JP2023511282A - シュウ酸塩が有害となる障害を治療するための遺伝子改変細菌 - Google Patents

シュウ酸塩が有害となる障害を治療するための遺伝子改変細菌 Download PDF

Info

Publication number
JP2023511282A
JP2023511282A JP2022542946A JP2022542946A JP2023511282A JP 2023511282 A JP2023511282 A JP 2023511282A JP 2022542946 A JP2022542946 A JP 2022542946A JP 2022542946 A JP2022542946 A JP 2022542946A JP 2023511282 A JP2023511282 A JP 2023511282A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
oxalate
gene
encoding
sequence
day
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2022542946A
Other languages
English (en)
Other versions
JPWO2021146397A5 (ja
Inventor
ヴィンセント エム． イザベラ，
デイビッド ルブコウィッツ，
マイケル ジェイムズ，
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Synlogic Inc
Original Assignee
Synlogic Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Synlogic Inc filed Critical Synlogic Inc
Publication of JP2023511282A publication Critical patent/JP2023511282A/ja
Publication of JPWO2021146397A5 publication Critical patent/JPWO2021146397A5/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/4427—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof containing further heterocyclic ring systems
    • A61K31/4439—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof containing further heterocyclic ring systems containing a five-membered ring with nitrogen as a ring hetero atom, e.g. omeprazole
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/13—Transferases (2.) transferring sulfur containing groups (2.8)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y208/00—Transferases transferring sulfur-containing groups (2.8)
    • C12Y208/03—CoA-transferases (2.8.3)
    • C12Y208/03016—Formyl-CoA transferase (2.8.3.16)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
    • C12Y401/01—Carboxy-lyases (4.1.1)
    • C12Y401/01002—Oxalate decarboxylase (4.1.1.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
    • C12Y401/01—Carboxy-lyases (4.1.1)
    • C12Y401/01008—Oxalyl-CoA decarboxylase (4.1.1.8)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y602/00—Ligases forming carbon-sulfur bonds (6.2)
    • C12Y602/01—Acid-Thiol Ligases (6.2.1)
    • C12Y602/01008—Oxalate--CoA ligase (6.2.1.8)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本発明は、少なくとも１つのシュウ酸塩異化酵素をコードする少なくとも１つの異種遺伝子を含む組換え細菌細胞を提供する。別の態様では、組換え細菌細胞は、シュウ酸塩取り込み輸送体をコードする少なくとも１つの異種遺伝子をさらに含む。本発明は、組換え細菌を含む医薬組成物、及び高シュウ酸尿症などのシュウ酸塩が有害となる障害を本発明の医薬組成物を使用して治療する方法をさらに提供する。本開示は、遺伝子改変細菌細胞、その医薬組成物、ならびにシュウ酸塩が有害となる障害を調整及び治療する方法を提供する。

