CN117083068A - 经工程化以治疗其中草酸盐有害的病症的细菌 - Google Patents
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- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了重组细菌细胞,其包含编码至少一种草酸分解代谢酶的至少一个异源基因。在另一个方面,重组细菌细胞还包含编码草酸盐输入蛋白的至少一个异源基因。本发明还提供了包含重组细菌的药物组合物以及使用本发明的药物组合物治疗其中草酸盐有害的病症诸如高草酸尿症的方法。
Description
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背景技术
草酸盐(草酸的离子形式)在人体内起源于饮食摄入或内源性合成。草酸盐普遍存在于植物和植物源性食物中,并因此不可避免地成为人类饮食的一部分。内源性合成的草酸盐主要来源于肝脏中的乙醛酸盐,在肝脏中过量的乙醛酸盐通过乙醇酸氧化酶(glycolate oxidase)或乳酸脱氢酶转化为草酸(Robijn等人,Kidney Int.80:1146-58(2011))。健康个体通常每24小时排泄在20-40mg草酸盐之间范围内的尿草酸盐。然而,尿草酸盐排泄浓度超过每24小时40-45mg时,在临床上被认为是高草酸尿症(hyperoxaluria)(Robijn等人(2011))。高草酸尿症的特征在于草酸盐的尿排泄增加和全身水平升高,并且在原发性高草酸尿症中,尿草酸盐水平通常为每24小时约90-500mg,并且在肠道高草酸尿症中为每24小时约45-130mg。如果不进行治疗,高草酸尿症可能导致显著的发病率和死亡率,包括肾结石(肾脏结石)、肾钙质沉着症(肾中钙增加)、结晶病(crystallopathy)以及最重要的终末期肾病的发生(Tasian等人,J.Am.Soc.Nephrol.,2018;29(6):1731-1740;以及Siener等人,Kidney International,2013:83:1144-1149)。
高草酸尿症一般可以分为两种临床类型:原发性高草酸尿症和继发性高草酸尿症。原发性高草酸尿症是由参与草酸盐代谢的几个基因之一中的突变引起的常染色体隐性遗传疾病(Hoppe等人,Nephr.Dial.Transplant.26:3609-15(2011))。原发性高草酸尿症的特征在于尿草酸盐排泄升高,其最终可能导致复发性尿石症、结晶病、进行性肾钙质沉着症和早期终末期肾病。此外,当原发性高草酸尿症患者出现慢性肾功能不全时,各种器官系统中可能会出现草酸钙的全身沉积(也称为草酸盐沉着),这可能导致骨病、促红细胞生成素难治性贫血、皮肤溃疡、手指坏疽、心律失常和心肌病(Hoppe等人(2011))。
原发性I型高草酸尿症(PHI)是最常见和最严重的高草酸尿症形式,并且是由维生素B6依赖性肝过氧化物酶体酶丙氨酸乙醛酸氨基转移酶(AGT,由AGXT基因编码)的缺陷引起,所述丙氨酸乙醛酸氨基转移酶催化乙醛酸盐向甘氨酸盐的转氨作用(Purdue等人,J.Cell Biol.111:2341-51(1990);Hoppe等人,Kidney Int.75:1264-71(2009))。AGT缺乏使乙醛酸盐被还原成乙醇酸盐,乙醇酸盐然后被氧化产生草酸盐。已经鉴定了人AGXT基因的超过140个突变(Williams等人,Hum.Mut.30:910-7(2009))。原发性II型高草酸尿症(PHII)是由酶乙醛酸/羟基丙酮酸还原酶(GRHPR)的突变引起的,所述酶是具有乙醛酸还原酶(GR)、羟基丙酮酸还原酶(HPR)和D-甘油酸脱氢酶的酶(DGDH)活性(参见例如,Cramer等人,Hum.Mol.Gen.8:2063-9(1999))。已经鉴定了人GRHPR基因的超过十二个突变(Cregeen等人,Hum.Mut.22:497(2003))。PHI和PHII两者都会导致严重的高草酸尿症(Robijn等人(2011))。原发性III型高草酸尿症(PHIII)由HOGA1基因中的突变引起,所述基因编码4-羟基2-酮戊二酸醛缩酶,这是一种将4-羟基2-酮戊二酸盐分解为丙酮酸盐和乙醛酸盐的线粒体酶(Pitt等人,JIMD Reports 15:1-6(2015))。已经鉴定了人HOGA1基因中的15个突变(Bhasin等人,World J.Nephrol.4:235-44(2015))。
继发性高草酸尿症通常是由以草酸盐吸收增加为基础的疾患(包括草酸盐的饮食摄入增加、草酸盐的肠道吸收增加、草酸盐前体的过量摄入、肠道微生物群落失衡和肠道草酸盐转运蛋白的遗传变异)引起的(Bhasin等人,2015;Robijn等人(2011))。在患有多种肠道病症(包括细菌过度生长综合征、克罗恩病(Crohn’s disease)、炎性肠病以及其他吸收不良状态(诸如在因肥胖进行空肠回肠旁路术之后、在胃溃疡手术之后和慢性肠系膜缺血))的患者中观察到草酸盐吸收增加,伴随必然的高草酸尿症,通常称为肠高草酸尿症(Pardi等人,Am.J.Gastroenterol.93:500-14(1998);Hylander 等人,Scand.J.Gastroent.15:349-52(1980);Canos等人,Can.Med.Assoc.J.124:729-33(1981);Drenick等人,Ann.Intern.Med.89:594-9(1978))。此外,肾移植后也可能出现高草酸尿症(Robijn等人(2011))。患有继发性高草酸尿症和肠高草酸尿症的患者易患上草酸钙结石,这可能导致严重的肾脏损害,并最终导致终末期肾病。
目前可用的高草酸尿症治疗是不够的。治疗原发性高草酸尿症的策略包括用吡多辛减少尿草酸盐,这仅在不到一半的PHI患者中有效,而对PHII和PHIII患者无效(Hoppe等人(2011))。此外,用柠檬酸盐、正磷酸盐和镁来增加草酸钙的尿溶解度并从而保护肾功能的治疗尚未得到很好地表征(Hoppe等人(2011))。治疗继发性和肠高草酸尿症的其他策略相当费力且通常无效,包括减少草酸盐的饮食摄入、口服钙补充和使用胆汁酸螯合剂(Parivar等人,J.Urol.155:432-40(1996);Hylander等人(1980);McLeod和Churchhill,J.Urol.148:974-8(1992))。一般来说,饮食限制并不完全有效,因为患者不能容易地识别要避免的食物(Parivar等人(1996))。因此,对高草酸尿症的有效、可靠和/或长期治疗的需求仍未得到满足。
发明内容
本公开提供了工程化细菌细胞、其药物组合物以及调节和治疗其中草酸盐是有害的病症的方法。具体而言,本文公开的工程化细菌已被构建成包含由例如治疗所述疾病的一种或多种草酸分解代谢基因(oxalate catabolism gene)构成的遗传回路,以及设计成确保被施用工程化细菌的受试者的安全性和不建群的其他任选回路(例如营养缺陷型)这些工程化细菌是安全的且耐受性良好,并且增强受试者微生物组的固有活性以达到治疗效果。
在一个实施方案中,本文公开了降低受试者的草酸盐水平的方法,所述方法包括向所述受试者施用包含重组细菌的药物组合物,所述重组细菌包含编码一种或多种草酸分解代谢酶的一个或多个基因序列,所述一个或多个基因序列可操作地连接到天然地与草酸分解代谢酶基因不相关直接或间接第一启动子上,从而降低所述受试者的草酸盐水平。在一个实施方案中,所述一个或多个基因序列直接与第一启动子可操作地连接。在另一个实施方案中,所述一个或多个基因序列间接与第一启动子可操作地连接。在一个实施方案中,第一启动子是诱导型启动子。在另一个实施方案中,第一启动子是组成型启动子。
在一个实施方案中,重组细菌具有1μmol/1x109个细胞的草酸盐消耗活性。在一个实施方案中,重组细菌具有约50-600mg/天、约100-550mg/天、约100-500mg/天、约100-400mg/天、约100-300mg/天的草酸盐消耗活性。在一个实施方案中,重组细菌具有约150-300mg/天的草酸盐消耗活性。在一个实施方案中,重组细菌具有约50mg/天、约100mg/天、约150mg/天、约200mg/天、约210mg/天、约211mg/天、约225mg/天、约250mg/天、约275mg/天、约300mg/天、约325mg/天、约350mg/天、约350mg/天、约375mg/天、约400mg/天、约425mg/天、约450mg/天、约475mg/天、约500mg/天、约525mg/天、约550mg/天、约575mg/天或约600mg/天的草酸盐消耗活性。在一个实施方案中,重组细菌在厌氧条件下具有约50mg/天、约100mg/天、约150mg/天、约200mg/天、约211mg/天、约225mg/天、约250mg/天、约275mg/天、约300mg/天、约325mg/天、约350mg/天、约350mg/天、约375mg/天、约400mg/天、约425mg/天、约450mg/天、约475mg/天、约500mg/天、约525mg/天、约550mg/天、约575mg/天或约600mg/天的草酸盐消耗活性。在一个实施方案中,重组细菌在向受试者每天施用三次时在厌氧条件下具有约50mg/天、约100mg/天、约150mg/天、约200mg/天、约211mg/天、约225mg/天、约250mg/天、约275mg/天、约300mg/天、约325mg/天、约350mg/天、约350mg/天、约375mg/天、约400mg/天、约425mg/天、约450mg/天、约475mg/天、约500mg/天、约525mg/天、约550mg/天、约575mg/天或约600mg/天的草酸盐消耗活性。在一个实施方案中,厌氧条件是在受试者的肠和/或结肠中的条件。
在一个实施方案中,重组细菌在厌氧条件下具有约0.2微摩尔/小时、约0.5微摩尔/小时、约0.8微摩尔/小时、约1.0微摩尔/小时、约1.2微摩尔/小时、约1.5微摩尔/小时、或约1.6微摩尔/小时的草酸盐消耗活性。在一个实施方案中,重组细菌在厌氧条件下具有至少0.2微摩尔/小时、至少0.5微摩尔/小时、至少0.8微摩尔/小时、至少1.0微摩尔/小时、至少1.2微摩尔/小时、至少1.5微摩尔/小时、或至少1.6微摩尔/小时的草酸盐消耗活性。在一个实施方案中,重组细菌在厌氧条件下具有约0.2微摩尔/小时至约1.6微摩尔/小时、约0.5微摩尔/小时至约1.5微摩尔/小时、或约1.0微摩尔/小时至约1.5微摩尔/小时的草酸盐消耗活性。在一个实施方案中,重组细菌在厌氧条件下具有约0.5微摩尔/小时至约1.5微摩尔/小时的草酸盐消耗活性。在一个实施方案中,厌氧条件是在受试者的肠和/或结肠中的条件。
在一个实施方案中,所述方法将受试者的急性草酸盐水平降低约两倍。在一个实施方案中,所述方法将受试者的急性草酸盐水平降低约三倍。在一个实施方案中,所述方法将受试者的慢性草酸盐水平降低约两倍。在一个实施方案中,所述方法将受试者的慢性草酸盐水平降低约三倍。
在一个实施方案中,所述方法将受试者的急性草酸盐水平降低至约25mg/天、约30mg/天、约40mg/天、约50mg/天、约60mg/天、约70mg/天、约80mg/天、约90mg/天或约100mg/天。在一个实施方案中,所述方法将受试者的慢性草酸盐水平降低至约25mg/天、约30mg/天、约40mg/天、约50mg/天、约60mg/天、约70mg/天、约80mg/天、约90mg/天或约100mg/天。
在一个实施方案中,如与UOx的对照水平相比,在受试者中施用后受试者中的UOx减少了至少约14%、至少约15%、至少约20%、至少约21%、至少约22%、至少约23%、至少约24%、至少约25%、至少约26%、至少约27%、至少约28%、至少约29%、至少约30%、至少约31%、至少约32%、至少约33%、至少约34%、至少约35%、至少约36%、至少约37%、至少约38%、至少约39%、至少约40%、至少约45%或至少约50%。在一个实施方案中,如与UOx的对照水平相比,在受试者中施用后受试者中的UOx减少了至少约14%至约50%、至少约14%至约45%、至少约15%至约50%、至少约15%至约45%、至少约15%至约40%、至少约20%至约50%、至少约25%至约50%、至少约30%至约50%、至少约20%至约40%、至少约20%至约45%、至少约25%至约45、或至少约25%至约40%。在一个实施方案中,UOx的对照水平是受试者在施用前的UOx水平。在另一个实施方案中,UOx的对照水平是未接受治疗的患有草酸盐疾病或病症的受试者或受试者群体中的UOx水平,其中所述疾病或病症是高草酸尿症、原发性高草酸尿症、饮食性高草酸尿症、肠高草酸尿症、短肠综合征、慢性胰腺炎、炎性肠病(IBD)、囊性纤维化、肾病和/或Roux-en-Y胃旁路术。在一个实施方案中,所述疾病或病症是短肠综合征或Roux-en-Y胃旁路术。
在一个实施方案中,如与对照UOx:肌酐比相比,在受试者中施用后受试者中的UOx:肌酐比减少了至少约14%、至少约15%、至少约20%、至少约21%、至少约22%、至少约23%、至少约24%、至少约25%、至少约26%、至少约27%、至少约28%、至少约29%、至少约30%、至少约31%、至少约32%、至少约33%、至少约34%、至少约35%、至少约36%、至少约37%、至少约38%、至少约39%、至少约40%、至少约45%或至少约50%。在一个实施方案中,如与对照UOx:肌酐比相比,在受试者中施用后受试者中的UOx:肌酐比减少了至少约14%至约50%、至少约14%至约45%、至少约15%至约50%、至少约15%至约45%、至少约15%至约40%、至少约20%至约50%、至少约25%至约50%、至少约30%至约50%、至少约20%至约40%、至少约20%至约45%、至少约25%至约45、或至少约25%至约40%。在一个实施方案中,对照UOx:肌酐比是受试者在施用前的UOx水平。在另一个实施方案中,对照UOx:肌酐比是未接受治疗的患有草酸盐疾病或病症的受试者或受试者群体中的UOx:肌酐比,其中所述疾病或病症是高草酸尿症、原发性高草酸尿症、饮食性高草酸尿症、肠高草酸尿症、短肠综合征、慢性胰腺炎、炎性肠病(IBD)、囊性纤维化、肾病和/或Roux-en-Y胃旁路术。在一个实施方案中,所述疾病或病症是短肠综合征或Roux-en-Y胃旁路术。
在一个实施方案中,所述方法在施用后第5天将受试者的急性草酸盐水平降低至少约40%。在一个实施方案中,所述方法在施用后第5天将受试者的急性草酸盐水平降低至少约50%。在一个实施方案中,所述方法在施用后第5天将受试者的急性草酸盐水平降低至少约60%。在一个实施方案中,所述方法在施用后第5天将受试者的急性草酸盐水平降低至少约70%。在一个实施方案中,所述方法在施用后第5天将受试者的急性草酸盐水平降低至少约80%。
在一个实施方案中,所述方法在施用后约24小时将受试者的急性草酸盐水平降低至少约10%。在一个实施方案中,所述方法在施用后约24小时将受试者的急性草酸盐水平降低至少约15%。在一个实施方案中,所述方法在施用后约24小时将受试者的急性草酸盐水平降低至少约20%。
在一个实施方案中,草酸盐水平或急性草酸盐水平或慢性草酸盐水平是尿草酸盐(UOx)水平。在一个实施方案中,施用后受试者中的UOx水平为小于44mg/24小时。在一个实施方案中,施用后受试者中的平均24小时尿草酸盐水平为小于44mg、小于43mg、小于42mg、小于41mg、小于40mg、小于39mg、小于38mg、约45mg至约35mg、约44mg至约36mg、约43mg至约37mg、约42mg至约38mg、约41mg至约39mg、或约40mg。
在一个实施方案中,重组细菌属于埃希氏菌属(Escherichia)。在一个实施方案中,重组细菌属于大肠埃希氏菌(Escherichia coli)菌株尼斯勒(Nissle)。
在一个实施方案中,口服施用药物组合物。在一个实施方案中,在施用药物组合物的一小时内给受试者喂食膳食。在一个实施方案中,在施用药物组合物的同时给受试者喂食膳食。在一个实施方案中,受试者是人受试者。
在一个实施方案中,本文公开了重组细菌,其包含编码一种或多种草酸分解代谢酶的一个或多个基因序列,所述一个或多个基因序列可操作地连接到天然地与草酸分解代谢酶基因不相关的直接或间接第一启动子上。在一个实施方案中,所述一个或多个基因序列直接与第一启动子可操作地连接。在另一个实施方案中,所述一个或多个基因序列间接与第一启动子可操作地连接。在一个实施方案中,第一启动子是诱导型启动子。在另一个实施方案中,第一启动子是组成型启动子。
在一个实施方案中,重组细菌具有1μmol/1x109个细胞的草酸盐消耗活性。在一个实施方案中,重组细菌在厌氧条件下具有约150-300mg/天的草酸盐消耗活性。在一个实施方案中,重组细菌在厌氧条件下具有约200mg/天的草酸盐消耗活性。在一个实施方案中,当每天三次施用于受试者时,重组细菌在厌氧条件下具有约200mg/天的草酸盐消耗活性。在一个实施方案中,厌氧条件是在受试者的肠和/或结肠中的条件。
在一个实施方案中,所述一个或多个基因序列包含scaaE3基因、frc基因和oxdC基因。在一个实施方案中,scaaE3基因包含与SEQ ID NO:3具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列,包含SEQ ID NO:3,或由SEQ ID NO:3组成。在一个实施方案中,frc基因包含与SEQ ID NO:1具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列,包含SEQ ID NO:1,或由SEQ ID NO:1组成。在一个实施方案中,scaaE3基因包含SEQ ID NO:3。在一个实施方案中,oxdC基因包含与SEQID NO:2具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列,包含SEQ ID NO:2,或由SEQ ID NO:2组成。在一个实施方案中,frc基因包含SEQ ID NO:2。
在一个实施方案中,重组细菌还包含编码草酸盐输入蛋白(importer)的基因。在一个实施方案中,编码草酸盐输入蛋白的基因是oxlT基因。在一个实施方案中,oxlT基因包含与SEQ ID NO:11具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列,,包含SEQ ID NO:11,或由SEQ ID NO:11组成。在一个实施方案中,oxlT基因包含SEQ ID NO:11。
在一个实施方案中,重组细菌还包含营养缺陷型。在一个实施方案中,营养缺陷型是thyA营养缺陷型。在一个实施方案中,thyA与SEQ ID NO:62具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性,包含SEQ ID NO:62,或由SEQ ID NO:62组成。
在一个实施方案中,重组细菌还包含内源噬菌体中的缺失。在一个实施方案中,内源噬菌体包含与SEQ ID NO:63具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列,包含SEQ ID NO:63,或由SEQ ID NO:63组成。在一个实施方案中,内源噬菌体包含SEQ ID NO:63的序列。
在一个实施方案中,重组细菌不包含编码抗生素抗性的基因。在一个实施方案中,第一启动子是诱导型启动子。在一个实施方案中,诱导型启动子由低氧或厌氧条件、温度或肿瘤的低氧环境诱导。在一个实施方案中,诱导型启动子是FNR启动子。在一个实施方案中,FNR启动子是选自由SEQ ID NO:13-29中任一者组成的组的启动子。
在一个实施方案中,重组细菌包含在诱导型启动子(任选地FNR启动子)的控制下的oxlT基因;在诱导型启动子(任选地FNR启动子)的控制下的scaaE3基因、oxcd基因和frc基因;thyA缺失(或营养缺陷型)和内源噬菌体3的缺失。在一个实施方案中,重组细菌包含HA910::FNR_oxlT、HA12::FNR_scaaE3-oxcd-frc、ΔthyA、Δ噬菌体3。
在一些实施方案中,重组细菌细胞还包含经修饰的内源性大肠杆菌素(colibactin)岛。
在一些实施方案中,经修饰的内源性大肠杆菌素岛包含一种或多种选自以下的经修饰的clb序列:clbA(SEQ ID NO:1065)、clbB(SEQ ID NO:1066)、clbC(SEQ ID NO:1067)、clbD(SEQ ID NO:1068)、clbE(SEQ ID NO:1069)、clbF(SEQ ID NO:1070)、clbG(SEQ IDNO:1071)、clbH(SEQ ID NO:1072)、clbI(SEQ ID NO:1073)、clbJ(SEQ ID NO:1074)、clbK(SEQ ID NO:1075)、clbL(SEQ ID NO:1076)、clbM(SEQ ID NO:1077)、clbN(SEQ ID NO:1078)、clbO(SEQ ID NO:1079)、clbP(SEQ ID NO:1080)、clbQ(SEQ ID NO:1081)、clbR(SEQID NO:1082)和clbS(SEQ ID NO:1803)。
在一些实施方案中,经修饰的内源性大肠杆菌素岛包含以下的缺失:clbA(SEQ IDNO:1065)、clbB(SEQ ID NO:1066)、clbC(SEQ ID NO:1067)、clbD(SEQ ID NO:1068)、clbE(SEQ ID NO:1069)、clbF(SEQ ID NO:1070)、clbG(SEQ ID NO:1071)、clbH(SEQ ID NO:1072)、clbI(SEQ ID NO:1073)、clbJ(SEQ ID NO:1074)、clbK(SEQ ID NO:1075)、clbL(SEQID NO:1076)、clbM(SEQ ID NO:1077)、clbN(SEQ ID NO:1078)、clbO(SEQ ID NO:1079)、clbP(SEQ ID NO:1080)、clbQ(SEQ ID NO:1081)和clbR(SEQ ID NO:1082)。
在一个实施方案中,重组细菌是SYN5752、SYN7169或SYNB8802。在一个实施方案中,重组细菌是SYNB8802。
在一个实施方案中,受试者患有高草酸尿症。在一个实施方案中,高草酸尿症是原发性高草酸尿症、饮食性高草酸尿症或肠高草酸尿症。在一个实施方案中,受试者患有短肠综合征、慢性胰腺炎、炎性肠病(IBD)、囊性纤维化、肾病和/或Roux-en-Y胃旁路术。
在一个实施方案中,受试者的尿草酸盐(Uox)水平在施用之前为至少70mg/天。在一个实施方案中,受试者在施用之后显示Uox水平降低至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%或80%。在一个实施方案中,受试者在施用之前具有eGFR<30mL/min/1.73m2,需要血液透析,或具有全身性草酸盐沉着。
在一个实施方案中,以约1x1011个活重组细菌、约2x1011个活重组细菌、约3x1011个活重组细菌、约4x1011个活重组细菌、约4.5x1011个活重组细菌、约5x1011个活重组细菌、约6x1011个活重组细菌、约1x1012个活重组细菌或约2x1012个活重组细菌的剂量施用重组细菌。在一个实施方案中,重组细菌以约6x1011个活重组细菌的剂量施用。在一个实施方案中,重组细菌以约3x1011个活重组细菌的剂量施用。在一个实施方案中,重组细菌以约1x1011个活重组细菌的剂量施用。在一个实施方案中,施用为约4.5x1011个活重组细菌。在一个实施方案中,施用为约5x1011个活重组细菌。在一个实施方案中,重组细菌以约1x1012个活重组细菌的剂量施用。在一个实施方案中,重组细菌以约2x1012个活重组细菌的剂量施用。在一个实施方案中,每天三次与膳食一起施用约5x1011个活重组细菌。在一个实施方案中,重组细菌以约1x1011个活重组细菌至约2x1012个活重组细菌的剂量施用。在一个实施方案中,重组细菌以约1x1012个活重组细菌至约2x1012个活重组细菌的剂量施用。在一个实施方案中,重组细菌以约5x1011个活重组细菌至约2x1012个活重组细菌的剂量施用。
