioni incogniti.
Per validare questa procedura sperimentale è stato realizzato un test di recupero per ogni terreno.
Al fine di verificare l’attività ed costruire una curva di consumo nel tempo, il ceppo è stato coltivato nelle medesime condizioni di crescita ed il terreno analizzato a tempi differenti (0, 24, 48, 144, 240, 360, 480, 648 ore). I terreni di fermentazione sono matrici molto ricche di varie componenti che rendono difficile l’analisi e l’identificazione dell’attivo di interesse se non vengono precedentemente trattati. La preparativa ha previsto, previa diluizione in acqua, un passaggio su cartuccia SPE e nello specifico si utilizza una SPE STRATA C18-E 500mg/6ml (Phenomenex, Torrance, CA, USA). La stessa è stata attivata con etanolo ed acqua ed è stato raccolto per analisi il passaggio del campione ed il primo lavaggio. L’eluato raccolto è stato evaporato sotto leggero flusso di azoto, ripreso con acqua ed iniettato nel sistema HPLC-DAD (Agilent, Santa Clara CA, USA). Questo step di passaggio ha lo scopo di allontanare tutta la frazione degli “inquinanti” che resterebbero in colonna, selezionando così solo la frazione di nostro interesse. L’analisi cromatografica dell’ossalato è stata eseguita in HPLC/DAD con un a colonna specifica per acidi organici, lavorando con il 100% di potassio fosfato monobasico (KH2PO4) come fase mobile e rilevando l’analita a 210 m. L’analisi cromatografica dura in totale 9min e l’ossalato ha tempo di ritenzione di circa 3.9 min.
Esempio 8
Sequenziamento del gene OXC e FRC in SGL 14
Il sequenziamento dei geni oxc (oxalyl-CoA decrabossilasi) e fcr (Formyl CoA transferasi) è stato realizzato dapprima amplificando i due geni mediante l’utilizzo dei primer specifici oxc-L/oxc-R e frc-L/frc-R ottenendo due ampliconi delle dimensioni attese: 1771 bp e 1363 bp rispettivamente. Il sequenziamento è stato realizzato mediante service della Eurofins e le sequenze ottenute sono state allineate con i geni già depositati di altri batteri lattici. Dalla percentuale di omologia tra i geni oxc e frc di L. amylovorus SGL 14 e L. acidophilus LA 14 (98% e 85% rispettivamente); si è potuto confermare la presenza di tali geni nel genoma di L. amylovorus SGL 14.
Materiali e metodi
Sequenziamento del gene OXC e FRC in SGL 14
Il DNA genomico è stato estratto da SGL 14 e è stato analizzato mediante PCR per l’identificazione dei geni oxc e frc già identificati in altri ceppi di lattobacilli.
I componenti utilizzati in tutte le reazioni di amplificazione sono:
• Phusion high fidelity DNA polymerase (Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA) come DNA polimerasi termostabile (2 U per reazione) e il suo tampone di reazione 5× Phusion GC buffer;
• miscela di nucleotidi trifosfato (8 mM, Euroclone, Siziano, Italy).
• set di primer (100 M, Eurofins MWG Operon, Ebersberg, Germany);
• DNA genomico;
• acqua sterile.
Di seguito sono riportati i primer utilizzati, il termociclo e l’amplicone atteso.
Tabella 7:
Gli ampliconi ottenuti sono stati sequenziati e confrontati con geni di L. acidophilus LA 14 già depositati in banca dati.
Esempio 9
Sperimentazione animale: verifica efficacia associazione SGL 14 e Phyllanto niruri Sono stati selezionati 40 topi in buono stato di salute. Su ogni animale, prima dell’inizio della sperimentazione, è stata eseguita la visita clinica con rilievo della temperatura e del peso corporeo.
Gli animali sono stati poi suddivisi in 4 gruppi con modalità random:
1) gruppo di controllo negativo alimentato con dieta normale.
2) gruppo test tossicità alimentato con dieta normale e prototipo integratore ad alto dosaggio.
3) gruppo di controllo positivo alimentato con dieta high-ox.
4) gruppo test efficacia alimentato con dieta high-ox, con l’aggiunta del prototipo integratore ad alto dosaggio.
I parametri monitorati e le analisi effettuate durante la sperimentazione sono riassunti nella Tabella 8 sottostante.