Description

関連出願
本出願は、２０２０年１１月９日に出願の米国特許仮出願第６３／１１１，３７６号、２０２０年１０月１４日に出願の米国特許仮出願第６３／０９１，６２０号、２０２０年１０月９日に出願の米国特許仮出願第６３／０８９，７５８号、２０２０年８月１４日に出願の米国特許仮出願第６３／０６５，７５２号、２０２０年５月２２日に出願の米国特許仮出願第６３／０２８，９０２号、２０２０年３月２３日に出願の米国特許仮出願第６２／９９３，３０１号、及び２０２０年１月１４日に出願の米国特許仮出願第６２／９６０，９５０号に対する優先権を主張し、それぞれの内容全体は、参照によりその全体が本明細書に明示的に組み込まれる。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０２１年１月８日に作成された上記ＡＳＣＩＩコピーの名前は、１２６０４６－０５１２０＿ＳＬ．ｔｘｔであり、サイズは１５３，１０９バイトである。
シュウ酸のイオン形態であるシュウ酸塩は、食事摂取または内因性合成によってヒトの体内で生じる。シュウ酸塩は、植物及び植物由来の食品に偏在しているため、必然的にヒトの食物の一部である。内因的に合成するシュウ酸塩は、主に肝臓内のグリオキシル酸 に由来し、過剰なグリオキシル酸は、グリコール酸酸化酵素または乳酸脱水素酵素によってシュウ酸塩に変換される（Ｒｏｂｉｊｎ ｅｔ ａｌ．，Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．８０：１１４６－５８（２０１１））。健常者の尿中シュウ酸塩排泄量は通常２４時間あたり２０～４０ｍｇである。しかし、２４時間あたり４０～４５ｍｇを超える濃度の尿中シュウ酸塩排泄量は、臨床的に高シュウ酸尿症と見なされる（Ｒｏｂｉｊｎ ｅｔ ａｌ．（２０１１））。高シュウ酸尿症は、シュウ酸塩の尿中排泄が増え、全身のシュウ酸塩レベルが上がることが特徴であり、尿中シュウ酸塩レベルは、通常、原発性高シュウ酸尿症では２４時間あたり約９０～５００ｍｇであり、腸性高シュウ酸尿症では２４時間あたり４５～１３０ｍｇである。治療せずに放置すると、高シュウ酸尿症は、腎結石（腎臓結石）、腎石灰化症（腎臓のカルシウム増加）、結晶症、及び最も重大なのは末期腎疾患の発症を含む、著しい体調不良及び死亡に至る可能性がある（Ｔａｓｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．，２０１８；２９（６）：１７３１－１７４０、及びＳｉｅｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，２０１３：８３：１１４４－１１４９）。
高シュウ酸尿症は、一般に、原発性高シュウ酸尿症及び続発性高シュウ酸尿症の２つの臨床分類に分けられる。原発性高シュウ酸尿症は、シュウ酸塩代謝に関与するいくつかの遺伝子のうち１つの突然変異が原因の常染色体劣性遺伝病である（Ｈｏｐｐｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｐｈｒ．Ｄｉａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２６：３６０９－１５（２０１１））。原発性高シュウ酸尿症は、尿中シュウ酸塩排泄が増えることが特徴であり、これは最終的に再発性尿石症、結晶症、進行性腎石灰化症及び早期末期腎疾患を引き起こす可能性がある。さらに、原発性高シュウ酸尿症の患者が慢性腎不全を発症すると、シュウ酸カルシウムの全身沈着（シュウ酸症としても知られている）が様々な器官系で生じることがあり、これにより、骨疾患、エリスロポエチン難治性貧血、皮膚潰瘍、指の壊疽、心不整脈及び心筋症につながることがある（Ｈｏｐｐｅ ｅｔ ａｌ．（２０１１））。
原発性高シュウ酸尿症Ｉ型（ＰＨＩ）は、高シュウ酸尿症のなかで最も頻度が高く重症形態であり、ビタミンＢ６依存性肝ペルオキシソーム酵素である、グリオキサル酸のグリシンへのアミノ基転移を触媒するアラニングリオキシル酸アミノ基転移酵素（ＡＧＴ、ＡＧＸＴ遺伝子によってコードされている）の欠乏によって発症する（Ｐｕｒｄｕｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１１：２３４１－５１（１９９０）；Ｈｏｐｐｅ ｅｔ ａｌ．，Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．７５：１２６４－７１（２００９））。ＡＧＴが欠乏すると、グリオキシル酸が還元されてグリコール酸塩となり、次にグリコール酸塩が酸化されてシュウ酸塩が生成される。ヒトＡＧＸＴ遺伝子の１４０を超える突然変異が、これまでに特定されている（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｕｔ．３０：９１０－７（２００９））。原発性高シュウ酸尿症ＩＩ型（ＰＨＩＩ）は、酵素グリオキシル酸／ヒドロキシピルビン酸還元酵素（ＧＲＨＰＲ）、グリオキシル酸還元酵素（ＧＲ）を有する酵素、ヒドロキシピルビン酸還元酵素（ＨＰＲ）、及びＤ－グリセリン酸脱水素酵素（ＤＧＤＨ）活性の突然変異によって発症する（例えば、Ｃｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．８：２０６３－９ （１９９９）を参照されたい）。ヒトＧＲＨＰＲ遺伝子の１２を超える突然変異が、これまでに特定されている（Ｃｒｅｇｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｕｔ．２２：４９７（２００３））。ＰＨＩ及びＰＨＩＩの両方は重度の高シュウ酸尿症を引き起こす（Ｒｏｂｉｊｎ ｅｔ ａｌ．（２０１１））。原発性高シュウ酸尿症ＩＩＩ型（ＰＨＩＩＩ）は、４－ヒドロキシ２－オキソグルタル酸アルドラーゼである、４－ヒドロキシ２－オキソグルタル酸をピルビン酸及びグリオキサル酸に分解するミトコンドリア酵素をコードするＨＯＧＡ１遺伝子の突然変異によって発症する（Ｐｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，ＪＩＭＤ Ｒｅｐｏｒｔｓ １５：１－６（２０１５））。ヒトＨＯＧＡ１遺伝子の１５の突然変異が、これまでに特定されている（Ｂｈａｓｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｗｏｒｌｄ Ｊ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．４：２３５－４４（２０１５））。
続発性高シュウ酸尿症は、通常、シュウ酸塩の食事摂取の増加、シュウ酸塩の腸管吸収の増加、シュウ酸塩前駆体の過剰摂取、腸内微生物相の不均衡、及び腸内シュウ酸塩輸送体の遺伝的変異を含む、シュウ酸塩の吸収の増加が根底にある病態に起因する（Ｂｈａｓｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｒｏｂｉｊｎ ｅｔ ａｌ．（２０１１））。腸性高シュウ酸尿症と呼ばれることも多い、シュウ酸塩吸収の増加とその結果として生じる高シュウ酸尿症は、腸内細菌異常増殖症候群、クローン病、炎症性腸疾患を含む様々な腸管疾患、ならびに肥満症に対する空腸回腸バイパス後、胃潰瘍手術後、及び慢性腸間膜虚血など他の吸収不全性病態を有する患者で観察される（Ｐａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ． Ｊ． Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．９３：５００－１４（１９９８）；Ｈｙｌａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔ．１５：３４９－５２（１９８０）；Ｃａｎｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．Ｊ．１２４：７２９－３３（１９８１）；Ｄｒｅｎｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．８９：５９４－９（１９７８））。加えて、高シュウ酸尿症はまた腎移植後に発症することもある（Ｒｏｂｉｊｎ ｅｔ ａｌ．（２０１１））。続発性高シュウ酸尿症及び腸性高シュウ酸尿症の患者は、シュウ酸カルシウム結石を発症しやすく、これにより、重大な腎障害を引き起こし、最終的に末期腎疾患になる可能性がある。
高シュウ酸尿症の現在利用可能な治療法は、不十分である。原発性高シュウ酸尿症の治療戦略は、ピリドキシンを用いて尿中シュウ酸塩を減らすことを含み、これは、ＰＨＩの患者の半分以下にしか効果がなく、ＰＨＩＩ及びＰＨＩＩＩの患者には効果がない（Ｈｏｐｐｅ ｅｔ ａｌ．（２０１１））。さらに、クエン酸塩、オルソリン酸塩、及びマグネシウムによってシュウ酸カルシウムの尿溶解度を高め、それにより腎機能を維持する治療は、十分にその特性が明らかとなっていない（Ｈｏｐｐｅ ｅｔ ａｌ．（２０１１））。非常に困難で、効果が現れないことが多い続発性高シュウ酸尿症及び腸性高シュウ酸尿症を治療する他の戦略は、シュウ酸塩の食事摂取の低減、経口カルシウム補給、及び胆汁酸隔離剤の使用を含む（Ｐａｒｉｖａｒ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｕｒｏｌ．１５５：４３２－４０（１９９６）；Ｈｙｌａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８０）；ＭｃＬｅｏｄ ａｎｄ Ｃｈｕｒｃｈｈｉｌｌ，Ｊ．Ｕｒｏｌ．１４８：９７４－８（１９９２））。一般的に、食事制限は、避けるべき食品を患者が容易に特定できないため、完全に有効であるというわけではない（Ｐａｒｉｖａｒ ｅｔ ａｌ．（１９９６））。したがって、効果的で、信頼性が高く、及び／または長期の高シュウ酸尿症の治療に対する重要なニーズが満たされていない。
Ｔａｓｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．，２０１８；２９（６）：１７３１－１７４０ Ｓｉｅｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，２０１３：８３：１１４４－１１４９ Ｈｏｐｐｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｐｈｒ．Ｄｉａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２６：３６０９－１５（２０１１）
本開示は、遺伝子改変細菌細胞、その医薬組成物、ならびにシュウ酸塩が有害となる障害を調整及び治療する方法を提供する。具体的には、本明細書にて開示する遺伝子改変細菌は、例えば、疾患を治療する１つ以上のシュウ酸塩異化遺伝子で構成される遺伝子回路、ならびに、例えば、栄養要求性、キルスイッチ、及びこれらの組み合わせなど、遺伝子改変細菌が投与される対象の安全性及び非集落形成化を確保するように設計された他の任意の回路を含むように構築されている。これらの遺伝子改変細菌は、安全で忍容性が高く、治療効果を実現するために対象のマイクロバイオームの生得活性を増強する。
一実施形態において、対象におけるシュウ酸塩のレベルを低下させる方法を本明細書にて開示し、該方法は、自然界におけるシュウ酸塩異化酵素遺伝子と関連のない、直接的または間接的な第１プロモーターに操作可能に連結された、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素をコードする１つ以上の遺伝子配列を含む組換え細菌を含む医薬組成物を対象に投与して、それにより対象におけるシュウ酸塩のレベルを低下させることを含む。
一実施形態では、組換え細菌は、１μｍｏｌ／１×１０９細胞のシュウ酸塩消費活性を有する。一実施形態では、組換え細菌は、約５０～６００ｍｇ／日、約１００～５５０ｍｇ／日、約１００～５００ｍｇ／日、約１００～４００ｍｇ／日、約１００～３００ｍｇ／日のシュウ酸塩消費活性を有する。一実施形態では、組換え細菌は、約１５０～３００ｍｇ／日のシュウ酸塩消費活性を有する。一実施形態では、組換え細菌は、約５０ｍｇ／日、約１００ｍｇ／日、約１５０ｍｇ／日、約２００ｍｇ／日、約２１０ｍｇ／日、約２１１ｍｇ／日、約２２５ｍｇ／日、約２５０ｍｇ／日、約２７５ｍｇ／日、約３００ｍｇ／日、約３２５ｍｇ／日、約３５０ｍｇ／日、約３５０ｍｇ／日、約３７５ｍｇ／日、約４００ｍｇ／日、約４２５ｍｇ／日、約４５０ｍｇ／日、約４７５ｍｇ／日、約５００ｍｇ／日、約５２５ｍｇ／日、約５５０ｍｇ／日、約５７５ｍｇ／日、または約６００ｍｇ／日のシュウ酸塩消費活性を有する。一実施形態では、組換え細菌は、嫌気的条件下で、約５０ｍｇ／日、約１００ｍｇ／日、約１５０ｍｇ／日、約２００ｍｇ／日、約２１１ｍｇ／日、約２２５ｍｇ／日、約２５０ｍｇ／日、約２７５ｍｇ／日、約３００ｍｇ／日、約３２５ｍｇ／日、約３５０ｍｇ／日、約３５０ｍｇ／日、約３７５ｍｇ／日、約４００ｍｇ／日、約４２５ｍｇ／日、約４５０ｍｇ／日、約４７５ｍｇ／日、約５００ｍｇ／日、約５２５ｍｇ／日、約５５０ｍｇ／日、約５７５ｍｇ／日、または約６００ｍｇ／日のシュウ酸塩消費活性を有する。一実施形態では、組換え細菌は、対象に１日３回投与された場合に、嫌気的条件下で、約５０ｍｇ／日、約１００ｍｇ／日、約１５０ｍｇ／日、約２００ｍｇ／日、約２１１ｍｇ／日、約２２５ｍｇ／日、約２５０ｍｇ／日、約２７５ｍｇ／日、約３００ｍｇ／日、約３２５ｍｇ／日、約３５０ｍｇ／日、約３５０ｍｇ／日、約３７５ｍｇ／日、約４００ｍｇ／日、約４２５ｍｇ／日、約４５０ｍｇ／日、約４７５ｍｇ／日、約５００ｍｇ／日、約５２５ｍｇ／日、約５５０ｍｇ／日、約５７５ｍｇ／日、または約６００ｍｇ／日のシュウ酸塩消費活性を有する。一実施形態では、嫌気的条件は、対象の腸及び／または結腸内の状態である。
一実施形態では、本方法は、対象におけるシュウ酸塩の急性レベルを約２分の１に低下させる。一実施形態では、本方法は、対象におけるシュウ酸塩の急性レベルを約３分の１に低下させる。一実施形態では、本方法は、対象におけるシュウ酸塩の慢性レベルを約２分の１に低下させる。一実施形態では、本方法は、対象におけるシュウ酸塩の慢性レベルを約３分の１に低下させる。
一実施形態では、本方法は、対象におけるシュウ酸塩の急性レベルを、約２５ｍｇ／日、約３０ｍｇ／日、約４０ｍｇ／日、約５０ｍｇ／日、約６０ｍｇ／日、約７０ｍｇ／日、約８０ｍｇ／日、約９０ｍｇ／日、または約１００ｍｇ／日まで低下させる。一実施形態では、本方法は、対象におけるシュウ酸塩の慢性レベルを、約２５ｍｇ／日、約３０ｍｇ／日、約４０ｍｇ／日、約５０ｍｇ／日、約６０ｍｇ／日、約７０ｍｇ／日、約８０ｍｇ／日、約９０ｍｇ／日、または約１００ｍｇ／日まで低下させる。
一実施形態では、本方法は、投与後５日目までに、対象におけるシュウ酸塩の急性レベルを少なくとも約４０％低下させる。一実施形態では、本方法は、投与後５日目までに、対象におけるシュウ酸塩の急性レベルを少なくとも約５０％低下させる。一実施形態では、本方法は、投与後５日目までに、対象におけるシュウ酸塩の急性レベルを少なくとも約６０％低下させる。一実施形態では、本方法は、投与後５日目までに、対象におけるシュウ酸塩の急性レベルを少なくとも約７０％低下させる。一実施形態では、本方法は、投与後５日目までに、対象におけるシュウ酸塩の急性レベルを少なくとも約８０％低下させる。
一実施形態では、本方法は、投与後約２４時間までに、対象におけるシュウ酸塩の急性レベルを少なくとも約１０％低下させる。一実施形態では、本方法は、投与後約２４時間までに、対象におけるシュウ酸塩の急性レベルを少なくとも約１５％低下させる。一実施形態では、本方法は、投与後約２４時間までに、対象におけるシュウ酸塩の急性レベルを少なくとも約２０％低下させる。
一実施形態では、組換え細菌は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属のものである。一実施形態では、組換え細菌は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ種Ｎｉｓｓｌｅ株のものである。
一実施形態では、医薬組成物は、経口投与される。一実施形態では、対象は、医薬組成物の投与の１時間以内に食事を与えられる。一実施形態では、対象は、医薬組成物の投与と同時に食事を与えられる。一実施形態では、対象は、ヒト対象である。
一実施形態において、自然界におけるシュウ酸塩異化酵素遺伝子と関連のない、直接的または間接的な第１誘導性プロモーターに操作可能に連結された、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素をコードする１つ以上の遺伝子配列を含む組換え細菌について本明細書にて開示する。
一実施形態では、組換え細菌は、１μｍｏｌ／１×１０９細胞のシュウ酸塩消費活性を有する。一実施形態では、組換え細菌は、嫌気的条件下で、約１５０～３００ｍｇ／日のシュウ酸塩消費活性を有する。一実施形態では、組換え細菌は、嫌気的条件下で、約２００ｍｇ／日のシュウ酸塩消費活性を有する。一実施形態では、組換え細菌は、対象に１日３回投与された場合に、嫌気的条件下で、約２００ｍｇ／日のシュウ酸塩消費活性を有する。一実施形態では、嫌気的条件は、対象の腸及び／または結腸内の状態である。
一実施形態では、１つ以上の遺伝子配列は、ｓｃａａＥ３遺伝子、ｆｒｃ遺伝子、及びｏｘｄＣ遺伝子を含む。一実施形態では、ｓｃａａＥ３遺伝子は、配列番号３に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する配列を含むか、配列番号３を含むか、またはもしくは配列番号３からなる。一実施形態では、ｆｒｃ遺伝子は、配列番号１に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する配列を含むか、配列番号１を含むか、または配列番号１からなる。一実施形態では、ｓｃａａＥ３遺伝子は、配列番号３を含む。一実施形態では、ｏｘｄＣ遺伝子は、配列番号２に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する配列を含むか、配列番号２を含むか、または配列番号２からなる。一実施形態では、ｆｒｃ遺伝子は、配列番号２を含む。
一実施形態では、組換え細菌は、シュウ酸塩取り込み輸送体をコードする遺伝子をさらに含む。一実施形態では、シュウ酸塩取り込み輸送体をコードする遺伝子は、ｏｘｌＴ遺伝子である。一実施形態では、ｏｘｌＴ遺伝子は、配列番号１１に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する配列を含むか、配列番号１１を含むか、または配列番号１１からなる。一実施形態では、ｏｘｌＴ遺伝子は、配列番号１１を含む。
一実施形態では、組換え細菌は、栄養要求性をさらに含む。一実施形態では、栄養要求性は、ｔｈｙＡ栄養要求性である。一実施形態では、ｔｈｙＡは、配列番号６２に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する配列を含むか、配列番号６２を含むか、または配列番号６２からなる。
一実施形態では、組換え細菌は、内因性ファージの欠失をさらに含む。一実施形態では、内因性ファージは、配列番号６３に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する配列を含むか、配列番号６３を含むか、または配列番号６３からなる。一実施形態では、内因性ファージは、配列番号６３の配列を含む。
一実施形態では、組換え細菌は、抗生物質耐性をコードする遺伝子を含まない。一実施形態では、第１プロモーターは、誘導性プロモーターである。一実施形態では、誘導性プロモーターは、低酸素もしくは嫌気的条件、温度、または腫瘍の低酸素環境によって誘導される。一実施形態では、誘導性プロモーターは、ＦＮＲプロモーターである。一実施形態では、ＦＮＲプロモーターは、配列番号１３～２９のうち任意の１つからなる群から選択されるプロモーターである。
一実施形態では、組換え細菌は、誘導性プロモーター、必要に応じてＦＮＲプロモーターの制御下にあるｏｘｌＴ遺伝子；誘導性プロモーター、必要に応じてＦＲＮプロモーターの制御下にあるｓｃａａＥ３遺伝子、ｏｘｃｄ遺伝子、及びｆｒｃ遺伝子；ｔｈｙＡ欠失（または栄養要求性）；ならびに内因性ファージ３の欠失を含む。一実施形態では、組換え細菌は、ＨＡ９１０：：ＦＮＲ＿ｏｘｌＴ，ＨＡ１２：：ＦＮＲ＿ｓｃａａＥ３－ｏｘｃｄ－ｆｒｃ，ΔｔｈｙＡ，Δｐｈａｇｅ３を含む。
一実施形態では、組換え細菌は、ＳＹＮ５７５２、ＳＹＮ７１６９、またはＳＹＮＢ８８０２である。一実施形態では、組換え細菌は、ＳＹＮＢ８８０２である。
一実施形態では、対象は、高シュウ酸尿症を患っている。一実施形態では、高シュウ酸尿症は、原発性高シュウ酸尿症、食事性高シュウ酸尿症、または腸性高シュウ酸尿症である。一実施形態では、対象は、短腸症候群、慢性膵炎、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、嚢胞性線維症、腎疾患を患っている、及び／またはルー－エン－Ｙ胃バイパスを受けている。
一実施形態では、対象の投与前の尿中シュウ酸塩（Ｕｏｘ）レベルは、少なくとも７０ｍｇ／日である。一実施形態では、対象は、投与後、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、または８０％のＵｏｘレベルの低下を示す。一実施形態では、対象は、投与前に、そのｅＧＦＲが３０ｍＬ／分／１．７３ｍ２未満であるか、血液透析を必要とするか、または全身性シュウ酸症を患っている。
一実施形態では、組換え細菌は、約１×１０１１個の生きた組換え細菌、約２×１０１１個の生きた組換え細菌、約３×１０１１個の生きた組換え細菌、約４×１０１１個の生きた組換え細菌、約５×１０１１個の生きた組換え細菌、約６×１０１１個の生きた組換え細菌、約１×１０１２個の生きた組換え細菌、または約２×１０１２個の生きた組換え細菌の用量で投与される。一実施形態では、組換え細菌は、約６×１０１１個の生きた組換え細菌の用量で投与される。一実施形態では、組換え細菌は、約３×１０１１個の生きた組換え細菌の用量で投与される。一実施形態では、組換え細菌は、約１×１０１１個の生きた組換え細菌の用量で投与される。一実施形態では、投与は、約５×１０１１個の生きた組換え細菌である。一実施形態では、組換え細菌は、約１×１０１２個の生きた組換え細菌の用量で投与される。一実施形態では、組換え細菌は、約２×１０１２個の生きた組換え細菌の用量で投与される。一実施形態では、投与は、１日３回の食事と同時の約５×１０１１個の生きた組換え細菌である。一実施形態では、組換え細菌は、約１×１０１１個の生きた組換え細菌から約２×１０１２個の生きた組換え細菌の用量で投与される。一実施形態では、組換え細菌は、約１×１０１２個の生きた組換え細菌から約２×１０１２個の生きた組換え細菌の用量で投与される。一実施形態では、組換え細菌は、約５×１０１１個の生きた組換え細菌から約２×１０１２個の生きた組換え細菌の用量で投与される。
別の実施形態では、投与は、１日２回の食事と共に経口で行われる。別の実施形態では、投与は、１日３回の食事と共に経口で行われる。
別の実施形態では、プロトンポンプ阻害剤（ＰＰＩ）が、対象に投与される。別の実施形態では、ＰＰＩは、エソメプラゾールである。別の実施形態では、ＰＰＩの投与は、１日１回である。
いくつかの実施形態において、本開示は、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）またはシュウ酸塩異化経路をコードする１つ以上の遺伝子、遺伝子カセット、及び／または合成回路を含むように遺伝子組換えされており、かつシュウ酸塩及び／またはシュウ酸ＣｏＡなどの他の代謝産物を代謝することができる細菌細胞を提供する。したがって、遺伝子組換えされた細菌細胞及びその細菌細胞を含む医薬組成物を使用して、シュウ酸塩が有害となる障害に関連する疾患、例えば原発性高シュウ酸尿症及び続発性高シュウ酸尿症を治療及び／または予防することができる。
いくつかの実施形態において、本開示は、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子配列（複数可）を含むように遺伝子改変された細菌細胞を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子配列（複数可）を含むように遺伝子改変されており、かつシュウ酸塩及び／または他の代謝産物、例えばシュウ酸ＣｏＡのレベルを低下させることができる細菌細胞を提供する。いくつかの実施形態では、細菌細胞は、１つ以上のシュウ酸塩輸送体（複数可）（取り込み輸送体（複数可））をコードする遺伝子配列（複数可）を含むように遺伝子改変されている。いくつかの実施形態では、細菌細胞は、１つ以上のギ酸塩排出輸送体（複数可）をコードする遺伝子配列（複数可）を含むように遺伝子改変されている。いくつかの実施形態では、遺伝子改変細菌は、シュウ酸塩の輸送（取り込み）及びギ酸塩の排出の両方を媒介する１つ以上のポリペプチド（複数可）（例えば、シュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体（複数可））をコードする遺伝子配列（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子改変細菌は、（ｉ）１つ以上のシュウ酸塩輸送体（複数可）、（ｉｉ）１つ以上のギ酸塩排出輸送体（複数可）、（ｉｉｉ）シュウ酸塩の輸送（取り込み）及びギ酸塩の排出の両方を媒介する１つ以上のポリペプチド（複数可）（例えば、シュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体（複数可））、ならびに（ｉｖ）これらの任意の組み合わせ、のうち１つ以上をコードする遺伝子配列（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、細菌細胞は、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）及び１つ以上のシュウ酸塩輸送体（複数可）（取り込み輸送体（複数可））をコードする遺伝子配列（複数可）を含むように遺伝子改変されている。いくつかの実施形態では、本開示の細菌細胞は、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）及び１つ以上のギ酸塩排出輸送体（複数可）をコードする遺伝子配列（複数可）を含むように遺伝子組換えされている。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）ならびにシュウ酸塩の輸送（取り込み）及びギ酸塩の排出の両方を媒介する１つ以上のポリペプチド（複数可）（例えば、シュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体（複数可））をコードする遺伝子配列（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、細菌細胞は、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子配列（複数可）、ならびに、（ｉ）１つ以上のシュウ酸塩輸送体（複数可）、（ｉｉ）１つ以上のギ酸塩排出輸送体（複数可）、（ｉｉｉ）シュウ酸塩の輸送（取り込み）及びギ酸塩の排出の両方を媒介する１つ以上のポリペプチド（複数可）（例えば、シュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体（複数可））、ならびに（ｉｖ）これらの任意の組み合わせ、のうち１つ以上をコードする遺伝子配列（複数可）を含むように遺伝子改変されている。
いくつかの実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子配列（複数可）は、誘導性プロモーターに操作可能に連結される。いくつかの実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩輸送体（複数可）（取り込み輸送体（複数可））をコードする遺伝子配列（複数可）は、誘導性プロモーターに操作可能に連結される。いくつかの実施形態では、１つ以上のギ酸塩排出輸送体（複数可）をコードする遺伝子配列（複数可）は、誘導性プロモーターに操作可能に連結される。いくつかの実施形態では、シュウ酸塩の輸送（取り込み）及びギ酸塩の排出の両方を媒介する１つ以上のポリペプチド（複数可）（例えば、シュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体（複数可））をコードする遺伝子配列（複数可）は、誘導性プロモーターに操作可能に連結される。いくつかの実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子配列（複数可）及び１つ以上のシュウ酸塩輸送体（複数可）（取り込み輸送体（複数可））をコードする遺伝子配列（複数可）は、誘導性プロモーターに操作可能に連結される。いくつかの実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子配列（複数可）及び１つ以上のギ酸塩排出輸送体（複数可）をコードする遺伝子配列（複数可）は、誘導性プロモーターに操作可能に連結される。いくつかの実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子配列（複数可）ならびにシュウ酸塩の輸送（取り込み）及びギ酸塩の排出の両方を媒介する１つ以上のポリペプチド（複数可）（例えば、シュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体（複数可））をコードする遺伝子配列（複数可）は、誘導性プロモーターに操作可能に連結される。いくつかの実施形態では、（ｉ）１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子配列（複数可）、（ｉｉ）１つ以上のシュウ酸塩輸送体（複数可）をコードする遺伝子配列（複数可）、（ｉｉｉ）１つ以上のギ酸塩排出輸送体（複数可）をコードする遺伝子配列（複数可）、ならびに（ｉｖ）シュウ酸塩の輸送（取り込み）及びギ酸塩の排出の両方を媒介する１つ以上のポリペプチド（複数可）（例えば、シュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体（複数可））をコードする遺伝子配列（複数可）、の遺伝子配列のうちの任意の１つ以上は、細菌細胞に存在する場合、誘導性プロモーターに操作可能に連結される。
いくつかの実施形態において、本開示は、低酸素及び／または嫌気的条件下、例えば、哺乳動物の腸内で見られる状態で誘導される誘導性プロモーターに操作可能に連結された、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子配列（複数可）を含むように遺伝子改変された細菌細胞を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、低酸素及び／または嫌気的条件下、例えば、哺乳動物の腸内で見られる状態で誘導される誘導性プロモーターに操作可能に連結された、１つ以上のシュウ酸塩輸送体（複数可）（取り込み輸送体（複数可））をコードする遺伝子配列（複数可）を含むように遺伝子改変された細菌細胞を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、低酸素及び／または嫌気的条件下、例えば、哺乳動物の腸内で見られる状態で誘導される誘導性プロモーターに操作可能に連結された、１つ以上のギ酸塩排出輸送体（複数可）をコードする遺伝子配列（複数可）を含むように遺伝子改変された細菌細胞を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、低酸素及び／または嫌気的条件下、例えば、哺乳動物の腸内で見られる状態で誘導される誘導性プロモーターに操作可能に連結された、シュウ酸塩の輸送（取り込み）及びギ酸塩の排出の両方を媒介する１つ以上のポリペプチド（複数可）（例えば、シュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体（複数可））をコードする遺伝子配列（複数可）を含むように遺伝子改変された細菌細胞を提供する。いくつかの実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子配列（複数可）及び１つ以上のシュウ酸塩輸送体（複数可）（取り込み輸送体（複数可））をコードする遺伝子配列（複数可）は、低酸素及び／または嫌気的条件下で誘導される誘導性プロモーターに操作可能に連結される。いくつかの実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子配列（複数可）、及び１つ以上のギ酸塩排出輸送体（複数可）をコードする遺伝子配列（複数可）は、低酸素及び／または嫌気的条件下で誘導される誘導性プロモーターに操作可能に連結される。いくつかの実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子配列（複数可）、ならびにシュウ酸塩の輸送（取り込み）及びギ酸塩の排出の両方を媒介する１つ以上のポリペプチド（複数可）（例えば、シュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体（複数可））をコードする遺伝子配列（複数可）は、低酸素及び／または嫌気的条件下で誘導される誘導性プロモーターに操作可能に連結される。いくつかの実施形態では、（ｉ）１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子配列（複数可）、（ｉｉ）１つ以上のシュウ酸塩輸送体（複数可）をコードする遺伝子配列（複数可）、（ｉｉｉ）１つ以上のギ酸塩排出輸送体（複数可）をコードする遺伝子配列（複数可）、ならびに（ｉｖ）シュウ酸塩の輸送（取り込み）及びギ酸塩の排出の両方を媒介する１つ以上のポリペプチド（複数可）（例えば、シュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体（複数可））をコードする遺伝子配列（複数可）、の遺伝子配列のうちの任意の１つ以上は、細菌細胞に存在する場合、低酸素及び／または嫌気的条件下で誘導される誘導性プロモーターに操作可能に連結される。
一実施形態では、誘導性プロモーターは、ＩＰＴＧを用いて誘導することができるｌａｃＩプロモーターである。別の実施形態では、誘導性プロモーターは、アラビノースを用いて誘導することができるｐＢＡＤプロモーターである。
いくつかの実施形態において、本開示は、哺乳動物の腸内で見られる環境シグナル及び／または状態によって誘導される（例えば、代謝産物（例えば、シュウ酸塩代謝産物）もしくは哺乳動物の腸内で見られる他の生体分子によって誘導されるか、及び／または炎症状態（例えば、活性窒素種及び／または活性酸素種）によって誘導される）誘導性プロモーターに操作可能に連結された、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子配列（複数可）を含むように遺伝子改変された細菌細胞を提供する。哺乳動物の腸内で見られる環境シグナル及び／または状態は、健康な哺乳動物の腸内で見られるシグナル及び状態、あるいはシュウ酸塩及び／またはシュウ酸塩代謝産物のレベルが高い高シュウ酸尿症もしくは他の病態を患っている対象の腸、及び／または過敏性大腸疾患、自己免疫疾患、及び腸の炎症によって起こる任意の他の状態などの炎症状態を患っている対象の腸など、罹患している哺乳動物の腸内で見られるシグナル及び状態である場合がある。いくつかの実施形態において、本開示は、炎症状態下で、例えば、哺乳動物の腸内で見られる炎症状態で誘導される誘導性プロモーターに操作可能に連結された、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子配列（複数可）を含むように遺伝子改変された細菌細胞を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、炎症状態下で、例えば、哺乳動物の腸内で見られる炎症状態で誘導される誘導性プロモーターに操作可能に連結された、１つ以上のシュウ酸塩輸送体（複数可）（取り込み輸送体（複数可））をコードする遺伝子配列（複数可）を含むように遺伝子改変された細菌細胞を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、炎症状態下で、例えば、哺乳動物の腸内で見られる炎症状態で誘導される誘導性プロモーターに操作可能に連結された、１つ以上のギ酸塩排出輸送体（複数可）をコードする遺伝子配列（複数可）を含むように遺伝子改変された細菌細胞を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、炎症状態下で、例えば、哺乳動物の腸内で見られる炎症状態で見られる状態で誘導される誘導性プロモーターに操作可能に連結された、シュウ酸塩の輸送（取り込み）及びギ酸塩の排出の両方を媒介する１つ以上のポリペプチド（複数可）（例えば、シュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体（複数可））をコードする遺伝子配列（複数可）を含むように遺伝子改変された細菌細胞を提供する。いくつかの実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子配列（複数可）及び１つ以上のシュウ酸塩輸送体（複数可）（取り込み輸送体（複数可））をコードする遺伝子配列（複数可）は、炎症状態下で誘導される誘導性プロモーターに操作可能に連結される。いくつかの実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子配列（複数可）及び１つ以上のギ酸塩排出輸送体（複数可）をコードする遺伝子配列（複数可）は、炎症状態下で誘導される誘導性プロモーターに操作可能に連結される。いくつかの実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子配列（複数可）ならびにシュウ酸塩の輸送（取り込み）及びギ酸塩の排出の両方を媒介する１つ以上のポリペプチド（複数可）（例えば、シュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体（複数可））をコードする遺伝子配列（複数可）は、炎症状態下で誘導される誘導性プロモーターに操作可能に連結される。いくつかの実施形態では、（ｉ）１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子配列（複数可）、（ｉｉ）１つ以上のシュウ酸塩輸送体（複数可）をコードする遺伝子配列（複数可）、（ｉｉｉ）１つ以上のギ酸塩排出輸送体（複数可）をコードする遺伝子配列（複数可）、ならびに（ｉｖ）シュウ酸塩の輸送（取り込み）及びギ酸塩の排出の両方を媒介する１つ以上のポリペプチド（複数可）（例えば、シュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体（複数可））をコードする遺伝子配列（複数可）、の遺伝子配列のうちの任意の１つ以上は、細菌細胞に存在する場合、炎症状態下で誘導される誘導性プロモーターに操作可能に連結される。
いくつかの実施形態において、本開示は、低酸素環境、例えば腸内で、シュウ酸塩及び／または他の代謝産物、例えばシュウ酸ＣｏＡのレベルを低下させることができる１つ以上のポリペプチド（複数可）をコードする遺伝子配列（複数可）を含むように遺伝子改変された細菌細胞を提供する。いくつかの実施形態では、細菌細胞は、（ｉ）１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）、（ｉｉ）１つ以上のシュウ酸塩輸送体（複数可）、（ｉｉｉ）１つ以上のギ酸塩排出輸送体（複数可）、及び（ｉｖ）１つ以上のシュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体（複数可）のうち１つ以上をコードする遺伝子配列（複数可）を含むように遺伝子改変されている。いくつかの実施形態では、細菌細胞は、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする１つ以上の回路を含むように遺伝子組換えされており、かつ、例えば低酸素環境、例えば腸内で、シュウ酸塩及び／またはシュウ酸ＣｏＡのレベルを調整及び低下させることができる。したがって、いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌細胞及び本開示の細菌細胞を含む医薬組成物を使用して、過剰なシュウ酸塩及び／またはシュウ酸ＣｏＡを細菌細胞に取り込んで、シュウ酸塩が有害となる障害に関連する病態、例えば、原発性高シュウ酸尿症及び続発性高シュウ酸尿症を治療及び／または予防することができる。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌細胞及び本開示の細菌細胞を含む医薬組成物を使用して、過剰なシュウ酸塩及び／またはシュウ酸ＣｏＡを非毒性分子に変換して、シュウ酸塩が有害となる障害に関連する病態、例えば、原発性高シュウ酸尿症及び続発性高シュウ酸尿症を治療及び／または予防することができる。
本開示は、組換え細菌細胞、その医薬組成物、ならびにシュウ酸塩が有害となる障害を調整及び治療する方法を提供する。遺伝子組換えされた細菌細胞及び本発明の細菌細胞を含む医薬組成物を使用して、過剰なシュウ酸塩及び／またはシュウ酸を非毒性分子に変換して、シュウ酸塩が有害となる障害に関連する病態、例えば、原発性高シュウ酸尿症及び続発性高シュウ酸尿症を治療及び／または予防することができる。いくつかの実施形態では、本発明の細菌細胞は、少なくとも１つのシュウ酸塩異化酵素をコードする少なくとも１つの異種遺伝子を含むように遺伝子改変されており、かつ、低酸素環境、例えば腸内で、シュウ酸塩のレベルを調整及び低下させることができる。いくつかの実施形態では、本発明の細菌細胞は、シュウ酸塩取り込み輸送体をコードする少なくとも１つの異種遺伝子を含むように遺伝子改変されており、かつ、低酸素環境、例えば腸内で、シュウ酸塩のレベルを低下させることができる。いくつかの実施形態では、本発明の細菌細胞は、ギ酸塩排出輸送体をコードする少なくとも１つの異種遺伝子を含むように遺伝子改変されており、かつ、低酸素環境、例えば腸内で、シュウ酸塩のレベルを低下させることができる。いくつかの実施形態では、本発明の細菌細胞は、シュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体をコードする少なくとも１つの異種遺伝子を含むように遺伝子改変されており、かつ、低酸素環境、例えば腸内で、シュウ酸塩のレベルを低下させることができる。いくつかの実施形態では、本発明の細菌細胞は、少なくとも１つのシュウ酸塩異化酵素をコードする少なくとも１つの異種遺伝子を含むように遺伝子改変されており、かつ、例えば腸内に存在する可能性があるような炎症性環境で、シュウ酸塩のレベルを調整及び低下させることができる。いくつかの実施形態では、本発明の細菌細胞は、シュウ酸塩取り込み輸送体をコードする少なくとも１つの異種遺伝子を含むように遺伝子改変されており、かつ、例えば腸内に存在する可能性があるような炎症性環境で、シュウ酸塩のレベルを低下させることができる。いくつかの実施形態では、本発明の細菌細胞は、ギ酸塩排出輸送体をコードする少なくとも１つの異種遺伝子を含むように遺伝子改変されており、かつ、例えば腸内に存在する可能性があるような炎症性環境で、シュウ酸塩のレベルを低下させることができる。いくつかの実施形態では、本発明の細菌細胞は、シュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体をコードする少なくとも１つの異種遺伝子を含むように遺伝子改変されており、かつ、例えば腸内に存在する可能性があるような炎症性環境で、シュウ酸塩のレベルを低下させることができる。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのシュウ酸塩異化酵素は、シュウ酸塩をギ酸塩またはホルミルＣｏＡに変換する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのシュウ酸塩異化酵素は、シュウ酸塩ＣｏＡリガーゼ（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＳｃＡＡＥ３）、シュウ酸ＣｏＡ脱炭酸酵素（例えば、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のＯｘｃ）、及びホルミルＣｏＡ転移酵素（例えば、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のＦｒｃ）から選択される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのシュウ酸塩異化酵素をコードする少なくとも１つの異種遺伝子は、ｆｒｃ遺伝子及びｏｘｃ遺伝子から選択される。一実施形態では、シュウ酸塩輸送体をコードする少なくとも１つの異種遺伝子は、ｏｘｌＴ遺伝子である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのシュウ酸塩異化酵素をコードする少なくとも１つの異種遺伝子は、細菌細胞内のプラスミド上に位置する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのシュウ酸塩異化酵素をコードする少なくとも１つの異種遺伝子は、細菌細胞内の染色体上に位置する。いくつかの実施形態では、シュウ酸塩輸送体をコードする少なくとも１つの異種遺伝子は、細菌細胞内のプラスミド上に位置する。いくつかの実施形態では、シュウ酸塩輸送体をコードする少なくとも１つの異種遺伝子は、細菌細胞内の染色体上に位置する。いくつかの実施形態では、ギ酸塩排出輸送体をコードする少なくとも１つの異種遺伝子は、細菌細胞内のプラスミド上に位置する。いくつかの実施形態では、ギ酸塩排出輸送体をコードする少なくとも１つの異種遺伝子は、細菌細胞内の染色体上に位置する。いくつかの実施形態では、シュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体をコードする少なくとも１つの異種遺伝子は、細菌細胞内のプラスミド上に位置する。いくつかの実施形態では、シュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体をコードする少なくとも１つの異種遺伝子は、細菌細胞内の染色体上に位置する。
いくつかの実施形態では、遺伝子改変細菌細胞は、プロバイオティック細菌細胞である。いくつかの実施形態では、遺伝子改変細菌細胞は、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ及びＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓからなる群から選択される属のメンバーである。いくつかの実施形態では、遺伝子改変細菌細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属のものである。いくつかの実施形態では、組換え細菌細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ種Ｎｉｓｓｌｅ株のものである。
いくつかの実施形態では、遺伝子改変細菌細胞は、遺伝子改変細菌細胞が哺乳動物の腸内に存在する際に補完されるという点で遺伝子的に栄養要求体である。いくつかの実施形態では、哺乳動物の腸は、ヒトの腸である。いくつかの実施形態では、遺伝子改変細菌細胞は、ジアミノピメリン酸の栄養要求体、またはチミン生合成経路の酵素である。いくつかの実施形態では、遺伝子改変細菌細胞は、誘導性プロモーターに操作可能に連結された、細菌細胞に対して有毒性である物質をコードする異種遺伝子をさらに含み、ここで、該誘導性プロモーターは、哺乳動物の腸内で自然に存在しない環境条件によって直接的または間接的に誘導される。
別の態様では、本発明は、第１誘導性プロモーターに操作可能に連結された、少なくとも１つのシュウ酸塩異化酵素をコードする少なくとも１つの異種遺伝子を含む組換え細菌細胞、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。別の態様では、本発明は、第１誘導性プロモーターに操作可能に連結された、少なくとも１つのシュウ酸塩異化酵素をコードする少なくとも１つの異種遺伝子、第２誘導性プロモーター（第１誘導性プロモーターと同じものであっても、異なるものでああってもよい）に操作可能に連結された、シュウ酸塩輸送体をコードする少なくとも１つの異種遺伝子を含む組換え細菌細胞、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。別の態様では、本発明は、第１誘導性プロモーターに操作可能に連結された、少なくとも１つのシュウ酸塩異化酵素をコードする少なくとも１つの異種遺伝子、第２誘導性プロモーター（第１誘導性プロモーターと同じものであっても、異なるものでああってもよい）に操作可能に連結された、ギ酸塩排出輸送体をコードする少なくとも１つの異種遺伝子を含む組換え細菌細胞、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。別の態様では、本発明は、第１誘導性プロモーターに操作可能に連結された、少なくとも１つのシュウ酸塩異化酵素をコードする少なくとも１つの異種遺伝子、第２誘導性プロモーター（第１誘導性プロモーターと同じものであっても、異なるものであってもよい）に操作可能に連結された、シュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体をコードする少なくとも１つの異種遺伝子を含む組換え細菌細胞、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。これらの実施形態のいずれにおいても、第１プロモーター及び第２プロモーターは、同じプロモーターの別々のコピーであってもよい。いくつかの実施形態では、第１誘導性プロモーター、第２誘導性プロモーター、または１誘導性プロモーター及び第２誘導性プロモーターは、それぞれ、環境条件によって直接的に誘導される。いくつかの実施形態では、第１誘導性プロモーター、第２誘導性プロモーター、または１誘導性プロモーター及び第２誘導性プロモーターは、それぞれ、環境条件によって間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、第１誘導性プロモーター、第２誘導性プロモーター、または１誘導性プロモーター及び第２誘導性プロモーターは、それぞれ、哺乳動物の腸内で見られる環境条件によって直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、第１誘導性プロモーター、第２誘導性プロモーター、または１誘導性プロモーター及び第２誘導性プロモーターは、それぞれ、低酸素環境または嫌気的条件によって直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、第１誘導性プロモーター、第２誘導性プロモーター、または１誘導性プロモーター及び第２誘導性プロモーターは、それぞれ、炎症状態によって直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、第１誘導性プロモーター、第２誘導性プロモーター、または１誘導性プロモーター及び第２誘導性プロモーターは、それぞれ、ＦＮＲ応答性プロモーターである。いくつかの実施形態では、第１誘導性プロモーター、第２誘導性プロモーター、または１誘導性プロモーター及び第２誘導性プロモーターは、それぞれ、ＲＮＳ応答性プロモーターである。いくつかの実施形態では、第１誘導性プロモーター、第２誘導性プロモーター、または１誘導性プロモーター及び第２誘導性プロモーターは、それぞれ、ＲＯＳ応答性プロモーターである。別の態様では、本発明は、対象においてシュウ酸塩が有害となる疾患または障害を治療する方法を提供し、該方法は、遺伝子改変細菌細胞または遺伝子改変細菌細胞を含む医薬組成物を対象に投与することを含み、ここで、該遺伝子改変細菌細胞は、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子配列を含む。別の態様では、本発明は、対象においてシュウ酸塩が有害となる疾患または障害を治療する方法を提供し、該方法は、遺伝子改変細菌細胞または遺伝子改変細菌細胞を含む医薬組成物を対象に投与することを含み、ここで、該遺伝子改変細菌細胞は、１つ以上のシュウ酸塩輸送体（複数可）をコードする遺伝子配列を含む。別の態様では、本発明は、対象においてシュウ酸塩が有害となる疾患または障害を治療する方法を提供し、該方法は、遺伝子改変細菌細胞または遺伝子改変細菌細胞を含む医薬組成物を対象に投与することを含み、ここで、該遺伝子改変細菌細胞は、１つ以上のギ酸塩排出輸送体（複数可）をコードする遺伝子配列を含む。別の態様では、本発明は、対象においてシュウ酸塩が有害となる疾患または障害を治療する方法を提供し、該方法は、遺伝子改変細菌細胞または遺伝子改変細菌細胞を含む医薬組成物を対象に投与することを含み、ここで、該遺伝子改変細菌細胞は、１つ以上のシュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体（複数可）をコードする遺伝子配列を含む。別の態様では、本発明は、対象においてシュウ酸塩が有害となる疾患または障害を治療する方法を提供し、該方法は、遺伝子改変細菌細胞または遺伝子改変細菌細胞を含む医薬組成物を対象に投与することを含み、ここで、該遺伝子改変細菌細胞は、（ｉ）シュウ酸塩異化酵素（複数可）、（ｉｉ）１つ以上のシュウ酸塩輸送体（複数可）、（ｉｉｉ）１つ以上のギ酸塩排出輸送体（複数可）、及び（ｉｖ）１つ以上のシュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体（複数可）、のうち１つ以上をコードする遺伝子配列を含む。
別の態様では、本発明は、対象においてシュウ酸塩が有害となる疾患または障害を治療する方法を提供し、該方法は、遺伝子改変細菌細胞または遺伝子改変細菌細胞を含む医薬組成物を対象に投与することを含み、ここで、該遺伝子改変細菌細胞は、対象の外因的な環境条件に応答して、少なくとも１つのシュウ酸塩異化酵素をコードする少なくとも１つの異種遺伝子を発現し、それにより、対象においてシュウ酸塩が有害となる疾患または障害を治療する。いくつかの実施形態では、遺伝子改変細菌細胞は、（ｉ）シュウ酸塩取り込み輸送体をコードする少なくとも１つの異種遺伝子、（ｉｉ）ギ酸塩排出輸送体をコードする少なくとも１つの異種遺伝子、及び／または（ｉｉｉ）シュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体をコードする少なくとも１つの異種遺伝子のうち１つ以上をさらに発現する。一態様では、本発明は、対象においてシュウ酸塩が有害となる障害を治療する方法を提供し、該方法は、遺伝子改変細菌細胞または本発明の医薬組成物を対象に投与し、それにより、対象においてシュウ酸塩が有害となる障害を治療することを含む。別の態様では、本発明は、対象の血漿中のシュウ酸塩のレベルを低下させる方法を提供し、該方法は、遺伝子改変細菌細胞または本発明の医薬組成物を対象に投与し、それにより、対象の血漿中のシュウ酸塩のレベルを低下させることを含む。別の態様では、本発明は、対象の尿中のシュウ酸塩のレベルを低下させる方法を提供し、該方法は、遺伝子改変細菌細胞または本発明の医薬組成物を対象に投与し、それにより、対象の尿中のシュウ酸塩のレベルを低下させることを含む。一実施形態では、シュウ酸塩のレベルは、遺伝子改変細菌細胞または医薬組成物を対象に投与後、対象の血漿中で低下する。別の実施形態では、シュウ酸塩のレベルは、遺伝子改変細菌細胞または医薬組成物を対象に投与後、対象の尿中で低下する。一実施形態では、遺伝子改変細菌細胞または医薬組成物は、経口投与される。別の実施形態では、方法は、遺伝子改変細菌細胞または医薬組成物を対象に投与後に、対象の血漿サンプル、または対象の尿サンプルを単離することと、対象の血漿サンプルまたは対象の尿サンプル中のシュウ酸塩のレベルを測定することと、をさらに含む。別の実施形態では、方法は、対象の血漿サンプルまたは対象の尿サンプル中のシュウ酸塩のレベルを、シュウ酸塩の対照レベルと比較することをさらに含む。一実施形態では、シュウ酸塩の対照レベルは、遺伝子改変細菌細胞または医薬組成物の投与前の対象の血漿中または対象の尿中のシュウ酸塩のレベルである。
一実施形態では、シュウ酸塩が有害となる障害は、高シュウ酸尿症である。一実施形態では、高シュウ酸尿症は、原発性高シュウ酸尿症Ｉ型である。別の実施形態では、高シュウ酸尿症は、原発性高シュウ酸尿症ＩＩ型である。別の実施形態では、高シュウ酸尿症は、原発性高シュウ酸尿症ＩＩＩ型である。一実施形態では、高シュウ酸尿症は、腸性高シュウ酸尿症である。別の実施形態では、高シュウ酸尿症は、食事性高シュウ酸尿症である。別の実施形態では、高シュウ酸尿症は、特発性高シュウ酸尿症である。
一実施形態では、対象は、医薬組成物の投与の１時間以内に食事を与えられる。別の実施形態では、対象は、医薬組成物の投与と同時に食事を与えられる。
遺伝子改変したＥ．ｃｏｌｉを使用したｉｎ ｖｉｔｒｏシュウ酸塩分解アッセイの結果を示したグラフである。Ｎｉｓｓｌｅ株を、野生型Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株と比較した。 遺伝子改変したＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株（遺伝子改変ＥｃＮ）と野生型Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株（ＥｃＮ）との比較を用いた、急性１３Ｃ－シュウ酸塩尿中回収率を測定することによるｉｎ ｖｉｖｏでのシュウ酸塩消費実験の結果を示した棒グラフである。 遺伝子改変したＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株（遺伝子改変ＥｃＮ）と野生型Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株（ＥｃＮ）との比較を用いた、慢性尿中シュウ酸塩回収率を測定することによるｉｎ ｖｉｖｏでのシュウ酸塩消費実験の結果を示した棒グラフである。 腸性高シュウ酸尿症の疾患病態形成の要約図である。 ＳＹＮＢ８８０２株の成分を示す。 ＳＹＮＢ８８０２と野生型Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株との比較を用いた、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのシュウ酸塩分解アッセイの結果を示したグラフである。 ＳＹＮＢ８８０２と野生型Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株との比較を用いた、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのシュウ酸塩分解及びギ酸塩生成アッセイの結果を示したグラフである。 シミュレート胃液及び結腸体液中でＳＹＮ－ＨＯＸを活性化させた場合のＳＹＮ－ＨＯＸ（ＳＹＮ５７５２）によるシュウ酸塩消費を示す図である。 マウスの腸内での遺伝子改変したＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株（遺伝子改変ＥｃＮ）、ＳＹＮ５７５２によるシュウ酸塩の消費を示す図である。ＳＹＮ５７５２は、抗生物質耐性を組み込んだ菌株である。ＳＹＮ７１６９は、抗生物質耐性、栄養要求性、及びファージ３欠失を組み込んだ菌株である。１３Ｃ－シュウ酸塩消費を、複数の急性マウス研究で測定し、この際、菌株の有効性は、５０～７５％の範囲であった。ＳＹＮ７１６９は、このマウスモデルでＳＹＮ５７５２と類似の挙動を示した。 健康なマウスの消化（ＧＩ）管でのＳＹＮＢ８８０２によるシュウ酸塩消費を示す図である。クレアチニン±平均値の標準誤差によって正規化した尿中１３Ｃ－シュウ酸塩回収率の平均を示したデータである。一元配置分散分析、続いて、Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定を使用して統計的解析を実施した。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。 健康なサルにおける尿中シュウ酸塩増加の減衰を示す図である。 ＳＹＮ７１６９による治療後の健康なサル（ＮＨＰ）における尿中シュウ酸塩の用量依存的回収率を示した棒グラフである。 ＳＹＮ７１６９による治療後の健康なサルにおける尿中１３Ｃ－シュウ酸塩の用量依存的回収率を示した棒グラフである。 急性高シュウ酸尿症のカニクイザルの消化管におけるシュウ酸塩及び１３Ｃ－シュウ酸塩消費を示す図である。クレアチニン±平均値の標準誤差によって正規化した尿中シュウ酸塩または尿中１３Ｃ－シュウ酸塩回収率の平均を示したデータである。ペアのｔ検定を使用して統計的解析を実施した。＊＊ｐ＜０．０１。 ＳＹＮＢ８８０２がｉｎ ｖｉｖｏで生存可能であり、かつ２４時間以内にマウスの糞便から消失することを示す図である。 ６時間及び２４時間にわたってカニクイザルの糞便から回収されたＳＹＮ－ＨＯＸ（ＳＹＮ８８０２）を示した図である。 ＳＹＮＢ８８０２の凍結乾燥（Ｌｙｏ）及び凍結液体（ＦＬ）による非ヒト霊長類（ＮＨＰ）におけるシュウ酸塩消費を示す図である。 ＣＦＵベース及び生きた細胞ベースのＳＹＮ－ＨＯＸ（ＳＹＮ７１６９）凍結乾燥（Ｌｙｏ）及び凍結液体によるマウスにおけるシュウ酸塩消費を示す図である。 ＳＹＮＢ８８０２による治療後のヒト患者における尿中シュウ酸塩の用量依存的回収率をモデリングしたグラフである。 ｉｎ ｓｉｌｉｃｏシミュレーション（ＩＳＳ）モデルの腸性高シュウ酸尿症の概略図である。 ｉｎ ｓｉｌｉｃｏシミュレーション（ＩＳＳ）によるＳＹＮＢ８８０２投与後のベースラインからの尿中シュウ酸塩の割合の変化を示した図である。このモデリングは、ＳＹＮＢ８８０２が、目的の用量範囲で尿中シュウ酸塩の２０％を超える減少率を達成させる潜在能があることを示唆している。 臨床試験の構成を要約した概略図である。
本開示は、遺伝子改変及びプログラムされた微生物、例えば、細菌、酵母菌、ウイルスなど、その医薬組成物、ならびにシュウ酸塩が有害となる障害を調整及び治療する方法を含む。いくつかの実施形態では、微生物、例えば、細菌、酵母菌、またはウイルスは、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする異種遺伝子配列（複数可）を含むように遺伝子組換えされている。いくつかの実施形態では、微生物、例えば、細菌、酵母菌、またはウイルスは、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする異種遺伝子配列（複数可）を含むように遺伝子組換えされており、かつ、低酸素環境、例えば腸内で、シュウ酸塩及び／またはシュウ酸を調整及び減少させることができる。いくつかの実施形態では、遺伝子改変微生物は、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする異種遺伝子配列（複数可）を含み、かつ、シュウ酸、シュウ酸塩、及び／または別の関連代謝産物（複数可）を細菌に輸送することができる。したがって、組換え微生物及び本発明の微生物を含む医薬組成物を使用して、シュウ酸塩またはシュウ酸を異化し、シュウ酸塩が有害となる障害に関連する病態を治療及び／または予防することができる。一実施形態では、シュウ酸塩が有害となる障害は、異常なシュウ酸塩のレベルを伴う障害、例えば、原発性高シュウ酸尿症（すなわち、ＰＨＩ、ＰＨＩＩ、及びＰＨＩＩＩ）、続発性高シュウ酸尿症、腸性高シュウ酸尿症、食事性高シュウ酸尿症、または特発性高シュウ酸尿症である。
いくつかの実施形態では、遺伝子改変微生物は、（ｉ）１つ以上のシュウ酸塩輸送体（複数可）、（ｉｉ）１つ以上のギ酸塩排出輸送体（複数可）、（ｉｉｉ）シュウ酸塩の輸送（取り込み）及びギ酸塩の排出の両方を媒介する１つ以上のポリペプチド（複数可）（例えば、シュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体（複数可））、ならびに（ｉｖ）これらの任意の組み合わせ、のうち１つ以上をコードする遺伝子配列（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、微生物は、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）、ならびに、（ｉ）１つ以上のシュウ酸塩輸送体（複数可）、（ｉｉ）１つ以上のギ酸塩排出輸送体（複数可）、（ｉｉｉ）シュウ酸塩の輸送（取り込み）及びギ酸塩の排出の両方を媒介する１つ以上のポリペプチド（複数可）（例えば、シュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体（複数可））、及び（ｉｖ）これらの任意の組み合わせ、のうち１つ以上をコードする遺伝子配列（複数可）を含むように遺伝子改変されている。
本開示をより容易に理解できるように、特定の用語をまず定義する。これらの定義は、本開示のこれ以降の記載に照らして、当業者によって理解されるように読まれるべきである。特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての専門的及び科学的用語は、当業者によって一般に理解されているものと同じ意味を有する。他の定義についても、本明細書の全体を通して詳細を説明する。
本明細書で使用される場合、用語「微生物」または「組換え微生物」とは、その天然状態から遺伝子操作された微生物、例えば、細菌もしくはウイルス細胞、または細菌もしくはウイルスを指す。したがって、「組換え細菌細胞」または「組換え細菌」とは、それらの天然状態から遺伝子操作された細菌細胞または細菌を指す。例えば、組換え細菌細胞は、それらのＤＮＡに導入される、ヌクレオチド挿入、ヌクレオチド欠失、ヌクレオチド再配列、及びヌクレオチド修飾を有する場合がある。これらの遺伝子修飾は、細菌もしくは細菌細胞の染色体に、または細菌もしくは細菌細胞内のプラスミド上に存在する場合がある。本明細書にて開示する組換え細菌細胞は、プラスミド上に外因的ヌクレオチド配列を含み得る。あるいは、組換え細菌細胞は、それらの染色体に安定に組み込まれた外因的ヌクレオチド配列を含んでもよい。
「プログラムまたは遺伝子改変された微生物」とは、特定の機能を行うように、その天然状態から遺伝子操作された微生物、例えば、細菌もしくはウイルス細胞、または細菌もしくはウイルスを指す。したがって、「プログラムもしくは遺伝子改変された細菌細胞」、「プログラムもしくは遺伝子改変された細菌」、または「遺伝子組換えされた細菌細胞もしくは細菌」とは、特定の機能を行うように、例えば、シュウ酸塩などの代謝産物を代謝するように、その天然状態から遺伝子操作された細菌細胞または細菌を指す。特定の実施形態では、プログラムまたは遺伝子改変された細菌細胞は、１つ以上のタンパク質、例えば、治療活性を有するか、または治療目的に貢献する１つ以上のタンパク質を発現するように修飾されている。追加として、プログラムまたは遺伝子改変された細菌細胞は、目的のタンパク質（複数可）が発現されると、それ自身の成長を止めるか、それ自身を破壊する能力を有する場合がある。
本明細書で使用される場合、用語「遺伝子」とは、タンパク質またはそのフラグメントをコードする核酸フラグメントを指し、必要に応じて、コード配列の前（５’非コード配列）及び後（３’非コード配列）の調節配列を含む。一実施形態では、「遺伝子」は、コード配列の前後に調節配列を含まない。「天然遺伝子」とは、自然界で見られる遺伝子を指し、必要に応じて、コード配列の前後にそれ自体の調節配列を有する。「キメラ遺伝子」とは、天然遺伝子ではない任意の遺伝子を指し、必要に応じて、コード配列の前後に調節配列を含み、ここで、各コード配列及び／または各調節配列の全てまたは一部は、自然界で一緒に見られないものである。したがって、キメラ遺伝子は、異なるソースに由来する調節配列及びコード配列、または同じソースに由来するが、自然界で見られるものとは異なって配列された調節配列及びコード配列を含み得る。
本明細書で使用される場合、用語「遺伝子配列」とは、遺伝性配列、例えば、核酸配列を意味するものである。遺伝子配列または遺伝性配列は、完全な遺伝子配列または部分的な遺伝子配列を含むことを意味する。遺伝子配列または遺伝性配列は、タンパク質またはポリペプチドをコードする配列を含むことを意味し、かつタンパク質またはポリペプチド、例えば、調節配列、先導配列、シグナル配列、または他の非タンパク質コード配列をコードしない遺伝性配列も含むことを意味する。
本明細書で使用される場合、「異種」遺伝子または「異種配列」とは、自然界の所与の細胞では通常見られないヌクレオチド配列を指す。本明細書で使用される場合、異種配列は、所与の細胞に外因的に導入される核酸配列を含み、かつ天然配列（細胞において天然に見られるか、または発現している）または非天然配列（細胞において天然に見られないか、発現していない）である場合があり、さらに、天然配列もしくは野生型配列、または変異配列、非天然配列、もしくは合成配列であり得る。「異種遺伝子」は、天然遺伝子またはそのフラグメントを含み、対応する天然遺伝子とは異なる形態で宿主細胞に導入されている。例えば、異種遺伝子は、宿主細胞に再導入される非天然調節領域を含むキメラ遺伝子の一部である天然のコード配列を含み得る。異種遺伝子はまた、非天然宿主細胞に導入される天然遺伝子またはそのフラグメントを含み得る。したがって、異種遺伝子は、受容細胞にとって外的なものまたは天然のもの；所与の細胞で天然に見られるが不自然な量の核酸及び／またはポリペプチドを発現させ、それをコードする核酸配列；及び／または自然界で互いに同じ関係では見られない２つ以上の核酸配列であってもよい。本明細書で使用される場合、用語「内因性遺伝子」とは、生命体のゲノム中でその自然な位置にある天然遺伝子を指す。本明細書で使用される場合、用語「導入遺伝子」とは、宿主生物、例えば、宿主細菌細胞、ゲノムに導入されている遺伝子を指す。
本明細書で使用される場合、「非天然」核酸配列とは、微生物に通常存在しない核酸配列、例えば、内因性配列の追加のコピー、または細菌もしくはウイルスの異なる種、菌株、もしくは亜系由来の配列などの異種配列、あるいは、同じ亜型の細菌もしくはウイルスからの未修飾配列と比べて、修飾及び／または突然変異された配列を指す。いくつかの実施形態では、非天然核酸配列は、合成配列、天然に存在しない配列である（例えば、Ｐｕｒｃｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２０１３を参照されたい）。非天然核酸配列は、調節領域、プロモーター、遺伝子、及び／または遺伝子カセット内の１つ以上の遺伝子であり得る。いくつかの実施形態では、「非天然」とは、自然界で互いに同じ関係では見られない２つ以上の核酸配列を指す。非天然核酸配列は、プラスミドまたは染色体上に存在し得る。いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子組換えされた微生物は、自然界における上記遺伝子と関連のない、プロモーターに操作可能に連結された遺伝子及び／または遺伝子カセットを含む。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書にて開示する遺伝子組換えされた細菌は、本明細書に記載の１つ以上のシュウ酸塩代謝酵素（複数可）、１つ以上のシュウ酸塩輸送体（複数可）、１つ以上の排出輸送体（複数可）（例えば、ギ酸塩の）、及び／または１つ以上の対向輸送体（複数可）（例えば、シュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体（複数可））をコードする遺伝子または遺伝子カセットを含み、該遺伝子または該遺伝子カセットは、直接的または間接的な誘導性プロモーターに操作可能に連結されており、該誘導性プロモーターは、自然界における上記遺伝子と関連のない、例えば、本明細書に記載の１つ以上のシュウ酸塩代謝酵素（複数可）、１つ以上のシュウ酸塩輸送体（複数可）、１つ以上の排出輸送体（複数可）（例えば、ギ酸塩の）、及び／または１つ以上の対向輸送体（複数可）（例えば、シュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体（複数可））のＦＮＲ応答性のもの（または本明細書に記載の他のプロモーター）であり、本明細書に記載の１つ以上のシュウ酸塩代謝酵素（複数可）、１つ以上のシュウ酸塩輸送体（複数可）、１つ以上の排出輸送体（複数可）（例えば、ギ酸塩の）、及び／または１つ以上の対向輸送体（複数可）（例えば、シュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体（複数可））をコードする遺伝子に操作可能に連結されている。いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子組換えされたウイルスは、自然界における上記遺伝子または遺伝子カセットと関連のない、直接的または間接的な誘導性プロモーター、例えば、１つ以上のシュウ酸塩代謝酵素（複数可）、１つ以上のシュウ酸塩輸送体（複数可）、１つ以上の排出輸送体（複数可）（例えば、ギ酸塩の）、及び／または１つ以上の対向輸送体（複数可）（例えば、シュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体（複数可））をコードする遺伝子及び／または遺伝子カセットに操作可能に連結されたプロモーターに操作可能に連結された遺伝子または遺伝子カセットを含む。
本明細書で使用される場合、用語「コード領域」とは、特定のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を指す。用語「調節配列」とは、コード配列の上流（５’非コード配列）、内部、または下流（３’非コード配列）に位置し、関連するコード配列の転写、ＲＮＡプロセシング、ＲＮＡ安定性、または翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を指す。調節配列の例としては、プロモーター、翻訳先導配列、エフェクター結合部位、シグナル配列、及びステム－ループ構造が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、調節配列は、プロモーター、例えば、本明細書にて開示するＦＮＲ応答性プロモーターまたは他のプロモーターを含む。
「操作可能に連結された」とは、あるものが他のものから影響を受けるような単一の核酸フラグメント上の複数の核酸配列の連結を指す。調節要素は、調節要素とコード配列との間の距離に関係なく、遺伝子コード配列の発現に影響を与えることができる場合、コード配列と操作可能に連結されている。より具体的には、操作可能に連結されたとは、核酸配列、例えば、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素をコードする遺伝子または遺伝子カセットが、核酸配列、例えば、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）、１つ以上のシュウ酸塩輸送体（複数可）、１つ以上の排出輸送体（複数可）（例えば、ギ酸塩の）、及び／または１つ以上の対向輸送体（複数可）（例えば、シュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体（複数可））をコードする遺伝子（複数可）または遺伝子カセットの発現を可能にするような方法で調節配列に結合していることを指す。言い換えれば、調節配列は、シスで作用する。一実施形態では、遺伝子は、遺伝子の発現を可能にするような方法で調節配列に「直接的に連結される」場合がある。別の実施形態では、遺伝子は、遺伝子の発現を可能にするような方法で調節配列に「間接的に連結される」場合がある。一実施形態では、２つ以上の遺伝子が、２つ以上の遺伝子の発現を可能にするような方法で調節配列に直接的または間接的に連結される場合がある。調節領域または調節配列は、目的の遺伝子の転写を指示することができ、かつプロモーター配列、エンハンサー配列、応答性要素、タンパク質認識部位、誘導性要素、プロモーター制御要素、タンパク質結合配列、５’及び３’非翻訳領域、転写開始点、終止配列、ポリアデニル化配列、及び介在配列を含み得る核酸である。
本明細書で使用される場合「プロモーター」とは、コード配列または遺伝子の発現を制御することができるヌクレオチド配列を指す。プロモーターは、一般に、それらが調節する配列の５’位に配置される。プロモーターは、その全体が天然遺伝子に由来するか、または自然界で見られるプロモーターに由来する異なる要素で構成されるか、及び／または合成ヌクレオチドセグメントを含み得る。当業者であれば、異なるプロモーターが、特定の刺激に応じて、例えば細胞または組織に特異的な方法で、異なる環境条件または生理学的条件に応じて、あるいは特定の化合物に応じて、コード配列または遺伝子の発現を調節できることを容易に理解されるであろう。原核生物プロモーターは、通常、誘導性プロモーターと構成的プロモーターの２つのクラスに分類される。「構成的プロモーター」とは、その制御下でコード配列または遺伝子の連続的な転写を可能にするプロモーターを指す。
「構成的プロモーター」とは、その制御下でコード配列または遺伝子の連続的な転写を促進することができる、及び／またはコード配列または遺伝子に操作可能に連結されたプロモーターを指す。構成的プロモーター及び変異体は当該技術分野において周知であり、例えば、Ｐｔａｃプロモーター、ＢＢａ＿Ｊ２３１００、構成的Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ σＳプロモーター（例えば、ｏｓｍＹプロモーター（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｍａｃｈｉｎｅ （ｉＧＥＭ） Ｒｅｇｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐａｒｔｓ Ｎａｍｅ ＢＢａ＿Ｊ４５９９２；ＢＢａ＿Ｊ４５９９３））、構成的Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ σ３２プロモーター（例えば、ｈｔｐＧ熱ショックプロモーター（ＢＢａ＿Ｊ４５５０４））、構成的Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ σ７０プロモーター（例えば、ｌａｃｑプロモーター（ＢＢａ＿Ｊ５４２００；ＢＢａ＿Ｊ５６０１５）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＣｒｅＡＢＣＤリン酸塩感知オペロンプロモーター（ＢＢａ＿Ｊ６４９５１）、ＧｌｎＲＳプロモーター（ＢＢａ＿Ｋ０８８００７）、ｌａｃＺプロモーター（ＢＢａ＿Ｋ１１９０００；ＢＢａ＿Ｋ１１９００１）；Ｍ１３Ｋ０７遺伝子Ｉプロモーター（ＢＢａ＿Ｍ１３１０１）；Ｍ１３Ｋ０７遺伝子ＩＩプロモーター（ＢＢａ＿Ｍ１３１０２）、Ｍ１３Ｋ０７遺伝子ＩＩＩプロモーター（ＢＢａ＿Ｍ１３１０３）、Ｍ１３Ｋ０７遺伝子ＩＶプロモーター（ＢＢａ＿Ｍ１３１０４）、Ｍ１３Ｋ０７遺伝子Ｖプロモーター（ＢＢａ＿Ｍ１３１０５）、Ｍ１３Ｋ０７遺伝子ＶＩプロモーター（ＢＢａ＿Ｍ１３１０６）、Ｍ１３Ｋ０７遺伝子ＶＩＩＩプロモーター（ＢＢａ＿Ｍ１３１０８）、Ｍ１３１１０（ＢＢａ＿Ｍ１３１１０））、構成的Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ σＡプロモーター（例えば、プロモーターｖｅｇ（ＢＢａ＿Ｋ１４３０１３）、プロモーター４３（ＢＢａ＿Ｋ１４３０１３）、ＰｌｉａＧ（ＢＢａ＿Ｋ８２３０００）、ＰｌｅｐＡ（ＢＢａ＿Ｋ８２３００２）、Ｐｖｅｇ（ＢＢａ＿Ｋ８２３００３））、構成的Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ σＢプロモーター（例えば、プロモーターｃｔｃ（ＢＢａ＿Ｋ１４３０１０）、プロモーターｇｓｉＢ（ＢＢａ＿Ｋ１４３０１１））、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａプロモーター（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ由来のＰｓｐｖ２（ＢＢａ＿Ｋ１１２７０６）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ由来のＰｓｐｖ（ＢＢａ＿Ｋ１１２７０７））、バクテリオファージＴ７プロモーター（例えば、Ｔ７プロモーター（ＢＢａ＿Ｉ７１２０７４；ＢＢａ＿Ｉ７１９００５；ＢＢａ＿Ｊ３４８１４；ＢＢａ＿Ｊ６４９９７；ＢＢａ＿Ｋ１１３０１０；ＢＢａ＿Ｋ１１３０１１；ＢＢａ＿Ｋ１１３０１２；ＢＢａ＿Ｒ００８５；ＢＢａ＿Ｒ０１８０；ＢＢａ＿Ｒ０１８１；ＢＢａ＿Ｒ０１８２；ＢＢａ＿Ｒ０１８３；ＢＢａ＿Ｚ０２５１；ＢＢａ＿Ｚ０２５２；ＢＢａ＿Ｚ０２５３））、及びバクテリオファージＳＰ６プロモーター（例えば、ＳＰ６プロモーター（ＢＢａ＿Ｊ６４９９８））が挙げられるが、これらに限定されない。
「誘導性プロモーター」とは、１つ以上の遺伝子に操作可能に連結された調節領域を指し、ここで、遺伝子（複数可）の発現は、上記調節領域の誘導因子の存在下で増加する。「誘導性プロモーター」とは、刺激または外因的な環境条件に応答して、その制御下でコード配列または遺伝子の転写のレベルの増加を開始するプロモーターを指す。「直接的な誘導性プロモーター」とは、調節領域を指し、ここで、該調節領域は、１つ以上のシュウ酸塩代謝酵素（複数可）、１つ以上のシュウ酸塩輸送体（複数可）、１つ以上の排出輸送体（複数可）（例えば、ギ酸塩の）、及び／または１つ以上の対向輸送体（複数可）（例えば、シュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体（複数可））をコードする遺伝子及び／または遺伝子カセットに操作可能に連結されており、この際、上記調節領域の誘導因子の存在下で、タンパク質またはポリペプチドが発現する。「間接的な誘導性プロモーター」とは、例えば、第１タンパク質、ポリペプチド、または因子、例えば転写調節因子をコードする第１遺伝子に操作可能に連結され、第２遺伝子に操作可能に連結された第２調節領域を調節することができ、この第２調節領域が活性化または抑制されると、第２遺伝子の発現が活性化または抑制され得る、第１調節領域、など２つ以上の調節領域を含む調節系を指す。直接的な誘導性プロモーター及び間接的な誘導性プロモーターの両方は、「誘導性プロモーター」に含まれる。本明細書に記載の例示的な誘導性プロモーターとしては、酸素レベル依存性プロモーター（例えば、ＦＮＲ誘導性プロモーター）、炎症または炎症反応によって誘導されるプロモーター（ＲＮＳ、ＲＯＳプロモーター）、及び腸内で自然に存在する、または存在しない場合がある（例えば、外因的に添加され得る）代謝産物、例えば、アラビノース及びテトラサイクリンによって誘導されるプロモーターなどが挙げられる。誘導性プロモーターの例としては、ＦＮＲ応答性プロモーター、ＰａｒａＣプロモーター、ＰａｒａＢＡＤプロモーター、ＰＴｅｔＲプロモーター、及びＰＬａｃＩプロモーターが挙げられるが、これらに限定されず、これらのそれぞれについては本明細書にてより詳細に記載する。他の誘導性プロモーターの例について、本明細書にて後述する。
本明細書で使用される場合、「安定的に維持される」または「安定した」細菌は、非天然遺伝物質、例えば、１つ以上のシュウ酸塩代謝酵素（複数可）、１つ以上のシュウ酸塩輸送体（複数可）、１つ以上の排出輸送体（複数可）（例えば、ギ酸塩の）、及び／または１つ以上の対向輸送体（複数可）（例えば、シュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体（複数可））をコードする遺伝子及び／または遺伝子カセットを保有している細菌宿主細胞を指すために使用され、ここで、この遺伝子及び／または遺伝子カセットは、非天然遺伝物質が維持され、発現され、かつ伝搬されるように宿主ゲノムに組み込まれるか、または自己複製染色体外プラスミドによって伝搬される。安定した細菌は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、例えば培地で、及び／またはｉｎ ｖｉｖｏ、例えば腸内で、生存及び／または増殖することができる。例えば、安定した細菌は、１つ以上のシュウ酸塩代謝酵素（複数可）、１つ以上のシュウ酸塩輸送体（複数可）、１つ以上の排出輸送体（複数可）（例えば、ギ酸塩の）、及び／または１つ以上の対向輸送体（複数可）（例えば、シュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体（複数可））をコードする遺伝子及び／または遺伝子カセットを含む遺伝子組換えされた細菌であり得、この際、この遺伝子を有するプラスミドまたは染色体は、１つ以上のシュウ酸塩代謝酵素（複数可）、１つ以上のシュウ酸塩輸送体（複数可）、１つ以上の排出輸送体（複数可）（例えば、ギ酸塩の）、及び／または１つ以上の対向輸送体（複数可）（例えば、シュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体（複数可））が細菌で発現でき、かつこの細菌がｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／またはｉｎ ｖｉｖｏで、生存及び／または増殖することができるように、細菌内で安定に維持される。いくつかの実施形態では、コピー数は、非天然遺伝物質の発現の安定性に影響を及ぼす。いくつかの実施形態では、コピー数は、非天然遺伝物質の発現のレベルに影響を及ぼす。
本明細書で使用される場合、用語「発現」とは、核酸に由来するセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写及び安定した蓄積、及び／またはｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を意味する。
本明細書で使用される場合、用語「プラスミド」または「ベクター」とは、染色体外核酸、例えば、ＤＮＡ、細菌細胞のゲノムに組み込まれない構築物を指す。プラスミドは、通常、環状であり、かつ自己複製することができる。プラスミドは、当技術分野で良く知られているような低コピー、中コピー、または高コピーであってよい。プラスミドは、必要に応じて抗生物質耐性遺伝子などの選択マーカーを含んでいてもよく、これは、プラスミドを含む細菌細胞を選択することを助力し、かつプラスミドが細菌細胞内に維持されることを確実にするものである。本明細書にて開示するプラスミドは、異種遺伝子、例えば、１つ以上のシュウ酸塩代謝酵素（複数可）、１つ以上のシュウ酸塩輸送体（複数可）、１つ以上の排出輸送体（複数可）（例えば、ギ酸塩の）、及び／または１つ以上の対向輸送体（複数可）（例えば、シュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体（複数可））をコードする遺伝子及び／または遺伝子カセットをコードする核酸配列を含んでいてもよい。
本明細書で使用される場合、用語「形質転換する」または「形質転換」とは、遺伝的に安定した継承をもたらす核酸フラグメントの宿主細菌細胞への転移を指す。形質転換された核酸フラグメントを含む宿主細菌細胞は、「組換え」または「遺伝子導入」または「形質転換された」生物と呼ばれる。
本明細書で使用される場合、用語「遺伝子修飾」は、任意の遺伝的変化を指す。例示的な遺伝子修飾としては、例えば、天然染色体または染色体外遺伝物質の修飾を含む遺伝子の発現の増加、減少または消滅などが挙げられる。また、例示的な遺伝子修飾には、少なくとも１つのプラスミドの導入、染色体もしくは染色体外遺伝性配列（複数可）の修飾、突然変異、塩基欠失、塩基付加、塩基置換、及び／またはコドン修飾、遺伝子過剰発現、遺伝子増幅、遺伝子抑制、プロモーター修飾もしくは置換、遺伝子付加（シングルコピーもしくはマルチコピー）、アンチセンス発現もしくは抑制、あるいは、その変化が表現型の変化を生じさせるかどうかにかかわらず、宿主細胞の遺伝的要素の任意の他の変化も含まれる。遺伝子修飾には、プラスミド、例えば、プロモーターに操作可能に連結された、１つ以上のシュウ酸塩代謝酵素（複数可）、１つ以上のシュウ酸塩輸送体（複数可）、１つ以上の排出輸送体（複数可）（例えば、ギ酸塩の）、及び／または１つ以上の対向輸送体（複数可）（例えば、シュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体（複数可））をコードする遺伝子及び／または遺伝子カセットを含むプラスミドの細菌細胞への導入が含まれる場合がある。遺伝子修飾にはまた、染色体内の標的置換、例えば、天然遺伝子プロモーターを、誘導性プロモーター、調節プロモーター、強力なプロモーター、または構成的プロモーターに置換することが含まれ得る。遺伝子修飾にはまた、遺伝子増幅、例えば、天然遺伝子の少なくとも１つの追加のコピーの細胞の染色体への導入が含まれる場合がある。あるいは、染色体遺伝子修飾は、遺伝子突然変異を含み得る。
本明細書で使用される場合、用語「遺伝子突然変異」とは、その天然配列または野生型配列にはない、ヌクレオチド配列を変化させる遺伝子または関連する調節領域のヌクレオチド配列における１つの変化または複数の変化を指す。突然変異としては、例えば、野生型配列内の全体的または部分的な置換、付加、及び欠失が挙げられる。このような置換、付加、または欠失は、単一のヌクレオチド変化（例えば、１つ以上の点突然変異）、または２つ以上ヌクレオチド変化である場合があり、これらの変化は、配列に実質的な変化をもたらし得る。突然変異は、遺伝子のコード領域内だけではなく、遺伝子の非コード配列及び調節配列でも起こり得る。用語「遺伝子突然変異」は、コード領域内の沈黙突然変異及び保存的突然変異だけではなく、遺伝子によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変える変化を含むことが意図されている。遺伝子コード配列内の遺伝子突然変異は、例えば、遺伝子のポリペプチド産物の活性（例えば、酵素活性）を、増加、減少または変化させる場合がある。調節配列内の遺伝子突然変異は、変化した調節配列に操作可能に連結された配列の発現を、増加、減少、または変化させる場合がある。
具体的には、用語「細菌細胞からのシュウ酸塩の排出を減少させる遺伝子修飾」とは、上記修飾のない細菌細胞、例えば、野生型細菌細胞からのシュウ酸塩の排出速度または排出量よりも、細菌細胞からのシュウ酸塩の排出速度または排出量を減少させる遺伝子修飾を指す。一実施形態では、細菌細胞からのシュウ酸塩の排出を減少させる遺伝子修飾のある組換え細菌細胞は、天然遺伝子の遺伝子突然変異を含む。別の実施形態では、細菌細胞からのシュウ酸塩の排出を減少させる遺伝子修飾のある組換え細菌細胞は、シュウ酸塩排出輸送体をコードする遺伝子の転写を減少または阻害する、天然プロモーター内の遺伝子突然変異を含む。別の実施形態では、細菌細胞からのシュウ酸塩の排出を減少させる遺伝子修飾のある組換え細菌細胞は、シュウ酸塩排出輸送体の抑制因子の過剰発現をもたらす遺伝子突然変異を含む。別の実施形態では、細菌細胞からのシュウ酸塩の排出を減少させる遺伝子修飾のある組換え細菌細胞は、シュウ酸塩排出輸送体をコードする遺伝子の翻訳を減少または阻害する遺伝子突然変異を含む。
さらに、用語「細菌細胞へのシュウ酸塩の取り込みを増加させる遺伝子修飾」とは、上記修飾のない細菌細胞、例えば、野生型細菌細胞の細胞質ゾルへのシュウ酸塩の摂取率または摂取量よりも、細菌細胞の細胞質ゾルへのシュウ酸塩の摂取率を増加させるか、または摂取量を増加させる遺伝子修飾を指す。いくつかの実施形態では、細菌細胞へのシュウ酸塩の取り込みを増加させる遺伝子修飾のある遺伝子改変細菌細胞とは、１つ以上のシュウ酸塩取り込み輸送体／輸送体（複数可）をコードする異種遺伝子配列（天然または非天然）を含む細菌細胞を指す。いくつかの実施形態では、細菌細胞へのシュウ酸塩の取り込みを増加させる遺伝子修飾を含む遺伝子組換えされた細菌は、細菌細胞へシュウ酸塩を輸送する、シュウ酸塩輸送体もしくは他の代謝産物輸送体または対向輸送体、例えば、シュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体をコードする遺伝子配列（複数可）を含む。輸送体は、細胞へのシュウ酸塩の取り込みを助力または可能にする任意の輸送体であり得る。特定の実施形態では、シュウ酸塩輸送体は、対向輸送体、例えば、シュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体、例えば、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のＯｘｌＴである。特定の実施形態では、遺伝子改変細菌細胞は、例えば、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のＯｘｌＴをコードする遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子改変細菌は、シュウ酸塩輸送体、例えば、シュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体、例えば、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のＯｘｌＴをコードする遺伝子配列の２つ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子改変細菌は、２つ以上のシュウ酸塩輸送体、例えば、２つ以上の異なるシュウ酸塩輸送体をコードする遺伝子配列（複数可）を含む。
本明細書で使用される場合、用語「輸送体」とは、メカニズム、例えば、分子、例えば、アミノ酸ペプチド（ジペプチド、トリペプチド、ポリペプチドなど）、毒素、代謝産物、基質、ならびにその他の生体分子を外部環境に由来する微生物に取り込むための、１つのタンパク質、複数のタンパク質、またはタンパク質複合体を意味する。本明細書で使用される場合、用語「輸送体」はまた、代謝産物を取り込み、かつ排出することができる対向輸送体、例えば、本明細書に記載のシュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体などを含む。本明細書で使用される場合、用語「輸送体」及び「取り込み輸送体」は、同様な意味合いで用いられる。
本明細書で使用される場合、用語「シュウ酸塩」とは、式Ｃ２Ｏ４ ２－のジアニオンを指す。シュウ酸塩は、シュウ酸の共役塩基である。本明細書で使用される場合、用語「シュウ酸」は、化学式Ｈ２Ｃ２Ｏ４のジカルボン酸を指す。
本明細書で使用される場合、語句「外因的な環境条件」または「外因的な環境シグナル」とは、本明細書に記載のプロモーターが直接的または間接的に誘導される状態での、設定、状況、刺激、または生物学的分子を指す。語句「外因的な環境条件」とは、遺伝子改変微生物に対して外部の環境条件ではあるが、宿主対象環境に対しては内因的なまたは天然の環境条件を意味する。したがって、「外因的な」及び「内因的な」は、同じ意味で用いられることがあり、環境条件を指し、ここで、この環境条件とは、哺乳動物の身体に対しては内因的ではあるが、無傷の微生物細胞に対しては外部のまたは外因的なものである。いくつかの実施形態では、外因的な環境条件は、哺乳動物の腸に特有なものである。いくつかの実施形態では、外因的な環境条件は、哺乳動物の上部消化管に特有のものである。いくつかの実施形態では、外因的な環境条件は、哺乳動物の下部消化管に特有のものである。いくつかの実施形態では、外因的な環境条件は、哺乳動物の小腸に特有のものである。いくつかの実施形態では、外因的な環境条件は、哺乳動物の腸の環境など、低酸素環境、微好気性条件、または嫌気的条件である。いくつかの実施形態では、外因的な環境条件は、哺乳動物の腸に特有な分子または代謝産物、例えば、プロピオン酸塩である。いくつかの実施形態では、外因的な環境条件は、組織特有または疾患特有の代謝産物または分子（複数可）である。いくつかの実施形態では、外因的な環境条件は、疾患、例えば、高シュウ酸尿症に特有のものである。いくつかの実施形態では、外因的な環境条件は、低ｐＨ環境である。いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子組換えされた微生物は、ｐＨ依存性プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子組換えされた微生物は、酸素レベル依存性プロモーターを含む。いくつかの態様では、細菌は、酸素レベルを感知することができる転写因子を進化させている。異なるシグナル伝達経路が、異なる酸素レベルによって引き起こされ、異なる反応速度で発生する場合がある。「酸素レベル依存性プロモーター」または「酸素レベル依存性調節領域」とは、１つ以上の酸素レベル感知転写因子が結合することができる核酸配列を指し、ここで、対応する転写因子の結合及び／または活性化が、下流遺伝子発現を活性する。
酸素レベル依存性転写因子の例としては、ＦＮＲ（フマル酸塩及び硝酸還元酵素）、ＡＮＲ、及びＤＮＲが挙げられるが、これらに限定されない。対応するＦＮＲ応答性プロモーター、ＡＮＲ（嫌気性硝酸呼吸）応答性プロモーター、及び ＤＮＲ（異化型硝酸呼吸調節因子）応答性プロモーターが、当技術分野において既知であり（例えば、Ｃａｓｔｉｇｌｉｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，２００９；Ｅｉｇｌｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８９；Ｇａｌｉｍａｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９９１；Ｈａｓｅｇａｗａ ｅｔ ａｌ．，１９９８；Ｈｏｅｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３；Ｓａｌｍｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００３を参照されたい）、表１にその非限定的例を示す。
非限定的例では、プロモーター（ＰｆｎｒＳ）は、環境酸素が少ないかまったくない条件下で発現することが知られている、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅフマル酸塩及び硝酸還元酵素遺伝子Ｓ（ｆｎｒＳ）から発生させた（Ｄｕｒａｎｄ ａｎｄ Ｓｔｏｒｚ，２０１０；Ｂｏｙｓｅｎ ｅｔ ａｌ，２０１０）。ＰｆｎｒＳプロモーターは、Ｎｉｓｓｌｅで自然に見られるグローバル転写調節因子ＦＮＲによって嫌気的条件下で活性化される。嫌気的条件下では、ＦＮＲは二量体を形成し、その制御下にある特定の遺伝子のプロモーター内の特定の配列に結合し、それによりそれらの発現を活性化させる。ただし、好気性条件下では、酸素が、ＦＮＲ二量体内の鉄－硫黄クラスターと反応し、それらを不活性形態に変換する。このように、ＰｆｎｒＳ誘導性プロモーターは、タンパク質またはＲＮＡの発現を調節するために取り入れられる。ＰｆｎｒＳは、本出願ではＦＮＲＳ、ｆｎｒｓ、ＦＮＲ、Ｐ－ＦＮＲＳプロモーター、及びプロモーターＰｆｎｒＳを指す他の関連する名称と同じ意味で用いられる。
Figure 2023511282000001
活性酸素種（ＲＯＳ）の存在または不在。その他の実施形態では、外因的な環境条件は、活性窒素種（ＲＮＳ）の存在または不在である。いくつかの実施形態では、外因的な環境条件は、炎症反応に関与する生物学的分子、例えば、腸の炎症性傷害で存在する分子である。いくつかの実施形態では、外因的な環境条件またはシグナルは、組換え細菌細胞が存在する環境において天然に存在するか、または天然に存在しない。いくつかの実施形態では、外因的な環境条件またはシグナルは、例えば、生物学的条件の構築もしくは排除、及び／または生物学的分子の投与もしくは排除によって、人工的に作られる。
いくつかの実施形態では、外因的な環境条件（複数可）及び／またはシグナル（複数可）は、誘導性プロモーターの活性を刺激する。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターを活性するように作用する外因的な環境条件（複数可）及び／またはシグナル（複数可）は、哺乳動物の腸内で天然に存在しない。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターは、本開示の医薬組成物、例えば、テトラサイクリン、アラビノース、または誘導性プロモーターを活性ように作用する任意の生物学的分子と組み合わせて投与される分子または代謝産物によって刺激される。いくつかの実施形態では、外因的な環境条件（複数可）及び／またはシグナル（複数可）は、本開示の組換え細菌細胞を含む培養液に添加される。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターを活性するように作用する外因的な環境条件は、哺乳動物の腸内（例えば、低酸素もしくは嫌気的条件、または炎症反応に関与する生物学的分子）で天然に存在する。いくつかの実施形態では、外因的な環境条件（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ）への曝露が減ることにより、プロモーターを誘導する外因的な環境条件が存在しない（例えば、腸の外の好気性環境）ので、誘導性プロモーターの活性が阻害される。「腸」とは、食物の運搬及び消化、栄養素の吸収、及び老廃物の排泄を担う臓器、腺、管、及び系を指す。ヒトでは、腸は、口から始まり肛門で終わる消化（ＧＩ）管を含み、さらに、食道、胃、小腸、及び大腸を含む。腸はまた、脾臓、肝臓、胆嚢、及び膵臓などの副器官及び副腺も含む。上部消化管は、食道、胃、及び小腸の十二指腸を含む。下部消化管は、残りの小腸、すなわち空腸及び回腸、ならびに大腸の全て、すなわち盲腸、結腸、直腸、及び肛門管を含む。細菌は、腸全体で、例えば、消化管で、及び特に腸管で見られる。
「微生物」とは、通常、単一の細胞からなる、微視的、限外顕微的、または超顕微鏡的なサイズの生物または微生物を指す。微生物の例としては、細菌、ウイルス、寄生生物、真菌、特定の藻類、及び原生動物が挙げられる。いくつかの態様では、微生物は、１つ以上の治療用分子、例えば、シュウ酸塩異化酵素（複数可）を産生するように遺伝子改変される（「遺伝子改変微生物」）。特定の実施形態では、遺伝子改変微生物は、遺伝子改変細菌である。特定の実施形態では、遺伝子改変微生物は、遺伝子改変ウイルスである。
「非病原細菌」とは、宿主に疾患または有害な反応を引き起こす能力がない細菌を指す。いくつかの実施形態では、非病原細菌は、グラム陰性菌である。いくつかの実施形態では、非病原細菌は、グラム陽性菌である。いくつかの実施形態では、非病原細菌は、リポ多糖体（ＬＰＳ）を含まない。いくつかの実施形態では、非病原細菌は、共生細菌である。非病原細菌の例としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属に属する特定の菌株、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ，Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ、及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂｏｕｌａｒｄｉｉが挙げられるが、これらに限定されない（Ｓｏｎｎｅｎｂｏｒｎ ｅｔ ａｌ．，２００９；Ｄｉｎｌｅｙｉｃｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４；米国特許第６，８３５，３７６号；米国特許第６，２０３，７９７号；米国特許第５，５８９，１６８号；米国特許第７，７３１，９７６号）。非病原細菌はまた、腸内の常在微生物叢中に存在する共生細菌も含む。一実施形態では、本開示は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂｏｕｌａｒｄｉｉなどの非病原性Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓをさらに含む。天然の病原細菌が、病原性を低減または排除するように遺伝子組換えされてもよい。
「プロバイオティック」は、生きている非病原微生物、例えば、適切な量の微生物を含む、宿主生物に健康上の利益を与えることができる細菌を指すために使用される。いくつかの実施形態では、宿主生物は哺乳動物である。いくつかの実施形態では、宿主生物はヒトである。いくつかの実施形態では、プロバイオティック細菌は、グラム陰性菌である。いくつかの実施形態では、プロバイオティック細菌は、グラム陽性菌である。非病原細菌のいくつかの種、菌株、及び／または亜型は、現在プロバイオティック細菌として認識されている。プロバイオティック細菌の例としては、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属に属する特定の菌株、例えば、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ、及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ、ならびにＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂｏｕｌａｒｄｉｉが挙げられるが、これらに限定されない（Ｄｉｎｌｅｙｉｃｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４；米国特許第５，５８９，１６８号；米国特許第６，２０３，７９７号；米国特許第６，８３５，３７６号）。プロバイオティックは、細菌の変異体または突然変異株であり得る（Ａｒｔｈｕｒ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｃｕｅｖａｓ－Ｒａｍｏｓ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｏｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｎｏｕｇａｙｒｅｄｅ ｅｔ ａｌ．， ２００６）。非病原細菌は、所望の生物学的特性、例えば、生存性を強化または改善するように遺伝子組換えされ得る。非病原細菌は、プロバイオティック特性を提供するように遺伝子組換えされ得る。プロバイオティック細菌は、プロバイオティック特性を強化または改善するように遺伝子組換えされ得る。
本明細書で使用される場合、用語「栄養要求体」または「栄養要求性」とは、特定の因子、例えば、アミノ酸、糖、または他の栄養素を、その成長をサポートするために必要とする生物を指す。「栄養要求性修飾」は、上記栄養素を産生できないことが理由で生存または増殖に不可欠な外因的に添加された栄養素がない場合に、生物を死に至らしめる遺伝子修飾である。本明細書で使用される場合、用語「必須遺伝子」とは、細胞増殖及び／または生存に必要な遺伝子を指す。必須遺伝子については、以下でより詳細に説明するが、必須遺伝子としては、ＤＮＡ合成遺伝子（ｔｈｙＡなど）、細胞壁合成遺伝子（ｄａｐＡなど）、及びアミノ酸遺伝子（ｓｅｒＡ及びｍｅｔＡなど）が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、用語「調整する」及び「治療する」、ならびにそれらと同類の語は、疾患、障害、及び／または病態、あるいはそれらの少なくとも１つの認識可能な症状の改善を指す。別の実施形態では、「調整する」及び「治療する」とは、必ずしも患者によって認識可能とは限らない、少なくとも１つの測定可能な物理的パラメータの改善を指す。別の実施形態では、「調整する」及び「治療する」とは、物理的に（例えば、認識可能な症状の安定化）、生理学的に（例えば、物理的パラメータの安定化）のいずれかで、またはその両方で、疾患、障害、及び／または病態の進行を阻害することを指す。別の実施形態では、「調整する」及び「治療する」とは、疾患、障害、及び／または病態の進行を遅らせること、または進行を逆転させることを指す。本明細書で使用される場合、「予防」及びそれと同類の語は、所与の疾患、障害、及び／または病態、あるいは、そのような疾患、障害、及び／または病態に関連する症状の発症を遅らせること、または罹患するリスクを低減することを指す。
治療の必要な個人には、特定の医学的疾患をすでに患っている個人、ならびに、そのリスクがある個人、または最終的に疾患を患う可能性がある個人が含まれる。治療の必要性は、例えば、疾患の発症、疾患の存在もしくは進行、または疾患を患っている対象の治療に対する適当な受容性に関する１つ以上のリスク因子の存在によって評価される。シュウ酸塩が有害となる障害、例えば、高シュウ酸尿症は、既知の治療法がない先天性の遺伝子突然変異によって引き起こされる場合がある。疾患はまた、その他の病態、例えば、腸管疾患に続発する場合もある。原発性高シュウ酸尿症または続発性高シュウ酸尿症などのシュウ酸塩が有害となる疾患を治療することは、シュウ酸塩及び／またはシュウ酸の標準的なレベルを低下させること、シュウ酸塩及び／またはシュウ酸の過剰なレベルを低下させること、あるいは、シュウ酸塩及び／またはシュウ酸を排除することを含むが、必ずしも基礎疾患の排除を含むわけではない。
本明細書で使用される場合、用語「異化」とは、シュウ酸塩の細胞摂取、シュウ酸塩の対応するシュウ酸ＣｏＡへの分解、及び／またはシュウ酸ＣｏＡギ酸塩及び二酸化炭素の分解を指す。一実施形態では、シュウ酸塩の細胞摂取は、腎臓で起こる。一実施形態では、細胞摂取は、肝臓で起こる。一実施形態では、シュウ酸塩の細胞摂取は、腸管で起こる。一実施形態では、シュウ酸塩の細胞摂取は、胃で起こる。一実施形態では、細胞摂取は、ＳＬＣ２６輸送タンパク質によって媒介される（Ｒｏｂｉｊｎ ｅｔ ａｌ．（２０１１）を参照されたい）。一実施形態では、細胞摂取は、輸送タンパク質ＳＬＣ２６Ａ１によって媒介される。一実施形態では、細胞摂取は、輸送タンパク質ＳＬＣ２６Ａ６によって媒介される。一実施形態では、シュウ酸塩の細胞摂取は、傍細胞輸送系によって媒介される。一実施形態では、シュウ酸塩の細胞摂取は、経細胞輸送系によって媒介される。
一実施形態では、「異常な異化」とは、シュウ酸塩の細胞摂取の速度の低下を指す。一実施形態では、「異常な異化」とは、２４時間あたり４０ｍｇを超える１日尿中シュウ酸塩排泄量をもたらす、いずれかの病態（複数可）、障害（複数可）、疾患（複数可）、素因（複数可）、及び／または遺伝子突然変異（複数可）を指す。一実施形態では、「異常な異化」とは、シュウ酸塩の細胞摂取を処理及び／または媒介する器官及び／または系の、不能及び／または能力の低下を指す。一実施形態では、上記のシュウ酸塩の細胞摂取を処理及び／または媒介する器官及び／または系の、不能及び／または能力の低下は、シュウ酸塩の内因的産生の増加が原因である。一実施形態では、シュウ酸塩の内因的産生の増加は、ペルオキシソーム肝臓酵素ＡＧＴの欠如または欠乏に起因する。一実施形態では、シュウ酸塩の内因的産生の増加は、酵素ＧＲＨＰＲの欠如または欠乏に起因する。一実施形態では、シュウ酸塩の内因的産生の増加は、酵素４－ヒドロキシ－２－オキソグルタル酸アルドラーゼの欠如または欠乏に起因する。一実施形態では、上記のシュウ酸塩の細胞摂取を処理及び／または媒介する器官及び／または系の、不能及び／または能力の低下は、シュウ酸塩の吸収の増加が原因である。一実施形態では、上記シュウ酸塩の吸収の増加は、シュウ酸塩の食事摂取量の増加に起因する。一実施形態では、上記シュウ酸塩の吸収の増加は、シュウ酸塩の腸管吸収の増加に起因する。一実施形態では、上記シュウ酸塩の吸収の増加は、シュウ酸塩前駆体の過剰摂取に起因する。一実施形態では、上記シュウ酸塩の吸収の増加は、腸内のシュウ酸塩分解微生物の減少に起因する。一実施形態では、上記シュウ酸塩の吸収の増加は、腸内のシュウ酸塩輸送体の遺伝的変異に起因する。