在一个实施方案中,施用是每天一次。在另一个实施方案中,施用是每天两次。在另一个实施方案中,施用是与膳食一起口服,每天一次。在另一个实施方案中,施用是与膳食一起口服,每天两次。在另一个实施方案中,施用是与膳食一起口服,每天三次。
在另一个实施方案中,向受试者施用质子泵抑制剂(PPI)。在另一个实施方案中,PPI是埃索美拉唑。在另一个实施方案中,埃索美拉唑以40mg每日施用一次。在另一个实施方案中,PPI的施用是每天一次。在另一个实施方案中,将半乳糖与本文所述的重组细菌组合(例如同时)或以相同的组合物或制剂施用于受试者。在另一个实施方案中,半乳糖的施用是每天一次、每天两次、每天三次或与膳食一起。在具体实施方案中,半乳糖以与本文所述的重组细菌相同的组合物或制剂施用于受试者。在一个实施方案中,半乳糖是D-半乳糖。在另一个实施方案中,将质子泵抑制剂(PPI)和半乳糖(例如D-半乳糖)与本文所述的重组细菌组合施用于受试者。在另一个实施方案中,PPI是埃索美拉唑。在另一个实施方案中,埃索美拉唑以40mg每日施用一次。在另一个实施方案中,PPI和半乳糖的施用是每天一次、每天两次、每天三次或与膳食一起。
在另一个实施方案中,以约0.1g至约3g、约0.1g至约2.5g、约0.1g至约2.0g、约0.1g至约1.5g、约0.1g至约1.0g、约0.1g至约0.5g、约0.5g至约3g、约0.5g至约2.5g、约0.5g至约2.0g、约0.5g至约1.5g、约0.5g至约1.0g、约1.0g至约3g、约1.0g至约2.5g、约1.0g至约2.0g、约1.0g至约1.5g、约1.5g至约3g、约1.5g至约2.5g、约1.5g至约2.0g、约2.0g至约3g、约2.0g至约2.5g、或约2.5g至约3g施用半乳糖。在一些实施方案中,以约1.0g施用半乳糖。在一些实施方案中,以约0.5g施用半乳糖。在一些实施方案中,以约2.0g施用半乳糖。在一些实施方案中,本公开提供了细菌细胞,其已被遗传工程化以包含编码一种或多种草酸分解代谢酶或草酸分解代谢途径的一个或多个基因、基因盒和/或合成回路,并且能够代谢草酸盐和/或其他代谢物,诸如草酰辅酶A。因此,遗传工程化细菌细胞和包含所述细菌细胞的药物组合物可以用于治疗和/或预防与其中草酸盐有害的病症相关的疾病,诸如原发性高草酸尿症和继发性高草酸尿症。
在一些实施方案中,本公开提供了细菌细胞,其已被工程化以包含编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列。在一些实施方案中,本公开提供了细菌细胞,其已被工程化以包含编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列,并且能够降低草酸盐和/或其他代谢物(例如草酰辅酶A)的水平。在一些实施方案中,细菌细胞已被工程化以包含编码一种或多种草酸盐转运蛋白(输入蛋白)的基因序列。在一些实施方案中,细菌细胞已被工程化以包含编码一种或多种甲酸盐输出蛋白的基因序列。在一些实施方案中,工程化细菌包含编码一种或多种多肽的基因序列,所述一种或多种多肽介导草酸盐的转运(输入)和甲酸盐的输出(例如,草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白)。在一些实施方案中,工程化细菌包含编码以下物质中的一种或多种的基因序列:(i)一种或多种草酸盐转运蛋白;(ii)一种或多种甲酸盐输出蛋白;(iii)介导草酸盐的转运(输入)和甲酸盐的输出的一种或多种多肽(例如,草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白);和(iv)它们的任何组合。在一些实施方案中,细菌细胞已被工程化以包含编码一种或多种草酸分解代谢酶和一种或多种草酸盐转运蛋白(输入蛋白)的基因序列。在一些实施方案中,本公开的细菌细胞已被遗传工程化以包含编码一种或多种草酸分解代谢酶和一种或多种甲酸盐输出蛋白的基因序列。在一些实施方案中,遗传工程化细菌包含编码一种或多种草酸分解代谢酶和一种或多种多肽的基因序列,所述一种或多种多肽介导草酸盐的转运(输入)和甲酸盐的输出(例如,草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白)。在一些实施方案中,细菌细胞已被工程化以包含编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列和编码以下物质中的一种或多种的基因序列:(i)一种或多种草酸盐转运蛋白;(ii)一个或多个甲酸盐输出蛋白;(iii)介导草酸盐的转运(输入)和甲酸盐的输出两者的一种或多种多肽(例如,草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白)。和(iv)它们的任何组合。
在一些实施方案中,编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列与诱导型启动子可操作地连接。在一些实施方案中,编码一种或多种草酸盐转运蛋白(输入蛋白)的基因序列与诱导型启动子可操作地连接。在一些实施方案中,编码一种或多种甲酸盐输出蛋白的基因序列与诱导型启动子可操作地连接。在一些实施方案中,编码介导草酸盐的转运(输入)和甲酸盐的输出的一种或多种多肽(例如,草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白)的基因序列与诱导型启动子可操作地连接。在一些实施方案中,编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列和编码一种或多种草酸盐转运蛋白(输入蛋白)的基因序列与诱导型启动子可操作地连接。在一些实施方案中,编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列和编码一种或多种甲酸盐输出蛋白的基因序列与诱导型启动子可操作地连接。在一些实施方案中,编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列和编码介导草酸盐的转运(输入)和甲酸盐的输出的一种或多种多肽(例如,草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白)的基因序列与诱导型启动子可操作地连接。在一些实施方案中,以下基因序列中的任何一个或多个,如果存在于细菌细胞中,与诱导型启动子可操作地连接:(i)编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列;(ii)编码一种或多种草酸盐转运蛋白的基因序列;(iii)编码一种或多种甲酸盐输出蛋白的基因序列;和(iv)编码介导草酸盐的转运(输入)和甲酸盐的输出的一种或多种多肽(例如,草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白)的基因序列。
在一些实施方案中,本公开提供了细菌细胞,其已被工程化以包含编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列,所述基因序列与在低氧和/或厌氧条件下(例如在哺乳动物肠道中发现的那些条件下)诱导的诱导型启动子可操作地连接。在一些实施方案中,本公开提供了细菌细胞,其已被工程化以包含编码一种或多种草酸盐转运蛋白(输入蛋白)的基因序列,所述基因序列与在低氧和/或厌氧条件下(例如在哺乳动物肠道中发现的那些条件下)诱导的诱导型启动子可操作地连接。在一些实施方案中,本公开提供了细菌细胞,其已被工程化以包含编码一种或多种甲酸盐输出蛋白的基因序列,所述基因序列与在低氧和/或厌氧条件下(例如在哺乳动物肠道中发现的那些条件下)诱导的诱导型启动子可操作地连接。在一些实施方案中,本公开提供了细菌细胞,其已被工程化以包含编码介导草酸盐的转运(输入)和甲酸盐的输出的一种或多种多肽(例如,草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白)的基因序列,所述基因序列与在低氧和/或厌氧条件下(例如在哺乳动物肠道中发现的那些条件下)诱导的诱导型启动子可操作地连接。在一些实施方案中,编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列和编码一种或多种草酸盐转运蛋白(输入蛋白)的基因序列与在低氧和/或厌氧条件下诱导的诱导型启动子可操作地连接。在一些实施方案中,编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列和编码一种或多种甲酸盐输出蛋白的基因序列与在低氧和/或厌氧条件下诱导的诱导型启动子可操作地连接。在一些实施方案中,编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列和编码介导草酸盐的转运(输入)和甲酸盐的输出的一种或多种多肽(例如,草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白)的基因序列与在低氧和/或厌氧条件下诱导的诱导型启动子可操作地连接。在一些实施方案中,以下基因序列中的任何一个或多个,如果存在于细菌细胞中,与在低氧和/或厌氧条件下诱导的诱导型启动子可操作地连接:(i)编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列;(ii)编码一种或多种草酸盐转运蛋白的基因序列;(iii)编码一种或多种甲酸盐输出蛋白的基因序列;和(iv)编码介导草酸盐的转运(输入)和甲酸盐的输出的一种或多种多肽(例如,草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白)的基因序列。在一个实施方案中,诱导型启动子是能够用IPTG诱导的lacI启动子。在一个实施方案中,将一个或多个上述基因序列与具有lacI操纵子的IPTG诱导型启动子(例如Ptac启动子)可操作地连接。在一个实施方案中,将lac阻遏基因lacI以反向取向放置在基因Ptac-构建体的上游,以允许差异转录。
在一些实施方案中,诱导型启动子是IPTG诱导型启动子。在一些实施方案中,IPTG诱导型启动子包含与SEQ ID NO:1107具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列,包含SEQ ID NO:1107,或由SEQ ID NO:1107组成。在一些实施方案中,重组细菌还包含编码Lac启动子阻遏物的基因序列。在一些实施方案中,编码阻遏物的基因序列包含与SEQ ID NO:1105具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列,包含SEQ ID NO:1105,或由SEQ ID NO:1105组成。在一些实施方案中,阻遏物包含与SEQ ID NO:1106具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列,包含SEQ ID NO:1106,或由SEQ ID NO:1106组成。
在另一个实施方案中,诱导型启动子是能够用阿拉伯糖诱导的pBAD启动子。在一个实施方案中,一个或多个上述基因序列与温度诱导型启动子可操作地连接,所述温度诱导型启动子具有供cI38或cI857阻遏物结合的操纵子。在一个实施方案中,将cI38或cI857阻遏物基因以反向取向放置在可操作地连接到温度敏感性启动子上的基因的上游,以允许差异转录。
在一些实施方案中,本公开提供了细菌细胞,其已被工程化以包含编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列,所述基因序列与诱导型启动子可操作地连接,所述诱导型启动子由哺乳动物肠道中发现的环境信号和/或条件诱导(例如,由哺乳动物肠道中发现的代谢物(例如,草酸盐代谢物)或其他生物分子诱导,和/或由炎症条件(例如,活性氮物质和/或活性氧物质)诱导)。在哺乳动物肠道中发现的环境信号和/或条件可以是在健康的哺乳动物肠道中发现的信号和条件,或者在患病的哺乳动物肠道(诸如患有高草酸尿症或其中草酸盐和/或草酸盐代谢物水平升高的其他疾患的受试者的肠道,和/或患有炎性疾患(诸如过敏性肠病、自身免疫性疾病和导致肠道炎症的任何其他疾患)的受试者的肠道)中发现的信号和条件。在一些实施方案中,本公开提供了细菌细胞,其已被工程化以包含编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列,所述基因序列与在炎症条件下(例如,在哺乳动物肠道中发现的炎症条件下)被诱导的诱导型启动子可操作地连接。在一些实施方案中,本公开提供了细菌细胞,其已被工程化以包含编码一种或多种草酸盐转运蛋白(输入蛋白)的基因序列,所述基因序列与在炎症条件下(例如,在哺乳动物肠道中发现的炎症条件下)被诱导的诱导型启动子可操作地连接。在一些实施方案中,本公开提供了细菌细胞,其已被工程化以包含编码一种或多种甲酸盐输出蛋白的基因序列,所述基因序列与在炎症条件下(例如在哺乳动物肠道中发现的炎症条件下)被诱导的诱导型启动子可操作地连接。在一些实施方案中,本公开提供了细菌细胞,其已被工程化以包含编码介导草酸盐的转运(输入)和甲酸盐的输出的一种或多种多肽(例如,草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白)的基因序列,所述基因序列与在炎症条件下(例如,在哺乳动物肠道中发现的炎症条件下)被诱导的诱导型启动子可操作地连接。在一些实施方案中,编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列和编码一种或多种草酸盐转运蛋白(输入蛋白)的基因序列与在炎症条件下诱导的诱导型启动子可操作地连接。在一些实施方案中,编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列和编码一种或多种甲酸盐输出蛋白的基因序列与在炎症条件下诱导的诱导型启动子可操作地连接。在一些实施方案中,编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列和编码介导草酸盐的转运(输入)和甲酸盐的输出的一种或多种多肽(例如,草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白)的基因序列与在炎症条件下诱导的诱导型启动子可操作地连接。在一些实施方案中,以下基因序列中的任何一个或多个,如果存在于细菌细胞中,与在炎症条件下诱导的诱导型启动子可操作地连接:(i)编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列;(ii)编码一种或多种草酸盐转运蛋白的基因序列;(iii)编码一种或多种甲酸盐输出蛋白的基因序列;和(iv)编码介导草酸盐的转运(输入)和甲酸盐的输出的一种或多种多肽(例如,草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白)的基因序列。
在一些实施方案中,本公开提供了细菌细胞,其已被工程化以包含编码一种或多种多肽的基因序列,所述一种或多种多肽能够在低氧环境(例如肠道)中降低草酸盐和/或其他代谢物(例如草酰辅酶A)的水平。在一些实施方案中,细菌细胞已被工程化以包含编码以下中的一种或多种的基因序列:(i)一种或多种草酸分解代谢酶;(ii)一种或多种草酸盐转运蛋白;(ii)一种或多种甲酸盐输出蛋白;和(iv)一种或多种草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白。在一些实施方案中,细菌细胞已被遗传工程化以包含编码一种或多种草酸分解代谢酶的一个或多个回路,并且能够例如在低氧环境(例如肠道)中处理和降低草酸盐和/或草酰辅酶A的水平。因此,在一些实施方案中,遗传工程化细菌细胞和包含本公开的细菌细胞的药物组合物可以被用于将过量的草酸盐和/或草酰辅酶A输入细菌细胞中,以便治疗和/或预防与草酸盐有害的病症相关的疾患,诸如原发性高草酸尿症和继发性高草酸尿症。在一些实施方案中,遗传工程化细菌细胞和包含本公开的细菌细胞的药物组合物可以被用于将过量的草酸盐和/或草酰辅酶A转化为无毒分子,以便治疗和/或预防与草酸盐有害的病症相关的疾患,诸如原发性高草酸尿症和继发性高草酸尿症。
在一些实施方案中,所述一个或多个基因序列包含scaaE3基因、frc基因和oxdC基因。
在一些实施方案中,scaaE3基因包含与SEQ ID NO:3具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列,包含SEQ ID NO:3,或由SEQ IDNO:3组成。
在一些实施方案中,frc基因包含与SEQ ID NO:1具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列,包含SEQ ID NO:1,或由SEQ ID NO:1组成。
在一些实施方案中,oxdC基因包含与SEQ ID NO:2具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列,包含SEQ ID NO:2,或由SEQ IDNO:2组成。
在一些实施方案中,重组细菌还包含编码草酸盐输入蛋白(importer)的基因。
在一些实施方案中,编码草酸盐输入蛋白的基因是oxlT基因。
在一些实施方案中,oxlT基因包含与SEQ ID NO:11具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列,包含SEQ ID NO:11,或由SEQ IDNO:11组成。
在一些实施方案中,重组细菌还包含营养缺陷型。
在一些实施方案中,营养缺陷型是thyA营养缺陷型。
在一些实施方案中,重组细菌还包含内源噬菌体中的缺失。
在一些实施方案中,内源噬菌体包含与SEQ ID NO:63具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列,包含SEQ ID NO:63,或由SEQ IDNO:63组成。
在一些实施方案中,重组细菌细胞还包含经修饰的内源性大肠杆菌素岛。
在一些实施方案中,经修饰的内源性大肠杆菌素岛包含一种或多种选自以下的经修饰的clb序列:clbA(SEQ ID NO:1065)、clbB(SEQ ID NO:1066)、clbC(SEQ ID NO:1067)、clbD(SEQ ID NO:1068)、clbE(SEQ ID NO:1069)、clbF(SEQ ID NO:1070)、clbG(SEQ IDNO:1071)、clbH(SEQ ID NO:1072)、clbI(SEQ ID NO:1073)、clbJ(SEQ ID NO:1074)、clbK(SEQ ID NO:1075)、clbL(SEQ ID NO:1076)、clbM(SEQ ID NO:1077)、clbN(SEQ ID NO:1078)、clbO(SEQ ID NO:1079)、clbP(SEQ ID NO:1080)、clbQ(SEQ ID NO:1081)、clbR(SEQID NO:1082)和clbS(SEQ ID NO:1803)。
在一些实施方案中,经修饰的内源性大肠杆菌素岛包含以下的缺失:clbA(SEQ IDNO:1065)、clbB(SEQ ID NO:1066)、clbC(SEQ ID NO:1067)、clbD(SEQ ID NO:1068)、clbE(SEQ ID NO:1069)、clbF(SEQ ID NO:1070)、clbG(SEQ ID NO:1071)、clbH(SEQ ID NO:1072)、clbI(SEQ ID NO:1073)、clbJ(SEQ ID NO:1074)、clbK(SEQ ID NO:1075)、clbL(SEQID NO:1076)、clbM(SEQ ID NO:1077)、clbN(SEQ ID NO:1078)、clbO(SEQ ID NO:1079)、clbP(SEQ ID NO:1080)、clbQ(SEQ ID NO:1081)和clbR(SEQ ID NO:1082)。
在一些实施方案中,重组细菌不包含编码抗生素抗性的基因。
在一些实施方案中,第一启动子为诱导型启动子,任选地当所述诱导型启动子为FNR启动子时,任选地其中所述FNR启动子包含与SEQ ID NO:13-29中的任一者具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列,包含SEQ ID NO:13-29中的任一者,或由SEQ ID NO:13-29中的任一者组成。
在一些实施方案中,诱导型启动子是Pr/Pl启动子。在一个实施方案中,Pr/Pl启动子包含与SEQ ID NO:206、213和219中的任一者具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列,包含SEQ ID NO:206、213和219中的任一者,或由SEQ ID NO:206、213和219中的任一者组成。在一些实施方案中,重组细菌还包含编码Pr/Pl启动子的突变体阻遏物的基因序列。在一些实施方案中,编码突变体阻遏物的基因序列包含与SEQ ID NO:210和214中的任一者具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列,包含SEQ ID NO:210和214中的任一者,或由SEQ ID NO:210和214中的任一者组成。
在一些实施方案中,诱导型启动子是IPTG诱导型启动子。在一个实施方案中,其中所述IPTG诱导型启动子包含与SEQ ID NO:1107具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列,包含SEQ ID NO:1107,或由SEQ ID NO:1107组成。在一些实施方案中,重组细菌还包含编码Lac启动子阻遏物的基因序列。在一些实施方案中,编码阻遏物的基因序列包含与SEQ ID NO:1105具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列,包含SEQ ID NO:1105,或由SEQ ID NO:1105组成。在一些实施方案中,阻遏物包含与SEQ ID NO:1106具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列,包含SEQ ID NO:1106,或由SEQ IDNO:1106组成。
本发明提供了重组细菌细胞、其药物组合物以及调节和治疗草酸盐有害的病症的方法。遗传工程化细菌细胞和包含本发明的细菌细胞的药物组合物可以被用于将过量的草酸盐和/或草酸转化为无毒分子,以便治疗和/或预防与草酸盐有害的病症相关的疾患,诸如原发性高草酸尿症和继发性高草酸尿症。在一些实施方案中,细菌细胞已被工程化以包含编码至少一种草酸分解代谢酶的至少一个异源基因,并且能够在低氧环境(例如肠道)中处理和降低草酸盐水平。在一些实施方案中,细菌细胞已被工程化以包含编码草酸盐输入蛋白的至少一个异源基因,并且能够在低氧环境(例如肠道)中降低草酸盐水平。在一些实施方案中,细菌细胞已被工程化以包含编码甲酸盐输出蛋白的至少一个异源基因,并且能够在低氧环境(例如肠道)中降低草酸盐水平。在一些实施方案中,细菌细胞已被工程化以包含编码草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白的至少一个异源基因,并且能够在低氧环境(例如肠道)中降低草酸盐水平。在一些实施方案中,细菌细胞已被工程化以包含编码至少一种草酸分解代谢酶的至少一个异源基因,并且能够在炎症环境中处理和降低草酸盐水平,诸如可能存在于肠道中。在一些实施方案中,细菌细胞已被工程化以包含编码草酸盐输入蛋白的至少一个异源基因,并且能够在炎症环境中降低草酸盐水平,例如可能存在于肠道中。在一些实施方案中,细菌细胞已被工程化以包含编码甲酸盐输出蛋白的至少一个异源基因,并且能够在炎症环境中降低草酸盐水平,例如可能存在于肠道中。在一些实施方案中,细菌细胞已被工程化以包含编码草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白的至少一个异源基因,并且能够在炎症环境中降低草酸盐水平,例如可能存在于肠道中。