Tabella 8:
I risultati ottenuti dalle misure della concentrazione di ossalato nelle urine dei topi dei 4 gruppi sperimentali sono riportati nella Tabella 9 ed in Figura 3.
Tabella 9:
Al termine della sperimentazione ossia a 6 settimane si evidenzia un calo (statisticamente significativo) dell’ossalato urinario nei topi trattati con il prototipo integratore composto da SGL 14 in associazione con l’estratto secco di Phyllanto niruri.
Esempio 10
Preparazione delle composizioni
Sono state preparate le composizioni secondo la presente invenzione e tutte le associazioni hanno sorprendentemente dimostrato attività probiotica e possono essere impiegate sia per l’uso medico che per l’uso alimentare nelle bevande. 1. Composizione comprendente il ceppo batterico L. amylovorus SGL 14 Il ceppo batterico L. amylovorus SGL 14. Esempi di dosaggi sono: per il fermento da 1 miliardo/dose a 20 miliardi/dose, in forma di polveri, capsule, compresse, granulato, gocce e sciroppi, chewing gum.
2. Composizione comprendente il ceppo batterico L. amylovorus SGL 14 e un estratto vegetale di Phyllanto niruri
Il ceppo batterico L. amylovorus SGL 14 si può associare in una composizione all’estratto vegetale di Phyllanto niruri. Idonei dosaggi possono essere: SGL 14 da 1 miliardo/dose a 20 miliardi/dose e da 0.5 g/dose a 10 g/dose per l’estratto di Phyllanto niruri. Essi saranno formulati in polveri, capsule, compresse, granulati, gocce e sciroppi, chewing gum.
3. Composizione comprendente il ceppo batterico L. amylovorus SGL 14 e il ceppo batterico L. gasseri SGL 18
Idonei dosaggi possono essere per entrambi i fermenti da 1 miliardo/dose a 20 miliardi/dose, in forma di polveri, capsule, compresse, granulato, gocce e sciroppi, chewing gum.
4. Composizione comprendente il ceppo batterico L. amylovorus SGL 14, un estratto vegetale di Phyllanto niruri e il ceppo batterico L. gasseri SGL 18 Idonei dosaggi per i fermenti SGL 14 che SGL 18 sono nel range da 1 miliardo/dose a 20 miliardi/dose e nel range da 0.5 g/dose a 10 g/dose per l’estratto di Phyllanto niruri. Essi saranno in forma di polveri, capsule, compresse, granulato, gocce e sciroppi, chewing gum.
Dalla descrizione dettagliata e dagli Esempi sopra riportati, risultano evidenti i vantaggi conseguiti mediante il ceppo batterico L. amylovorus SGL 14 della presente invenzione. In particolare, tale ceppo batterico si è mostrato sorprendentemente e vantaggiosamente adatto come probiotico e nel trattamento della calcolosi, delle iperossalurie e della litiasi.
Claims (12)
- RIVENDICAZIONI 1. Un ceppo batterico appartenente alla specie Lactobacillus amylovorus, in cui detto ceppo è L. amylovorus SGL 14 depositato con il numero di accesso DSM 27014 in data 18/03/2013.
- 2. Composizione comprendente il ceppo batterico secondo la rivendicazione 1.
- 3. Composizione comprendente il ceppo batterico secondo la rivendicazione 1, e un estratto vegetale di Phyllanto niruri.
- 4. Composizione comprendente il ceppo batterico secondo la rivendicazione 1, e il ceppo batterico L. gasseri SGL 18 depositato con il numero di accesso DSM 32802 in data 20 aprile 2018.
- 5. Composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 2 a 4, ed eccipienti farmacologicamente accettabili.
- 6. La composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 2 a 5, in cui detta composizione ha attività probiotica.
- 7. La composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 2 a 6, in cui detta composizione è in forma solida o liquida.
- 8. Composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 2 a 7, per l’uso come medicamento.
- 9. Composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 2 a 7, per l’uso nel trattamento delle calcolosi scelte dal gruppo consistente in: calcolosi renale, calcolosi biliare e calcolosi della cistifellea.
- 10. Composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 2 a 7, per l’uso nel trattamento delle iperossalurie.
- 11. Composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 2 a 6, per l’uso nel trattamento delle litiasi.
- 12. Composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 2 a 7, per l’uso alimentare.
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