一実施形態では、「シュウ酸塩が有害となる障害」は、異常な、例えば、シュウ酸塩及び／またはシュウ酸あるいはグリオキシル酸などのすぐ上流の分子のレベルの増加が関係する疾患または障害である。一実施形態では、シュウ酸塩が有害となる障害は、対象において高シュウ酸尿症が観察される障害または疾患である。一実施形態では、シュウ酸塩が有害となる障害とは、２４時間あたり４０ｍｇを超える１日尿中シュウ酸塩排泄量をもたらす、いずれかの病態（複数可）、障害（複数可）、疾患（複数可）、素因（複数可）、及び／または遺伝子突然変異（複数可）を指す。一実施形態では、シュウ酸塩が有害となる障害は、ＰＨＩ、ＰＨＩＩ、ＰＨＩＩＩ、続発性高シュウ酸尿症、腸性高シュウ酸尿症、腸内細菌異常増殖症候群、クローン病、炎症性腸疾患、腎移植後の高シュウ酸尿症、肥満症に対する空腸回腸バイパス後の高シュウ酸尿症、胃潰瘍手術後の高シュウ酸尿症、慢性腸間膜虚血、胃バイパス、嚢胞性線維症、短腸症候群、胆管／膵臓疾患（例えば、慢性膵炎）からなる群から選択される障害または疾患である。
本明細書で使用される場合、「医薬組成物」とは、本開示の遺伝子組換えされた微生物、例えば、遺伝子組換えされた細菌またはウイルスと、生理学的に好適な担体及び／または賦形剤などの他の成分との調製物を指す。一実施形態では、医薬組成物は、凍結液体組成物である。別の実施形態では、医薬組成物は、凍結乾燥組成物である。
同じ意味で用いられる場合がある用語「生理学的に許容される担体」及び「薬学的に許容される担体」とは、生物に重大な炎症を引き起こさず、かつ投与される細菌またはウイルス化合物の生物活性及び特性を抑止しない担体または希釈剤を指す。これらの語句には、アジュバントも含まれる。
用語「賦形剤」とは、活性成分の投与をより促進するために医薬組成物に添加される不活性な物質を指す。例としては、重炭酸カルシウム、重炭酸ナトリウムリン酸カルシウム、様々な糖及びデンプンの類、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、ポリエチレングリコール、及び、例えばポリソルベート２０などの界面活性剤が挙げられるが、これらに限定されない。
用語「治療的有効量」及び「治療上有効な量」は、症状の発症の予防、遅延、または病態の症状、例えば、シュウ酸塩が有害となる障害の寛解をもたらす化合物の量を指すために使用される。治療上有効な量は、例えば、２４時間あたり４０ｍｇを超える１日尿中シュウ酸塩排泄量と関係した疾患または病態の、重症度を治療、予防、低減し、発症を遅延し、及び／または１つ以上の症状の発症のリスクを低減するのに十分な量である。治療上有効な量、ならびに、治療上有効な投与頻度は、当技術分野において知られておる方法、及び下記にて説明する方法によって決定することができる。
本明細書で使用される場合、用語「静菌性」または「細胞増殖抑制」とは、本開示の組換え細菌細胞の成長、分裂、増殖、または複製を、阻止、減速、または阻害することができる分子またはタンパク質を指す。
本明細書で使用される場合、用語「殺菌性」とは、本開示の組換え細菌細胞を殺傷することができる分子またはタンパク質を指す。
本明細書で使用される場合、用語「毒素」とは、本開示の組換え細菌細胞の成長、分裂、増殖、もしくは複製を、阻止、減速、もしくは阻害することができるか、または、本開示の組換え細菌細胞を殺傷することができる、タンパク質、酵素、もしくはそのポリペプチドフラグメント、または他の分子を指す。用語「毒素」は、静菌性タンパク質及び殺菌性タンパク質を含むことを意図している。用語「毒素」には、溶菌タンパク質、バクテリオシン（例えば、ミクロシンまたはコリシン）、ジャイレース阻害剤、ポリメラーゼ阻害剤、転写阻害剤、翻訳阻害剤、ＤＮａｓｅｓ、及びＲＮａｓｅｓが含まれるが、これらに限定されないことが意図される。本明細書中で使用する場合、用語「抗毒素」または「アンチトキシン」は、毒素の活性を阻害することができるタンパク質または酵素を指す。抗毒素という用語には、免疫修飾物質、及び毒素発現阻害剤が含まれるが、これらに限定されないことが意図される。毒素及び抗毒素の例は、当技術分野において既知であり、かつ下記にてより詳細に説明する。
本明細書中で使用する場合、用語「シュウ酸塩異化もしくは異化酵素」、または「シュウ酸塩代謝酵素」は、シュウ酸塩を代謝することができるか、もしくは蓄積しているシュウ酸塩を減少させることができるいずれかの酵素、または、１つ以上の疾患、もしくはシュウ酸塩が有害となる疾患の症状を軽減、緩和、もしくは予防できる酵素を意味する。シュウ酸塩酵素の例としては、ホルミルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素（ホルミルＣｏＡ転移酵素とも呼ばれる）、例えば、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のＦｒｃ、シュウ酸ＣｏＡシンテターゼ（シュウ酸塩ＣｏＡリガーゼとも呼ばれる）、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアシル活性化酵素３（ＳｃＡＡＥ３）、シュウ酸ＣｏＡ脱炭酸酵素、例えば、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のＯｘｃ（本明細書ではｏｘｄＣまたはシュウ酸脱炭酸酵素とも呼ばれる）、アセチルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素（ＡＣＯＣＴ）、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＹｆｄＥ、及びシュウ酸塩、シュウ酸ＣｏＡ、または任意の他のその代謝産物を異化する任意の他の酵素が挙げられるが、これらに限定されない。異化酵素としては、アラニングリオキシル酸アミノ基転移酵素（ＡＧＴ、ＡＧＸＴ遺伝子によってコードされる、例えば、ヒト型）、グリオキシル酸／ヒドロキシピルビン酸還元酵素（ＧＲＨＰＲ；グリオキシル酸還元酵素（ＧＲ）を有する酵素、ヒドロキシピルビン酸還元酵素（ＨＰＲ）、及びＤ－グリセリン酸脱水素酵素（ＤＧＤＨ）活性、例えば、ヒト型）、ならびに、４－ヒドロキシ２－オキソグルタル酸アルドラーゼ（例えば、ヒトのＨＯＧＡ１遺伝子によってコードされ、かつ４－ヒドロキシ２－オキソグルタル酸をピルビン酸及びグリオキサル酸に分解する）が、さらに挙げられる。これらのタンパク質の機能的欠陥は、細胞及び組織内のシュウ酸塩またはそれに対応するα－ケト酸の蓄積をもたらす。本開示のシュウ酸塩代謝酵素は、野生型または修飾シュウ酸塩代謝酵素の両方を含み、組換え及び合成方法を使用して産生するか、または自然界のソースから精製することができる。シュウ酸塩代謝酵素には、完全長ポリペプチド及びその機能的フラグメント、加えて、そのホモログ及び変異体が含まれる。シュウ酸塩代謝酵素には、野生型配列から修飾されたポリペプチド、例えば、１つ以上のアミノ酸欠失、挿入、及び／または置換を有するポリペプチドが含まれ、かつ、例えば、融合ポリペプチド、ならびに追加の配列、例えば調節ペプチド配列、リンカーペプチド配列、及び他のペプチド配列を有するポリペプチドも含まれる場合がある。
本明細書で使用される場合、「ペイロード」とは、細菌またはウイルスなどの遺伝子組換えされた微生物によって産生される目的の１つ以上の分子を指す。いくつかの実施形態では、ペイロードは、治療用ペイロード、例えば、シュウ酸塩異化酵素またはシュウ酸塩輸送体ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ペイロードは、調節分子、例えば、ＦＮＲなどの転写調節因子である。いくつかの実施形態では、ペイロードは、プロモーターまたは抑制因子などの調節要素を含む。いくつかの実施形態では、ペイロードは、ＦＮＲＳ由来のような誘導性プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、ペイロードは、キルスイッチなどの抑制因子要素を含む。いくつかの実施形態では、ペイロードは、抗生物質耐性遺伝子または遺伝子カセットを含む。いくつかの実施形態では、ペイロードは、１つの遺伝子、複数の遺伝子、遺伝子カセット、またはオペロンによってコードされる。代替の実施形態では、ペイロードは、生合成または生化学的経路によって生成され、ここで、この生合成または生化学的経路は、必要に応じて微生物に内因性のものであってもよい。代替の実施形態では、ペイロードは、生合成または生化学的経路によって生成され、ここで、この生合成または生化学的経路は、微生物にとって内因性のものではない。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた微生物は、２つ以上ペイロードを含む。
本明細書で使用される場合、用語「従来の高シュウ酸尿症治療法」または「従来の高シュウ酸尿症療法」とは、シュウ酸塩が有害となる疾患または障害を治療することが、現在受け入れられ、現在の標準治療と見なされ、及び／またはほとんどの医療従事者によって使用されている治療法または療法を指す。これは、それほど幅広く使用されていない代替療法または補完療法とは異なるものである。
本明細書で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、「１つのポリペプチド」に加えて「複数のポリペプチド」を含み、かつ、アミド結合（すなわち、ペプチド結合）によって直線的に連結されたアミノ酸モノマーで構成される分子を指す。用語「ポリペプチド」は、２つ以上のアミノ酸の任意の１つの鎖もしくは複数の鎖を指すが、産物の特定の長さを指すものではない。したがって、「ペプチド」、「ジペプチド」、「トリペプチド」、「オリゴペプチド」、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、または任意の他の用語は、２つ以上のアミノ酸の１つの鎖もしくは複数の鎖を指すために使用され、「ポリペプチド」の定義内に含まれ、かつ、用語「ポリペプチド」は、これらの用語の代わりに使用されるか、またはこれらの用語のいずれかと同じ意味で使用されることがある。用語「ポリペプチド」はまた、例えば、限定はされないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、誘導体化、タンパク質分解切断、または天然に存在しないアミノ酸による修飾を含む、ポリペプチドの発現後修飾の産物を指すことが意図される。ポリペプチドは、天然の生物源に由来するか、または組換え技術によって産生され得る。その他の実施形態では、ポリペプチドは、本発明の遺伝子組換えされた細菌またはウイルスによって産生される。本発明のポリペプチドは、約３以上、５以上、１０以上、２０以上、２５以上、５０以上、７５以上、１００以上、２００以上、５００または以上、１，０００以上、または２，０００以上のアミノ酸のサイズであり得る。ポリペプチドは、定義付けられた３次元構造を有する場合があるが、必ずしもそのような構造を持っているわけではない。定義付けられた３次元構造を有するポリペプチドは、折り畳まれたと表現されるが、定義付けられた３次元構造を持たないが、多数の異なるコンフォメーションをとることができるポリペプチドは、折り畳まれていないと表現される。用語「ペプチド」または「ポリペプチド」とは、タンパク質もしくはタンパク質の一部に対応するアミノ酸配列を指すか、または、非タンパク質配列、例えば、調節ペプチド配列、リーダーペプチド配列、シグナルペプチド配列、リンカーペプチド配列、及びその他のペプチド配列から選択される配列に対応するアミノ酸配列を指す場合がある。
「単離された」ポリペプチドもしくはフラグメント、変異体、またはその誘導体とは、その天然の環境にないポリペプチドを指す。特定の精製レベルが求められるわけではない。任意の好適な技術によって、分離、分画または部分的もしくは実質的に精製された天然のポリペプチドまたは組換えポリペプチドと同様に、限定はされないが、細菌または哺乳動物細胞を含む宿主細胞で発現させた組換え作製ポリペプチド及びタンパク質は、本発明の目的において、単離されているものと見なす。組換えペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質とは、組換えＤＮＡ技術によって作製された、すなわち、ポリペプチドをコードする外因的な組換えＤＮＡ発現構築物によって形質転換された細胞、微生物、または哺乳動物から産生された、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を指す。ほとんどの細菌培養で発現するタンパク質またはペプチドは、通常、グリカンを含まない。前述のポリペプチドのフラグメント、誘導体、類似体、または変異体、及びこれらの任意の組み合わせも、ポリペプチドとして含まれる。用語「フラグメント」、「変異体」、「誘導体」、及び「類似体」には、元のペプチドのアミノ酸配列に十分に類似したアミノ酸配列を有するポリペプチドが含まれ、かつ、対応する元のポリペプチドの少なくとも１つ以上の特性を保持している任意のポリペプチドが含まれる。本発明のポリペプチドのフラグメントには、タンパク質分解フラグメントに加え、欠失フラグメントが含まれる。フラグメントにはまた、本明細書に記載のいずれかのポリペプチドに由来する特定の抗体または生物活性フラグメントもしくは免疫学的活性フラグメントも含まれる。変異体は、天然に存在してもよいし、または天然には存在しなくてもよい。天然に存在しない変異体は、当技術分野において知られている突然変異誘発方法を使用して作製されてよい。変異体ポリペプチドは、保存的または非保存的アミノ酸置換、欠失、または付加を含んでもよい。
ポリペプチドには、融合タンパク質も含まれる。本明細書で使用される場合、用語「変異体」は、元のペプチドの配列、または元のペプチドに十分に類似した配列を含む融合タンパク質を含む。本明細書で使用される場合、用語「融合タンパク質」とは、２つ以上の異なるタンパク質のアミノ酸配列を含むキメラタンパク質を指す。通常、融合タンパク質は、良く知られているｉｎ ｖｉｔｒｏの遺伝子組換え技術によって生じる。融合タンパク質は、融合タンパク質の成分である個々の元のタンパク質と、類似の構造的機能（ただし、必ずしも同じ程度である必要はない）、類似の調節機能（ただし、必ずしも同じ程度である必要はない）、類似の生化学的機能（ただし、必ずしも同じ程度である必要はない）、及び／または免疫学的活性（ただし、必ずしも同じ程度である必要はない）を有していてもよい。「誘導体」には、限定はされないが、２０個の標準アミノ酸のうちの１つ以上の天然に存在するアミノ酸誘導体を含むペプチドが含まれる。２つのペプチドの間の「類似性」は、１つのペプチドのアミノ酸配列と、もう１つのペプチドの配列を比較することによって決定される。あるペプチドのアミノ酸が、別のペプチドの対応するアミノ酸と同一であるか、または保存的アミノ酸置換である場合、それと類似している。保存的置換としては、Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．，ｅｄ．，Ｔｈｅ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ５，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９７８），及びＡｒｇｏｓ，ＥＭＢＯ Ｊ．８（１９８９），７７９－７８５に記載されるものが挙げられる。例えば次のグループ：－Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；－Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ；－Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｐｈｅ；－Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ；Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ；及び－Ａｓｐ、Ｇｌｕの１つに属するアミノ酸は、保存的な変化または置換を表す。
本明細書で使用される場合、用語「十分に類似した」とは、第１アミノ酸配列及び第２アミノ酸配列が、共通の構造的ドメイン及び／または共通の機能的活性を有するように、第１アミノ酸配列が、第２アミノ酸配列と比較して同じもしくは等しいアミノ酸残基の十分もしくは最低限の数を有することを意味する。例えば、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または少なくとも約１００％、同一である共通の構造的ドメインを含むアミノ酸配列は、本明細書では十分類似していると定義される。好ましくは、変異体は、本発明のペプチドのアミノ酸配列に十分に類似する。このような変異体は、概して、本発明のペプチドの機能的活性を保持している。変異体には、１つ以上のアミノ酸欠失（複数可）、付加（複数可）、及び／または置換（複数可）によって、それぞれ、天然ペプチド及びｗｔペプチドとはアミノ酸配列が異なるペプチドが含まれる。これらは、天然に存在する変異体、ならびに、人工的に設計されたものであってよい。
本明細書で使用される場合、用語「リンカー」、「リンカーペプチド」もしくは「ペプチドリンカー」または「リンカー」とは、２つのポリペプチド配列を接続または連結させる、例えば、２つのポリペプチドドメインを連結させる、合成または非天然または天然に存在しないアミノ酸配列を指す。本明細書で使用される場合、用語「合成」とは、天然に存在しないアミノ酸配列を指す。例示的なリンカーについて、本明細書に記載する。別の例示的なリンカーについては、ＵＳ２０１４００７９７０１に記載されており、その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される場合、用語「コドン最適化」とは、核酸分子によってコードされるポリペプチドを改変せずに、宿主生物の典型的なコドン使用頻度を反映する、核酸分子の遺伝子またはコード領域におけるコドンの修飾を指す。このような最適化には、少なくとも１つ、２つ以上または有意な数のコドンを、宿主生物の遺伝子での使用頻度がより高い１つ以上のコドンに置き換えることが含まれる。「コドン最適化配列」とは、既存のコード配列から修飾されたか、または例えば、コード配列から転写された転写ＲＮＡ分子の、発現宿主細胞もしくは生物における翻訳を改善するか、コード配列の転写を改善するように設計された配列を指す。コドン最適化には、発現宿主生物のコドンの好みに適合するようにコード配列のコドンを選択することを含むプロセスが含まれるが、これに限定されない。多くの生物は、成長するポリペプチド鎖への特定のアミノ酸の挿入をコードするために特定のコドンを使用することへの偏りまたは好みを呈する。コドンの好みまたはコドンの偏り、生物間のコドン使用の違いは、遺伝コードの縮重によって可能になり、多くの生物の間で十分に文書で証明されている。コドンの偏りは、多くの場合、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳効率と相関し、それによりとりわけ翻訳されるコドンの特性及び特定の転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に依存すると考えられている。細胞内で圧倒的に多い量のｔＲＮＡが選択されることは、一般にペプチド合成で最も頻繁に使用されるコドンの反映である。したがって、遺伝子は、コドン最適化に基づいて所与の生物における最適な遺伝子発現のために調整することができる。
本明細書で使用される場合、用語「分泌系」または「分泌タンパク質」とは、生体分子、例えば、微生物からのポリペプチド、例えば、細菌の細胞質を分泌または排出することができる天然のまたは非天然の分泌メカニズムを指す。分泌系は、単一のタンパク質を含むか、または複合体に組み立てられた２つ以上タンパク質、例えば、ＨｌｙＢＤを含み得る。グラム陰性菌の分泌系の非限定的例としては、修飾されたＩＩＩ型鞭毛、Ｉ型（例えば、溶血素分泌系）、ＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、ＶＩ型、及びＶＩＩ型分泌系、耐性結節形成分裂（ＲＮＤ）多剤排出ポンプ、種々の単一膜分泌系、が挙げられる。グラム陽性菌の分泌系の非限定的例としては、Ｓｅｃ及びＴＡＴ分泌系が挙げられる。いくつかの実施形態では、分泌されるポリペプチドは、ポリペプチドを特定の分泌系に向けるための、ＲＮＡまたはペプチド起源のいずれかの「分泌タグ」を含む。いくつかの実施形態では、分泌系は、遺伝子改変細菌からポリペプチドが分泌される前にこのタグを除去することができる。例えば、Ｖ型の自己分泌媒介分泌では、Ｎ末端ペプチド分泌タグは、天然Ｓｅｃ系による細胞質から周辺質隔壁への「パッセンジャー」ペプチドの輸送に基づいて除去される。さらに、自己分泌物が外膜を越えて輸送されると、Ｃ末端分泌タグは、自己触媒またはタンパク質分解酵素触媒、例えば、ＯｍｐＴ切断によって除去され得、それにより、治療用ポリペプチドが細胞外環境に放出される。いくつかの実施形態では、分泌系は、「漏出性」または不安定化された外膜の生成に関連し、このことは、例えば、ｌｐｐ、ｏｍｐＣ、ｏｍｐＡ、ｏｍｐＦ、ｔｏｌＡ、ｔｏｌＢ、ｐａｌ、ｄｅｇＳ、ｄｅｇＰ、及びｎｌｐｌを含む、剛性ペプチドグリカン骨格に外膜を繋ぎとめることに関与する遺伝子を除去または突然変異誘発することによって達成され得る。Ｌｐｐは、ペプチドグリカンに対する細菌細胞壁の主要な「ステープル」として機能する。ＴｏｌＡ－ＰＡＬ及びＯｍｐＡ複合体は、Ｌｐｐと同様に機能し、漏出性表現型を生成する他の欠失標的である。さらに、ｄｅｇＳ、ｄｅｇＰ、またはｎｌｐＩなどの周辺質タンパク質分解酵素の活性が失われる場合に、漏出性表現型が観察されている。したがって、いくつかの実施形態では、遺伝子改変細菌は、１つ以上の欠失または突然変異された膜遺伝子、例えば、ｌｐｐ、ｏｍｐＡ、ｏｍｐＡ、ｏｍｐＦ、ｔｏｌＡ、ｔｏｌＢ、及びｐａｌから選択される遺伝子を有する。いくつかの実施形態では、遺伝子改変細菌は、例えば、１つ以上の欠失または突然変異された周辺質タンパク質分解酵素遺伝子、例えば、ｄｅｇＳ、ｄｅｇＰ、及びｎｌｐｌから選択される遺伝子を有する。いくつかの実施形態では、遺伝子改変細菌は、ｌｐｐ、ｏｍｐＡ、ｏｍｐＡ、ｏｍｐＦ、ｔｏｌＡ、ｔｏｌＢ、ｐａｌ、ｄｅｇＳ、ｄｅｇＰ、及びｎｌｐｌ遺伝子から選択される１つ以上の欠失または突然変異された遺伝子（複数可）を有する。
本明細書で使用される場合、冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、明確に正反対のものであるといった指示がない限り、「少なくとも１つ」を意味すると理解されるべきである。
リスト内の要素間で使用される場合、語句「及び／または」は、（１）リストで挙げられた要素が１つだけ存在するか、または（２）複数の要素がそのリストに存在することを意味するものとする。例えば、「Ａ、Ｂ、及び／またはＣ」は、選択がＡのみ；Ｂのみ；Ｃのみ；Ａ及びＢ；Ａ及びＣ；Ｂ及びＣ；あるいはＡ、Ｂ、及びＣである場合があることを意味する。語句「及び／または」は、リスト内の要素「のうち少なくとも１つ」または「のうち１つ以上」と同じ意味で用いられる場合がある。
本明細書において提供される範囲は、その範囲内の全ての値の簡略表記であることが理解される。例えば、１～５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０からなる群からの任意の数、数の組み合わせ、または下位範囲を含むことが理解される。
細菌
本開示の遺伝子組換えされた細菌など、遺伝子組換えされた微生物またはプログラムされた微生物は、シュウ酸塩及び／またはその代謝産物を代謝するための１つ以上の酵素を産生することができる。いくつかの態様において、本開示は、シュウ酸塩レベルの低下をもたらすシュウ酸塩異化酵素または他のタンパク質をコードする１つ以上の異種遺伝子配列（複数可）を含む細菌細胞を提供する。
特定の実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、偏性嫌気性細菌である。特定の実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、条件的嫌気性細菌である。特定の実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、好気性細菌である。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、グラム陽性菌である。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、グラム陽性菌であり、ＬＰＳを欠いている。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、グラム陰性菌である。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、グラム陽性菌及び偏性嫌気性細菌である。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、グラム陽性菌及び条件的嫌気性細菌である。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、非病原細菌である。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、共生細菌である。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、プロバイオティック細菌である。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、病原性を低減または排除するように修飾または突然変異された天然の病原細菌である。例示的な細菌としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉａ、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｖｉｂｒｉｏ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ ＵＣＣ２００３、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ Ｍ－５５、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｏｃｈｌｅａｒｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｆｅｌｓｉｎｅｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｍｕｌｔｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｎｏｖｙｉ－ＮＴ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐａｒａｐｕｔｒｉｆｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐａｓｔｅｕｒｅａｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｃｔｉｎｏｖｏｒｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｒｔｉｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｙｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ１９１７、Ｌｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、及びＶｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ、及びＯｘａｌｏｂａｃｔｅｒ ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ細菌細胞からなる群から選択される。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂｏｕｌａｒｄｉｉ。特定の実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ、及びＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ細菌細胞から選択される。一実施形態では、細菌細胞は、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ細菌細胞である。一実施形態では、細菌細胞は、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ細菌細胞である。一実施形態では、細菌細胞は、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ細菌細胞である。一実施形態では、細菌細胞は、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ細菌細胞である。一実施形態では、細菌細胞は、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ細菌細胞である。一実施形態では、細菌細胞は、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｉｓまたはＢ．ｉｎｆａｎｔｉｓ細菌細胞である。一実施形態では、細菌細胞は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ細菌細胞である。一実施形態では、細菌細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細菌細胞である。一実施形態では、細菌細胞は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ細菌細胞である。一実施形態では、細菌細胞は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ細菌細胞である。一実施形態では、細菌細胞は、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｉｓ細菌細胞である。一実施形態では、細菌細胞は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ細菌細胞である。一実施形態では、細菌細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細菌細胞である。一実施形態では、細菌細胞は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ細菌細胞である。一実施形態では、細菌細胞は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ細菌細胞である。一実施形態では、細菌細胞は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ細菌細胞である。一実施形態では、細菌細胞は、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ細菌細胞である。一実施形態では、細菌細胞は、Ｏｘａｌｏｂａｃｔｅｒ ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ細菌細胞である。別の実施形態では、細菌細胞は、Ｏｘａｌｏｂａｃｔｅｒ ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓを含まない。
いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ１９１７株（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ）であり、最も特徴的なプロバイオティクスの１つに進化した腸内細菌科ファミリーのグラム陰性菌である（Ｕｋｅｎａ ｅｔ ａｌ．，２００７）。この菌株は、完全に無害であることが特徴であり（Ｓｃｈｕｌｔｚ，２００８）、ＧＲＡＳ（一般に安全であると認識されている）のステータスを有してる（Ｒｅｉｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１４、重要視されている）。ゲノムシーケンシングにより、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅは、目立った毒性因子（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ α－溶血素、Ｐ－線毛アドヘシン）を持っていないことが確認された（Ｓｃｈｕｌｔｚ，２００８）。加えて、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅは、病原性付着因子を持たず、いずれのエンテロトキシンまたは細胞毒も産生せず、侵襲性がなく、尿路病原性ではないことが明らかとなっている（Ｓｏｎｎｅｎｂｏｒｎ ｅｔ ａｌ．，２００９）。１９１７年に早くも、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅは、治療用途のために、Ｍｕｔａｆｌｏｒと呼ばれる薬用カプセルに包装された。それ以来、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅは、ｉｎ ｖｉｖｏでのヒトの潰瘍性大腸炎の治療（Ｒｅｍｂａｃｋｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９）、ｉｎ ｖｉｖｏでのヒトの炎症性腸疾患、クローン病及び回腸嚢炎の治療（Ｓｃｈｕｌｔｚ，２００８）、及びｉｎ ｖｉｔｒｏでの腸管組織侵入性Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ、及びＳｈｉｇｅｌｌａの阻害（Ａｌｔｅｎｈｏｅｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００４）のために使用されている。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅの治療効果及び安全性は、説得力を持って証明された（Ｕｋｅｎａ ｅｔ ａｌ．，２００７）ことが一般に認識されている。
一実施形態では、本発明の組換え細菌細胞は、シュウ酸塩が有害となる障害を患っている対象にコロニーを形成しない。
当業者であれば、本明細書にて開示する遺伝子修飾が、細菌の他の種、菌株、及び亜型に適合され得ることを理解されるであろう。さらに、１つ以上の異なる種からの遺伝子は、互いに導入することができ、例えば、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ由来のシュウ酸塩異化遺伝子は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉで発現させることができる。未修飾Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ及び本発明の遺伝子組換えされた細菌は、例えば、腸内または血清中の防御因子によって破壊される場合がある（Ｓｏｎｎｅｎｂｏｒｎ ｅｔ ａｌ．，２００９）。いくつかの実施形態では、滞留時間は、ヒト対象に関して計算される。いくつかの実施形態では、ｉｎ ｖｉｖｏでの滞留時間は、本発明の遺伝子組換えされた細菌に関して計算される。
いくつかの実施形態では、細菌細胞は、遺伝子組換えされた細菌細胞である。別の実施形態では、細菌細胞は、組換え細菌細胞である。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書にて開示する細菌細胞のコロニーを含む。
別の態様において、本開示は、本明細書にて開示する細菌細胞を含んでいる組換え細菌培養物を提供する。一態様において、本開示は、培養物の培地中でシュウ酸塩またはシュウ酸のレベルを低下させる組換え細菌培養物を提供する。一実施形態では、シュウ酸塩またはシュウ酸のレベルは、細胞培養の培地中で約５０％、約７５％、または約１００％低下する。別の実施形態では、シュウ酸塩またはシュウ酸のレベルは、細胞培養の培地中で約２分の１、３分の１、４分の１、５分の１、６分の１、７分の１、８分の１、９分の１、または１０分の１に低下する。一実施形態では、シュウ酸塩またはシュウ酸のレベルは、細胞培養の培地中で検出限界を下回って低下する。
上記の遺伝子組換えされた細菌のいくつかの実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子及び／または遺伝子カセットは、細菌内のプラスミド上に存在する。上記の遺伝子組換えされた細菌のいくつかの実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子及び／または遺伝子カセットは、細菌内のプラスミド上に存在し、かつ、本明細書にて開示するプロモーターのいずれかなど、低酸素環境または嫌気的条件下で誘導されるプロモーターにプラスミド上で機能的に連結される。他の実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子及び／または遺伝子カセットは、細菌染色体内に存在する。他の実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子及び／または遺伝子カセットは、細菌染色体内に存在し、かつ、本明細書にて開示するプロモーターのいずれかなど、低酸素環境または嫌気的条件下で誘導されるプロモーターに染色体内で機能的に連結される。上記の遺伝子組換えされた細菌のいくつかの実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子及び／または遺伝子カセットは、細菌内のプラスミド上に存在し、かつ、本明細書にて開示するプロモーターのいずれかなど、炎症状態下で誘導されるプロモーターにプラスミド上で機能的に連結される。他の実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子及び／または遺伝子カセットは、細菌染色体内に存在し、かつ、本明細書にて開示するプロモーターのいずれかなど、炎症状態下で誘導されるプロモーターに染色体内で機能的に連結される。
いくつかの実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子及び／または遺伝子カセットを含む遺伝子組換えされた細菌は、シュウ酸塩輸送体をコードする遺伝子配列（複数可）をさらに含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子及び／または遺伝子カセットを含む遺伝子組換えされた細菌は、ギ酸塩排出輸送体をコードする遺伝子配列（複数可）をさらに含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子及び／または遺伝子カセットを含む遺伝子組換えされた細菌は、シュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体をコードする遺伝子配列（複数可）をさらに含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子及び／または遺伝子カセットを含む遺伝子組換えされた細菌は、シュウ酸塩輸送体、ギ酸塩排出輸送体、及び／またはシュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体のうち１つ以上をコードする遺伝子配列（複数可）をさらに含む。
いくつかの実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）、シュウ酸塩輸送体、ギ酸塩排出輸送体、及び／またはシュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体をコードする遺伝子及び／または遺伝子カセットを含む遺伝子組換えされた細菌は、栄養要求体である。一実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、ｃｙｓＥ、ｇｌｎＡ、ｉｌｖＤ、ｌｅｕＢ、ｌｙｓＡ、ｓｅｒＡ、ｍｅｔＡ、ｇｌｙＡ、ｈｉｓＢ、ｉｌｖＡ、ｐｈｅＡ、ｐｒｏＡ、ｔｈｒＣ、ｔｒｐＣ、ｔｙｒＡ、ｔｈｙＡ、ｕｒａＡ、ｄａｐＡ、ｄａｐＢ、ｄａｐＤ、ｄａｐＥ、ｄａｐＦ、ｆｌｈＤ、ｍｅｔＢ、ｍｅｔＣ、ｐｒｏＡＢ、及びｔｈｉ１栄養要求体から選択される栄養要求体である。いくつかの実施形態では、遺伝子改変細菌は、２つ以上の栄養要求性を有し、例えば、それらは、ΔｔｈｙＡ及びΔｄａｐＡ栄養要求体である。
いくつかの実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）、シュウ酸塩輸送体、ギ酸塩排出輸送体、及び／またはシュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体をコードする遺伝子及び／または遺伝子カセットを含む遺伝子組換えされた細菌は、本明細書にて開示する分泌系のいずれかなど、生体分子を分泌する分泌タンパク質またはタンパク質複合体をコードする遺伝子配列（複数可）をさらに含む。
いくつかの実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）、シュウ酸塩輸送体、ギ酸塩排出輸送体、及び／またはシュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体をコードする遺伝子及び／または遺伝子カセットを含む遺伝子組換えされた細菌は、本明細書にて開示する抗生物質遺伝子のいずれかなど、１つ以上の抗生物質遺伝子（複数可）をコードする遺伝子配列（複数可）をさらに含む。
いくつかの実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）、シュウ酸塩輸送体、ギ酸塩排出輸送体、及び／またはシュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体をコードする遺伝子及び／または遺伝子カセットを含む遺伝子組換えされた細菌は、本明細書に記載のキルスイッチ回路のいずれかなど、キルスイッチ回路をさらに含む。例えば、いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、誘導性プロモーターの制御下にある、１つ以上の組換え酵素（複数可）をコードする１つ以上の遺伝子、及び逆転毒素配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、抗毒素をコードする１つ以上の遺伝子をさらに含む。いくつかの実施形態では、遺伝子改変細菌は、誘導性プロモーターの制御下にある、１つ以上の組換え酵素（複数可）をコードする１つ以上の遺伝子、及び１つ以上の逆転除去遺伝子をさらに含み、ここで、除去遺伝子（複数可）は、必須遺伝子を欠失させる酵素をコードする。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、抗毒素をコードする１つ以上の遺伝子をさらに含む。いくつかの実施形態では、遺伝子改変細菌は、ＴｅｔＲ抑制因子結合部位を有するプロモーターの制御下にある、毒素をコードする１つ以上の遺伝子、及びＰａｒａＢＡＤなどのアラビノースによって誘導される誘導性プロモーターの制御下にある、ＴｅｔＲをコードする遺伝子をさらに含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、抗毒素をコードする１つ以上の遺伝子をさらに含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子及び／または遺伝子カセットを含む栄養要求体であり、かつ本明細書に記載のキルスイッチ回路のいずれかなど、キルスイッチ回路をさらに含む。
上記の遺伝子組換えされた細菌のいくつかの実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子及び／または遺伝子カセットは、細菌内のプラスミド上に存在する。いくつかの実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子及び／または遺伝子カセットは、細菌染色体内に存在する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、シュウ酸塩を細菌細胞に輸送する１つ以上のシュウ酸塩輸送体（複数可）をコードする１つ以上の遺伝子及び／または遺伝子カセット（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、シュウ酸塩輸送体をコードする遺伝子配列（複数可）は、細菌内のプラスミド上に存在する。いくつかの実施形態では、シュウ酸塩輸送体をコードする遺伝子配列（複数可）は、細菌染色体内に存在する。いくつかの実施形態では、本明細書にて開示する分泌系のいずれかなど、生体分子を分泌する分泌タンパク質またはタンパク質複合体をコードする遺伝子配列は、細菌内のプラスミド上に存在する。いくつかの実施形態では、本明細書にて開示する分泌系のいずれかなど、生体分子を分泌する分泌タンパク質またはタンパク質複合体をコードする遺伝子配列は、細菌染色体内に存在する。いくつかの実施形態では、抗生物質耐性遺伝子をコードする遺伝子配列（複数可）は、細菌内のプラスミド上に存在する。いくつかの実施形態では、抗生物質耐性遺伝子をコードする遺伝子配列（複数可）は、細菌染色体内に存在する。
シュウ酸塩異化酵素
Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓは、ヒトで初めて報告されたシュウ酸塩分解性偏性嫌気性菌であり、嫌気性シュウ酸塩分解を研究する際に模範となる生物として役割を果たした。Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓは、シュウ酸の異化に関与する３つの酵素を有する。最初の細胞外シュウ酸塩は、ｏｘｌＴ遺伝子によってコードされる膜結合シュウ酸塩－ギ酸塩対向輸送体であるＯｘｌＴによって取り込まれる。ｆｒｃ遺伝子は、細胞内シュウ酸塩を活性化してシュウ酸ＣｏＡを形成するホルミルＣｏＡ転移酵素であるＦｒｃをコードする。これは、ｏｘｃ遺伝子から発現される酵素、シュウ酸ＣｏＡ脱炭酸酵素であるＯｘｃによるチアミンＰＰｉ依存性反応で脱炭酸化される。ギ酸塩及び二酸化炭素が最終生成物であり、シュウ酸塩－ギ酸塩対向輸送体であるＯｘｌＴは、細胞からの細胞内ギ酸塩の排出を触媒する。Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓでは、エネルギーの生成は、シュウ酸塩輸送膜タンパク質ＯｘｌＴによって媒介されるシュウ酸塩輸送と結び付いている（Ａｂｒａｔｔ ａｎｄ Ｒｅｉｄ Ｏｘａｌａｔｅ－Ｄｅｇｒａｄｉｎｇ Ｂａｃｔｅｒｉａ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｕｔ ａｓ Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｋｉｄｎｅｙ Ｓｔｏｎｅ Ｄｉｓｅａｓｅ及び本明細書の参考文献に記載されており、その内容は、その全体が参照として本明細書に組み込まれる）。
本明細書で使用される場合、用語「シュウ酸塩異化酵素」とは、シュウ酸塩の対応するシュウ酸ＣｏＡ分子への異化、シュウ酸ＣｏＡのギ酸塩及び二酸化炭素への異化、あるいはシュウ酸塩の別の代謝産物への異化、に関与する酵素を指す。シュウ酸塩の異化に関与する酵素は、当業者には周知である。例えば、偏性嫌気性菌Ｏｘａｌｏｂａｃｔｅｒ ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓでは、ホルミル補酵素Ａ転移酵素ＦＲＣ（ｆｒｃ遺伝子によってコードされる）は、補酵素Ａ部分をシュウ酸に転移し、シュウ酸ＣｏＡを形成する（例えば、Ｓｉｄｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：３３７８－８１（１９９７）を参照されたく、またその内容の全ては、参照により本明細書に明示的に組み込まれる）。さらに、シュウ酸ＣｏＡは、シュウ酸ＣｏＡ脱炭酸酵素ＯＸＣ（ｏｘｃ遺伝子によってコードされる）によって媒介される反応を受け、それにより、ギ酸塩及び二酸化炭素の形成がもたらされる（例えば、Ｌｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７６：２４６８－７２（１９９４）を参照されたく、またその内容の全ては、参照により本明細書に明示的に組み込まれる）。さらに、Ｅ．ｃｏｌｉタンパク質ＹｆｄＷ（タンパク質データバンク登録番号１ｐｔ５）及びＹｆｄＵ（タンパク質データバンク登録番号Ｅ０ＳＮＣ８）は、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ ＦＲＣ及びＯＸＣ酵素の機能的ホモログであることが明らかとなっているホルミルＣｏＡ転移酵素及びシュウ酸ＣｏＡ脱炭酸酵素である（例えば、Ｔｏｙｏｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔ．１９０：２２５６－６４（２００８）；Ｗｅｒｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｊ．２７７：２６２８－４０（２０１０）；Ｆｏｎｔｅｎｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔ．１９５：１４４６－５５（２０１３）を参照されたい）。
別のシュウ酸塩異化酵素のアセチルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素は、アセチルＣｏＡ及びシュウ酸塩をシュウ酸ＣｏＡ及び酢酸塩に変換する。非限定的例では、アセチルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素は、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＹｆｄＥである（例えば、Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｘ－ｒａｙ ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＹｆｄＥ；ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１３ Ｊｕｌ ２３；８（７）：ｅ６７９０１に記載されている）。アセチルＣｏＡ基質は、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌に非常に遍在する代謝産物であり、例えば、産生される酢酸塩は、輸送体を必要とせずに細胞外空間に拡散する場合がある。一例では、アセチルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素反応の後に、シュウ酸ＣｏＡ脱炭酸酵素ＯＸＣ（ｏｘｃ遺伝子によってコードされる）が続き、これにより、ギ酸塩及び二酸化炭素の形成がもたらされ得る。ギ酸塩は、例えば、限定はされないが、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のＯｘｌＴを含むギ酸塩排出輸送体を介して細胞から排出される場合がある。
別の例示的なシュウ酸塩異化酵素シュウ酸ＣｏＡシンテターゼ（ＯＣＬ、シュウ酸塩ＣｏＡリガーゼとも呼ばれる）は、シュウ酸塩、ＣｏＡ、及びＡＴＰを、シュウ酸ＣｏＡ、ＡＭＰ、及び二リン酸塩に変換する。非限定的例では、シュウ酸塩ＣｏＡリガーゼは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアシル活性化酵素３（ＳｃＡＡＥ３）である（例えば、Ｆｏｓｔｅｒ ａｎｄ Ｎａｋａｔａ，Ａｎ ｏｘａｌｙｌ－ＣｏＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ｉｓ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｆｏｒ ｏｘａｌａｔｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２０１４ Ｊａｎ ３；５８８（１）：１６０－６に記載されている）。一例では、シュウ酸塩ＣｏＡリガーゼの後に、シュウ酸ＣｏＡ脱炭酸酵素ＯＸＣ（ｏｘｃ遺伝子によってコードされる）が続き、これにより、ギ酸塩及び二酸化炭素の形成がもたらされ得る。ギ酸塩は、例えば、限定はされないが、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のＯｘｌＴを含むギ酸塩排出輸送体を介して細胞から排出される場合がある。
いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子組換えされた細菌は、少なくとも１つのシュウ酸塩異化酵素をコードする１つ以上の遺伝子（複数可）及び／または遺伝子カセット（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子改変細菌は、少なくとも１つのシュウ酸塩異化酵素をコードする１つ以上の遺伝子（複数可）及び／または遺伝子カセット（複数可）を含み、シュウ酸塩をシュウ酸ＣｏＡに変換することができる。いくつかの実施形態では、遺伝子改変細菌は、少なくとも１つのシュウ酸塩異化酵素をコードする１つ以上の遺伝子（複数可）及び／または遺伝子カセット（複数可）を含み、シュウ酸ＣｏＡをギ酸塩及び二酸化炭素に変換することができる。いくつかの実施形態では、遺伝子改変細菌は、少なくとも１つのシュウ酸塩異化酵素をコードする１つ以上の遺伝子（複数可）及び／または遺伝子カセット（複数可）を含み、シュウ酸塩をシュウ酸ＣｏＡに、かつシュウ酸ＣｏＡをギ酸塩及び二酸化炭素に変換することができる。いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子改変細菌は、シュウ酸塩及びホルミルＣｏＡをシュウ酸ＣｏＡ及びギ酸塩に変換する１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする１つ以上の遺伝子（複数可）及び／または遺伝子カセットを含む。いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子改変細菌は、シュウ酸塩及びアセチルｃｏＡをシュウ酸ＣｏＡ及び酢酸塩に変換する１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする１つ以上の遺伝子（複数可）及び／または遺伝子カセット（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子改変細菌は、シュウ酸塩及びＣｏＡをシュウ酸ＣｏＡに（例えば、１つのＡＴＰをＡＭＰと二リン酸塩に変換することによって）変換する１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする１つ以上の遺伝子（複数可）及び／または遺伝子カセット（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子改変細菌は、シュウ酸ＣｏＡを二酸化炭素及びホルミルＣｏＡに変換する１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする１つ以上の遺伝子（複数可）及び／または遺伝子カセット（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子改変細菌は、シュウ酸塩異化の結果としてギ酸塩を産生する。いくつかの実施形態では、遺伝子改変細菌は、シュウ酸塩異化の結果としてギ酸塩及び二酸化炭素を産生する。いくつかの実施形態では、遺伝子改変細菌は、シュウ酸塩異化の結果として酢酸塩を産生する。いくつかの実施形態では、遺伝子改変細菌は、シュウ酸塩異化の結果として酢酸塩及び二酸化炭素を産生する。いくつかの実施形態では、遺伝子改変細菌は、シュウ酸塩異化の結果としてギ酸塩、酢酸塩、及び二酸化炭素を産生する。
いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子配列（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）は、細胞内のシュウ酸塩及び／またはシュウ酸ＣｏＡ異化の速度を加速させる。いくつかの実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）は、細胞内のシュウ酸塩のレベルを低下させる。いくつかの実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）は、細胞内のシュウ酸ＣｏＡのレベルを低下させる。いくつかの実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）は、細胞内のシュウ酸のレベルを低下させる。
いくつかの実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）は、細胞内の対応するシュウ酸塩のレベルよりも、細胞内のシュウ酸ＣｏＡのレベルを増加させる。いくつかの実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）は、細胞内の対応するシュウ酸ＣｏＡのレベルよりも、細胞内のギ酸塩及び二酸化炭素のレベルを増加させる。いくつかの実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）は、細胞内のシュウ酸塩のレベルよりも、シュウ酸塩及び／またはシュウ酸ＣｏＡのレベルを低下させる。
シュウ酸塩の異化に関与する酵素は、シュウ酸塩の異化を増強するために、本発明の細菌で発現または修飾され得る。具体的には、本発明の遺伝子改変細菌細胞で少なくとも１つのシュウ酸塩異化酵素が発現する場合に、遺伝子改変細菌細胞は、より多くのシュウ酸塩をシュウ酸ＣｏＡに変換するか、または、同じ条件下での同じ細菌亜型の未修飾細菌よりも異化酵素が発現する場合に、より多くのシュウ酸ＣｏＡをギ酸塩及び二酸化炭素に変換する。したがって、シュウ酸塩異化酵素をコードする異種遺伝子を含む遺伝子組換えされた細菌は、シュウ酸塩及び／またはシュウ酸ＣｏＡを異化して、ＰＨＩ、ＰＨＩＩ、ＰＨＩＩＩ、ならびに続発性高シュウ酸尿症、腸性高シュウ酸尿症、及び特発性高シュウ酸尿症などのシュウ酸塩が有害となる障害を治療することができる。
一実施形態では、本発明の細菌細胞は、少なくとも１つのシュウ酸塩異化酵素をコードする少なくとも１つの異種遺伝子を含む。一実施形態では、本発明の細菌細胞は、シュウ酸塩取り込み輸送体をコードする少なくとも１つの異種遺伝子、及び少なくとも１つのシュウ酸塩異化酵素をコードする少なくとも１つの異種遺伝子を含む。一実施形態では、本発明の細菌細胞は、ギ酸塩排出輸送体をコードする少なくとも１つの異種遺伝子、及び少なくとも１つのシュウ酸塩異化酵素をコードする少なくとも１つの異種遺伝子を含む。一実施形態では、本発明の細菌細胞は、シュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体をコードする少なくとも１つの異種遺伝子、及び少なくとも１つのシュウ酸塩異化酵素をコードする少なくとも１つの異種遺伝子を含む。
いくつかの実施形態では、本発明は、第１プロモーターに操作可能に連結された、少なくとも１つのシュウ酸塩異化酵素をコードする少なくとも１つの異種遺伝子を含む細菌細胞を提供する。一実施形態では、細菌細胞は、異なる生物、例えば、異なる種の細菌由来の少なくとも１つのシュウ酸塩異化酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子を含む。別の実施形態では、細菌細胞は、シュウ酸塩異化酵素をコードする天然遺伝子の２つ以上のコピーを含む。さらに別の実施形態では、細菌細胞は、少なくとも１つのシュウ酸塩異化酵素をコードする少なくとも１つの天然遺伝子、ならびに、異なる生物、例えば、異なる種の細菌由来のシュウ酸塩異化酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子の少なくとも１つのコピーを含む。一実施形態では、細菌細胞は、シュウ酸塩異化酵素をコードする遺伝子の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのコピーを含む。一実施形態では、細菌細胞は、シュウ酸塩異化酵素をコードする遺伝子の複数のコピーを含む。
シュウ酸塩異化酵素は、当技術分野において既知である。いくつかの実施形態では、シュウ酸塩異化酵素は、細菌種に由来する少なくとも１つのシュウ酸塩異化酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態では、シュウ酸塩異化酵素は、非細菌種に由来するシュウ酸塩異化酵素をコードする遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態では、シュウ酸塩異化酵素は、真核生物種、例えば、酵母菌種または植物種に由来する遺伝子によってコードされる。一実施形態では、シュウ酸塩異化酵素は、ヒトに由来する遺伝子によってコードされる。一実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子配列（複数可）は、限定はされないが、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｍａｇｎｅｔｏｓｐｉｒｉｌｌｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｏｘａｌｏｂａｃｔｅｒ、例えば、Ｏｘａｌｏｂａｃｔｅｒ ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ、及びＴｈａｕｅｒａ、例えば、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｉｍａｌｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ、Ｂｏｒｄａｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ、Ｂｏｒｄａｔｅｌｌａ ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｆｕｎｇｏｒｕｍ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｘｅｎｏｖｏｒａｎｓ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｃｉｎｄｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｎｔａｎｉ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｎｔｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｍａｇｎｅｔｏｓｐｉｒｉｌｌｉｕｍ ｍａｇｅｎｔｏｔａｔｉｃｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｌｃｅｒａｎｓ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ、Ｏｘａｌｏｂａｃｔｅｒ ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ｒｅｔｔｇｅｒｉ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｎｔｕｍ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ｖｏｌｃａｎｉｕｍ、及びＴｈａｕｅｒａ ａｒｏｍａｔｉｃａを含む属または種の生物に由来する。
一実施形態では、遺伝子組換えされた細菌によってコードされる１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）は、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ、例えば、前述のｏｘｃ及びｆｒｃに由来する。
一実施形態では、遺伝子改変細菌によってコードされる１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）は、Ｅｎｔｅｒｏｃｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓに由来する。誘導性シュウ酸塩異化システムについては、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ Ｆｒｃ及びＯｘｃのホモログに含まれる、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓで説明されている（Ｈｏｋａｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｏｘａｌａｔｅ－ｄｅｇｒａｄｉｎｇ Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４４，２３５－２４０）。
一実施形態では、遺伝子改変細菌によってコードされる１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）は、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｎｔｕｍに由来する。シュウ酸塩分解タンパク質である、シュウ酸ＣｏＡ脱炭酸酵素及びホルミルＣｏＡ転移酵素は、この菌株から分離されたと報告されている（Ｉｔｏ，Ｈ．，Ｋｏｔａｋｅ，Ｔ．，ａｎｄ Ｍａｓａｉ，Ｍ．（１９９６）．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｘａｌｉｃ ａｃｉｄ ｂｙ ｈｕｍａｎ ｆｅｃｅｓ．Ｉｎｔ．Ｊ． Ｕｒｏｌ．３，２０７－２１１）。
一実施形態では、遺伝子改変細菌によってコードされる１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）は、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ Ｆｒｃ及びＯｘｃのホモログであることが明らかとなっているＰｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ｒｅｔｔｇｅｒｉに由来する（例えば、Ａｂｒａｔｔ ａｎｄ Ｒｅｉｄ，Ｏｘａｌａｔｅ－ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｇｕｔ ａｓ ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｋｉｄｎｅｙ ｓｔｏｎｅ ｄｉｓｅａｓｅ；Ａｄｖ Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１０；７２：６３－８７、及び本明細書の参考文献に記載されている）。
一実施形態では、遺伝子改変細菌によってコードされる１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）は、Ｅ．ｃｏｌｉ、例えば、ｙｆｄＸＷＵＶＥオペロンに由来する。例えば、ｙｄｆＵは、ｏｘｃホモログであると考えられている。一実施形態では、遺伝子改変細菌によってコードされる１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ及び／またはＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種に由来する。非限定的例では、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）は、ｏｘｃ及びｆｒｃホモログＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ及び／またはＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種に由来する。このようなＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種の非限定的例としては、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓが挙げられる。このようなＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種の非限定的例としては、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｉｍａｌｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｉｓ、及びＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓが挙げられる。
一実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子配列（複数可）は、本発明の組換え細菌細胞で使用するためにコドン最適化されている。一実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子配列（複数可）は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉで使用するためにコドン最適化されている。一実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子配列（複数可）は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉで使用するためにコドン最適化されていない。別の実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子配列（複数可）は、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓで使用するためにコドン最適化されている。１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子配列（複数可）が本発明の組換え細菌細胞に発現している場合、細菌細胞は、同じ条件下（例えば、培養または環境条件）での同じ細菌亜型の未修飾細菌よりも、より多くのシュウ酸塩またはシュウ酸ＣｏＡを異化する。したがって、少なくとも１つのシュウ酸塩異化酵素をコードする少なくとも１つの異種遺伝子を含む遺伝子組換えされた細菌を使用して、過剰なシュウ酸塩、シュウ酸、及び／またはシュウ酸ＣｏＡを異化して、ＰＨＩ、ＰＨＩＩ、ＰＨＩＩＩ、ならびに続発性高シュウ酸尿症、腸性高シュウ酸尿症、及び特発性高シュウ酸尿症などのシュウ酸塩が有害となる障害を治療することができる。
本発明は、シュウ酸塩異化酵素の機能的フラグメントまたはシュウ酸塩異化酵素の機能的変異体をコードする遺伝子をさらに含む。本明細書で使用される場合、シュウ酸塩異化酵素の「その機能的フラグメント」または「その機能的変異体」という用語は、フラグメントまたは変異体が誘導された野生型シュウ酸塩異化酵素と共通の定性的生物活性を有する要素に関連する。例えば、突然変異型のシュウ酸塩異化酵素の機能的フラグメントまたは機能的変異体は、機能的フラグメントまたは機能的変異体が誘導されたシュウ酸塩異化酵素と本質的に同じシュウ酸ＣｏＡを異化する能力を保持するものである。例えば、シュウ酸塩異化酵素活性を有するポリペプチドは、Ｎ末端またはＣ末端で切断される場合があり、シュウ酸塩異化酵素のその保持は、本明細書に記載の例示的なアッセイを含む当業者に既知のアッセイを使用して評価される。一実施形態では、本発明の組換え細菌細胞は、シュウ酸塩異化酵素の機能的変異体をコードする異種遺伝子を含む。別の実施形態では、本発明の組換え細菌細胞は、シュウ酸塩異化酵素の機能的フラグメントをコードする異種遺伝子を含む。
シュウ酸塩異化酵素、シュウ酸塩異化酵素の機能的変異体、またはシュウ酸塩異化酵素の機能的フラグメントの活性を試験するためのアッセイは、当業者に良く知られている。例えば、シュウ酸塩異化は、内因性のシュウ酸塩異化酵素活性を欠く組換え細菌細胞でタンパク質、機能的変異体、またはそのフラグメントを発現させることによって評価することができる。シュウ酸塩異化活性は、培養液中のシュウ酸塩分解を定量化することによって評価することができ、これについては、Ｆｅｄｅｒｉｃｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７０：５０６６－７３（２００４）によって説明されており、その全内容は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。ホルミルＣｏＡ転移酵素及びシュウ酸ＣｏＡ脱炭酸酵素活性は、Ｔｕｒｒｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１０３：１６００－９（２００７）に記載されているようにキャピラリー電気泳動によって測定することができる。
本明細書で使用される場合、用語「パーセント（％）配列同一性」または「パーセント（％）同一性」さらに「相同性」は、最大パーセント配列同一性を得るために、配列をアラインメントして、必要に応じてギャップを導入した後に、及び配列同一性の一部として任意の保存的置換を考慮しない、参照配列内のアミノ酸残基またはヌクレオチドと同一である候補配列におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドのパーセンテージとして定義される。比較のための配列の最適なアラインメントは、手動の他に、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１，Ａｄｓ Ａｐｐ．Ｍａｔｈ．２，４８２の局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｄｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３の局所相同性アルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５，２４４４の類似性検索方法によって、またはこれらのアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ Ｐ、ＢＬＡＳＴ Ｎ及びＴＦＡＳＴＡ）を使用するコンピュータプログラムによって、行うことができる。一実施形態では、遺伝子またはタンパク質は、本明細書にて開示する遺伝子またはタンパク質と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４＄、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％ または１００％同一である。
本発明は、本明細書に記載のアミノ酸配列と実質的に同じ配列でアミノ酸を含むシュウ酸塩異化酵素をコードする遺伝子を包含する。本明細書に記載の配列と実質的に同じアミノ酸配列には、保存的アミノ酸置換に加えてアミノ酸欠失及び／または挿入を含む配列が含まれる。保存的アミノ酸置換とは、第１のアミノ酸の、第１のアミノ酸と同様の化学的及び／または物理的性質（例えば、荷電、構造、極性、疎水性／親水性）を有する第２のアミノ酸との置換を指す。保存的置換には、あるアミノ酸の、以下のグループ：リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）及びヒスチジン（Ｈ）；アスパラギン酸（Ｄ）及びグルタミン酸（Ｅ）；アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、チロシン（Ｙ）Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｄ、及びＥ；アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、メチオニン（Ｍ）、システイン（Ｃ）及びグリシン（Ｇ）；Ｆ、Ｗ、及びＹ；Ｃ、Ｓ及びＴ、の中の別のアミノ酸との置換が含まれる。同様に、塩基性アミノ酸と別の塩基性アミノ酸との置換（例えば、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓの間の置換）、酸性アミノ酸と別の酸性アミノ酸との置換（例えば、Ａｓｐ及びＧｌｕの間の置換）、中性アミノ酸と別の中性アミノ酸との置換（例えば、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｐｈｅ、Ｃｙｓ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌの間の置換）も考えられる。
いくつかの実施形態では、シュウ酸塩異化酵素をコードする遺伝子を突然変異誘発させ、活性の増加が見られる突然変異体を選択し、かつシュウ酸塩異化酵素をコードする突然変異誘発させた遺伝子を単離して、本発明の細菌細胞に挿入する。一実施形態では、細菌が唯一の炭素源としてシュウ酸塩によって増殖できるようになる自発的突然変異体を、スクリーニングし、選択することができる。本明細書に記載の修飾を含む遺伝子は、プラスミドまたは染色体上に存在し得る。本開示のシュウ酸塩異化酵素の非限定的例を表２に示す。
Figure 2023511282000002
一実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子配列（複数可）は、ホルミルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素配列を含む。一実施形態では、ホルミルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素は、例えば、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のｆｒｃである。したがって、一実施形態では、ｆｒｃ遺伝子は、配列番号１の配列全体と少なくとも約８０％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ｆｒｃ遺伝子は、配列番号１の配列全体と少なくとも約９０％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ｆｒｃ遺伝子は、配列番号１の配列全体と少なくとも約９５％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ｆｒｃ遺伝子は、配列番号１の配列全体と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。別の実施形態では、ｆｒｃ遺伝子は、配列番号１の配列を含む。さらに別の実施形態では、ｆｒｃ遺伝子は、配列番号１の配列からなる。
一実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子配列（複数可）は、シュウ酸ＣｏＡ脱炭酸酵素配列を含む。一実施形態では、シュウ酸ＣｏＡ脱炭酸酵素は、例えば、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のｏｘｃである。したがって、一実施形態では、ｏｘｃ遺伝子は、配列番号２の配列全体と少なくとも約８０％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ｏｘｃ遺伝子は、配列番号２の配列全体と少なくとも約９０％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ｏｘｃ遺伝子は、配列番号２の配列全体と少なくとも約９５％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ｏｘｃ遺伝子は、配列番号２の配列全体と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。別の実施形態では、ｏｘｃ遺伝子は、配列番号２の配列を含む。さらに別の実施形態では、ｏｘｃ遺伝子は、配列番号２の配列からなる。別の実施形態では、ｏｘｃ遺伝子は、配列番号２の配列からなる。
一実施形態では、少なくとも１つのシュウ酸塩異化酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子は、シュウ酸塩ＣｏＡリガーゼ配列を含む。一実施形態では、シュウ酸塩ＣｏＡリガーゼは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＳｃＡＡＥ３である。したがって、一実施形態では、ＳｃＡＡＥ３遺伝子は、配列番号３の配列全体と少なくとも約８０％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ＳｃＡＡＥ３遺伝子は、配列番号３の配列全体と少なくとも約９０％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ＳｃＡＡＥ３遺伝子は、配列番号３の配列全体と少なくとも約９５％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ＳｃＡＡＥ３遺伝子は、配列番号３の配列全体と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。別の実施形態では、ＳｃＡＡＥ３遺伝子は、配列番号３の配列を含む。さらに別の実施形態では、ＳｃＡＡＥ３遺伝子は、配列番号３の配列からなる。
一実施形態では、少なくとも１つのシュウ酸塩異化酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子は、アセチルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素配列を含む。一実施形態では、アセチルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素は、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＹｆｄＥである。したがって、一実施形態では、ＹｆｄＥ遺伝子は、配列番号４の配列全体と少なくとも約８０％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ＹｆｄＥ遺伝子は、配列番号４の配列全体と少なくとも約９０％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ＹｆｄＥ遺伝子は、配列番号４の配列全体と少なくとも約９５％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ＹｆｄＥ遺伝子は、配列番号４の配列全体と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。別の実施形態では、ＹｆｄＥ遺伝子は、配列番号４の配列を含む。さらに別の実施形態では、ＹｆｄＥ遺伝子は、配列番号４の配列からなる。
シュウ酸塩異化酵素ポリペプチド配列の非限定的例を表３に示す。
Figure 2023511282000003
一実施形態では、シュウ酸塩異化カセット（複数可）によってコードされ、遺伝子組換えされた細菌によって発現される１つ以上のポリペプチド（複数可）は、ホルミルＣｏＡ転移酵素、例えば、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のｆｒｃを含む。一実施形態では、ポリペプチド（複数可）は、配列番号５と少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施形態では、シュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）によってコードされ、遺伝子組換えされた細菌によって発現される１つ以上のポリペプチド（複数可）は、配列番号５と少なくとも約８５％の同一性を有する。一実施形態では、シュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）によってコードされ、遺伝子組換えされた細菌によって発現される１つ以上のポリペプチド（複数可）は、配列番号５と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施形態では、シュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）によってコードされ、遺伝子組換えされた細菌によって発現される１つ以上のポリペプチド（複数可）は、配列番号５と少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施形態では、シュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）によってコードされ、遺伝子組換えされた細菌によって発現される１つ以上のポリペプチド（複数可）は、配列番号５と少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、シュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）によってコードされ、遺伝子組換えされた細菌によって発現される１つ以上のポリペプチド（複数可）は、配列番号５と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。別の実施形態では、シュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）によってコードされ、遺伝子組換えされた細菌によって発現される１つ以上のポリペプチド（複数可）は、配列番号５の配列を含む。さらに別の実施形態では、シュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）によってコードされ、遺伝子組換えされた細菌によって発現される１つ以上のポリペプチド（複数可）は、配列番号５の配列からなる。
一実施形態では、シュウ酸塩異化カセット（複数可）によってコードされ、遺伝子改変細菌によって発現される１つ以上のポリペプチド（複数可）は、シュウ酸ＣｏＡ脱炭酸酵素、例えば、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のｏｘｃを含む。一実施形態では、ポリペプチド（複数可）は、配列番号６と少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施形態では、シュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）によってコードされ、遺伝子改変細菌によって発現される１つ以上のポリペプチド（複数可）は、配列番号６と少なくとも約８５％の同一性を有する。一実施形態では、シュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）によってコードされ、遺伝子改変細菌によって発現される１つ以上のポリペプチド（複数可）は、配列番号６と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施形態では、シュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）によってコードされ、遺伝子改変細菌によって発現される１つ以上のポリペプチド（複数可）は、配列番号６と少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施形態では、シュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）によってコードされ、遺伝子改変細菌によって発現される１つ以上のポリペプチド（複数可）は、配列番号６と少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、シュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）によってコードされ、遺伝子組換えされた細菌によって発現される１つ以上のポリペプチド（複数可）は、配列番号６と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。別の実施形態では、シュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）によってコードされ、遺伝子改変細菌によって発現される１つ以上のポリペプチド（複数可）は、配列番号６の配列を含む。さらに別の実施形態では、シュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）によってコードされ、遺伝子組換えされた細菌によって発現される１つ以上のポリペプチド（複数可）は、配列番号６の配列からなる。
一実施形態では、シュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）によってコードされ、遺伝子改変細菌によって発現される１つ以上のポリペプチド（複数可）は、シュウ酸塩ＣｏＡリガーゼ、例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＳｃＡＡＥ３を含む。一実施形態では、ポリペプチド（複数可）は、配列番号７と少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施形態では、シュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）によってコードされ、遺伝子改変細菌によって発現される１つ以上のポリペプチド（複数可）は、配列番号７と少なくとも約８５％の同一性を有する。一実施形態では、シュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）によってコードされ、遺伝子改変細菌によって発現される１つ以上のポリペプチド（複数可）は、配列番号７と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施形態では、シュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）によってコードされ、遺伝子改変細菌によって発現される１つ以上のポリペプチド（複数可）は、配列番号７と少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施形態では、シュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）によってコードされ、遺伝子改変細菌によって発現される１つ以上のポリペプチド（複数可）は、配列番号７と少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、シュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）によってコードされ、遺伝子改変細菌によって発現される１つ以上のポリペプチド（複数可）は、配列番号７と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。別の実施形態では、シュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）によってコードされ、遺伝子改変細菌によって発現される１つ以上のポリペプチド（複数可）は、配列番号７の配列を含む。さらに別の実施形態では、シュウ酸塩異化カセット（複数可）によってコードされ、遺伝子組換えされた細菌によって発現される１つ以上のポリペプチド（複数可）は、配列番号７の配列からなる。
一実施形態では、シュウ酸塩異化カセット（複数可）によってコードされ、遺伝子改変細菌によって発現される１つ以上のポリペプチド（複数可）は、アセチルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＹｆｄＥを含む。一実施形態では、ポリペプチド（複数可）は、配列番号８と少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施形態では、シュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）によってコードされ、遺伝子改変細菌によって発現される１つ以上のポリペプチド（複数可）は、配列番号８と少なくとも約８５％の同一性を有する。一実施形態では、シュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）によってコードされ、遺伝子改変細菌によって発現される１つ以上のポリペプチド（複数可）は、配列番号８と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施形態では、シュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）によってコードされ、遺伝子改変細菌によって発現される１つ以上のポリペプチド（複数可）は、配列番号８と少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施形態では、シュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）によってコードされ、遺伝子改変細菌によって発現される１つ以上のポリペプチド（複数可）は、配列番号８と少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、シュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）によってコードされ、遺伝子組換えされた細菌によって発現される１つ以上のポリペプチド（複数可）は、配列番号８と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。別の実施形態では、シュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）によってコードされ、遺伝子改変細菌によって発現される１つ以上のポリペプチド（複数可）は、配列番号８の配列を含む。さらに別の実施形態では、シュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）によってコードされ、遺伝子改変細菌によって発現される１つ以上のポリペプチド（複数可）は、配列番号８の配列からなる。
一実施形態では、シュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）によってコードされ、遺伝子組換えされた細菌によって発現される１つ以上のポリペプチド（複数可）は、ホルミルＣｏＡ転移酵素、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のｙｆｄＷを含む。一実施形態では、ポリペプチド（複数可）は、配列番号９と少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施形態では、シュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）によってコードされ、遺伝子改変細菌によって発現される１つ以上のポリペプチド（複数可）は、配列番号９と少なくとも約８５％の同一性を有する。一実施形態では、シュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）によってコードされ、遺伝子改変細菌によって発現される１つ以上のポリペプチド（複数可）は、配列番号９と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施形態では、シュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）によってコードされ、遺伝子改変細菌によって発現される１つ以上のポリペプチド（複数可）は、配列番号９と少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施形態では、シュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）によってコードされ、遺伝子改変細菌によって発現される１つ以上のポリペプチド（複数可）は、配列番号９と少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、シュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）によってコードされ、遺伝子改変細菌によって発現される１つ以上のポリペプチド（複数可）は、配列番号９と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。別の実施形態では、シュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）によってコードされ、遺伝子改変細菌によって発現される１つ以上のポリペプチド（複数可）は、配列番号９の配列を含む。さらに別の実施形態では、シュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）によってコードされ、遺伝子改変細菌によって発現される１つ以上のポリペプチド（複数可）は、配列番号９の配列からなる。
一実施形態では、シュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）によってコードされ、遺伝子改変細菌によって発現される１つ以上のポリペプチド（複数可）は、シュウ酸ＣｏＡ脱炭酸酵素、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のｙｆｄＵを含む。一実施形態では、ポリペプチド（複数可）は、配列番号１０と少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施形態では、シュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）によってコードされ、遺伝子改変細菌によって発現される１つ以上のポリペプチド（複数可）は、配列番号１０と少なくとも約８５％の同一性を有する。一実施形態では、シュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）によってコードされ、遺伝子改変細菌によって発現される１つ以上のポリペプチド（複数可）は、配列番号１０と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施形態では、シュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）によってコードされ、遺伝子改変細菌によって発現される１つ以上のポリペプチド（複数可）は、配列番号１０と少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施形態では、シュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）によってコードされ、遺伝子改変細菌によって発現される１つ以上のポリペプチド（複数可）は、配列番号１０と少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、シュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）によってコードされ、遺伝子改変細菌によって発現される１つ以上のポリペプチド（複数可）は、配列番号１０と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。別の実施形態では、シュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）によってコードされ、遺伝子改変細菌によって発現される１つ以上のポリペプチド（複数可）は、配列番号１０の配列を含む。さらに別の実施形態では、シュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）によってコードされ、遺伝子改変細菌によって発現される１つ以上のポリペプチド（複数可）は、配列番号１０の配列からなる。
一実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子配列（複数可）は、第１プロモーターに直接的に操作可能に連結される。別の実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子配列（複数可）は、第１プロモーターに間接的に操作可能に連結される。一実施形態では、プロモーターは、自然界におけるシュウ酸塩異化酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子に操作可能に連結されない。
いくつかの実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子配列（複数可）は、構成的プロモーターの制御下で発現される。別の実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子配列（複数可）は、誘導性プロモーターの制御下で発現される。いくつかの実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子配列（複数可）は、外因的な環境条件によって直接的または間接的に誘導されるプロモーターの制御下で発現される。一実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子配列（複数可）は、哺乳動物の腸の環境条件など低酸素環境または嫌気的条件によって直接的または間接的に誘導されるプロモーターの制御下で発現され、ここで、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子配列（複数可）の発現は、哺乳動物の腸の環境など低酸素環境または嫌気性環境下で活性化される。いくつかの実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子配列（複数可）は、炎症状態によって直接的または間接的に誘導されるプロモーターの制御下で発現される。本明細書に記載の例示的な誘導性プロモーターとしては、酸素レベル依存性プロモーター（例えば、ＦＮＲ誘導性プロモーター）、炎症または炎症反応によって誘導されるプロモーター（ＲＮＳ、ＲＯＳプロモーター）、及び腸内で自然に存在する、または存在しない場合がある（例えば、外因的に添加され得る）代謝産物、例えば、アラビノース及びテトラサイクリンによって誘導されるプロモーターなどが挙げられる。誘導性プロモーターの例としては、ＦＮＲ応答性プロモーター、ＰａｒａＣプロモーター、ＰａｒａＢＡＤプロモーター、ＰＴｅｔＲプロモーター、及びＰＬａｃＩプロモーターが挙げられるが、これらに限定されず、これらのそれぞれについては本明細書にてより詳細に記載する。誘導性プロモーターについては、以下でさらに詳細に説明する。
少なくとも１つのシュウ酸塩異化酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子は、細菌細胞内のプラスミドまたは染色体上に存在し得る。一実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子配列（複数可）は、細菌細胞内のプラスミド上に位置する。別の実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子配列（複数可）は、細菌細胞の染色体内に位置する。さらに別の実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子配列（複数可）の天然コピーは、細菌細胞の染色体内に位置し、異なる種の細菌由来の少なくとも１つのシュウ酸塩異化酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子は、細菌細胞内のプラスミド上に位置する。さらに別の実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子配列（複数可）の天然コピーは、細菌細胞内のプラスミド上に位置し、異なる種の細菌由来の少なくとも１つのシュウ酸塩異化酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子は、細菌細胞内のプラスミド上に位置する。さらに別の実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子配列（複数可）の天然コピーは、細菌細胞の染色体内に位置し、異なる種の細菌由来の少なくとも１つのシュウ酸塩異化酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子は、細菌細胞の染色体内に位置する。
いくつかの実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子配列（複数可）は、低コピープラスミド上で発現される。いくつかの実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子配列（複数可）は、高コピープラスミド上で発現される。いくつかの実施形態では、高コピープラスミドは、少なくとも１つのシュウ酸塩異化酵素の発現を増加させるのに有用であり得、それにより、シュウ酸塩、シュウ酸、及び／またはシュウ酸ＣｏＡの異化が増加される。
いくつかの実施形態では、高コピープラスミド上で発現される少なくとも１つのシュウ酸塩異化酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子を含む本発明の組換え細菌細胞は、シュウ酸塩異種取り込み輸送体及びシュウ酸塩天然取り込み輸送体の別のコピーの不在下で低コピープラスミド上で発現される同じ遺伝子を含む組換え細菌細胞よりも、シュウ酸塩異化が増加しないか、またはシュウ酸塩及び／またはシュウ酸レベルが低下しない。さらに、シュウ酸塩取り込み輸送体を組換え細菌細胞に組み込むいくつかの実施形態では、シュウ酸塩異化酵素の発現の安定性を強化しながら、高シュウ酸塩異化を維持し、形質転換された細菌に対する陰性選択圧を低減するために、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子配列（複数可）を含む低コピープラスミドを組み合わせて使用することには、さらなる利点がある可能性がある。代替の実施形態では、シュウ酸塩取り込み輸送体は、高コピープラスミドと組み合わせて使用される。
シュウ酸塩輸送体（取り込み輸送体）
嫌気性細菌であるＯｘａｌｏｂａｃｔｅｒ ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓへのシュウ酸塩の取り込みは、シュウ酸塩輸送体ＯｘｌＴを介して起こることが判明している（例えば、Ｒｕａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１０５３７－４３（１９９２）を参照されたく、またその内容の全ては、参照により本明細書に明示的に組み込まれる）。ＯｘｌＴは、二価のアニオンである細胞外シュウ酸塩とシュウ酸塩の脱炭酸から誘導される一価のカチオンである細胞内ギ酸塩との交換、ゆえに起プロトン力の発生を触媒する。シュウ酸塩の取り込みを媒介するその他のタンパク質も当業者に良く知られている。
シュウ酸塩輸送体、例えば、シュウ酸塩取り込み輸送体は、細胞へのシュウ酸塩の輸送を増強するために、本発明の細菌において発現または修飾される場合がある。具体的には、シュウ酸塩取り込み輸送体が本発明の組換え細菌細胞に発現している場合、その細菌細胞は、取り込み輸送体が発現している際に同じ条件下での同じ細菌亜型の未修飾細菌よりも多くのシュウ酸塩を細胞中に取り込む。したがって、シュウ酸塩取り込み輸送体をコードする１つ以上の異種遺伝子配列（複数可）を含む遺伝子組換えされた細菌を使用して、シュウ酸塩を細菌に取り込むことができ、これにより、生物に発現しているシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子配列（複数可）を使用して、ＰＨＩ、ＰＨＩＩ、ＰＨＩＩＩ、ならびに続発性高シュウ酸尿症、腸性高シュウ酸尿症、及び特発性高シュウ酸尿症などのシュウ酸塩が有害となる障害を治療することができる。一実施形態では、本発明の細菌細胞は、シュウ酸塩輸送体（取り込み輸送体）をコードする異種遺伝子配列（複数可）を含む。一実施形態では、本発明の細菌細胞は、シュウ酸塩輸送体をコードする異種遺伝子配列（複数可）、及び１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする１つ以上の異種遺伝子配列（複数可）を含む。一実施形態では、本発明の細菌細胞は、シュウ酸塩輸送体をコードする異種遺伝子配列（複数可）、及びギ酸塩排出輸送体、シュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体、及びこれらの組み合わせから選択される１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の異種遺伝子配列（複数可）を含む。一実施形態では、本発明の細菌細胞は、シュウ酸塩輸送体をコードする異種遺伝子配列（複数可）、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする１つ以上の異種遺伝子配列（複数可）、及びギ酸塩排出輸送体、シュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体、及びこれらの組み合わせから選択される１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の異種遺伝子配列（複数可）を含む。
したがって、いくつかの実施形態において、本発明は、第１プロモーターに操作可能に連結された、シュウ酸塩異化酵素をコードする１つ以上の異種遺伝子配列（複数可）、及びシュウ酸塩輸送体（取り込み輸送体）をコードする１つ以上の異種遺伝子配列（複数可）を含む細菌細胞を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、第１プロモーターに操作可能に連結された、シュウ酸塩輸送体（取り込み輸送体）をコードする１つ以上の異種遺伝子配列（複数可）を含む細菌細胞を提供する。別の実施形態において、本発明は、第１プロモーターに操作可能に連結された、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする１つ以上の異種遺伝子配列（複数可）、及び第２プロモーターに操作可能に連結された、シュウ酸塩輸送体（取り込み輸送体）をコードする１つ以上の異種遺伝子配列（複数可）を含む細菌細胞を提供する。一実施形態では、第１プロモーター及び第２プロモーターは、同じプロモーターの別々のコピーである。別の実施形態では、第１プロモーター及び第２プロモーターは、異なるプロモーターである。
一実施形態では、細菌細胞は、異なる生物、例えば、異なる種の細菌に由来するシュウ酸塩輸送体（取り込み輸送体）をコードする１つ以上の遺伝子配列（複数可）を含む。一実施形態では、細菌細胞は、シュウ酸塩輸送体（取り込み輸送体）をコードする１つ以上の天然遺伝子配列（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、シュウ酸塩輸送体（取り込み輸送体）をコードする１つ以上の天然遺伝子配列（複数可）は、修飾されない。別の実施形態では、細菌細胞は、シュウ酸塩輸送体（取り込み輸送体）をコードする１つ以上の天然遺伝子配列（複数可）の２つ以上のコピーを含む。さらに別の実施形態では、細菌細胞は、シュウ酸塩天然輸送体（取り込み輸送体）をコードする１つ以上の遺伝子配列（複数可）のコピーに加えて、異なる細菌種に由来するシュウ酸塩輸送体をコードする１つ以上の異種遺伝子配列（複数可）の１つ以上のコピーを含む。一実施形態では、細菌細胞は、シュウ酸塩輸送体をコードする１つ以上の異種遺伝子配列（複数可）の１つ以上、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つのコピーを含む。一実施形態では、細菌細胞は、シュウ酸塩輸送体をコードする１つ以上の異種遺伝子配列（複数可）の複数のコピーを含む。