在一些实施方案中,所述至少一种草酸分解代谢酶将草酸盐转化为甲酸盐或甲酰辅酶A。在一些实施方案中,所述至少一种草酸分解代谢酶选自草酸辅酶A连接酶(例如,来自酿酒酵母的ScAAE3)、草酰辅酶A脱羧酶(Oxc,例如,来自产甲酸草酸杆菌(O.formigenes))和甲酰辅酶A转移酶(例如,Frc,例如,来自产甲酸草酸杆菌)。在一些实施方案中,所述编码至少一种草酸分解代谢酶的至少一个异源基因选自frc基因和oxc基因。在一个实施方案中,所述编码草酸盐转运蛋白的至少一个异源基因是oxlT基因。在一些实施方案中,所述编码至少一种草酸分解代谢酶的至少一个异源基因位于细菌细胞中的质粒上。在一些实施方案中,所述编码至少一种草酸分解代谢酶的至少一个异源基因位于细菌细胞中的染色体上。在一些实施方案中,所述编码草酸盐转运蛋白的至少一个异源基因位于细菌细胞中的质粒上。在一些实施方案中,所述编码草酸盐转运蛋白的至少一个异源基因位于细菌细胞中的染色体上。在一些实施方案中,所述编码甲酸盐输出蛋白的至少一个异源基因位于细菌细胞中的质粒上。在一些实施方案中,所述编码甲酸盐输出蛋白的至少一个异源基因位于细菌细胞中的染色体上。在一些实施方案中,所述编码草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白的至少一个异源基因位于细菌细胞中的质粒上。在一些实施方案中,所述编码草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白的至少一个异源基因位于细菌细胞中的染色体上。
在一些实施方案中,工程化细菌细胞是益生菌细胞。在一些实施方案中,工程化细菌细胞是选自由拟杆菌属(Bacteroides)、双歧杆菌属(Bfidobacterium)、梭菌属(Clostridium)、埃希氏菌属(Escherichia)、乳杆菌属(Lactobacillus)和乳球菌属(Lactococcus)组成的组的属的成员。在一些实施方案中,工程化细菌细胞属于属埃希氏菌属。在一些实施方案中,重组细菌细胞属于物种大肠埃希氏菌菌株尼斯勒。
在一些实施方案中,工程化细菌细胞是当工程化细菌细胞存在于哺乳动物肠道中时被补充的基因的营养缺陷型。在一些实施方案中,哺乳动物肠道是人类肠道。在一些实施方案中,工程化细菌细胞是二氨基庚二酸或胸腺嘧啶生物合成途径中的酶的营养缺陷型。在一些实施方案中,工程化细菌细胞还包含编码对细菌细胞有毒的物质的异源基因,所述异源基因与诱导型启动子可操作地连接,其中所述诱导型启动子由哺乳动物肠道中不天然存在的环境条件直接或间接诱导。
在另一个方面,本发明提供了包含重组细菌细胞和药学上可接受的载体的药物组合物,所述重组细菌细胞包含与第一诱导型启动子可操作地连接的编码至少一种草酸分解代谢酶的至少一个异源基因。在另一个方面,本发明提供了包含重组细菌细胞和药学上可接受的载体的药物组合物,所述重组细菌细胞包含与第一诱导型启动子可操作地连接的编码至少一种草酸分解代谢酶的至少一个异源基因、与第二诱导型启动子可操作地连接的编码草酸盐转运蛋白的至少一个异源基因,所述第二诱导型启动子可以是与所述第一诱导型启动子相同或不同的启动子。在另一个方面,本发明提供了包含重组细菌细胞和药学上可接受的载体的药物组合物,所述重组细菌细胞包含与第一诱导型启动子可操作地连接的编码至少一种草酸分解代谢酶的至少一个异源基因、与第二诱导型启动子可操作地连接的编码甲酸盐输出蛋白的至少一个异源基因,所述第二诱导型启动子可以是与所述第一诱导型启动子相同或不同的启动子。在另一个方面,本发明提供了包含重组细菌细胞和药学上可接受的载体的药物组合物,所述重组细菌细胞包含与第一诱导型启动子可操作地连接的编码至少一种草酸分解代谢酶的至少一个异源基因、与第二诱导型启动子可操作地连接的编码草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白的至少一个异源基因,所述第二诱导型启动子可以是与所述第一诱导型启动子相同或不同的启动子。在任何这些实施方案中,所述第一启动子和所述第二启动子可以是同一启动子的单独拷贝。在一些实施方案中,所述第一诱导型启动子、所述第二诱导型启动子、或所述第一诱导型启动子和所述第二诱导型启动子各自由环境条件直接诱导。在一些实施方案中,所述第一诱导型启动子、所述第二诱导型启动子、或所述第一诱导型启动子和所述第二诱导型启动子各自由环境条件间接诱导。在一些实施方案中,所述第一诱导型启动子、所述第二诱导型启动子、或所述第一诱导型启动子和所述第二诱导型启动子各自由哺乳动物肠道中的环境条件直接或间接诱导。在一些实施方案中,所述第一诱导型启动子、所述第二诱导型启动子、或所述第一诱导型启动子和所述第二诱导型启动子各自由低氧或厌氧条件直接或间接诱导。在一些实施方案中,所述第一诱导型启动子、所述第二诱导型启动子、或所述第一诱导型启动子和所述第二诱导型启动子各自由炎症条件直接或间接诱导。在一些实施方案中,所述第一诱导型启动子、所述第二诱导型启动子或所述第一诱导型启动子和所述第二诱导型启动子各自是FNR响应性启动子。在一些实施方案中,所述第一诱导型启动子、所述第二诱导型启动子或所述第一诱导型启动子和所述第二诱导型启动子各自是RNS响应性启动子。在一些实施方案中,所述第一诱导型启动子、所述第二诱导型启动子、或所述第一诱导型启动子和所述第二诱导型启动子各自是ROS响应性启动子。在另一个方面,本发明提供了用于治疗受试者中草酸盐有害的疾病或病症的方法,所述方法包括向所述受试者施用工程化细菌细胞或包含工程化细菌细胞的药物组合物,其中所述工程化细菌细胞包含编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列。在另一个方面,本发明提供了用于治疗受试者中草酸盐有害的疾病或病症的方法,所述方法包括向所述受试者施用工程化细菌细胞或包含工程化细菌细胞的药物组合物,其中所述工程化细菌细胞包含编码一种或多种草酸盐转运蛋白的基因序列。在另一个方面,本发明提供了用于治疗受试者中草酸盐有害的疾病或病症的方法,所述方法包括向所述受试者施用工程化细菌细胞或包含工程化细菌细胞的药物组合物,其中所述工程化细菌细胞包含编码一种或多种甲酸盐输出蛋白的基因序列。在另一个方面,本发明提供了用于治疗受试者中草酸盐有害的疾病或病症的方法,所述方法包括向所述受试者施用工程化细菌细胞或包含工程化细菌细胞的药物组合物,其中所述工程化细菌细胞包含编码一种或多种草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白的基因序列。在另一个方面,本发明提供了用于治疗受试者中草酸盐有害的疾病或病症的方法,所述方法包括向所述受试者施用工程化细菌细胞或包含工程化细菌细胞的药物组合物,其中所述工程化细菌细胞包含编码以下物质中的一种或多种的基因序列:(i)一种或多种草酸分解代谢酶;(ii)一种或多种草酸盐转运蛋白;(iii)一种或多种甲酸盐输出蛋白;和(iv)一种或多种草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白。
在另一个方面,本发明提供了用于治疗受试者的草酸盐有害的疾病或病症的方法,所述方法包括向所述受试者施用工程化细菌细胞或包含工程化细菌细胞的药物组合物,其中所述工程化细菌细胞响应于受试者的外源环境条件表达编码至少一种草酸分解代谢酶的至少一个异源基因,从而治疗受试者的草酸盐有害的疾病或病症。在一些实施方案中,工程化细菌细胞还表达以下基因中的一种或多种:(i)编码草酸盐输入蛋白的至少一个异源基因;(ii)编码甲酸盐输出蛋白的至少一个异源基因;和/或(iii)编码草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白的至少一个异源基因。在一个方面,本发明提供了治疗受试者的草酸盐有害的病症的方法,所述方法包括向所述受试者施用本发明的工程化细菌细胞或药物组合物,从而治疗受试者的草酸盐有害的病症。在另一个方面,本发明提供了降低受试者血浆中的草酸盐水平的方法,所述方法包括向所述受试者施用本发明的工程化细菌细胞或药物组合物,从而降低受试者血浆中的草酸盐水平。在另一个方面,本发明提供了降低受试者尿液中的草酸盐水平的方法,所述方法包括向所述受试者施用本发明的工程化细菌细胞或药物组合物,从而降低受试者尿液中的草酸盐水平。在一个实施方案中,在向所述受试者施用工程化细菌细胞或药物组合物之后,受试者血浆中的草酸盐水平降低。在另一个实施方案中,在向所述受试者施用工程化细菌细胞或药物组合物之后,受试者尿液中的草酸盐水平降低。在一个实施方案中,口服施用工程化细菌细胞或药物组合物。在另一个实施方案中,所述方法还包括在向所述受试者施用工程化细菌细胞或药物组合物之后,分离来自受试者的血浆样品或来自受试者的尿液样品,并且确定来自受试者的血浆样品中或来自受试者的尿液样品中的草酸盐水平。在另一个实施方案中,所述方法还包括将来自受试者的血浆样品或来自受试者的尿液样品中的草酸盐水平与对照草酸盐水平进行比较。在一个实施方案中,对照草酸盐水平是在施用工程化细菌细胞或药物组合物之前在受试者血浆或受试者尿液中的草酸盐水平。
在一个实施方案中,草酸盐有害的病症是高草酸尿症。在一个实施方案中,高草酸尿症是原发性I型高草酸尿症。在另一个实施方案中,高草酸尿症是原发性II型高草酸尿症。在另一个实施方案中,高草酸尿症是原发性III型高草酸尿症。在一个实施方案中,高草酸尿症是肠高草酸尿症。在另一个实施方案中,高草酸尿症是饮食性高草酸尿症。在另一个实施方案中,高草酸尿症是特发性高草酸尿症。
在一个实施方案中,在施用药物组合物的一小时内给受试者喂食膳食。在另一个实施方案中,在施用药物组合物的同时给受试者喂食膳食。在一个实施方案中,重组细菌能够将施用后受试者的尿草酸盐降低至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%或至少45%。
在一个实施方案中,所述降低是与施用前受试者的尿草酸盐水平相比的降低。在另一个实施方案中,所述降低是与尚未经重组细菌治疗的患有高草酸尿症的受试者或受试者群体中的尿草酸盐水平相比的降低。在一个实施方案中,所述方法还包括测量施用前受试者的尿草酸盐水平。在另一个实施方案中,所述方法还包括测量施用后受试者的尿草酸盐水平。在一个实施方案中,所述方法包括测量施用前和施用后受试者的尿草酸盐水平。
在一个实施方案中,重组细菌能够将施用后受试者的粪便草酸盐减低至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少85%。在一个实施方案中,所述降低是与施用前受试者的粪便草酸盐水平相比的降低。在另一个实施方案中,所述降低是与尚未经重组细菌治疗的患有高草酸尿症的受试者或受试者群体中的粪便草酸盐水平相比的降低。在一个实施方案中,所述方法还包括测量施用前受试者的粪便草酸盐水平。在另一个实施方案中,所述方法还包括测量施用后受试者的粪便草酸盐水平。在一个实施方案中,所述方法包括测量施用前和施用后受试者的粪便草酸盐水平。
在一个实施方案中,本文公开了降低受试者的草酸盐水平的方法,所述方法包括向受试者施用包含重组细菌的药物组合物,从而降低受试者的草酸盐水平,所述重组细菌包含:编码一种或多种草酸分解代谢酶的一个或多个基因序列,所述一个或多个基因序列直接地或间接地与第一启动子可操作地连接,所述第一启动子在自然界不与草酸分解代谢酶基因相关,其中所述一个或多个基因序列包含scaaE3基因、frc基因和oxdC基因,其中所述scaaE3基因包含与SEQ ID NO:3具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列,包含SEQ ID NO:3或由SEQ ID NO:3组成,其中所述frc基因包含与SEQ ID NO:1具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列,包含SEQ ID NO:1或由SEQ ID NO:1组成,并且其中所述oxdC基因包含与SEQ IDNO:2具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列,包含SEQ ID NO:2或由SEQ ID NO:2组成;编码草酸盐输入蛋白的基因,其中所述编码草酸盐输入蛋白的基因是oxlT基因,并且其中所述oxlT基因包含与SEQ ID NO:11具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列,包含SEQ ID NO:11或由SEQ ID NO:11组成;ΔthyA营养缺陷型;内源噬菌体中的缺失;经修饰的内源性大肠杆菌素岛。
在一个实施方案中,内源噬菌体包含与SEQ ID NO:63具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列,包含SEQ ID NO:63,或由SEQ IDNO:63组成。
在一个实施方案中,经修饰的内源性大肠杆菌素岛包含一种或多种选自以下的经修饰的clb序列:clbA(SEQ ID NO:1065)、clbB(SEQ ID NO:1066)、clbC(SEQ ID NO:1067)、clbD(SEQ ID NO:1068)、clbE(SEQ ID NO:1069)、clbF(SEQ ID NO:1070)、clbG(SEQ IDNO:1071)、clbH(SEQ ID NO:1072)、clbI(SEQ ID NO:1073)、clbJ(SEQ ID NO:1074)、clbK(SEQ ID NO:1075)、clbL(SEQ ID NO:1076)、clbM(SEQ ID NO:1077)、clbN(SEQ ID NO:1078)、clbO(SEQ ID NO:1079)、clbP(SEQ ID NO:1080)、clbQ(SEQ ID NO:1081)、clbR(SEQID NO:1082)和clbS(SEQ ID NO:1803)。
在一个实施方案中,经修饰的内源性大肠杆菌素岛包含以下的缺失:clbA(SEQ IDNO:1065)、clbB(SEQ ID NO:1066)、clbC(SEQ ID NO:1067)、clbD(SEQ ID NO:1068)、clbE(SEQ ID NO:1069)、clbF(SEQ ID NO:1070)、clbG(SEQ ID NO:1071)、clbH(SEQ ID NO:1072)、clbI(SEQ ID NO:1073)、clbJ(SEQ ID NO:1074)、clbK(SEQ ID NO:1075)、clbL(SEQID NO:1076)、clbM(SEQ ID NO:1077)、clbN(SEQ ID NO:1078)、clbO(SEQ ID NO:1079)、clbP(SEQ ID NO:1080)、clbQ(SEQ ID NO:1081)和clbR(SEQ ID NO:1082)。
在一个实施方案中,重组细菌不包含编码抗生素抗性的基因。
在一个实施方案中,重组细菌具有至少约1μmol/1x109个细胞的草酸盐消耗活性。
在一个实施方案中,重组细菌在厌氧条件下具有约50至约600mg/天的草酸盐消耗活性。在一个实施方案中,重组细菌在厌氧条件下具有约211mg/天的草酸盐消耗活性。在一个实施方案中,当每天三次施用于受试者时,重组细菌在厌氧条件下具有约211mg/天的草酸盐消耗活性。
在一个实施方案中,厌氧条件是在受试者的肠和/或结肠中的条件。
在一个实施方案中,所述方法将受试者的急性草酸盐水平降低约两倍。在一个实施方案中,所述方法将受试者的急性草酸盐水平降低约三倍。在一个实施方案中,所述方法将受试者的慢性草酸盐水平降低约两倍。在一个实施方案中,所述方法将受试者的慢性草酸盐水平降低约三倍。
在一个实施方案中,所述方法将受试者的急性草酸盐水平降低至约25mg/天、约30mg/天、约40mg/天、约50mg/天、约60mg/天、约70mg/天、约80mg/天、约90mg/天或约100mg/天。在一个实施方案中,所述方法将受试者的慢性草酸盐水平降低至约25mg/天、约30mg/天、约40mg/天、约50mg/天、约60mg/天、约70mg/天、约80mg/天、约90mg/天或约100mg/天。
在一个实施方案中,重组细菌属于埃希氏菌属(Escherichia)。在一个实施方案中,重组细菌属于大肠埃希氏菌(Escherichia coli)菌株尼斯勒(Nissle)。
在一个实施方案中,口服施用药物组合物。在一个实施方案中,在施用药物组合物的一小时内给受试者喂食膳食。在一个实施方案中,在施用药物组合物的同时给受试者喂食膳食。
在一个实施方案中,受试者是人受试者。
在一个实施方案中,第一启动子为诱导型启动子,任选地当所述诱导型启动子为FNR启动子时,任选地其中所述FNR启动子包含与SEQ ID NO:13-29中的任一者具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列,包含SEQ ID NO:13-29中的任一者,或由SEQ ID NO:13-29中的任一者组成。
在一些实施方案中,诱导型启动子是Pr/Pl启动子。在一个实施方案中,Pr/Pl启动子包含与SEQ ID NO:206、213和219中的任一者具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列,包含SEQ ID NO:206、213和219中的任一者,或由SEQ ID NO:206、213和219中的任一者组成。在一些实施方案中,重组细菌还包含编码Pr/Pl启动子的突变体阻遏物的基因序列。在一些实施方案中,编码突变体阻遏物的基因序列包含与SEQ ID NO:210和214中的任一者具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列,包含SEQ ID NO:210和214中的任一者,或由SEQ ID NO:210和214中的任一者组成。
在一些实施方案中,诱导型启动子是IPTG诱导型启动子。在一个实施方案中,所述IPTG诱导型启动子包含与SEQ ID NO:1107具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列,包含SEQ ID NO:1107,或由SEQ ID NO:1107组成。在一些实施方案中,重组细菌还包含编码Lac启动子阻遏物的基因序列。在一些实施方案中,编码阻遏物的基因序列包含与SEQ ID NO:1105具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列,包含SEQ ID NO:1105,或由SEQ ID NO:1105组成。在一些实施方案中,阻遏物包含与SEQ ID NO:1106具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列,包含SEQ ID NO:1106,或由SEQ ID NO:1106组成。
在一个实施方案中,重组细菌是SYNB8802v1。
在一个实施方案中,受试者患有高草酸尿症。在一个实施方案中,高草酸尿症是原发性高草酸尿症、饮食性高草酸尿症或肠高草酸尿症。
在一个实施方案中,受试者患有短肠综合征、慢性胰腺炎、炎性肠病(IBD)、囊性纤维化、肾病和/或Roux-en-Y胃旁路术。在一个实施方案中,受试者患有短肠综合征和/或Roux-en-Y胃旁路术。
在一个实施方案中,受试者在施用前具有至少70mg/天的尿草酸盐(Uox)水平。
在一个实施方案中,受试者在施用之后显示Uox水平降低至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%或80%。
在一个实施方案中,受试者在施用之前具有eGFR<30mL/min/1.73m2,需要血液透析,或具有全身性草酸盐沉着。
在一个实施方案中,以约1x1011个活重组细菌、约3x1011个活重组细菌、约4.5x1011个活细菌、约5x1011个活重组细菌、约6x1011个活重组细菌、约1x1012个活重组细菌或约2x1012个活重组细菌的剂量施用重组细菌。在一个实施方案中,施用为约4.5x1011个活重组细菌。
在一个实施方案中,重组细菌每天施用一次、每天施用两次或每天施用三次。在一个实施方案中,每天三次与膳食一起施用约5x1011个活重组细菌。
在一个实施方案中,所述方法还包括向受试者施用质子泵抑制剂(PPI)。在一个实施方案中,PPI是埃索美拉唑。在另一个实施方案中,埃索美拉唑以40mg每日施用一次。在一个实施方案中,PPI的施用是每天一次。
在一个实施方案中,药物组合物还包含半乳糖。在一个实施方案中,半乳糖是D-半乳糖。在另一个实施方案中,组合物中存在的半乳糖为约0.1g至约3g、约0.1g至约2.5g、约0.1g至约2.0g、约0.1g至约1.5g、约0.1g至约1.0g、约0.1g至约0.5g、约0.5g至约3g、约0.5g至约2.5g、约0.5g至约2.0g、约0.5g至约1.5g、约0.5g至约1.0g、约1.0g至约3g、约1.0g至约2.5g、约1.0g至约2.0g、约1.0g至约1.5g、约1.5g至约3g、约1.5g至约2.5g、约1.5g至约2.0g、约2.0g至约3g、约2.0g至约2.5g、或约2.5g至约3g。在一些实施方案中,半乳糖以约1.0g存在于组合物中。在一些实施方案中,半乳糖以约0.5g存在于组合物中。在一些实施方案中,半乳糖以约2.0g存在于组合物中。
在一个实施方案中,本文公开了重组细菌,所述重组细菌包含:编码一种或多种草酸分解代谢酶的一个或多个基因序列,所述一个或多个基因序列直接地或间接地与第一启动子可操作地连接,所述第一启动子在自然界不与草酸分解代谢酶基因相关,其中所述一个或多个基因序列包含scaaE3基因、frc基因和oxdC基因,其中所述scaaE3基因包含与SEQID NO:3具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列,包含SEQ ID NO:3或由SEQ ID NO:3组成,其中所述frc基因包含与SEQ ID NO:1具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列,包含SEQ IDNO:1或由SEQ ID NO:1组成,并且其中所述oxdC基因包含与SEQ ID NO:2具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列,包含SEQ ID NO:2或由SEQ ID NO:2组成;编码草酸盐输入蛋白的基因,其中所述编码草酸盐输入蛋白的基因是oxlT基因,并且其中所述oxlT基因包含与SEQ ID NO:11具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列,包含SEQ ID NO:11或由SEQ ID NO:11组成;ΔthyA营养缺陷型;内源噬菌体中的缺失;经修饰的内源性大肠杆菌素岛。
在一个实施方案中,内源噬菌体包含与SEQ ID NO:63具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列,包含SEQ ID NO:63,或由SEQ IDNO:63组成。
在一个实施方案中,经修饰的内源性大肠杆菌素岛包含一种或多种选自以下的经修饰的clb序列:clbA(SEQ ID NO:1065)、clbB(SEQ ID NO:1066)、clbC(SEQ ID NO:1067)、clbD(SEQ ID NO:1068)、clbE(SEQ ID NO:1069)、clbF(SEQ ID NO:1070)、clbG(SEQ IDNO:1071)、clbH(SEQ ID NO:1072)、clbI(SEQ ID NO:1073)、clbJ(SEQ ID NO:1074)、clbK(SEQ ID NO:1075)、clbL(SEQ ID NO:1076)、clbM(SEQ ID NO:1077)、clbN(SEQ ID NO:1078)、clbO(SEQ ID NO:1079)、clbP(SEQ ID NO:1080)、clbQ(SEQ ID NO:1081)、clbR(SEQID NO:1082)和clbS(SEQ ID NO:1803)。