いくつかの実施形態では、シュウ酸塩輸送体は、Ｏｘａｌｏｂａｃｔｅｒを含むがこれらに限定されない細菌属または種に由来するシュウ酸塩輸送体遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態では、シュウ酸塩輸送体遺伝子は、Ｏｘａｌｏｂａｃｔｅｒ ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ種の細菌に由来する。いくつかの実施形態では、輸送体は、Ｏｘａｌｏｂａｃｔｅｒ ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓに由来するＯｘｌＴシュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体である。
その他の実施形態では、シュウ酸塩輸送体は、シュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体（ＯＦＡ）ファミリーから選択される遺伝子によってコードされる。ＯＦＡファミリーメンバーは、主要ファシリテータースーパーファミリーに属し、かつ自然界に広く分布しており、細菌界、古細菌界、及び真核生物界に存在する（例えば、Ｐａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｊｏｒ Ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．Ｍａｒｃｈ １９９８ ｖｏｌ．６２ ｎｏ．１ １－３４を参照されたい）。非限定的例では、輸送体は、Ｏｘａｌｏｂａｃｔｅｒ ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓシュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体のホモログ及び／またはオーソログである。別の非限定的例では、輸送体は、細菌由来の、Ｏｘａｌｏｂａｃｔｅｒ ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓシュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体（ＯｘｌＴ）のホモログ及び／またはオーソログである。本発明は、シュウ酸塩輸送体の機能的フラグメントまたはシュウ酸塩輸送体の機能的変異体をコードする遺伝子をさらに含む。本明細書で使用される場合、シュウ酸塩輸送体の「その機能的フラグメント」または「その機能的変異体」という用語は、フラグメントまたは変異体が誘導された野生型シュウ酸塩輸送体と共通の定性的生物活性を有する要素に関連する。例えば、突然変異型のシュウ酸塩輸送体タンパク質の機能的フラグメントまたは機能的変異体は、機能的フラグメントまたは機能的変異体が誘導された輸送体タンパク質と本質的に同じ、シュウ酸塩を細菌細胞に取り込む能力を保持するものである。一実施形態では、本発明の組換え細菌細胞は、シュウ酸塩輸送体の機能的フラグメントをコードする１つ以上の異種遺伝子配列（複数可）を含む。別の実施形態では、本発明の組換え細菌細胞は、シュウ酸塩輸送体の機能的変異体をコードする１つ以上の異種遺伝子配列（複数可）を含む。
シュウ酸塩輸送体、シュウ酸塩輸送体機能的変異体、またはシュウ酸塩輸送体機能的フラグメントの活性を試験するためのアッセイは、当業者に良く知られている。例えば、シュウ酸塩の取り込みは、タンパク質、機能的変異体、またはそのフラグメントを発現している組換え細菌細胞から界面活性剤抽出プロテオリポソームを調製し、［１４Ｃ］シュウ酸塩取り込みを測定することによって評価することができ、このことについては、Ａｂｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：６７８９－９３（１９９６）に記載されており、その全内容は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
一実施形態では、シュウ酸塩輸送体をコードする遺伝子は、宿主生物で使用するためにコドン最適化されている。一実施形態では、シュウ酸塩輸送体をコードする遺伝子は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉで使用するためにコドン最適化されている。
本発明はまた、本明細書に記載のアミノ酸配列と実質的に同じ配列でアミノ酸を含むシュウ酸塩輸送体をコードする遺伝子も包含する。本明細書に記載の配列と実質的に同じアミノ酸配列には、保存的アミノ酸置換に加えてアミノ酸欠失及び／または挿入を含む配列が含まれる。
いくつかの実施形態では、シュウ酸塩輸送体をコードする１つ以上の遺伝子配列（複数可）を突然変異誘発させ、シュウ酸塩輸送の増加が見られる突然変異体を選択し、かつシュウ酸塩輸送体をコードする突然変異誘発させた１つ以上の遺伝子配列（複数可）を単離して、本発明の細菌細胞に挿入する。いくつかの実施形態では、シュウ酸塩輸送体をコードする１つ以上の遺伝子配列（複数可）を突然変異誘発させ、シュウ酸塩輸送の減少が見られる突然変異体を選択し、かつシュウ酸塩輸送体をコードする突然変異誘発させた１つ以上の遺伝子配列（複数可）を単離して、本発明の細菌細胞に挿入する。本明細書に記載の輸送体修飾は、プラスミドまたは染色体上に存在し得る。
シュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体の非限定的例のポリペプチド及びポリヌクレオチド配列を表４に示す。
Figure 2023511282000004
一実施形態では、シュウ酸塩取り込み輸送体は、シュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体ＯｘｌＴである。一実施形態では、ＯｘｌＴ遺伝子は、配列番号１１に対して少なくとも約８０％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ＯｘｌＴ遺伝子は、配列番号１１に対して少なくとも約９０％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ＯｘｌＴ遺伝子は、配列番号１１に対して少なくとも約９５％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ＯｘｌＴ遺伝子は、配列番号１１に対して少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。別の実施形態では、ＯｘｌＴ遺伝子は、配列番号１１の配列を含む。さらに別の実施形態では、ＯｘｌＴ遺伝子は、配列番号１１の配列からなる。
一実施形態では、１つ以上の遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）によってコードされ、遺伝子組換えされた細菌によって発現される１つ以上のポリペプチド（複数可）は、シュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体ＯｘｌＴである。一実施形態では、ポリペプチド（複数可）は、配列番号１２と少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施形態では、１つ以上の遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）によってコードされ、遺伝子改変細菌によって発現される１つ以上のポリペプチド（複数可）は、配列番号１２と少なくとも約８５％の同一性を有する。一実施形態では、１つ以上の遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）によってコードされ、遺伝子改変細菌によって発現される１つ以上のポリペプチド（複数可）は、配列番号１２と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施形態では、１つ以上の遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）によってコードされ、遺伝子改変細菌によって発現される１つ以上のポリペプチド（複数可）は、配列番号１２と少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施形態では、１つ以上の遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）によってコードされ、遺伝子改変細菌によって発現される１つ以上のポリペプチド（複数可）は、配列番号１２と少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、１つ以上の遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）によってコードされ、遺伝子改変細菌によって発現される１つ以上のポリペプチド（複数可）は、配列番号１２と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。別の実施形態では、１つ以上の遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）によってコードされ、遺伝子改変細菌によって発現される１つ以上のポリペプチド（複数可）は、配列番号１２の配列を含む。さらに別の実施形態では、１つ以上の遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）によってコードされ、遺伝子改変細菌によって発現される１つ以上のポリペプチド（複数可）は、配列番号１２の配列からなる。
いくつかの実施形態では、細菌細胞は、第１プロモーターに操作可能に連結された、少なくとも１つのシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする１つ以上の異種遺伝子配列（複数可）及びシュウ酸塩取り込み輸送体をコードする１つ以上の異種遺伝子配列（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、シュウ酸塩取り込み輸送体をコードする１つ以上の異種遺伝子配列（複数可）は、第１プロモーターに操作可能に連結される。その他の実施形態では、シュウ酸塩取り込み輸送体をコードする１つ以上の異種遺伝子配列（複数可）は、第２プロモーターに操作可能に連結される。一実施形態では、シュウ酸塩取り込み輸送体をコードする１つ以上の遺伝子配列（複数可）は、第２プロモーターに直接的に操作可能に連結される。別の実施形態では、シュウ酸塩取り込み輸送体をコードする１つ以上の遺伝子配列（複数可）は、第２プロモーターに間接的に操作可能に連結される。
いくつかの実施形態では、シュウ酸塩取り込み輸送体をコードする１つ以上の遺伝子配列（複数可）の発現は、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子配列（複数可）の発現を制御するプロモーターとは異なるプロモーターによって制御される。いくつかの実施形態では、シュウ酸塩取り込み輸送体をコードする１つ以上の遺伝子配列（複数可）の発現は、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）の発現を制御する同じプロモーターによって制御される。いくつかの実施形態では、シュウ酸塩取り込み輸送体及びシュウ酸塩異化酵素をコードする１つ以上の遺伝子配列（複数可）は、プロモーター領域から分岐して転写される。いくつかの実施形態では、シュウ酸塩取り込み輸送体をコードする遺伝子配列（複数可）及び１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子配列（複数可）をコードする遺伝子のそれぞれの発現は、異なるプロモーターによって制御される。
一実施形態では、プロモーターは、自然界におけるシュウ酸塩取り込み輸送体をコードする１つ以上の遺伝子配列（複数可）と操作可能に連結されていない。いくつかの実施形態では、シュウ酸塩取り込み輸送体をコードする１つ以上の遺伝子配列（複数可）は、その天然プロモーターによって制御される。いくつかの実施形態では、シュウ酸塩取り込み輸送体をコードする１つ以上の遺伝子配列（複数可）は、誘導性プロモーターによって制御される。いくつかの実施形態では、シュウ酸塩取り込み輸送体をコードする１つ以上の遺伝子配列（複数可）は、その天然プロモーターよりも強力なプロモーターによって制御される。いくつかの実施形態では、シュウ酸塩取り込み輸送体をコードする１つ以上の遺伝子配列（複数可）は、構成的プロモーターによって制御される。
別の実施形態では、プロモーターは、誘導性プロモーターである。誘導性プロモーターについては、以下でさらに詳細に説明する。
一実施形態では、シュウ酸塩取り込み輸送体をコードする１つ以上の遺伝子配列（複数可）は、細菌細胞内のプラスミド上に位置する。別の実施形態では、シュウ酸塩取り込み輸送体をコードする１つ以上の遺伝子配列（複数可）は、細菌細胞の染色体内に位置する。さらに別の実施形態では、シュウ酸塩取り込み輸送体をコードする１つ以上の遺伝子配列（複数可）の天然コピーは、細菌細胞の染色体内に位置し、異なる種の細菌由来のシュウ酸塩取り込み輸送体をコードする１つ以上の遺伝子配列（複数可）のコピーは、細菌細胞内のプラスミド上に位置する。さらに別の実施形態では、シュウ酸塩取り込み輸送体をコードする１つ以上の遺伝子配列（複数可）の天然コピーは、細菌細胞内のプラスミド上に位置し、異なる種の細菌由来のシュウ酸塩取り込み輸送体をコードする１つ以上の遺伝子配列（複数可）のコピーは、細菌細胞内のプラスミド上に位置する。さらに別の実施形態では、シュウ酸塩取り込み輸送体をコードする１つ以上の遺伝子配列（複数可）の天然コピーは、細菌細胞の染色体内に位置し、異なる種の細菌由来のシュウ酸塩取り込み輸送体をコードする１つ以上の遺伝子配列（複数可）のコピーは、細菌細胞の染色体内に位置する。
いくつかの実施形態では、細菌細胞内のシュウ酸塩取り込み輸送体をコードする少なくとも１つの天然遺伝子は、修飾されず、シュウ酸塩天然取り込み輸送体の１つ以上の追加のコピーがゲノムに挿入される。一実施形態では、ゲノムに挿入される天然の取り込み輸送体の１つ以上の追加のコピーは、シュウ酸塩異化酵素をコードする１つ以上の遺伝子配列（複数可）の発現を制御する同じ誘導性プロモーター、例えば、ＦＮＲ応答性プロモーター、または少なくとも１つのシュウ酸塩異化酵素の発現を制御するプロモーターとは異なる誘導性プロモーター、あるいは構成的プロモーターの制御下にある。代替の実施形態では、取り込み輸送体をコードする少なくとも１つの天然遺伝子は修飾されず、異なる細菌種由来の取り込み輸送体の１つ以上の追加のコピーが、細菌細胞のゲノムに挿入される。一実施形態では、細菌細胞のゲノムに挿入される取り込み輸送体の１つ以上の追加のコピーは、シュウ酸塩異化酵素をコードする１つ以上の遺伝子配列（複数可）の発現を制御する同じ誘導性プロモーター、例えば、ＦＮＲ応答性プロモーター、または１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子配列（複数可）の発現を制御するプロモーターとは異なる誘導性プロモーター、あるいは構成的プロモーターの制御下にある。
一実施形態では、シュウ酸塩取り込み輸送体が本発明の組換え細菌細胞に発現している場合、その細菌細胞は、取り込み輸送体が発現している際に同じ条件下での同じ細菌亜型の未修飾細菌よりも１０％多いシュウ酸塩を細菌細胞中に取り込む。別の実施形態では、シュウ酸塩取り込み輸送体が本発明の組換え細菌細胞に発現している場合、その細菌細胞は、取り込み輸送体が発現している際に同じ条件下での同じ細菌亜型の未修飾細菌よりも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％ または１００％多いシュウ酸塩を細菌細胞中に取り込む。さらに別の実施形態では、シュウ酸塩取り込み輸送体が本発明の組換え細菌細胞に発現している場合、その細菌細胞は、取り込み輸送体が発現している際に同じ条件下での同じ細菌亜型の未修飾細菌よりも２倍多いシュウ酸塩を細胞中に取り込む。さらに別の実施形態では、シュウ酸塩取り込み輸送体が本発明の組換え細菌細胞に発現している場合、その細菌細胞は、取り込み輸送体が発現している際に同じ条件下での同じ細菌亜型の未修飾細菌よりも３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍多いシュウ酸塩を細胞中に取り込む。
いくつかの実施形態では、細菌細胞は、ギ酸塩輸送体（取り込み輸送体）をコードする１つ以上の内因性遺伝子（複数可）に遺伝子突然変異を含み、ここで、この遺伝子突然変異により、ギ酸塩の細菌細胞への流入が減少される。理論に拘束されることを望まないが、このような突然変異により、細胞内のギ酸塩濃度を低下させ、かつシュウ酸塩異化経路を介した流動を増加させることができる。Ｅ．ｃｏｌｉのＦｏｃＡは、双方向的ギ酸塩輸送を触媒し、かつチャネル型メカニズムによって機能する可能性がある（Ｆｌａｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｕｎｅｘｐｅｃｔｅｄ ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ＦｏｃＡ ｆｏｒｍａｔｅ ｃｈａｎｎｅｌ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ：ａ ｐａｒａｄｉｇｍ ｆｏｒ ｔｈｅ ｆｏｒｍａｔｅ－ｎｉｔｒｉｔｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｉｎｔｅｇｒａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ”．ＦＥＭＳ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｌｅｔｔｅｒｓ．３０３（１）：６９－７５）。ＦｏｃＡは、その動作形態を、高い外部ｐＨの受動的排出チャネルから、低ｐＨの二次活性ギ酸塩／Ｈ取り込み輸送体に切り換え可能な場合がある。非限定的例では、遺伝子組換えされた細菌がＦｏｃＡに突然変異及び／または欠失を持ち、それによりＦｏｃＡを非機能的にさせる場合もある。
ギ酸塩排出輸送体
ギ酸塩は、多くの腸内細菌によるグルコースの嫌気性発酵における主要代謝産物である。いくつかのタイプのギ酸塩の取り込み及び排出タンパク質が当技術分野で知られている。例えば、ギ酸塩は、Ｅ．ｃｏｌｉ及びその他の腸内細菌科の五量体イオンチャネル／輸送体ＦｏｃＡによって細胞膜を越えて輸送される。ＦｏｃＡは、細胞質で生成されたギ酸アニオンの受動的排出輸送体として作用する。周辺質では、ギ酸塩は、その後ギ酸脱水素酵素によって二酸化炭素に還元される。ギ酸脱水素酵素及び／またはギ酸脱離酵素の別の形態もまた、Ｅ．ｃｏｌｉの細胞質に存在する。増殖培地のｐＨが６．８を下回ると、輸送形態の機能的切り換えが発生する。周辺質で利用可能なプロトンが十分にあるため、細胞は、ギ酸塩を能動的に取り込むように切り替わり、再びその作業にＦｏｃＡを使用する。
別の例では、前述のように、嫌気性細菌Ｏｘａｌｏｂａｃｔｅｒ ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓへのシュウ酸塩の取り込みが、シュウ酸塩輸送体ＯｘｌＴを介して起こることが判明している。ＯｘｌＴは、シュウ酸塩と、シュウ酸塩の脱炭酸によって誘導された細胞内ギ酸塩との交換を可能にする。これらの関連する活性（交換及び脱炭酸）は全体的に、ＡＴＰ合成、成長基質の蓄積、及び老廃物の排出を含む膜機能を支える起プロトン力の発生に影響を与える。したがって、いくつかの実施形態における「ギ酸塩排出輸送体」は、シュウ酸塩輸送体、例えば、ＯｘｌＴの場合のように、ギ酸塩：シュウ酸塩対向輸送体も包含する。
ギ酸塩の排出を強化するために（かつ、シュウ酸塩取り込みを組み合わせて、それによりシュウ酸塩取り込みを強化する場合）、ギ酸塩排出輸送体及び／またはシュウ酸塩取り込み機能を組み合わせたギ酸塩排出輸送体が、細菌で発現されるか、または修飾され得る。具体的には、いくつかの実施形態では、ギ酸塩排出輸送体が、遺伝子改変細菌細胞に発現している場合、その細菌細胞は、排出輸送体が発現している際に同じ条件下での同じ細菌亜型の未修飾細菌よりも多くのギ酸塩を細胞外に排出する。一実施形態では、細菌細胞は、ギ酸塩排出輸送体をコードする１つ以上の遺伝子配列（複数可）を含む。一実施形態では、細菌細胞は、ギ酸塩排出輸送体をコードする異種遺伝子、及び少なくとも１つのシュウ酸塩異化酵素をコードする少なくとも１つの異種遺伝子または遺伝子カセットを含む。
したがって、いくつかの実施形態において、本開示は、第１プロモーターに操作可能に連結された、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする１つ以上の遺伝子配列（複数可）及びギ酸塩排出輸送体をコードする１つ以上の遺伝子配列（複数可）を含む細菌細胞を提供する。いくつかの実施形態では、ギ酸塩排出輸送体をコードする１つ以上の遺伝子配列（複数可）は、第１プロモーターに操作可能に連結される。別の実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする１つ以上の遺伝子配列（複数可）は、第１プロモーターに操作可能に連結され、かつギ酸塩排出輸送体をコードする１つ以上の遺伝子配列（複数可）は、第２プロモーターに操作可能に連結される。一実施形態では、第１プロモーター及び第２プロモーターは、同じプロモーターの別々のコピーである。別の実施形態では、第１プロモーター及び第２プロモーターは、異なるプロモーターである。
一実施形態では、細菌細胞は、異なる生物、例えば、異なる種の細菌に由来するギ酸塩排出輸送体をコードする１つ以上の遺伝子配列（複数可）を含む。一実施形態では、細菌細胞は、ギ酸塩排出輸送体をコードする少なくとも１つの天然遺伝子配列（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、ギ酸塩排出輸送体をコードする少なくとも１つの天然遺伝子配列（複数可）は、修飾されない。別の実施形態では、細菌細胞は、ギ酸塩排出輸送体をコードする少なくとも１つの遺伝子天然配列（複数可）の２つ以上のコピーを含む。さらに別の実施形態では、細菌細胞は、天然をコードする１つ以上の遺伝子配列（複数可）のコピーに加えて、異なる細菌種に由来するギ酸塩排出輸送体をコードする少なくとも１つの異種遺伝子配列（複数可）の少なくとも１つのコピーを含む。一実施形態では、細菌細胞は、ギ酸塩排出輸送体をコードする少なくとも１つの異種遺伝子配列の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つのコピーを含む。一実施形態では、細菌細胞は、ギ酸塩排出輸送体をコードする１つ以上の異種遺伝子配列（複数可）の複数のコピーを含む。
いくつかの実施形態では、ギ酸塩排出輸送体は、限定はされないが、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｍａｇｎｅｔｏｓｐｉｒｉｌｌｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｏｘａｌｏｂａｃｔｅｒ、例えば、Ｏｘａｌｏｂａｃｔｅｒ ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ、及びＴｈａｕｅｒａ、例えば、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｉｍａｌｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ、Ｂｏｒｄａｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ、Ｂｏｒｄａｔｅｌｌａ ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｆｕｎｇｏｒｕｍ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｘｅｎｏｖｏｒａｎｓ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｃｉｎｄｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｎｔａｎｉ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｎｔｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｍａｇｎｅｔｏｓｐｉｒｉｌｌｉｕｍ ｍａｇｅｎｔｏｔａｔｉｃｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｌｃｅｒａｎｓ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ、Ｏｘａｌｏｂａｃｔｅｒ ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ｒｅｔｔｇｅｒｉ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｎｔｕｍ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ｖｏｌｃａｎｉｕｍ、及びＴｈａｕｅｒａ ａｒｏｍａｔｉｃａを含む、細菌属または種に由来するギ酸塩排出輸送体遺伝子によってコードされる。
本開示は、ギ酸塩排出輸送体の機能的フラグメントまたはギ酸塩排出輸送体の機能的変異体をコードする遺伝子をさらに含む。本明細書で使用される場合、ギ酸塩排出輸送体の「その機能的フラグメント」または「その機能的変異体」という用語は、フラグメントまたは変異体が誘導された野生型ギ酸塩排出輸送体と共通の定性的生物活性を有する要素に関連する。例えば、突然変異型のギ酸塩排出輸送体タンパク質の機能的フラグメントまたは機能的変異体は、機能的フラグメントまたは機能的変異体が誘導された排出輸送体タンパク質と本質的に同じ、ギ酸塩を細菌細胞に取り込む能力を保持するものである。一実施形態では、遺伝子改変細菌細胞は、ギ酸塩排出輸送体の機能的フラグメントをコードする少なくとも１つの異種遺伝子を含む。別の実施形態では、遺伝子改変細菌細胞は、ギ酸塩排出輸送体の機能的変異体をコードする少なくとも１つの異種遺伝子を含む。
ギ酸塩排出輸送体、ギ酸塩排出輸送体の機能的変異体、またはギ酸塩排出輸送体の機能的フラグメントの活性を試験するためのアッセイは、当業者に良く知られている。例えば、ギ酸塩排出は、内因性のギ酸塩排出輸送体を欠く遺伝子改変細菌細胞でタンパク質、機能的変異体、またはそのフラグンメントを発現させて、タンパク質の発現後に培地中のギ酸塩レベルを評価することによって評価することができる。ギ酸塩排出の測定方法は、当業者に良く知られている（例えば、Ｗｒａｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ａ ｐｅｎｔａｍｅｒｉｃ ｆｏｒｍａｔｅ ｃｈａｎｎｅｌ Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１０ Ｊａｎ；１７（１）：３１－３７を参照さされたい）。
一実施形態では、ギ酸塩排出輸送体をコードする遺伝子は、宿主生物で使用するためにコドン最適化されている。一実施形態では、ギ酸塩排出輸送体をコードする遺伝子は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉで使用するためにコドン最適化されている。
本開示はまた、本明細書に記載のアミノ酸配列と実質的に同じ配列でアミノ酸を含むギ酸塩排出輸送体をコードする遺伝子も包含する。本明細書に記載の配列と実質的に同じアミノ酸配列には、保存的アミノ酸置換に加えてアミノ酸欠失及び／または挿入を含む配列が含まれる。
いくつかの実施形態では、ギ酸塩排出輸送体をコードする少なくとも１つの遺伝子を突然変異誘発させ、ギ酸塩輸送の増加が見られる突然変異体を選択し、かつギ酸塩排出輸送体をコードする突然変異誘発させた少なくとも１つの遺伝子を単離して、細菌細胞に挿入する。非限定的例では、ギ酸塩の排出の増加により、シュウ酸塩の取り込みも増加させることができる。いくつかの実施形態では、ギ酸塩排出輸送体をコードする少なくとも１つの遺伝子を突然変異誘発させ、ギ酸塩輸送の減少が見られる突然変異体を選択し、かつギ酸塩排出輸送体をコードする突然変異誘発させた少なくとも１つの遺伝子を単離して、細菌細胞に挿入する。本明細書に記載の排出輸送体修飾は、プラスミドまたは染色体上に存在し得る。
一実施形態では、ギ酸塩排出輸送体は、ＯｘｌＴである。一実施形態では、ＯｘｌＴ遺伝子は、配列番号１１に対して少なくとも約８０％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ＯｘｌＴ遺伝子は、配列番号１１に対して少なくとも約９０％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ＯｘｌＴ遺伝子は、配列番号１１に対して少なくとも約９５％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ＯｘｌＴ遺伝子は、配列番号１１に対して少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。別の実施形態では、ＯｘｌＴ遺伝子は、配列番号１１の配列を含む。さらに別の実施形態では、ＯｘｌＴ遺伝子は、配列番号１１の配列からなる。
一実施形態では、ＯｘｌＴ遺伝子は、配列番号１２に対して少なくとも約８０％の同一性を有するポリペプチドをコードする。したがって、一実施形態では、ＯｘｌＴ遺伝子は、配列番号１２に対して少なくとも約９０％の同一性を有するポリペプチドをコードする。したがって、一実施形態では、ＯｘｌＴ遺伝子は、配列番号１２に対して少なくとも約９５％の同一性を有するポリペプチドをコードする。したがって、一実施形態では、ＯｘｌＴ遺伝子は、配列番号１２に対して少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するポリペプチドをコードする。別の実施形態では、ＯｘｌＴ遺伝子は、配列番号１２の配列を含むポリペプチドをコードする。さらに別の実施形態では、ＯｘｌＴ遺伝子は、配列番号１２の配列からなるポリペプチドをコードする。
いくつかの実施形態では、細菌細胞は、第１プロモーターに操作可能に連結された、少なくとも１つのシュウ酸塩異化酵素をコードする１つ以上の異種遺伝子配列（複数可）、及びギ酸塩排出輸送体をコードする１つ以上の異種遺伝子配列（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、ギ酸塩排出輸送体をコードする１つ以上の異種遺伝子配列（複数可）は、第１プロモーターに操作可能に連結される。その他の実施形態では、ギ酸塩排出輸送体をコードする１つ以上の異種遺伝子配列（複数可）は、第２プロモーターに操作可能に連結される。一実施形態では、ギ酸塩排出輸送体をコードする１つ以上の異種遺伝子配列（複数可）は、第２プロモーターに直接的に操作可能に連結される。別の実施形態では、ギ酸塩排出輸送体をコードする１つ以上の異種遺伝子配列（複数可）は、第２プロモーターに間接的に操作可能に連結される。
いくつかの実施形態では、ギ酸塩排出輸送体をコードする１つ以上の遺伝子配列（複数可）の発現は、少なくとも１つのシュウ酸塩異化酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子の発現を制御するプロモーターとは異なるプロモーターによって制御される。いくつかの実施形態では、ギ酸塩排出輸送体をコードする１つ以上の遺伝子配列（複数可）の発現は、少なくとも１つのシュウ酸塩異化酵素の発現を制御する同じプロモーターによって制御される。いくつかの実施形態では、ギ酸塩排出輸送体及びシュウ酸塩異化酵素をコードする１つ以上の遺伝子配列（複数可）は、プロモーター領域から分岐して転写される。いくつかの実施形態では、ギ酸塩排出輸送体をコードする１つ以上の遺伝子配列（複数可）及び少なくとも１つのシュウ酸塩異化酵素をコードする１つ以上の遺伝子配列（複数可）をコードする遺伝子のそれぞれの発現は、異なるプロモーターによって制御される。
一実施形態では、プロモーターは、自然界におけるギ酸塩排出輸送体をコードする１つ以上の遺伝子配列（複数可）と操作可能に連結されていない。いくつかの実施形態では、ギ酸塩排出輸送体をコードする１つ以上の遺伝子配列（複数可）は、その天然プロモーターによって制御される。いくつかの実施形態では、ギ酸塩排出輸送体をコードする１つ以上の遺伝子配列（複数可）は、誘導性プロモーターによって制御される。いくつかの実施形態では、ギ酸塩排出輸送体をコードする１つ以上の遺伝子配列（複数可）は、その天然プロモーターよりも強力なプロモーターによって制御される。いくつかの実施形態では、ギ酸塩排出輸送体をコードする１つ以上の遺伝子配列（複数可）は、構成的プロモーターによって制御される。
別の実施形態では、プロモーターは、誘導性プロモーターである。誘導性プロモーターについては、以下でさらに詳細に説明する。
一実施形態では、ギ酸塩排出輸送体をコードする１つ以上の遺伝子配列（複数可）は、細菌細胞内のプラスミド上に位置する。別の実施形態では、ギ酸塩排出輸送体をコードする１つ以上の遺伝子配列（複数可）は、細菌細胞の染色体内に位置する。さらに別の実施形態では、ギ酸塩排出輸送体をコードする１つ以上の遺伝子配列（複数可）の天然コピーは、細菌細胞の染色体内に位置し、異なる種の細菌由来のギ酸塩排出輸送体をコードする少なくとも１つの遺伝子のコピーは、細菌細胞内のプラスミド上に位置する。さらに別の実施形態では、ギ酸塩排出輸送体をコードする１つ以上の遺伝子配列（複数可）の天然コピーは、細菌細胞内のプラスミド上に位置し、異なる種の細菌由来のギ酸塩排出輸送体をコードする少なくとも１つの遺伝子のコピーは、細菌細胞内のプラスミド上に位置する。さらに別の実施形態では、ギ酸塩排出輸送体をコードする１つ以上の遺伝子配列（複数可）の天然コピーは、細菌細胞の染色体内に位置し、異なる種の細菌由来のギ酸塩排出輸送体をコードする１つ以上の遺伝子配列（複数可）のコピーは、細菌細胞の染色体内に位置する。
いくつかの実施形態では、細菌細胞内の排出輸送体をコードする少なくとも１つの天然遺伝子は、修飾されず、天然の排出輸送体の１つ以上の追加のコピーがゲノムに挿入される。一実施形態では、ゲノムに挿入される天然の排出輸送体の１つ以上の追加のコピーは、シュウ酸塩異化酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子の発現を制御する同じ誘導性プロモーター、例えば、ＦＮＲ応答性プロモーター、または少なくとも１つのシュウ酸塩異化酵素の発現を制御するプロモーターとは異なる誘導性プロモーター、あるいは構成的プロモーターの制御下にある。代替の実施形態では、排出輸送体をコードする少なくとも１つの天然遺伝子は修飾されず、異なる細菌種由来の排出輸送体の１つ以上の追加のコピーが、細菌細胞のゲノムに挿入される。一実施形態では、細菌細胞のゲノムに挿入される排出輸送体の１つ以上の追加のコピーは、シュウ酸塩異化酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子の発現を制御する同じ誘導性プロモーター、例えば、ＦＮＲ応答性プロモーター、または少なくとも１つのシュウ酸塩異化酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子の発現を制御するプロモーターとは異なる誘導性プロモーター、あるいは構成的プロモーターの制御下にある。
一実施形態では、ギ酸塩排出輸送体が、遺伝子改変細菌細胞に発現している場合、その細菌細胞は、排出輸送体が発現している際に同じ条件下での同じ細菌亜型の未修飾細菌よりも１０％多いギ酸塩を細菌細胞外に排出する。別の実施形態では、ギ酸塩排出輸送体が遺伝子改変細菌細胞に発現している場合、その細菌細胞は、排出輸送体が発現している際に同じ条件下での同じ細菌亜型の未修飾細菌よりも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％ または１００％多いギ酸塩を細菌細胞外に排出する。さらに別の実施形態では、ギ酸塩排出輸送体が、遺伝子改変細菌細胞に発現している場合、その細菌細胞は、排出輸送体が発現している際に同じ条件下での同じ細菌亜型の未修飾細菌よりも２倍多いギ酸塩を細胞外に排出する。さらに別の実施形態では、ギ酸塩排出輸送体が、遺伝子改変細菌細胞に発現している場合、その細菌細胞は、排出輸送体が発現している際に同じ条件下での同じ細菌亜型の未修飾細菌よりも３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍多いギ酸塩を細胞外に排出する。
一実施形態では、細菌細胞は、シュウ酸塩排出輸送体に突然変異または欠失を含み、それにより排出輸送体を低機能的または非機能的にさせる。このような突然変異により、細胞内のシュウ酸塩の排出が阻止され、シュウ酸塩の異化が増加する可能性がある。
いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、１つ以上の内因性のギ酸塩排出輸送体、例えば、ＦｏｃＡに突然変異または欠失をさらに含む。非限定的例では、ＦｏｃＡに突然変異を含むような遺伝子組換えされた細菌は、ギ酸塩：シュウ酸塩対向輸送体、例えば、ＯｘｌＴをコードする１つ以上の遺伝子配列（複数可）を含む。非限定的例では、１つ以上の内因性のギ酸塩排出輸送体（複数可）は、ギ酸塩：シュウ酸塩対向輸送体、例えば、ＯｘｌＴを通して、シュウ酸塩の同時取り込みを伴わないギ酸塩の排出を低減または阻止するように、（例えば、ＦｏｃＡを）突然変異誘発または欠失をされる。このような突然変異は、細菌細胞内のシュウ酸塩の取り込み及び異化を増加させる可能性がある。
いくつかの実施形態では、ギ酸脱水素酵素及び／またはギ酸脱離酵素は、例えば、細菌細胞内のギ酸塩の異化を阻止するために、突然変異または欠失される。理論に拘束されることを望まないが、このような突然変異により、細胞内のギ酸塩濃度を増加させ、ギ酸塩：シュウ酸塩対向輸送体を介した流動の増加を可能にし、それにより、シュウ酸塩の取り込みを増加させることができる可能性がある。
誘導性プロモーター
いくつかの実施形態では、細菌細胞は、シュウ酸塩異化酵素（複数可）が宿主細胞に発現でき、かつこの宿主細胞が、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、例えば、培地で、及び／またはｉｎ ｖｉｖｏで、例えば、腸内で、生存及び／または増殖することができるように、例えば、ｆｒｃ（Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来）などのホルミルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素、例えば、ＳｃＡＡＥ３（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来）などのシュウ酸ＣｏＡシンテターゼ、例えば、ｏｘｃ（Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来）などのシュウ酸ＣｏＡ脱炭酸酵素、及び／または例えば、ＹｆｄＥ（Ｅ．ｃｏｌｉ由来）などのアセチルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素遺伝子、から選択される１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子及び／または遺伝子カセットを有する安定に維持されたプラスミドまたは染色体を含む。いくつかの実施形態では、細菌細胞は、２つ以上の異なるシュウ酸塩異化酵素、例えば、ｆｒｃ（Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来）などのホルミルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素、例えば、ＳｃＡＡＥ３（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来）などのシュウ酸ＣｏＡシンテターゼ、例えば、ｏｘｃ（Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来）などのシュウ酸ＣｏＡ脱炭酸酵素、及び／または例えば、ＹｆｄＥ（Ｅ．ｃｏｌｉ由来）などのアセチルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、同じシュウ酸塩異化酵素遺伝子及び／または遺伝子カセットの複数のコピーを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、異なるシュウ酸塩異化酵素遺伝子の複数のコピーを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子及び／または遺伝子カセットは、プラスミド上に存在し、かつ直接的または間接的な誘導性プロモーターに操作可能に連結される。いくつかの実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子及び／または遺伝子カセットは、プラスミド上に存在し、かつ低酸素環境または嫌気的条件下で誘導されるプロモーターに操作可能に連結される。いくつかの実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子及び／または遺伝子カセットは、染色体上に存在し、かつ直接的または間接的な誘導性プロモーターに操作可能に連結される。いくつかの実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子及び／または遺伝子カセットは、染色体内に存在し、かつ低酸素環境または嫌気的条件下で誘導されるプロモーターに操作可能に連結される。いくつかの実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子及び／または遺伝子カセットは、プラスミド上に存在し、かつテトラサイクリンまたはアラビノースに曝されることで誘導されるプロモーターに操作可能に連結される。
いくつかの実施形態では、細菌細胞は、輸送体、例えば、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のＯｘｌＴが宿主細胞で発現でき、かつこの宿主細胞が、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、例えば、培地で、及び／またはｉｎ ｖｉｖｏで、例えば、腸内で、生存及び／または増殖することができるように、１つ以上のシュウ酸塩輸送体（複数可）、例えば、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のＯｘｌＴをコードする遺伝子及び／または遺伝子カセットを有する安定に維持されたプラスミドまたは染色体を含む。いくつかの実施形態では、細菌細胞は、１つ以上のシュウ酸塩輸送体（複数可）、例えば、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のＯｘｌＴをコードする遺伝子及び／または遺伝子カセットの２つ以上の異なるコピーを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、１つ以上のシュウ酸塩輸送体（複数可）、例えば、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のＯｘｌＴをコードする同じ遺伝子及び／または遺伝子カセットの複数のコピーを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩輸送体（複数可）、例えば、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のＯｘｌＴをコードする少なくとも１つの遺伝子及び／または遺伝子カセットは、プラスミド上に存在し、直接的または間接的な誘導性プロモーターに操作可能に連結される。いくつかの実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩輸送体（複数可）、例えば、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のＯｘｌＴをコードする遺伝子及び／または遺伝子カセットは、プラスミド上に存在し、かつ低酸素環境または嫌気的条件下で誘導されるプロモーターに操作可能に連結される。いくつかの実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩輸送体（複数可）、例えば、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のＯｘｌＴをコードする遺伝子及び／または遺伝子カセットは、染色体上に存在し、直接的または間接的な誘導性プロモーターに操作可能に連結される。いくつかの実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩輸送体（複数可）、例えば、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のＯｘｌＴをコードする遺伝子及び／または遺伝子カセットは、染色体内に存在し、かつ低酸素環境または嫌気的条件下で誘導されるプロモーターに操作可能に連結される。いくつかの実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩輸送体（複数可）、例えば、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のＯｘｌＴをコードする遺伝子及び／または遺伝子カセットは、プラスミド上に存在し、かつテトラサイクリンに曝されることで誘導されるプロモーターに操作可能に連結される。
いくつかの実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子及び／または遺伝子カセットに操作可能に連結されたプロモーター、及び１つ以上のシュウ酸塩輸送体（複数可）、例えば、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のＯｘｌＴをコードする遺伝子及び／または遺伝子カセットに操作可能に連結されたプロモーターは、外因的な環境条件によって直接的に誘導される。いくつかの実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子及び／または遺伝子カセットに操作可能に連結されたプロモーター、及び１つ以上のシュウ酸塩輸送体（複数可）、例えば、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のＯｘｌＴをコードする遺伝子及び／または遺伝子カセットに操作可能に連結されたプロモーターは、外因的な環境条件によって間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、哺乳動物の腸に特有の外因的な環境条件によって直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、哺乳動物の小腸に特有の外因的な環境条件によって直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、哺乳動物の腸環境など低酸素環境または嫌気的条件によって直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、哺乳動物の腸に特有の分子または代謝産物、例えば、プロピオン酸塩によって直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、細菌細胞と同時投与される分子によって直接的または間接的に誘導される。
酸素依存性調節
特定の実施形態では、細菌細胞は、フマル酸塩及び硝酸還元酵素調節因子（ＦＮＲ）プロモーターの制御下で発現される、例えば、ｆｒｃ（Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来）などのホルミルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素、例えば、ＳｃＡＡＥ３（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来）などのシュウ酸ＣｏＡシンテターゼ、例えば、ｏｘｃ（Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来）などのシュウ酸ＣｏＡ脱炭酸酵素、及び／または例えば、ＹｆｄＥ（Ｅ．ｃｏｌｉ由来）などのアセチルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素、から選択される１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子及び／または遺伝子カセットを含む。特定の実施形態では、細菌細胞は、フマル酸塩及び硝酸還元酵素調節因子（ＦＮＲ）プロモーターの制御下で発現される、１つ以上のシュウ酸塩輸送体（複数可）、例えば、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のＯｘｌＴをコードする遺伝子及び／または遺伝子カセットを含む。Ｅ．ｃｏｌｉでは、ＦＮＲは、好気性代謝から嫌気性代謝への切り換えを制御する主要な転写活性化因子である（Ｕｎｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。嫌気性状態では、ＦＮＲは、二量体化して活動性ＤＮＡ結合タンパク質となり、嫌気性増殖に適応するための数百の遺伝子を活性化させる。好気性状態では、ＦＮＲは、酸素によって二量体化が阻止され、かつ不活性である。
ＦＮＲ応答性プロモーターとしては、以下の表で一覧となっているＦＮＲ応答性プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。下線の配列は、予測されるリボソーム結合部位であり、太字の配列はクローニングに使用される制限酵素部位である。
Figure 2023511282000005
一実施形態では、ＦＮＲ応答性プロモーターは、配列番号１３を含む。一実施形態では、ＦＮＲ応答性プロモーターは、配列番号１４を含む。別の実施形態では、ＦＮＲ応答性プロモーターは、配列番号１５を含む。別の実施形態では、ＦＮＲ応答性プロモーターは、配列番号１６を含む。別の実施形態では、ＦＮＲ応答性プロモーターは、配列番号１７を含む。その他のＦＮＲ応答性プロモーターについて下記の表６に示す。
Figure 2023511282000006
一実施形態では、ＦＮＲ応答性プロモーターは、配列番号１８を含む。一実施形態では、ＦＮＲ応答性プロモーターは、配列番号１９を含む。別の実施形態では、ＦＮＲ応答性プロモーターは、配列番号２０を含む。別の実施形態では、ＦＮＲ応答性プロモーターは、配列番号２１を含む。別の実施形態では、ＦＮＲ応答性プロモーターは、配列番号２２を含む。一実施形態では、ＦＮＲ応答性プロモーターは、配列番号２３を含む。一実施形態では、ＦＮＲ応答性プロモーターは、配列番号２４を含む。別の実施形態では、ＦＮＲ応答性プロモーターは、配列番号２５を含む。別の実施形態では、ＦＮＲ応答性プロモーターは、配列番号２６を含む。別の実施形態では、ＦＮＲ応答性プロモーターは、配列番号２７を含む。別の実施形態では、ＦＮＲ応答性プロモーターは、配列番号２８を含む。別の実施形態では、ＦＮＲ応答性プロモーターは、配列番号２９を含む。
いくつかの実施形態では、複数の異なるＦＮＲ核酸配列が、遺伝子組換えされた細菌に挿入される。代替の実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、代替の酸素レベル依存性プロモーター、例えば、ＤＮＲ（Ｔｒｕｎｋ ｅｔ ａｌ．，２０１０）またはＡＮＲ（Ｒａｙ ｅｔ ａｌ．，１９９７）の制御下で発現される、例えば、Ｆｒｃ（Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来）などのホルミルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素、例えば、ＳｃＡＡＥ３（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来）などのシュウ酸ＣｏＡシンテターゼ、例えば、Ｏｘｃ（Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来）などのシュウ酸ＣｏＡ脱炭酸酵素、及び／または例えば、ＹｆｄＥ（Ｅ．ｃｏｌｉ由来）などのアセチルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素、あるいはその他の本明細書にて開示する酵素から選択される１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子及び／または遺伝子カセット（複数可）を含む。代替の実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、代替の酸素レベル依存性プロモーター、例えば、ＤＮＲ（Ｔｒｕｎｋ ｅｔ ａｌ．，２０１０）またはＡＮＲ（Ｒａｙ ｅｔ ａｌ．，１９９７）の制御下で発現される、１つ以上のシュウ酸塩輸送体（複数可）、例えば、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のＯｘｌＴをコードする遺伝子及び／または遺伝子カセットを含む。これらの実施形態では、シュウ酸塩及び／またはその代謝産物の異化は、腸内など低酸素環境または嫌気性環境で特に活性化される。いくつかの実施形態では、遺伝子発現は、当技術分野において知られている方法によって、例えば、リボソーム結合部位を最適化することによって及び／またはｍＲＮＡ安定性を強化することによってさらに最適化される。一実施形態では、哺乳動物の腸は、ヒト哺乳動物の腸である。
いくつかの実施形態では、細菌細胞は、酸素レベル依存性転写調節因子、例えば、ＦＮＲ、ＡＮＲ、またはＤＮＲ、及び異なる細菌種由来の対応するプロモーターを含む。異種酸素レベル依存性転写調節因子及びプロモーターは、低酸素環境または嫌気性環境において、同じ条件下での細菌内の天然遺伝子（複数可）及びプロモーターよりも、上記プロモーターに操作可能に連結された遺伝子、例えば、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子及び／もしくは遺伝子カセット、ならびに／または１つ以上のシュウ酸塩輸送体（複数可）、例えば、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のＯｘｌＴをコードする遺伝子及び／もしくは遺伝子カセットの転写を増加させる。特定の実施形態では、非天然酸素レベル依存性転写調節因子は、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ由来のＦＮＲタンパク質である（例えば、Ｉｓａｂｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．，２０１１を参照されたい）。いくつかの実施形態では、対応する野生型転写調節因子は、無傷のまま野生型活性を維持している。代替の実施形態では、対応する野生型転写調節因子は、野生型活性を低減または排除するように欠失または突然変異される。
いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、野生型酸素レベル依存性転写調節因子、例えば、ＦＮＲ、ＡＮＲ、またはＤＮＲ、及び同じ亜型の細菌由来の野生型プロモーターと比較して突然変異された対応するプロモーターを含む。突然変異されたプロモーターは、野生型転写調節因子への結合を強化し、かつ低酸素環境または嫌気性環境において、同じ条件下での野生型プロモーターよりも、上記プロモーターに操作可能に連結された遺伝子、例えば、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子及び／もしくは遺伝子カセット、ならびに／または１つ以上のシュウ酸塩輸送体（複数可）、例えば、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のＯｘｌＴをコードする遺伝子及び／もしくは遺伝子カセットの転写を増加させる。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、野生型酸素レベル依存性プロモーター、例えば、ＦＮＲ、ＡＮＲ、またはＤＮＲプロモーター、及び同じ亜型の細菌由来の野生型転写調節因子と比較して突然変異された対応する転写調節因子を含む。突然変異された転写調節因子は、野生型プロモーターへの結合を強化し、かつ低酸素環境または嫌気性環境において、同じ条件下での野生型転写調節因子よりも、上記プロモーターに操作可能に連結された遺伝子、例えば、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子及び／もしくは遺伝子カセット、ならびに／または１つ以上のシュウ酸塩輸送体（複数可）、例えば、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のＯｘｌＴをコードする遺伝子及び／もしくは遺伝子カセットの転写を増加させる。特定の実施形態では、酸素レベル依存性突然変異転写調節因子は、二量体化及びＦＮＲ活性を強化する、アミノ酸置換を含んだＦＮＲタンパク質である（例えば、Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，２００６を参照されたい）。
いくつかの実施形態では、本明細書にて開示する細菌細胞は、酸素レベル感知転写調節因子をコードする内因性遺伝子、例えば、ＦＮＲ遺伝子の複数のコピーを含む。いくつかの実施形態では、酸素レベル感知転写調節因子をコードする遺伝子は、プラスミド上に存在する。いくつかの実施形態では、酸素レベル感知転写調節因子をコードする遺伝子、ならびに１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子及び／または遺伝子カセットは、異なるプラスミド上に存在する。いくつかの実施形態では、酸素レベル感知転写調節因子をコードする遺伝子、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子及び／もしくは遺伝子カセット、ならびに／またはシュウ酸塩輸送体をコードする遺伝子は、異なるプラスミド上に存在する。いくつかの実施形態では、酸素レベル感知転写調節因子をコードする遺伝子、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子及び／もしくは遺伝子カセット、ならびに／または１つ以上のシュウ酸塩輸送体（複数可）をコードする遺伝子及び／もしくは遺伝子カセットは、同じプラスミド上に存在する。
いくつかの実施形態では、酸素レベル感知転写調節因子をコードする遺伝子は、染色体上に存在する。いくつかの実施形態では、酸素レベル感知転写調節因子をコードする遺伝子、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子及び／もしくは遺伝子カセット、ならびに／または１つ以上のシュウ酸塩輸送体（複数可）をコードする遺伝子及び／もしくは遺伝子カセットは、異なる染色体上に存在する。いくつかの実施形態では、酸素レベル感知転写調節因子をコードする遺伝子、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子及び／もしくは遺伝子カセット、ならびに／または１つ以上のシュウ酸塩輸送体（複数可）をコードする遺伝子及び／もしくは遺伝子カセットは、同じ染色体上に存在する。場合によっては、発現の安定性を強化するために、誘導性プロモーターの制御下で酸素レベル感知転写調節因子を発現させることは有利である場合がある。いくつかの実施形態では、転写調節因子の発現は、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）及び／またはシュウ酸塩輸送体をコードする遺伝子及び／または遺伝子カセットの発現を制御するプロモーターとは異なるプロモーターによって制御される。いくつかの実施形態では、転写調節因子の発現は、シュウ酸塩異化酵素（複数可）及び／またはシュウ酸塩輸送体（複数可）の発現を制御する同じプロモーターによって制御される。いくつかの実施形態では、転写調節因子及びシュウ酸塩異化酵素（複数可）は、プロモーター領域から分岐して転写される。
ＲＮＳ依存性調節
いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、誘導性プロモーターの制御下で発現される、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子及び／または遺伝子カセットを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）及び／またはシュウ酸塩輸送体（複数可）が発現している遺伝子組換えされた細菌は、炎症状態によって活性化されるプロモーターの制御下にある。一実施形態では、シュウ酸塩異化酵素（複数可）及び／またはシュウ酸塩輸送体を産生するための遺伝子及び／または遺伝子カセットは、炎症性環境で活性化する炎症依存性プロモーター、例えば、活性窒素種またはＲＮＳプロモーターの制御下で発現される。
本明細書で使用される場合、「活性窒素種」及び「ＲＮＳ」は、同じ意味で用いられ、分子窒素から誘導される高活性分子、イオン、及び／またはラジカルを指す。ＲＮＳは、ニトロソ化ストレスなどの有害な細胞効果を引き起こす可能性がある。ＲＮＳとしては、一酸化窒素（ＮＯ・）、ペルオキシナイトライトまたはペルオキシナイトライトアニオン（ＯＮＯＯ－）、二酸化窒素（・ＮＯ２）、三酸化二窒素（Ｎ２Ｏ３）、ペルオキシ亜硝酸（ＯＮＯＯＨ）、及びニトロペルオキシ炭酸塩（ＯＮＯＯＣＯ２－）が挙げられるが、これらに限定されない（・は不対電子を表している）。細菌は、ＲＮＳレベルを感知することできる転写因子を進化させている。異なるＲＮＳシグナル伝達経路が、異なるＲＮＳレベルによって引き起こされ、異なる反応速度で発生する。
本明細書で使用される場合、「ＲＮＳ誘導性調節領域」とは、１つ以上のＲＮＳ感知転写因子が結合することができる核酸配列を指し、ここで、対応する転写因子の結合及び／または活性化が下流遺伝子発現を活性し、またＲＮＳの存在下では転写因子は調節領域に結合する、及び／または調節領域を活性化する。いくつかの実施形態では、ＲＮＳ誘導性調節領域は、プロモーター配列を含む。いくつかの実施形態では、転写因子は、ＲＮＳを感知し、それに続いてＲＮＳ誘導性調節領域に結合し、それによって下流遺伝子発現を活性化する。代替の実施形態では、転写因子は、ＲＮＳの不在下ではＲＮＳ誘導性調節領域に結合し、ＲＮＳの存在下では転写因子はコンフォメーション変化を起こし、それによって下流遺伝子発現を活性化する。ＲＮＳ誘導性調節領域は、遺伝子及び／または遺伝子カセット、例えば、本明細書に記載のシュウ酸塩異化酵素のいずれかの、例えば、シュウ酸塩異化酵素遺伝子配列（複数可）に機能的に連結され得る。例えば、ＲＮＳの存在下では、転写因子は、ＲＮＳを感知し、対応するＲＮＳ誘導性調節領域を活性化し、それによって機能的に連結されている遺伝子配列の発現を誘導する。このように、ＲＮＳは、遺伝子または遺伝子配列の発現を誘導する。
本明細書で使用される場合、「ＲＮＳ抑制解除調節領域」とは、１つ以上のＲＮＳ感知転写因子が結合することができる核酸配列を指し、ここで、対応する転写因子の結合が下流遺伝子発現を抑制し、またＲＮＳの存在下では転写因子は調節領域に結合せず、調節領域を抑制しない。いくつかの実施形態では、ＲＮＳ抑制解除調節領域は、プロモーター配列を含む。ＲＮＳ抑制解除調節領域は、遺伝子または遺伝子カセット、例えば、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素遺伝子配列（複数可）及びシュウ酸塩輸送体配列（複数可）に機能的に連結され得る。例えば、ＲＮＳの存在下では、転写因子は、ＲＮＳを感知し、調節領域にはそれ以上結合せず、及び／または調節領域を抑制し、それによって、機能的に連結されている遺伝子配列または遺伝子カセットを抑制解除する。このように、ＲＮＳは、遺伝子または遺伝子カセットの発現を抑制解除する。
本明細書で使用される場合、「ＲＮＳ抑制調節領域」とは、１つ以上のＲＮＳ感知転写因子が結合することができる核酸配列を指し、ここで、対応する転写因子の結合が下流遺伝子発現を抑制し、またＲＮＳの存在下では転写因子は調節領域に結合し、調節領域を抑制する。いくつかの実施形態では、ＲＮＳ抑制調節領域は、プロモーター配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＳを感知する転写因子は、プロモーター配列の一部と重複する調節領域に結合することができる。代替の実施形態では、ＲＮＳを感知する転写因子は、プロモーター配列の上流または下流である調節領域に結合することができる。ＲＮＳ抑制調節領域は、遺伝子配列または遺伝子カセットに機能的に連結され得る。例えば、ＲＮＳの存在下では、転写因子は、ＲＮＳを感知し、対応するＲＮＳ抑制調節領域に結合し、それによって機能的に連結されている単一の遺伝子配列または複数の遺伝子配列の発現をブロックする。このように、ＲＮＳは、遺伝子または遺伝子配列の発現を抑制する。
本明細書で使用される場合、「ＲＮＳ応答性調節領域」とは、ＲＮＳ誘導性調節領域、ＲＮＳ抑制調節領域、及び／またはＲＮＳ抑制解除調節領域を指す。いくつかの実施形態では、ＲＮＳ応答性調節領域は、プロモーター配列を含む。調節領域のそれぞれは、少なくとも１つの対応するＲＮＳ感知転写因子に結合することができる。ＲＮＳを感知する転写因子及びそれらの対応するＲＮＳ応答性遺伝子、プロモーター、及び／または調節領域の例としては、表７に示すものが挙げられるが、これらに限定されない。
Figure 2023511282000007
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子組換えされた細菌は、少なくとも１つの活性窒素種を感知することができる転写因子によって直接的または間接的に制御される調整可能な調節領域を含む。調整可能な調節領域は、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）、シュウ酸塩輸送体（複数可）の発現を直接的または間接的に誘導し、したがってＲＮＳレベルに相関してシュウ酸塩異化酵素、シュウ酸塩輸送体（複数可）の発現を制御することができる遺伝子及び／または遺伝子カセットに機能的に連結される。例えば、調整可能な調節領域は、ＲＮＳ誘導性調節領域であり、ペイロードは、本明細書に記載のシュウ酸塩異化酵素、及び／またはシュウ酸塩輸送体（複数可）のいずれかなどの１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）、シュウ酸塩輸送体（複数可）であり、ＲＮＳが存在する場合、例えば炎症組織において、ＲＮＳ感知転写因子は、調節領域に結合し、及び／または調節領域を活性化し、かつシュウ酸塩異化酵素及び／またはシュウ酸塩輸送体遺伝子または遺伝子カセットの発現を誘導する。その後、炎症が緩和されると、ＲＮＳレベルが低下し、シュウ酸塩異化酵素（複数可）及びシュウ酸塩輸送体（複数可）の産生は減少するか、または排除される。
いくつかの実施形態では、調整可能な調節領域は、ＲＮＳ誘導性調節領域であり、ＲＮＳの存在下では、転写因子はＲＮＳを感知して、ＲＮＳ誘導性調節領域を活性化し、それによって機能的に連結されている遺伝子または遺伝子カセットの発現を誘導する。いくつかの実施形態では、転写因子は、ＲＮＳを感知し、それに続いてＲＮＳ誘導性調節領域に結合し、それによって下流遺伝子発現を活性化する。代替の実施形態では、転写因子は、ＲＮＳの不在下ではＲＮＳ誘導性調節領域に結合し、転写因子がＲＮＳを感知する場合、コンフォメーション変化を起こし、それによって下流遺伝子発現を誘導する。
いくつかの実施形態では、調整可能な調節領域は、ＲＮＳ誘導性調節領域であり、ＲＮＳを感知する転写因子は、ＮｏｒＲである。ＮｏｒＲは、「ＮＯを亜酸化窒素に還元するフラボルブレドキシン及び関連するフラビンタンパク質をコードするｎｏｒＶＷ遺伝子の発現を調節するＮＯ－応答性転写活性化因子である」（Ｓｐｉｒｏ ２００６）。本発明の遺伝子組換えされた細菌は、ＮｏｒＲによって活性化される遺伝子に由来する任意の好適なＲＮＳ応答性調節領域を含み得る。ＮｏｒＲによって活性化され得る遺伝子は、当技術分野において既知である（例えば、Ｓｐｉｒｏ ２００６；Ｖｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｋａｒｌｉｎｓｅｙ ｅｔ ａｌ．，２０１２；表１を参照されたい）。特定の実施形態では、本発明の遺伝子組換えされた細菌は、遺伝子及び／または遺伝子カセット、例えば、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）及び／またはシュウ酸塩輸送体（複数可）に機能的に連結された、ｎｏｒＶＷ由来のＲＮＳ誘導性調節領域を含む。ＲＮＳの存在下では、ＮｏｒＲ転写因子は、ＲＮＳを感知して、ｎｏｒＶＷ調節領域を活性化し、それによって機能的に連結されている遺伝子及び／または遺伝子カセットの発現を誘導して、シュウ酸塩異化酵素（複数可）及び／またはシュウ酸塩輸送体（複数可）を産生する。
いくつかの実施形態では、調整可能な調節領域は、ＲＮＳ誘導性調節領域であり、ＲＮＳを感知する転写因子は、ＤＮＲである。ＤＮＲ（異化型硝酸呼吸調節因子）は、一酸化窒素の存在下で「ｎｉｒ、ｎｏｒ、及びｎｏｓ遺伝子の発現を促進する」（Ｃａｓｔｉｇｌｉｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，２００９）。本発明の遺伝子組換えされた細菌は、ＤＮＲによって活性化される遺伝子に由来する任意の好適なＲＮＳ応答性調節領域を含み得る。ＤＮＲによって活性化され得る遺伝子は、当技術分野において既知である（例えば、Ｃａｓｔｉｇｌｉｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，２００９；Ｇｉａｒｄｉｎａ ｅｔ ａｌ．，２００８；表１を参照されたい）。特定の実施形態では、本発明の遺伝子組換えされた細菌は、遺伝子及び／または遺伝子カセット、例えば、酪酸生成遺伝子カセットに機能的に連結された、ｎｏｒＣＢ由来のＲＮＳ誘導性調節領域を含む。ＲＮＳの存在下では、ＤＮＲ転写因子は、ＲＮＳを感知して、ｎｏｒＣＢ調節領域を活性化し、それによって機能的に連結されている遺伝子または遺伝子カセットの発現を誘導して、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素を産生する。いくつかの実施形態では、ＤＮＲは、緑膿菌ＤＮＲである。
いくつかの実施形態では、調整可能な調節領域は、ＲＮＳ抑制解除調節領域であり、対応する転写因子の結合により、下流遺伝子発現が抑制され、またＲＮＳの存在下では転写因子は調節領域にそれ以上結合せず、それによって機能的に連結されている遺伝子または遺伝子カセットを抑制解除する。
いくつかの実施形態では、調整可能な調節領域は、ＲＮＳ抑制解除調節領域であり、ＲＮＳを感知する転写因子は、ＮｓｒＲである。ＮｓｒＲは、「ＮＯを感知し、ＮＯ代謝を担う遺伝子の発現を制御することができるＲｒｆ２型転写抑制因子である」（Ｉｓａｂｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．，２００９）。本発明の遺伝子組換えされた細菌は、ＮｓｒＲによって抑制される遺伝子に由来する任意の好適なＲＮＳ応答性調節領域を含み得る。いくつかの実施形態では、ＮｓｒＲは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ ＮｓｒＲである。ＮｓｒＲによって抑制され得る遺伝子は、当技術分野において既知である（例えば、Ｉｓａｂｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．，２００９；Ｄｕｎｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０；表１を参照されたい）。特定の実施形態では、本発明の遺伝子組換えされた細菌は、遺伝子または遺伝子カセット、例えば、シュウ酸塩異化酵素遺伝子または遺伝子カセットに機能的に連結された、ｎｏｒＢ由来のＲＮＳ抑制解除調節領域を含む。ＲＮＳの存在下では、ＮｓｒＲ転写因子は、ＲＮＳを感知し、ｎｏｒＢ調節領域にはそれ以上結合せず、それによって機能的に連結されているシュウ酸塩異化酵素及び／またはシュウ酸塩輸送体遺伝子または遺伝子カセットを抑制解除して、シュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードするものを産生する。
いくつかの実施形態では、細菌においてかなりの数の天然遺伝子の発現を調節しないＲＮＳ感知転写因子を遺伝子組換えされた細菌が発現することが有利である。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子組換えされた細菌は、細菌の異なる種、菌株、または亜系に由来するＲＮＳ感知転写因子を発現するが、この際、この転写因子は、本発明の遺伝子組換えされた細菌において調節配列に結合しない。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子組換えされた細菌は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉであり、ＲＮＳ感知転写因子は、例えば、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ由来のＮｓｒＲであり、ここで、このＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉは、上記ＮｓｒＲに対する結合部位を含まない。いくつかの実施形態では、異種転写因子は、遺伝子組換えされた細菌における内因性調節領域及び遺伝子に対するオフターゲット効果を最小化または排除する。
いくつかの実施形態では、調整可能な調節領域は、ＲＮＳ抑制調節領域であり、対応する転写因子の結合により、下流遺伝子発現が抑制され、またＲＮＳの存在下では転写因子はＲＮＳを感知して、ＲＮＳ抑制調節領域に結合し、それによって機能的に連結されている遺伝子または遺伝子カセットの発現を抑制する。いくつかの実施形態では、ＲＮＳ感知転写因子は、プロモーター配列の一部と重複する調節領域に結合することができる。代替の実施形態では、ＲＮＳ感知転写因子は、プロモーター配列の上流または下流である調節領域に結合することができる。
これらの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、シュウ酸塩異化酵素を発現するために使用される２種の抑制因子の活性化調節回路を含む場合がある。２種の抑制因子の活性化調節回路は、第１ＲＮＳ感知抑制因子及び第２抑制因子を含み、これは、例えば、シュウ酸塩異化酵素をコードする遺伝子または遺伝子カセットに機能的に連結される。これらの実施形態の一態様では、ＲＮＳ感知抑制因子は、第２抑制因子の転写を阻害し、これにより、遺伝子または遺伝子カセットの転写が阻害される。これらの実施形態において有用な第２抑制因子の例としては、ＴｅｔＲ、Ｃ１、及びＬｅｘＡが挙げられるが、これらに限定されない。第１抑制因子による結合が存在しない場合（これはＲＮＳの不在下で発生する）、第２抑制因子が転写され、これにより、遺伝子または遺伝子カセットの発現が抑制される。第１抑制因子による結合が存在する場合（これはＲＮＳの存在下で発生する）、第２抑制因子の発現は抑制され、遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）、例えば、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）及び／またはシュウ酸塩輸送体（複数可）遺伝子または遺伝子カセットが発現される。
ＲＮＳ応答性転写因子は、遺伝子組換えされた細菌で用いられる調節領域配列に応じて遺伝子発現を誘導、抑制解除、または抑制することができる。ＲＮＳ感知転写因子のうち１つ以上のタイプ及び対応する調節領域配列は、遺伝子組換えされた細菌で存在し得る。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、ＲＮＳ感知転写因子の１つのタイプ、例えば、ＮｓｒＲ、及び例えば、ｎｏｒＢ由来の１つの対応する調節領域配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、ＲＮＳ感知転写因子の１つのタイプ、例えば、ＮｓｒＲ、及び例えば、ｎｏｒＢ及びａｎｉＡ由来の２つ以上の異なる対応する調節領域配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、ＲＮＳ感知転写因子の２つ以上のタイプ、例えば、ＮｓｒＲ及びＮｏｒＲ、ならびに例えば、ｎｏｒＢ及びｎｏｒＲ由来のそれぞれ、２つ以上の対応する調節領域配列を含む。１つのＲＮＳ応答性調節領域は、２つ以上の転写因子に結合することができる場合がある。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、ＲＮＳ感知転写因子の２つ以上のタイプ、及び１つの対応する調節領域配列を含む。いくつかのＲＮＳ調節型調節領域の核酸配列は、当技術分野において既知である（例えば、Ｓｐｉｒｏ ２００６；Ｉｓａｂｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．，２００９；Ｄｕｎｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｖｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｋａｒｌｉｎｓｅｙ ｅｔ ａｌ．，２０１２を参照されたい）。
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子組換えされた細菌は、ＲＮＳ感知転写因子をコードする遺伝子、例えば、ｎｓｒＲ遺伝子を含み、これは、その天然プロモーター、誘導性プロモーター、天然プロモーターよりも強力なプロモーター、例えば、ＧｌｎＲＳプロモーターもしくはＰ（Ｂｌａ）プロモーター、または構成的プロモーターによって制御される遺伝子である。場合によっては、発現の安定性を強化するために、誘導性プロモーターの制御下でＲＮＳ感知転写因子を発現させることは有利である場合がある。いくつかの実施形態では、ＲＮＳ感知転写因子の発現は、治療用分子の発現を制御するプロモーターとは異なるプロモーターによって制御される。いくつかの実施形態では、ＲＮＳ感知転写因子の発現は、治療用分子の発現を制御する同じプロモーターによって制御される。いくつかの実施形態では、ＲＮＳ感知転写因子及び治療用分子は、プロモーター領域から分岐して転写される。
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子組換えされた細菌は、細菌の異なる種、菌株、または亜系に由来するＲＮＳ感知転写因子の遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、細菌の異なる種、菌株、または亜系に由来するＲＮＳ応答性調節領域を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、ＲＮＳ感知転写因子、及び細菌の異なる種、菌株、または亜系に由来する対応するＲＮＳ応答性調節領域を含む。異種ＲＮＳ感知転写因子及び調節領域は、同じ条件下での同じ亜型の細菌に由来する天然転写因子及び調節領域よりも、ＲＮＳの存在下で上記調節領域に機能的に連結されている遺伝子の転写を増加させることができる。
いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、ＲＮＳ感知転写因子、ＮｓｒＲ、及び対応する調節領域、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ由来のｎｓｒＲを含む。いくつかの実施形態では、天然ＲＮＳ感知転写因子、例えば、ＮｓｒＲは、無傷のまま野生型活性を維持している。代替の実施形態では、天然ＲＮＳ感知転写因子、例えば、ＮｓｒＲは、野生型活性を低減または排除するように欠失または突然変異される。
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子組換えされた細菌は、ＲＮＳ感知転写因子をコードする内因性遺伝子、例えば、ｎｓｒＲ遺伝子の複数のコピーを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＳ感知転写因子をコードする遺伝子は、プラスミド上に存在する。いくつかの実施形態では、ＲＮＳ感知転写因子をコードする遺伝子、及び治療用分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、異なるプラスミド上に存在する。いくつかの実施形態では、ＲＮＳ感知転写因子をコードする遺伝子、及び治療用分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、同じプラスミド上に存在する。いくつかの実施形態では、ＲＮＳ感知転写因子をコードする遺伝子は、染色体上に存在する。いくつかの実施形態では、ＲＮＳ感知転写因子をコードする遺伝子、及び治療用分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、異なる染色体上に存在する。いくつかの実施形態では、ＲＮＳ感知転写因子をコードする遺伝子、及び治療用分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、同じ染色体上に存在する。
いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、ＲＮＳ感知転写因子をコードする野生型遺伝子、例えば、ＮｓｒＲ遺伝子、及び同じ亜型の細菌由来の野生型調節領域と比較して突然変異された対応する調節領域、例えば、ｎｏｒＢ調節領域を含む。突然変異された調節領域は、同じ条件下での野生型調節領域よりも、ＲＮＳの存在下でシュウ酸塩異化酵素の発現を増加させる。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、野生型ＲＮＳ応答性調節領域、例えば、ｎｏｒＢ調節領域、及び同じ亜型の細菌由来の野生型転写因子と比較して突然変異された対応する転写因子、例えば、ＮｓｒＲを含む。突然変異転写因子は、同じ条件下での野生型転写因子よりも、ＲＮＳの存在下でシュウ酸塩異化酵素（複数可）の発現を増加させる。いくつかの実施形態では、ＲＮＳ感知転写因子及び対応する調節領域の両方は、ＲＮＳの存在下でシュウ酸塩異化酵素（複数可）及び／またはシュウ酸塩輸送体（複数可）の発現を増加させるために、同じ亜型の細菌由来の野生型配列と比較して突然変異される。
いくつかの実施形態では、抗炎症及び／または腸バリア機能エンハンサー分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、プラスミド上に存在し、ＲＮＳによって誘導されるプロモーターに操作可能に連結される。いくつかの実施形態では、発現は、当技術分野において知られている方法によって、例えば、リボソーム結合部位を最適化することによって、転写調節因子を操作することによって、及び／またはｍＲＮＡ安定性を強化することによってさらに最適化される。
いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子（複数可）のうちいずれかは、１つ以上の組み込み部位で細菌染色体に組み込まれ得る。例えばシュウ酸塩異化酵素及び／またはシュウ酸塩輸送体遺伝子（複数可）の１つ以上のコピーが、細菌染色体に組み込まれてもよい。染色体に組み込まれた遺伝子または遺伝子（複数可）の複数のコピーを有することにより、シュウ酸塩異化酵素（複数可）のより多い産生が可能になり、さらに発現のレベルの微調整も可能になる。あるいは、分泌または排出輸送体回路のいずれかなど、本明細書に記載の異なる回路に加えて、治療用遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）は、複数の異なる機能を行うように１つ以上の異なる組み込み部位で細菌染色体に組み込むことができる。
ＲＯＳ依存性調節
いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、誘導性プロモーターの制御下で発現される、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）及び／またはシュウ酸塩輸送体（複数可）を産生するための遺伝子及び／または遺伝子カセットを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、細胞障害状態によって活性化されるプロモーターの制御下で１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）及び／またはシュウ酸塩輸送体（複数可）を発現する。一実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）を産生するための遺伝子及び／または遺伝子カセットは、細胞障害または組織障害がある環境で活性化する細胞障害依存性プロモーター、例えば、活性酸素種またはＲＯＳプロモーターの制御下で発現される。
本明細書で使用される場合、「活性酸素種」及び「ＲＯＳ」は、同じ意味で用いられ、分子酸素から誘導される高活性分子、イオン、及び／またはラジカルを指す。ＲＯＳは、好気呼吸または金属触媒酸化の副産物として産生される場合があり、酸化的損傷などの有害な細胞効果を引き起こす可能性がある。ＲＯＳとしては、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、有機過酸化物（ＲＯＯＨ）、水酸化物イオン（ＯＨ－）、水酸ラジカル（・ＯＨ）、超酸化物もしくは超酸化物アニオン（・Ｏ２－）、一重項酸素（１Ｏ２）、オゾン（Ｏ３）、炭酸ラジカル、過酸化物もしくは過酸ラジカル（・Ｏ２－２）、次亜塩素酸（ＨＯＣｌ）、次亜塩素酸イオン（ＯＣｌ－）、次亜塩素酸ナトリウム（ＮａＯＣｌ）、一酸化窒素（ＮＯ・）、及びペルオキシナイトライトもしくはペルオキシナイトライトアニオン（ＯＮＯＯ－）が挙げあれるが、これらに限定されない（・は不対電子を表している）。細菌は、ＲＯＳレベルを感知することできる転写因子を進化させている。異なるＲＯＳシグナル伝達経路が、異なるＲＯＳレベルによって引き起こされ、異なる反応速度で発生する（Ｍａｒｉｎｈｏ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。
本明細書で使用される場合、「ＲＯＳ誘導性調節領域」とは、１つ以上のＲＯＳ感知転写因子が結合することができる核酸配列を指し、ここで、対応する転写因子の結合及び／または活性化が下流遺伝子発現を活性し、またＲＯＳの存在下では転写因子は調節領域に結合する、及び／または調節領域を活性化する。いくつかの実施形態では、ＲＯＳ誘導性調節領域は、プロモーター配列を含む。いくつかの実施形態では、転写因子は、ＲＯＳを感知し、それに続いてＲＯＳ誘導性調節領域に結合し、それによって下流遺伝子発現を活性化する。代替の実施形態では、転写因子は、ＲＯＳの不在下ではＲＯＳ誘導性調節領域に結合し、ＲＯＳの存在下では転写因子はコンフォメーション変化を起こし、それによって下流遺伝子発現を活性化する。ＲＯＳ誘導性調節領域は、単一の遺伝子配列または複数の遺伝子配列、例えば、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする単一の配列または複数の配列に機能的に連結され得る。例えば、ＲＯＳの存在下では、転写因子、例えば、ＯｘｙＲは、ＲＯＳを感知し、対応するＲＯＳ誘導性調節領域を活性化し、それによって機能的に連結されている単一の遺伝子配列または複数の遺伝子配列の発現を誘導する。このように、ＲＯＳは、遺伝子または遺伝子カセットの発現を誘導する。
本明細書で使用される場合、「ＲＯＳ抑制解除調節領域」とは、１つ以上のＲＯＳ感知転写因子が結合することができる核酸配列を指し、ここで、対応する転写因子の結合が下流遺伝子発現を抑制し、またＲＯＳの存在下では転写因子は調節領域に結合せず、調節領域を抑制しない。いくつかの実施形態では、ＲＯＳ抑制解除調節領域は、プロモーター配列を含む。ＲＯＳ抑制解除調節領域は、遺伝子または遺伝子カセット、例えば、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする１つ以上の遺伝子に機能的に連結され得る。例えば、ＲＯＳの存在下では、転写因子、例えば、ＯｈｒＲは、ＲＯＳを感知し、調節領域にはそれ以上結合せず、及び／または調節領域を抑制し、それによって、機能的に連結されている遺伝子配列または遺伝子カセットを抑制解除する。このように、ＲＯＳは、遺伝子または遺伝子カセットの発現を抑制解除する。
本明細書で使用される場合、「ＲＯＳ抑制調節領域」とは、１つ以上のＲＯＳ感知転写因子が結合することができる核酸配列を指し、ここで、対応する転写因子の結合が下流遺伝子発現を抑制し、またＲＯＳの存在下では転写因子は調節領域に結合し、調節領域を抑制する。いくつかの実施形態では、ＲＯＳ抑制調節領域は、プロモーター配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＯＳを感知する転写因子は、プロモーター配列の一部と重複する調節領域に結合することができる。代替の実施形態では、ＲＯＳを感知する転写因子は、プロモーター配列の上流または下流である調節領域に結合することができる。ＲＯＳ抑制調節領域は、単一の遺伝子配列または複数の遺伝子配列に機能的に連結され得る。例えば、ＲＯＳの存在下では、転写因子、例えば、ＰｅｒＲは、ＲＯＳを感知し、対応するＲＯＳ抑制調節領域に結合し、それによって機能的に連結されている単一の遺伝子配列または複数の遺伝子配列の発現をブロックする。このように、ＲＯＳは、遺伝子または遺伝子カセットの発現を抑制する。
本明細書で使用される場合、「ＲＯＳ応答性調節領域」とは、ＲＯＳ誘導性調節領域、ＲＯＳ抑制調節領域、及び／またはＲＯＳ抑制解除調節領域を指す。いくつかの実施形態では、ＲＯＳ応答性調節領域は、プロモーター配列を含む。調節領域のそれぞれは、少なくとも１つの対応するＲＯＳ感知転写因子に結合することができる。ＲＯＳを感知する転写因子及びそれらの対応するＲＯＳ応答性遺伝子、プロモーター、及び／または調節領域の例としては、表８に示すものが挙げられるが、これらに限定されない。
Figure 2023511282000008
いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、少なくとも１つの活性酸素種を感知することができる転写因子によって直接的または間接的に制御される調整可能な調節領域を含む。調整可能な調節領域は、シュウ酸塩異化酵素の発現を直接的または間接的に誘導し、したがってＲＯＳレベルに相関してシュウ酸塩異化酵素（複数可）の発現を制御することができる遺伝子または遺伝子カセットに機能的に連結される。例えば、調整可能な調節領域は、ＲＯＳ誘導性調節領域であり、分子は、シュウ酸塩異化酵素であり、ＲＯＳが存在する場合、例えば炎症組織において、ＲＯＳ感知転写因子は、調節領域に結合し、及び／または調節領域を活性化し、かつ１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）及び／またはシュウ酸塩輸送体（複数可）の遺伝子配列及び／または遺伝子カセット配列の発現を誘導し、それによってシュウ酸塩異化酵素（複数可）及び／またはシュウ酸塩輸送体（複数可）を産生する。その後、炎症が緩和されると、ＲＯＳレベルが低下し、シュウ酸塩異化酵素（複数可）及び／またはシュウ酸塩輸送体（複数可）の産生は減少するか、または排除される。
いくつかの実施形態では、調整可能な調節領域は、ＲＯＳ誘導性調節領域であり、ＲＯＳの存在下では、転写因子はＲＯＳを感知して、ＲＯＳ誘導性調節領域を活性化し、それによって機能的に連結されている遺伝子または遺伝子カセットの発現を誘導する。いくつかの実施形態では、転写因子は、ＲＯＳを感知し、それに続いてＲＯＳ誘導性調節領域に結合し、それによって下流遺伝子発現を活性化する。代替の実施形態では、転写因子は、ＲＯＳの不在下ではＲＯＳ誘導性調節領域に結合し、転写因子がＲＯＳを感知する場合、コンフォメーション変化を起こし、それによって下流遺伝子発現を誘導する。
いくつかの実施形態では、調整可能な調節領域は、ＲＯＳ誘導性調節領域であり、ＲＯＳを感知する転写因子は、ＯｘｙＲである。ＯｘｙＲは、「過酸化物ストレス応答のグローバル調節因子として主に機能し」、かつ多数の遺伝子、例えば、「Ｈ２Ｏ２解毒化（ｋａｔＥ、ａｈｐＣＦ）、ヘム生合成（ｈｅｍＨ）、還元体供給（ｇｒｘＡ、ｇｏｒ、ｔｒｘＣ）、チオール－二硫化物異性化（ｄｓｂＧ）、Ｆｅ－Ｓ中心修復（ｓｕｆＡ－Ｅ、ｓｕｆＳ）、鉄結合（ｙａａＡ）、鉄取り込み系の抑制（ｆｕｒ）に関与する遺伝子」、及び「ＯｘｙＳ、小型の調節ＲＮＡ」を調節することができる（Ｄｕｂｂｓ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。遺伝子組換えされた細菌は、ＯｘｙＲによって活性化される遺伝子に由来する任意の好適なＲＯＳ応答性調節領域を含み得る。ＯｘｙＲによって活性化され得る遺伝子は、当技術分野において既知である（例えば、Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｄｕｂｂｓ ｅｔ ａｌ．，２０１２；表１を参照されたい）。特定の実施形態では、本発明の遺伝子組換えされた細菌は、遺伝子及び／または遺伝子カセット、例えば、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）及び／またはシュウ酸塩輸送体遺伝子に機能的に連結された、ｏｘｙＳ由来のＲＯＳ誘導性調節領域を含む。ＲＯＳ、例えば、Ｈ２Ｏ２の存在下では、ＯｘｙＲ転写因子は、ＲＯＳを感知して、ｏｘｙＳ調節領域を活性化し、それによって機能的に連結されているシュウ酸塩異化酵素及び／またはシュウ酸塩輸送体の遺伝子及び／または遺伝子カセットの発現を誘導して、シュウ酸塩異化酵素（複数可）及び／またはシュウ酸塩輸送体（複数可）を産生する。いくつかの実施形態では、ＯｘｙＲは、Ｅ．ｃｏｌｉ ｏｘｙＲ遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態では、ｏｘｙＳ調節領域は、Ｅ．ｃｏｌｉ ｏｘｙＳ調節領域である。いくつかの実施形態では、ＲＯＳ誘導性調節領域は、ｋａｔＧ、ｄｐｓ、及びａｈｐＣの調節領域から選択される。
代替の実施形態では、調整可能な調節領域は、ＲＯＳ誘導性調節領域であり、ＲＯＳを感知する対応する転写因子は、ＳｏｘＲである。ＳｏｘＲが「その［２Ｆｅ－２Ｓ］ クラスターの酸化によって活性化される場合、ＳｏｘＳの合成が増加し、それによってその標的遺伝子発現が活性化される」（Ｋｏｏ ｅｔ ａｌ．，２００３）。ＳｏｘＲは、超酸化物及び一酸化窒素に主に反応することが知られており（Ｋｏｏ ｅｔ ａｌ．，２００３）、かつＨ２Ｏ２にも反応することができる。本発明の遺伝子組換えされた細菌は、ＳｏｘＲによって活性化される遺伝子に由来する任意の好適なＲＯＳ応答性調節領域を含み得る。ＳｏｘＲによって活性化され得る遺伝子は、当技術分野において既知である（例えば、Ｋｏｏ ｅｔ ａｌ．，２００３；表１を参照されたい）。特定の実施形態では、本発明の遺伝子組換えされた細菌は、遺伝子及び／または遺伝子カセット、例えば、シュウ酸塩異化酵素に機能的に連結された、ｓｏｘＳ由来のＲＯＳ誘導性調節領域を含む。ＲＯＳ存在下では、ＳｏｘＲ転写因子は、ＲＯＳを感知して、ｓｏｘＳ調節領域を活性化し、それによって機能的に連結されているシュウ酸塩異化酵素及び／またはシュウ酸塩輸送体の遺伝子または遺伝子カセットの発現を誘導して、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）及び／またはシュウ酸塩輸送体（複数可）を産生する。
いくつかの実施形態では、調整可能な調節領域は、ＲＯＳ抑制解除調節領域であり、対応する転写因子の結合により、下流遺伝子発現が抑制され、またＲＯＳの存在下では転写因子は調節領域にそれ以上結合せず、それによって機能的に連結されている遺伝子または遺伝子カセットを抑制解除する。
いくつかの実施形態では、調整可能な調節領域は、ＲＯＳ抑制解除調節領域であり、ＲＯＳを感知する転写因子は、ＯｈｒＲである。ＯｈｒＲは「ｏｈｒＡプロモーター部位と重複する逆方向反復ＤＮＡ配列のペアと結合し、それによって転写イベントを抑制する」が、酸化したＯｈｒＲは、「そのＤＮＡ標的に結合することができない」（Ｄｕａｒｔｅ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。ＯｈｒＲは、「有機過酸化物及びＮａＯＣｌの両方を感知する転写抑制因子であり」（Ｄｕｂｂｓ ｅｔ ａｌ．，２０１２）、かつ「Ｈ２Ｏ２による活性は弱いが、有機ヒドロペルオキシドに対しては、はるかに高い反応性を示す（Ｄｕａｒｔｅ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。本発明の遺伝子組換えされた細菌は、ＯｈｒＲによって抑制される遺伝子に由来する任意の好適なＲＯＳ応答性調節領域を含み得る。ＯｈｒＲによって抑制され得る遺伝子は、当技術分野において既知である（例えば、Ｄｕｂｂｓ ｅｔ ａｌ．，２０１２；表１を参照されたい）。特定の実施形態では、本発明の遺伝子組換えされた細菌は、遺伝子または遺伝子カセット、例えば、シュウ酸塩異化酵素及び／またはシュウ酸塩輸送体遺伝子に機能的に連結された、ｏｈｒＡ由来のＲＯＳ抑制解除調節領域を含む。ＲＯＳ、例えば、ＮａＯＣｌの存在下では、ＯｈｒＲ転写因子はＲＯＳを感知し、ｏｈｒＡ調節領域にはそれ以上結合せず、それによって機能的に連結されているシュウ酸塩異化酵素及び／またはシュウ酸塩輸送体遺伝子を抑制解除して、シュウ酸塩異化酵素及び／またはシュウ酸塩輸送体を産生する。
ＯｈｒＲは、ＲＯＳ応答性調節因子のＭａｒＲファミリーのメンバーである。「ＭａｒＲファミリーのほとんどのメンバーが転写抑制因子であり、ＲＮＡポリメラーゼ結合の立体障害を引き起こすプロモーターの－１０または－３５領域に結合することが多い」（Ｂｕｓｓｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。このファミリーの他のメンバーは、当技術分野において既知であり、ＯｓｐＲ、ＭｇｒＡ、ＲｏｓＲ、及びＳａｒＺが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＲＯＳを感知する転写因子はＯｓｐＲ、ＭｇＲＡ、ＲｏｓＲ、及び／またはＳａｒＺであり、本発明の遺伝子組換えされた細菌は、ＯｓｐＲ、ＭｇＲＡ、ＲｏｓＲ、及び／またはＳａｒＺによって抑制される遺伝子由来の１つ以上の対応する調節領域配列を含む。ＯｓｐＲ、ＭｇＲＡ、ＲｏｓＲ、及び／またはＳａｒＺによって抑制され得る遺伝子は、当技術分野において既知である（例えば、Ｄｕｂｂｓ ｅｔ ａｌ．，２０１２を参照されたい）。
いくつかの実施形態では、調整可能な調節領域は、ＲＯＳ抑制解除調節領域であり、ＲＯＳを感知する対応する転写因子は、ＲｏｓＲである。ＲｏｓＲは、「コンセンサス配列ＴＴＧＴＴＧＡＹＲＹＲＴＣＡＡＣＷＡ（配列番号６４）を伴う１８－ｂｐ逆方向反復配列」に結合する「ＭａｒＲ型転写調節因子」であり、「酸化剤Ｈ２Ｏ２によって可逆的に阻害される」（Ｂｕｓｓｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。ＲｏｓＲは、限定はされないが、「推定ポリイソプレノイド結合タンパク質（ｃｇ１３２２、ｒｏｓＲ由来の上流及び分岐遺伝子）、感覚ヒスチジンキナーゼ（ｃｇｔＳ９）、Ｃｒｐ／ＦＮＲファミリーの推定転写調節因子（ｃｇ３２９１）、グルタチオンＳ転移酵素ファミリーのタンパク質（ｃｇ１４２６）、２つの推定ＦＭＮ還元酵素（ｃｇ１１５０及びｃｇ１８５０）、ならびに４つの推定一酸素添加酵素（ｃｇ０８２３、ｃｇ１８４８、ｃｇ２３２９、及びｃｇ３０８４）」を含む、多数の遺伝子及び推定遺伝子を抑制することができる（Ｂｕｓｓｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。本発明の遺伝子組換えされた細菌は、ＲｏｓＲによって抑制される遺伝子に由来する任意の好適なＲＯＳ応答性調節領域を含み得る。ＲｏｓＲによって抑制され得る遺伝子は、当技術分野において既知である（例えば、Ｂｕｓｓｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０；表１を参照されたい）。特定の実施形態では、本発明の遺伝子組換えされた細菌は、遺伝子または遺伝子カセット、例えば、酵素及び／またはシュウ酸塩輸送体に機能的に連結された、ｃｇｔＳ９由来のＲＯＳ抑制解除調節領域を含む。ＲＯＳ、例えば、Ｈ２Ｏ２の存在下では、ＲｏｓＲ転写因子はＲＯＳを感知し、ｃｇｔＳ９調節領域にはそれ以上結合せず、それによって機能的に連結されているシュウ酸塩異化酵素及び／またはシュウ酸塩輸送体遺伝子を抑制解除して、シュウ酸塩異化酵素及び／またはシュウ酸塩輸送体を産生する。
いくつかの実施形態では、細菌においてかなりの数の天然遺伝子の発現を調節しないＲＯＳ感知転写因子を遺伝子組換えされた細菌が発現することが有利である。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子組換えされた細菌は、細菌の異なる種、菌株、または亜系に由来するＲＯＳ感知転写因子を発現するが、この際、この転写因子は、本発明の遺伝子組換えされた細菌において調節配列に結合しない。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子組換えされた細菌は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉであり、ＲＯＳ感知転写因子は、例えば、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ由来のＲｏｓＲであり、ここで、このＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉは、上記ＲｏｓＲに対する結合部位を含まない。いくつかの実施形態では、異種転写因子は、遺伝子組換えされた細菌における内因性調節領域及び遺伝子に対するオフターゲット効果を最小化または排除する。
いくつかの実施形態では、調整可能な調節領域は、ＲＯＳ抑制調節領域であり、対応する転写因子の結合により、下流遺伝子発現が抑制され、またＲＯＳの存在下では転写因子はＲＯＳを感知して、ＲＯＳ抑制調節領域に結合し、それによって機能的に連結されている遺伝子または遺伝子カセットの発現を抑制する。いくつかの実施形態では、ＲＯＳ感知転写因子は、プロモーター配列の一部と重複する調節領域に結合することができる。代替の実施形態では、ＲＯＳ感知転写因子は、プロモーター配列の上流または下流である調節領域に結合することができる。
いくつかの実施形態では、調整可能な調節領域は、ＲＯＳ抑制調節領域であり、ＲＯＳを感知する転写因子は、ＰｅｒＲである。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓでは、ＰｅｒＲは、「ＤＮＡに結合すると、酸化的ストレス応答（ｋａｔＡ、ａｈｐＣ、及びｍｒｇＡ）、金属恒常性（ｈｅｍＡＸＣＤＢＬ、ｆｕｒ、及びｚｏａＡ）、及びそれ自体の合成（ｐｅｒＲ）に関与するタンパク質をコードする遺伝子を抑制する」（Ｍａｒｉｎｈｏ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＰｅｒＲは、「Ｈ２Ｏ２に主に応答するグローバル調節因子」であり（Ｄｕｂｂｓ ｅｔ ａｌ．，２０１２）、「ｐｅｒボックス、ＰｅｒＲ制御遺伝子のプロモーター配列内及びその近くに存在する特定の反復性コンセンサス配列（ＴＴＡＴＡＡＴＮＡＴＴＡＴＡＡ（配列番号６５））でＤＮＡと相互作用する」（Ｍａｒｉｎｈｏ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＰｅｒＲは、「プロモーターの一部と重複するか、またはプロモーターからのすぐ下流にある」調節領域に結合することができる（Ｄｕｂｂｓ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。本発明の遺伝子組換えされた細菌は、ＰｅｒＲによって抑制される遺伝子に由来する任意の好適なＲＯＳ応答性調節領域を含み得る。ＰｅｒＲによって抑制され得る遺伝子は、当技術分野において既知である（例えば、Ｄｕｂｂｓ ｅｔ ａｌ．，２０１２；表１を参照されたい）。
これらの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、シュウ酸塩異化酵素を発現するために使用される２種の抑制因子の活性化調節回路を含む場合がある。２種の抑制因子の活性化調節回路は、第１ＲＯＳ感知抑制因子、例えば、ＰｅｒＲ、及び第２抑制因子、例えば、ＴｅｔＲを含み、これは、遺伝子または遺伝子カセット、例えば、シュウ酸塩異化酵素に機能的に連結される。これらの実施形態の一態様では、ＲＯＳ感知抑制因子は、第２抑制因子の転写を阻害し、これにより、遺伝子または遺伝子カセットの転写が阻害される。これらの実施形態において有用な第２抑制因子の例としては、ＴｅｔＲ、Ｃ１、及びＬｅｘＡが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＲＯＳ感知抑制因子は、ＰｅｒＲである。いくつかの実施形態では、第２抑制因子は、ＴｅｔＲである。本実施形態では、ＰｅｒＲ抑制調節領域は、ＴｅｔＲの発現を誘導し、ＴｅｔＲ抑制調節領域は、遺伝子または遺伝子カセット、例えば、シュウ酸塩異化酵素の発現を誘導する。ＰｅｒＲ結合が存在しない場合（これはＲＯＳの不在下で発生する）、ｔｅｔＲが転写されて、ＴｅｔＲが遺伝子または遺伝子カセット、例えば、シュウ酸塩異化酵素の発現を抑制する。ＰｅｒＲ結合が存在する場合（これはＲＯＳの存在下で発生する）、ｔｅｔＲ発現は抑制され、遺伝子または遺伝子カセット、例えば、シュウ酸塩異化酵素及び／またはシュウ酸塩輸送体が発現される。
ＲＯＳ応答性転写因子は、遺伝子組換えされた細菌で用いられる調節領域配列に応じて遺伝子発現を誘導、抑制解除、または抑制することができる。例えば、「ＯｘｙＲは主に酸化条件下での転写活性化因子と考えられているが、ＯｘｙＲは、酸化条件及び還元条件の両方で抑制因子または活性化因子として機能することができ」（（Ｄｕｂｂｓ ｅｔ ａｌ．，２０１２）、ＯｘｙＲは、「それ自体の発現の抑制因子であること、ならびにｆｈｕＦ（第二鉄イオン還元酵素をコードする）及びｆｌｕ（抗原４３外膜タンパク質をコードする）のものであることが明らかとなっている」（Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００１）。本発明の遺伝子組換えされた細菌は、ＯｘｙＲによって抑制される遺伝子に由来する任意の好適なＲＯＳ応答性調節領域を含み得る。いくつかの実施形態では、ＯｘｙＲは、前述の通り２種の抑制因子活性化調節回路で使用される。ＯｘｙＲによって抑制され得る遺伝子は、当技術分野において既知である（例えば、Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００１；表１を参照されたい）。あるいは、例えば、ＲｏｓＲは、いくつかの遺伝子を抑制することができるが、特定の遺伝子、例えば、ｎａｒＫＧＨＪＩオペロンを活性化することもできる。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、ＲｏｓＲによって活性化される遺伝子に由来する任意の好適なＲＯＳ応答性調節領域を含み得る。加えて、「ＰｅｒＲ媒介型陽性調節もまたこれまでに観察されており、ＰｅｒＲが離れた上流部位へ結合することが関与しているようである」（Ｄｕｂｂｓ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、ＰｅｒＲによって活性化される遺伝子に由来する任意の好適なＲＯＳ応答性調節領域を含む。
ＲＯＳ感知転写因子のうち１つ以上のタイプ及び対応する調節領域配列は、遺伝子組換えされた細菌で存在し得る。例えば、「ＯｈｒＲは、グラム陽性菌及びグラム陰性菌の両方で見られ、ＯｘｙＲもしくはＰｅｒＲまたはその両方と共存することができる」（Ｄｕｂｂｓ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、ＲＯＳ感知転写因子の１つのタイプ、例えば、ＯｘｙＲ、及び例えば、ｏｘｙＳ由来の１つの対応する調節領域配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、ＲＯＳ感知転写因子の１つのタイプ、例えば、ＯｘｙＲ、及び例えば、ｏｘｙＳ及びｋａｔＧ由来の２つ以上の異なる対応する調節領域配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、ＲＯＳ感知転写因子の２つ以上のタイプ、例えば、ＯｘｙＲ及びＰｅｒＲ、ならびに例えば、ｏｘｙＳ及びｋａｔＡ由来のそれぞれ、２つ以上の対応する調節領域配列を含む。１つのＲＯＳ応答性調節領域は、２つ以上の転写因子に結合することができる場合がある。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、ＲＯＳ感知転写因子の２つ以上のタイプ、及び１つの対応する調節領域配列を含む。
いくつかの例示的なＯｘｙＲ調節型調節領域の核酸配列を表５に示す。下線及び太字のものはＯｘｙＲ結合部位である。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、配列番号４６、４７、４８、または４９、あるいはその機能的フラグメントのＤＮＡ配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも９５％、または少なくとも約約９９％相同である核酸配列を含む。
Figure 2023511282000009
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子組換えされた細菌は、ＲＯＳ感知転写因子をコードする遺伝子、例えば、ｏｘｙＲ遺伝子を含み、これは、その天然プロモーター、誘導性プロモーター、天然プロモーターよりも強力なプロモーター、例えば、ＧｌｎＲＳプロモーターもしくはＰ（Ｂｌａ）プロモーター、または構成的プロモーターによって制御される遺伝子である。場合によっては、発現の安定性を強化するために、誘導性プロモーターの制御下でＲＯＳ感知転写因子を発現させることは有利である場合がある。いくつかの実施形態では、ＲＯＳ感知転写因子の発現は、治療用分子の発現を制御するプロモーターとは異なるプロモーターによって制御される。いくつかの実施形態では、ＲＯＳ感知転写因子の発現は、治療用分子の発現を制御する同じプロモーターによって制御される。いくつかの実施形態では、ＲＯＳ感知転写因子及び治療用分子は、プロモーター領域から分岐して転写される。
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子組換えされた細菌は、細菌の異なる種、菌株、または亜系に由来するＲＯＳ感知転写因子の遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、細菌の異なる種、菌株、または亜系に由来するＲＯＳ応答性調節領域を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、ＲＯＳ感知転写因子、及び細菌の異なる種、菌株、または亜系に由来する対応するＲＯＳ応答性調節領域を含む。異種ＲＯＳ感知転写因子及び調節領域は、同じ条件下での同じ亜型の細菌に由来する天然転写因子及び調節領域よりも、ＲＯＳの存在下で上記調節領域に機能的に連結されている遺伝子の転写を増加させることができる。
いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、ＲＯＳ感知転写因子、ＯｘｙＲ、及びＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来の対応する調節領域、ｏｘｙＳを含む。いくつかの実施形態では、天然ＲＯＳ感知転写因子、例えば、ＯｘｙＲは、無傷のまま野生型活性を維持している。代替の実施形態では、天然ＲＯＳ感知転写因子、例えば、ＯｘｙＲは、野生型活性を低減または排除するように欠失または突然変異される。
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子組換えされた細菌は、ＲＯＳ感知転写因子をコードする内因性遺伝子、例えば、ｏｘｙＲ遺伝子の複数のコピーを含む。いくつかの実施形態では、ＲＯＳ感知転写因子をコードする遺伝子は、プラスミド上に存在する。いくつかの実施形態では、ＲＯＳ感知転写因子をコードする遺伝子、及び治療用分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、異なるプラスミド上に存在する。いくつかの実施形態では、ＲＯＳ感知転写因子をコードする遺伝子、及び治療用分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、同じプラスミド上に存在する。いくつかの実施形態では、ＲＯＳ感知転写因子をコードする遺伝子は、染色体上に存在する。いくつかの実施形態では、ＲＯＳ感知転写因子をコードする遺伝子、及び治療用分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、異なる染色体上に存在する。いくつかの実施形態では、ＲＯＳ感知転写因子をコードする遺伝子、及び治療用分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、同じ染色体上に存在する。
いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、ＲＯＳ感知転写因子をコードする野生型遺伝子、例えば、ｓｏｘＲ遺伝子、及び同じ亜型の細菌由来の野生型調節領域と比較して突然変異された対応する調節領域、例えば、ｓｏｘＳ調節領域を含む。突然変異された調節領域は、同じ条件下での野生型調節領域よりも、ＲＯＳの存在下でシュウ酸塩異化酵素及び／またはシュウ酸塩輸送体の発現を増加させる。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、野生型ＲＯＳ応答性調節領域、例えば、ｏｘｙＳ調節領域、及び同じ亜型の細菌由来の野生型転写因子と比較して突然変異された対応する転写因子、例えば、ＯｘｙＲを含む。突然変異転写因子は、同じ条件下での野生型転写因子よりも、ＲＯＳの存在下でシュウ酸塩異化酵素及び／またはシュウ酸塩輸送体の発現を増加させる。いくつかの実施形態では、ＲＯＳ感知転写因子及び対応する調節領域の両方は、ＲＯＳの存在下でシュウ酸塩異化酵素（複数可）の発現を増加させるために、同じ亜型の細菌由来の野生型配列と比較して突然変異される。
いくつかの実施形態では、シュウ酸塩異化酵素（複数可）を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、プラスミド上に存在し、ＲＯＳによって誘導されるプロモーターに操作可能に連結される。いくつかの実施形態では、シュウ酸塩異化酵素（複数可）を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、染色体内に存在し、ＲＯＳによって誘導されるプロモーターに操作可能に連結される。いくつかの実施形態では、シュウ酸塩異化酵素（複数可）を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、染色体上に存在し、テトラサイクリンに曝されることで誘導されるプロモーターに操作可能に連結される。いくつかの実施形態では、シュウ酸塩異化酵素及び／またはシュウ酸塩輸送体を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、プラスミド上に存在し、テトラサイクリンに曝されることで誘導されるプロモーターに操作可能に連結される。いくつかの実施形態では、発現は、当技術分野において知られている方法によって、例えば、リボソーム結合部位を最適化することによって、転写調節因子を操作することによって、及び／またはｍＲＮＡ安定性を強化することによってさらに最適化される。
いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、シュウ酸塩異化酵素（複数可）及び／またはシュウ酸塩輸送体（複数可）を産生することができる遺伝子（複数可）の複数のコピーを含み得る。いくつかの実施形態では、シュウ酸塩異化酵素（複数可）及び／またはシュウ酸塩輸送体（複数可）を産生することができる遺伝子（複数可）は、プラスミド上に存在し、ＲＯＳ応答性調節領域に機能的に連結される。いくつかの実施形態では、シュウ酸塩異化酵素及び／またはシュウ酸塩輸送体を産生することができる遺伝子（複数可）は、染色体内に存在し、ＲＯＳ応答性調節領域に機能的に連結される。
したがって、いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌または遺伝子組換えされたウイルスは、酸素レベル依存性プロモーター、活性酸素種（ＲＯＳ）依存性プロモーター、または活性窒素種（ＲＮＳ）依存性プロモーター、ならびに対応する転写因子の制御下で１つ以上のシュウ酸塩異化酵素を産生する。
いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、シュウ酸塩異化酵素及び／またはシュウ酸塩輸送体が宿主細胞で発現でき、かつこの宿主細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏで、例えば、培地で、及び／またはｉｎ ｖｉｖｏで、生存及び／または増殖することができるように、シュウ酸塩異化酵素及び／またはシュウ酸塩輸送体を産生するための遺伝子を有する安定に維持されたプラスミドまたは染色体を含む。いくつかの実施形態では、細菌は、細１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）及び／またはシュウ酸塩輸送体（複数可）をコードする遺伝子及び／または遺伝子カセットの複数のコピーを含み得る。いくつかの実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）及び／またはシュウ酸塩輸送体（複数可）をコードする遺伝子及び／または遺伝子カセットは、低コピープラスミド上で発現される。いくつかの実施形態では、低コピープラスミドは、発現の安定性を高めるのに有用である場合がある。いくつかの実施形態では、低コピープラスミドは、非誘導条件下での漏出性発現を減少させるのに有用である場合がある。いくつかの実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）及び／またはシュウ酸塩輸送体（複数可）をコードする遺伝子及び／または遺伝子カセットは、高コピープラスミド上で発現される。いくつかの実施形態では、高コピープラスミドは、シュウ酸塩異化酵素（複数可）及び／またはシュウ酸塩輸送体（複数可）の発現を増加させるのに有用である場合がある。いくつかの実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）及び／またはシュウ酸塩輸送体（複数可）をコードする遺伝子及び／または遺伝子カセットは、染色体上で発現される。
いくつかの実施形態では、細菌は、複数の作用機序（ＭＯＡ）、例えば、同じ生成物の複数のコピーを生成する（例えば、コピー数を増やす）回路、または複数の異なる機能を実施する回路を含むように遺伝子組換えされる。例えば、遺伝子組換えされた細菌は、４つの異なる挿入部位に挿入される１つ以上の特定のシュウ酸塩異化酵素（複数可）及び／またはシュウ酸塩輸送体（複数可）をコードする遺伝子及び／または遺伝子カセットの４つのコピーを含み得る。あるいは、遺伝子組換えされた細菌は、３つの異なる挿入部位に挿入される特定のシュウ酸塩異化酵素及び／またはシュウ酸塩輸送体をコードする遺伝子の３つのコピー、及び３つの異なる挿入部位に挿入される異なるシュウ酸塩異化酵素及び／またはシュウ酸塩輸送体をコードする遺伝子の３つのコピーを含み得る。
いくつかの実施形態では、シュウ酸塩異化酵素（複数可）及び／またはシュウ酸塩輸送体が発現している条件下で、本開示の遺伝子組換えされた細菌は、同じ条件下での同じ亜型の未修飾細菌よりも、オペロンにおいて、シュウ酸塩異化酵素（複数可）、シュウ酸塩輸送体（複数可）及び／または遺伝子（複数可）の転写を、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約６００倍、少なくとも約７００倍、少なくとも約８００倍、少なくとも約９００倍、少なくとも約１，０００倍、または少なくとも約１，５００倍多く生成する。
いくつかの実施形態では、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を使用して、シュウ酸塩異化酵素（複数可）及び／またはシュウ酸塩輸送体（複数可）遺伝子（複数可）のｍＲＮＡ発現レベルを、増幅、検出、及び／または定量化する。当該技術分野で既知の方法に従ってシュウ酸塩異化酵素及び／またはシュウ酸塩輸送体遺伝子（複数可）に特異的なプライマーを設計してそれを使用し、サンプル内のｍＲＮＡを検出することができる。いくつかの実施形態では、蛍光体をシュウ酸塩異化酵素ｍＲＮＡを含有し得るサンプル反応混合物に加えて、サーマルサイクラーを使用して、サンプル反応混合物を特定の波長の光で照射し、蛍光体によるその後の放射を検出する。反応混合物を、所定の時間で、所定の温度まで、加熱及び冷却する。特定の実施形態では、加熱及び冷却は、所定の回数のサイクルで繰り返される。いくつかの実施形態では、反応混合物を所定の回数のサイクルで９０～１００℃、６０～７０℃、及び３０～５０℃に加熱及び冷却する。特定の実施形態では、反応混合物を所定の回数のサイクルで９３～９７℃、５５～６５℃、及び３５～４５℃に加熱及び冷却する。いくつかの実施形態では、蓄積しているアンプリコンを、ｑＰＣＲの各サイクル後に定量化する。蛍光が閾値を超えるサイクル数が、閾値サイクル（ＣＴ）である。サンプルごとに少なくとも１つのＣＴ結果を生成し、そのＣＴ結果（複数可）を使用して、シュウ酸塩異化酵素及び／またはシュウ酸塩輸送体遺伝子（複数可）のｍＲＮＡ発現レベルを測定することができる。
いくつかの実施形態では、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を使用して、シュウ酸塩異化酵素（複数可）及び／またはシュウ酸塩輸送体遺伝子（複数可）のｍＲＮＡ発現レベルを、増幅、検出、及び／または定量化する。当該技術分野で既知の方法に従ってシュウ酸塩異化酵素及び／またはシュウ酸塩輸送体遺伝子（複数可）に特異的なプライマーを設計してそれを使用し、サンプル内のｍＲＮＡを検出することができる。いくつかの実施形態では、蛍光体をシュウ酸塩異化酵素及び／またはシュウ酸塩輸送体ｍＲＮＡを含有し得るサンプル反応混合物に加えて、サーマルサイクラーを使用して、サンプル反応混合物を特定の波長の光で照射し、蛍光体によるその後の放射を検出する。反応混合物を、所定の時間で、所定の温度まで、加熱及び冷却する。特定の実施形態では、加熱及び冷却は、所定の回数のサイクルで繰り返される。いくつかの実施形態では、反応混合物を所定の回数のサイクルで９０～１００℃、６０～７０℃、及び３０～５０℃に加熱及び冷却する。特定の実施形態では、反応混合物を所定の回数のサイクルで９３～９７℃、５５～６５℃、及び３５～４５℃に加熱及び冷却する。いくつかの実施形態では、蓄積しているアンプリコンを、ｑＰＣＲの各サイクル後に定量化する。蛍光が閾値を超えるサイクル数が、閾値サイクル（ＣＴ）である。サンプルごとに少なくとも１つのＣＴ結果を生成し、そのＣＴ結果（複数可）を使用して、シュウ酸塩異化酵素及び／またはシュウ酸塩輸送体遺伝子（複数可）のｍＲＮＡ発現レベルを測定することができる。
その他の実施形態では、誘導性プロモーターは、プロピオン酸塩応答性プロモーターである。例えば、ｐｒｐＲプロモーターは、プロピオン酸塩応答性プロモーターである。一実施形態では、プロピオン酸塩応答性プロモーターは、配列番号５８を含む。
必須遺伝子及び栄養要求体
本明細書で使用される場合、用語「必須遺伝子」とは、細胞増殖及び／または生存に必要な遺伝子を指す。細菌の必須遺伝子は、当業者に良く知られており、遺伝子の欠失の導入及び／または無作為突然変異誘発及びスクリーニングによって同定され得る（例えば、Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｌｉｎ，２００９，ＤＥＧ ５．０，ａ ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｂｏｔｈ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ ａｎｄ ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３７：Ｄ４５５－Ｄ４５８、及びＧｅｒｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｇｅｎｅｓ ｏｎ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｍａｐｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１７（５）：４４８－４５６を参照されたく、またそのそれぞれの内容の全ては、参照により本明細書に明示的に組み込まれる）。
「必須遺伝子」は、生物が生息する状況及び環境に依存する場合がある。例えば、必須遺伝子の突然変異、修飾、または除去により、本開示の組換え細菌が栄養要求体となる可能性がある。栄養要求性修飾は、細菌がその必須栄養素を生成するのに必要な遺伝子（複数可）を欠いていることが理由で生存または増殖に必須の外因的に添加された栄養素がない場合に、細菌を死滅させることを目的とするものである。
栄養要求性修飾は、細菌がその必須栄養素を生成するのに必要な遺伝子（複数可）を欠いていることが理由で生存または増殖に必須の外因的に添加された栄養素がない場合に、細菌を死滅させることを目的とするものである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子組換えされた細菌のいずれかはまた、細胞生存及び／または増殖に必要な１つ以上の遺伝子（複数可）の欠失または突然変異を含んでいる。
いくつかの実施形態では、細菌細胞は、シュウ酸塩生合成遺伝子をコードする１つ以上の内因性遺伝子（複数可）に遺伝子突然変異を含み、ここで、この遺伝子突然変異により、細菌細胞におけるシュウ酸塩の生合成が減少する。
一実施形態では、必須遺伝子は、オリゴヌクレオチド合成遺伝子、例えばｔｈｙＡである。別の実施形態では、必須遺伝子は、細胞壁合成遺伝子、例えばｄａｐＡである。さらに別の実施形態では、必須遺伝子は、アミノ酸遺伝子、例えばｓｅｒＡまたはＭｅｔＡである。対応する野生型遺伝子生成物が細菌内に産生されない限り、細胞生存及び／または増殖に必要な任意の遺伝子が対象とされてよく、そのような遺伝子には、ｃｙｓＥ、ｇｌｎＡ、ｉｌｖＤ、ｌｅｕＢ、ｌｙｓＡ、ｓｅｒＡ、ｍｅｔＡ、ｇｌｙＡ、ｈｉｓＢ、ｉｌｖＡ、ｐｈｅＡ、ｐｒｏＡ、ｔｈｒＣ、ｔｒｐＣ、ｔｙｒＡ、ｔｈｙＡ、ｕｒａＡ、ｄａｐＡ、ｄａｐＢ、ｄａｐＤ、ｄａｐＥ、ｄａｐＦ、ｆｌｈＤ、ｍｅｔＢ、ｍｅｔＣ、ｐｒｏＡＢ、及びｔｈｉ１が挙げられるが、これらに限定されない。
表１０の一覧は、栄養要求性株を産生するために、破壊または欠失されることがある例示的な細菌遺伝子を示している。これらには、オリゴヌクレオチド合成、アミノ酸合成、及び細胞壁合成に必要な遺伝子が含まれるがこれらに限定されない。
Figure 2023511282000010
表１１は、強制飼養実施から２４時間及び４８時間後に検出されたマウスの腸内の種々のアミノ酸栄養要求体の生存を示す。これらの栄養要求体は、Ｅ．ｃｏｌｉの非Ｎｉｓｓｌｅ株であるＢＷ２５１１３を使用して産生した。
Figure 2023511282000011
Figure 2023511282000012
例えば、チミンは、細菌細胞増殖に必要な核酸であり、それが存在しないと、細菌は細胞死を起こす。ｔｈｙＡ遺伝子は、ｄＵＭＰをｄＴＭＰに変換することによってチミン合成の最初のステップを触媒する酵素である、チミジル酸生成酵素をコードする（Ｓａｔ ｅｔ ａｌ．，２００３）。いくつかの実施形態では、本開示の細菌細胞は、ｔｈｙＡ栄養要求体であり、この際、ｔｈｙＡ遺伝子は、欠失されている、及び／または無関係の遺伝子と置き換えられている。ｔｈｙＡ栄養要求体は、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏにて増殖培地にチミンを添加することによって、またはｉｎ ｖｉｖｏにてヒトの腸内で自然に見られる高レベルのチミンの存在下で十分な量のチミンが存在する場合にのみ成長することができる。いくつかの実施形態では、本開示の細菌細胞は、細菌が哺乳動物の腸内に存在する際に補完されるという点で遺伝子的に栄養要求性である。十分な量のチミンなしでは、ｔｈｙＡ栄養要求体は死滅する。いくつかの実施形態では、栄養要求性修飾を用いて、栄養要求性遺伝子生成物の不在下（例えば、腸の外）では細菌細胞が確実に生存しないようにする。
ジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）は、リジン生合成経路内で合成されるアミノ酸であり、細菌細胞壁増殖に必要である（Ｍｅａｄｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９５９；Ｃｌａｒｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９７１）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子組換えされた細菌のいずれかは、ｄａｐＤ栄養要求体であり、この際、ｄａｐＤは、欠失されている、及び／または無関係の遺伝子と置き換えられている。ｄａｐＤ栄養要求体は、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏにて増殖培地にＤＡＰを添加することによって十分な量のＤＡＰが存在する場合にのみ成長することができる。十分な量のＤＡＰなしでは、ｄａｐＤ栄養要求体は死滅する。いくつかの実施形態では、栄養要求性修飾を用いて、栄養要求性遺伝子生成物の不在下（例えば、腸の外）では細菌細胞が確実に生存しないようにする。
その他の実施形態では、本開示の遺伝子組換えされた細菌は、ｕｒａＡ栄養要求体であり、この際、ｕｒａＡは、欠失されている、及び／または無関係の遺伝子と置き換えられている。ｕｒａＡ遺伝子は、ピリミジンウラシルの取り込み及びその後の代謝を促進する膜結合輸送体であるＵｒａＡをコードする（Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。ｕｒａＡ栄養要求体は、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏにて増殖培地にウラシルを添加することによって十分な量のウラシルが存在する場合にのみ成長することができる。十分な量のウラシルなしでは、ｕｒａＡ栄養要求体は死滅する。いくつかの実施形態では、栄養要求性修飾を用いて、栄養要求性遺伝子生成物の不在下（例えば、腸の外）では細菌が確実に生存しないようにする。
複雑な群集では、細菌がＤＮＡを共有する可能性がある。非常にまれな状況では、栄養要求性細菌株は、非栄養要求性株からＤＮＡを受け取ることがあり、これにより、ゲノム欠失が修復され、栄養要求体が恒久的に救済される。したがって、２つ以上の栄養要求体を有する細菌株を遺伝子改変することにより、栄養要求性を救済するのに十分な回数でＤＮＡ転移が発生する可能性を大幅に低減することができる。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、細胞生存及び／または増殖に必要な２つ以上の遺伝子の欠失または突然変異を含んでいる。
必須遺伝子のその他の例としては、ｙｈｂＶ、ｙａｇＧ、ｈｅｍＢ、ｓｅｃＤ、ｓｅｃＦ、ｒｉｂＤ、ｒｉｂＥ、ｔｈｉＬ、ｄｘｓ、ｉｓｐＡ、ｄｎａＸ、ａｄｋ、ｈｅｍＨ、ｌｐｘＨ、ｃｙｓＳ、ｆｏｌｄ、ｒｐｌＴ、ｉｎｆＣ、ｔｈｒＳ、ｎａｄＥ、ｇａｐＡ、ｙｅａＺ、ａｓｐＳ、ａｒｇＳ、ｐｇｓＡ、ｙｅｆＭ、ｍｅｔＧ、ｆｏｌＥ、ｙｅｊＭ、ｇｙｒＡ、ｎｒｄＡ、ｎｒｄＢ、ｆｏｌＣ、ａｃｃＤ、ｆａｂＢ、ｇｌｔＸ、ｌｉｇＡ、ｚｉｐＡ、ｄａｐＥ、ｄａｐＡ、ｄｅｒ、ｈｉｓＳ、ｉｓｐＧ、ｓｕｈＢ、ｔａｄＡ、ａｃｐＳ、ｅｒａ、ｒｎｃ、ｆｔｓＢ、ｅｎｏ、ｐｙｒＧ、ｃｈｐＲ、ｌｇｔ、ｆｂａＡ、ｐｇｋ、ｙｑｇＤ、ｍｅｔＫ、ｙｑｇＦ、ｐｌｓＣ、ｙｇｉＴ、ｐａｒｅ、ｒｉｂＢ、ｃｃａ、ｙｇｊＤ、ｔｄｃＦ、ｙｒａＬ、ｙｉｈＡ、ｆｔｓＮ、ｍｕｒＩ、ｍｕｒＢ、ｂｉｒＡ、ｓｅｃＥ、ｎｕｓＧ、ｒｐｌＪ、ｒｐｌＬ、ｒｐｏＢ、ｒｐｏＣ、ｕｂｉＡ、ｐｌｓＢ、ｌｅｘＡ、ｄｎａＢ、ｓｓｂ、ａｌｓＫ、ｇｒｏＳ、ｐｓｄ、ｏｒｎ、ｙｊｅＥ、ｒｐｓＲ、ｃｈｐＳ、ｐｐａ、ｖａｌＳ、ｙｊｇＰ、ｙｊｇＱ、ｄｎａＣ、ｒｉｂＦ、ｌｓｐＡ、ｉｓｐＨ、ｄａｐＢ、ｆｏｌＡ、ｉｍｐ、ｙａｂＱ、ｆｔｓＬ、ｆｔｓＩ、ｍｕｒＥ、ｍｕｒＦ、ｍｒａＹ、ｍｕｒＤ、ｆｔｓＷ、ｍｕｒＧ、ｍｕｒＣ、ｆｔｓＱ、ｆｔｓＡ、ｆｔｓＺ、ｌｐｘＣ、ｓｅｃＭ、ｓｅｃＡ、ｃａｎ、ｆｏｌＫ、ｈｅｍＬ、ｙａｄＲ、ｄａｐＤ、ｍａｐ、ｒｐｓＢ、ｉｎｆＢ ，ｎｕｓＡ、ｆｔｓＨ、ｏｂｇＥ、ｒｐｍＡ、ｒｐｌＵ、ｉｓｐＢ、ｍｕｒＡ、ｙｒｂＢ、ｙｒｂＫ、ｙｈｂＮ、ｒｐｓＩ、ｒｐｌＭ、ｄｅｇＳ、ｍｒｅＤ、ｍｒｅＣ、ｍｒｅＢ、ａｃｃＢ、ａｃｃＣ、ｙｒｄＣ、ｄｅｆ、ｆｍｔ、ｒｐｌＱ、ｒｐｏＡ、ｒｐｓＤ、ｒｐｓＫ、ｒｐｓＭ、ｅｎｔＤ、ｍｒｄＢ、ｍｒｄＡ、ｎａｄＤ、ｈｌｅｐＢ、ｒｐｏＥ、ｐｓｓＡ、ｙｆｉＯ、ｒｐｌＳ、ｔｒｍＤ、ｒｐｓＰ、ｆｆｈ、ｇｒｐＥ、ｙｆｊＢ、ｃｓｒＡ、ｉｓｐＦ、ｉｓｐＤ、ｒｐｌＷ、ｒｐｌＤ、ｒｐｌＣ、ｒｐｓＪ、ｆｕｓＡ、ｒｐｓＧ、ｒｐｓＬ、ｔｒｐＳ、ｙｒｆＦ、ａｓｄ、ｒｐｏＨ、ｆｔｓＸ、ｆｔｓＥ、ｆｔｓＹ、ｆｒｒ、ｄｘｒ、ｉｓｐＵ、ｒｆａＫ、ｋｄｔＡ、ｃｏａＤ、ｒｐｍＢ、ｄｆｐ、ｄｕｔ、ｇｍｋ、ｓｐｏｔ、ｇｙｒＢ、ｄｎａＮ、ｄｎａＡ、ｒｐｍＨ、ｒｎｐＡ、ｙｉｄＣ、ｔｎａＢ、ｇｌｍＳ、ｇｌｍＵ、ｗｚｙＥ、ｈｅｍＤ、ｈｅｍＣ、ｙｉｇＰ、ｕｂｉＢ、ｕｂｉＤ、ｈｅｍＧ、ｓｅｃＹ、ｒｐｌＯ、ｒｐｍＤ、ｒｐｓＥ、ｒｐｌＲ、ｒｐｌＦ、ｒｐｓＨ、ｒｐｓＮ、ｒｐｌＥ、ｒｐｌＸ、ｒｐｌＮ、ｒｐｓＱ、ｒｐｍＣ、ｒｐｌＰ、ｒｐｓＣ、ｒｐｌＶ、ｒｐｓＳ、ｒｐｌＢ、ｃｄｓＡ、ｙａｅＬ、ｙａｅＴ、ｌｐｘＤ、ｆａｂＺ、ｌｐｘＡ、ｌｐｘＢ、ｄｎａＥ、ａｃｃＡ、ｔｉｌＳ、ｐｒｏＳ、ｙａｆＦ、ｔｓｆ、ｐｙｒＨ、ｏｌＡ、ｒｌｐＢ、ｌｅｕＳ、ｌｎｔ、ｇｌｎＳ、ｆｌｄＡ、ｃｙｄＡ、ｉｎｆＡ、ｃｙｄＣ、ｆｔｓＫ、ｌｏｌＡ、ｓｅｒＳ、ｒｐｓＡ、ｍｓｂＡ、ｌｐｘＫ、ｋｄｓＢ、ｍｕｋＦ、ｍｕｋＥ、ｍｕｋＢ、ａｓｎＳ、ｆａｂＡ、ｍｖｉＮ、ｒｎｅ、ｙｃｅＱ、ｆａｂＤ、ｆａｂＧ、ａｃｐＰ、ｔｍｋ、ｈｏｌＢ、ｌｏｌＣ、ｌｏｌＤ、ｌｏｌＥ、ｐｕｒＢ、ｙｍｆＫ、ｍｉｎＥ、ｍｉｎｄ、ｐｔｈ、ｒｓＡ、ｉｓｐＥ、ｌｏｌＢ、ｈｅｍＡ、ｐｒｆＡ、ｐｒｍＣ、ｋｄｓＡ、ｔｏｐＡ、ｒｉｂＡ、ｆａｂＩ、ｒａｃＲ、ｄｉｃＡ、ｙｄｆＢ、ｔｙｒＳ、ｒｉｂＣ、ｙｄｉＬ、ｐｈｅＴ、ｐｈｅＳ、ｙｈｈＱ、ｂｃｓＢ、ｇｌｙＱ、ｙｉｂＪ、及びｇｐｓＡが挙げられるが、これらに限定されない。その他の必須遺伝子は、当業者に知られている。
いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子組換えされた細菌は、合成リガンド依存性必須遺伝子（ＳＬｉＤＥ）細菌細胞である。ＳＬｉＤＥ細菌細胞は、特定のリガンドの存在下でのみ成長する１つ以上の必須遺伝子に突然変異を有する合成栄養要求体である（Ｌｏｐｅｚ ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ “Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ａｕｘｏｔｒｏｐｈｓ ｗｉｔｈ Ｌｉｇａｎｄ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｇｅｎｅｓ ｆｏｒ ａ ＢＬ２１（ＤＥ３ Ｂｉｏｓａｆｅｔｙ Ｓｔｒａｉｎ，”ＡＣＳ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０１５）ＤＯＩ：１０．１０２１／ａｃｓｓｙｎｂｉｏ．５ｂ０００８５を参照されたく、またその全内容は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる）。
いくつかの実施形態では、ＳＬｉＤＥ細菌細胞は、必須遺伝子に突然変異を含む。いくつかの実施形態では、必須遺伝子は、ｐｈｅＳ、ｄｎａＮ、ｔｙｒＳ、ｍｅｔＧ、及びａｄｋからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、必須遺伝子は、Ｈ１９１Ｎ、Ｒ２４０Ｃ、Ｉ３１７Ｓ、Ｆ３１９Ｖ、Ｌ３４０Ｔ、Ｖ３４７Ｉ、及びＳ３４５Ｃの突然変異のうち１つ以上を含むｄｎａＮである。いくつかの実施形態では、必須遺伝子は、Ｈ１９１Ｎ、Ｒ２４０Ｃ、Ｉ３１７Ｓ、Ｆ３１９Ｖ、Ｌ３４０Ｔ、Ｖ３４７Ｉ、及びＳ３４５Ｃの突然変異を含むｄｎａＮである。いくつかの実施形態では、必須遺伝子は、Ｆ１２５Ｇ、Ｐ１８３Ｔ、Ｐ１８４Ａ、Ｒ１８６Ａ、及びＩ１８８Ｌの突然変異のうち１つ以上を含むｐｈｅＳである。いくつかの実施形態では、必須遺伝子は、Ｆ１２５Ｇ、Ｐ１８３Ｔ、Ｐ１８４Ａ、Ｒ１８６Ａ、及びＩ１８８Ｌの突然変異を含むｐｈｅＳである。いくつかの実施形態では、必須遺伝子は、Ｌ３６Ｖ、Ｃ３８Ａ、及びＦ４０Ｇの突然変異のうち１つ以上を含むｔｙｒＳである。いくつかの実施形態では、必須遺伝子は、Ｌ３６Ｖ、Ｃ３８Ａ、及びＦ４０Ｇの突然変異を含むｔｙｒＳである。いくつかの実施形態では、必須遺伝子は、Ｅ４５Ｑ、Ｎ４７Ｒ、Ｉ４９Ｇ、及びＡ５１Ｃの突然変異のうち１つ以上を含むｍｅｔＧである。いくつかの実施形態では、必須遺伝子は、Ｅ４５Ｑ、Ｎ４７Ｒ、Ｉ４９Ｇ、及びＡ５１Ｃの突然変異を含むｍｅｔＧである。いくつかの実施形態では、必須遺伝子は、Ｉ４Ｌ、Ｌ５Ｉ、及びＬ６Ｇの突然変異のうち１つ以上を含むａｄｋである。いくつかの実施形態では、必須遺伝子は、Ｉ４Ｌ、Ｌ５Ｉ、及びＬ６Ｇの突然変異を含むａｄｋである。
いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、リガンドによって補完される。いくつかの実施形態では、リガンドは、ベンゾチアゾール、インドール、２－アミノベンゾチアゾール、インドール－３－酪酸、インドール－３－酢酸、及びＬ－ヒスチジンメチルエステルからなる群から選択される。例えば、ｍｅｔＧに突然変異（Ｅ４５Ｑ、Ｎ４７Ｒ、Ｉ４９Ｇ、及びＡ５１Ｃ）を含む細菌細胞は、ベンゾチアゾール、インドール、２－アミノベンゾチアゾール、インドール－３－酪酸、インドール－３－酢酸、またはＬ－ヒスチジンメチルエステルによって補完される。ｄｎａＮに突然変異（Ｈ１９１Ｎ、Ｒ２４０Ｃ、Ｉ３１７Ｓ、Ｆ３１９Ｖ、Ｌ３４０Ｔ、Ｖ３４７Ｉ、及びＳ３４５Ｃ）を含む細菌細胞は、ベンゾチアゾール、インドール、または２－アミノベンゾチアゾールによって補完される。ｐｈｅＳに突然変異（Ｆ１２５Ｇ、Ｐ１８３Ｔ、Ｐ１８４Ａ、Ｒ１８６Ａ、及びＩ１８８Ｌ）を含む細菌細胞は、ベンゾチアゾール、または２－アミノベンゾチアゾールによって補完される。ｔｙｒＳに突然変異（Ｌ３６Ｖ、Ｃ３８Ａ、及びＦ４０Ｇ）を含む細菌細胞は、ベンゾチアゾール、または２－アミノベンゾチアゾールによって補完される。ａｄｋに突然変異（Ｉ４Ｌ、Ｌ５Ｉ、及びＬ６Ｇ）を含む細菌細胞は、ベンゾチアゾール、またはインドールによって補完される。
いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、リガンドにたいしてそれを栄養要求性にする２つ以上の突然変異必須遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、細菌細胞は、２つの必須遺伝子に突然変異を含む。例えば、いくつかの実施形態では、細菌細胞は、ｔｙｒＳに突然変異（Ｌ３６Ｖ、Ｃ３８Ａ、及びＦ４０Ｇ）、ならびにｍｅｔＧに突然変異（Ｅ４５Ｑ、Ｎ４７Ｒ、Ｉ４９Ｇ、及びＡ５１Ｃ）を含む。その他の実施形態では、細菌細胞は、３つの必須遺伝子に突然変異を含む。例えば、いくつかの実施形態では、細菌細胞は、ｔｙｒＳに突然変異（Ｌ３６Ｖ、Ｃ３８Ａ、及びＦ４０Ｇ）、ｍｅｔＧに突然変異（Ｅ４５Ｑ、Ｎ４７Ｒ、Ｉ４９Ｇ、及びＡ５１Ｃ）、ならびにｐｈｅＳに突然変異（Ｆ１２５Ｇ、Ｐ１８３Ｔ、Ｐ１８４Ａ、Ｒ１８６Ａ、及びＩ１８８Ｌ）を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、その必須遺伝子（複数可）が本明細書に記載のアラビノース系を使用して置換される条件付き栄養要求体である。
いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子組換えされた細菌は、栄養要求体であり、また、本明細書に記載のキルスイッチ成分及び系のいずれかなどのキルスイッチ回路も含む。例えば、組換え細菌は、細胞生存及び／または増殖に必要な必須遺伝子に、例えば、ｔｈｙＡなどのＤＮＡ合成遺伝子に、例えば、ｄａｐＡなどの細胞壁合成遺伝子、及び／または例えば、ｓｅｒＡ、ＭｅｔＡもしくはｉｌｖＣなどのアミノ酸遺伝子に欠失または突然変異を含む場合があり、また、環境条件（複数可）及び／またはシグナル（複数可）（記載したアラビノース系など）に応じて発現する１つ以上の転写活性化因子によって調節されるか、または外因的な環境条件（複数可）及び／またはシグナル（複数可）（本明細書に記載の組換え酵素系など）を感知すると発現する１つ以上の組換え酵素によって調節される毒素遺伝子も含む場合がある。他の実施形態については、Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，“ＧｅｎｅＧｕａｒｄ： Ａ Ｍｏｄｕｌａｒ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ Ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｆｏｒ Ｂｉｏｓａｆｅｔｙ，”ＡＣＳ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０１５）４：３０７－１６に記載されており、その全内容は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子組換えされた細菌は、栄養要求体であり、また、本明細書に記載のキルスイッチ成分及び系のいずれかなどのキルスイッチ回路、ならびに条件付き複製起点などの別のバイオセキュリティー系も含む（Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，上記を参照されたい）。
遺伝性調節回路
いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、本明細書に記載の構築物を発現させるための多層遺伝性調節回路を含む（例えば、米国特許仮出願第６２／１８４，８１１号を参照されたく、またその全体は本明細書に参照として組み込まれる）。遺伝性調節回路は、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）及び／またはシュウ酸塩輸送体（複数可）を産生するか、または栄養要求体を救済する突然変異細菌のスクリーニングに有用である。特定の実施形態において、本発明は、目的の１つ以上の遺伝子を産生する遺伝子組換えされた細菌を選択する方法を提供する。
いくつかの実施形態において、本発明は、ペイロード及びＴ７ポリメラーゼ調節型遺伝性調節回路を産生するための遺伝子または遺伝子カセットを含む遺伝子組換えされた細菌を提供する。例えば、遺伝子組換えされた細菌は、Ｔ７ポリメラーゼをコードする第１遺伝子であって、フマル酸塩及び硝酸還元酵素調節因子（ＦＮＲ）応答性プロモーターに操作可能に連結された第１遺伝子と、ペイロードを産生するための第２遺伝子または遺伝子カセットであって、Ｔ７ポリメラーゼによって誘導されるＴ７プロモーターに操作可能に連結された第２遺伝子または遺伝子カセットと、Ｔ７ポリメラーゼを阻害することができる阻害性因子であるｌｙｓＹをコードする第３遺伝子と、を含む。酸素の存在下では、ＦＮＲは、ＦＮＲ応答性プロモーターに結合せず、ペイロードは発現しない。ＬｙｓＹは、構成的に発現され（Ｐ－ｌａｃ構成）、さらにＴ７ポリメラーゼを阻害する。酸素の不在下では、ＦＮＲは、二量体化し、ＦＮＲ応答性プロモーターに結合し、Ｔ７ポリメラーゼは、ｌｙｓＹ阻害に打ち勝つのに十分なレベルで発現し、ペイロードが発現する。いくつかの実施形態では、ｌｙｓＹ遺伝子は、追加のＦＮＲ結合部位に操作可能に連結される。酸素の不在下では、ＦＮＲは、前述の通り二量体化してＴ７ポリメラーゼ発現を活性化し、またｌｙｓＹ発現を阻害する。
いくつかの実施形態において、本発明は、ペイロード及びタンパク質分解酵素調節型遺伝性調節回路を産生するための遺伝子または遺伝子カセットを含む遺伝子組換えされた細菌を提供する。例えば、遺伝子組換えされた細菌は、ｍｆ－ｌｏｎタンパク質分解酵素をコードする第１遺伝子であって、ＦＮＲ応答性プロモーターに操作可能に連結された第１遺伝子と、Ｔｅｔ調節領域（ｔｅｔＯ）に操作可能に連結された、ペイロードを産生するための第２遺伝子または遺伝子カセットと、Ｔｅｔ抑制因子（ｔｅｔＲ）に操作可能に連結された、ｍｆ－ｌｏｎ分解シグナルをコードする第３遺伝子と、を含み、ここで、該ｔｅｔＲは、Ｔｅｔ調節領域に結合して、第２遺伝子または遺伝子カセットの発現を抑制することができる。ｍｆ－ｌｏｎタンパク質分解酵素は、ｍｆ－ｌｏｎ分解シグナルを認識して、ｔｅｔＲを分解することができる。酸素の存在下では、ＦＮＲは、ＦＮＲ応答性プロモーターに結合せず、抑制因子は分解されず、ペイロードは発現しない。酸素の不在下では、ＦＮＲは、二量体化し、ＦＮＲ応答性プロモーターに結合し、それによってｍｆ－ｌｏｎタンパク質分解酵素の発現を誘導する。ｍｆ－ｌｏｎタンパク質分解酵素は、ｍｆ－ｌｏｎ分解シグナルを認識し、ｔｅｔＲを分解し、ペイロードが発現する。
いくつかの実施形態において、本発明は、ペイロード及び抑制因子調節型遺伝性調節回路を産生するための遺伝子または遺伝子カセットを含む遺伝子組換えされた細菌を提供する。例えば、遺伝子組換えされた細菌は、第１抑制因子をコードする第１遺伝子であって、ＦＮＲ応答性プロモーターに操作可能に連結された第１遺伝子と、構成的プロモーターを含む第１調節領域に操作可能に連結された、ペイロードを産生するための第２遺伝子または遺伝子カセットと、第２抑制因子をコードする第３遺伝子と、を含み、ここで、該第２抑制因子は、第１調節領域に結合して、第２遺伝子または遺伝子カセットの発現を抑制することができる。第３遺伝子は、構成的プロモーターを含む第２調節領域に操作可能に連結され、ここで、第１抑制因子は、第２調節領域に結合して、第２抑制因子の発現を阻害することができる。酸素の存在下では、ＦＮＲは、ＦＮＲ応答性プロモーターに結合せず、第１抑制因子は発現せず、第２抑制因子は発現し、ペイロードは発現しない。酸素の不在下では、ＦＮＲは、二量体化し、ＦＮＲ応答性プロモーターに結合し、第１抑制因子は発現し、第２抑制因子は発現せず、ペイロードは発現しない。
これらの実施形態で有用な抑制因子の例としては、ＡｒｇＲ、ＴｅｔＲ、ＡｒｓＲ、ＡｓｃＧ、ＬａｃＩ、ＣｓｃＲ、ＤｅｏＲ、ＤｇｏＲ、ＦｒｕＲ、ＧａｌＲ、ＧａｔＲ、ＣＩ、ＬｅｘＡ、ＲａｆＲ、ＱａｃＲ、及びＰｔｘＳが挙げられるが、これらに限定されない（ＵＳ２００３０１６６１９１）。
いくつかの実施形態において、本発明は、ペイロード及び調節ＲＮＡ調節型遺伝性調節回路を産生するための遺伝子または遺伝子カセットを含む遺伝子組換えされた細菌を提供する。例えば、遺伝子組換えされた細菌は、調節ＲＮＡをコードする第１遺伝子であって、ＦＮＲ応答性プロモーターに操作可能に連結された第１遺伝子と、ペイロードを産生するための第２遺伝子または遺伝子カセットと、を含む。第２遺伝子または遺伝子カセットは、構成的プロモーターに操作可能に連結され、さらにペイロードの翻訳を阻害するｍＲＮＡヘアピンを産生することができるヌクレオチド配列に連結される。調節ＲＮＡは、ｍＲＮＡヘアピンを排除して、リボソーム結合部位を介したペイロード翻訳を誘導することができる。酸素の存在下では、ＦＮＲは、ＦＮＲ応答性プロモーターに結合せず、調節ＲＮＡは発現せず、ｍＲＮＡヘアピンは、ペイロードが翻訳されることを妨げる。酸素の不在下では、ＦＮＲは、二量体化し、ＦＮＲ応答性プロモーターに結合し、調節ＲＮＡは発現し、ｍＲＮＡヘアピンが排除され、ペイロードは発現する。
いくつかの実施形態において、本発明は、ペイロード及びＣＲＩＳＰＲ調節型遺伝性調節回路を産生するための遺伝子または遺伝子カセットを含む遺伝子組換えされた細菌を提供する。例えば、遺伝子組換えされた細菌は、Ｃａｓ９タンパク質と、をＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡをコードする第１遺伝子であって、ＦＮＲ応答性プロモーターに操作可能に連結された第１遺伝子と、ペイロードを産生するための第２遺伝子または遺伝子カセットであって、構成的プロモーターを含む調節領域に操作可能に連結された第２遺伝子または遺伝子カセットと、構成的プロモーターに操作可能に連結された、抑制因子をコードする第３遺伝子と、を含み、ここで、該抑制因子は、調節領域に結合して、第２遺伝子または遺伝子カセットの発現を抑制することができる。第３遺伝子は、さらにＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡに結合することができるＣＲＩＳＰＲ標的配列に連結され、ここで、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡへの上記結合により、Ｃａｓ９タンパク質による切断が誘導され、抑制因子の発現が阻害される。酸素の存在下では、ＦＮＲは、ＦＮＲ応答性プロモーターに結合せず、ガイドＲＮＡは発現せず、抑制因子は発現し、ペイロードは発現しない。酸素の不在下では、ＦＮＲは、二量体化し、ＦＮＲ応答性プロモーターに結合し、ガイドＲＮＡは発現し、抑制因子は発現せず、ペイロードは発現しない。
いくつかの実施形態において、本発明は、ペイロード及び組換え酵素調節型遺伝性調節回路を産生するための遺伝子または遺伝子カセットを含む遺伝子組換えされた細菌を提供する。例えば、遺伝子組換えされた細菌は、組換え酵素をコードする第１遺伝子であって、ＦＮＲ応答性プロモーターに操作可能に連結された第１遺伝子と、構成的プロモーターに操作可能に連結された、ペイロードを産生するための第２遺伝子または遺伝子カセットと、を含む。第２遺伝子または遺伝子カセットは、方向が逆転しており（３’から５’）、組換え酵素結合部位で挟まれており、組換え酵素は、組換え酵素結合部位に結合してその方向を復帰させることによって（５’から３’）第２遺伝子または遺伝子カセットの発現を誘導することができる。酸素の存在下では、ＦＮＲは、ＦＮＲ応答性プロモーターに結合せず、組換え酵素は発現せず、ペイロードは３’から５’の方向を維持し、機能的なペイロードは産生されない。酸素の不在下では、ＦＮＲは、二量体化し、ＦＮＲ応答性プロモーターに結合し、組換え酵素は発現し、ペイロードは、５’から３’の方向に復帰し、機能的ペイロードが産生される。
いくつかの実施形態において、本発明は、ペイロードならびにポリメラーゼ及び組換え酵素調節型遺伝性調節回路を産生するための遺伝子または遺伝子カセットを含む遺伝子組換えされた細菌を提供する。例えば、遺伝子組換えされた細菌は、組換え酵素をコードする第１遺伝子であって、ＦＮＲ応答性プロモーターに操作可能に連結された第１遺伝子と、Ｔ７プロモーターに操作可能に連結された、ペイロードを産生するための第２遺伝子または遺伝子カセットと、Ｔ７ポリメラーゼをコードする第３遺伝子と、を含み、ここで、該Ｔ７ポリメラーゼは、Ｔ７プロモーターに結合して、ペイロードの発現を阻害することができる。Ｔ７ポリメラーゼをコードする第３遺伝子は、方向が逆転しており（３’から５’）、組換え酵素結合部位で挟まれており、組換え酵素は、組換え酵素結合部位に結合してその方向を復帰させることによって（５’から３’）Ｔ７ポリメラーゼ遺伝子の発現を誘導することができる。酸素の存在下では、ＦＮＲは、ＦＮＲ応答性プロモーターに結合せず、組換え酵素は発現せず、Ｔ７ポリメラーゼ遺伝子は３’から５’の方向を維持し、ペイロードは発現しない。酸素の不在下では、ＦＮＲは、二量体化し、ＦＮＲ応答性プロモーターに結合し、組換え酵素は発現し、Ｔ７ポリメラーゼ遺伝子は、５’から３’の方向に復帰し、ペイロードが発現する。
キルスイッチ
いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、キルスイッチも含む（例えば、米国特許仮出願第６２／１８３，９３５及び６２／２６３，３２９号を参照されたく、またそのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれる）。キルスイッチは、外部刺激に応答して遺伝子改変微生物を能動的に殺傷することを目的としてる。生存のための必須栄養素を欠くことが理由で細菌が死滅する栄養要求性突然変異とは対照的に、キルスイッチは、微生物内部で細胞死を引き起こす有毒性分子の産生を誘導する環境内の特定の因子によって引き起こされる。
キルスイッチを用いて遺伝子改変された細菌が、ｉｎ ｖｉｔｒｏ研究目的で、例えば、実験室環境の外部でバイオ燃料産生微生物の拡散を制限するために、これまでに遺伝子改変されている。疾患または障害を治療するためにｉｎ ｖｉｖｏ投与向けに遺伝子改変された細菌もまた、異種遺伝子または遺伝子カセット、例えば、治療用遺伝子（複数可）の発現及び送達後、または対象が治療効果を経験した後、特定の時間に死滅するようにプログラムすることもできる。例えば、いくつかの実施形態では、キルスイッチは、シュウ酸塩異化酵素の発現後の一定期間後に細菌を殺傷するために活性化される。いくつかの実施形態では、キルスイッチは、シュウ酸塩異化遺伝子の発現に続いて、例えば、シュウ酸塩異化酵素の産生後、遅れて活性化される。あるいは、細菌は、疾患部位の外部にその細菌が拡散した後に死滅するように遺伝子改変され得る。具体的には、微生物による対象の長期間の集落形成、対象内部の目的の領域の外側（例えば、腸の外）への微生物の拡散、または対象の外側の微生物の環境への拡散（例えば、対象の糞便を介した環境への拡散）を防ぐのに有用である可能性がある。
キルスイッチに使用可能なそのような毒素の例としては、細胞膜を溶解して、細胞ＤＮＡまたはその他のメカニズムを分解することによって細胞死を引き起こす、バクテリオシン、溶解素、及びその他の分子が挙げられるが、これらに限定されない。このような毒素は、個別にまたは組み合わせて使用することができる。それらの産生を制御するスイッチは、例えば転写活性化（トグルスイッチ；例えば、Ｇａｒｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０００を参照）、翻訳（リボレギュレーター）、またはＤＮＡ組換え（組換え酵素ベースのスイッチ）に基づく場合があり、嫌気生活または活性酸素種などの環境刺激を感知することができる。これらのスイッチは、単一の環境因子によって活性化され得るか、または細胞死を誘導するためにＡＮＤ、ＯＲ、ＮＡＮＤ、及びＮＯＲ論理構成のいくつかの活性化因子が必要となる場合がある。例えば、ＡＮＤリボレギュレータースイッチは、テトラサイクリン、イソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、及びアラビノースによって活性化され、細胞膜を浸透性にし、細胞を殺傷する溶解素の発現を誘導する。ＩＰＴＧは、エンドリシン及びホリンｍＲＮＡの発現を誘導し、次いで、アラビノース及びテトラサイクリンの添加によって抑制解除される。細胞死を引き起こすために、３つの全ての誘導因子が存在する必要がある。キルスイッチの例は、当技術分野において既知である（Ｃａｌｌｕｒａ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。いくつかの実施形態では、キルスイッチは、シュウ酸塩異化酵素の酸素レベル依存性発現後の一定期間後に細菌を殺傷するために活性化される。いくつかの実施形態では、キルスイッチは、シュウ酸塩異化酵素の酸素レベル依存性発現後、遅れて活性化される。
キルスイッチは、環境条件または外部シグナルに応答して毒素が産生される（例えば、細菌は、外部キューに応答して殺傷される；すなわち、活性化ベースキルスイッチ）ように設計されるか、あるいは、環境条件がもはや存在しないか、または外部シグナルが停止すると毒素が産生される（すなわち、抑制ベースキルスイッチ）ように設計され得る。
したがって、いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子組換えされた細菌は、外因的な環境シグナルを感知した後に、例えば低酸素環境で、死滅するようにさらにプログラムされる。いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子組換えされた細菌、例えば、シュウ酸塩異化酵素を発現する細菌は、その発現が環境条件またはシグナルに応答して誘導され、最終的に細胞を殺傷する毒素の発現をもたらす１つ以上の組換えイベントを引き起こす、１つ以上の組換え酵素（複数可）をコードする１つ以上の遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの組換えイベントは、細菌毒素をコードする逆転異種遺伝子の反転であり、この細菌毒素は、第１組換え酵素によって反転された後に構成的に発現される。一実施形態では、細菌毒素の構成的発現により、遺伝子組換えされた細菌が殺傷される。キルスイッチ系のこれらのタイプでは、遺伝子改変細菌細胞が外因的な環境条件を感知し、目的の異種遺伝子が発現すると、組換え細菌細胞はそれ以上生存できなくなる。
本開示の遺伝子組換えされた細菌、例えば、シュウ酸塩異化酵素を発現する細菌が少なくとも１つの組換えイベントを引き起こす環境条件またはシグナルに応答して１つ以上の組換え酵素（複数可）を発現する別の実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、外因的な環境条件またはシグナルに応答して抗毒素をコードする異種遺伝子をさらに発現する。一実施形態では、少なくとも１つの組換えイベントは、第１組換え酵素による細菌毒素をコードする逆転異種遺伝子の反転である。一実施形態では、細菌毒素をコードする逆転異種遺伝子は、第１フォワード組換え酵素認識配列と第１リバース組換え酵素認識配列との間に位置する。一実施形態では、細菌毒素をコードする異種遺伝子は、第１組換え酵素によって反転された後に構成的に発現される。一実施形態では、抗毒素は、毒素の活性を阻害し、それによって遺伝子組換えされた細菌の死を遅らせる。一実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、外因的な環境条件がもはや存在せず、抗毒素をコードする異種遺伝子がそれ以上発現しない場合に、細菌毒素によって殺傷される。
別の実施形態では、少なくとも１つの組換えイベントは、第１組換え酵素による第２の組換え酵素をコードする逆転異種遺伝子の反転、続いて第２組換え酵素による細菌毒素をコードする逆転異種遺伝子の反転である。一実施形態では、第２組換え酵素をコードする逆転異種遺伝子は、第１フォワード組換え酵素認識配列と第１リバース組換え酵素認識配列との間に位置する。一実施形態では、細菌毒素をコードする逆転異種遺伝子は、第２フォワード組換え酵素認識配列と第２リバース組換え酵素認識配列との間に位置する。一実施形態では、第２組換え酵素をコードする異種遺伝子は、第１組換え酵素によって反転された後に構成的に発現される。一実施形態では、細菌毒素をコードする異種遺伝子は、第２組換え酵素によって反転された後に構成的に発現される。一実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、細菌毒素によって殺傷される。一実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、外因的な環境条件に応答して、抗毒素をコードする異種遺伝子をさらに発現する。一実施形態では、抗毒素は、外因的な環境条件が存在する場合に毒素の活性を阻害し、それによって遺伝子組換えされた細菌の死を遅らせる。一実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、外因的な環境条件がもはや存在せず、抗毒素をコードする異種遺伝子がそれ以上発現しない場合に、細菌毒素によって殺傷される。
一実施形態では、少なくとも１つの組換えイベントは、第１組換え酵素による第２の組換え酵素をコードする逆転異種遺伝子の反転、続いて第２組換え酵素による第３組換え酵素をコードする逆転異種遺伝子の反転、続いて第３組換え酵素による細菌毒素をコードする逆転異種遺伝子の反転である。それに応じて、一実施形態において、本開示は、連続して使用することができる少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の組換え酵素を提供する。
一実施形態では、少なくとも１つの組換えイベントは、第１組換え酵素による第１除去酵素をコードする逆転異種遺伝子の反転である。一実施形態では、第１除去酵素をコードする逆転異種遺伝子は、第１フォワード組換え酵素認識配列と第１リバース組換え酵素認識配列との間に位置する。一実施形態では、第１除去酵素をコードする異種遺伝子は、第１組換え酵素によって反転された後に構成的に発現される。一実施形態では、第１除去酵素は、第１必須遺伝子を切除する。一実施形態では、プログラムされた組換え細菌細胞は、第１必須遺伝子が切除された後は生存できない。
一実施形態では、第１組換え酵素は、第２除去酵素をコードする逆転異種遺伝子をさらに反転させる。一実施形態では、第２の除去酵素をコードする逆転異種遺伝子は、第２フォワード組換え酵素認識配列と第２リバース組換え酵素認識配列との間に位置する。一実施形態では、第２除去酵素をコードする異種遺伝子は、第１組換え酵素によって反転された後に構成的に発現される。一実施形態では、第１必須遺伝子及び第２必須遺伝子の両方が切除されると、遺伝子組換えされた細菌は、死滅するか、またはそれ以上生存できなくなる。一実施形態では、第１組換え酵素によって、第１必須遺伝子が切除されるか、または第２必須遺伝子が切除されると、遺伝子組換えされた細菌は、死滅するか、またはそれ以上生存できなくなる。
一実施形態では、第１除去酵素は、Ｘｉｓ１である。一実施形態では、第１除去酵素は、Ｘｉｓ２である。一実施形態では、第１除去酵素はＸｉｓ１であり、第２除去酵素はＸｉｓ２である。
一実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、少なくとも１つの組換えイベントが起こった後に死滅する。別の実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、少なくとも１つの組換えイベントが起こった後、それ以上生存できない。
これらの実施形態のいずれかでは、組換え酵素は、ＢｘｂＩ、ＰｈｉＣ３１、ＴＰ９０１、ＢｘｂＩ、ＰｈｉＣ３１、ＴＰ９０１、ＨＫ０２２、ＨＰ１、Ｒ４、Ｉｎｔ１、Ｉｎｔ２、Ｉｎｔ３、Ｉｎｔ４、Ｉｎｔ５、Ｉｎｔ６、Ｉｎｔ７、Ｉｎｔ８、Ｉｎｔ９、Ｉｎｔ１０、Ｉｎｔ１１、Ｉｎｔ１２、Ｉｎｔ１３、Ｉｎｔ１４、Ｉｎｔ１５、Ｉｎｔ１６、Ｉｎｔ１７、Ｉｎｔ１８、Ｉｎｔ１９、Ｉｎｔ２０、Ｉｎｔ２１、Ｉｎｔ２２、Ｉｎｔ２３、Ｉｎｔ２４、Ｉｎｔ２５、Ｉｎｔ２６、Ｉｎｔ２７、Ｉｎｔ２８、Ｉｎｔ２９、Ｉｎｔ３０、Ｉｎｔ３１、Ｉｎｔ３２、Ｉｎｔ３３、及びＩｎｔ３４、またはその生物学的に活性なフラグメントからなる群から選択される組換え酵素であり得る。
上述したキルスイッチ回路では、毒素は、環境因子またはシグナルの存在下で産生される。キルスイッチ回路の別の態様では、毒素は、環境因子の存在下で抑制されて（産生されず）、その後、環境条件または外部シグナルがもはや存在しなくなると産生される場合がある。このようなキルスイッチは、抑制ベースキルスイッチと呼ばれ、アラビノースまたは他の糖などの外部因子またはシグナルの存在下でのみ細菌細胞が生存できる表現系を意味する。外部因子またはシグナルの存在下で毒素が抑制される（かつ、外部シグナルが除去されると活性化される）例示的なキルスイッチ設計は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１７／０４０７１９号（弁護士参照番号：１２６０４６－００５２０）の各図にて示されている。本開示は、外因的な環境のアラビノースまたは他の糖を感知することに応じて１つ以上の異種遺伝子（複数可）を発現する組換え細菌細胞を提供する。本態様では、組換え細菌細胞は、ＡｒａＣ転写因子をコードするａｒａＣ遺伝子、ならびにａｒａＢＡＤプロモーターの制御下にある１つ以上の遺伝子を含む。アラビノースの不在下では、ＡｒａＣ転写因子は、ａｒａＢＡＤプロモーターの制御下にある遺伝子の転写を抑制するコンフォメーションをとる。アラビノースの存在下では、ＡｒａＣ転写因子は、ａｒａＢＡＤプロモーターに結合して、活性化することが可能となるコンフォメーション変化を起こし、これにより、所望の遺伝子、例えば、毒素遺伝子の発現を抑制するｔｅｔＲの発現を誘導する。本実施形態では、毒素遺伝子は、アラビノースまたは他の糖の存在下で抑制される。アラビノースが存在しない環境では、ｔｅｔＲ遺伝子は活性化されず、毒素が発現し、その結果、細菌が殺傷される。アラビノース系を使用して、必須遺伝子を発現させることもできるが、この際、必須遺伝子は、アラビノースまたは他の糖の存在下でのみ発現し、アラビノースまたは他の糖がその環境に存在しない場合は発現しない。
ゆえに、外因的な環境のアラビノースを感知すると１つ以上の異種遺伝子（複数可）が発現するいくつかの実施形態では、１つ以上の異種遺伝子は、直接的または間接的にａｒａＢＡＤプロモーターの制御下にある。いくつかの実施形態では、発現される異種遺伝子は、異種治療用遺伝子、抗毒素をコードする異種遺伝子、例えばＴｅｔＲ抑制因子などの抑制因子タンパク質もしくはポリペプチドをコードする異種遺伝子、細菌細胞で見られる必須タンパク質をコードする異種遺伝子、及び／または調節タンパク質もしくはポリペプチドをコードする異種遺伝子のうち１つ以上から選択される。
Ｐａｒａ、ＰａｒａＢ、ＰａｒａＣ、及びＰａｒａＢＡＤを含むアラビノース誘導性プロモーターが、当技術分野において既知である。一実施形態では、アラビノース誘導性プロモーターは、Ｅ．ｃｏｌｉ由来である。いくつかの実施形態では、ＰａｒａＣプロモーター及びＰａｒａＢＡＤプロモーターは、一方向で異種遺伝子（複数可）の発現を制御するＰａｒａＢＡＤプロモーター、及び他の方向で異種遺伝子（複数可）の発現を制御する（ＰａｒａＢＡＤプロモーターに極めて接近し、かつそれと反対側の鎖上の）ＰａｒａＣとの双方向的プロモーターとして作用する。アラビノースの存在下では、両方のプロモーターからの両方の異種遺伝子の転写が誘導される。しかし、アラビノースの不在下では、両方のプロモーターからの両方の異種遺伝子の転写が誘導されない。
本開示の一例示的実施形態では、本開示の遺伝子改変細菌は、テトラサイクリン抑制因子タンパク質（ＴｅｔＲ）をコードする異種遺伝子に操作可能に連結されたＰａｒａＢＡＤプロモーター、ＡｒａＣ転写因子をコードする異種遺伝子に操作可能に連結されたＰａｒａＣプロモーター、及びテトラサイクリン抑制因子タンパク質（ＰＴｅｔＲ）によって抑制されるプロモーターに操作可能に連結された、細菌毒素をコードする異種遺伝子、の配列を少なくとも有するキルスイッチを含んでいる。アラビノースの存在下では、ＡｒａＣ転写因子が、ＰａｒａＢＡＤプロモーターを活性化し、それによりＴｅｔＲタンパク質の転写が活性化され、続いて、毒素の転写が抑制される。しかし、アラビノースの不在下では、ＡｒａＣは、ＰａｒａＢＡＤプロモーターからの転写を抑制し、ＴｅｔＲタンパク質は発現されない。この場合、異種毒素遺伝子の発現が活性化され、毒素が発現する。毒素が組換え細菌細胞内で増え、組換え細菌細胞が殺傷される。一実施形態では、ＡｒａＣ転写因子をコードするａｒａＣ遺伝子は、構成的プロモーターの制御下にあり、したがって構成的に発現される。
本開示の一実施形態では、組換え細菌細胞は、構成的プロモーターの制御下にある抗毒素をさらに含む。この場合、アラビノースの存在下では、ＴｅｔＲタンパク質による抑制によって毒素は発現せず、抗毒素タンパク質が細胞内で増える。しかし、アラビノースの不在下では、ＴｅｔＲタンパク質は発現されず、毒素の発現が誘導される。組換え細菌細胞内部で毒素が増え始める。毒素タンパク質が細胞内の抗毒素タンパク質の量と同じかそれ以上の量で存在すると、組換え細菌細胞はそれ以上生存することができなくなり、その毒素によって組換え細菌細胞は殺傷されることになる。
本開示の別の実施形態では、組換え細菌細胞は、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下にある抗毒素をさらに含む。この場合、アラビノースの存在下では、ＴｅｔＲ及び抗毒素が発現し、抗毒素が細胞内で増え、ＴｅｔＲタンパク質による抑制によって毒素は発現しない。しかし、アラビノースの不在下では、ＴｅｔＲタンパク質及び抗毒素の両方が発現せず、毒素の発現が誘導される。組換え細菌細胞内部で毒素が増え始める。毒素タンパク質が発現すると、組換え細菌細胞はそれ以上生存することができなくなり、その毒素によって組換え細菌細胞は殺傷されることになる。
本開示の別の例示的実施形態では、本開示の遺伝子改変細菌は、組換え細菌細胞では見られない（かつ生存に必要な）必須ポリペプチドをコードする異種遺伝子に操作可能に連結されたＰａｒａＢＡＤプロモーター、及びＡｒａＣ転写因子をコードする異種遺伝子に操作可能に連結されたＰａｒａＣプロモーター、の配列を少なくとも有するキルスイッチを含んでいる。アラビノースの存在下では、ＡｒａＣ転写因子が、ＰａｒａＢＡＤプロモーターを活性化し、それにより必須ポリペプチドをコードする異種遺伝子の転写が活性化され、組換え細菌細胞の生存が可能になる。しかし、アラビノースの不在下では、ＡｒａＣは、ＰａｒａＢＡＤプロモーターからの転写を抑制し、生存に必要な必須タンパク質は発現されない。この場合、組換え細菌細胞は、アラビノースの不在下で死滅する。いくつかの実施形態では、組換え細菌細胞では見られない必須ポリペプチドをコードする異種遺伝子に操作可能に連結されたＰａｒａＢＡＤプロモーターの配列は、上記のＴｅｔＲ／毒素キルスイッチ系と組み合わせて細菌細胞内に存在し得る。いくつかの実施形態では、組換え細菌細胞では見られない必須ポリペプチドをコードする異種遺伝子に操作可能に連結されたＰａｒａＢＡＤプロモーターの配列は、上記のＴｅｔＲ／毒素／抗毒素キルスイッチ系と組み合わせて細菌細胞内に存在し得る。
さらに他の実施形態では、細菌は、短命の抗毒素及び長命の毒素の両方を産生するプラスミドを含むプラスミド安定系を含む場合がある。この系では、細菌細胞は、毒素及び抗毒素を同じ量で産生して毒素を中和する。しかし、細胞がプラスミドを失った場合、短命抗毒素が減衰し始める。抗毒素が完全に減衰すると、より長寿命の毒素が細胞を殺傷する結果として、細胞が死滅する。
いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子改変細菌、例えば、シュウ酸塩異化酵素を発現する細菌は、上述したキルスイッチ回路のいずれかの成分をコードする遺伝子（複数可）をさらに含む。
上述した実施形態のいずれかでは、細菌毒素は、溶解素、Ｈｏｋ、Ｆｓｔ、ＴｉｓＢ、ＬｄｒＤ、Ｋｉｄ、ＳｙｍＥ、ＭａｚＦ、ＦｌｍＡ、Ｉｂｓ、ＸＣＶ２１６２、ｄｉｎＪ、ＣｃｄＢ、ＭａｚＦ、ＰａｒＥ、ＹａｆＯ、Ｚｅｔａ、ｈｉｃＢ、ｒｅｌＢ、ｙｈａＶ、ｙｏｅＢ、ｃｈｐＢＫ、ｈｉｐＡ、ミクロシンＢ、ミクロシンＢ１７、ミクロシンＣ、ミクロシンＣ７－Ｃ５１、ミクロシンＪ２５、ミクロシンＣｏｌＶ、ミクロシン２４、ミクロシンＬ、ミクロシンＤ９３、ミクロシンＬ、ミクロシンＥ４９２、ミクロシンＨ４７、ミクロシンＩ４７、ミクロシンＭ、コリシンＡ、コリシンＥ１、コリシンＫ、コリシンＮ、コリシンＵ、コリシンＢ、コリシンＩａ、コリシンＩｂ、コリシン５、コリシン１０、コリシンＳ４、コリシンＹ、コリシンＥ２、コリシンＥ７、コリシンＥ８、コリシンＥ９、コリシンＥ３、コリシンＥ４、コリシンＥ６；コリシンＥ５、コリシンＤ、コリシンＭ、及びクロアシンＤＦ１３、またはその生物学的に活性なフラグメント、からなる群から選択される。
上述した実施形態のいずれかでは、抗毒素は、抗溶解素、Ｓｏｋ、ＲＮＡＩＩ、ＩｓｔＲ、ＲｄｌＤ、Ｋｉｓ、ＳｙｍＲ、ＭａｚＥ、ＦｌｍＢ、Ｓｉｂ、ｐｔａＲＮＡ１、ｙａｆＱ、ＣｃｄＡ、ＭａｚＥ、ＰａｒＤ、ｙａｆＮ、Ｅｐｓｉｌｏｎ、ＨｉｃＡ、ｒｅｌＥ、ｐｒｌＦ、ｙｅｆＭ、ｃｈｐＢＩ、ｈｉｐＢ、ＭｃｃＥ、ＭｃｃＥＣＴＤ、ＭｃｃＦ、Ｃａｉ、ＩｍｍＥ１、Ｃｋｉ、Ｃｎｉ、Ｃｕｉ、Ｃｂｉ、Ｉｉａ、Ｉｍｍ、Ｃｆｉ、Ｉｍ１０、Ｃｓｉ、Ｃｙｉ、Ｉｍ２、Ｉｍ７、Ｉｍ８、Ｉｍ９、Ｉｍ３、Ｉｍ４、ＩｍｍＥ６、クロアシン免疫タンパク質（Ｃｉｍ）、ＩｍｍＥ５、ＩｍｍＤ、及びＣｍｉ、またはその生物学的に活性なフラグメント、からなる群から選択される。
一実施形態では、細菌毒素は、遺伝子組換えされた細菌に対して殺菌性である。一実施形態では、細菌毒素は、遺伝子組換えされた細菌に対して静菌性である。
一実施形態では、方法は、第２組換え細菌細胞を対象に投与することをさらに含み、ここで、該第２組換え細菌細胞は、外因的な環境条件によって直接的または間接的に誘導される誘導性プロモーターに操作可能に連結された異種レポーター遺伝子を含む。一実施形態では、異種レポーター遺伝子は、蛍光遺伝子である。一実施形態では、蛍光遺伝子は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする。別の実施形態では、方法は、第２組換え細菌細胞を対象に投与することをさらに含み、ここで、該第２組換え細菌細胞は、基質を切断して尿中で検出される場合がある小分子を産生するｌａｃＺレポーター構築物を発現する（例えば、Ｄａｎｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７（２８９）：１－１２，２０１５を参照されたく、またその全内容は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる）。
単離されたプラスミド
その他の実施形態において、本開示は、第１誘導性プロモーターに操作可能に連結された、第１ペイロードをコードする第１核酸、及び第２誘導性プロモーターに操作可能に連結された、第２ペイロードをコードする第２核酸を含む単離されたプラスミドを提供する。その他の実施形態において、本開示は、第３誘導性プロモーターに操作可能に連結された、第３ペイロードをコードする第３核酸をさらに含む単離されたプラスミドを提供する。その他の実施形態において、本開示は、誘導性プロモーターに操作可能に連結された、４、５、６個またはそれ以上のペイロードをコードする４、５、６個またはそれ以上の核酸類を含むプラスミドを提供する。本明細書で記載された実施形態のいずれかでは、第１、第２、第３、第４、第５、第６などの「ペイロード（複数可）」は、シュウ酸塩異化酵素、シュウ酸塩輸送体、または本明細書に記載の他の配列であり得る。一実施形態では、第１ペイロードをコードする核酸、及び第２のペイロードをコードする核酸は、第１誘導性プロモーターに操作可能に連結される。一実施形態では、第１ペイロードをコードする核酸は、第１誘導性プロモーターに操作可能に連結され、第２ペイロードをコードする核酸は、第２誘導性プロモーターに操作可能に連結される。一実施形態では、第１誘導性プロモーター及び第２誘導性プロモーターは、同じ誘導性プロモーターの別々のコピーである。別の実施形態では、第１誘導性プロモーター及び第２誘導性プロモーターは、異なる誘導性プロモーターである。第３核酸を含むその他の実施形態では、第３ペイロードをコードする核酸及び第１及び第２ペイロードをコードする核酸は全て、同じ誘導性プロモーターに操作可能に連結される。その他の実施形態では、第１ペイロードをコードする核酸は、第１誘導性プロモーターに操作可能に連結され、第２ペイロードをコードする核酸は、第２誘導性プロモーターに操作可能に連結され、第３ペイロードをコードする核酸は、第３誘導性プロモーターに操作可能に連結される。いくつかの実施形態では、第１、第２、及び第３誘導性プロモーターは、同じ誘導性プロモーターの別々のコピーである。その他の実施形態では、第１誘導性プロモーター、第２誘導性プロモーター、及び第３誘導性プロモーターは、異なる誘導性プロモーターである。いくつかの実施形態では、第１プロモーター、第２プロモーター、及び任意の第３プロモーター、あるいは第１プロモーター及び第２プロモーターならびに任意の第３プロモーターは、それぞれ、低酸素環境または嫌気的条件によって直接的または間接的に誘導される。その他の実施形態では、第１プロモーター、第２プロモーター、及び任意の第３プロモーター、あるいは第１プロモーター及び第２プロモーターならびに任意の第３プロモーターは、それぞれ、フマル酸塩及び硝酸塩還元調節因子（ＦＮＲ）応答性プロモーターである。その他の実施形態では、第１プロモーター、第２プロモーター、及び任意の第３プロモーター、あるいは第１プロモーター及び第２プロモーターならびに任意の第３プロモーターは、それぞれ、ＲＯＳ誘導性調節領域である。その他の実施形態では、第１プロモーター、第２プロモーター、及び任意の第３プロモーター、あるいは第１プロモーター及び第２プロモーターならびに任意の第３プロモーターは、それぞれ、ＲＮＳ誘導性調節領域である。
いくつかの実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする異種遺伝子及び／または遺伝子カセットは、構成的プロモーターに操作可能に連結される。一実施形態では、構成的プロモーターは、ｌａｃプロモーターである。別の実施形態では、構成的プロモーターは、Ｔｅｔプロモーターである。別の実施形態では、構成的プロモーターは、構成的Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ σ３２プロモーターである。別の実施形態では、構成的プロモーターは、構成的Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ σ７０プロモーターである。別の実施形態では、構成的プロモーターは、構成的Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ σＡプロモーターである。別の実施形態では、構成的プロモーターは、構成的Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ σＢプロモーターである。別の実施形態では、構成的プロモーターは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａプロモーターである。その他の実施形態では、構成的プロモーターは、バクテリオファージＴ７プロモーターである。その他の実施形態では、構成的プロモーターは、バクテリオファージＳＰ６プロモーターである。上述した実施形態のいずれかでは、プラスミドは、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターに操作可能に連結され得る、シュウ酸塩輸送体をコードする異種遺伝子、及び／またはキルスイッチ構築物をさらに含む。
いくつかの実施形態では、単離されたプラスミドは、第１誘導性プロモーターに操作可能に連結された少なくとも１つの異種シュウ酸塩異化酵素遺伝子と、ＰａｒａＢＡＤプロモーターに操作可能に連結された、ＴｅｔＲタンパク質をコードする異種遺伝子と、ＰａｒａＣプロモーターに操作可能に連結された、ＡｒａＣをコードする異種遺伝子と、構成的プロモーターに操作可能に連結された、抗毒素をコードする異種遺伝子と、ＰＴｅｔＲプロモーターに操作可能に連結された、毒素をコードする異種遺伝子と、を含む。別の実施形態では、単離されたプラスミドは、第１誘導性プロモーターに操作可能に連結された、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする少なくとも１つの異種遺伝子及び／または遺伝子カセットと、ＰａｒａＢＡＤプロモーターに操作可能に連結された、ＴｅｔＲタンパク質及び抗毒素をコードする異種遺伝子と、ＰａｒａＣプロモーターに操作可能に連結された、ＡｒａＣをコードする異種遺伝子と、ＰＴｅｔＲプロモーターに操作可能に連結された、毒素をコードする異種遺伝子と、を含む。
いくつかの実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする第１核酸は、ホルミルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素（例えば、ｆｒｃ）遺伝子を含む。一実施形態では、ｆｒｃ遺伝子は、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来である。一実施形態では、ｆｒｃ遺伝子は、配列番号１に対して少なくとも約９０％の同一性を有する。別の実施形態では、ｆｒｃ遺伝子は、配列番号１を含む。その他の実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする第１核酸は、シュウ酸塩ＣｏＡリガーゼ（例えば、ＳｃＡＡＥ３）遺伝子を含む。一実施形態では、ＳｃＡＡＥ３遺伝子は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来である。一実施形態では、ＳｃＡＡＥ３遺伝子は、配列番号３に対して少なくとも約９０％の同一性を有する。別の実施形態では、ＳｃＡＡＥ３遺伝子は、配列番号３を含む。その他の実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする第１核酸は、アセチルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素（例えば、ＹｆｄＥ）遺伝子を含む。一実施形態では、ＹｆｄＥ遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉ由来である。一実施形態では、ＹｆｄＥ遺伝子は、配列番号４に対して少なくとも約９０％の同一性を有する。別の実施形態では、ＹｆｄＥ遺伝子は、配列番号４を含む。
いくつかの実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする第１核酸は、シュウ酸ＣｏＡ脱炭酸酵素（例えば、ｏｘｃ）遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ｆｒｃ、ＳｃＡＡＥ３、及び／またはＹｆｄＥ遺伝子（複数可）は、シュウ酸ＣｏＡ脱炭酸酵素（例えば、ｏｘｃ）遺伝子と共発現される。一実施形態では、ｏｘｃ遺伝子は、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来である。一実施形態では、ｏｘｃ遺伝子は、配列番号２に対して少なくとも約９０％の同一性を有する。別の実施形態では、ｏｘｃ遺伝子は、配列番号２を含む。
いくつかの実施形態では、シュウ酸塩輸送体をコードする第２核酸は、ＯｘｌＴを含む。一実施形態では、ＯｘｌＴ輸送体は、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来である。別の実施形態では、ＯｘｌＴ輸送体は、配列番号１１に対して少なくとも約９０％の同一性を有する。別の実施形態では、ＯｘｌＴ輸送体は、配列番号１１を含む。
一実施形態では、プラスミドは、高コピープラスミドである。別の実施形態では、プラスミドは、低コピープラスミドである。
別の態様において、本開示は、本明細書に記載の単離されたプラスミドを含んでいる組換え細菌細胞を提供する。別の実施形態において、本開示は、組換え細菌細胞を含んでいる医薬組成物を提供する。
一実施形態では、細菌細胞は、シュウ酸塩排出輸送体をコードする内因性遺伝子に遺伝子突然変異をさらに含み、ここで、この遺伝子突然変異により、細菌細胞からのシュウ酸塩の排出が減少する。
一実施形態では、細菌細胞は、シュウ酸塩生合成遺伝子をコードする内因性遺伝子に遺伝子突然変異をさらに含み、ここで、この遺伝子突然変異により、細菌細胞におけるシュウ酸塩の生合成が減少する。
組み合わせ
いくつかの実施形態では、細菌は、複数の作用機序（ＭＯＡ）、例えば、同じ生成物の複数のコピーを生成する（例えば、コピー数を増やす）回路、または複数の異なる機能を実施する回路を含むように遺伝子組換えされる。挿入部位の例としては、ｍａｌＥ／Ｋ、ｉｎｓＢ／Ｉ、ａｒａＣ／ＢＡＤ、ｌａｃＺ、ｄａｐＡ、及びｃｅａが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、遺伝子組換えされた細菌は、シュウ酸塩異化遺伝子もしくはシュウ酸塩異化遺伝子カセットの４つのコピー、または４つの異なる挿入部位、例えば、ｍａｌＥ／Ｋ、ｉｎｓＢ／Ｉ、ａｒａＣ／ＢＡＤ、及びｌａｃＺに挿入されたシュウ酸塩異化遺伝子の４つのコピーを含んでいてもよい。あるいは、遺伝子組換えされた細菌は、１つ以上の異なる挿入部位、例えば、ｍａｌＥ／Ｋ、ｉｎｓＢ／Ｉ、及びｌａｃＺに挿入されたシュウ酸塩異化遺伝子または遺伝子カセットの１つ以上のコピー、１つ以上の異なる挿入部位、例えば、ｄａｐＡ、ｃｅａ、及びａｒａＣ／ＢＡＤに挿入されたシュウ酸塩異化遺伝子または遺伝子カセットの１つ以上のコピー、及び／または１つ以上の異なる挿入部位に挿入されたシュウ酸塩異化遺伝子または遺伝子カセットの１つ以上のコピー、を含んでいてもよい。
いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、（１）野生型または突然変異形態（安定性または代謝活性を上げるため）の本明細書に記載の１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする１つ以上の遺伝子（複数可）及び／または遺伝子カセット、（２）野生型または突然変異形態（安定性または代謝活性を上げるため）であり、いくつかの実施形態では、ギ酸塩排出と連結された、シュウ酸塩取り込みのための１つ以上の輸送体（複数可）をコードする１つ以上の遺伝子（複数可）及び／または遺伝子カセット（複数可）、（３）野生型または突然変異形態（安定性または代謝活性を上げるため）であり、いくつかの実施形態では、シュウ酸塩取り込みと連結された、ギ酸塩排出のための１つ以上の排出輸送体（複数可）をコードする１つ以上の遺伝子（複数可）及び／または遺伝子カセット（複数可）、（４）野生型または突然変異形態（安定性または代謝活性を上げるため）であり、いくつかの実施形態では、シュウ酸塩取り込みと連結された、１つ以上のシュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体をコードする１つ以上の遺伝子（複数可）及び／または遺伝子カセット（複数可）、（５）シュウ酸塩の分泌及び細胞外分解のための本明細書に記載の１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする１つ以上の遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）、（６）本明細書に記載のような分泌機構の１つ以上の成分をコードする１つ以上の遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）、（７）１つ以上の栄養要求性、例えば、ΔＴｈｙＡ、（８）カナマイシンまたはクロラムフェニコール耐性を含むがこれらに限定されない１つ以上の抗生物質耐性（複数可）をコードする１つ以上の遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）、（９）細菌細胞へのシュウ酸塩取り込みを増加させる１つ以上の修飾、（１０）細菌細胞からのギ酸塩排出を増加させる１つ以上の修飾、（１１）細菌細胞へのギ酸塩取り込みを減少させる１つ以上の修飾、（１２）細菌細胞からのシュウ酸塩排出を減少させる１つ以上の修飾、（１３）内因性シュウ酸塩合成経路の遺伝子の突然変異／欠失、（１４）シュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体を介した流動の増加及びシュウ酸塩取り込みの増加をもたらすギ酸塩排出輸送体の突然変異及び／または欠失、のうち１つ以上を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、シュウ酸塩異化酵素を含む２つ以上の異なる経路カセットまたはオペロンを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素をコードする１つ以上のシュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のｆｒｃを含むがこれに限定されないホルミルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＳｃＡＡＥ３を含むがこれに限定されないシュウ酸ＣｏＡシンテターゼ、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のｏｘｃを含むがこれに限定されないシュウ酸ＣｏＡ脱炭酸酵素、及び／またはＥ．ｃｏｌｉ由来のＹｆｄＥを含むがこれに限定されないアセチルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素、から選択される１つ以上のシュウ酸塩異化酵素をコードする遺伝子配列（複数可）を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のｆｒｃを含むがこれに限定されないホルミルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素をコードする１つ以上のシュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＳｃＡＡＥ３を含むがこれに限定されないシュウ酸ＣｏＡシンテターゼをコードする１つ以上のシュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のｏｘｃを含むがこれに限定されないシュウ酸ＣｏＡ脱炭酸酵素をコードする１つ以上のシュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＹｆｄＥを含むがこれに限定されないアセチルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素をコードする１つ以上のシュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のｆｒｃを含むがこれに限定されないホルミルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素、及びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＳｃＡＡＥ３を含むがこれに限定されないシュウ酸ＣｏＡシンテターゼをコードする１つ以上のシュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のｆｒｃを含むがこれに限定されないホルミルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素、及びＯ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のｏｘｃを含むがこれに限定されないシュウ酸ＣｏＡ脱炭酸酵素をコードする１つ以上のシュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のｆｒｃを含むがこれに限定されないホルミルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素、及びＥ．ｃｏｌｉ由来のＹｆｄＥを含むがこれに限定されないアセチルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素をコードする１つ以上のシュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＳｃＡＡＥ３を含むがこれに限定されないシュウ酸ＣｏＡシンテターゼ、及びＯ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のｏｘｃを含むがこれに限定されないシュウ酸ＣｏＡ脱炭酸酵素をコードする１つ以上のシュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＳｃＡＡＥ３を含むがこれに限定されないシュウ酸ＣｏＡシンテターゼ、及びＥ．ｃｏｌｉ由来のＹｆｄＥを含むがこれに限定されないアセチルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素をコードする１つ以上のシュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のｏｘｃを含むがこれに限定されないシュウ酸ＣｏＡ脱炭酸酵素、及びＥ．ｃｏｌｉ由来のＹｆｄＥを含むがこれに限定されないアセチルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素をコードする１つ以上のシュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のｆｒｃを含むがこれに限定されないホルミルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＳｃＡＡＥ３を含むがこれに限定されないシュウ酸ＣｏＡシンテターゼ、及びＯ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のｏｘｃを含むがこれに限定されないシュウ酸ＣｏＡ脱炭酸酵素をコードする１つ以上のシュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のｆｒｃを含むがこれに限定されないホルミルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＳｃＡＡＥ３を含むがこれに限定されないシュウ酸ＣｏＡシンテターゼ、及びＥ．ｃｏｌｉ由来のＹｆｄＥを含むがこれに限定されないアセチルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素をコードする１つ以上のシュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のｆｒｃを含むがこれに限定されないホルミルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のｏｘｃを含むがこれに限定されないシュウ酸ＣｏＡ脱炭酸酵素、及びＥ．ｃｏｌｉ由来のＹｆｄＥを含むがこれに限定されないアセチルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素をコードする１つ以上のシュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＳｃＡＡＥ３を含むがこれに限定されないシュウ酸ＣｏＡシンテターゼ、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のｏｘｃを含むがこれに限定されないシュウ酸ＣｏＡ脱炭酸酵素、及びＥ．ｃｏｌｉ由来のＹｆｄＥを含むがこれに限定されないアセチルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素をコードする１つ以上のシュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のｆｒｃを含むがこれに限定されないホルミルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＳｃＡＡＥ３を含むがこれに限定されないシュウ酸ＣｏＡシンテターゼ、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のｏｘｃを含むがこれに限定されないシュウ酸ＣｏＡ脱炭酸酵素、及びＥ．ｃｏｌｉ由来のＹｆｄＥを含むがこれに限定されないアセチルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素をコードする１つ以上のシュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｎｅｓ由来のＯｘｌＴを含むがこれに限定されない１つ以上のシュウ酸塩輸送体及び／または対向輸送体をさらに含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、シュウ酸塩輸送体、例えば、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のシュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体ＯｘｌＴをコードする１つ以上のシュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のｆｒｃを含むがこれに限定されないホルミルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素、及びシュウ酸塩輸送体、例えば、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のシュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体ＯｘｌＴをコードする１つ以上のシュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＳｃＡＡＥ３を含むがこれに限定されないシュウ酸ＣｏＡシンテターゼ、及びシュウ酸塩輸送体、例えば、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のシュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体ＯｘｌＴをコードする１つ以上のシュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のｏｘｃを含むがこれに限定されないシュウ酸ＣｏＡ脱炭酸酵素、及びシュウ酸塩輸送体、例えば、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のシュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体ＯｘｌＴをコードする１つ以上のシュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＹｆｄＥを含むがこれに限定されないアセチルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素、及びシュウ酸塩輸送体、例えば、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のシュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体ＯｘｌＴをコードする１つ以上のシュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のｆｒｃを含むがこれに限定されないホルミルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＳｃＡＡＥ３を含むがこれに限定されないシュウ酸ＣｏＡシンテターゼ、及びシュウ酸塩輸送体、例えば、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のシュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体ＯｘｌＴをコードする１つ以上のシュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のｆｒｃを含むがこれに限定されないホルミルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のｏｘｃを含むがこれに限定されないシュウ酸ＣｏＡ脱炭酸酵素、及びシュウ酸塩輸送体、例えば、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のシュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体ＯｘｌＴをコードする１つ以上のシュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のｆｒｃを含むがこれに限定されないホルミルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＹｆｄＥを含むがこれに限定されないアセチルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素、及びシュウ酸塩輸送体、例えば、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のシュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体ＯｘｌＴをコードする１つ以上のシュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＳｃＡＡＥ３を含むがこれに限定されないシュウ酸ＣｏＡシンテターゼ、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のｏｘｃを含むがこれに限定されないシュウ酸ＣｏＡ脱炭酸酵素、及びシュウ酸塩輸送体、例えば、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のシュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体ＯｘｌＴをコードする１つ以上のシュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＳｃＡＡＥ３を含むがこれに限定されないシュウ酸ＣｏＡシンテターゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＹｆｄＥを含むがこれに限定されないアセチルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素、及びシュウ酸塩輸送体、例えば、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のシュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体ＯｘｌＴをコードする１つ以上のシュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のｏｘｃを含むがこれに限定されないシュウ酸ＣｏＡ脱炭酸酵素、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＹｆｄＥを含むがこれに限定されないアセチルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素、及びシュウ酸塩輸送体、例えば、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のシュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体ＯｘｌＴをコードする１つ以上のシュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のｆｒｃを含むがこれに限定されないホルミルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＳｃＡＡＥ３を含むがこれに限定されないシュウ酸ＣｏＡシンテターゼ、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のｏｘｃを含むがこれに限定されないシュウ酸ＣｏＡ脱炭酸酵素、及びシュウ酸塩輸送体、例えば、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のシュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体ＯｘｌＴをコードする１つ以上のシュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のｆｒｃを含むがこれに限定されないホルミルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＳｃＡＡＥ３を含むがこれに限定されないシュウ酸ＣｏＡシンテターゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＹｆｄＥを含むがこれに限定されないアセチルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素、及びシュウ酸塩輸送体、例えば、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のシュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体ＯｘｌＴをコードする１つ以上のシュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のｆｒｃを含むがこれに限定されないホルミルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のｏｘｃを含むがこれに限定されないシュウ酸ＣｏＡ脱炭酸酵素、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＹｆｄＥを含むがこれに限定されないアセチルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素、及びシュウ酸塩輸送体、例えば、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のシュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体ＯｘｌＴをコードする１つ以上のシュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＳｃＡＡＥ３を含むがこれに限定されないシュウ酸ＣｏＡシンテターゼ、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のｏｘｃを含むがこれに限定されないシュウ酸ＣｏＡ脱炭酸酵素、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＹｆｄＥを含むがこれに限定されないアセチルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素、及びシュウ酸塩輸送体、例えば、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のシュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体ＯｘｌＴをコードする１つ以上のシュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のｆｒｃを含むがこれに限定されないホルミルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＳｃＡＡＥ３を含むがこれに限定されないシュウ酸ＣｏＡシンテターゼ、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のｏｘｃを含むがこれに限定されないシュウ酸ＣｏＡ脱炭酸酵素、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＹｆｄＥを含むがこれに限定されないアセチルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素、及びシュウ酸塩輸送体、例えば、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のシュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体ＯｘｌＴをコードする１つ以上のシュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）を含む。
いくつかの実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩異化遺伝子（複数可）もしくは遺伝子カセット（複数可）及び１つ以上のシュウ酸塩輸送体（複数可）を含む遺伝子組換えされた細菌は、例えば、本明細書に記載されるようなギ酸塩排出輸送体をコードする。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、１つ以上のシュウ酸塩異化遺伝子（複数可）もしくは遺伝子カセット（複数可）、及び本明細書に記載のギ酸塩排出輸送体、例えば、ＯｘｌＴとしても機能する１つ以上のシュウ酸塩輸送体（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、ギ酸塩排出及びシュウ酸塩取り込みは、切り離される。いくつかの実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）を含む遺伝子組換えされた細菌は、ギ酸塩排出輸送体を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のｆｒｃを含むがこれに限定されないホルミルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素、及び例えば、本明細書に記載のギ酸塩排出輸送体をコードする１つ以上のシュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＳｃＡＡＥ３を含むがこれに限定されないシュウ酸ＣｏＡシンテターゼ、及び例えば、本明細書に記載のギ酸塩排出輸送体をコードする１つ以上のシュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のｏｘｃを含むがこれに限定されないシュウ酸ＣｏＡ脱炭酸酵素、及び例えば、本明細書に記載のギ酸塩排出輸送体をコードする１つ以上のシュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＹｆｄＥを含むがこれに限定されないアセチルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素、及び例えば、本明細書に記載のギ酸塩排出輸送体をコードする１つ以上のシュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のｆｒｃを含むがこれに限定されないホルミルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＳｃＡＡＥ３を含むがこれに限定されないシュウ酸ＣｏＡシンテターゼ、及び例えば、本明細書に記載のギ酸塩排出輸送体をコードする１つ以上のシュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のｆｒｃを含むがこれに限定されないホルミルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のｏｘｃを含むがこれに限定されないシュウ酸ＣｏＡ脱炭酸酵素を、及び例えば、本明細書に記載のギ酸塩排出輸送体をコードする１つ以上のシュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のｆｒｃを含むがこれに限定されないホルミルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＹｆｄＥを含むがこれに限定されないアセチルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素、及び例えば、本明細書に記載のギ酸塩排出輸送体をコードする１つ以上のシュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＳｃＡＡＥ３を含むがこれに限定されないシュウ酸ＣｏＡシンテターゼ、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のｏｘｃを含むがこれに限定されないシュウ酸ＣｏＡ脱炭酸酵素、及び例えば、本明細書に記載のギ酸塩排出輸送体をコードする１つ以上のシュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＳｃＡＡＥ３を含むがこれに限定されないシュウ酸ＣｏＡシンテターゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＹｆｄＥを含むがこれに限定されないアセチルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素、及び例えば、本明細書に記載のギ酸塩排出輸送体をコードする１つ以上のシュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のｏｘｃを含むがこれに限定されないシュウ酸ＣｏＡ脱炭酸酵素、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＹｆｄＥを含むがこれに限定されないアセチルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素、及び例えば、本明細書に記載のギ酸塩排出輸送体をコードする１つ以上のシュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のｆｒｃを含むがこれに限定されないホルミルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＳｃＡＡＥ３を含むがこれに限定されないシュウ酸ＣｏＡシンテターゼ、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のｏｘｃを含むがこれに限定されないシュウ酸ＣｏＡ脱炭酸酵素、及び例えば、本明細書に記載のギ酸塩排出輸送体をコードする１つ以上のシュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のｆｒｃを含むがこれに限定されないホルミルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＳｃＡＡＥ３を含むがこれに限定されないシュウ酸ＣｏＡシンテターゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＹｆｄＥを含むがこれに限定されないアセチルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素、及び例えば、本明細書に記載のギ酸塩排出輸送体をコードする１つ以上のシュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のｆｒｃを含むがこれに限定されないホルミルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のｏｘｃを含むがこれに限定されないシュウ酸ＣｏＡ脱炭酸酵素、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＹｆｄＥを含むがこれに限定されないアセチルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素、及び例えば、本明細書に記載のギ酸塩排出輸送体をコードする１つ以上のシュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＳｃＡＡＥ３を含むがこれに限定されないシュウ酸ＣｏＡシンテターゼ、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のｏｘｃを含むがこれに限定されないシュウ酸ＣｏＡ脱炭酸酵素、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＹｆｄＥを含むがこれに限定されないアセチルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素、及び例えば、本明細書に記載のギ酸塩排出輸送体をコードする１つ以上のシュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のｆｒｃを含むがこれに限定されないホルミルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＳｃＡＡＥ３を含むがこれに限定されないシュウ酸ＣｏＡシンテターゼ、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のｏｘｃを含むがこれに限定されないシュウ酸ＣｏＡ脱炭酸酵素、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＹｆｄＥを含むがこれに限定されないアセチルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素、及び例えば、本明細書に記載のギ酸塩排出輸送体をコードする１つ以上のシュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、コードする１つ以上のシュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、シュウ酸塩輸送体、例えば、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のシュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体ＯｘｌＴ、例えば、本明細書に記載のギ酸塩排出輸送体をコードする１つ以上のシュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のｆｒｃを含むがこれに限定されないホルミルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素、シュウ酸塩輸送体、例えば、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のシュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体ＯｘｌＴ、及び例えば、本明細書に記載のギ酸塩排出輸送体をコードする１つ以上のシュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＳｃＡＡＥ３を含むがこれに限定されないシュウ酸ＣｏＡシンテターゼ、シュウ酸塩輸送体、例えば、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のシュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体ＯｘｌＴ、及び例えば、本明細書に記載のギ酸塩排出輸送体をコードする１つ以上のシュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のｏｘｃを含むがこれに限定されないシュウ酸ＣｏＡ脱炭酸酵素、シュウ酸塩輸送体、例えば、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のシュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体ＯｘｌＴ、及び例えば、本明細書に記載のギ酸塩排出輸送体をコードする１つ以上のシュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＹｆｄＥを含むがこれに限定されないアセチルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素、シュウ酸塩輸送体、例えば、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のシュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体ＯｘｌＴ、及び例えば、本明細書に記載のギ酸塩排出輸送体をコードする１つ以上のシュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のｆｒｃを含むがこれに限定されないホルミルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＳｃＡＡＥ３を含むがこれに限定されないシュウ酸ＣｏＡシンテターゼ、シュウ酸塩輸送体、例えば、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のシュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体ＯｘｌＴ、及び例えば、本明細書に記載のギ酸塩排出輸送体をコードする１つ以上のシュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のｆｒｃを含むがこれに限定されないホルミルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のｏｘｃを含むがこれに限定されないシュウ酸ＣｏＡ脱炭酸酵素、シュウ酸塩輸送体、例えば、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のシュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体ＯｘｌＴ、及び例えば、本明細書に記載のギ酸塩排出輸送体をコードする１つ以上のシュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のｆｒｃを含むがこれに限定されないホルミルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＹｆｄＥを含むがこれに限定されないアセチルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素、シュウ酸塩輸送体、例えば、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のシュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体ＯｘｌＴ、及び例えば、本明細書に記載のギ酸塩排出輸送体をコードする１つ以上のシュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＳｃＡＡＥ３を含むがこれに限定されないシュウ酸ＣｏＡシンテターゼ、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のｏｘｃを含むがこれに限定されないシュウ酸ＣｏＡ脱炭酸酵素、シュウ酸塩輸送体、例えば、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のシュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体ＯｘｌＴ、及び例えば、本明細書に記載のギ酸塩排出輸送体をコードする１つ以上のシュ

ウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＳｃＡＡＥ３を含むがこれに限定されないシュウ酸ＣｏＡシンテターゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＹｆｄＥを含むがこれに限定されないアセチルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素、シュウ酸塩輸送体、例えば、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のシュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体ＯｘｌＴ、及び例えば、本明細書に記載のギ酸塩排出輸送体をコードする１つ以上のシュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のｏｘｃを含むがこれに限定されないシュウ酸ＣｏＡ脱炭酸酵素、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＹｆｄＥを含むがこれに限定されないアセチルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素、シュウ酸塩輸送体、例えば、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のシュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体ＯｘｌＴ、及び例えば、本明細書に記載のギ酸塩排出輸送体をコードする１つ以上のシュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のｆｒｃを含むがこれに限定されないホルミルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＳｃＡＡＥ３を含むがこれに限定されないシュウ酸ＣｏＡシンテターゼ、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のｏｘｃを含むがこれに限定されないシュウ酸ＣｏＡ脱炭酸酵素、シュウ酸塩輸送体、例えば、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のシュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体ＯｘｌＴ、及び例えば、本明細書に記載のギ酸塩排出輸送体をコードする１つ以上のシュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のｆｒｃを含むがこれに限定されないホルミルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＳｃＡＡＥ３を含むがこれに限定されないシュウ酸ＣｏＡシンテターゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＹｆｄＥを含むがこれに限定されないアセチルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素、シュウ酸塩輸送体、例えば、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のシュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体ＯｘｌＴ、及び例えば、本明細書に記載のギ酸塩排出輸送体をコードする１つ以上のシュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のｆｒｃを含むがこれに限定されないホルミルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のｏｘｃを含むがこれに限定されないシュウ酸ＣｏＡ脱炭酸酵素、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＹｆｄＥを含むがこれに限定されないアセチルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素、シュウ酸塩輸送体、例えば、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のシュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体ＯｘｌＴ、及び例えば、本明細書に記載のギ酸塩排出輸送体をコードする１つ以上のシュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＳｃＡＡＥ３を含むがこれに限定されないシュウ酸ＣｏＡシンテターゼ、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のｏｘｃを含むがこれに限定されないシュウ酸ＣｏＡ脱炭酸酵素、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＹｆｄＥを含むがこれに限定されないアセチルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素、シュウ酸塩輸送体、例えば、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のシュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体ＯｘｌＴ、及び例えば、本明細書に記載のギ酸塩排出輸送体をコードする１つ以上のシュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のｆｒｃを含むがこれに限定されないホルミルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＳｃＡＡＥ３を含むがこれに限定されないシュウ酸ＣｏＡシンテターゼ、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のｏｘｃを含むがこれに限定されないシュウ酸ＣｏＡ脱炭酸酵素、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＹｆｄＥを含むがこれに限定されないアセチルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素、シュウ酸塩輸送体、例えば、Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来のシュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体ＯｘｌＴ、及び例えば、本明細書に記載のギ酸塩排出輸送体をコードする１つ以上のシュウ酸塩異化遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、栄養要求性、例えば、ΔＴｈｙＡ；カナマイシンまたはクロラムフェニコール耐性を含むがこれらに限定されない１つ以上の抗生物質耐性（複数可）をコードする１つ以上の遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）；細菌細胞からのギ酸塩排出を増加させる１つ以上の修飾；細菌細胞へのギ酸塩取り込みを減少させる１つ以上の修飾；本明細書に記載のような、例えば、シュウ酸塩排出輸送体の遺伝子の突然変異／欠失；内因性シュウ酸塩合成経路の遺伝子の突然変異／欠失、のうち１つ以上をさらに含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、シュウ酸塩異化酵素を含む２つ以上の異なる経路カセットまたはオペロンを含む。一実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子配列（複数可）は、第１プロモーターに直接的に操作可能に連結される。別の実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子配列（複数可）は、第１プロモーターに間接的に操作可能に連結される。一実施形態では、プロモーターは、自然界におけるシュウ酸塩異化酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子に操作可能に連結されない。
いくつかの実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子配列（複数可）は、構成的プロモーターの制御下で発現される。別の実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子配列（複数可）は、誘導性プロモーターの制御下で発現される。いくつかの実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子配列（複数可）は、外因的な環境条件によって直接的または間接的に誘導されるプロモーターの制御下で発現される。一実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子配列（複数可）は、低酸素環境または嫌気的条件によって直接的または間接的に誘導されるプロモーターの制御下で発現され、ここで、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子配列（複数可）の発現は、哺乳動物の腸の環境など低酸素環境または嫌気性環境下で活性化される。いくつかの実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子配列（複数可）は、炎症状態によって直接的または間接的に誘導されるプロモーターの制御下で発現される。本明細書に記載の例示的な誘導性プロモーターとしては、酸素レベル依存性プロモーター（例えば、ＦＮＲ誘導性プロモーター）、炎症または炎症反応によって誘導されるプロモーター（ＲＮＳ、ＲＯＳプロモーター）、及び腸内で自然に存在する、または存在しない場合がある（例えば、外因的に添加され得る）代謝産物、例えば、アラビノース及びテトラサイクリンによって誘導されるプロモーターなどが挙げられる。誘導性プロモーターの例としては、ＦＮＲ応答性プロモーター、ＰａｒａＣプロモーター、ＰａｒａＢＡＤプロモーター、ＰＴｅｔＲプロモーター、及びＰＬａｃＩプロモーターが挙げられるが、これらに限定されず、これらのそれぞれについては本明細書にてより詳細に記載する。誘導性プロモーターについては、以下でさらに詳細に説明する。
少なくとも１つのシュウ酸塩異化酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子は、細菌細胞内のプラスミドまたは染色体上に存在し得る。一実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子配列（複数可）は、細菌細胞内のプラスミド上に位置する。別の実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子配列（複数可）は、細菌細胞の染色体内に位置する。さらに別の実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子配列（複数可）の天然コピーは、細菌細胞の染色体内に位置し、異なる種の細菌由来の少なくとも１つのシュウ酸塩異化酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子は、細菌細胞内のプラスミド上に位置する。さらに別の実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子配列（複数可）の天然コピーは、細菌細胞内のプラスミド上に位置し、異なる種の細菌由来の少なくとも１つのシュウ酸塩異化酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子は、細菌細胞内のプラスミド上に位置する。さらに別の実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子配列（複数可）の天然コピーは、細菌細胞の染色体内に位置し、異なる種の細菌由来の少なくとも１つのシュウ酸塩異化酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子は、細菌細胞の染色体内に位置する。
いくつかの実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子配列（複数可）は、低コピープラスミド上で発現される。いくつかの実施形態では、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子配列（複数可）は、高コピープラスミド上で発現される。いくつかの実施形態では、高コピープラスミドは、少なくとも１つのシュウ酸塩異化酵素の発現を増加させるのに有用であり得、それにより、シュウ酸塩、シュウ酸、及び／またはシュウ酸ＣｏＡの異化が増加される。
いくつかの実施形態では、高コピープラスミド上で発現される少なくとも１つのシュウ酸塩異化酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子を含む本発明の組換え細菌細胞は、シュウ酸塩異種取り込み輸送体及びシュウ酸塩天然取り込み輸送体の別のコピーの不在下で低コピープラスミド上で発現される同じ遺伝子を含む組換え細菌細胞よりも、シュウ酸塩異化が増加しないか、またはシュウ酸塩及び／またはシュウ酸レベルが低下しない。さらに、シュウ酸塩輸送体（取り込み輸送体）を組換え細菌細胞に組み込むいくつかの実施形態では、シュウ酸塩異化酵素の発現の安定性を強化しながら、高シュウ酸塩異化を維持し、形質転換された細菌に対する陰性選択圧を低減するために、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子配列（複数可）を含む低コピープラスミドを組み合わせて使用することには、さらなる利点がある可能性がある。代替の実施形態では、シュウ酸塩取り込み輸送体は、高コピープラスミドと組み合わせて使用される。
いくつかの実施形態では、上述の遺伝子組換えされた細菌は、本明細書に記載の内因性遺伝子に修飾、突然変異、及び／または欠失のうち１つ以上さらに含む。
宿主－プラスミド相互依存性
いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌はまた、宿主－プラスミド相互依存性を作り出すように修飾されたプラスミドも含む。特定の実施形態では、相互依存の宿主－プラスミドのプラットフォームは、ＧｅｎｅＧｕａｒｄである（Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。いくつかの実施形態では、ＧｅｎｅＧｕａｒｄプラスミドは、（ｉ）必須の複製開始タンパク質がトランスで与えられる条件付き複製起点、（ｉｉ）ゲノム転座を介して宿主によって救済され、またリッチな培地にて使用するのに相溶性がある栄養要求性修飾、及び／または（ｉｉｉ）広域スペクトル毒素をコードする核酸配列、を含む。毒素遺伝子は、抗毒素を発現していない菌株（例えば、野生型細菌）に対してプラスミドＤＮＡ自体を不利にすることによる、プラスミド拡散に対する選択のために使用され得る。いくつかの実施形態では、ＧｅｎｅＧｕａｒｄプラスミドは、抗生物質選択を伴わずに少なくとも１００世代にわたって安定する。いくつかの実施形態では、ＧｅｎｅＧｕａｒｄプラスミドは、宿主の成長を妨害しない。ＧｅｎｅＧｕａｒｄプラスミドは、本明細書に記載の遺伝子組換えされた細菌における非意図的なプラスミド伝達を大幅に低減するために使用される。
相互依存の宿主－プラスミドのプラットフォームは、単独で、または本明細書に記載のもの（例えば、キルスイッチ、栄養要求性）など他のバイオセーフティメカニズムと組み合わされて使用されてよい。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、ＧｅｎｅＧｕａｒｄプラスミドを含む。その他の実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、ＧｅｎｅＧｕａｒｄプラスミド及び／または１つ以上のキルスイッチを含む。その他の実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、ＧｅｎｅＧｕａｒｄプラスミド及び／または１つ以上の栄養要求性を含む。さらにその他の実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、ＧｅｎｅＧｕａｒｄプラスミド、１つ以上のキルスイッチ、及び／または１つ以上の栄養要求性を含む。
いくつかの実施形態では、ベクターは、条件付き複製起点を含む。いくつかの実施形態では、条件付き複製起点は、Ｒ６ＫまたはＣｏｌＥ２－Ｐ９である。プラスミドが条件付き複製起点Ｒ６Ｋを含んでいる実施形態では、宿主細胞は、複製開始タンパク質πを発現する。プラスミドが条件付き複製起点ＣｏｌＥ２を含んでいる実施形態では、宿主細胞は、複製開始タンパク質ＲｅｐＡを発現する。複製開始タンパク質の発現は、タンパク質の所望の発現レベルが宿主細胞で実現されて、それによりプラスミドの複製が制御されるように調節可能であることは当業者によって理解されている。例えば、いくつかの実施形態では、複製開始タンパク質をコードする遺伝子の発現は、タンパク質の発現を調節するために、強い、中程度の、または弱いプロモーターの制御下に置かれる場合がある。
いくつかの実施形態では、ベクターは、宿主細胞栄養要求性、好ましくはリッチな培地の相溶性栄養要求性の相補に必要なタンパク質をコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、チミジン（ΔｔｈｙＡ）に対して栄養要求性であり、ベクターは、チミジン酸シンターゼ（ｔｈｙＡ）遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ジアミノピメリン酸（ΔｄａｐＡ）に対して栄養要求性であり、ベクターは、４－ヒドロキシ－テトラヒドロジピコリネートシンターゼ（ｄａｐＡ）遺伝子を含む。宿主細胞栄養要求性の相補に必要なタンパク質をコードする遺伝子の発現は、タンパク質の所望の発現レベルが宿主細胞で実現されるように調節可能であることは当業者によって理解されている。
いくつかの実施形態では、ベクターは、毒素遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、抗毒素の発現をコードする及び／または抗毒素の発現に必要な抗毒素遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、毒素はゼータであり、抗毒素はイプシロンである。いくつかの実施形態では、毒素はＫｉｄであり、抗毒素はＫｉｓである。好ましい実施形態では、毒素は、静菌性である。本明細書に記載の毒素／抗毒素のペアのいずれかが、本開示のベクターシステムで使用されてよい。毒素をコードする遺伝子の発現は、毒素の発現レベルが宿主細胞にとって有害となることを防ぐために抗毒素を発現する当技術分野で知られている方法を用いて調節可能であることは当業者によって理解されている。例えば、いくつかの実施形態では、毒素をコードする遺伝子は、中程度のプロモーターによって調節することができる。その他の実施形態では、毒素をコードする遺伝子は、遺伝子の発現を所望のレベルに調節するように、目的のリボソーム結合部位に隣接してクローニングすることができる（例えば、Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．（２０１５）を参照されたい）。
組み込み
いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）のいずれかは、１つ以上の組み込み部位で細菌染色体に組み込まれ得る。遺伝子（例えば、シュウ酸塩異化遺伝子、シュウ酸塩輸送体遺伝子、及び／またはシュウ酸塩結合タンパク質遺伝子）または遺伝子カセット（例えば、シュウ酸塩異化遺伝子及び／またはシュウ酸塩輸送体遺伝子を含む遺伝子カセット）の１つ以上のコピーが、細菌染色体に組み込まれてよい。染色体に組み込まれた遺伝子または遺伝子カセットの複数のコピーを有することにより、ペイロード、例えば、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）及び／またはシュウ酸塩輸送体遺伝子（複数可）、ならびに遺伝子カセットのその他の酵素のより多い産生が可能になり、さらに発現のレベルの微調整も可能になる。あるいは、キルスイッチ回路のいずれかなど、本明細書に記載の異なる回路に加えて、治療用遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）は、複数の異なる機能を行うように１つ以上の異なる組み込み部位で細菌染色体に組み込むことができる。
分泌
いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、細菌細胞質からシュウ酸塩異化酵素を分泌する能力がある天然の分泌メカニズム（例えば、グラム陽性菌）または非天然の分泌メカニズム（例えば、グラム陰性菌）をさらに含む。多くの細菌は、細菌細胞エンベロープを越えて基質を輸送する精巧な分泌系を進化させている。小分子、タンパク質、及びＤＮＡなどの基質は、細胞外空間または周辺質（例えば、腸管内腔またはその他の空間）に放出されるか、標的細胞に注入されるか、または細菌膜に結合する場合がある。
グラム陰性菌では、分泌機構は、内膜及び外膜のうち１つまたは両方にまたがることがある。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、非天然の二重膜貫通分泌系をさらに含む。二重膜貫通分泌系としては、Ｉ型分泌系（Ｔ１ＳＳ）、ＩＩ型分泌系（Ｔ２ＳＳ）、ＩＩＩ型分泌系（Ｔ３ＳＳ）、ＩＶ型分泌系（Ｔ４ＳＳ）、ＶＩ型分泌系（Ｔ６ＳＳ）、及び多剤排出ポンプの耐性結節形成分裂（ＲＮＤ）ファミリーが挙げられるが、これらに限定されない（Ｐｕｇｓｌｅｙ １９９３；Ｇｅｒｌａｃｈ ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｃｏｌｌｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｃｏｓｔａ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｒｅｅｖｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１５；ＷＯ２０１４１３８３２４Ａ１を参照されたく、これらは本明細書に引用される）。グラム陰性様細胞エンベロープを有するマイコバクテリアもまた、ＶＩＩ型分泌系（Ｔ７ＳＳ）をコードしている（Ｓｔａｎｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，２００３）。Ｔ２ＳＳを除く二重膜貫通分泌系は、一般に細菌細胞質から細胞外空間または標的細胞に基質を直接輸送する。対照的に、外膜のみにまたがるＴ２ＳＳ及び分泌系は、２ステップメカニズムを用いる場合があり、この際、基質はまず内膜貫通輸送体によって周辺質に運搬され、次に、外膜に移されるか、または細胞外空間に分泌される。外膜貫通分泌系としては、Ｖ型分泌または自動輸送体系（Ｔ５ＳＳ）、カーリー分泌系、及び線毛構築のシャペロン－アッシャー経路が挙げられるが、これらに限定されない（Ｓａｉｅｒ，２００６；Ｃｏｓｔａ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子組換えされた細菌は、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｅ． ｃｏｌｉ、Ｂｉｖｒｉｏ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ由来のＩＩＩ型またはＩＩＩ型様分泌系（Ｔ３ＳＳ）をさらに含む。Ｔ３ＳＳは、針状複合体を通して細菌の細胞質から宿主の細胞質にタンパク質を輸送することができる。Ｔ３ＳＳは、細菌細胞質から分子を分泌するが、分子を宿主細胞質に注入しないように修飾され得る。したがって、分子は、腸管内腔またはその他の細胞外空間に分泌される。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、上記の修飾されたＴ３ＳＳを含み、かつ細菌細胞質からシュウ酸塩異化酵素を分泌することができる。いくつかの実施形態では、異種タンパク質またはペプチド、例えば、シュウ酸塩異化酵素などの分泌される分子は、細菌からのシュウ酸塩異化酵素の分泌を可能にするＩＩＩ型分泌配列を含む。
いくつかの実施形態では、鞭毛ＩＩＩ型分泌経路が、目的の分子、例えば、シュウ酸塩異化酵素を分泌するために用いられる。いくつかの実施形態では、不完全な鞭毛が、天然の鞭毛成分のＮ末端鞭毛分泌シグナルにペプチドを組換え的に融合させることによって、目的の治療用ペプチドを分泌するために用いられる。このようにして、細胞内で発現されるキメラペプチドは、内膜または外膜はまたいで周囲の宿主環境へと動員される。
いくつかの実施形態では、Ｖ型自動輸送体分泌系が、目的の分子、例えば、治療用ペプチドを分泌するために使用される。比較的大きなタンパク質フラックスを処理する機構及び能力が単純であることから、Ｖ型分泌系は、組換えタンパク質の細胞外産生にとって魅力的である。いくつかの実施形態では、治療用ペプチド（ｓｔａｒ）がＮ末端分泌シグナル、リンカー、及び自動輸送体のβドメインに融合される場合がある。Ｎ末端シグナル配列は、タンパク質を内膜をまたいで周辺質に移動させ、続いてシグナル配列の次の切断を行うＳｅｃＡ－ＹＥＧ機構にタンパク質を向ける。βドメインがＢａｍ複合体（βバレルアセンブリ機構）に動員され、そこでβドメインは折り畳まれ、βバレル構造体として外膜に挿入される。治療用ペプチドは、リンカー配列の前にあるβバレル構造体の中空孔を通り抜ける。細胞外環境に曝されると、治療用ペプチドは、自己触媒切断（Ｂａｍ複合体の左側）によって、またはリンカー内の相補的タンパク質分解酵素切断部位への膜結合ペプチダーゼ（黒色のはさみ；Ｂａｍ複合体の右側）の標的化によってリンカー系から遊離され得る。このように、いくつかの実施形態では、異種タンパク質またはペプチド、例えば、シュウ酸塩異化酵素などの分泌される分子は、細菌からの分子の分泌を可能にするように、Ｎ末端分泌シグナル、リンカー、及び自動輸送体のβドメインを含む。
いくつかの実施形態では、溶血素ベースの分泌系が、目的の分子、例えば、治療用ペプチドを分泌ために使用される。Ｉ型分泌系は、細胞質から細胞外空間へとそれらのパッセンジャーペプチドを直接輸送することで、他の分泌型の２ステッププロセスを不要にするといった利点を有する。尿路病原性Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのα溶血素（ＨｌｙＡ）は、ＡＴＰ結合カセット輸送体であるＨｌｙＢ、膜融合タンパク質であるＨｌｙＤ、及び外膜タンパク質であるＴｏｌＣによって分泌される。これらの３つのタンパク質の集合体は、内膜及び外膜の両方を貫通するチャネルを形成する。自然界では、このチャネルはＨｌｙＡを分泌するのに用いられるが、本開示の治療用ペプチドを分泌させるために、ＨｌｙＡの分泌シグナル含有Ｃ末端部分を治療用ペプチド（ｓｔａｒ）のＣ末端部分に融合させ、このペプチドの分泌を媒介させる。
代替の実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、非天然の単一膜貫通分泌系をさらに含む。単一膜貫通輸送体は、分泌系の構成要素として機能するか、または独立して基質を排出する場合がある。このような輸送体としては、ＡＴＰ結合カセットトランスロカーゼ、鞭毛／病原性関連トランスロカーゼ、複合体化関連トランスロカーゼ、一般的な分泌系（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＳｅｃＹＥＧ複合体）、マイコバクテリア及びいくつかのタイプのグラム陽性菌（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｄｏｎｉｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）における補助的な分泌系、ならびにツインアルギニン透過（ＴＡＴ）系が挙げられるが、これらに限定されない（Ｓａｉｅｒ， ２００６；Ｒｉｇｅｌ ａｎｄ Ｂｒａｕｎｓｔｅｉｎ，２００８；Ａｌｂｉｎｉａｋ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。一般的な分泌系及びＴＡＴ系の両方は、切断可能なＮ末端シグナルペプチドを含む基質を周辺質に排出できることが知られており、バイオ医薬品製造に関連してこれまでに調査されている。ただし、ＴＡＴ系は、折り畳まれた基質を輸送し、ゆえに潜在的な早すぎるまたは不正確な折り畳みを排除することができるという点で、特別な利点を有する場合がある。特定の実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、ＴＡＴまたはＴＡＴ様系を含み、かつ細菌細胞質からシュウ酸塩異化酵素を分泌することができる。当業者であれば、本明細書にて開示する分泌系が細菌の異なる種、菌株、及び亜型において機能するように修飾され、及び／または異なるペイロードを送達するように適合され得ることを理解されるであろう。
タンパク質、例えば、治療用ポリペプチドを細胞外空間に輸送するために、ポリペプチドは、細胞内で最初に翻訳され、内膜を越えて動員され、最終的に外膜を越えて動員される必要がある。多くのエフェクタータンパク質（例えば、治療用ポリペプチド）、特に真核生物由来のものは、三次構造及び四次構造を安定化するジスルフィド結合を含んでいる。これらの結合は、周辺質シャペロンの助けを借りて酸化周辺質隔壁で正確に形成することができるが、ポリペプチドを外膜を越えて輸送するためには、ジスルフィド結合を還元して、タンパク質を再び変性させる必要がある。
グラム陰性菌、特にジスルフィド結合を必要とする細菌において折り畳まれたタンパク質を適切に分泌する１つの方法は、不安定な外膜を有する細菌の周辺質を標的にする方法である。この方法によって、タンパク質は、酸化環境に動員されて、適切に折り畳まれる。組織化された細胞外分泌系とは対照的に、タンパク質は、その後、膜の漏出によって適切に折り畳まれた状態で細胞周辺腔から抜け出すことができる。したがって、これらの「漏出性」グラム陰性突然変異は、生物活性があり、適切にジスルフィド結合したポリペプチドを分泌することができる。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、「漏出性」外膜または不安定な外膜を有する。細菌の外膜を不安定化して漏出を誘発することは、例えば、ｌｐｐ、ｏｍｐＣ、ｏｍｐＡ、ｏｍｐＦ、ｔｏｌＡ、ｔｏｌＢ、ｐａｌ、ｄｅｇＳ、ｄｅｇＰ、及びｎｌｐｌを含む、剛性ペプチドグリカン骨格に外膜を繋ぎとめることに関与する遺伝子を除去または突然変異誘発することによって達成され得る。Ｌｐｐは、細菌細胞のなかで最も豊富なポリペプチドであり、細胞あたり約５００，０００のコピーで存在し、ペプチドグリカンへの細菌細胞壁の主要な「ステープル」として機能する。（Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．，Ｋａｈｎｅ，Ｄ．＆ Ｗａｌｋｅｒ，Ｓ． Ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｅｌｌ ｅｎｖｅｌｏｐｅ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ Ｂｉｏｌ ２，ａ０００４１４ （２０１０））。ＴｏｌＡ－ＰＡＬ及びＯｍｐＡ複合体は、Ｌｐｐと同様に機能し、漏出性表現型を生成する他の欠失標的である。さらに、周辺質タンパク質分解酵素の活性が失われる場合に、漏出性表現型が観察されている。周辺質にはタンパク質が非常に高密度で詰まっているため、タンパク質代謝回転を容易にするいくつかの周辺質タンパク質をコードしている。ｄｅｇＳ、ｄｅｇＰまたはｎｌｐＩなどの周辺質タンパク質分解酵素の除去により、周辺質タンパク質の過度の増加の促進による漏出性表現型を誘導し得る。また、タンパク質分解酵素の突然変異により、これらのタンパク質分解酵素による標的分解を防ぐことによってエフェクターポリペプチドが保存され得る。さらに、これらの突然変異の組み合わせにより、細胞生存率を大きく犠牲にすることなく細胞の漏出性表現型を相乗的に高める可能性がある。したがって、いくつかの実施形態では、遺伝子改変細菌は、１つ以上の欠失または突然変異された膜遺伝子を有する。いくつかの実施形態では、遺伝子改変細菌は、欠失または突然変異されたｌｐｐ遺伝子を有する。いくつかの実施形態では、遺伝子改変細菌は、ｏｍｐＡ、ｏｍｐＡ、及びｏｍｐＦ遺伝子から選択される１つ以上の欠失または突然変異された遺伝子（複数可）を有する。いくつかの実施形態では、遺伝子改変細菌は、ｔｏｌＡ、ｔｏｌＢ、及びｐａｌ遺伝子から選択される１つ以上の欠失または突然変異された遺伝子（複数可）を有する。いくつかの実施形態では、遺伝子改変細菌は、１つ以上の欠失または突然変異された周辺質タンパク質分解酵素遺伝子を有する。いくつかの実施形態では、遺伝子改変細菌は、ｄｅｇＳ、ｄｅｇＰ、及びｎｌｐｌから選択される１つ以上の欠失または突然変異された周辺質タンパク質分解酵素遺伝子を有する。いくつかの実施形態では、遺伝子改変細菌は、ｌｐｐ、ｏｍｐＡ、ｏｍｐＡ、ｏｍｐＦ、ｔｏｌＡ、ｔｏｌＢ、ｐａｌ、ｄｅｇＳ、ｄｅｇＰ、及びｎｌｐｌ遺伝子から選択される１つ以上の欠失または突然変異された遺伝子（複数可）を有する。
細胞生存率の乱れを最小限に抑えるために、誘導性プロモーターの制御下で、例えば、ｌｐｐ、ｏｍｐＡ、ｏｍｐＡ、ｏｍｐＦ、ｔｏｌＡ、ｔｏｌＢ、ｐａｌ、ｄｅｇＳ、ｄｅｇＰ、及びｎｌｐｌから選択される、１つ以上の膜または周辺質タンパク質分解酵素遺伝子を配置することによって、漏出性表現型を誘導可能にすることができる。例えば、ｌｐｐ、他の細胞壁安定性タンパク質、または周辺質タンパク質分解酵素の発現は、治療用ポリペプチドが送達（分泌）される必要がある状況では抑制され得る。例えば、誘導状況下で、転写抑制因子タンパク質または設計されたアンチセンスＲＮＡを発現させることができ、これにより、標的の膜または周辺質タンパク質分解酵素遺伝子の転写または翻訳が減少される。逆に、特定のペプチドの過剰発現により、不安定な表現型、例えば、コリシン、またはＴｏｌＡの第３位相幾何学的ドメインの過剰発現をもたらすことができ、これにより、ペプチド過剰発現が、治療用ポリペプチドが送達（分泌）される必要がある状況で誘導され得る。これらの類の戦略により、バイオマス生産から脆弱な漏出性表現型が切り離される。したがって、いくつかの実施形態では、遺伝子改変細菌は、誘導性プロモーターの制御下にある、１つ以上の膜及び／または周辺質タンパク質分解酵素遺伝子を有する。
以下の各表は、グラム陽性菌及びグラム陰性菌の分泌系を一覧にしたものである。
Figure 2023511282000013
Figure 2023511282000014
Figure 2023511282000015
Figure 2023511282000016
グラム陽性菌及びグラム陰性菌の上記の表は、遺伝子改変細菌からシュウ酸塩異化酵素（複数可）及び他のポリペプチドを分泌するために使用することができる分泌系を一覧にしたものであり、これらは、Ｍｉｌｔｏｎ Ｈ．Ｓａｉｅｒ，Ｊｒ．Ｍｉｃｒｏｂｅ／Ｖｏｌｕｍｅ１，Ｎｕｍｂｅｒ９，２００６“Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｉｎ Ｇｒａｍ－Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉａ Ｇｒａｍ－ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａ ｐｏｓｓｅｓｓ ｍａｎｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ－ｍｅｍｂｒａｎｅ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍｓ ｔｈａｔ ａｐｐａｒｅｎｔｌｙ ｅｖｏｌｖｅｄ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ”にて考察されており、その全体が参照として本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のシュウ酸塩異化酵素が分泌される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のシュウ酸塩異化酵素は、分泌効率、タンパク質分解酵素に対する感受性の低下、安定性、及び／または半減期を改善するようにさらに修飾される。いくつかの実施形態では、例えば、Ｆｒｃ（Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来）などのホルミルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素は、単独で、または他のシュウ酸塩異化酵素、例えば、ＳｃＡＡＥ３（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来）などのシュウ酸ＣｏＡシンテターゼ、例えば、Ｏｘｃ（Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来）などのシュウ酸ＣｏＡ脱炭酸酵素、及び／または例えば、ＹｆｄＥ（Ｅ．ｃｏｌｉ由来）などのアセチルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素、と組み合わせて分泌される。いくつかの実施形態では、例えば、ＳｃＡＡＥ３（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来）などのシュウ酸ＣｏＡシンテターゼは、単独で、または他のシュウ酸塩異化酵素、例えば、Ｆｒｃ（Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来）などのホルミルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素、例えば、Ｏｘｃ（Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来）などのシュウ酸ＣｏＡ脱炭酸酵素、及び／または例えば、ＹｆｄＥ（Ｅ．ｃｏｌｉ由来）などのアセチルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素、と組み合わせて分泌される。いくつかの実施形態では、例えば、Ｏｘｃ（Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来）などのシュウ酸ＣｏＡ脱炭酸酵素は、単独で、または他のシュウ酸塩異化酵素、例えば、ＳｃＡＡＥ３（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来）などのシュウ酸ＣｏＡシンテターゼ、例えば、Ｆｒｃ（Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来）などのホルミルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素、及び／または例えば、ＹｆｄＥ（Ｅ．ｃｏｌｉ由来）などのアセチルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素、と組み合わせて分泌される。いくつかの実施形態では、例えば、ＹｆｄＥ（Ｅ．ｃｏｌｉ由来）などのアセチルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素は、単独で、または他のシュウ酸塩異化酵素、例えば、Ｏｘｃ（Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来）などのシュウ酸ＣｏＡ脱炭酸酵素、例えば、ＳｃＡＡＥ３（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来）などのシュウ酸ＣｏＡシンテターゼ、及び／または例えば、Ｆｒｃ（Ｏ．ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ由来）などのホルミルＣｏＡ：シュウ酸塩ＣｏＡ転移酵素、と組み合わせて分泌される。
いくつかの実施形態では、アラニングリオキシル酸アミノ基転移酵素（ＡＧＴ、ＡＧＸＴ遺伝子によってコードされる、例えば、ヒト型）、グリオキシル酸／ヒドロキシピルビン酸還元酵素（ＧＲＨＰＲ；グリオキシル酸還元酵素（ＧＲ）を有する酵素、ヒドロキシピルビン酸還元酵素（ＨＰＲ）、及びＤ－グリセリン酸脱水素酵素（ＤＧＤＨ）活性、例えば、ヒト型）、及び／または４－ヒドロキシ２－オキソグルタル酸アルドラーゼ（例えば、ヒトのＨＯＧＡ１遺伝子によってコードされる）から選択される１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）は、単独でまたは種々の組み合わせで、あるいは本明細書に記載の他のシュウ酸塩異化酵素と組み合わせて分泌される。
医薬組成物及び製剤
本発明の遺伝子組換えされた微生物を含む医薬組成物を使用して、対象においてシュウ酸塩が有害となる疾患または障害を治療、管理、緩和、及び／または予防することができる。別の実施形態では、シュウ酸塩が有害となる障害とは、２４時間あたり４０ｍｇを超える１日尿中シュウ酸塩排泄量をもたらす障害である。本発明の医薬組成物は、１つ以上の遺伝子組換えされた細菌、及び／または１つ以上の遺伝子組換えされたウイルスを、単独でまたは予防剤、治療剤、及び／または薬学的に許容される担体と組み合わせて含んで提供される。
特定の実施形態では、医薬組成物は、例えば、少なくとも１つのシュウ酸塩異化酵素、シュウ酸塩取り込み輸送体／輸送体、ギ酸塩排出輸送体、及び／またはシュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体、栄養要求性、キルスイッチ、ノックアウトなどの発現から選択される本明細書に記載の遺伝子修飾のうち１つ以上を含むように遺伝子改変された細菌の１つの種、菌株、または亜型を含む。代替の実施形態では、医薬組成物は、例えば、１つのシュウ酸塩異化酵素、シュウ酸塩取り込み輸送体／輸送体、ギ酸塩排出輸送体、及び／またはシュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体、栄養要求性、キルスイッチ、ノックアウトなど、本明細書に記載の遺伝子修飾を含むようにそれぞれが遺伝子改変された細菌の２つ以上の種、菌株、及び／または亜型を含む。
本開示の医薬組成物は、薬学的使用向けの組成物への活性成分の加工を促進する賦形剤及び補助剤を含む１つ以上の生理学的に許容される担体を使用して、従来の方式で製剤化され得る。医薬組成物を製剤化する方法は、当技術分野において既知である（例えば、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，”Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡを参照されたい）。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、錠剤化、凍結乾燥、直接圧縮、従来の混合、溶解、顆粒化、水簸、乳化、カプセル化、封入、または噴霧乾燥に供して、錠剤、顆粒、ナノ粒子、ナノカプセル、マイクロカプセル、マイクロ錠剤、ペレット、もしくは粉末を形成し、これらは、腸溶的にコーティングしてもよいし、腸溶的にコーティングしなくてもよい。適切な製剤化は、投与経路に依存する。
遺伝子組換えされた微生物は、任意の好適な剤形（例えば、経口投与向けの液剤、カプセル剤、サシェ、ハードカプセル、ソフトカプセル、錠剤、腸溶性コーティング錠剤、懸濁粉末、顆粒、またはマトリックス徐放性形成物）で、及び任意の好適なタイプの投与（例えば、経口、局所、注射用、静脈内、皮下、即時放出、脈動放出、遅延放出、または持続放出）向けに、医薬組成物へと製剤化され得る。遺伝子組換えされた細菌の好適な投薬量は、約１０４～１０１２細菌の範囲であってよい。組成物は、１日に、１週間に、または１月に１回以上投与されてよい。組成物は、食事の前、最中、または後に投与されてよい。一実施形態では、医薬組成物は、対象が食事をとる前に投与される。一実施形態では、医薬組成物は、食事と同時に投与される。一実施形態では、医薬組成物は、対象が食事をとった後に投与される。
遺伝子組換えされた細菌または遺伝子組換えされたウイルスは、１つ以上の薬学的に許容される担体、増粘剤、希釈剤、緩衝液、緩衝剤、表面活性剤、中性もしくはカチオン性脂質、脂質複合体、リポソーム、浸透増強剤、担体化合物、及びその他の薬学的に許容される担体または薬剤を含む医薬組成物へと製剤化される。例えば、医薬組成物は、重炭酸カルシウム、重炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、様々な糖及びデンプンの類、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、ポリエチレングリコール、及び、例えばポリソルベート２０などの界面活性剤の追加を含み得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子組換えされた細菌は、（例えば、胃などの酸性細胞環境を緩衝するために）重炭酸ナトリウムの溶液中で、例えば、重炭酸ナトリウムの１モル溶液中で製剤化され得る。遺伝子組換えされた細菌は、中性または塩の形態として投与及び製剤化されてよい。薬学的に許容される塩には、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などから誘導される、アニオンの形態のもの、及びナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２－エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどから誘導される、カチオンの形態のものが含まれる。
遺伝子組換えされた微生物は、例えば、点滴または注射によって静脈内投与されてよい。
本開示の遺伝子組換えされた微生物は、髄腔内投与されてよい。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子組換えされた微生物は、経口投与される場合がある。本明細書にて開示する遺伝子組換えされた微生物は、局所投与されてよく、かつ軟膏、クリーム、経皮パッチ、ローション、ゲル、シャンプー、スプレー、エアロゾル、溶液、エマルション、または当業者に良く知られている他の形態で製剤化される。例えば、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，”Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡを参照されたい。一実施形態では、噴霧できない局所用剤形の場合、局所適用と相溶性があり、かつ水よりも高い動的粘度を有する担体または１つ以上の賦形剤を含む粘性体から半固体または固体形態が使用される。適切な製剤としては、溶液、懸濁液、エマルション、クリーム、軟膏、粉末、塗布薬、軟膏剤などが挙げられるが、これらに限定されず、これらは、滅菌されるか、または例えば、浸透圧などの種々の特性に影響を与える補助的な薬剤（例えば、保存剤、安定剤、湿潤剤、緩衝剤、または塩類）と混合されてよい。他の好適な局所用剤形としては、噴霧できるエアロゾル調製物が挙げられ、この際、固形物または液体不活性担体と組み合わされる活性成分は、加圧揮発性物質（例えば、フレオンなどのガス状噴霧剤）と組み合わせてた混合物で、または圧縮ボトルに包装される。保湿剤または潤湿剤もまた、医薬組成物及び剤形に加えることができる。そのような追加の成分の例は、当該技術分野において周知である。一実施形態では、本発明の組換え細菌を含む医薬組成物は、衛生用製品として製剤化され得る。例えば、衛生用製品は、抗菌製剤、または発酵ブロスなどの発酵製品などであってもよい。衛生用製品は、例えば、シャンプー、コンディショナー、クリーム、ペースト類、ローション、及びリップバームであってもよい。
本明細書にて開示する遺伝子組換えされた微生物は、経口投与されてよく、かつ錠剤、丸剤、糖剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、懸濁剤などとして製剤化される。経口使用向けの薬理学的組成物は、錠剤または糖衣コアを得るために、固形の賦形剤を用いて、所望する場合補助剤を加えた後に、必要に応じて得られた混合物を研磨し、顆粒の混合物を加工して作ることができる。好適な賦形剤としては、ラクトース、ショ糖、マンニトール、またはソルビトールを含む糖などのフィラー；トウモロコシデンプン、小麦デンプン、米デンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボメチルセルロースなどのセルロース組成物；及び／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの生理学的に許容されるポリマー類が挙げられるが、これらに限定されない。架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸、またはその塩であるアルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤も、添加されてよい。
錠剤またはカプセル剤は、従来の方法によって、薬学的に許容される賦形剤、例えば、結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、ショ糖、グルコース、ソルビトール、デンプン、ゴム、カオリン、及びトラガカント）；フィラー（例えば、ラクトース、微結晶セルロース、またはリン酸水素カルシウム）；潤滑剤（例えば、カルシウム、アルミニウム、亜鉛、ステアリン酸、ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、デンプン、安息香酸ナトリウム、Ｌ－ロイシン、ステアリン酸マグネシウム、タルク、またはシリカ）；崩壊剤（例えば、デンプン、ジャガイモデンプン、デンプングリコール酸ナトリウム、糖、セルロース誘導体、シリカ粉末）、あるいは湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）を用いて調製することができる。錠剤は、当該技術分野において周知の方法でコーティングされ得る。コーティングシェルも検討され得、一般的な薄膜としては、ポリラクチド、ポリグリコール酸、ポリ無水物、その他の生分解性ポリマー、アルギン酸－ポリリジン－アルギン酸（ＡＰＡ）、アルギン酸－ポリメチレン－ｃｏ－グアニジン－アルギン酸（Ａ－ＰＭＣＧ－Ａ）、アクリル酸ヒドロキシメチル－メタクリル酸メチル（ＨＥＭＡ－ＭＭＡ）、多層ＨＥＭＡ－ＭＭＡ－ＭＡＡ、ポリアクリロニトリルビニルクロライド（ＰＡＮ－ＰＶＣ）、アクリロニトリル／メタリルスルホン酸ナトリウム（ＡＮ－６９）、ポリエチレングリコール／ポリペンタメチルシクロペンタシロキサン／ポリジメチルシロキサン（ＰＥＧ／ＰＤ５／ＰＤＭＳ）、ポリＮ，Ｎ－ジメチルアクリルアミド（ＰＤＭＡＡｍ）、ケイ酸含有カプセル類、硫酸セルロース／アルギン酸ナトリウム／ポリメチレン－ｃｏ－グアニジン（ＣＳ／Ａ／ＰＭＣＧ）、酢酸フタル酸セルロース、アルギン酸カルシウム、ｋ－カラギーナン－イナゴマメゴムゲルビーズ、ゲラン－キサンタンビーズ、ポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）、カラギーナン、デンプンポリ無水物類、デンプンポリメタクリレート、ポリアミノ酸、及び腸溶性コーティングポリマー、が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた微生物は、腸、または腸の特定の領域、例えば、大腸への放出向けに腸溶的にコーティングされる。胃から結腸までの典型的なｐＨプロファイルは、約１～４（胃）、５．５～６（十二指腸）、７．３～８．０（回腸）、及び５．５～６．５（結腸）である。一部の疾患では、ｐＨプロファイルは変更される場合がある。いくつかの実施形態では、コーティングは、放出部位を特定するために、特定のｐＨ環境で分解される。いくつかの実施形態では、少なくとも２種のコーティングが使用される。いくつかの実施形態では、外側コーティング及び内側コーティングは、異なるｐＨレベルで分解される。
いくつかの実施形態では、腸溶性コーティング材料は、１つ以上のコーティング層（例えば、外側、内側、及び／または中間コーティング層）の状態で使用される場合がある。腸溶性コーティングポリマーは、低ｐＨで非イオン化を維持するため、不溶性のままである。しかし、消化管内のｐＨが上昇すると、酸性官能基がイオン化するようになり、ポリマーが膨潤するか、または腸液に溶けるようになる。
腸溶性コーティングに使用される材料としては、酢酸フタル酸セルロース（ＣＡＰ）、ポリ（メタクリル酸－ｃｏ－メタクリル酸メチル）、酢酸トリメリット酸セルロース（ＣＡＴ）、ポリ（酢酸フタル酸ビニル）（ＰＶＡＰ）、ならびにフタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣＰ）、脂肪酸、ワックス、シェラック（アルウリチン酸のエステル）、プラスチック及び植物繊維、が挙げられる。加えて、ゼイン、アクアゼイン（アルコールを含有しない水溶性ゼイン製剤）、アミロースデンプン及びデンプン誘導体、ならびにデキストリン（例えば、マルトデキストリン）もまた使用される。他の既知の腸溶性コーティングとしては、エチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、酢酸フタル酸アミロース、酢酸フタル酸セルロース、フタル酸ヒドロキシルプロピルメチルセルロース、アクリル酸エチル、及びメタクリル酸メチルが挙げられる。
コーティングポリマーはまた、フタル酸誘導体、ＣＡＴ、ＨＰＭＣＡＳ、ポリアクリル酸誘導体、アクリル酸及び少なくとも１つのアクリル酸エステルを含むコポリマー、Ｅｕｄｒａｇｉｔ（商標）Ｓ（ポリ（メタクリル酸、メタクリル酸メチル）１：２）；Ｅｕｄｒａｇｉｔ Ｌ１００（商標）Ｓ（ポリ（メタクリル酸、メタクリル酸メチル）１：１）；Ｅｕｄｒａｇｉｔ Ｌ３０Ｄ（商標）（ポリ（メタクリル酸、アクリル酸エチル）１：１）、及び Ｅｕｄｒａｇｉｔ Ｌ１００－５５（ポリ（メタクリル酸、アクリル酸エチル）１：１）（Ｅｕｄｒａｇｉｔ（商標）Ｌは、メタクリル酸及びメタクリル酸メチルエステルから合成されたアニオン性ポリマーである）、アクリル酸とブレンドされたポリメタクリル酸メチル及びアクリル酸エステル共重合体、アルギン酸、アルギン酸アンモニア、ナトリウム、カリウム、マグネシウムもしくはアルギン酸カルシウム、酢酸ビニルコポリマー、ポリ酢酸ビニル３０Ｄ（水中で３０％分散）、ポリ（アクリル酸ジメチルアミノエチル）を含む中性メタクリル酸エステル（Ｅｕｄｒａｇｉｔ Ｅ（商標））、メタクリル酸トリメチルアンモニアエチル塩化物とのメタクリル酸メチル及びアクリル酸エチルのコポリマー、メタクリル酸メチル及びアクリル酸エチルのコポリマー、ゼイン、シェラック、ゴム、または多糖類、あるいはこれらの組み合わせ、のうち１つ以上を含み得る。
コーティング層はまた、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシプロピルエチルセルロース（ＨＰＥＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、ヒドロキシプロピルエチルセルロース（ＨＰＥＣ）、ヒドロキシメチルプロピルセルロース（ＨＭＰＣ）、エチルヒドロキシエチルセルロース（ＥＨＥＣ）（エツロース）、ヒドロキシエチルメチルセルロース（ＨＥＭＣ）、ヒドロキシメチルエチルセルロース（ＨＭＥＣ）、プロピルヒドロキシエチルセルロース（ＰＨＥＣ）、メチルヒドロキシエチルセルロース（ＭＨＥＣ）、疎水変性ヒドロキシエチルセルロース（ＮＥＸＴＯＮ）、カルボキシメチルヒドロキシエチルセルロース（ＣＭＨＥＣ）、メチルセルロース、エチルセルロース、水溶性酢酸ビニルコポリマー、ゴム、アルギン酸などの多糖類、及びアルギン酸アンモニア、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カリウムなどのアルギン酸塩類、炭水化物のフタル酸酸、酢酸フタル酸アミロース、酢酸フタル酸セルロース（ＣＡＰ）、フタル酸セルロースエステル、フタル酸セルロースエーテル、フタル酸ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣＰ）、フタル酸ヒドロキシプロピルエチルセルロース（ＨＰＥＣＰ）、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣＰ）、酢酸コハク酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣＡＳ）を含有するポリマー類を含み得る。
経口投与向けの液体調製物は、溶液、シロップ、懸濁液、または使用前に水またはその他の好適なビヒクルを用いて液体調製される乾燥生成物の形態をとってもよい。このような液体調製物は、従来の方法によって、薬学的に許容される薬剤、例えば、沈殿防止剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、または水素添加食用脂肪）；乳化剤（例えば、レシチンもしくはアカシア）；非水性ビヒクル（例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、もしくは分留植物油）；及び保存剤（例えば、メチルもしくはプロピル－ｐ－ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸）を用いて調製することができる。調製物はまた、必要に応じて、緩衝塩、着香剤、着色剤、及び甘味剤を含有していてもよい。経口投与向けの調製物は、本明細書に記載の遺伝子組換えされた微生物の徐放、制御放出、または持続放出向けに適切に製剤化され得る。
一実施形態では、本開示の遺伝子組換えされた微生物は、小児対象への投与に適した組成物の状態で製剤化され得る。当該技術分野において良く知られているように、胃内容物排出速度、ｐＨ、胃腸透過性の違いなど、多くの面で小児は成人とは異なる（Ｉｖａｎｏｖｓｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ，１３４（２）：３６１－３７２，２０１４））。さらに、投与経路及び味覚属性などの小児用製剤の容認性及び選好は、許容可能な小児服薬遵守を達成することに関して不可欠なものである。したがって、一実施形態では、小児対象への投与に適した組成物には、飲み込みやすいか、もしくは溶解可能な剤形、またはより味のよい組成物、例えば、風味、甘味、もしくは味覚遮断物を加えた組成物が含まれる場合がある。一実施形態では、小児対象への投与に適した組成物は、成人への投与にも適している場合がある。
一実施形態では、小児対象への投与に適した組成物には、溶液、シロップ、懸濁液、エリキシル、懸濁液もしくは溶液として溶液調製される粉末、分散性／発泡性錠剤、咀しゃく錠、グミキャンディ、ロリポップ、フリーザーポップ、トローチ、チューインガム、経口薄片、経口崩壊錠、サシェ、ソフトゼラチンカプセル、散在経口粉末、または顆粒が含まれ得る。一実施形態では、組成物は、キャンディの弾性、所望の噛みごたえ、及びより長い保存寿命を与えるゼラチンベースから作られるグミキャンディである。いくつかの実施形態では、グミキャンディはまた、甘味または風味も含む場合がある。
一実施形態では、小児対象への投与に適した組成物は、風味を含む場合がある。本明細書で使用される場合、「風味」は、製剤に独特の味及び香りを与える物質（液体または固形物）である。風味はまた、製剤の美味しさの改善に役立つ。風味としては、ストロベリー、バニラ、レモン、グレープ、バブルガム、及びチェリーが挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態では、遺伝子組換えされた微生物は、例えば、不活性希釈剤または吸収可能な食用担体と共に経口投与されてもよい。化合物はまた、ハードまたはソフトシェルゼラチンカプセルに封入されるか、錠剤に圧縮されるか、または対象の食事に直接混合されてもよい。経口治療投与の場合、化合物は、賦形剤と混合され、摂取可能な錠剤、バッカル錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウェハースなどの形態で使用され得る。非経口投与以外の方法で化合物を投与するためには、その不活性化を阻止する物質で化合物をコーティングするか、またはその物質と共に化合物を同時投与する必要がある場合がある。
別の実施形態では、本発明の組換え細菌を含む医薬組成物は、食用に適した製品、例えば、食品である場合がある。一実施形態では、食品は、牛乳、濃縮乳、発酵乳（ヨーグルト、サワーミルク、冷凍ヨーグルト、乳酸菌発酵飲料）、粉ミルク、アイスクリーム、クリームチーズ、ドライチーズ、豆乳、発酵豆乳、野菜フルーツジュース、フルーツジュース、スポーツドリンク、菓子、キャンディ、幼児用食品（幼児用ケーキなど）、栄養食品、動物の飼料、または栄養補助食品である。一実施形態では、食品は、発酵乳製品などの発酵食品である。一実施形態では、発酵乳製品は、ヨーグルトである。別の実施形態では、発酵乳製品は、チーズ、牛乳、クリーム、アイスクリーム、ミルクセーキ、またはケフィアである。別の実施形態では、本発明の組換え細菌は、プロバイオティックとして機能することを目的とした他の生細菌細胞を含有する調製物に組み合わされる。別の実施形態では、食品は、飲料である。一実施形態では、飲料は、フルーツジュースベースの飲料か、または植物もしくは薬草抽出物を含有する飲料である。別の実施形態では、食品は、ゼリーまたはプディングである。本発明の組換え細菌の投与に適した他の食品は、当該技術分野において周知である。例えば、Ｕ．Ｓ．２０１５／０３５９８９４及びＵＳ２０１５／０２３８５４５を参照されたく、これらのそれぞれの全内容は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。さらに別の実施形態では、本発明の医薬組成物は、パン、ヨーグルト、またはチーズなどの食品に注入されるか、噴霧されるか、または振りかけられる。
いくつかの実施形態では、組成物は、腸溶的にコーティングされるか、または腸溶的にコーティングされていないナノ粒子、ナノカプセル、マイクロカプセル、もしくはマイクロ錠剤を介した腸内投与、空腸内投与、十二指腸内投与、回腸内投与、胃シャント投与、または結腸内投与向けに製剤化される。医薬組成物はまた、例えば、カカオバターまたはその他のグリセリドなど従来の坐薬を使用する、坐薬または停留浣腸など直腸組成物の状態で製剤化され得る。組成物は、油性または水性ビヒクルに懸濁、溶解、乳濁していてもよく、また懸濁剤、安定化剤、及び／または分散剤を含有していてもよい。
本明細書に記載の遺伝子組換えされた微生物は、鼻孔内投与され、エアロゾル形態、スプレー、ミストで、または、滴の形態で製剤化され、かつ好適な噴霧剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフロロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、またはその他の好適な気体）の使用を伴う加圧パックもしくは噴霧器からのエアロゾルスプレー状態の形態で好適に送達され得る。加圧エアロゾル投薬量単位は、計量された量を送達する弁を設けることによって確定され得る。吸入器または注入器で使用するためのカプセル及びカートリッジ（例えば、ゼラチンの）は、化合物とラクトースもしくはデンプンなどの適切な粉末ベースとの粉末混合物を含有するように製剤化され得る。
遺伝子組換えされた微生物は、デポー調製物として投与及び製剤化され得る。このような長時間作用型製剤は、移植によって、または静脈内注射、皮下注射、局所注射、直接注射もしくは点滴を含む注射によって投与され得る。例えば、組成物は、好適な高分子もしくは疎水性物質（例えば、許容可能な油中のエマルションとして）またはイオン交換樹脂を用いて、あるいは、やや難溶な可溶性誘導体として（例えば、やや難溶な可溶性塩として）製剤化され得る。
いくつかの実施形態において、単回使用製剤での薬学的に許容される組成物について本明細書にて開示する。単回使用製剤は、液体または固体形態であり得る。単回使用製剤は、改質することなく直接患者に投与されるか、または投与前に希釈もしくは溶液調製される場合がある。特定の実施形態では、単回使用製剤は、ボーラス形態で、例えば、単回注射で、複数の錠剤、カプセル、丸剤などを含む経口量を含む単回経口量で投与され得る。代替の実施形態では、単回使用製剤は、例えば、点滴によってある期間にわたって投与され得る。
いくつかの実施形態において、本発明は、食品もしくは食用製品の形態ではない、またはそれらに組み込まれない、薬学的に許容される組成物を提供する。
医薬組成物の単回使用製剤は、医薬組成物を、より少量のアリコート、単回投与容器、単回投与液体形態、または錠剤、顆粒、ナノ粒子、ナノカプセル、マイクロカプセル、マイクロ錠剤、ペレット、もしくは粉末など腸溶的にコーティングされるか、または腸溶的にコーティングされない場合がある単回投与固体形態に分割することによって調製され得る。固体形態の単回投与剤は、患者への投与前に、液体、典型的には滅菌水または生理食塩水を加えることによって、溶液調製される場合がある。
その他の実施形態では、組成物は、制御放出または持続放出装置で送達される場合がある。一実施形態では、制御放出または持続放出を実現するためにポンプが使用される場合がある。別の実施形態では、本開示の療法剤の制御放出または持続放出を実現するために高分子材料が使用される場合がある（例えば、米国特許第５，９８９，４６３号を参照されたい）。持続放出製剤で使用されるポリマーの例としては、ポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレン－ｃｏ－酢酸ビニル）、ポリ（メタクリル酸）、ポリグリコリド（ＰＬＧ）、ポリ無水物、ポリ（Ｎ－ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレングリコール）、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）（ＰＬＧＡ）、及びポリオルトエステルが挙げられるが、これらに限定されない。持続放出製剤で使用されるポリマーは、非活性で、浸出性不純物を含まず、貯蔵時に安定であり、無菌であり、かつ生分解性のものであってよい。いくつかの実施形態では、制御放出または持続放出装置は、予防的または治療的標的の近くに配置することができ、したがって、全身用量のほんの一部しか必要としない。当業者に既知の任意の好適な技術が使用されてよい。
投薬計画は治療応答を提供するように調整することができる。投薬は、疾患の重症度及び応答性、投与経路、治療の時間経過（数日から数ヶ月から数年）、及び疾患の寛解までの時間など、いくつかの要因に依存する可能性がある。例えば、単回ボーラスが一度に投与されてもよく、複数回に分割した用量で予め決められた期間にわたって投与されてよもよく、または、その用量は治療状況に応じて減量または増量されてよい。投薬量の基準値は、活性化合物の固有の特性、及び達成されるべき特定の治療効果によって決定される。投薬量の値は、緩和されるべき病態の種類及び重症度によって変化し得る。任意の特定の対象に対して、特定の投薬計画が、個々のニーズ及び治療を行う臨床医の専門的判断に従って、経時的に調整されてよい。本明細書に記載の化合物の毒性及び治療効果は、細胞培養または動物モデルにおける標準的な薬学的手法によって決定することができる。例えば、ＬＤ５０、ＥＤ５０、ＥＣ５０、及びＩＣ５０が決定されてよく、かつ毒作用と治療効果との間の用量比（ＬＤ５０／ＥＤ５０）が治療指数として計算されてもよい。潜在的な損傷を最小限に抑えて副作用を低減するように慎重に改質した状態で、有毒性の副作用を呈する組成物を使用することもできる。投薬は、細胞培養アッセイ及び動物モデルから最初に推定されてもよい。ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏアッセイ及び動物研究から得られたデータは、ヒトで使用するための投薬量の範囲を算出する際に使用することができる。
一実施形態では、組換え細菌は、約１×１０１１個の生きた組換え細菌、約２×１０１１個の生きた組換え細菌、約３×１０１１個の生きた組換え細菌、約４×１０１１個の生きた組換え細菌、約５×１０１１個の生きた組換え細菌、約６×１０１１個の生きた組換え細菌、約１×１０１２個の生きた組換え細菌、または約２×１０１２個の生きた組換え細菌の用量で投与される。一実施形態では、組換え細菌は、約６×１０１１個の生きた組換え細菌の用量で投与される。一実施形態では、組換え細菌は、約１×１０１１個の生きた組換え細菌の用量で投与される。一実施形態では、投与は、約５×１０１１個の生きた組換え細菌である。一実施形態では、組換え細菌は、約１×１０１２個の生きた組換え細菌の用量で投与される。一実施形態では、組換え細菌は、約２×１０１２個の生きた組換え細菌の用量で投与される。一実施形態では、投与は、１日３回の食事と同時の約５×１０１１個の生きた組換え細菌である。一実施形態では、組換え細菌は、１日３回の食事と共に約６×１０１１個の生きた組換え細菌の用量で投与される。一実施形態では、組換え細菌は、１日３回の食事と共に約１×１０１１個の生きた組換え細菌の用量で投与される。一実施形態では、組換え細菌は、１日３回の食事と共に約１×１０１２個の生きた組換え細菌の用量で投与される。一実施形態では、組換え細菌は、１日３回の食事と共に約２×１０１２個の生きた組換え細菌の用量で投与される。
成分は、例えば、活性薬剤の量を示すアンプルもしくはサシェなどの密閉容器内に乾燥した凍結乾燥粉末もしくは水不含濃縮物として、単位剤形で別々に供給されるか、または一緒に混合されて供給される。投与様式が注射によるものである場合、投与の前に成分を混合することができるように、注射用滅菌水もしくは生理食塩水のアンプルが提供される場合がある。
医薬組成物は、薬剤の量を示したアンプルまたはサシェなどの密閉容器に包装され得る。一実施形態では、医薬組成物のち１つ以上は、密閉容器内の乾燥した滅菌凍結乾燥粉末または水不含濃縮物として供給され、かつ対象への投与に適切な濃度に溶液調製する（例えば、水または生理食塩水を用いて）ことができる。一実施形態では、予防的もしくは治療的薬剤、または医薬組成物のうち１つ以上は、２℃～８℃で保管される密閉容器内の乾燥した滅菌凍結乾燥粉末として供給され、溶液調製された後、１時間以内、３時間以内、５時間以内、６時間以内、１２時間以内、２４時間以内、４８時間以内、７２時間以内、または１週間以内に投与される。凍結乾燥剤形には、凍結防止剤、主に０～１０％のショ糖（最適には０．５～１．０％）を含めることができる。その他の適切な凍結防止剤には、トレハロース及びラクトースが含まれる。その他の適切な充填剤には、それぞれが０～０．０５％の濃度で含まれる場合があるグリシン及びアルギニン、及びポリソルベート８０（最適には０．００５～０．０１％の濃度で含まれる）が含まれる。追加の界面活性剤としては、ポリソルベート２０及びＢＲＩＪ（登録商標）界面活性剤が挙げられるが、これらに限定されない。医薬組成物は、注射用溶液として調製され得、補助剤として有用な薬剤、例えば、吸収または分散を増加させるために使用されるもの、例えば、ヒアルロニダーゼをさらに含めることができる。
いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされたウイルスは、効率的な送達及び宿主の抗ウイルス免疫応答の克服に対する必要性を考慮した送達に向けて調製される。抗ウイルス応答を回避する手法には、治療計画と同じ水準の異なるウイルス血清型の投与（血清型切り換え）、抗体認識からウイルスをマスクするポリマーコーティングなどの製剤化、及び送達媒体としての細胞の使用が含まれる。
別の実施形態では、組成物は、制御放出または持続放出装置で送達される場合がある。一実施形態では、制御放出または持続放出を実現するためにポンプが使用される場合がある。別の実施形態では、本開示の療法剤の制御放出または持続放出を実現するために高分子材料が使用される場合がある（例えば、米国特許第５，９８９，４６３号を参照されたい）。持続放出製剤で使用されるポリマーの例としては、ポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレン－ｃｏ－酢酸ビニル）、ポリ（メタクリル酸）、ポリグリコリド（ＰＬＧ）、ポリ無水物、ポリ（Ｎ－ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレングリコール）、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）（ＰＬＧＡ）、及びポリオルトエステルが挙げられるが、これらに限定されない。持続放出製剤で使用されるポリマーは、非活性で、浸出性不純物を含まず、貯蔵時に安定であり、無菌であり、かつ生分解性のものであってよい。いくつかの実施形態では、制御放出または持続放出装置は、予防的または治療的標的の近くに配置することができ、したがって、全身用量のほんの一部しか必要としない。当業者に既知の任意の好適な技術が使用されてよい。
本発明の遺伝子組換えされた細菌は、中性または塩の形態として投与及び製剤化されてよい。薬学的に許容される塩には、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などから誘導される、アニオンの形態のもの、及びナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２－エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどから誘導される、カチオンの形態のものが含まれる。
Ｉｎ ｖｉｖｏ法
本発明の組換え細菌は、ｉｎ ｖｉｖｏで、例えば、動物モデルで評価され得る。シュウ酸塩が有害となる疾患または病態の任意の好適な動物モデルが使用されてよい。例えば、Ｓａｌｉｄｏらによって説明されているようなＰＨＩのアラニン－グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ欠損（ａｇｘｔ－／－）マウスモデルを使用することができる（例えば、Ｓａｌｉｄｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０３：１８２４９－５４（２００６）を参照されたい）。ＰＨＩＩのグリオキシル酸還元酵素／ヒドロキシピルビン酸還元酵素ノックアウト（ＧＲＨＰＲ－／－）マウスモデルも使用することができる（例えば、Ｋｎｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｎａｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．３０２：Ｆ６８８－９３（２０１２）を参照されたい）。高シュウ酸尿症を発症するシュウ酸塩輸送体タンパク質ＳＬＣ２６Ａ６を欠損しているマウス（Ｓｌｃ２６ａ６ヌルマウス）を使用することもできる（例えば、Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎ．３８：４７４－８（２００６）を参照されたい）。
あるいは、ラットモデルが使用されてもよい。例えば、Ｃａｎａｌｅｓらは、高脂肪飼料を与えた結果として脂肪便症、高シュウ酸尿症、及び低尿ｐＨとなるルー－エン－Ｙ胃バイパス（ＲＹＧＢ）手術のラットモデルについて説明しており、通常の脂肪を含み、シュウ酸塩を含まない食事を摂取したＲＹＧＢ動物は、年齢を一致させた擬似対照よりも２倍のシュウ酸塩を排泄し、また高シュウ酸尿症は、食事脂肪とシュウ酸塩の含有量を下げることで部分的に可逆的であった（Ｃａｎａｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅａｔｏｒｒｈｅａ Ａｎｄ Ｈｙｐｅｒｏｘａｌｕｒｉａ Ｏｃｃｕｒ Ａｆｔｅｒ Ｇａｓｔｒｉｃ Ｂｙｐａｓｓ Ｓｕｒｇｅｒｙ Ｉｎ Ｏｂｅｓｅ Ｒａｔｓ Ｒｅｇａｒｄｌｅｓｓ Ｏｆ Ｄｉｅｔａｒｙ Ｆａｔ Ｏｒ Ｏｘａｌａｔｅ；Ｊ Ｕｒｏｌ．２０１３ Ｓｅｐ；１９０（３）：１１０２－１１０９）。
本発明の組換え細菌細胞は、例えば、経口強制飼養によって動物に投与され得、治療効果は例えば、治療前後のシュウ酸の尿中レベルを測定することによって判定される。動物を犠牲にし、組織サンプルを採取して分析することができる。
下記の表１４は、遺伝子組換えされた細菌のｉｎ ｖｉｖｏ活性を評価するのに使用することができる追加のラットモデルを含む。
Figure 2023511282000017
Figure 2023511282000018
スクリーニングの方法
本発明のいくつかの実施形態では、取り込み輸送体、排出輸送体、対向輸送体、及びシュウ酸塩異化酵素のいずれかの効果または活性は、これらの遺伝子のいずれかの突然変異を通して向上させることができる。誘導される突然変異及びスクリーニングの方法は、当技術分野において既知である。
目的の代謝産物を輸送する能力が強化された細菌株の生成
培養が容易で、生成時間が短く、個体群密度非常に高く、かつゲノムが小さいことによって、微生物は短期間で固有の表現型を進化させることができる。適応的実験室進化（ＡＬＥ）は、選択的圧力下において微生物を継代することで好ましい表現型の菌株を進化させる処理である。最も一般的には、この方法は、炭素／エネルギー供給源の利用を増加させるため、または菌株を環境的ストレス（例えば、温度、ｐＨ）に適応させるために適用され、それによって、炭素基質上またはストレス下で増殖しやすい突然変異株は、個体群内で適応性の低い菌株を駆逐し、最終的には個体群の中で優性になる。
これと同じ処理を、栄養要求体を作り出すことによって、任意の必須代謝産物に対して拡張することができる。栄養要求体は、必須代謝産物を合成することができない菌株があるため、増殖させるためには培地中に代謝産物を供給する必要がある。このシナリオでは、栄養要求体を作って、代謝産物の量を減らして継代させることによって、得られた優性株はこの必須代謝産物をより獲得して取り込むことができるはずである。
例えば、目的の代謝産物を産生するための生合成経路が破壊される場合、目的の代謝産物を高親和性で捕捉することができる菌株は、ＡＬＥを介して進化させることができる。まず、増殖をサポートする最小限の濃度が確立するまで、目的の栄養要求性代謝産物の様々な濃度で菌株を増殖させる。次に菌株をその濃度で継代して、定期的に目的の代謝産物の濃度を下げるように希釈する。時間の経過とともに、成長を制限する濃度で、目的の代謝産物に対して最も競合性のある細胞が、個体群の中で優性になる。これらの菌株は、それらの目的の代謝産物輸送体に突然変異がある可能性があり、その結果、目的の必須及び制限代謝産物を取り込む能力が向上する。
同様に、上流代謝産物を使用して目的の代謝産物を形成することができない栄養要求体を使用することによって、上流代謝産物をより効率的に取り込むだけでなく、代謝産物を目的の必須下流代謝産物に変換することができるように菌株を進化させることができる。これらの菌株はまた、上流代謝産物の取り込みを増加させるために突然変異を進化させるが、下流酵素の発現または反応速度を向上させるか、または競合性のある基質利用経路を減少させる突然変異も含み得る。
微生物に固有の代謝産物は、突然変異栄養要求性及び内因性代謝産物の増殖制限補充を適用した選択を介して必須にすることができる。しかし、非天然化合物を消費できる表現型は、それらの消費を必須化合物の産生に結び付けることによって進化させることができる。例えば、必須化合物または必須化合物の前駆体を産生できる異なる生物由来の遺伝子が単離される場合、この遺伝子を組換え的に導入し、異種宿主で発現させることができる。この新しい宿主株は、以前は代謝ができなかった基質から必須栄養素を合成する能力を持つことになる。
これにより、類似のＡＬＥ処理は、直ちに下流代謝産物を変換できない栄養要求体を作り、組換え酵素の同時発現を伴う非天然化合物の増殖制限量を選択することによって適用することができる。これにより、非天然基質の輸送、異種酵素の発現及び活性、ならびに下流天然酵素の発現及び活性に変異が生じる。この処理中の重要な必要条件は、非天然代謝産物の消費を増殖に不可欠な代謝産物の産生につなぎ留める能力であることを強調する必要がある。
一旦、選択メカニズムの基礎が確立され、補充の最小レベルが確立されると、実際のＡＬＥ実験を進めることができる。この処理の全体を通して、いくつかのパラメータを注意深くモニターする必要がある。培養物を指数増殖期に維持し、飽和／定常期に到達しないようにすることが重要である。これは、各継代中に増殖速度を確認し、それに応じてその後の希釈を調整する必要があることを意味する。希釈が大きくなる程度まで増殖速度が上がる場合は、増殖速度を遅くして、選択圧を上げて、継代中の亜集団に大きなバイアスをかけるほど希釈が厳しいものにならないように、栄養要求性補充の濃度を低下させる必要がある。加えて、定期的に細胞を希釈して、固形培地で増殖させ、個々のクローンをテストし、ＡＬＥ培養で観察された増殖速度の表現型を確認する必要がある。
ＡＬＥ実験をいつ停止させるかを予測することも、警戒が必要である。進化の誘導の成功は実験全体を通して「スクリーニングされた」突然変異の数に直接関係し、かつ突然変異は通常ＤＮＡ複製中のエラーと相関関係にあるので、累積細胞分裂数（ＣＣＤ）は、スクリーニングされた全突然変異の代用データとして機能する。以前の研究で、異なる炭素源での成長に有益な表現型は、約１０１１．２ＣＣＤ１で単離することができることが明らかとなっている。この速度は、ＤＮＡ複製エラーの増加を引き起こすＮ－メチル－Ｎ－ニトロ－Ｎ－ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）などの化学的突然変異誘発物質を培養物に加えることによって加速することができる。しかし、継代の継続により増殖速度がほとんど、またはまったく加速しない場合は、個体群はある適応度の最大値に収束しており、ＡＬＥ実験を停止することができる。
ＡＬＥ実験の最後に、細胞を希釈し、固体培地で単離し、培養フラスコのものと一致する増殖表現型を評価する必要がある。次に選択したものから最高の能力を発揮するものは、ゲノムＤＮＡ向けに準備され、全ゲノムシーケンシングに送られる。シーケンシングにより改良型の表現型を提供することができるゲノム周辺で起こる突然変異を明らかにすることができるが、サイレント突然変異（利益をもたらさないが、所望の表現型を損なうこともないもの）も含む。ＮＴＧまたはその他の化学的突然変異誘発物質の存在下で進化する培養物には、はるかに多くのサイレントバックグラウンド突然変異が存在することになる。その目下の状態において最高の能力を発揮する菌株で満足する場合、ユーザーは、その菌株を用いた応用に進むことができる。そうでない場合は、ゲノム工学技術によって親株に突然変異を再導入することによって進化した菌株から寄与する突然変異をデコンボリューションすることができる。Ｌｅｅ，Ｄ．－Ｈ．，Ｆｅｉｓｔ，Ａ．Ｍ．，Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｃ．Ｌ． ＆ Ｐａｌｓｓｏｎ，Ｂ．Ｏ．Ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ Ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｄｉｖｉｓｉｏｎｓ ａｓ ａ Ｍｅａｎｉｎｇｆｕｌ Ｔｉｍｅｓｃａｌｅ ｆｏｒ Ａｄａｐｔｉｖｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ ６，ｅ２６１７２（２０１１）を参照されたい。
類似の方法を使用してシュウ酸塩を消費または取り込むＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ突然変異体を生成してもよい。
治療の方法
本発明の別の態様は、対象においてシュウ酸塩が有害となる障害、または対象においてシュウ酸塩が有害となる障害に関連する症状（複数可）を治療する方法を提供する。一実施形態では、シュウ酸塩が有害となる障害は、シュウ酸塩のレベルの増加に関連する障害である。一実施形態では、シュウ酸塩のレベルの増加に関する障害は、１日尿中シュウ酸塩排泄量が２４時間あたり４０ｍｇ以上である障害である。シュウ酸塩のレベルの増加に関する障害としては、ＰＨＩ、ＰＨＩＩ、ＰＨＩＩＩ、続発性高シュウ酸尿症、腸性高シュウ酸尿症、食事性高シュウ酸尿症、特発性高シュウ酸尿症、腸内細菌異常増殖症候群、クローン病、炎症性腸疾患、腎移植後の高シュウ酸尿症、肥満症に対する空腸回腸バイパス後の高シュウ酸尿症、胃潰瘍手術後の高シュウ酸尿症、慢性腸間膜虚血、胃バイパス、嚢胞性線維症、短腸症候群、胆管／膵臓疾患（例えば、慢性膵炎）、比較的保存された腎機能を伴う再発性腎臓結石を伴った高シュウ酸尿症、及び重度の腎機能異常を伴う再発性腎臓結石を伴った高シュウ酸尿症（例えば、血液透析中の患者を含む）が挙げられる。一実施形態では、シュウ酸塩が有害となる障害は、ＰＨＩである。一実施形態では、シュウ酸塩が有害となる障害は、ＰＨＩＩである。別の実施形態では、シュウ酸塩が有害となる障害は、ＰＨＩＩＩである。一実施形態では、シュウ酸塩が有害となる障害は、続発性高シュウ酸尿症である。別の実施形態では、シュウ酸塩が有害となる障害は、食事性高シュウ酸尿症である。一実施形態では、シュウ酸塩が有害となる障害は、特発性高シュウ酸尿症である。別の実施形態では、シュウ酸塩が有害となる障害は、腸性高シュウ酸尿症である。一実施形態では、シュウ酸塩が有害となる障害は、腸内細菌異常増殖症候群である。別の実施形態では、シュウ酸塩が有害となる障害は、クローン病である。一実施形態では、シュウ酸塩が有害となる障害は、炎症性腸疾患である。別の実施形態では、シュウ酸塩が有害となる障害は、腎移植後の高シュウ酸尿症である。一実施形態では、シュウ酸塩が有害となる障害は、肥満症に対する空腸回腸バイパス後の高シュウ酸尿症である。別の実施形態では、シュウ酸塩が有害となる障害は、胃潰瘍手術後の高シュウ酸尿症である。一実施形態では、シュウ酸塩が有害となる障害は、慢性腸間膜虚血である。別の実施形態では、シュウ酸塩が有害となる障害は、胃バイパスである。別の実施形態では、シュウ酸塩が有害となる障害は、嚢胞性線維症である。別の実施形態では、シュウ酸塩が有害となる障害は、短腸症候群である。別の実施形態では、シュウ酸塩が有害となる障害は、胆管／膵臓疾患である。別の実施形態では、シュウ酸塩が有害となる障害は、慢性膵炎である。別の実施形態では、シュウ酸塩が有害となる障害は、比較的保存された腎機能を伴う再発性腎臓結石を伴った高シュウ酸尿症である。別の実施形態では、シュウ酸塩が有害となる障害は、重度の腎機能異常を伴う再発性腎臓結石を伴った高シュウ酸尿症（例えば、血液透析中の患者を含む）である。
本開示は、驚くべきことに、本明細書にて開示する組換え細菌細胞を含む医薬組成物が、ＰＨＩ及びＰＨＩなどのシュウ酸塩が有害となる障害を治療するために使用され得ることを実証する。
一実施形態では、ＰＨＩを患っている対象は、ＡＧＸＴ遺伝子に突然変異を有する。別の実施形態では、ＰＨＩＩを患っている対象は、ＧＲＨＰＲ遺伝子に突然変異を有する。一実施形態では、ＰＨＩＩＩを患っている対象は、ＨＯＧＡ１遺伝子に突然変異を有する。別の態様において、本発明は、本発明の細菌細胞を含む医薬組成物を対象に投与し、それによって対象におけるシュウ酸塩及び／またはシュウ酸の血漿中レベルを低下させることによって、対象におけるシュウ酸塩及び／またはシュウ酸の血漿中レベルを低下させる方法を提供する。一実施形態では、対象は、シュウ酸塩が有害となる疾患または障害を患っている。一実施形態では、シュウ酸塩が有害となる障害は、ＰＨＩである。
一実施形態では、シュウ酸塩が有害となる障害は、ＰＨＩＩである。別の実施形態では、シュウ酸塩が有害となる障害は、ＰＨＩＩＩである。一実施形態では、シュウ酸塩が有害となる障害は、続発性高シュウ酸尿症である。別の実施形態では、シュウ酸塩が有害となる障害は、食事性高シュウ酸尿症である。一実施形態では、シュウ酸塩が有害となる障害は、特発性高シュウ酸尿症である。別の実施形態では、シュウ酸塩が有害となる障害は、腸性高シュウ酸尿症である。一実施形態では、シュウ酸塩が有害となる障害は、腸内細菌異常増殖症候群である。別の実施形態では、シュウ酸塩が有害となる障害は、クローン病である。一実施形態では、シュウ酸塩が有害となる障害は、炎症性腸疾患である。別の実施形態では、シュウ酸塩が有害となる障害は、腎移植後の高シュウ酸尿症である。一実施形態では、シュウ酸塩が有害となる障害は、肥満症に対する空腸回腸バイパス後の高シュウ酸尿症である。別の実施形態では、シュウ酸塩が有害となる障害は、胃潰瘍手術後の高シュウ酸尿症である。一実施形態では、シュウ酸塩が有害となる障害は、慢性腸間膜虚血である。別の実施形態では、シュウ酸塩が有害となる障害は、胃バイパスである。別の実施形態では、シュウ酸塩が有害となる障害は、嚢胞性線維症である。別の実施形態では、シュウ酸塩が有害となる障害は、短腸症候群である。別の実施形態では、シュウ酸塩が有害となる障害は、胆管／膵臓疾患である。別の実施形態では、シュウ酸塩が有害となる障害は、慢性膵炎である。
いくつかの実施形態において、本開示は、これらの疾患に関連する、発熱、嘔吐、悪心、下痢、腎臓結石、シュウ酸症、骨疾患、エリスロポエチン難治性貧血、皮膚潰瘍、指の壊疽、心不整脈、及び心筋症などを含むがこれらに限定されない１つ以上の症状（複数可）を軽減、緩和、または排除する方法を提供する。いくつかの実施形態では、疾患は、他の病態、例えば、肝疾患に続発するものである。
特定の実施形態では、本明細書にて開示する細菌細胞は、シュウ酸塩が有害となる障害を治療するために、対象におけるシュウ酸塩及び／またはシュウ酸を異化させることができる。これらの実施形態では、シュウ酸塩が有害となる障害、例えば、ＰＨＩまたはＰＨＩＩに罹患している患者は、実質的に通常の食事、または、シュウ酸塩を含まないもしくはシュウ酸塩が非常に低い食事とは異なる制限のない食事を再開することができる可能性がある。いくつかの実施形態では、細菌細胞は、シュウ酸塩が有害となる障害を治療するために、別の供給源、例えば、血液からのシュウ酸塩及び／またはシュウ酸を異化させることができる可能性がある。
いくつかの実施形態では、食事によるシュウ酸塩の取り込みは、本明細書に記載の遺伝子組換えされた細菌を提供することよって抑制される。いくつかの実施形態では、例えば、哺乳動物において代謝経路を通して生成されるシュウ酸塩は、減少する。
この方法は、本明細書に記載の細菌の少なくとも１つの遺伝子組換えされた種、菌株、または亜型を含む医薬組成物を調製することと、該医薬組成物を治療上有効な量で対象に投与することと、を含む場合がある。いくつかの実施形態では、シュウ酸塩の上昇に関連する疾病または障害を治療する方法は、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子配列（複数可）を含む遺伝子改変細菌、またはその医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、シュウ酸塩の上昇に関連する疾病または障害を治療する方法は、１つ以上のシュウ酸塩輸送体（複数可）をコードする遺伝子配列（複数可）を含む遺伝子改変細菌、またはその医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、シュウ酸塩の上昇に関連する疾病または障害を治療する方法は、１つ以上のギ酸塩取り込み輸送体（複数可）をコードする遺伝子配列（複数可）を含む遺伝子改変細菌、またはその医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、シュウ酸塩の上昇に関連する疾病または障害を治療する方法は、１つ以上のシュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体（複数可）をコードする遺伝子配列（複数可）を含む遺伝子改変細菌、またはその医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、シュウ酸塩の上昇に関連する疾病または障害を治療する方法は、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素（複数可）をコードする遺伝子配列（複数可）、ならびに（ｉ）１つ以上のシュウ酸塩輸送体（複数可）、（ｉｉ）１つ以上のギ酸塩排出輸送体（複数可）、（ｉｉｉ）１つ以上のシュウ酸塩：ギ酸塩対向輸送体（複数可）、及び（ｉｖ）これらの組み合わせのうち１つ以上をコードする遺伝子配列（複数可）を含む遺伝子改変細菌、またはその医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書にて開示する細菌細胞は、例えば、液体懸濁液で経口投与される。いくつかの実施形態では、本明細書にて開示する細菌細胞は、ゲルキャップ内に凍結乾燥され、経口投与される。いくつかの実施形態では、本明細書にて開示する細菌細胞は、栄養管または胃シャントを介して投与される。いくつかの実施形態では、本明細書にて開示する細菌細胞は、例えば、浣腸によって直腸内に投与される。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、局所、腸内、空腸内、十二指腸内、回腸内、及び／または結腸に投与される。
特定の実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物の投与は、対象におけるシュウ酸塩及び／またはシュウ酸レベルを低下させるために行われる。いくつかの実施形態では、本開示の方法は、対象におけるシュウ酸塩及び／またはシュウ酸レベルを、少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上低下させる。別の実施形態では、本発明の方法は、対象におけるシュウ酸塩及び／またはシュウ酸レベルを少なくとも２分の１、３分の１、４分の１、５分の１、６分の１、７分の１、８分の１、９分の１、または１０分の１に低下させる。別の実施形態では、本発明の方法は、対象の１日尿中シュウ酸塩排泄量を２４時間あたり４０ｍｇ未満に減少させる。いくつかの実施形態では、低下は、医薬組成物の投与前後の対象におけるシュウ酸塩及び／またはシュウ酸レベルを比較することによって測定される。一実施形態では、シュウ酸塩及び／またはシュウ酸レベルは、対象の腸内で低下する。一実施形態では、シュウ酸塩及び／またはシュウ酸レベルは、対象の尿中で低下する。別の実施形態では、シュウ酸塩及び／またはシュウ酸レベルは、対象の血液中で低下する。別の実施形態では、シュウ酸塩及び／またはシュウ酸レベルは、対象の血漿中で低下する。別の実施形態では、シュウ酸塩及び／またはシュウ酸レベルは、対象の糞便中で低下する。別の実施形態では、シュウ酸塩及び／またはシュウ酸レベルは、対象の脳内で低下する。
一実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、対象におけるシュウ酸塩及び／またはシュウ酸レベルを標準的なレベルまで低下させるために投与される。別の実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、対象におけるシュウ酸塩及び／またはシュウ酸レベルを標準的なレベルを下回るまで低下させるために投与される。別の実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、対象の１日尿中シュウ酸塩排泄量を２４時間あたり４０ｍｇ未満に減少させるために投与される。
特定の実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、対象におけるシュウ酸塩レベルを低下させるために投与される。いくつかの実施形態では、本開示の方法は、治療していない対象または対照対象におけるレベルよりも、対象におけるシュウ酸塩レベルを少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上低下させる。別の実施形態では、本開示の方法は、対象におけるシュウ酸塩レベルを少なくとも２分の１、３分の１、４分の１、５分の１、６分の１、７分の１、８分の１、９分の１、または１０分の１に低下させる。いくつかの実施形態では、低下は、医薬組成物の投与前後の対象におけるシュウ酸塩レベルを比較することによって測定される。一実施形態では、シュウ酸塩レベルは、対象の腸内で低下する。別の実施形態では、シュウ酸塩レベルは、対象の血液中で低下する。別の実施形態では、シュウ酸塩レベルは、対象の血漿中で低下する。別の実施形態では、シュウ酸塩レベルは、対象の肝臓内で低下する。別の実施形態では、シュウ酸塩レベルは、対象の腎臓内で低下する。
一実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、対象におけるシュウ酸塩を標準的なレベルまで低下させるために投与される。
いくつかの実施形態では、シュウ酸塩が有害となる障害、例えば、ＰＨＩまたはＰＨＩＩを治療する方法は、病態または障害の１つ以上の症状が少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またそれ以上改善することを可能にする。いくつかの実施形態では、シュウ酸塩が有害となる障害、例えば、ＰＨＩまたはＰＨＩＩを治療する方法は、病態または障害の１つ以上の症状が少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍改善することを可能にする。
医薬組成物の投与前、投与中、及び投与後、対象におけるシュウ酸塩及び／またはシュウ酸レベルは、血液、血清、血漿、尿、腹腔液、脳脊髄液、糞便、腸内粘膜切屑、組織から採取したサンプル、及び／または胃、腎臓、肝臓、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結腸、直腸、及び肛門管のうち１つ以上の部分から採取したサンプルなど、生体サンプルで測定することができる。いくつかの実施形態では、方法は、シュウ酸塩及び／またはシュウ酸のレベルを低下させるために、本明細書にて開示する組成物の投与を含み得る。いくつかの実施形態では、方法は、対象においてシュウ酸塩及び／またはシュウ酸を検出不可能レベルまで低下させるために、本発明の組成物の投与を含み得る。いくつかの実施形態では、方法は、シュウ酸塩及び／またはシュウ酸濃度を検出不可能レベルまで、あるいは、治療前の対象のシュウ酸塩及び／またはシュウ酸レベルの少なくとも約１％、２％、５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％未満に低下させるために、本発明の組成物の投与を含み得る。
いくつかの実施形態では、本明細書にて開示する組換え細菌細胞は、同じ条件下での同じ亜型の未修飾細菌よりも、尿、血液、または血漿中のシュウ酸塩及び／またはシュウ酸のレベルを、少なくとも約１．５分の１、少なくとも約２分の１、少なくとも約３分の１、少なくとも約４分の１、少なくとも約５分の１、少なくとも約６分の１、少なくとも約７分の１、少なくとも約８分の１、少なくとも約９分の１、少なくとも約１０分の１、少なくとも約１５分の１、少なくとも約２０分の１、少なくとも約３０分の１、少なくとも約４０分の１、または少なくとも約５０分の１に低下させるために、哺乳動物の腸内の低酸素環境などの外因的な環境条件下でシュウ酸塩異化酵素を産生する。
一実施形態では、本明細書にて開示する細菌は、シュウ酸塩の血漿中レベルを４ｍｇ／ｄＬ未満に低下させる。一実施形態では、本明細書にて開示する細菌は、シュウ酸塩の血漿中レベルを３．９ｍｇ／ｄＬ未満に低下させる。一実施形態では、本明細書にて開示する細菌は、シュウ酸塩の血漿中レベルを３．８ｍｇ／ｄＬ、３．７ｍｇ／ｄＬ、３．６ｍｇ／ｄＬ、３．５ｍｇ／ｄＬ、３．４ｍｇ／ｄＬ、３．３ｍｇ／ｄＬ、３．２ｍｇ／ｄＬ、３．１ｍｇ／ｄＬ、３．０ｍｇ／ｄＬ、２．９ｍｇ／ｄＬ、２．８ｍｇ／ｄＬ、２．７ｍｇ／ｄＬ、２．６ｍｇ／ｄＬ、２．５ｍｇ／ｄＬ、２．０ｍｇ／ｄＬ、１．７５ｍｇ／ｄＬ、１．５ｍｇ／ｄＬ、１．０ｍｇ／ｄＬ、または０．５ｍｇ／ｄＬ未満に低下させる。
一実施形態では、本明細書にて開示する医薬組成物の投与前の、対象の血漿中レベルは、少なくとも４ｍｇ／ｄＬシュウ酸塩である。別の実施形態では、本明細書にて開示する医薬組成物の投与前の、対象の血漿中レベルは、少なくとも４．１ｍｇ／ｄＬ、４．２ｍｇ／ｄＬ、４．３ｍｇ／ｄＬ、４．４ｍｇ／ｄＬ、４．５ｍｇ／ｄＬ、４．７５ｍｇ／ｄＬ、５．０ｍｇ／ｄＬ、５．５ｍｇ／ｄＬ、６ｍｇ／ｄＬ、７ｍｇ／ｄＬ、８ｍｇ／ｄＬ、９ｍｇ／ｄＬ、または１０ｍｇ／ｄＬである。
特定の未修飾細菌では、シュウ酸塩またはシュウ酸ＣｏＡ処理の測定可能なレベルを得られない。これらの細菌の遺伝子操作形態を使用する実施形態では、シュウ酸塩及び／またはシュウ酸ＣｏＡの処理は、外因的な環境条件下で測定可能なものであろう。
シュウ酸塩及び／またはシュウ酸レベルは、当技術分野において知られている方法によって測定することができる。例えば血漿中シュウ酸塩レベルは、Ｌａｄｗｉｇらによって説明されている分光光度血漿シュウ酸塩アッセイを使用して測定することができる（Ｌａｄｗｉｇ ｅｔ．ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．５１：２３７７－８０（２００５））。さらに、尿中シュウ酸塩レベルは、例えば、シュウ酸塩酸化酵素比色分析酵素アッセイを使用することによって測定することができる（Ｋａｓｉｄａｓ ａｎｄ Ｒｏｓｅ，Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２：４１２－９（１９８５））。いくつかの実施形態では、シュウ酸塩異化酵素、例えば、Ｆｒｃの発現は、当技術分野において知られている方法によって測定される。別の実施形態では、シュウ酸塩異化酵素活性は、Ｆｒｃ活性を評価する当技術分野において知られている方法によって測定される（シュウ酸塩異化酵素のセクション、上記を参照されたい）。
特定の実施形態では、組換え細菌は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅである。組換え細菌は、投与後数時間または数日で、例えば、腸または血清中の防御因子によって（Ｓｏｎｎｅｎｂｏｒｎ ｅｔ ａｌ．，２００９）、またはキルスイッチの活性化によって破壊される場合がある。したがって、組換え細菌を含む医薬組成物は、治療的有効量及び頻度で再投与される場合がある。代替の実施形態では、組換え細菌は、投与後数時間または数日中に破壊されず、腸で増殖してコロニー形成する場合がある。
一実施形態では、本明細書にて開示する細菌細胞は、１日１回、対象に投与される。別の実施形態では、本明細書にて開示する細菌細胞は、１日２回、対象に投与される。別の実施形態では、本明細書にて開示する細菌細胞は、食事と組み合わせて対象に投与される。別の実施形態では、本明細書にて開示する細菌細胞は、食事の前に対象に投与される。別の実施形態では、本明細書にて開示する細菌細胞は、食事の後に対象に投与される。別の実施形態では、本発明の細菌細胞は、食品もしくは食用製品の形態で投与されないか、または食品もしくは食用製品に組み込まれない。医薬組成物の投薬量及び投与の頻度は、症状の重症度及び疾患の進行に基づいて選択することができる。適切な治療的有効量及び／または投与の頻度は、治療を行う臨床医によって選択することができる。
本明細書にて開示される方法は、本明細書にて開示する組成物を単独で、または１つ以上の追加の療法剤、例えば、ピリドキシン、クエン酸塩、オルソリン酸塩、及びマグネシウム、経口カルシウム補給、ならびに胆汁酸隔離剤、または低脂肪及び／または低シュウ酸塩食と組み合わせて、投与することを含んでもよい。１つ以上の追加の治療剤を選択する際の重要な考慮事項は、薬剤（複数可）が本明細書にて開示する細菌と相容性でなければならず、例えば、その薬剤（複数可）は、細菌を妨害または殺傷してはならないことである。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌は、低脂肪及び／または低シュウ酸塩食と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた細菌の投与により、患者がより多くのシュウ酸塩及び／または脂肪を消費できるように耐性が向上する。
本明細書にて開示される方法は、本明細書にて開示する組成物の投与前に対象から血漿サンプルを単離することと、サンプル内のシュウ酸塩及び／またはシュウ酸のレベルを測定することとをさらに含む場合がある。いくつかの実施形態では、本明細書にて開示する方法は、本明細書にて開示する組成物の投与後に対象から血漿サンプルを単離することと、サンプル内のシュウ酸塩及び／またはシュウ酸のレベルを測定することとをさらに含む場合がある。
本発明の方法は、本発明の組成物の投与前に対象から尿サンプルを単離することと、サンプル中のシュウ酸塩及び／またはシュウ酸のレベルを測定することとをさらに含む場合がある。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、本発明の組成物の投与後に対象から尿サンプルを単離することと、サンプル中のシュウ酸塩及び／またはシュウ酸のレベルを測定することとをさらに含む場合がある。
一実施形態では、本明細書にて開示する方法は、本明細書にて開示する組成物を対象に投与した後の対象の血漿サンプル中のシュウ酸塩及び／またはシュウ酸のレベルと、本明細書にて開示する組成物を対象に投与する前の対象の血漿サンプル中のシュウ酸塩及び／またはシュウ酸のレベルとを比較することをさらに含む。一実施形態では、本明細書にて開示する組成物の投与後の対象の血漿サンプル中のシュウ酸塩及び／またはシュウ酸のレベルが低下することは、シュウ酸塩及び／またはシュウ酸の血漿中レベルが低下し、それにより対象におけるシュウ酸塩が有害となる障害が治療されることを意味する。一実施形態では、シュウ酸塩及び／またはシュウ酸の血漿中レベルは、医薬組成物の投与前のサンプル中の血漿中レベルよりも、医薬組成物の投与後のサンプル中で少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％低下する。別の実施形態では、シュウ酸塩及び／またはシュウ酸の血漿中レベルは、医薬組成物の投与前のサンプル中の血漿中レベルよりも、医薬組成物の投与後のサンプル中で少なくとも２分の１、３分の１、４分の１、または５分の１に低下する。
一実施形態では、本発明の方法は、本発明の組成物を対象に投与した後の対象の尿サンプル中のシュウ酸塩及び／またはシュウ酸のレベルと、本発明の組成物を対象に投与する前の対象の尿サンプル中のシュウ酸塩及び／またはシュウ酸のレベルとを比較することをさらに含む。一実施形態では、本発明の組成物の投与後の対象の尿サンプル中のシュウ酸塩及び／またはシュウ酸のレベルが低下することは、シュウ酸塩及び／またはシュウ酸の尿中レベルが低下し、それにより対象におけるシュウ酸塩が有害となる障害が治療されることを意味する。一実施形態では、シュウ酸塩及び／またはシュウ酸の尿中レベルは、医薬組成物の投与前のサンプル中の血漿中レベルよりも、医薬組成物の投与後のサンプル中で少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％低下する。別の実施形態では、シュウ酸塩及び／またはシュウ酸の尿中レベルは、医薬組成物の投与前のサンプル中の尿中レベルよりも、医薬組成物の投与後のサンプル中で少なくとも２分の１、３分の１、４分の１、または５分の１に低下する。
一実施形態では、本明細書にて開示する方法は、本明細書にて開示する組成物の投与後の対象の血漿サンプル中のシュウ酸塩／シュウ酸のレベルと、シュウ酸塩及び／またはシュウ酸の対照レベルとを比較することをさらに含む。
別の実施形態では、本発明の方法は、本発明の組成物の投与後の対象の尿サンプル中のシュウ酸塩／シュウ酸のレベルと、シュウ酸塩及び／またはシュウ酸の対照レベルとを比較することをさらに含む。
本発明は、以下の実施例によりさらに説明されるが、いかなる方法によっても限定するものとして解釈されるべきではない。本出願全体で引用される文献参照、発行済特許、及び公開済特許出願を含む全ての引用参考文献は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。本明細書に添付されている全ての図及び表の内容もまた参照により本明細書に明示的に組み込まれることをさらに理解されたい。
実施例１．時間の経過とともにシュウ酸塩濃度を低下させる遺伝子組換えされたＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ細菌株
ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験及びｉｎ ｖｉｖｏ実験の両方を実施し、これらの実験により、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ細菌株が、時間の経過とともにシュウ酸塩濃度を低下させることが実証された。
具体的には、機能的ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを、図１に示すように実施した。このアッセイの結果により、遺伝子組換えされたＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ細菌株が、野生型Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ細菌株よりも時間の経過とともにシュウ酸塩濃度を低下させることが実証された（図１を参照されたい）。
動物でのｉｎ ｖｉｖｏ実験も実施した。０日目に、マウスの体重を測定して、印を付け、４つのグループに無作為に分けた。１日目から以下のプロトコルを使用した。
１日目：
Ｔ０：
－１００μＬ（１００μｇ）の１３Ｃ－シュウ酸塩のＰＯ投与
－２００μＬの治療剤のＰＯ投与
Ｔ１：
－３００μＬの治療剤のＰＯ投与
Ｔ６：尿、糞便を採取
動物に、３．１２×１０１０ＣＦＵの高用量、１．０４×１０１０ＣＦＵの中用量、及び３．４６×１０９ＣＦＵの低用量（総ＣＦＵ）を投与した。
図２Ａに示されている結果により、遺伝子組換えされたＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ細菌株が、野生型株よりも処置済みマウスの尿中で検出される１３Ｃ－シュウ酸塩の急性レベルを低下させることが実証された。
図２Ｂに示されている結果により、遺伝子組換えされたＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ細菌株が、野生型株よりも処置済みマウスの尿中で検出されるシュウ酸塩の慢性レベルを低下させることが実証された。
Figure 2023511282000019
Figure 2023511282000020
Figure 2023511282000021
Figure 2023511282000022
Figure 2023511282000023
Figure 2023511282000024
サンプル調製
シュウ酸ストック１０ｍｇ／ｍＬを水中で調製し、１．５ｍＬ微小遠心管でアリコートにし（１００μＬ）、－２０℃で保管した。標準液（１０００、５００、２５０、１００、２０、４、及び０．８μｇ／ｍＬ）を水中で調製した。氷上で、Ｖ底９６ウェルプレート内で、２０μＬのサンプル（及び標準液）を最終溶液中で１０μｇ／ｍＬのシュウ酸－ｄ２を含む１８０μＬのＨ２Ｏと混合した。プレートを、ＣｌｅａｒＡＳｅａｌシートでヒートシールし、十分に混合した。
ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ法
Ｔｈｅｒｍｏ ＴＳＱ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｍａｘトリプル四重極質量分析計を使用したタンデム型質量分析に連結された液体クロマトグラフィー（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）によってシュウ酸塩を測定した。表２１、表２２、及び表２３にＬＣ－ＭＳ／ＭＳ法の概要を提示する。
Figure 2023511282000025
Figure 2023511282000026
Figure 2023511282000027
Figure 2023511282000028
Figure 2023511282000029
Figure 2023511282000030
Figure 2023511282000031
Figure 2023511282000032
Figure 2023511282000033
実施例２．その他の目的の配列
Figure 2023511282000034
Figure 2023511282000035
実施例３．急性マウスモデル及び健康なサルにおけるシュウ酸塩濃度の減少
腸性高シュウ酸尿症は、消化（ＧＩ）管内でシュウ酸塩が過剰に吸収されると発症し、それにより腎臓にシュウ酸塩が蓄積し、再発性腎臓結石及び腎不全を引き起こす可能性がある。消化管内のシュウ酸塩の減少が患者にとって臨床的に有益であることがこれまでに明らかとなっている。しかし、現在利用可能な治療法はなく、米国内だけで８０，００００人以上の重症患者がいる。これらの患者は、再発性腎臓結石、及び腎不全のリスクがある可能性がある。
本明細書で実証するように、遺伝子改変細菌株は、胃、小腸、及び結腸で作用し、血中へのシュウ酸塩の吸収を低下させるといった優れた潜在能力を有する（図３）。
ｉｎ ｖｉｖｏ実験を急性マウスモデル及び健康なサルの両方で実施し、この実験により、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ細菌株が、時間の経過とともにシュウ酸塩濃度を低下させることが実証された。具体的には、３つの遺伝子改変されたＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株（ＳＹＮ５７５２、ＳＹＮ７１６９、及びＳＹＮＢ８８０２）を構築した。ＳＹＮ７１６９はＳＹＮ５７５２から誘導したものであり、唯一の違いは、ｔｈｙＡ及びファージ３ｋｏである（配列は表３３に含まれている）。遺伝子型を下記に示す。
ＳＹＮ５７５２：ＨＡ９１０：：ＦＮＲ＿ｏｘｌＴ，ＨＡ１２：：ＦＮＲ＿ｓｃａａＥ３－ｏｘｃｄ－ｆｒｃ
ＳＹＮ７１６９：ＨＡ９１０：：ＦＮＲ＿ｏｘｌＴ，ＨＡ１２：：ＦＮＲ＿ｓｃａａＥ３－ｏｘｃｄ－ｆｒｃ，ＴｈｙＡ：：ＫａｎＲ，ｐｈａｇｅ３：：ＣａｍＲ
ＳＹＮ７１６９及びＳＹＮＢ８８０２は、同じ遺伝子修飾を有するが、ＳＹＮ７１６９は、選択的媒介物の分離を支援するクロラムフェニコール及びカナマイシン耐性カセットも有する。関連する配列は、上記の表及び表３３に含まれている。
ＳＹＮＢ８８０２（図４Ａ）は、嫌気性誘導性プロモーター（ｐＦｎｒｓ）及び嫌気性応答性転写活性化因子ＦＮＲの調節制御下にあるＯｘａｌｏｂａｃｔｅｒ ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓに由来するシュウ酸塩対向輸送体（ＯｘｌＴ）をコードする１つの遺伝子の挿入、嫌気性誘導性プロモーター（ｐＦｎｒｓ）及び嫌気性応答性転写活性化因子ＦＮＲの調節制御下にある３つの遺伝子（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに由来するシュウ酸ＣｏＡシンテターゼ（ｓｃａａｅ３）、Ｏｘａｌｏｂａｃｔｅｒ ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓに由来するシュウ酸脱炭酸酵素（ｏｘｄｃ）、及びＯｘａｌｏｂａｃｔｅｒ ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓに由来するホルミルＣｏＡ転移酵素）をコードする１つのオペロンの挿入、ならびに、チミジン栄養要求体を生成するチミジン酸シンターゼをコードするｔｈｙＡ遺伝子の欠失を含み、かつ内因性Ｎｉｓｓｌｅプロファージが不活性化されている。関連する配列は、本明細書中の各表に含まれている。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験を前述したように実施した。このアッセイの結果により、遺伝子組換えされたＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ細菌株（ＳＹＮＢ８８０２）が、野生型Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ細菌株よりも時間の経過とともにシュウ酸塩濃度を低下させることが実証された（図４Ｂを参照されたい）。
さらに、遺伝子組換えされたＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ細菌株（ＳＹＮＢ８８０２）が、野生型Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ細菌株よりも時間の経過とともにギ酸塩濃度を上昇させることが実証された（図４Ｃ）。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ（対照）及び ＳＹＮＢ８８０２を、振とうフラスコ内で培養し、その後に嫌気性チャンバーで活性化させ、続いて、－６５℃以下で、グリセロールベースの製剤緩衝液中で濃縮及び凍結した。１０ｍＭの１３Ｃ－シュウ酸塩を含有するアッセイ培地で、光学密度＝５の活性化細胞を３７℃で静的にインキュベートした。上澄液サンプルを３０分及び６０分で除去し、１３Ｃ－シュウ酸塩及び１３Ｃ－ギ酸塩の濃度を測定した。１３Ｃ－シュウ酸塩及び１３Ｃ－ギ酸塩の濃度を、液体クロマトグラフィー・タンデム型質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）によって測定した。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ胃腸シミュレーション（ＩＶＳ）
胃及び結腸シミュレート腸液の両方が、ｉｎ ｖｉｔｒｏでシミュレートされたＳＹＮＨＯＸを活性化することができた（図５Ａ）。シミュレート胃液は、シミュレート結腸液中のシュウ酸塩消費と比較した場合、２倍以上のＳＹＮＨＯＸ（ＳＹＮ５７５２）シュウ酸塩消費活性を活性化した（図５Ａ）。
遺伝子改変細菌株の生存率及び代謝活性の特性を決定し、かつｉｎ ｖｉｖｏでのそれらの機能を予測するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏ胃腸シミュレーション（ＩＶＳ）モデルを、酸素濃度、胃及び膵臓酵素、ならびに胆汁を含むヒトの消化管の主要な態様をシミュレートするように設計した。ＩＶＳモデルを、胃、小腸、及び、結腸の状態をシミュレートするように設計された９６ウェルマイクロプレート形式での一連のインキュベーションで構成した。ＩＶＳモデルの胃、小腸、結腸の部分は、Ｍｉｎｅｋｕｓ ｅｔ ａｌ．，２０１４から適応させた。
簡単に述べると、細菌細胞の凍結アリコートを、まず室温で解凍し、５．０×１０９生きた細胞／ｍＬで０．０７７Ｍの重炭酸ナトリウム緩衝液に再懸濁させた。次に、この溶液を、１０ｍＭのシュウ酸塩を含有する等量のシミュレート胃液（ＳＧＦ；Ｍｉｎｅｋｕｓ ｅｔ ａｌ．，２０１４）と混合し、Ｃｏｙ微好気性チャンバー内で振とうさせながら３７℃で２時間インキュベートした。微好気性チャンバー内の大気圧を、最初に７％酸素に目盛りを定め、２時間かけて徐々に２％酸素になるまで低下させた。ＳＧＦ内の細胞密度は、２．５×１０９生きた細胞／ｍＬであった。２時間後、続いて、細胞をシミュレート腸液（ＳＩＦ；Ｍｉｎｅｋｕｓ ｅｔ ａｌ．，２０１４）と１：１の容量で混合し、Ｃｏｙ微好気性チャンバー内で振とうさせながら３７℃でさらに２時間インキュベートした。ＳＩＦ内の細胞密度は、１．２５×１０９生きた細胞／ｍＬであった。２時間後、細胞を嫌気性チャンバーに移し、ＳＧＦ；Ｍｉｎｅｋｕｓ ｅｔ ａｌ．，２０１４をベースにした結腸シミュレート培地と１：６で混合した（ＣＳＭ）。ＣＳＭに１０ｍＭのシュウ酸塩を加え、３７℃で３時間インキュベートした。ＣＳＭ内の細胞密度は、２．０８×１０６生きた細胞／ｍＬであった。
時間の経過とともに菌株の活性を測定するために、アリコートを定期的に採取し、卓上遠心分離機を使用して４０００ｒｐｍで５分間、遠心分離にかけた。細胞を含有していない上澄液を採取し、シュウ酸塩濃度の質量分析前に－８０℃で保管した。
ｉｎ ｖｉｖｏマウスモデル研究
ｉｎ ｖｉｖｏマウス研究では、０日目に、マウスの体重を測定して、印を付け、４つのグループに無作為に分けた。１日目から以下のプロトコルを使用した。
１日目：
Ｔ０：
－１００μＬ（１００μｇ）の１３Ｃ－シュウ酸塩のＰＯ投与
－２００μＬの治療剤のＰＯ投与
Ｔ１：
－３００μＬの治療剤のＰＯ投与
Ｔ６：尿、糞便を採取
動物に、３×１０１０ＣＦＵの高用量、１×１０１０ＣＦＵの中用量、及び３×１０９の低用量（総ＣＦＵ）を投与した。
図５Ｂに示すように、急性アイソトープモデルのＳＹＮ－５７５２株は、腸内の尿中シュウ酸塩消費を示した。１３Ｃ－シュウ酸塩消費を複数の急性マウス研究で測定し、菌株の効力は、５０～７５％の範囲であった（図５Ｂ）。ＳＹＮ７１６９は、このモデルでＳＹＮ５７５２と類似の挙動を示した。
異なる実験では、オスのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスをグループで飼育し、１３Ｃ－シュウ酸塩（１００μｇ）の用量、続いて、ビヒクル（１３．８％質量／体積トレハロース、６８ｍＭトリス、５５ｍＭ ＨＣｌ、１×ＰＢＳ）またはＳＹＮＢ８８０２の用量を経口投与した。マウスを直ちに代謝ケージに入れ（ｎ＝３／ｃａｇｅ）、最初の投与の１時間後にビヒクルまたはＳＹＮＢ８８０２の別の用量、例えば、１日合計４．７×１０８、４．７×１０９、または４．７×１０１０個の生きた細胞を加えた。最初の投与の６時間後に尿を採取し、１３Ｃ－シュウ酸塩及びクレアチニンレベルを液体クロマトグラフィー／タンデム型質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）で定量した。２つの研究を実施し、その結果を組み合わせた（図５Ｃ）。
ｉｎ ｖｉｖｏサルモデル研究
ｉｎ ｖｉｖｏサル研究では、動物を２つのグループ、ビヒクル（製剤緩衝液）及びＳＹＮ７１６９（５×１０１１）に無作為に分けた。各グループ中Ｎ＝６であった。一晩の絶食後、各動物に同じ量のホウレンソウスムージー、ラベル付けした１３Ｃ－２シュウ酸塩、重炭酸ナトリウム（１Ｍ）、及びビヒクルまたは菌株のいずれかを与えた（表３２を参照されたい）。ホウレンソウスムージーは、若いホウレンソウの葉を水道水に混ぜて滑らかになるまでブレンドし、ホウレンソウ：水の比率が、６０ｇｍ：４０ｍＬとなるように調製した。
具体的には、１日目に治療剤を経口強制飼養によって該当する動物に投与した。キャップされた細菌チューブを各投与の前に３回逆転させた。用量製剤を、プラスチックのシリンジが取り付けられた使い捨てカテーテルを使用して経口強制飼養によって投与した。投与後、強制飼養チューブを５ｍＬの動物用飲料水で動物の胃にすすいだ。清潔な強制飼養チューブを使用して各動物への投与を行った。投与の初日を１日目として設定した。
Figure 2023511282000036
ＰＯ投与の６時間後に尿を採取した。動物を分離し、尿の採取を助けるために、室温で投与前に清潔な採尿受け皿を入れた。投与後６時間の最後に、尿の総量を測定して記録した。固有にラベル付けした透明のポリプロピレンチューブで１ｍＬのサンプルの１アリコートを採取、直ちにドライアイスで凍結した。およそ１００ｕＬの第２アリコートを９６ウェル深型プレートに採取し、直ちにドライアイスで凍結した。
サルまたは非ヒト霊長類（ＮＨＰ）尿におけるシュウ酸塩、１３Ｃ２－シュウ酸塩、及びクレアチニンを、Ｔｈｅｒｍｏ Ｖａｎｑｕｉｓｈ－ＴＳＱ Ａｌｔｉｓ ＬＣ－ＭＳ／ＭＳシステムを使用して、分析物固有の断片生成物の選択的反応モニタリング（ＳＲＭ）を伴う液体クロマトグラフィー（ＬＣ）タンデム型質量分析（ＭＳ／ＭＳ）によって測定した。クレアチニン－ｄ５ ２ｕＬを含有する１０ｍＭの酢酸アンモニウムを注入して尿を１０倍に希釈し、Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＨＳＳ Ｔ３カラム（２．１×１００ｍｍ）を使用して、０．４ｕＬ／ｍｉｎ、及び５０℃で、２分間にわたってＢが０から９５％（Ａ：１０ｍＭの酢酸アンモニウム；Ｂ：アセトニトリル）になるように分離した。ＳＲＭイオントランジションは、エレクトロスプレー陰性モードでは、シュウ酸塩８９＞６１、１３Ｃ２－シュウ酸塩９１＞６２；エレクトロスプレー陽性モードでは、クレアチニン１１４＞４４、クレアチニン－ｄ５ １９９＞４９であった。シュウ酸塩及び１３Ｃ２－シュウ酸塩のサンプル濃度を、ＮＨＰ尿で作られた絶対ピーク面積及びマトリックスベースの標準曲線を用いて計算した。クレアチニン濃度を、クレアチニン／クレアチニン－ｄ５ピーク面積比及び水ベースの標準曲線を用いて計算した。
図６に示すように、ホウレンソウスムージーにより、処置したサルのシュウ酸塩レベルが上昇した一方で、遺伝子改変ＥｃＮ（ＳＹＮ７１６９）は、尿中シュウ酸塩のこれらの増加を大幅に減衰させた。ＳＹＮ７１６９は、ビヒクルよりも、５×１０１０、１×１０１１、５×１０１１または１×１０１２ＣＦＵで、それそれ、用量依存的に尿中シュウ酸塩の回収率を４５％、３７％、４５％及び７５％低下させた（図７Ａを参照）。１３Ｃ－シュウ酸塩に対するＳＹＮ７１６９の効果は、類似の傾向となった（図７Ｂを参照）。結論として、これらの研究により、ＳＹＮ７１６９は急性高シュウ酸尿症を有するサルにおいてシュウ酸塩を消費することができることが示された。
２番目の試験では、１２匹のオスのカニクイザルにビヒクル及びＳＹＮＢ８８０２の両方を与えた。試験の前夜に、動物をおよそ１６～１８時間絶食させた。実験の朝に、各サルをケージから出し、ビヒクル（水）またはホウレンソウ懸濁液（３９ｇ）、重炭酸ナトリウム（１．８ミリモル）、１３Ｃ－シュウ酸塩（５０ｍｇ）、及びビヒクル（１３．８％重量／体積トレハロース、６８ｍＭトリス、５５ｍＭ ＨＣｌ、１×ＰＢＳ）またはＳＹＮＢ８８０２（１×１０１２個の生きた細胞）を投与した。次に動物をケージに戻し、清潔な採尿受け皿を、各ケージの底に設置した。投与の６時間後に尿を採取し、シュウ酸塩、１３Ｃ－シュウ酸塩、及びクレアチニンのレベルを、液体クロマトグラフィー／タンデム型質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）によって定量した（図７Ｃ）。
糞便サンプルからの生存可能ＳＹＮＨＯＸ
マウス及び非ヒト霊長類（ＮＨＰ）の両方に経口投与した６時間後及び２４時間後に糞便内の生存可能ＳＹＮＨＯＸを回収した。かなりの数の生存可能ＳＹＮＨＯＸ（ＳＹＮ７１６９）及びＳＹＮＢ８８０２が、両方の時点で回収された。
生存可能ＳＹＮＢ８８０２及び野生型Ｅ．ｃｏｌｉを、マウス糞便から回収し、それらは摂食後７２時間の間の複数の時点で生存可能であった（図８Ａ）。２４時間後糞便からＳＹＮＢ８８０２は消失したが、その一方で野生型株は摂食後７２時間で消失した。簡単に述べると、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを、グループで飼育し、平均ケージ体重に基づいて複数のグループ（ｎ＝１６）に分けた。マウスに治療剤の単回経口投与量（１．３×１０１０ＣＦＵ）を与え、自然採取により排泄されたばかりの糞便を採取し、５００ｍＬのＰＢＳを含有する事前に計量されたＢｅａｄＢｕｇチューブに入れ、計量し、次いで、採取後直ちに階段希釈プレーティング向けに処理し、生存可能コロニー形成単位（ＣＦＵ）を測定した。データを平均細菌株の糞便回収率±平均の標準誤差として提示する。ＣＦＵ＝コロニー形成単位、ＳＹＮＢ８８０２＊＝抗生物質耐性ＳＹＮＢ８８０２である。
別の実験では、試験の前夜に１２匹のオスのサルを絶食させた。試験の朝、各サルをケージから出し、ホウレンソウ懸濁液、重炭酸ナトリウム、１３Ｃ－シュウ酸塩、及び製剤緩衝液または細菌を投与した。投与の６時間後及び２４時間後に糞便を採取し、総重量を記録した。糞便サンプルをリン酸塩－緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；サンプル重量の１０倍）で均一化し、添加した緩衝液の最終容積を記録した。糞便サンプル懸濁液を、ＰＢＳで段階希釈し、選択的ＬＢ寒天培地にプレーティングし、ＳＹＮ７１６９またはＳＹＮＢ８８０２コロニー形成単位（ＣＦＵ）を計測した（図８Ｂ）。
実施例４：製剤化及びヒトの治療
図９～１０に示すように、それぞれＳＹＢＮＢ８８０２及びＳＹＮ７１６９によるシュウ酸塩消費、凍結乾燥製剤と凍結液体製剤との比較を試験した。オスのカニクイザル（およそ２～５年齢、及び平均体重３．３ｋｇ）を一晩絶食させた。カニクイザル（ｎ＝１２）におよそ４００ｍｇのシュウ酸塩（ラベル付けした１３Ｃ－シュウ酸塩を含む）を含有するホウレンソウ調製物を与えた。一方のグループ（ｎ＝６）には、ＳＹＮＢ８８０２凍結液体の５×１０１１個の生きた細胞を与え、もう一方のグループ（ｎ＝６）にはＳＹＮＢ８８０２凍結乾燥材料の５×１０１１個の生きた細胞を与えた。尿を６時間採取し、累積尿中シュウ酸塩及びクレアチニンレベルを、液体クロマトグラフィー／質量分析によって測定した。上記のＮＨＰ「ホウレンソウスムージー」モデルで試験した菌株及び量を、以下の表３３に開示する。生きた細胞の同定は、少なくとも、表題「Ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｂｙ Ｌｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」のＰＣＴ国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０３０４６８号に記載されているように算出した。なお、上記特許出願の全内容は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
Figure 2023511282000037
図１１Ａに示すように、モデリングでは、ＳＹＮＢ８８０２は目標用量範囲で、２０％～５０％の尿中シュウ酸塩低下を達成する可能性があると予測されている。モデリングには、異なる腸区画内のシミュレートされた条件での菌株活性評価、食事中のシュウ酸塩消費の既知のレベル、消化管におけるシュウ酸塩吸収レベル、及び尿中シュウ酸塩排泄が組み込まれている。したがって、一実施形態では、ＳＹＮＢ８８０２の投薬量は、５×１０１１細胞である。一実施形態では、ＳＹＮＢ８８０２の投薬量は、２×１０１１細胞である。一実施形態では、ＳＹＮＢ８８０２の投薬量は、１×１０１１細胞である。
ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ刺激（ＩＳＳ）は、宿主及び疾患生物学に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ菌株活性の学識と関係がある。菌株側のモデルでは、胃腸生理学の範囲内でのＳＹＮＢ８８０２によるシュウ酸塩の消費をシミュレートした（図１１Ｂ）。宿主側のモデル（全概略）では、身体全体にわたるシュウ酸塩の分布に対するＳＹＮＢ８８０２による消費の影響をシミュレートした（図１１Ｂ）。このモデルでは、ＳＹＮＢ８８０２が食事と共に与えられることが想定され、腸でのシュウ酸塩消費及び血中へのシュウ酸塩の吸収の低下が予測された。ＩＳＳにより、ＳＹＮＢ８８０２が１×１０１１細胞を超える用量で、患者において２０％を超える尿中シュウ酸塩低下を達成する可能性があると予測された。
ＩＳＳにより、尿中シュウ酸塩の用量依存的低下が予測された（図１１Ｃ）。データは、ＨＯＸ患者における食事中のシュウ酸塩吸収の増加（４倍の健康な吸収）のベースライン仮定を表し、画定された領域は仮定の範囲（３倍～５倍の健康な吸収）を表している。
実施例５：臨床試験
第Ｉパート臨床試験は、健康なボランティア（ＨＶ）を対象に、入院患者二重盲検ランダム化プラセボ対照反復漸増投与（ＭＡＤ）試験でＳＹＮＢ８８０２を試験するデザインであった。ＳＹＮＢ８８０２を、反復漸増投与で、例えば、１×１０１１ 細胞、３×１０１１細胞、及び１×１０１２細胞で、好ましくは、６×１０１１細胞及び２×１０１２細胞の用量で、あるいはプラセボを投与する。ＳＹＮＢ８８０２の用量は、２×１０１２細胞を超えないことが好ましい。用量を、５日間、１日３回（ＴＩＤ）投与する。４日以内に、最終用量濃度に達成するまで反復漸増投与する。第Ｉパートの任意のコホートには、５日間、１日３回投与された、最初に試験したコホートからのデータに基づいて決定される用量でＳＹＮＢ８８０２が投与される健康なボランティアが含まれる。
第ＩＩパート臨床試験は、腸性高シュウ酸尿症を有する患者を対象に、外来患者二重盲検（治験依頼者非盲検）ランダム化プラセボ対照クロスオーバー試験でＳＹＮＢ８８０２を試験するデザインであった。期間１のベースラインＵＯｘレベルを判定するために、治験薬（ＩＭＰ）の初回投与の７日間以内に２４時間尿サンプルを３日間採取する（図１２）。１×１０１１、３×１０１１、または１×１０１２ではあるが、２×１０１２は超えない用量でＩＭＰを、ＴＩＤ投与する。被験者は、各期間の初回ＩＭＰ投与の４日前から開始し、各期間の最後のＩＭＰ投与まで、プロトンポンプ阻害剤（ＰＰＩ；エソメプラゾール）を１日１回、選択した食事の６０～９０分前に服用する。被験者を１日目にランダム化し、第１パートで決定された最大耐量（ＭＴＤ）以下のＳＹＮＢ８８０２、またはプラセボを投与し、１～６日目に食事と共に１日３回（ＴＩＤ）投与する。４日以内に、最終用量濃度に達成するまで反復漸増投与する。２４時間シュウ酸塩レベル判定のための尿サンプルを４～６日目に採取する。少なくとも２週間から４週間以内のウォッシュアウト期間後、被験者をクロスオーバーし、第２期間を開始する。期間２のベースラインＵＯｘレベルを判定するために、期間２のＩＭＰの初回投与の７日間以内に２４時間尿サンプルを３日間採取する。その後、被験者をクロスオーバーし、６日間、ＳＹＮＢ８８０２またはプラセボを投与する。２４時間シュウ酸塩レベルの尿サンプルを、期間２の４日目、５日目、及び６日目に再度採取する。ＩＭＰの最後の投与から７日後に安全性経過観察訪問（または遠隔医療）を行う。被験者は、ＩＭＰの最後の投与後４週間、毎週糞便のサンプルを採取する。
Figure 2023511282000038
Figure 2023511282000039
主要なアウトカム指標は、治療下で現れた有害事象を示す被験者の数である。毒性は、米国国立がん研究所の有害事象の共通用語（ＣＴＣＡＥ０、第５．０版）に従って分類した。有害事象（ＡＥ）は、同意書に署名した時点から、安全性経過観察期間終了までの、臨床検査、バイタルサイン、身体検査、心電図、及びその他の医学的に必要な評価に基づいて報告される。ＡＥは、試験治療の最初の投与後にＡＥが発生するか、または重症度が悪化した場合、治療により現れたもの（ＴＥＡＥ）と見なされる。治験薬との因果関係が、関連あるかもしれない、おそらく関連あり、または明らかに関連ありの場合、ＴＥＡＥは投与に関連したと見なされる。
適格基準
第Ｉパート：選択基準
１． 年齢１８歳以上６４歳未満。
２． 肥満指数（ＢＭＩ）１８．５～２８ｋｇ／ｍ２。
３． 同意書の処置を自発的に完了する能力があり、その意思があること。
４． 糞便、尿、及び血液採取、食事管理の遵守、入院患者モニタリング、経過観察訪問、ならびに全ての試験手順の遵守を含む、全ての試験手順を行う能力があり、同意すること。
５． 性的に禁欲的もしくは不妊手術（精管切除）を受けた男性被験者、または女性パートナー（複数可）と性的に活動的であり、同意取得後、試験全体を通して、ＩＭＰの最後の投与後最低３ヶ月間、許容可能な避妊法（殺精子剤含有のコンドームなど）と併せて妊娠していない女性パートナー（複数可）に対する許容可能な避妊法（選択基準番号６に記載するような）の使用に同意する男性被験者、及びスクリーニングから治験薬の投与後３ヶ月までの期間に精子を提供する意思のない男性被験者。
６． 下記のうち１つを満たす女性被験者：
ａ． 妊娠可能な女性（ＷＯＣＢＰ）は、ＩＭＰの開始前にスクリーニング時及びベースライン時に妊娠試験（ヒト絨毛性ゴナドトロピン）が陰性でなければならず、同意取得後、試験全体を通して、ＩＭＰの最後の投与後最低３ヶ月間、許容可能な避妊法（複数可）と併せて男性パートナー（複数可）に対する許容可能な避妊法（選択基準番号５に記載するような）の使用に同意しなければならない。許容可能な避妊法としては、ホルモン不妊法、ホルモン性もしくは非ホルモン性子宮内避妊器具、両側卵管閉塞、完全禁欲、処置の３ヶ月後に無精子症であることが文書で証明されている精管切除術を行ったパートナー、殺精子剤含有のペッサリー、殺精子剤含有の子宮頚部キャップ、殺精子剤含有の膣内スポンジ、または殺精子剤含有もしくは非含有の男性用もしくは女性用コンドーム、が挙げられる。
ｂ． 以下のうち少なくとも１つを伴う閉経前女性：
ｉ． 子宮摘出が文書で証明されていること。
ｉｉ． 両側卵管摘除が文書で証明されていること。
ｉｉｉ． 両側卵巣摘出が文書で証明されていること。
ｉｖ． 卵管結紮／閉塞が文書で証明されていること。
ｖ． 性的禁欲が好ましい、または被験者の通常のライフスタイル。
ｃ． 閉経後女性（卵胞刺激ホルモン［ＦＳＨ］試験によってか１２ヶ月以上の無月経が確認されており、他の生物学的もしくは生理学的原因がない４５歳以上）。
第Ｉパート：除外基準
１． 治験責任医師によって、被験者は登録に不適当と評価される、試験への参加に関連する被験者のリスクを増大させ、試験手順及び要件の遵守を損なう可能性があるか、または試験の安全性またはＰＤの結果の解釈を混乱させる可能性がある、急性もしくは慢性の医学的病態（ＣＯＶＩＤ－１９感染を含む）、外科的病態、精神医学的病態、もしくは社会的病態、または臨床検査異常。
２． 肥満指数（ＢＭＩ）が１８．５ｋｇ／ｍ２未満、または２８ｋｇ／ｍ２を超えている。
３． Ｏｘａｌｏｂａｃｔｅｒ ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ保菌者。
４． 妊娠中（本人もしくはパートナー）または授乳中。
５． 試験期間中、ビタミンＣ補給を中止することができないか、中止する意思がない。
６． 自己免疫障害及びヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗体陽性を含む、免疫不全障害の病歴があるか、罹患中。
７． Ｂ型肝炎表面抗原陽性（ただし、Ｂ型肝炎表面抗体陽性及びＢ型肝炎コア抗体陽性の被験者は、Ｂ型肝炎表面抗原が陰性であれば除外しない）。
８． Ｃ型肝炎抗体陽性、ただしＣ型肝炎ウイルスのリボ核酸検査を実施し、その結果が陰性である場合を除く。
９． 予想されるＩＭＰの初回投与前の３０日以内に治験責任医師によって臨床的に問題であると見なされた発熱性疾患、菌血症の確認、または他の活動性感染症の病歴。
１０． １日あたり３回以上の軟便通過歴（過去１ヶ月以内に）；この際、「軟便」とは、Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｓｔｏｏｌ Ｃｈａｒｔのタイプ６またはタイプ７として規定されているものを指す（補足資料１：Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｓｔｏｏｌ Ｃｈａｒｔを参照されたい）。
１１． 腎臓結石、腎臓、または膵臓疾患の病歴。
１２． ＵＯｘレベルの上昇が関連する可能性のある消化管障害（あらゆるグレードの炎症性障害もしくは過敏性腸障害及び腸部分の外科的除去を含む）。
１３． スクリーニング訪問前の６０日以内に、入院関連事象（複数可）または吐血もしくは血便の既往歴によって確認された消化管出血の罹患中、または消化管出血の病歴。
１４． ＥｃＮ、エソメプラゾール、もしくはＰＰＩ全般、またはＳＹＮＢ８８０２もしくはプラセボ製剤内の成分のいずれかに対する不耐性、またはアレルギー反応。
１５． 薬剤もしくは栄養素の吸収に影響を及ぼす可能性がある、あらゆる条件（例えば、セリアック病、胃切除、バイパス手術、回腸瘻造設）、処方薬または市販薬。
１６．１日目の３０日前から入院患者モニタリングの最終日までに全身性（例えば、経口または静脈内）抗生物質のいずれかのタイプを服用中または服用する予定。例外：局所抗生物質は許容される。
１７． 大手術（頭蓋、胸部、腹部、もしくは骨盤腔内部の臓器に対する手術）またはスクリーニング前の過去３ヶ月以内の入院患者としての入院。
１８． スクリーニングから予測される最終訪問までの間の、抗生物質を必要とする、予定された手術、入院、歯科治療、または介入研究。
１９． １日目以前の３０日以内、及び参加から経過観察の期間中にプロバイオティックサプリメント（補強食品を除く）を服用中または服用する予定。
２０． アルコール依存症または薬物乱用。
２１． スクリーニング訪問前の３０日以内もしくは５半減期のいずれか長い方の期間内の治験薬の投与または摂食；あるいは現在何らかの治験に組み入れられている。
２２． 標準レンジに基づくか、下記表で定義されているか、または治験責任医師によって臨床的に問題であると判断される正常範囲を超えるスクリーニング臨床検査パラメータ（例えば、化学的パネル、血液学、凝固）及びＥＣＧ。１回の再評価が許容可能である。
第ＩＩパート：選択基準
１． 年齢１８歳以上７４歳未満。
２． 同意書の処置を自発的に完了する能力があり、その意思があること。
３． 糞便、尿、及び血液採取、食事管理の遵守、経過観察訪問、ならびに全ての試験手順の遵守を含む、全ての試験手順を行う能力があり、同意すること。
４． ルーＹ肥満手術に続発する（術後少なくとも１２ヶ月）腸性高シュウ酸尿症。
５． 尿中シュウ酸塩が７０ｍｇ／２４時間以上である（スクリーニングの間の少なくとも２回の採尿の平均）。
６． 性的に禁欲的もしくは不妊手術（精管切除）を受けた男性被験者、または女性パートナー（複数可）と性的に活動的であり、同意取得後、試験全体を通して、ＩＭＰの最後の投与後最低３ヶ月間、許容可能な避妊法（殺精子剤含有のコンドームなど）と併せて妊娠していない女性パートナー（複数可）に対する許容可能な避妊法（選択基準番号７に記載するような）の使用に同意する男性被験者、及びスクリーニングから治験薬の投与後３ヶ月までの期間に精子を提供する意思のない男性被験者。
７． 下記のうち１つを満たす女性被験者：
ａ． 妊娠可能な女性（ＷＯＣＢＰ）は、ＩＭＰの開始前にスクリーニング時及びベースライン時に妊娠試験（ヒト絨毛性ゴナドトロピン）が陰性でなければならず、同意取得後、試験全体を通して、ＩＭＰの最後の投与後最低３ヶ月間、許容可能な避妊法（複数可）と併せて男性パートナー（複数可）に対する許容可能な避妊法（選択基準番号６に記載するような）の使用に同意しなければならない。許容可能な避妊法としては、ホルモン不妊法、ホルモン性もしくは非ホルモン性子宮内避妊器具、両側卵管閉塞、完全禁欲、処置の３ヶ月後に無精子症であることが文書で証明されている精管切除術を行ったパートナー、殺精子剤含有のペッサリー、殺精子剤含有の子宮頚部キャップ、殺精子剤含有の膣内スポンジ、または殺精子剤含有もしくは非含有の男性用もしくは女性用コンドーム、が挙げられる。
ｂ． 以下のうち少なくとも１つを伴う閉経前女性：
ｉ． 子宮摘出が文書で証明されていること。
ｉｉ． 両側卵管摘除が文書で証明されていること。
ｉｉｉ． 両側卵巣摘出が文書で証明されていること。
ｉｖ．卵管結紮／閉塞が文書で証明されていること。
ｖ．性的禁欲が好ましい、または被験者の通常のライフスタイル。
ｃ． 閉経後女性（ＦＳＨ試験によってか１２ヶ月以上の無月経が確認されており、他の生物学的もしくは生理学的原因がない４５歳以上）。
８． スクリーニング臨床検査評価（例えば、化学的パネル、白血球百分率を伴う全血球計算、プロトロンビン時間［ＰＴ］／活性化部分トロンボプラスチン時間［ａＰＴＴ］、尿検査）、及び心電図（ＥＣＧ）が、正常範囲内であるか、治験責任医師によって臨床的に問題となるものではないと判定されなければならない。
第ＩＩパート：除外基準
１． 治験責任医師によって、被験者は登録に不適当と評価される、試験への参加に関連する被験者のリスクを増大させ、試験手順及び要件の遵守を損なう可能性があるか、または試験の安全性またはＰＤの結果の解釈を混乱させる可能性がある、急性もしくは慢性の医学的病態（ＣＯＶＩＤ－１９感染を含む）、外科的病態、精神医学的病態、もしくは社会的病態、または臨床検査異常。
２． 急性腎不全またはｅＧＦＲが４５ｍＬ／ｍｉｎ／１．７３ｍ２未満。１回の再評価が許容可能である。
３． 試験期間中、ビタミンＣ補給を中止することができないか、中止する意思がない。
４． 原発性高シュウ酸尿症または高シュウ酸尿症いずれかの他の原因との診断。
５． Ｏｘａｌｏｂａｃｔｅｒ ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ保菌者。
６． 妊娠中（本人もしくはパートナー）または授乳中。
７． １日目の３０日前から最後の安全性評価までに全身性（例えば、経口または静脈内）抗生物質のいずれかのタイプを服用中または服用する予定。例外：局所抗生物質は許容される。
８． 大手術（頭蓋、胸部、腹部、もしくは骨盤腔内部の臓器に対する手術）またはスクリーニング前の過去３ヶ月以内の入院患者としての入院。
９． スクリーニングから予測される最終訪問までの間の、予定された手術、入院、歯科治療、または介入研究。
１０． １日目以前の３０日以内、及び参加期間中にプロバイオティックサプリメント（補強食品を除く）を服用中または服用する予定。
１１． ＥｃＮ、エソメプラゾール、もしくはＰＰＩ全般、またはＳＹＮＢ８８０２もしくはプラセボ製剤内の成分のいずれかに対する不耐性、またはアレルギー反応。
１２． アルコール依存症または薬物乱用。
１３． 自己免疫障害及びＨＩＶ抗体陽性を含む、免疫不全障害の病歴があるか、罹患中。
１４．Ｂ型肝炎表面抗原陽性（ただし、Ｂ型肝炎表面抗体陽性及びＢ型肝炎コア抗体陽性の被験者は、Ｂ型肝炎表面抗原が陰性であれば除外しない）。
１５．Ｃ型肝炎抗体陽性、ただしＣ型肝炎ウイルスのリボ核酸検査を実施し、その結果が陰性である場合を除く。
１６． スクリーニング訪問前の３０日以内もしくは５半減期のいずれか長い方の期間内の治験薬の投与または摂食；あるいは現在何らかの治験に組み入れられている。
１７． 予想されるＩＭＰの初回投与前の３０日以内の菌血症の病歴。
１８． 炎症性腸疾患の病歴。
Figure 2023511282000040
等価物
当業者は、本明細書に記載された特定の実施形態及び方法に対する多くの等価物を、認識し、通例にすぎない実験を使用して確認することができるであろう。そのような等価物は、添付の特許請求の範囲の範囲に包含されることが意図される。

Claims (53)

  1. 対象におけるシュウ酸塩のレベルを低下させる方法であって、自然界におけるシュウ酸塩異化酵素遺伝子と関連のない、直接的または間接的な第１プロモーターに操作可能に連結された、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素をコードする１つ以上の遺伝子配列を含む組換え細菌を含む医薬組成物を前記対象に投与して、それにより前記対象におけるシュウ酸塩のレベルを低下させることを含む、前記方法。
  2. 前記組換え細菌は、少なくとも約１μｍｏｌ／１×１０９細胞のシュウ酸塩消費活性を有する、請求項１に記載の方法。
  3. 前記組換え細菌は、嫌気的条件下で、約５０～約６００ｍｇ／日のシュウ酸塩消費活性を有する、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記組換え細菌は、嫌気的条件下で、約２１１ｍｇ／日のシュウ酸塩消費活性を有する、請求項３に記載の方法。
  5. 前記組換え細菌は、前記対象に１日３回投与された場合に、嫌気的条件下で、約２１１ｍｇ／日のシュウ酸塩消費活性を有する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
  6. 前記嫌気的条件は、前記対象の腸及び／または結腸内の条件である、請求項３～５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 前記方法は、前記対象におけるシュウ酸塩の急性レベルを約２分の１に低下させる、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
  8. 前記方法は、前記対象におけるシュウ酸塩の急性レベルを約３分の１に低下させる、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  9. 前記方法は、前記対象におけるシュウ酸塩の慢性レベルを約２分の１に低下させる、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  10. 前記方法は、前記対象におけるシュウ酸塩の慢性レベルを約３分の１に低下させる、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  11. 前記方法は、前記対象におけるシュウ酸塩の急性レベルを、約２５ｍｇ／日、約３０ｍｇ／日、約４０ｍｇ／日、約５０ｍｇ／日、約６０ｍｇ／日、約７０ｍｇ／日、約８０ｍｇ／日、約９０ｍｇ／日、または約１００ｍｇ／日まで低下させる、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  12. 前記方法は、前記対象におけるシュウ酸塩の慢性レベルを、約２５ｍｇ／日、約３０ｍｇ／日、約４０ｍｇ／日、約５０ｍｇ／日、約６０ｍｇ／日、約７０ｍｇ／日、約８０ｍｇ／日、約９０ｍｇ／日、または約１００ｍｇ／日まで低下させる、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  13. 前記組換え細菌は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属のものである、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
  14. 前記組換え細菌は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ種Ｎｉｓｓｌｅ株のものである、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記医薬組成物は、経口投与される、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
  16. 前記対象は、前記医薬組成物の投与の１時間以内に食事を与えられる、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
  17. 前記対象は、前記医薬組成物の投与と同時に食事を与えられる、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。
  18. 前記対象は、ヒト対象である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
  19. 前記１つ以上の遺伝子配列は、ｓｃａａＥ３遺伝子、ｆｒｃ遺伝子、及びｏｘｄＣ遺伝子を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
  20. 前記ｓｃａａＥ３遺伝子は、配列番号３に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する配列を含むか、配列番号３を含むか、または配列番号３からなる、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記ｆｒｃ遺伝子は、配列番号１に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する配列を含むか、配列番号１を含むか、または配列番号１からなる、請求項１９または２０に記載の方法。
  22. 前記ｏｘｄＣ遺伝子は、配列番号２に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する配列を含むか、配列番号２を含むか、または配列番号２からなる、請求項１９～２１のいずれか１項に記載の方法。
  23. 前記組換え細菌は、シュウ酸塩取り込み輸送体をコードする遺伝子をさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
  24. 前記シュウ酸塩取り込み輸送体をコードする遺伝子は、ｏｘｌＴ遺伝子である、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記ｏｘｌＴ遺伝子は、配列番号１１に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する配列を含むか、配列番号１１を含むか、または配列番号１１からなる、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記組換え細菌は、栄養要求性をさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
  27. 前記栄養要求性は、ｔｈｙＡ栄養要求性である、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記組換え細菌は、内因性ファージの欠失をさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
  29. 前記内因性ファージは、配列番号６３に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する配列を含むか、配列番号６３を含むか、または配列番号６３からなる、請求項２６に記載の方法。
  30. 前記組換え細菌は、抗生物質耐性をコードする遺伝子を含まない、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
  31. 前記第１プロモーターは、誘導性プロモーターであり、必要に応じて前記誘導性プロモーターは、ＦＮＲプロモーターであり、必要に応じて前記ＦＮＲプロモーターは、配列番号１３～２９のうち任意の１つに対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する配列を含むか、配列番号１３～２９のうち任意の１つを含むか、または配列番号１３～２９のうち任意の１つからなる、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
  32. 前記組換え細菌は、ＳＹＮ５７５２、ＳＹＮ７１６９、またはＳＹＮＢ８８０２である、請求項１～１７のいずれか１項に記載の方法。
  33. 前記対象は、高シュウ酸尿症を患っている、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
  34. 前記高シュウ酸尿症は、原発性高シュウ酸尿症、食事性高シュウ酸尿症、または腸性高シュウ酸尿症である、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記対象は、短腸症候群、慢性膵炎、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、嚢胞性線維症、腎疾患を患っている、及び／またはルー－エン－Ｙ胃バイパスを受けている、請求項３３または３４に記載の方法。
  36. 前記対象の前記投与前の尿中シュウ酸塩（Ｕｏｘ）レベルは、少なくとも７０ｍｇ／日である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
  37. 前記対象は、前記投与後、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、または８０％のＵｏｘレベルの低下を示す、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
  38. 前記対象は、前記投与前に、ｅＧＦＲが３０ｍＬ／分／１．７３ｍ２未満であるか、血液透析を必要とするか、または全身性シュウ酸症を患っている、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
  39. 前記組換え細菌は、約１×１０１１個の生きた組換え細菌、約３×１０１１個の生きた組換え細菌、約６×１０１１個の生きた組換え細菌、約１×１０１２個の生きた組換え細菌、または約２×１０１２個の生きた組換え細菌の用量で投与される、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
  40. 前記組換え細菌は、約６×１０１１個の生きた組換え細菌の用量で投与される、請求項１～３８のいずれか１項に記載の方法。
  41. 前記組換え細菌は、約２×１０１２個の生きた組換え細菌の用量で投与される、請求項１～３８のいずれか１項に記載の方法。
  42. 前記組換え細菌は、約１×１０１２個の生きた組換え細菌の用量で投与される、請求項１～３８のいずれか１項に記載の方法。
  43. 前記組換え細菌は、約１×１０１１個の生きた組換え細菌の用量で投与される、請求項１～３８のいずれか１項に記載の方法。
  44. 前記組換え細菌は、約３×１０１１個の生きた組換え細菌の用量で投与される、請求項１～３８のいずれか１項に記載の方法。
  45. 前記投与は、１日３回の食事と共に約５×１０１１個の生きた組換え細菌を投与する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
  46. プロトンポンプ阻害剤（ＰＰＩ）を前記対象に投与することをさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
  47. 前記ＰＰＩは、エソメプラゾールである、請求項４６に記載の方法。
  48. 前記ＰＰＩの前記投与は、１日１回である、請求項４６または４７に記載の方法。
  49. 自然界におけるシュウ酸塩異化酵素遺伝子と関連のない、直接的または間接的な第１プロモーターに操作可能に連結された、１つ以上のシュウ酸塩異化酵素をコードする１つ以上の遺伝子配列を含む、組換え細菌。
  50. 前記組換え細菌は、少なくとも約１μｍｏｌ／１×１０９細胞のシュウ酸塩消費活性を有する、請求項４９に記載の組換え細菌。
  51. 前記組換え細菌は、嫌気的条件下で、約５０～６００ｍｇ／日のシュウ酸塩消費活性を有する、請求項４９または５０に記載の組換え細菌。
  52. 前記組換え細菌は、ＳＹＮＢ８８０２、ＳＹＮ７１６９、またはＳＹＮ５７５２である、請求項４５～５０のいずれか１項に記載の組換え細菌。
  53. 前記組換え細菌は、ＳＹＮＢ８８０２である、請求項５２に記載の組換え細菌。
JP2022542946A 2020-01-14 2021-01-14 シュウ酸塩が有害となる障害を治療するための遺伝子改変細菌 Pending JP2023511282A (ja)