在一个实施方案中,经修饰的内源性大肠杆菌素岛包含以下的缺失:clbA(SEQ IDNO:1065)、clbB(SEQ ID NO:1066)、clbC(SEQ ID NO:1067)、clbD(SEQ ID NO:1068)、clbE(SEQ ID NO:1069)、clbF(SEQ ID NO:1070)、clbG(SEQ ID NO:1071)、clbH(SEQ ID NO:1072)、clbI(SEQ ID NO:1073)、clbJ(SEQ ID NO:1074)、clbK(SEQ ID NO:1075)、clbL(SEQID NO:1076)、clbM(SEQ ID NO:1077)、clbN(SEQ ID NO:1078)、clbO(SEQ ID NO:1079)、clbP(SEQ ID NO:1080)、clbQ(SEQ ID NO:1081)和clbR(SEQ ID NO:1082)。
在一个实施方案中,重组细菌不包含编码抗生素抗性的基因。
在一个实施方案中,第一启动子为诱导型启动子,任选地当所述诱导型启动子为FNR启动子时,任选地其中所述FNR启动子包含与SEQ ID NO:13-29中的任一者具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列,包含SEQ ID NO:13-29中的任一者,或由SEQ ID NO:13-29中的任一者组成。
在一个实施方案中,重组细菌具有至少约1μmol/1x109个细胞的草酸盐消耗活性。在一个实施方案中,重组细菌在厌氧条件下具有约50-600mg/天的草酸盐消耗活性。
在一个实施方案中,重组细菌是SYNB8802v1。在一个实施方案中,重组细菌是SYNB8802。
在一个实施方案中,重组细菌在厌氧条件下具有约0.2微摩尔/小时至约1.6微摩尔/小时、约0.5微摩尔/小时至约1.5微摩尔/小时、或约1.0微摩尔/小时至约1.5微摩尔/小时的草酸盐消耗活性。在一个实施方案中,重组细菌在厌氧条件下具有约0.5微摩尔/小时至约1.5微摩尔/小时的草酸盐消耗活性。在一个实施方案中,重组细菌在厌氧条件下具有约0.2微摩尔/小时至约1.6微摩尔/小时、约0.5微摩尔/小时至约1.5微摩尔/小时、或约1.0微摩尔/小时至约1.5微摩尔/小时的草酸盐消耗活性。在一个实施方案中,重组细菌在厌氧条件下具有约0.5微摩尔/小时至约1.5微摩尔/小时的草酸盐消耗活性。
在一个实施方案中,重组细菌能够将施用后受试者的尿草酸盐降低至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%或至少45%。在一个实施方案中,重组细菌能够将施用后受试者的粪便草酸盐减低至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少85%。
附图说明
图1描绘了显示与野生型大肠埃希氏菌Nissle菌株相比时使用工程化大肠埃希氏菌尼斯勒菌株的体外草酸盐降解测定的结果的图。
图2A描绘了显示通过测量当与野生型大肠埃希氏菌尼斯勒菌株(EcN)相比使用工程化大肠埃希氏菌尼斯勒菌株(工程化EcN)的急性13C-草酸盐尿回收进行的体内草酸盐消耗实验的结果的柱状图。图2B描绘了显示通过测量当与野生型大肠埃希氏菌尼斯勒菌株(EcN)相比使用工程化大肠埃希氏菌尼斯勒菌株(工程化EcN)的慢性尿草酸盐回收进行的体内草酸盐消耗实验的结果的柱状图。
图3是概括了肠高草酸尿症的疾病发病机理的图。
图4A描绘了菌株SYNB8802的组分,并且图4B描绘了显示与野生型大肠埃希氏菌尼斯勒菌株相比使用SYNB8802的体外草酸盐降解测定的结果的图。图4C描绘了显示与野生型大肠埃希氏菌尼斯勒菌株相比使用SYNB8802的体外草酸盐降解和甲酸盐产生测定的结果的图。
图5A描绘了当在模拟的胃和结肠液中激活SYN-HOX时SYN-HOX(SYN5752)的草酸盐消耗。图5B描绘了工程化大肠埃希氏菌尼斯勒菌株(工程化EcN)SYN5752在小鼠肠道中消耗草酸盐。SYN5752是具有抗生素抗性的整合菌株。SYN7169是一种具有抗生素抗性、营养缺陷型和噬菌体3缺失的整合菌株。在多次急性小鼠研究中测量了13C-草酸盐消耗,并且所述菌株的功效在50%-75%之间。在该小鼠模型中,SYN7169的行为与SYN5752相似。图5C描绘了健康小鼠胃肠道(GI)中SYNB8802的草酸盐消耗。数据表示为通过肌酐归一化的平均尿13C-草酸盐回收±平均值的标准误差。统计分析采用单因子方差分析,随后采用Dunnett多重比较检验进行。****p<0.0001。
图6描绘了健康猴子中的尿草酸盐增加的减弱。
图7A描绘了显示在用SYN7169治疗后在健康猴子(NHP)中尿草酸盐的剂量依赖性回收的条形图。图7B描绘了显示在用SYN7169治疗后在健康猴子中尿13C-草酸盐的剂量依赖性回收的条形图。图7C描绘了患有急性高草酸尿症的食蟹猴胃肠道中的草酸盐和13C-草酸盐消耗。数据表示为通过肌酐归一化的平均尿草酸盐或13C-草酸盐回收±平均值的标准误差。使用配对t检验进行统计分析。**p<0.01。
图8A描绘了SYNB8802在体内存活,并且在24小时后从小鼠的粪便中被清除。图8B描绘了在6小时和24小时内从食蟹猴的粪便中回收的SYN-HOX(SYNB8802)。
图9描绘了在非人灵长类动物(NHP)中用冻干的SYNB8802(Lyo)和冷冻液体(FL)的草酸盐消耗。
图10描绘了基于CFU和活细胞用冻干的SYN-HOX(SYN7169)(Lyo)和冷冻液体在小鼠中的草酸盐消耗。
图11A描绘了对在用SYNB8802治疗后在人类患者中尿草酸盐的剂量依赖性回收建模的图。图11B描绘了肠高草酸尿症计算机模拟(ISS)模型的示意图。图11C描绘了在给予SYNB8802之后从基线的尿草酸盐百分比变化的计算机模拟(ISS)。该建模表明,在目标剂量范围内SYNB8802有可能实现>20%的尿草酸盐降低。
图12是概括临床试验的组织的示意图。
图13描绘了健康志愿者在高草酸盐/低钙饮食后的基线尿草酸盐的图。
图14A描绘了在SYNB8802施用和600mg每日草酸盐后剂量响应性和可再现性尿草酸盐降低的图。尿草酸盐变化百分比越低越好。图14B描绘了在SYNB8802施用和400mg每日草酸盐之后与图14A中所描绘的一样的图。尿草酸盐变化百分比越低越好。相对于安慰剂的LS平均变化,+/-90%CI,基线和治疗所有天数。
图15A描绘了在以3x1011个活细胞的剂量施用SYNB8802之后尿草酸盐变化的图。图15B描绘了以3x1011个活细胞的剂量施用安慰剂或SYNB8802的健康志愿者的尿草酸盐水平的图。相对于安慰剂的LS平均变化,+/-90%测量标准误差,所有天数;以及给药5天后的24小时UOx,+/-90%测量标准误差,600mg每日草酸盐。
图16描绘了健康志愿者的尿草酸盐变化的图。相对于安慰剂的LS平均变化%+/-SEM。
图17描绘了体外模拟(IVS)的图。左侧y轴:以μmol/h/109个细胞计的草酸盐降解速率。X轴=以小时计的时间。左侧X轴0-4小时,右侧X轴6-48小时。圆点代表一式三份的平均值,误差条代表标准偏差。左侧方框中的数据点代表在模拟胃液(SGF)中的孵育。中间方框中的数据点代表在模拟肠液(SIF)中的孵育。右侧方框中的数据点代表在模拟结肠液(SCF)中的孵育。
图18A描绘了计算机模拟(ISS)酶活性和pH抑制模型。酶动力学的Michaelis-Menten模型。Vmax定义了最大酶速度(SYNB8802对草酸盐的消耗速率)。Km定义了出现半最大酶速度时的草酸盐浓度。通过体外模拟确定Vmax和Km。
图18B描绘了作为固体膳食后时间的函数的模拟胃pH(深蓝色)。此函数是幂指数衰减,其中半衰期为110分钟,并且形状参数等于1.81。在胃中花费的时间的可能性基于胃停留时间分布(浅蓝色)。分布被截断为最长4小时,并且中值胃停留时间为110分钟。
图18C描绘了作为时间的函数的在胃中的模拟归一化SYNB8802活性。
图18D描绘了作为先前在胃中花费的时间的函数的在小肠中的模拟归一化SYNB8802活性。函数相当于胃幻术,其中所赋予的上限基于肠道pH。
图19A描绘了计算机模拟(ISS)模型验证和继通过SYNB8802去除饮食草酸盐之后的模拟的尿草酸盐降低。对照临床数据验证模拟的尿草酸盐排泄。自由生活饮食和三天高草酸盐饮食的模拟尿草酸盐(深蓝色);点和误差条分别代表30名模拟健康受试者中的平均值和标准偏差。自由生活饮食和三天高草酸盐、低钙(HOLC)饮食的观察到的尿草酸盐(浅蓝色);点和误差条分别代表30名健康受试者中的平均值和标准偏差。
图19B描绘了在没有SYNB8802和有1x1011个、2x1011个和5x1011个SYNB8802细胞TID的情况下在10天内消耗200mg/天饮食草酸盐的健康受试者的模拟尿草酸盐和尿草酸盐减少。点代表在健康受试者的饮食草酸盐吸收的基线假设下的模拟(Holmes等人,2001)。误差条代表膳食草酸盐吸收的模拟范围(0.75x-1.25x基线)。
图20描绘了体外模拟的SYNB8802 pH抑制。SYNB8802活性为暴露于pH范围为2.0至7.0的培养基的时间的函数。黑色的点和误差条代表体外测量(n=每组3个重复培养物;平均值±SD)。蓝色曲线代表拟合至每个pH水平的体外测量的指数衰减模型。
图21A描绘了当受试者在其饮食中每天被给予400mg草酸盐时从BID(一天两次)日开始并且在整个给药期中维持的活性组和安慰剂组的UOx分离。向活性组施用3e11个SYNB8802活细胞。
图21B描绘了在受试者在其饮食中每天被给予600mg草酸盐时从BID(一天两次)日开始并且在整个给药期中维持的活性组和安慰剂组的UOx分离。向活性组施用3e11个SYNB8802活细胞。
图22描绘了当受试者在其饮食中每天施用600mg草酸盐时粪便草酸盐的剂量相关减少。
图23是概述第1a部分-研究设计的组织的示意图。
图24描绘了在用SYNB8802(HOX+pks)和SYNB8802v1(HOX-pks)的情况下的草酸盐减少。
图25描绘了针对第1期数据的ISS模型验证。
图26描绘了示例性草酸盐消耗菌株SYNB8802的示意图。
具体实施方式
草酸盐来源于各种饮食和内源性来源,并且被认为是人类代谢的终产物。在生理条件下,吸收的饮食和内源性产生的草酸盐通过肾脏以尿草酸盐(UOx)的形式排泄。(Mitchell T等人Dietary oxalate and kidney stone formation.Am J Physiol RenalPhysiol.2019;316:F409-13)。在健康人中,只有一小部分摄入的草酸盐被吸收。在健康人中,内源性草酸盐产生和饮食草酸盐吸收对UOx的贡献大致相等(Holmes R,Goodman H,Assimos D.Contribution of dietary oxalate to urinary oxalate excretion.KidneyInt.2001;59:270-76)。胃肠道(GI)草酸盐吸收或肝脏草酸盐产生的增加会增加血浆草酸盐(POx)并因此增加UOx,并且促成结石形成和其他不良肾脏后果的风险(Curhan G,TaylorE.24-h uric acid excretion and the risk of kidney stones.Kidney Int.2008;73:489-96)。大约85%的肾结石是由于尿中的草酸钙过饱和引起的。
肠道高草酸尿症(EH)可能由肠道草酸盐吸收增加、食物草酸盐生物利用度增加、肠道草酸盐降解减少、肠道草酸盐分泌减少或内源性草酸盐产生增加引起。在正常情况下,饮食钙在肠腔中与草酸盐形成复合物,使其不溶,因此不能被吸收。导致肠道中脂肪吸收不良和游离脂肪酸增加的胃肠道疾病可以通过阻止草酸钙复合物的形成而导致结肠中的可溶性草酸盐增加和草酸盐的结肠吸收增加。
因此,通常在患有影响脂肪吸收的潜在消化系统疾病的患者中观察到EH,所述患者诸如有减肥手术史、炎症性肠病(IBD)、囊性纤维化、短肠综合征和慢性胆道或胰腺病理的患者。据估计,美国患有肾结石的EH患者的患病率<250,000,最常见的潜在吸收不良肠道疾患是Roux-n-Y(RnY)胃旁路术(>60%)和IBD(20%)(Tasian G,Wade B,Gaebler J,KauszA,Medicis J,Wyatt C.Prevalence of kidney stones in patients with entericdisorders.论文发表于哥伦比亚特区华盛顿的美国肾脏学会(American Society ofNephrology Washington,DC),2019年)。
肠道微生物群和某些遗传异常也可能对草酸盐体内平衡产生影响。人类肠道微生物组中的某些共生细菌菌株,包括草酸杆菌属(Oxalobacter)某些种、双歧杆菌属(Bifidobacterium)某些种和乳杆菌属(Lactobacillus)某些种,可以降解草酸盐并且能够调节肠道草酸盐分泌。此外,阴离子交换体SLC26家族的遗传缺陷可能使个体更易患EH(Freel R等人,Ileal oxalate absorption and urinary oxalate excretion areenhanced in Slc26a6-null mice.Am J Physiol.2006;290:G719-28)。
肠道高草酸尿症可能导致肾结石的形成。UOx增加也是急性肾损伤和慢性肾病(CKD)的危险因素(Lumlertgul N,Siribamrungwong M,Jaber B,SusantitaphongP.Secondary oxalate nephropathy:A systematic review.Kidney Int Rep.2018;3:1363-72)。EH中的草酸盐肾病可能导致进行性肾脏衰退,并最终导致需要透析的终末期肾脏疾病。当肾小球滤过率落入每1.73m2低于30至40mL/min时,POx水平可能显著增加,使在肾外组织中更易形成草酸钙晶体沉积物,这一过程称为全身性草酸盐沉着。虽然这是一种罕见的EH表现,但CKD患者可以表现为视网膜、关节、皮肤和心血管系统受累,具有严重的后果。
没有批准的用于治疗高草酸尿症的药物疗法。高草酸尿症的管理旨在降低肾结石复发的风险,并且涉及控制和降低饮食草酸盐和脂肪的摄入,增加饮食中钙的摄入,并确保足够的液体摄入(Pearle MS,Goldfarb DS,Assimos DG,Curhan G,Denu-Ciocca CJ,Matlaga BR等人Medical management of kidney stones:AUA guideline.J Urol.2014;92(2):316-24)。然而,饮食治疗尤其是在患有严重高草酸尿症的那些患者中的功效是有限的。长期坚持低草酸盐饮食具有挑战性,因为许多食物(例如,绿色蔬菜、坚果、谷物、水果、巧克力)中都存在草酸盐。高盐、高脂肪和低钙含量的典型西方饮食也会增加草酸盐的吸收。因此,对于患有继发性高草酸尿症及其相关并发症(诸如肾结石和草酸盐肾病)的患者,存在对耐受性良好的慢性疗法的未满足的医学需求。
本公开包括工程化和编程的微生物(例如细菌、酵母、病毒等)、其药物组合物以及调节和治疗草酸盐有害的病症的方法。在一些实施方案中,微生物(例如细菌、酵母或病毒)已被遗传工程化以包含编码一种或多种草酸分解代谢酶的异源基因序列。在一些实施方案中,微生物(例如细菌、酵母或病毒)已被遗传工程化以包含编码一种或多种草酸分解代谢酶的异源基因序列,并且能够在低氧环境(例如肠道)中处理和降低草酸盐和/或草酸。在一些实施方案中,工程化微生物包含编码一种或多种草酸分解代谢酶的异源基因序列,并且能够将草酸和/或草酸盐和/或另一种相关代谢物转运到细菌中。因此,重组微生物和包含本发明的微生物的药物组合物可以被用于分解代谢草酸盐或草酸,以治疗和/或预防与草酸盐有害的病症相关的疾患。在一个实施方案中,草酸盐有害的病症是涉及异常草酸盐水平的病症,诸如原发性高草酸尿症(即PHI、PHII和PHIII)、继发性高草酸尿症、肠高草酸尿症、饮食性高草酸尿症或特发性高草酸尿症。
在一些实施方案中,工程化微生物包含编码以下物质中的一种或多种的基因序列:(i)一种或多种草酸盐转运蛋白;(ii)一个或多个甲酸盐输出蛋白;(iii)介导草酸盐的转运(输入)和甲酸盐的输出两者的一种或多种多肽(例如,草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白);和(iv)它们的任何组合。在一些实施方案中,微生物已被工程化以包含编码一种或多种草酸分解代谢酶和以下物质中的一种或多种的基因序列:(i)一种或多种草酸盐转运蛋白;(ii)一个或多个甲酸盐输出蛋白;(iii)介导草酸盐的转运(输入)和甲酸盐的输出两者的一种或多种多肽(例如,草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白);和(iv)它们的任何组合。
为了能够更容易地理解本公开,首先定义某些术语。应当根据本公开的其余部分并如本领域普通技术人员所理解的来解读这些定义。除非另有定义,否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。附加定义如整个具体实施方式中所阐述。
如本文所用,术语“微生物”或“重组微生物”是指已经从其天然状态进行遗传修饰的微生物(例如细菌或病毒细胞、或细菌或病毒)。因此,“重组细菌细胞”或“重组细菌”是指已经从其天然状态进行遗传修饰的细菌细胞或细菌。例如,重组细菌细胞可以在其DNA中引入核苷酸插入、核苷酸缺失、核苷酸重排和核苷酸修饰。这些遗传修饰可能存在于细菌或细菌细胞的染色体中,或者存在于细菌或细菌细胞的质粒上。本文所公开的重组细菌细胞可以包含在质粒上的外源核苷酸序列。可替代地,重组细菌细胞可以包含稳定掺入其染色体中的外源核苷酸序列。
“编程的或工程化微生物”是指已经从其天然状态进行了遗传修饰以执行特定功能的微生物(例如细菌或病毒细胞、或细菌或病毒)。因此,“编程的或工程化细菌细胞”或“编程的或工程化的细菌”或“遗传工程化细菌细胞或细菌”是指已经从其天然状态进行遗传修饰以执行特定功能(例如代谢代谢物(例如草酸盐))的细菌细胞或细菌。在某些实施方案中,编程的或工程化细菌细胞已经被修饰以表达一种或多种蛋白质,例如具有治疗活性或服务于治疗目的的一种或多种蛋白质。一旦所关注的蛋白质已经被表达,编程的或工程化细菌细胞还可以具有停止生长或自身毁灭的能力。
如本文所用,术语“基因”是指编码蛋白质或其片段的核酸片段,任选地包括编码序列之前(5′非编码序列)和之后(3′非编码序列)的调节序列。在一个实施方案中,“基因”不包括编码序列之前和之后的调节序列。“天然基因”是指在自然界中发现的基因,任选地在编码序列之前和之后具有其自身的调节序列。“嵌合基因”是指任何非天然基因的基因,任选地包含在编码序列之前和之后的调节序列,其中所述编码序列和/或所述调节序列全部或部分在自然界中并不存在。因此,嵌合基因可以包含源自不同来源的调节序列和编码序列,或者源自相同来源但以不同于自然界中存在的方式排列的调节序列和编码序列。
如本文所用,术语“基因序列”意指遗传序列,例如核酸序列。基因序列或遗传序列意在包括完整基因序列或部分基因序列。基因序列或遗传序列意在包括编码蛋白质或多肽的序列,并且也意在包括不编码蛋白质或多肽的遗传序列,例如调节序列、前导序列、信号序列或其他非蛋白质编码序列。
如本文所用,“异源”基因或“异源序列”是指通常在自然界中在给定细胞中不存在的核苷酸序列。如本文所用,异源序列涵盖外源引入给定细胞中的核酸序列,并且可以是天然序列(在细胞中天然存在或表达)或非天然序列(在细胞中非天然存在或表达),并且可以是天然或野生型序列或变体、非天然或合成的序列。“异源基因”包括以不同于相应的天然基因的形式引入宿主细胞中的天然基因或其片段。例如,异源基因可以包括作为嵌合基因一部分的天然编码序列,以包括重新引入宿主细胞中的非天然调节区。异源基因也可以包括引入非天然宿主细胞中的天然基因或其片段。因此,异源基因对于受体细胞可以是外源的或天然的;在给定细胞中天然存在但表达非天然量的核酸和/或其编码的多肽的核酸序列;和/或在自然界中彼此不存在于相同关系中的两个或更多个核酸序列。如本文所用,术语“内源基因”是指在生物体基因组中在其天然位置中的天然基因。如本文所用,术语“转基因”是指已经被引入宿主生物体(例如宿主细菌细胞)基因组中的基因。
如本文所用,“非天然”核酸序列是指通常不存在于微生物中的核酸序列,例如内源序列的额外拷贝或异源序列(诸如来自细菌或病毒的不同物种、品系或亚株的序列、或与来自相同亚型的细菌或病毒的未修饰序列相比被修饰和/或突变的序列)。在一些实施方案中,非天然核酸序列是合成的、非天然存在的序列(参见例如,Purcell等人,2013)。非天然核酸序列可以是调节区、启动子、基因和/或基因盒中的一个或多个基因。在一些实施方案中,“非天然的”是指在自然界中彼此不存在于相同关系中的两个或更多个核酸序列。非天然核酸序列可以存在于质粒或染色体上。在一些实施方案中,本公开的遗传工程化微生物包含与在自然界中不与所述基因相关的启动子可操作地连接的基因和/或基因盒。例如,在一些实施方案中,本文所公开的遗传工程化细菌包含编码本文所述的一种或多种草酸代谢酶和/或一种或多种草酸盐转运蛋白、一种或多种输出蛋白(例如甲酸盐的)和/或一种或多种反向转运蛋白(例如草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白)的基因或基因盒,所述基因或基因盒可操作地连接到天然不与所述基因相关的直接或间接诱导型启动子上,所述启动子例如与编码本文所述的一种或多种草酸代谢酶和/或一种或多种草酸转运蛋白、一种或多种(例如甲酸盐的)输出蛋白和/或一种或多种反向转运蛋白(例如草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白)的基因可操作地连接的FNR响应性一种或多种本文所述的草酸代谢酶和/或一种或多种草酸盐转运蛋白、一种或多种输出蛋白(例如甲酸盐的)和/或一种或多种反向转运蛋白(例如草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白)(或本文所公开的其他启动子)。在一些实施方案中,本公开的遗传工程化病毒包含可操作地连接到在自然界中不与所述基因或基因盒相关的直接或间接诱导型启动子上的基因或基因盒,所述启动子例如与编码一种或多种草酸代谢酶和/或一种或多种草酸盐转运蛋白和/或一种或多种(例如甲酸盐的)输出蛋白和/或一种或多种反向转运蛋白(例如,草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白)的基因和/或基因盒可操作地连接的启动子。
如本文所用,术语“编码区”是指编码特定氨基酸序列的核苷酸序列。术语“调节序列”是指位于编码序列上游(5′非编码序列)、内部或下游(3′非编码序列)的核苷酸序列,并且其影响相关编码序列的转录、RNA加工、RNA稳定性或翻译。调节序列的实例包括但不限于启动子、翻译前导序列、效应子结合位点、信号序列和茎环结构。在一个实施方案中,调节序列包含启动子,例如FNR响应性启动子或本文所公开的其他启动子。
“可操作地连接”是指核酸序列在单个核酸片段上的缔合,使得一个核酸序列的功能受到另一个核酸序列的影响。当调节元件能够影响基因编码序列的表达时,其与编码序列可操作地连接,而不管调节元件与编码序列之间的距离。更具体而言,可操作地连接是指核酸序列(例如编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因或基因盒)其以允许所述核酸序列表达的方式与调节序列连接,所述核酸序列例如编码一种或多种草酸分解代谢酶和/或一种或多种草酸转运蛋白、一种或多种(例如甲酸盐的)输出蛋白和/或一种或多种反向转运蛋白(例如草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白)的基因或基因盒。换句话说,调节序列以顺式发挥作用。在一个实施方案中,可以将基因以允许基因表达的方式“直接连接”到调节序列上。在另一个实施方案中,可以将基因以允许基因表达的方式“间接连接”到调节序列上。在一个实施方案中,可以将两个或更多个基因以允许两个或更多个基因表达的方式直接或间接连接到调节序列上。调节区或序列是能够指导所关注基因的转录的核酸,并且可以包含启动子序列、增强子序列、应答元件、蛋白质识别位点、诱导型元件、启动子控制元件、蛋白质结合序列、5′和3′非翻译区、转录起始位点、终止序列、聚腺苷酸化序列和内含子。
如本文所用的“启动子”是指能够控制编码序列或基因表达的核苷酸序列。启动子通常位于它们所调节的序列的5′端。启动子可以全部来源于天然基因,或者由来源于自然界中存在的启动子的不同元件构成,和/或包含合成的核苷酸区段。本领域技术人员将容易地确定,不同的启动子可以响应于特定的刺激(例如以细胞或组织特异性的方式响应于不同的环境或生理条件或响应于特定的化合物)来调节编码序列或基因的表达。原核生物启动子通常被分为两个类别:诱导型和组成型。“组成型启动子”是指允许在其控制下的编码序列或基因连续转录的启动子。
“组成型启动子”是指能够促进在其控制下和/或与其可操作地连接的编码序列或基因连续转录的启动子。组成型启动子和变体是本领域熟知的,并且包括但不限于Ptac启动子、BBa_J23100、组成型大肠埃希氏菌σS启动子(例如,osmY启动子(国际遗传工程机器(International Genetically Engineered Machine,iGEM)标准生物部分注册名称BBa_J45992;BBa_J45993))、组成型大肠埃希氏菌σ32启动子(例如,htpG热休克启动子(BBa_J45504))、组成型大肠埃希氏菌σ70启动子(例如,lacq启动子(BBa_J54200;BBa_J56015)、大肠埃希氏菌CreABCD磷酸盐感应操纵子启动子(BBa_J64951)、GlnRS启动子(BBa_K088007)、lacZ启动子(BBa_K119000;BBa_K119001);M13K07基因I启动子(BBa_M13101);M13K07基因II启动子(BBa_M13102)、M13K07基因III启动子(BBa_M13103)、M13K07基因IV启动子(BBa_M13104)、M13K07基因V启动子(BBa_M13105)、M13K07基因VI启动子(BBa_M13106)、M13K07基因VIII启动子(BBa_M13108)、M13110(BBa_M13110))、组成型枯草芽孢杆菌σA启动子(例如,启动子veg(BBa_K143013)、启动子43(BBa_K143013)、PliaG(BBa_K823000)、PlepA(BBa_K823002)、Pveg(BBa_K823003))、组成型枯草芽孢杆菌σB启动子(例如,启动子ctc(BBa_K143010)、启动子gsiB(BBa_K143011))、沙门氏菌属启动子(例如,来自沙门氏菌属的Pspv2(BBa_K112706)、来自沙门氏菌属的Pspv(BBa_K112707))、噬菌体T7启动子(例如,T7启动子(BBa_I712074;BBa_I719005;BBa_J34814;BBa_J64997;BBa_K113010;BBa_K113011;BBa_K113012;BBa_R0085;BBa_R0180;BBa_R0181;BBa_R0182;BBa_R0183;BBa_Z0251;BBa_Z0252;BBa_Z0253))和噬菌体SP6启动子(例如,SP6启动子(BBa_J64998))。
“诱导型启动子”是指与一个或多个基因可操作地连接的调节区,其中在所述调节区的诱导物的存在下基因的表达增加。“诱导型启动子”是指响应于刺激或外源环境条件启动在其控制下的编码序列或基因的转录水平增加的启动子。“直接诱导型启动子”是指调节区,其中调节区与编码一种或多种草酸代谢酶和/或一种或多种草酸盐转运蛋白和/或一种或多种(例如甲酸盐的)输出蛋白和/或一种或多种反向转运蛋白(例如草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白)的基因和/或基因盒可操作地连接,其中在所述调节区的诱导物的存在下蛋白质或多肽得以表达。“间接诱导型启动子”是指包含两个或更多个调节区的调节系统,所述两个或更多个调节区例如与编码第一蛋白质、多肽或因子(例如转录调节因子)的第一基因可操作地连接的第一调节区,所述第一调节区能够调节与第二基因可操作地连接的第二调节区,所述第二调节区可以被激活或阻遏,从而激活或阻遏所述第二基因的表达。“诱导型启动子”涵盖直接诱导型启动子和间接诱导型启动子两者。本文所述的示例性诱导型启动子包括氧水平依赖性启动子(例如,FNR诱导型启动子)、由炎症或炎症反应诱导的启动子(RNS、ROS启动子)和由由可能天然地存在于或可能不天然地存在于(例如,可以外源地添加到)肠道中的代谢物(例如阿拉伯糖和四环素)诱导的启动子。诱导型启动子的实例包括但不限于FNR响应性启动子、ParaC启动子、ParaBAD启动子、PTetR启动子和PLacI启动子,它们各自在本文中有更详细的描述。本文下面提供了其他诱导型启动子的实例。
如本文所用,“稳定维持的”或“稳定的”细菌用于指携带非天然遗传物质的细菌宿主细胞,所述非天然遗传物质例如编码一种或多种草酸代谢酶和/或一种或多种草酸盐转运蛋白和/或一种或多种(例如甲酸盐的)输出蛋白和/或一种或多种反向转运蛋白(例如草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白)的基因和/或基因盒,所述非天然遗传物质被整合到宿主基因组中或在自我复制的染色体外质粒上增殖,使得所述非天然遗传物质得以保留、表达和增殖。稳定的细菌能够在体外(例如在培养基中)和/或在体内(例如在肠道中)存活和/或生长。例如,稳定的细菌可以是包含编码一种或多种草酸代谢酶和/或一种或多种草酸盐转运蛋白和/或一种或多种(例如甲酸盐的)输出蛋白和/或一种或多种反向转运蛋白(例如,草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白)的基因和/或基因盒的遗传工程化细菌,其中携带所述基因的质粒或染色体稳定地保持在细菌中,使得所述一种或多种草酸分解代谢酶和/或一种或多种草酸盐转运蛋白和/或一种或多种(例如甲酸盐的)输出蛋白和/或一种或多种反向转运蛋白(例如,草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白)可以在细菌中被表达,并且所述细菌能够在体外和/或在体内存活和/或生长。在一些实施方案中,拷贝数影响所述非天然遗传物质表达的稳定性。在一些实施方案中,拷贝数影响所述非天然遗传物质的表达水平。
如本文所用,术语“表达”是指来自核酸的有义(mRNA)或反义RNA的转录和稳定积累,和/或mRNA翻译成多肽。
如本文所用,术语“质粒”或“载体”是指未整合到细菌细胞基因组中的染色体外核酸(例如DNA)构建体。质粒通常是环状的,并且能够自主复制。质粒可以是低拷贝、中等拷贝或高拷贝的,如本领域熟知的。质粒可以任选地包含有助于选择含有质粒的细菌细胞并且确保质粒保留在细菌细胞中的选择性标记,诸如抗生素抗性基因,其。本文所公开的质粒可以包含编码异源基因的核酸序列,所述异源基因例如编码一种或多种草酸代谢酶和/或一种或多种草酸盐转运蛋白和/或一种或多种(例如甲酸盐的)输出蛋白和/或一种或多种反向转运蛋白(例如草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白)的基因和/或基因盒。
如本文所用,术语“转化”(“transform”或“transformation”)是指将核酸片段转移到宿主细菌细胞中,导致遗传稳定的遗传。包含转化的核酸片段的宿主细菌细胞被称为“重组的”或“转基因的”或“转化的”生物体。
如本文所用的术语“遗传修饰”是指任何遗传变化。示例性的遗传修饰包括增加、减少或消除基因表达的修饰,包括例如天然染色体或染色体外遗传物质的修饰。示例性的遗传修饰还包括引入至少一个质粒、染色体或染色体外遗传序列的修饰、突变、碱基缺失、碱基添加、碱基取代和/或密码子修饰、基因过表达、基因扩增、基因抑制、启动子修饰或取代、基因添加(单拷贝或多拷贝)、反义表达或抑制、或宿主细胞遗传元件的任何其他变化(无论所述变化是否产生表型变化)。遗传修饰可以包括将质粒引入细菌细胞中,所述质粒例如包含与启动子可操作地连接的编码一种或多种草酸代谢酶和/或一种或多种草酸盐转运蛋白和/或一种或多种(例如甲酸盐的)输出蛋白和/或一种或多种反向转运蛋白(例如草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白)的基因和/或基因盒的质粒。遗传修饰也可能涉及染色体中的靶向替换,例如,用诱导型启动子、调节性启动子、强启动子或组成型启动子替换天然基因启动子。遗传修饰也可以包括基因扩增,例如,将天然基因的至少一个额外拷贝引入细胞的染色体中。可替代地,染色体遗传修饰可能涉及遗传突变。
如本文所用,术语“遗传突变”是指与其天然或野生型序列相比在基因或相关调节区的核苷酸序列中改变了核苷酸序列的一个或多个变化。突变包括例如在野生型序列中全部或部分的取代、添加和缺失。此类取代、添加或缺失可以是单个核苷酸变化(例如,一个或多个点突变),或者可以是两个或更多个核苷酸变化,这可能导致序列的实质性变化。突变可以发生在基因的编码区内,也可以发生在基因的非编码和调节序列内。术语“遗传突变”旨在包括编码区内的沉默和保守突变,以及改变由基因编码的多肽的氨基酸序列的变化。基因编码序列中的遗传突变可以例如增加、减少或以其他方式改变基因多肽产物的活性(例如酶活性)。调节序列中的遗传突变可以增加、减少或以其他方式改变与改变的调节序列可操作地连接的序列的表达。
具体而言,术语“减少草酸盐从细菌细胞输出的遗传修饰”是指与草酸盐从不具有所述修饰的细菌细胞(例如野生型细菌细胞)的输出速率或输出量相比,减少草酸盐从细菌细胞的输出速率或输出量的遗传修饰。在一个实施方案中,具有减少草酸盐从细菌细胞输出的遗传修饰的重组细菌细胞包含天然基因中的遗传突变。在另一个实施方案中,具有减少草酸盐从细菌细胞输出的遗传修饰的重组细菌细胞包含天然启动子中的遗传突变,其减少或抑制编码草酸盐输出蛋白的基因的转录。在另一个实施方案中,具有减少草酸盐从细菌细胞输出的遗传修饰的重组细菌细胞包含导致草酸盐输出蛋白的阻遏物过表达的遗传突变。在另一个实施方案中,具有减少草酸盐从细菌细胞输出的遗传修饰的重组细菌细胞包含减少或抑制编码草酸盐输出蛋白的基因翻译的遗传突变。
此外,术语“增加细菌细胞中草酸盐的输入的遗传修饰”是指与不具有所述修饰的细菌细胞(例如野生型细菌细胞)的细胞溶质中草酸盐的摄取速率或摄取量相比,增加细菌细胞的细胞溶质中草酸盐的摄取速率或摄取量的遗传修饰。在一些实施方案中,具有增加细菌细胞中草酸盐的输入的遗传修饰的工程化细菌细胞是指包含编码一种或多种草酸盐输入蛋白/转运蛋白的异源基因序列(天然或非天然)的细菌细胞。在一些实施方案中,包含增加细菌细胞中草酸盐的输入的遗传修饰的遗传工程化细菌包含编码草酸盐转运蛋白或其他代谢物转运蛋白或反向转运蛋白(例如将草酸盐转运到细菌细胞中的草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白)的基因序列。转运蛋白可以是辅助或允许草酸盐输入细胞中的任何转运蛋白。在某些实施方案中,草酸盐转运蛋白是反向转运蛋白,例如来自产甲酸草酸杆菌的例如草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白,例如OxlT。在某些实施方案中,工程化细菌细胞包含编码例如来自产甲酸草酸杆菌的OxlT的基因序列。在一些实施方案中,工程化细菌包含多于一个拷贝的编码草酸盐转运蛋白(例如草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白,例如OxlT,例如来自产甲酸草酸杆菌的基因序列。在一些实施方案中,工程化细菌包含编码多于一种草酸盐转运蛋白(例如两种或更多种不同的草酸盐转运蛋白)的基因序列。
如本文所用,术语“转运蛋白”意在指用于将分子(例如,氨基酸、肽(二肽、三肽、多肽等)、毒素、代谢物、底物以及其他生物分子)从细胞外环境输入微生物中的一种机制(例如,一种蛋白质、多种蛋白质或蛋白质复合物)。如本文所用,术语“转运蛋白”还包括可以输入和输出代谢物的反向转运蛋白,例如本文所述的草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白。如本文所用,术语“转运蛋白”和“输入蛋白”被等效地使用。
如本文所用的术语“草酸盐”是指式C2O4 2-的二价阴离子。草酸盐是草酸的共轭碱。如本文所用的术语“草酸”是指化学式H2C2O4的二羧酸。
如本文所用,短语“外源环境条件”或“外源环境信号”是指直接或间接诱导的本文所述的启动子的设置、环境、刺激或生物分子。短语“外源环境条件”意在指对于工程化微生物是外部的但是对于宿主受试者环境是内源的或天然的环境条件。因此,“外源”和“内源”可以互换使用,是指环境条件,其中所述环境条件对于哺乳动物体是内源的但是对于完整的微生物细胞是外部的或外源的。在一些实施方案中,外源环境条件对于哺乳动物的肠道是特异的。在一些实施方案中,外源环境条件对于哺乳动物的上胃肠道是特异的。在一些实施方案中,外源环境条件对于哺乳动物的下胃肠道是特异的。在一些实施方案中,外源环境条件对于哺乳动物的小肠是特异的。在一些实施方案中,外源环境条件是低氧、微需氧或厌氧条件,诸如哺乳动物肠道的环境。在一些实施方案中,外源环境条件是对哺乳动物肠道特异的分子或代谢物,例如丙酸盐。在一些实施方案中,外源环境条件是组织特异性或疾病特异性代谢物或分子。在一些实施方案中,外源环境条件对疾病(例如高草酸尿症)是特异的。在一些实施方案中,外源环境条件是低pH环境。在一些实施方案中,本公开的遗传工程化微生物包含pH依赖性启动子。在一些实施方案中,本公开的遗传工程化微生物包含氧水平依赖性启动子。在一些方面,细菌已经进化出能够感知氧水平的转录因子。不同的信号传导途径可能由不同的氧水平触发,并且以不同的动力学发生。“氧水平依赖性启动子”或“氧水平依赖性调节区”是指一种或多种氧水平感知转录因子能够结合的核酸序列,其中相应转录因子的结合和/或激活会激活下游基因表达。
氧水平依赖性转录因子的实例包括但不限于FNR(延胡索酸和硝酸还原酶)、ANR和DNR。相应的FNR响应性启动子、ANR(厌氧硝酸呼吸)响应性启动子和DNR(异化硝酸呼吸调节剂)响应性启动子是本领域已知的(参见例如,Castiglione等人,2009;Eiglmeier等人,1989;Galimand等人,1991;Hasegawa等人,1998;Hoeren等人,1993;Salmon等人,2003),并且非限制性实例在表1中示出。
在非限制性实例中,启动子(PfnrS)衍生自已知在低或无环境氧的条件下高度表达的大肠埃希氏菌尼斯勒延胡索酸和硝酸还原酶基因S(fnrS)(Durand和Storz,2010;Boysen等人,2010)。PfnrS启动子在厌氧条件下被在尼斯勒中天然存在的全局转录调节因子FNR激活。在厌氧条件下,FNR形成二聚体,并且在其控制下与特定基因启动子中的特定序列结合,从而激活它们的表达。然而,在有氧条件下,氧与FNR二聚体中的铁-硫簇发生反应,并且将它们转化为非活性形式。以这种方式,采用PfnrS诱导型启动子来调节蛋白质或RNA的表达。PfnrS在本申请中与FNRS、fnrs、FNR、P-FNRS启动子和其他表示启动子PfnrS的此类相关名称可互换使用。
表1.转录因子和响应性基因及调节区的实例
在一些实施方案中,外源环境条件存在或不存在活性氧物质(ROS)。在其他实施方案中,外源环境条件是活性氮物质(RNS)的存在或不存在。在一些实施方案中,外源环境条件是参与炎症反应的生物分子,例如,存在于肠道炎症性病症中的分子。在一些实施方案中,外源环境条件或信号在重组细菌细胞所在的环境中天然存在或天然不存在。在一些实施方案中,外源环境条件或信号是人工产生的,例如,通过产生或去除生物条件和/或施用或去除生物分子。
在一些实施方案中,外源环境条件和/或信号刺激诱导型启动子的活性。在一些实施方案中,用于激活诱导型启动子的外源环境条件和/或信号不是天然存在于哺乳动物的肠道中。在一些实施方案中,诱导型启动子被与本公开的药物组合物联合施用的分子或代谢物(例如四环素、阿拉伯糖或任何用于激活诱导型启动子的生物分子)刺激。在一些实施方案中,将外源环境条件和/或信号添加到包含本公开的重组细菌细胞的培养基中。在一些实施方案中,用于激活诱导型启动子的外源环境条件天然存在于哺乳动物的肠道内(例如,低氧或厌氧条件,或参与炎症反应的生物分子)。在一些实施方案中,暴露于外源环境条件(例如,体内)的丢失抑制诱导型启动子的活性,因为不存在外源环境条件来诱导启动子(例如,肠道外部的有氧环境)。“肠道”是指负责食物转移和消化、营养吸收和废物排泄的器官、腺体、肠道和系统。在人类中,肠道包括胃肠(GI)道,其开始于嘴并终止于肛门,并且另外还包括食道、胃、小肠和大肠。肠道还包括附属器官和腺体,诸如脾、肝、胆囊和胰腺。上胃肠道包括食道、胃和小肠的十二指肠。下胃肠道包括小肠的剩余部分(即空肠和回肠)以及大肠的全部(即盲肠、结肠、直肠和肛管)。可以在整个肠道(例如在胃肠道中,以及特别是在小肠中)中发现细菌。
“微生物”是指通常由单细胞组成的微观、亚微观或超微观大小的生物体或微生物。微生物的实例包括细菌、病毒、寄生虫、真菌、某些藻类和原生动物。在一些方面,微生物被工程化(“工程化微生物”)以产生一种或多种治疗分子,例如一种或多种草酸分解代谢酶。在某些实施方案中,工程化微生物是工程化细菌。在某些实施方案中,工程化微生物是工程化病毒。
“非致病性细菌”是指不能在宿主体内引起疾病或有害反应的细菌。在一些实施方案中,非致病性细菌是革兰氏阴性菌。在一些实施方案中,非致病性细菌是革兰氏阳性菌。在一些实施方案中,非致病性细菌不含有脂多糖(LPS)。在一些实施方案中,非致病性细菌是共生细菌。非致病性细菌的实例包括但不限于属于属芽施杆菌属、拟杆菌属、双歧杆菌属、短杆菌属、梭菌属、肠球菌属、大肠埃希氏菌、乳酸杆菌属、乳球菌属、酵母菌属和葡萄球菌属的某些菌株,例如凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、枯草芽孢杆菌、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、枯草拟杆菌(Bacteroides subtilis)、多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、婴儿双歧杆菌(Bfidobacterium infantis)、乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、丁酸梭菌(Clostridium butyricum)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、大肠埃希氏菌、大肠埃希氏菌尼斯勒、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、约翰逊乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、罗伊乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)和布拉尔酵母菌(Saccharomyces boulardii)(Sonnenborn等人,2009;Dinleyici等人,2014;美国专利号6,835,376;美国专利号6,203,797;美国专利号5,589,168;美国专利号7,731,976)。非致病性细菌还包括共生细菌,它们存在于肠道的固有微生物群中。在一个实施方案中,本公开还包括非致病性酵母菌属,诸如希拉尔酵母菌。天然致病性细菌可以进行遗传工程化来降低或消除致病性。
“益生菌”用于指可以赋予含有适当量微生物的宿主生物体健康益处的活的非致病性微生物,例如细菌。在一些实施方案中,宿主生物体是哺乳动物。在一些实施方案中,宿主生物体是人。在一些实施方案中,益生菌是革兰氏阴性菌。在一些实施方案中,益生菌是革兰氏阳性菌。非致病性细菌的一些物种、菌株和/或亚型目前被认为是益生菌。益生菌的实例包括但不限于属于属双歧杆菌属、大肠埃希氏菌、乳杆菌属和酵母菌属的某些菌株,例如两歧双歧杆菌、屎肠球菌、大肠埃希氏菌菌株尼斯勒、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、副干酪乳杆菌和植物乳杆菌、以及布拉尔酵母菌(Dinleyici等人,2014;美国专利号5,589,168;美国专利号6,203,797;美国专利号6,835,376)。益生菌可以是细菌的变体或突变菌株(Arthur等人,2012;Cuevas-Ramos等人,2010;Olier等人,2012;Nougayrede等人,2006)。可以对非致病性细菌进行遗传工程化以增强或改善所需的生物特性,例如生存能力。可以对非致病性细菌进行遗传工程化以提供益生菌特性。可以对益生菌进行遗传工程化以增强或改善益生菌特性。
如本文所用,术语“营养缺陷型”或“营养缺陷型的”是指需要特定因子(例如,氨基酸、糖或其他营养素)来支持其生长的生物体。“营养缺陷型修饰”是导致生物体在不存在生存或生长所必需的外源添加的营养素的情况下因为所述生物体不能产生所述营养素而死亡的一种遗传修饰。如本文所用,术语“必需基因”是指细胞生长和/或存活所必需的基因。必需基因在下文中有更详细的描述,并且包括但不限于DNA合成基因(诸如thyA)、细胞壁合成基因(诸如dapA)和氨基酸基因(诸如serA和metA)。
如本文所用,术语“调节”和“治疗”及其同源词是指疾病、病症和/或疾患或其至少一种可辨别症状的改善。在另一个实施方案中,“调节”和“治疗”是指至少一个可测量的物理参数(不一定可由患者辨别)的改善。在另一个实施方案中,“调节”和“治疗”是指在身体上(例如,可辨别症状的稳定)、在生理上(例如,物理参数的稳定)或两者抑制疾病、病症和/或疾患的进展。在另一个实施方案中,“调节”和“治疗”是指减缓疾病、病症和/或疾患的进展或逆转其进展。如本文所用,“预防”及其同源词是指延迟给定疾病、病症和/或疾患或与此类疾病、病症和/或疾患相关的症状的发病或降低获得给定疾病、病症和/或疾患或与此类疾病、病症和/或疾患相关的症状的风险。
需要治疗者可能包括已经患有某种特定医学疾病的个体,以及有患上疾病的风险或最终可能患上疾病的个体。例如,通过与发展疾病相关的一种或多种风险因素的存在、疾病的存在或进展、或患有疾病的受试者对治疗的可能接受性来评估治疗的需要。草酸盐有害的病症(例如高草酸尿症)可能是由先天性遗传突变引起的,目前尚无治愈方法。疾病也可以继发于其他疾患,例如肠道病症。治疗草酸盐有害的疾病(诸如原发性高草酸尿症或继发性高草酸尿症)可以涵盖降低草酸盐和/或草酸的正常水平,降低草酸盐和/或草酸的过量水平,或消除草酸盐和/或草酸,但不一定涵盖消除基础疾病。
如本文所用,术语“分解代谢”是指草酸盐的细胞摄取、和/或草酸盐降解成其相应的草酰辅酶A、和/或草酰辅酶A甲酸盐和二氧化碳的降解。在一个实施方案中,草酸盐的细胞摄取发生在肾脏中。在一个实施方案中,细胞摄取发生在肝脏中。在一个实施方案中,草酸盐的细胞摄取发生在肠道中。在一个实施方案中,草酸盐的细胞摄取发生在胃中。在一个实施方案中,细胞摄取由SLC26转运蛋白介导(参见Robijn等人(2011))。在一个实施方案中,细胞摄取由转运蛋白SLC26A1介导。在一个实施方案中,细胞摄取由转运蛋白SLC26A6介导。在一个实施方案中,草酸盐的细胞摄取由细胞旁转运系统介导。在一个实施方案中,草酸盐的细胞摄取由跨细胞转运系统介导。
在一个实施方案中,“异常分解代谢”是指草酸盐的细胞摄取的速率降低。在一个实施方案中,“异常分解代谢”是指导致每日尿草酸盐排泄超过每24小时40mg的任何疾患、病症、疾病、倾向和/或遗传突变。在一个实施方案中,“异常分解代谢”是指器官和/或系统处理和/或介导草酸盐细胞摄取的能力失能和/或降低。在一个实施方案中,所述器官和/或系统处理和/或介导草酸盐细胞摄取的能力失能或降低是由草酸盐的内源性产生增加引起的。在一个实施方案中,内源性草酸盐产生的增加是由过氧化物酶体肝酶AGT的缺乏或缺失引起的。在一个实施方案中,内源性草酸盐产生的增加是由酶GRHPR的缺乏或缺失引起的。在一个实施方案中,内源性草酸盐产生的增加是由酶4-羟基-2-酮戊二酸醛缩酶的缺乏或缺失引起的。在一个实施方案中,所述器官和/或系统处理和/或介导草酸盐细胞摄取的能力失能或降低是由草酸盐吸收增加引起的。在一个实施方案中,所述草酸盐吸收的增加是由草酸盐的饮食摄入增加引起的。在一个实施方案中,所述草酸盐吸收的增加是由草酸盐的肠吸收增加引起的。在一个实施方案中,所述草酸盐吸收的增加是由草酸盐前体的过量摄入引起的。在一个实施方案中,所述草酸盐吸收的增加是由肠草酸盐降解微生物的减少引起的。在一个实施方案中,所述草酸盐吸收的增加是由肠草酸盐转运蛋白的遗传变异引起的。