Applications Claiming Priority (15)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202062960950P 2020-01-14 2020-01-14
US62/960,950 2020-01-14
US202062993301P 2020-03-23 2020-03-23
US62/993,301 2020-03-23
US202063028902P 2020-05-22 2020-05-22
US63/028,902 2020-05-22
US202063065752P 2020-08-14 2020-08-14
US63/065,752 2020-08-14
US202063089758P 2020-10-09 2020-10-09
US63/089,758 2020-10-09
US202063091620P 2020-10-14 2020-10-14
US63/091,620 2020-10-14
US202063111376P 2020-11-09 2020-11-09
US63/111,376 2020-11-09
PCT/US2021/013401 WO2021146397A1 (en) 2020-01-14 2021-01-14 Bacteria engineered to treat disorders in which oxalate is detrimental

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2023511282A true JP2023511282A (ja) 2023-03-17
JPWO2021146397A5 JPWO2021146397A5 (ja) 2024-01-22

Family

ID=76864711

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2022542946A Pending JP2023511282A (ja) 2020-01-14 2021-01-14 シュウ酸塩が有害となる障害を治療するための遺伝子改変細菌

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20230092431A1 (ja)
EP (1) EP4090343A4 (ja)
JP (1) JP2023511282A (ja)
CN (1) CN115335066A (ja)
AU (1) AU2021207879A1 (ja)
BR (1) BR112022013867A2 (ja)
CA (1) CA3167754A1 (ja)
IL (1) IL294710A (ja)
WO (1) WO2021146397A1 (ja)

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2739345A1 (en) * 2008-09-30 2010-04-08 Meiji Dairies Corporation Lactic acid bacterium having high oxalic acid decomposition ability
US11273184B2 (en) * 2015-08-31 2022-03-15 Synlogic Operating Company, Inc. Bacteria engineered to treat disorders in which oxalate is detrimental
IT201800005355A1 (it) * 2018-05-14 2019-11-14 Lactobacillus amylovorus SGL 14: attività probiotiche e riduzione dell’ossalato enterico

Also Published As

Publication number Publication date
CN115335066A (zh) 2022-11-11
EP4090343A4 (en) 2024-02-14
IL294710A (en) 2022-09-01
CA3167754A1 (en) 2021-07-22
WO2021146397A1 (en) 2021-07-22
US20230092431A1 (en) 2023-03-23
AU2021207879A1 (en) 2022-09-08
BR112022013867A2 (pt) 2022-09-13
EP4090343A1 (en) 2022-11-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7245271B2 (ja) 高フェニルアラニン血症を低減させるように操作された細菌
US20220233609A1 (en) Bacteria engineered to treat disorders in which oxalate is detrimental
US10273489B2 (en) Bacteria engineered to treat diseases that benefit from reduced gut inflammation and/or tightened gut mucosal barrier
JP6993970B2 (ja) 高フェニルアラニン血症を低減させるように操作された細菌
KR20170121291A (ko) 감소된 창자 염증 및/또는 강화된 창자 점막 장벽으로부터 이익을 얻는 질병을 치료하기 위해 공학처리된 박테리아
WO2017123592A1 (en) Bacteria engineered to treat disorders associated with bile salts
WO2017023818A1 (en) Bacteria engineered to treat disorders involving propionate catabolism
US20230092431A1 (en) Bacteria engineered to treat disorders in which oxalate is detrimental
CA3212817A1 (en) Bacteria engineered to treat disorders in which oxalate is detrimental
JP7494345B2 (ja) 高フェニルアラニン血症を低減させるように操作された細菌
CN117083068A (zh) 经工程化以治疗其中草酸盐有害的病症的细菌
WO2023250478A1 (en) Recombinant bacteria engineered to treat diseases associated with methionine metabolism and methods of use thereof

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20240112

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20240112