在一个实施方案中,“其中草酸盐有害的病症”是涉及草酸盐和/或草酸或直接位于上游的分子(诸如乙醛酸盐)的水平异常(例如增加)的疾病或病症。在一个实施方案中,其中草酸盐有害的病症是在受试者中观察到高草酸尿症的病症或疾病。在一个实施方案中,其中草酸盐有害的病症是指导致每日尿草酸盐排泄超过每24小时40mg的任何疾患、病症、疾病、倾向和/或遗传突变。在一个实施方案中,其中草酸盐有害的病症是选自由以下组成的组的病症或疾病:PHI、PHII、PHII、继发性高草酸尿症、肠高草酸尿症、细菌过度生长综合征、克罗恩病、炎性肠病、肾移植后高草酸尿症、因肥胖进行空肠回肠旁路术后的高草酸尿症、胃溃疡手术后的高草酸尿症、慢性肠系膜缺血、胃旁路术、囊性纤维化、短肠综合征、胆/胰腺疾病(例如慢性胰腺炎)。
如本文所用,“药物组合物”是指本公开的遗传工程化微生物(例如遗传工程化细菌或病毒)以及其他组分(诸如生理学上合适的载体和/或赋形剂)的制剂。在一个实施方案中,药物组合物是冷冻液体组合物。在另一个实施方案中,药物组合物是冻干组合物。
可以互换使用的短语“生理学上可接受的载体”和“药学上可接受的载体”是指不会对生物体造成显著刺激并且不会消除所施用的细菌或病毒化合物的生物活性和特性的载体或稀释剂。佐剂包括在这些短语中。
术语“赋形剂”是指添加到药物组合物中以进一步促进活性成分施用的惰性物质。实例包括但不限于碳酸氢钙、碳酸氢钠、磷酸钙、各种糖和各种类型的淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油、聚乙二醇和表面活性剂(包括例如聚山梨醇酯20)。
术语“治疗有效剂量”和“治疗有效量”用于指导致预防、延迟疾患(例如草酸盐有害的病症)的症状发作或改善其症状的化合物的量。治疗有效量可以例如足以治疗、预防、降低与超过每24小时40mg的每日尿草酸盐排泄相关的疾病或疾患的一种或多种症状的严重性、延迟其发作和/或降低其发生的风险。治疗有效量以及治疗有效的施用频率可以通过本领域已知的方法来确定,并且在下面进行论述。
如本文所用,术语“抑菌的”或“抑制细胞生长的”是指能够阻止、延缓或抑制本公开的重组细菌细胞的生长、分裂、增殖或复制的分子或蛋白质。
如本文所用,术语“杀菌的”是指能够杀灭本公开的重组细菌细胞的分子或蛋白质。
如本文所用,术语“毒素”是指能够阻止、延缓或抑制本公开的重组细菌细胞的生长、分裂、增殖或复制或能够杀灭本公开的重组细菌细胞的蛋白质、酶或其多肽片段或其他分子。术语“毒素”旨在包括抑菌蛋白和杀菌蛋白。术语“毒素”旨在包括但不限于溶解蛋白、细菌素(例如微菌素和大肠埃希氏菌素)、促旋酶抑制剂、聚合酶抑制剂、转录抑制剂、翻译抑制剂、DNA酶和RNA酶。如本文所用的术语“抗-毒素”或“抗毒素”是指能够抑制毒素活性的蛋白质或酶。术语抗-毒素旨在包括但不限于免疫调节剂和毒素表达抑制剂。毒素和抗毒素的实例是本领域已知的,并且在下文中有更详细的描述。
如本文所用,术语“草酸分解代谢(catabolic或catabolism)酶”或“草酸分解代谢酶”或“草酸代谢酶”是指任何能够代谢草酸盐或能够减少草酸盐积聚或能够减轻、改善或预防一种或多种草酸盐有害的疾病或疾病症状的酶。草酸酶的实例包括但不限于甲酰辅酶A:草酸辅酶A转移酶(也称为甲酰辅酶A转移酶)(例如来自产甲酸草酸杆菌的Frc)、草酰辅酶A合成酶(也称为草酸辅酶A连接酶)(例如来自酿酒酵母的酿酒酵母酰基活化酶3(ScAAE3))、草酰辅酶A脱羧酶(例如来自产甲酸草酸杆菌的Oxc(本文也称为oxdC或草酸盐脱羧酶))、乙酰辅酶A:草酸辅酶A转移酶(ACOCT)(例如,来自大肠埃希氏菌的YfdE)和任何分解代谢草酸、草酰辅酶A或其任何其他代谢物的其他酶。分解代谢酶还包括丙氨酸乙醛酸转氨酶(AGT,由AGXT基因编码,例如人形式)、乙醛酸/羟基丙酮酸还原酶(GRHPR;具有乙醛酸还原酶(GR)、羟基丙酮酸还原酶(HPR)和D-甘油酸脱氢酶(DGDH)活性的酶,例如人形式)、以及4-羟基2-酮戊二酸醛缩酶(由HOGA1基因编码,例如在人中,并且其将4-羟基2-酮戊二酸分解为丙酮酸和乙醛酸)。这些蛋白质的功能缺陷导致草酸盐或其相应的α-酮酸在细胞和组织中积聚。本公开的草酸分解代谢酶包括野生型或经修饰的草酸代谢酶两者,并且可以使用重组和合成方法产生或从天然来源纯化。草酸代谢酶包括全长多肽及其功能片段、以及其同系物和变体。草酸代谢酶包括已经由野生型序列修饰的多肽,包括例如具有一个或多个氨基酸缺失、插入和/或取代的多肽,并且可以包括例如融合多肽和具有额外序列的多肽,所述额外序列例如调节肽序列、接头肽序列和其他肽序列。
如本文所用,术语“常规高草酸尿症治疗”或“常规高草酸尿症疗法”是指目前被接受、被认为是当前护理标准和/或被大多数健康护理专业人员用于治疗草酸盐有害的疾病或病症的治疗或疗法。其不同于未被广泛使用的替代疗法或补充疗法。
如本文所用,术语“多肽”包括“一种多肽”以及“多种多肽”,并且是指由通过酰胺键(即肽键)线性连接的氨基酸单体构成的分子。术语“多肽”是指两个或更多个氨基酸的任何一条或多条链,而不是指产物的特定长度。因此,“肽”、“二肽”、“三肽”、“寡肽”、“蛋白质”、“氨基酸链”或用于指两个或更多个氨基酸的一条链或多条链的任何其他术语都包括在“多肽”的定义中,并且术语“多肽”可以代替这些术语中的任何一个使用,或者与这些术语中的任何一个互换使用。术语“多肽”也旨在指多肽的表达后修饰的产物,所述表达后修饰包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、衍生化、蛋白水解切割或通过非天然存在氨基酸的修饰。多肽可以来源于天然生物来源或通过重组技术产生。在其他实施方案中,多肽由本发明的遗传工程化细菌或病毒产生。本发明的多肽可以具有约3个或更多个、5个或更多个、10个或更多个、20个或更多个、25个或更多个、50个或更多个、75个或更多个、100个或更多个、200个或更多个、500个或更多个、1,000个或更多个、或2,000个或更多个氨基酸的大小。多肽可以具有确定的三维结构,尽管它们不一定具有这种结构。具有确定的三维结构的多肽被称为折叠的,并且不具有确定的三维结构而是可以采用大量不同构象的多肽被称为未折叠的。术语“肽”或“多肽”可以指与蛋白质或蛋白质的一部分对应的氨基酸序列,或者可以指与非蛋白质序列对应的氨基酸序列,例如选自调节肽序列、前导肽序列、信号肽序列、接头肽序列和其他肽序列的序列。
“分离的”多肽或其片段、变体或衍生物是指不在其天然环境中的多肽。不需要特定的纯化水平。为了本发明的目的而分离的在宿主细胞(包括但不限于细菌或哺乳动物细胞)中表达的重组产生的多肽和蛋白质被认为是已通过任何合适的技术被分离、分馏或部分或基本上被纯化的天然或重组多肽。重组肽、多肽或蛋白质是指通过重组DNA技术产生的肽、多肽或蛋白质,即从被编码多肽的外源重组DNA表达构建体转化的细胞、微生物或哺乳动物产生的肽、多肽或蛋白质。在大多数细菌培养物中表达的蛋白质或肽将通常不含聚糖。前述多肽的片段、衍生物、类似物或变体及其任何组合也包括在多肽内。术语“片段”、“变体”、“衍生物”和“类似物”包括具有与原始肽的氨基酸序列足够相似的氨基酸序列的多肽,并且包括保留相应原始多肽的至少一种或多种特性的任何多肽。本发明多肽的片段包括蛋白水解片段、以及缺失片段。片段还包括来源于本文所述的任何多肽的特异性抗体或生物活性片段或免疫活性片段。变体可以是天然存在的或非天然存在的。使用本领域已知的诱变方法可以产生非天然存在的变体。变体多肽可以包含保守或非保守的氨基酸取代、缺失或添加。
多肽还包括融合蛋白。如本文所用,术语“变体”包括融合蛋白,其包含原始肽的序列或与原始肽足够相似的序列。如本文所用,术语“融合蛋白”是指包含两种或更多种不同蛋白质的氨基酸序列的嵌合蛋白。通常,融合蛋白产生自熟知的体外重组技术。融合蛋白可以具有与作为融合蛋白组分的单个原始蛋白相似的结构功能(但不一定达到相同的程度)、和/或相似的调节功能(但不一定达到相同的程度)、和/或相似的生物化学功能(但不一定达到相同的程度)和/或免疫活性(但不一定达到相同的程度)。“衍生物”包括但不限于肽,其含有二十种标准氨基酸的一种或多种天然存在的氨基酸衍生物。通过比较一个肽的氨基酸序列和另一个肽的序列来确定两个肽之间的“相似性”。如果其是相同的或保守的氨基酸取代,则一个肽的氨基酸与第二个肽的相应氨基酸相似。保守取代包括在Dayhoff,M.O.编辑,The Atlas ofProtein Sequence and Structure 5,National Biomedical ResearchFoundation,Washington,D.C.(1978)以及Argos,EMBO J.8(1989),779-785中所述的那些。例如,属于以下组之一的氨基酸代表保守改变或取代:-Ala、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Thr;-Cys、Ser、Tyr、Thr;-Val、Ile、Leu、Met、Ala、Phe;-Lys、Arg、His;-Phe、Tyr、Trp、His;和-Asp、Glu。
如本文所用,术语“足够相似”意指第一氨基酸序列相对于第二氨基酸序列含有足够或最小数量的相同或等同的氨基酸残基,使得所述第一氨基酸序列和所述第二氨基酸序列具有共同的结构性结构域和/或共同的功能活性。例如,包含为45%、至少约50%、至少约55%、至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约91%、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%或至少约100%相同的共同结构性结构域的氨基酸序列在本文中被定义为足够相似。优选地,变体将与本发明的肽的氨基酸序列足够相似。此类变体通常保留了本发明肽的功能活性。变体包括分别通过一个或多个氨基酸缺失、添加和/或取代而与天然和野生型肽在氨基酸序列上不同的肽。这些可能是天然存在的变体,也可能是人工设计的变体。
如本文所用,术语“接头”、“接头肽”或“肽接头”或“接头”是指联结或连接两个多肽序列(例如,连接两个多肽结构域)的合成的或非天然的或非天然存在的氨基酸序列。如本文所用,术语“合成的”是指不是天然存在的氨基酸序列。本文描述了示例性的接头。US20140079701中提供了附加的示例性接头,所述文献的内容以引用的方式整体并入本文。
如本文所用,术语“密码子优化的”是指修改在核酸分子的基因或编码区中密码子以反映宿主生物体的典型密码子使用,而不改变由核酸分子编码的多肽。这种优化包括用一个或多个在宿主生物体的基因中更频繁地使用的密码子替换至少一个、多于一个或大量的密码子。“密码子优化的序列”是指由现有的编码序列修改而成或者被设计成例如改善由编码序列转录的转录物RNA分子在表达宿主细胞或生物体中的翻译或改善编码序列的转录的一种序列。密码子优化包括但不限于包括为编码序列选择密码子以适合表达宿主生物体的密码子偏爱的过程。许多生物体表现出对使用特定密码子来编码以将特定氨基酸插入生长多肽链中的偏好或偏爱。密码子偏爱或密码子偏好(即生物体之间密码子使用的差异)是遗传密码简并性所允许的,并且在许多生物体中被很好地证明。密码子偏好通常与信使RNA(mRNA)的翻译效率相关,而翻译效率又被认为取决于被翻译的密码子的特性和特定转移RNA(tRNA)分子的可用性等。细胞中所选tRNA的优势通常反映了肽合成中最常使用的密码子。因此,可以基于密码子优化针对给定生物体中的最佳基因表达来定制基因。
如本文所用的冠词“一个/一种”应被理解为意指“至少一个/至少一种”,除非有明确相反的指示。
短语“和/或”在列表中的要素之间使用时,旨在表示(1)仅存在单个列出的要素,或者(2)存在列表中的多于一个要素。例如,“A、B和/或C”表示选择可以是单独的A;单独的B;单独的C;A和B;A和C;B和C;或者A、B和C。短语“和/或”可以与列表中的“至少一个”或“一个或多个”要素互换使用。
本文提供的范围被理解为所述范围内所有值的速写。例如,1至50的范围被理解为包括选自由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50组成的组的任何数字、数字组合或子范围。
细菌
遗传工程化微生物或编程的微生物(诸如本公开的遗传工程化细菌)能够产生一种或多种用于代谢草酸盐和/或其代谢物的酶。在一些方面,本公开提供了细菌细胞,所述细菌细胞包含编码导致草酸盐水平降低的草酸分解代谢酶或其他蛋白质的一个或多个异源基因序列。
在某些实施方案中,遗传工程化细菌是专性厌氧细菌。在某些实施方案中,遗传工程化细菌是兼性厌氧细菌。在某些实施方案中,遗传工程化细菌是需氧细菌。在一些实施方案中,遗传工程化细菌是革兰氏阳性菌。在一些实施方案中,遗传工程化细菌是革兰氏阳性菌并且缺乏LPS。在一些实施方案中,遗传工程化细菌是革兰氏阴性菌。在一些实施方案中,遗传工程化细菌是革兰氏阳性菌和专性厌氧细菌。在一些实施方案中,遗传工程化细菌是革兰氏阳性菌和兼性厌氧细菌。在一些实施方案中,遗传工程化细菌是非致病性细菌。在一些实施方案中,遗传工程化细菌是共生细菌。在一些实施方案中,遗传工程化细菌是益生菌。在一些实施方案中,遗传工程化细菌是被修饰或突变以降低或消除致病性的天然致病性细菌。示例性细菌包括但不限于芽孢杆菌属、拟杆菌属、双歧杆菌属、短杆菌属、柄杆菌属、梭菌属、肠球菌属、大肠埃希氏菌、乳杆菌属、乳球菌属、李斯特菌属、分枝杆菌属、酵母菌属、沙门氏菌属、葡萄球菌属、链球菌属、弧菌属、凝结芽孢杆菌属、枯草芽孢杆菌、脆弱拟杆菌、枯草拟杆菌、多形拟杆菌、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、两歧双歧杆菌、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)UCC2003、婴儿双歧杆菌、乳双歧杆菌、长双歧杆菌、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、丁酸梭菌、丁酸梭菌M-55、匙形梭菌(Clostridium cochlearum)、费新尼亚梭菌(Clostridium felsineum)、溶组织梭菌(Clostridium histolyticum)、多酶梭菌(Clostridium multifermentans)、诺维梭菌(Clostridium novyi)-NT、副腐化梭菌(Clostridium paraputrificum)、巴斯德梭菌(Clostridium pasteureanum)、蚀果胶梭菌(Clostridium pectinovorum)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfrringens)、致瑰色梭菌(Clostridium roseum)、产孢梭菌(Clostridium sporogenes)、第三梭菌(Clostridium tertium)、破伤风梭菌(Clostridiumtetani)、酪丁酸梭菌(Clostridium tyrobutyricum)、短小棒状杆菌(Corynebacteriumparvum)、大肠埃希氏菌MG 1655、大肠埃希氏菌尼斯勒1917、单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)、牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、猪霍乱沙门氏菌(Salmonella choleraesuis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)和霍乱弧菌(Vibrio cholera)。在某些实施方案中,遗传工程化细菌选自由以下组成的组:屎肠球菌、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌、约翰逊乳杆菌、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、乳酸乳球菌和产甲酸草酸杆菌细菌细胞。希拉尔酵母菌。在某些实施方案中,遗传工程化细菌选自脆弱拟杆菌、多形拟杆菌、枯草拟杆菌、两歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、乳双歧杆菌、丁酸梭菌、大肠埃希氏菌、大肠埃希氏菌尼斯勒、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊乳杆菌和乳酸乳球菌细菌细胞。在一个实施方案中,细菌细胞是脆弱拟杆菌细菌细胞。在一个实施方案中,细菌细胞是多形拟杆菌细菌细胞。在一个实施方案中,细菌细胞是枯草拟杆菌细菌细胞。在一个实施方案中,细菌细胞是两歧双歧杆菌细菌细胞。在一个实施方案中,细菌细胞是婴儿双歧杆菌细菌细胞。在一个实施方案中,细菌细胞是乳双岐杆菌或婴儿双歧杆菌细菌细胞。在一个实施方案中,细菌细胞是丁酸梭菌(Clostridium butyricum)细菌细胞。在一个实施方案中,细菌细胞是大肠埃希氏菌细菌细胞。在一个实施方案中,细菌细胞是嗜酸乳杆菌细菌细胞。在一个实施方案中,细菌细胞是植物乳杆菌细菌细胞。在一个实施方案中,细菌细胞是乳双歧杆菌细菌细胞。在一个实施方案中,细菌细胞是丁酸梭菌细菌细胞。在一个实施方案中,细菌细胞是大肠埃希氏菌细菌细胞。在一个实施方案中,细菌细胞是嗜酸乳杆菌细菌细胞。在一个实施方案中,细菌细胞是植物乳杆菌细菌细胞。在一个实施方案中,细菌细胞是罗伊乳杆菌细菌细胞。在一个实施方案中,细菌细胞是乳酸乳球菌细菌细胞。在一个实施方案中,细菌细胞是产甲酸草酸杆菌细菌细胞。在另一个实施方案中,细菌细胞不包括产甲酸草酸杆菌。
在一些实施方案中,遗传工程化细菌是大肠埃希氏菌菌株尼斯勒1917(大肠埃希氏菌尼斯勒),其是已进化成最佳表征的益生菌之一的肠杆菌科革兰氏阴性菌(Ukena等人,2007)。所述菌株的特点在于其完全无害(Schultz,2008),并且具有GRAS(通常被认为是安全的)状态(Reister等人,2014,重点部分已标明)。基因组测序证实,大肠埃希氏菌尼斯勒缺乏显著的毒力因子(例如,大肠埃希氏菌α溶血素、P菌毛粘附素)(Schultz,2008)。此外,已经表明,大肠埃希氏菌尼斯勒不携带致病性粘附因子,不产生任何肠毒素或细胞毒素,不具有侵袭性并且不具有尿路致病性(Sonnenbom等人,2009)。早在1917年,大肠埃希氏菌尼斯勒被包装成药用胶囊(称为Mutaflor),用于治疗用途。从那以后大肠埃希氏菌尼斯勒已经被用于体内治疗人的溃疡性结肠炎(Rembacken等人,1999),以体内治疗人的炎性肠病、克罗恩病和隐窝炎(Schultz,2008),并且在体外抑制肠侵袭性沙门氏菌、军团菌(Legionella)、耶尔森氏菌(Yersinia)和志贺氏菌(Shigella)(Altenhoefer等人,2004)。普遍认为,大肠埃希氏菌尼斯勒的治疗功效和安全性已得到令人信服的证明(Ukena等人,2007)。
在一个实施方案中,本发明的重组细菌细胞不在患有草酸盐有害的病症的受试者体内建群。
本领域普通技术人员将会理解,本文所公开的遗传修饰可以适用于细菌的其他物种、菌株和亚型。此外,来自一种或多种不同物种的基因可以彼此相互引入,例如,来自乳酸乳球菌的草酸分解代谢基因可以在大肠埃希氏菌中表达。未修饰的大肠埃希氏菌尼斯勒和本发明的遗传工程化细菌可以被例如肠道或血清中的防御因子破坏(Sonnenborn等人,2009)。在一些实施方案中,为人类受试者计算停留时间。在一些实施方案中,为本文所公开的遗传工程化细菌计算在体内的停留时间。
在一些实施方案中,细菌细胞是遗传工程化细菌细胞。在另一个实施方案中,细菌细胞是重组细菌细胞。在一些实施方案中,本公开包含本文所公开的细菌细胞的菌落。
在另一个方面,本公开提供了包含本文所公开的细菌细胞的重组细菌培养物。在一个方面,本公开提供了降低培养物培养基中的草酸盐或草酸的水平的重组细菌培养物。在一个实施方案中,例如在诱导条件下在一段时间(例如,1小时)后细胞培养物的培养基中的草酸盐或草酸的水平降低约50%、约75%或约100%。在另一个实施方案中,例如在诱导条件下在一段时间(例如,1小时)后细胞培养物的培养基中的草酸盐或草酸的水平降低约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。在一个实施方案中,在细胞培养物的培养基中草酸盐或草酸的水平降低到检测极限以下。
在上述遗传工程化细菌的一些实施方案中,编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒存在于细菌中的质粒上。在上述遗传工程化细菌的一些实施方案中,编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒存在于细菌中的质粒上,并且在质粒上可操作地连接到在低氧或厌氧条件下诱导的启动子(诸如本文公开的任何启动子)上。在其他实施方案中,编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒存在于细菌染色体中。在其他实施方案中,编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒存在于细菌染色体中,并且在染色体中可操作地连接到在低氧或厌氧条件下诱导的启动子(诸如本文公开的任何启动子)上。在上述遗传工程化细菌的一些实施方案中,编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒存在于细菌中的质粒上,并且在质粒上可操作地连接到在炎症条件下诱导的启动子(诸如本文公开的任何启动子)上。在其他实施方案中,编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒存在于细菌染色体中,并且在染色体中可操作地连接到在炎症条件下诱导的启动子(诸如本文公开的任何启动子)上。
在一些实施方案中,包含编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒的遗传工程化细菌还包含编码草酸盐转运蛋白的基因序列。在一些实施方案中,包含编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒的遗传工程化细菌还包含编码甲酸盐输出蛋白的基因序列。在一些实施方案中,包含编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒的遗传工程化细菌还包含编码草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白的基因序列。在一些实施方案中,包含编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒的遗传工程化细菌还包含编码以下物质中的一种或多种的基因序列:草酸盐转运蛋白、甲酸盐输出蛋白和/或草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白。
在一些实施方案中,包含编码一种或多种草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白和/或甲酸盐输出蛋白和/或草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白的基因和/或基因盒的遗传工程化细菌是营养缺陷型。在一个实施方案中,遗传工程化细菌是选自cysE、glnA、ilvD、leuB、lysA、serA、metA、glyA、hisB、ilvA、pheA、proA、thrC、trpC、tyrA、thyA、uraA、dapA、dapB、dapD、dapE、dapF、flhD、metB、metC、proAB和thi1营养缺陷型的营养缺陷型。在一些实施方案中,工程化细菌具有多于一种营养缺陷型,例如它们可以是ΔthyA和ΔdapA营养缺陷型。
在一些实施方案中,包含编码一种或多种草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白和/或甲酸盐输出蛋白和/或草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白的基因和/或基因盒的遗传工程化细菌还包含编码用于分泌生物分子的分泌蛋白或蛋白质复合物(诸如本文公开的任何分泌系统)的基因序列。
在一些实施方案中,包含编码一种或多种草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白和/或甲酸盐输出蛋白和/或草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白的基因和/或基因盒的遗传工程化细菌还包含编码一种或多种抗生素基因(诸如本文公开的任何抗生素基因)的基因序列。
在一些实施方案中,包含编码一种或多种草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白和/或甲酸盐输出蛋白和/或草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白的基因和/或基因盒的遗传工程化细菌还包含杀灭开关回路(诸如本文提供的任何杀灭开关回路)。例如,在一些实施方案中,遗传工程化细菌还包含编码在诱导型启动子控制下的一种或多种重组酶的一个或多个基因、以及反向毒素序列。在一些实施方案中,遗传工程化细菌还包含编码抗毒素的一个或多个基因。在一些实施方案中,工程化细菌还包含在诱导型启动子的控制下的编码一种或多种重组酶的一个或多个基因和一个或多个反向切除基因,其中所述切除基因编码缺失必需基因的酶。在一些实施方案中,遗传工程化细菌还包含编码抗毒素的一个或多个基因。在一些实施方案中,工程化细菌还包含在具有TetR阻遏物结合位点的启动子的控制下的一种或多种编码毒素的基因,以及在由阿拉伯糖诱导的诱导型启动子诸如ParaBAD的控制下的编码TetR的基因。在一些实施方案中,遗传工程化细菌还包含编码抗毒素的一个或多个基因。
在一些实施方案中,遗传工程化细菌是包含编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒的营养缺陷型,并且还包含杀灭开关回路,诸如本文所述的任何杀灭开关回路。
在上述遗传工程化细菌的一些实施方案中,编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒存在于细菌中的质粒上。在一些实施方案中,编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒存在于细菌染色体中。在一些实施方案中,遗传工程化细菌包含编码将草酸盐转运到细菌细胞中的一种或多种草酸盐转运蛋白的一种或多种基因和/或基因盒。在一些实施方案中,编码草酸盐转运蛋白的基因序列存在于细菌中的质粒上。在一些实施方案中,编码草酸盐转运蛋白的基因序列存在于细菌染色体中。在一些实施方案中,编码用于分泌生物分子的分泌蛋白或蛋白质复合物(诸如本文公开的任何分泌系统)的基因序列存在于细菌中的质粒上。在一些实施方案中,编码用于分泌生物分子的分泌蛋白或蛋白质复合物(诸如本文公开的任何分泌系统)的基因序列存在于细菌染色体中。在一些实施方案中,编码抗生素抗性基因的基因序列存在于细菌中的质粒上。在一些实施方案中,编码抗生素抗性基因的基因序列存在于细菌染色体中。
草酸分解代谢酶
产甲酸草酸杆菌是第一个在人类中被描述的降解草酸盐的专性厌氧菌,并且已经用作研究厌氧草酸盐降解的模式生物体。产甲酸草酸杆菌有三种参与草酸的分解代谢的酶。首先细胞外的草酸盐通过由oxlT基因编码的膜缔合的草酸盐-甲酸盐反向转运蛋白OxlT被吸收。frc基因编码甲酰辅酶A转移酶Frc,其激活细胞内草酸盐形成草酰辅酶A。这在硫胺素PPi依赖性反应中被由oxc基因表达的草酰辅酶A脱羧酶Oxc酶脱羧。甲酸盐和二氧化碳是最终产物,并且草酸盐-甲酸盐反向转运蛋白OxlT催化细胞内甲酸盐向细胞外的输出。在产甲酸草酸杆菌中,能量的产生与草酸盐转运偶联,草酸盐转运由草酸盐转运膜蛋白OxlT介导(如在Abratt和Reid的(Oxalate-Degrading Bacteria of the Human Gut asProbiotics in the Management of Kidney Stone Disease)中所述,其内容以及其中的参考文献以引用的方式整体并入本文)。
如本文所用,术语“草酸分解代谢酶”是指参与草酸盐分解代谢成其相应的草酰辅酶A分子、草酰辅酶A分解代谢成甲酸盐和二氧化碳或草酸盐分解代谢成另一种代谢物的酶。参与草酸盐的分解代谢的酶是本领域技术人员熟知的。例如,在专性厌氧菌产甲酸草酸杆菌中,甲酰辅酶A转移酶FRC(由frc基因编码)将辅酶A部分转移到草酸上,形成草酰辅酶A(参见例如,Sidhu等人,J.Bacteriol.179:3378-81(1997),其全部内容以引用的方式整体明确并入本文)。随后,草酰辅酶A经历由草酰辅酶A脱羧酶OXC(由oxc基因编码)介导的反应,这导致甲酸盐和二氧化碳的形成(参见例如,Lung等人,J.Bacteriol.176:2468-72(1994),其全部内容以引用的方式整体明确并入本文)。此外,大肠埃希氏菌蛋白质YfdW(蛋白质数据库登录号lpt5)和YfdU(蛋白质数据库登录号E0SNC8)是甲酰辅酶A转移酶和草酰辅酶A脱羧酶,它们已被证明是产甲酸草酸杆菌FRC和OXC酶的功能同系物(参见例如,Toyota等人,J.Bact.190:2256-64(2008);Werther等人,FEBS J.277:2628-40(2010);Fontenot等人,J.Bact.195:1446-55(2013))。
另一种草酸分解代谢酶乙酰辅酶A:草酸辅酶A转移酶将乙酰辅酶A和草酸盐转化为草酰辅酶A和乙酸盐。在非限制性实例中,乙酰辅酶A:草酸辅酶A转移酶是来自大肠埃希氏菌的YfdE(例如,描述于Function and X-ray crystal structure of Escherichiacoli YfdE;PLoS One.2013年7月23日;8(7):e67901)。乙酰辅酶A底物是细菌(诸如大肠埃希氏菌)中非常普遍的代谢物,并且所产生的乙酸盐可以例如扩散到细胞外空间,而不需要转运蛋白。在一个实例中,乙酰辅酶A:草酸辅酶A转移酶反应之后可以是草酰辅酶A脱羧酶OXC(由oxc基因编码),这导致甲酸盐和二氧化碳的形成。甲酸盐可以例如通过甲酸盐输出蛋白(包括但不限于来自产甲酸草酸杆菌的OxlT)离开细胞。
另一种示例性的草酸分解代谢酶草酰辅酶A合成酶(OCL;也称为草酸辅酶A连接酶),其将草酸和辅酶A和ATP转化为草酰辅酶A和AMP以及二磷酸。在非限制性实例中,草酸辅酶A连接酶是酿酒酵母酰基活化酶3(ScAAE3)(例如,描述于Foster和Nakata,An oxalyl-CoA synthetase is important for oxalate metabolismin Saccharomycescerevisiae.FEBS Lett.2014年1月3日;588(1):160-6)。在一个实例中,草酸辅酶A连接酶之后可以是草酰辅酶A脱羧酶OXC(由oxc基因编码),这导致甲酸盐和二氧化碳的形成。甲酸盐可以例如通过甲酸盐输出蛋白(包括但不限于来自产甲酸草酸杆菌的OxlT)离开细胞。
在一些实施方案中,本公开的遗传工程化细菌包含编码至少一种草酸分解代谢酶的一个或多个基因和/或基因盒。在一些实施方案中,工程化细菌包含编码至少一种草酸分解代谢酶的一个或多个基因和/或基因盒,并且能够将草酸盐转化为草酰辅酶A。在一些实施方案中,工程化细菌包含编码至少一种草酸分解代谢酶的一个或多个基因和/或基因盒,并且能够将草酰辅酶A转化为甲酸盐和二氧化碳。在一些实施方案中,工程化细菌包含编码至少一种草酸分解代谢酶的一个或多个基因和/或基因盒,并且能够将草酸盐转化为草酰辅酶A,并将草酰辅酶A转化为甲酸盐和二氧化碳。在一些实施方案中,本公开的工程化细菌包含编码将草酸盐和甲酰辅酶A转化为草酰辅酶A和甲酸盐的一种或多种草酸分解代谢酶的一个或多个基因和/或基因盒。在一些实施方案中,本公开的工程化细菌包含编码将草酸盐和乙酰辅酶A转化为草酰辅酶A和乙酸盐的一种或多种草酸分解代谢酶的一个或多个基因和/或基因盒。在一些实施方案中,本公开的工程化细菌包含编码一种或多种草酸分解代谢酶的一个或多个基因和/或基因盒,所述草酸分解代谢酶将草酸盐和辅酶A转化为草酰辅酶A(例如,通过将一个ATP转化为AMP加二磷酸)。在一些实施方案中,本公开的工程化细菌包含编码一种或多种草酸分解代谢酶的一个或多个基因和/或基因盒,所述草酸分解代谢酶将草酰辅酶A转化为二氧化碳和甲酰辅酶A。在一些实施方案中,工程化细菌由于草酸盐分解代谢而产生甲酸盐。在一些实施方案中,工程化细菌由于草酸盐分解代谢而产生甲酸盐和二氧化碳。在一些实施方案中,工程化细菌由于草酸盐分解代谢而产生乙酸。在一些实施方案中,工程化细菌由于草酸盐分解代谢而产生乙酸盐和二氧化碳。在一些实施方案中,工程化细菌由于草酸盐分解代谢而产生甲酸盐、乙酸盐和二氧化碳。
在一些实施方案中,遗传工程化细菌包含编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列。在一些实施方案中,所述一种或多种草酸分解代谢酶增加细胞中草酸盐和/或草酰辅酶A分解代谢的速率。在一些实施方案中,所述一种或多种草酸分解代谢酶降低细胞中草酸盐的水平。在一些实施方案中,所述一种或多种草酸分解代谢酶降低细胞中草酰辅酶A的水平。在一些实施方案中,所述一种或多种草酸分解代谢酶降低细胞中草酸的水平。
在一些实施方案中,与细胞中其相应的草酸盐水平相比,所述一种或多种草酸分解代谢酶增加了细胞中草酰辅酶A的水平。在一些实施方案中,与细胞中其相应的草酰辅酶A的水平相比,所述一种或多种草酸分解代谢酶增加了细胞中甲酸盐和二氧化碳的水平。在一些实施方案中,与细胞中草酸盐的水平相比,所述一种或多种草酸分解代谢酶降低了草酸盐和/或草酰辅酶A的水平。
参与草酸盐的分解代谢的酶可以在本发明的细菌中表达或修饰,以增强草酸盐的分解代谢。具体而言,与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比,当至少一种草酸分解代谢酶在本发明的工程化细菌细胞中表达时,当分解代谢酶表达时,工程化细菌细胞将更多的草酸盐转化为草酰辅酶A,或者将更多的草酰辅酶A转化为甲酸盐和二氧化碳。因此,包含编码草酸分解代谢酶的异源基因的遗传工程化细菌可以分解代谢草酸盐和/或草酰辅酶A以治疗草酸盐有害的病症,诸如PHI、PHII、PHIII以及继发性高草酸尿症、肠高草酸尿症和特发性高草酸尿症。
在一个实施方案中,本发明的细菌细胞包含编码至少一种草酸分解代谢酶的至少一个异源基因。在一个实施方案中,本发明的细菌细胞包含编码草酸盐输入蛋白的至少一个异源基因和个编码至少一种草酸分解代谢酶的至少一异源基因。在一个实施方案中,本发明的细菌细胞包含编码甲酸盐输出蛋白的至少一个异源基因和编码至少一种草酸分解代谢酶的至少一个异源基因。在一个实施方案中,本发明的细菌细胞包含编码草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白的至少一个异源基因和编码至少一种草酸分解代谢酶的至少一个异源基因。
在一些实施方案中,本发明提供了细菌细胞,其包含与第一启动子可操作地连接的编码至少一种草酸分解代谢酶的至少一个异源基因。在一个实施方案中,细菌细胞包含编码来自不同生物体(例如不同的细菌物种)的至少一种草酸分解代谢酶的至少一个基因。在另一个实施方案中,细菌细胞包含多于一个拷贝的编码草酸分解代谢酶的天然基因。在又另一个实施方案中,细菌细胞包含编码至少一种草酸分解代谢酶的至少一个天然基因,以及至少一个拷贝的编码来自不同生物体(例如不同细菌物种)的草酸分解代谢酶的至少一个基因。在一个实施方案中,细菌细胞包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个拷贝的编码草酸分解代谢酶的基因。在一个实施方案中,细菌细胞包含多个拷贝的编码草酸分解代谢酶的基因。
草酸分解代谢酶是本领域已知的。在一些实施方案中,草酸分解代谢酶由至少一个基因编码,所述至少一个基因编码来源于细菌物种的至少一种草酸分解代谢酶。在一些实施方案中,草酸分解代谢酶由编码来源于非细菌物种的草酸分解代谢酶的基因编码。在一些实施方案中,草酸分解代谢酶由来源于真核物种(例如酵母物种或植物物种)的基因编码。在一个实施方案中,草酸分解代谢酶由来源于人类的基因编码。在一个实施方案中,编码所述一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列来源于包括但不限于以下的属或物种的生物体:双歧杆菌属、博德特菌属(Bordetella)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、梭菌属、肠球菌属、埃希氏菌属、真细菌属(Eubacterium)、乳杆菌属、磁螺菌属(Magnetospirillium)、分枝杆菌属、脉孢菌属(Neurospora)、草酸杆菌属(Oxalobacter)(例如,产甲酸草酸杆菌)、罗尔斯通氏菌属(Ralstonia)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、志贺氏菌属(Shigella)、热原体属(Thermoplasma)和需氧去氮菌(Thauera),例如,动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)、两岐双岐杆菌、婴儿双岐杆菌、乳双歧杆菌、长双歧杆菌、支气管炎博德特菌(Bordatella bronchiseptica)、副百日咳博德特菌(Bordatella parapertussis)、真菌伯克霍尔德菌(Burkholderia fungorum)、Burkholderia xenovorans、大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、闪烁梭菌(Clostridium scindens)、产孢梭菌(Clostridium sporogenes)、破伤风梭菌(Clostridium tentani)、粪肠球菌、大肠埃希氏菌、迟缓真杆菌(Eubacterium lentum)、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、乳酸乳球菌、向磁磁螺菌(Magnetospirillium magentotaticum)、鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)、胞内分枝杆菌(Mycobacterium intracellulare)、堪萨斯分枝杆菌(Mycobacterium kansasii)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、溃疡分枝杆菌(Mycobacterium ulcerans)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、产甲酸草酸杆菌、雷氏普罗威登斯菌(Providencia rettgeri)、迟缓真杆菌(Eubacterium lentum)、富养产碱菌(Ralstonia eutropha)、Ralstonia metallidurans、沼泽红假草胞菌菌(Rhodopseudomonas palustris)、弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri)、火山热原体(Thermoplasma volcanium)和芳香族需氧去氮菌(Thauera aromatica)。
在一个实施方案中,由遗传工程化细菌编码的一种或多种草酸分解代谢酶来源于产甲酸草酸杆菌,例如上述oxc和frc。
在一个实施方案中,由工程化细菌编码的一种或多种草酸分解代谢酶来源于粪肠球菌。已经在粪肠球菌中描述了可诱导的草酸分解代谢系统,其包含产甲酸草酸杆菌Frc和Oxc的同系物(Hokama等人,Oxalate-degrading Enterococcusfaecalis.Microbiol.Immunol.44,235-240)。
在一个实施方案中,由工程化细菌编码的一种或多种草酸分解代谢酶来源于迟缓真杆菌。据报道,草酸降解蛋白草酰辅酶A脱羧酶和甲酰辅酶A转移酶分离自该菌株(Ito,H.,Kotake,T.和Masai,M.(1996).Invitro degradation of oxalic acid by humanfeces.Tnt.J.Urol.3,207-211.)。
在一个实施方案中,由工程化细菌编码的一种或多种草酸分解代谢酶来源于雷氏普罗威登斯菌,其已显示出为产甲酸草酸杆菌Frc和Oxc的同系物(例如,如Abratt和Reid,Oxalate-degrading bacteria ofthe human gut as probiotics in the management ofkidney stone disease;Adv Appl Microbiol.2010;72:63-87以及其中的参考文献所述)。
在一个实施方案中,由工程化细菌编码的一种或多种草酸分解代谢酶来源于大肠埃希氏菌,例如来自yfdXWUVE操纵子。例如,ydfU被认为是oxc同系物。在一个实施方案中,由工程化细菌编码的一种或多种草酸分解代谢酶来源于乳杆菌属和/或双歧杆菌属物种。在非限制性实例中,一种或多种草酸分解代谢酶来源于oxc和frc同系物乳杆菌属和/或双歧杆菌属物种。此类乳杆菌属物种的非限制性实例包括植物乳杆菌、短乳杆菌菌(Lactobacillus brevis)、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、加氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)。此类双歧杆菌属物种的非限制性实例包括婴儿双歧杆菌、例物双歧杆菌、短双歧杆菌、长双歧杆菌、乳双歧杆菌和青春双歧杆菌。
在一个实施方案中,编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列已经被密码子优化,以用于本发明的重组细菌细胞。在一个实施方案中,编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列已经被密码子优化以用于大肠埃希氏菌。在一个实施方案中,编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列尚未被密码子优化以用于大肠埃希氏菌。在另一个实施方案中,编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列已经被密码子优化以用于乳球菌属。当编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列在本发明的重组细菌细胞中表达时,在相同条件(例如,培养或环境条件)下细菌细胞比相同细菌亚型的未修饰细菌分解代谢更多的草酸盐或草酰辅酶A。因此,包含编码至少一种草酸分解代谢酶的至少一个异源基因的遗传工程化细菌可以用于分解代谢过量的草酸盐、草酸和/或草酰辅酶A,以治疗草酸盐有害的病症,诸如PHI、PHII、PHIII以及继发性高草酸尿症、肠高草酸尿症和特发性高草酸尿症。
本发明还包括编码草酸分解代谢酶的功能片段或草酸分解代谢酶的功能变体的基因。如本文所用,草酸分解代谢酶的术语“其功能片段”或“其功能变体”涉及具有与所述片段或变体所来源的野生型草酸分解代谢酶共有的定性生物活性的元件。例如,突变的草酸分解代谢酶的功能片段或功能变体是保留了与所述功能片段或功能变体所来源的草酸分解代谢酶基本相同的分解代谢草酰辅酶A的能力的功能片段或功能变体。例如,具有草酸分解代谢酶活性的多肽可以是在N末端或C末端截短的,并且草酸分解代谢酶活性的保留使用本领域技术人员已知的测定(包括本文提供的示例性测定)进行评估。在一个实施方案中,本发明的重组细菌细胞包含编码草酸分解代谢酶功能变体的异源基因。在另一个实施方案中,本发明的重组细菌细胞包含编码草酸分解代谢酶功能片段的异源基因。
用于测试草酸分解代谢酶、草酸分解代谢酶功能变体或草酸分解代谢酶功能片段的活性的测定是本领域普通技术人员熟知的。例如,可以通过在缺乏内源性草酸分解代谢酶活性的重组细菌细胞中表达蛋白质、其功能变体或片段来评估草酸分解代谢。草酸分解代谢活性可以通过定量培养基中的草酸盐降解来评估,如Federici等人,Appl.Environ.Microbiol.70:5066-73(2004)中所述,所述文献的全部内容以引用的方式明确地并入本文。甲酰辅酶A转移酶和草酰辅酶A脱羧酶活性可以通过毛细管电泳来测量,如在描Turroni等人,J.Appl.Microbiol.103:1600-9(2007)中所述。
如本文所用,术语“序列同一性百分比(%)”或“同一性百分比(%)”,也包括“同源性”,被定义为在比对序列并引入缺口(如果必要的话)以达到最大序列同一性百分比并且不考虑任何保守取代作为序列同一性一部分之后候选序列中的氨基酸残基或核苷酸与参考序列中的氨基酸残基或核苷酸相同的百分比。用于比较的序列的最佳比对(除了手动以外)可以通过以下手段来产生:Smith和Waterman,1981,AdsApp.Math.2,482的局部同源算法、Neddleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48,443的局部同源算法、Pearson和Lipman,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85,2444的相似性搜索方法、或通过使用这些算法的计算机程序(威斯康星遗传学软件包(Genetics Computer Group,575 Science Drive,Madison,Wis.)中的GAP、BESTFIT、FASTA、BLASTP、BLAST N和TFASTA)。在一个实施方案中,基因或蛋白质与本文所公开的基因或蛋白质至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同。
本发明涵盖编码草酸分解代谢酶的基因,所述草酸分解代谢酶在其序列中包含与本文所述的氨基酸序列基本相同的氨基酸。与本文所述序列基本相同的氨基酸序列包括包含保守氨基酸取代以及氨基酸缺失和/或插入的序列。保守氨基酸取代是指第一个氨基酸被第二个氨基酸替换,所述第二个氨基酸具有与第一个氨基酸相似的化学和/或物理性质(例如,电荷、结构、极性、疏水性/亲水性)。保守取代包括一个氨基酸被以下组内的另一个氨基酸替换:赖氨酸(K)、精氨酸(R)和组氨酸(H);天冬氨酸(D)和谷氨酸(E);天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、酪氨酸(Y)、K、R、H、D和E;丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、脯氨酸(P)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)和甘氨酸(G);F、W和Y;C、S和T。类似地,预期碱性氨基酸被另一种碱性氨基酸替换(例如,Lys、Arg、His之间的替换),酸性氨基酸被另一种酸性氨基酸替换(例如,Asp和Glu之间的替换),中性氨基酸被另一种中性氨基酸替换(例如,Ala、Gly、Ser、Met、Thr、Leu、Ile、Asn、Gln、Phe、Cys、Pro、Trp、Tyr、Val之间的替换)。
在一些实施方案中,诱变编码草酸分解代谢酶的基因;选择表现出活性增加的突变体;并且将诱变的编码草酸分解代谢酶的基因分离并插入本发明的细菌细胞中。在一个实施方案中,可以筛选和选择允许细菌在草酸盐作为唯一碳源上生长的自发突变体。包含本文所述修饰的基因可以存在于质粒或染色体上。表2中列出了本公开的草酸分解代谢酶的非限制性实例。
表2.草酸分解代谢酶多核苷酸序列
在一个实施方案中,编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列包含甲酰辅酶A:草酸辅酶A转移酶序列。在一个实施方案中,甲酰辅酶A:草酸辅酶A转移酶是frc,例如来自产甲酸草酸杆菌。因此,在一个实施方案中,frc基因与SEQ ID NO:1的整个序列具有至少约80%的同一性。因此,在一个实施方案中,frc基因与SEQ ID NO:1的整个序列具有至少约90%的同一性。因此,在一个实施方案中,frc基因与SEQ ID NO:1的整个序列具有至少约95%的同一性。因此,在一个实施方案中,frc基因与SEQ ID NO:1的整个序列具有至少约85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。在另一个实施方案中,frc基因包含SEQ ID NO:1的序列。在又另一个实施方案中,frc基因由SEQ ID NO:1的序列组成。
在一个实施方案中,所述编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列包含草酰辅酶A脱羧酶序列。在一个实施方案中,草酰辅酶A脱羧酶是oxc,例如来自产甲酸草酸杆菌。因此,在一个实施方案中,oxc基因与SEQ ID NO:2的整个序列具有至少约80%的同一性。因此,在一个实施方案中,oxc基因与SEQ ID NO:2的整个序列具有至少约90%的同一性。因此,在一个实施方案中,oxc基因与SEQ ID NO:2的整个序列具有至少约95%的同一性。因此,在一个实施方案中,oxc基因与SEQ ID NO:2的整个序列具有至少约85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。在另一个实施方案中,oxc基因包含SEQ ID NO:2的序列。在又另一个实施方案中,oxc基因由SEQ IDNO:2的序列组成。在另一个实施方案中,oxc基因由SEQ ID NO:2的序列组成。
在一个实施方案中,所述编码至少一种草酸分解代谢酶的至少一个基因包含草酸辅酶A连接酶序列。在一个实施方案中,草酸辅酶A连接酶是来自酿酒酵母的ScAAE3。因此,在一个实施方案中,ScAAE3基因与SEQ ID NO:3的整个序列具有至少约80%的同一性。因此,在一个实施方案中,ScAAE3基因与SEQ ID NO:3的整个序列具有至少约90%的同一性。因此,在一个实施方案中,ScAAE3基因与SEQ ID NO:3的整个序列具有至少约95%的同一性。因此,在一个实施方案中,ScAAE3基因与SEQ ID NO:3的整个序列具有至少约85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。在另一个实施方案中,ScAAE3基因包含SEQ ID NO:3的序列。在又另一个实施方案中,ScAAE3基因由SEQ ID NO:3的序列组成。
在一个实施方案中,所述至少一个编码至少一种草酸分解代谢酶的基因包含乙酰辅酶A:草酸辅酶A转移酶序列。在一个实施方案中,乙酰辅酶A:草酸辅酶A转移酶是来自大肠埃希氏菌、来自酿酒酵母的YfdE。因此,在一个实施方案中,YfdE基因与SEQ ID NO:4的整个序列具有至少约80%的同一性。因此,在一个实施方案中,YfdE基因与SEQ ID NO:4的整个序列具有至少约90%的同一性。因此,在一个实施方案中,YfdE基因与SEQ ID NO:4的整个序列具有至少约95%的同一性。因此,在一个实施方案中,YfdE基因与SEQ ID NO:4的整个序列具有至少约85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。在另一个实施方案中,YfdE基因包含SEQ ID NO:4的序列。在又另一个实施方案中,YfdE基因由SEQ ID NO:4的序列组成。
表3列出了草酸分解代谢酶多肽序列的非限制性实例。
表3.草酸分解代谢酶的多肽序列
在一个实施方案中,由草酸盐分解代谢盒编码并由遗传工程化细菌表达的一种或多种多肽包含甲酰辅酶A转移酶,例如来自产甲酸草酸杆菌的frc。在一个实施方案中,多肽与SEQ ID NO:5具有至少约80%的同一性。在另一个实施方案中,由草酸分解代谢基因或基因盒编码并由遗传工程化细菌表达的一种或多种多肽与SEQ ID NO:5具有至少约85%的同一性。在一个实施方案中,由草酸分解代谢基因或基因盒编码并由遗传工程化细菌表达的一种或多种多肽与SEQ ID NO:5具有至少约90%的同一性。在一个实施方案中,由草酸分解代谢基因或基因盒编码并由遗传工程化细菌表达的一种或多种多肽与SEQ ID NO:5具有至少约95%的同一性。在另一个实施方案中,由草酸分解代谢基因或基因盒编码并由遗传工程化细菌表达的一种或多种多肽与SEQ ID NO:5具有至少约96%、97%、98%或99%的同一性。因此,在一个实施方案中,由草酸分解代谢基因或基因盒编码并由遗传工程化细菌表达的一种或多种多肽与SEQ ID NO:5具有至少约80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。在另一个实施方案中,由草酸分解代谢基因或基因盒编码并由遗传工程化细菌表达的一种或多种多肽包含SEQ ID NO:5的序列。在又另一个实施方案中,由草酸分解代谢基因或基因盒编码并由遗传工程化细菌表达的一种或多种多肽由SEQ ID NO:5的序列组成。
在一个实施方案中,由草酸盐分解代谢盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽包含草酰辅酶A脱羧酶,例如来自产甲酸草酸杆菌的oxc。在一个实施方案中,多肽与SEQ ID NO:6具有至少约80%的同一性。在另一个实施方案中,由草酸分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽与SEQ ID NO:6具有至少约85%的同一性。在一个实施方案中,由草酸分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽与SEQ ID NO:6具有至少约90%的同一性。在一个实施方案中,由草酸分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽与SEQ ID NO:6具有至少约95%的同一性。在另一个实施方案中,由草酸分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽与SEQ ID NO:6具有至少约96%、97%、98%或99%的同一性。因此,在一个实施方案中,由草酸分解代谢基因或基因盒编码并由遗传工程化细菌表达的一种或多种多肽与SEQ ID NO:6具有至少约80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。在另一个实施方案中,由草酸分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽包含SEQ ID NO:6的序列。在又另一个实施方案中,由草酸分解代谢基因或基因盒编码并由遗传工程化细菌表达的一种或多种多肽由SEQ ID NO:6的序列组成。
在一个实施方案中,由草酸分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽包含草酸辅酶A连接酶,例如来自酿酒酵母的ScAAE3。在一个实施方案中,多肽与SEQ ID NO:7具有至少约80%的同一性。在另一个实施方案中,由草酸分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽与SEQ ID NO:7具有至少约85%的同一性。在一个实施方案中,由草酸分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽与SEQ ID NO:7具有至少约90%的同一性。在一个实施方案中,由草酸分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽与SEQ ID NO:7具有至少约95%的同一性。在另一个实施方案中,由草酸分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽与SEQ ID NO:7具有至少约96%、97%、98%或99%的同一性。因此,在一个实施方案中,由草酸分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽与SEQ ID NO:7具有至少约80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。在另一个实施方案中,由草酸分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽包含SEQ ID NO:7的序列。在又另一个实施方案中,由草酸盐分解代谢盒编码并由遗传工程化细菌表达的一种或多种多肽由SEQ ID NO:7的序列组成。
在一个实施方案中,由草酸盐分解代谢盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽包含来自例如来自大肠埃希氏菌的YfdE的乙酰辅酶A:草酸辅酶A转移酶。在一个实施方案中,多肽与SEQ ID NO:8具有至少约80%的同一性。在另一个实施方案中,由草酸分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽与SEQ ID NO:8具有至少约85%的同一性。在一个实施方案中,由草酸分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽与SEQ ID NO:8具有至少约90%的同一性。在一个实施方案中,由草酸分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽与SEQ ID NO:8具有至少约95%的同一性。在另一个实施方案中,由草酸分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽与SEQ ID NO:8具有至少约96%、97%、98%或99%的同一性。因此,在一个实施方案中,由草酸分解代谢基因或基因盒编码并由遗传工程化细菌表达的一种或多种多肽与SEQ ID NO:8具有至少约80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。在另一个实施方案中,由草酸分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽包含SEQ ID NO:8的序列。在又另一个实施方案中,由草酸分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽由SEQ ID NO:8的序列组成。
在一个实施方案中,由草酸分解代谢基因或基因盒编码并由遗传工程化细菌表达的一种或多种多肽包含甲酰辅酶A转移酶,例如来自大肠埃希氏菌的yfdW。在一个实施方案中,多肽与SEQ ID NO:9具有至少约80%的同一性。在另一个实施方案中,由草酸分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽与SEQ ID NO:9具有至少约85%的同一性。在一个实施方案中,由草酸分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽与SEQ ID NO:9具有至少约90%的同一性。在一个实施方案中,由草酸分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽与SEQ ID NO:9具有至少约95%的同一性。在另一个实施方案中,由草酸分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽与SEQ ID NO:9具有至少约96%、97%、98%或99%的同一性。因此,在一个实施方案中,由草酸分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽与SEQ ID NO:9具有至少约80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。在另一个实施方案中,由草酸分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽包含SEQ IDNO:9的序列。在又另一个实施方案中,由草酸分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽由SEQ ID NO:9的序列组成。
在一个实施方案中,由草酸分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽包含草酰辅酶A脱羧酶,例如来自大肠埃希氏菌的yfdU。在一个实施方案中,多肽与SEQ ID NO:10具有至少约80%的同一性。在另一个实施方案中,由草酸分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽与SEQ ID NO:10具有至少约85%的同一性。在一个实施方案中,由草酸分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽与SEQ ID NO:10具有至少约90%的同一性。在一个实施方案中,由草酸分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽与SEQ ID NO:10具有至少约95%的同一性。在另一个实施方案中,由草酸分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽与SEQ ID NO:10具有至少约96%、97%、98%或99%的同一性。因此,在一个实施方案中,由草酸分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽与SEQ ID NO:10具有至少约80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。在另一个实施方案中,由草酸分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽包含SEQ ID NO:10的序列。在又另一个实施方案中,由草酸分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽由SEQ ID NO:10的序列组成。
在一个实施方案中,重组细菌包含与SEQ ID NO:1103具有至少约80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列。在又另一个实施方案中,重组细菌包含SEQ ID NO:1103的序列。在又另一个实施方案中,重组细菌由SEQ ID NO:1103的序列组成。
在一个实施方案中,重组细菌包含与SEQ ID NO:1104具有至少约80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列。在又另一个实施方案中,重组细菌包含SEQ ID NO:1104的序列。在又另一个实施方案中,重组细菌由SEQ ID NO:1104的序列组成。
在一个实施方案中,重组细菌包含与SEQ ID NO:1103和SEQ ID NO:1104具有至少约80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列。在又另一个实施方案中,重组细菌包含SEQ ID NO:1103和SEQ ID NO:1104的序列。在又另一个实施方案中,重组细菌由SEQ IDNO:1103和SEQ ID NO:1104的序列组成。
在一个实施方案中,编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列直接与第一启动子可操作地连接。在另一个实施方案中,编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列直接与第一启动子可操作地连接。在一个实施方案中,启动子不与天然编码草酸分解代谢酶的至少一个基因可操作地连接。
在一些实施方案中,编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列在组成型启动子的控制下表达。在另一个实施方案中,编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列在诱导型启动子的控制下表达。在一些实施方案中,编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列在由外源环境条件直接或间接诱导的启动子的控制下表达。在一个实施方案中,编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列在启动子的控制下表达,所述启动子由低氧或厌氧条件(诸如哺乳动物肠道的环境条件)直接或间接诱导,其中所述编码所述一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列的表达在低氧或厌氧环境(诸如哺乳动物肠道环境)下被激活。在一些实施方案中,所述编码所述一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列在由炎症条件直接或间接诱导的启动子的控制下表达。本文所述的示例性诱导型启动子包括氧水平依赖性启动子(例如,FNR诱导型启动子)、由炎症或炎症反应诱导的启动子(RNS、ROS启动子)和由由可能天然地存在于或可能不天然地存在于(例如,可以外源地添加到)肠道中的代谢物(例如阿拉伯糖和四环素)诱导的启动子。诱导型启动子的实例包括但不限于FNR响应性启动子、ParaC启动子、ParaBAD启动子、PTetR启动子和PLacI启动子,它们各自在本文中更详细地描述。诱导型启动子在下文中有更详细的描述。
所述编码至少一种草酸分解代谢酶的至少一个基因可以存在于细菌细胞中的质粒或染色体上。在一个实施方案中,所述编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列位于细菌细胞中的质粒上。在另一个实施方案中,所述编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列位于细菌细胞的染色体中。在又另一个实施方案中,所述编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列的天然拷贝位于细菌细胞的染色体中,并且编码来自不同细菌物种的至少一种草酸分解代谢酶的至少一个基因位于细菌细胞中的质粒上。在又另一个实施方案中,所述编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列的天然拷贝位于细菌细胞中的质粒上,并且编码来自不同细菌物种的至少一种草酸分解代谢酶的至少一个基因位于细菌细胞中的质粒上。在又另一个实施方案中,所述编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列的天然拷贝位于细菌细胞的染色体中,并且编码来自不同细菌物种的至少一种草酸分解代谢酶的至少一个基因位于细菌细胞中的染色体中。
在一些实施方案中,编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列在低拷贝质粒上表达。在一些实施方案中,编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列在高拷贝质粒上表达。在一些实施方案中,高拷贝质粒可以用于增加所述至少一种草酸分解代谢酶的表达,从而增加对草酸盐、草酸和/或草酰辅酶A的分解代谢。
在一些实施方案中,与重组细菌相比,包含在高拷贝质粒上表达的编码至少一种草酸分解代谢酶的至少一个基因的本发明的重组细菌细胞不增加草酸分解代谢或降低草酸盐和/或草酸水平包含在低拷贝质粒上表达的相同基因的细胞,不存在草酸盐的异源输入者和草酸的天然输入者的额外拷贝。此外,在将草酸盐输入蛋白掺入重组细菌细胞中的一些实施方案中,联合使用包含编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列的低拷贝质粒以便增强草酸分解代谢酶表达的稳定性,同时保持高草酸分解代谢并降低对转化细菌的阴性选择压力可能具有附加的优势。在替代性实施方案中,草酸盐输入蛋白与高拷贝质粒联合使用。
草酸盐转运蛋白(输入蛋白)
已经发现,厌氧细菌产甲酸草酸杆菌(Oxalobacter formigenes)对草酸盐的摄取是通过草酸盐转运蛋白OxlT发生的(参见例如,Ruan等人,J.Biol.Chem.267:10537-43(1992),其全部内容以引用的方式整体明确并入本文)。OxlT催化细胞外草酸盐(二价阴离子)与细胞内甲酸盐(来源于草酸盐脱羧的一价阳离子)的交换,因此产生质子原动力。介导草酸盐输入的其他蛋白质是本领域技术人员熟知的。
可以在本发明的细菌中表达或修饰草酸盐转运蛋白(例如草酸盐输入蛋白),以便增强草酸盐向细胞中的转运。具体而言,当草酸盐输入蛋白在本发明的重组细菌细胞中表达时,与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比,当输入蛋白被表达时,细菌细胞将更多的草酸盐输入细胞中。因此,包含编码草酸盐输入蛋白的一个或多个异源基因序列的遗传工程化细菌可以用于将草酸盐输入细菌中,使得可以将在生物体中表达的编码草酸分解代谢酶的任何基因序列用于治疗草酸盐有害的病症,诸如PHI、PHII、PHIII以及继发性高草酸尿症、肠高草酸尿症和特发性高草酸尿症。在一个实施方案中,本发明的细菌细胞包含编码草酸盐转运蛋白(输入蛋白)的异源基因序列。在一个实施方案中,本发明的细菌细胞包含编码草酸盐转运蛋白的异源基因序列和编码一种或多种草酸分解代谢酶的一个或多个异源基因序列。在一个实施方案中,本发明的细菌细胞包含编码草酸盐转运蛋白的异源基因序列和编码选自甲酸盐输出蛋白、草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白及它们的组合的一种或多种多肽的一个或多个异源基因序列。在一个实施方案中,本发明的细菌细胞包含编码草酸盐转运蛋白的异源基因序列、编码一种或多种草酸分解代谢酶的一个或多个异源基因序列、和编码选自甲酸盐输出蛋白、草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白及它们的组合的一种或多种多肽的一个或多个异源基因序列。
因此,在一些实施方案中,本发明提供了细菌细胞,其包含与第一启动子可操作地连接的编码草酸分解代谢酶的一个或多个异源基因序列以及编码草酸盐转运蛋白(输入蛋白)的一个或多个异源基因序列。在一些实施方案中,本发明提供了细菌细胞,其包含与第一启动子可操作地连接的编码草酸盐转运蛋白(输入蛋白)的一个或多个异源基因序列。在另一个实施方案中,本发明提供了细菌细胞,其包含与第一启动子可操作地连接的编码一种或多种草酸分解代谢酶的一个或多个异源基因序列以及与第二启动子可操作地连接的编码草酸盐转运蛋白(输入蛋白)的一个或多个异源基因序列。在一个实施方案中,第一启动子和第二启动子是相同启动子的独立拷贝。在另一个实施方案中,第一启动子和第二启动子是不同的启动子。
在一个实施方案中,细菌细胞包含编码来自不同生物体(例如不同细菌物种)的草酸盐转运蛋白(输入蛋白)的一个或多个基因序列。在一个实施方案中,细菌细胞包含编码草酸盐转运蛋白(输入蛋白)的一个或多个天然基因序列。在一些实施方案中,所述编码草酸盐转运蛋白(输入蛋白)的一个或多个天然基因序列没有被修饰。在另一个实施方案中,细菌细胞包含多于一个拷贝的编码草酸盐转运蛋白(输入蛋白)的一个或多个天然基因序列。在又另一个实施方案中,细菌细胞包含一个拷贝的编码天然草酸盐转运蛋白(输入蛋白)的一个或多个基因序列、以及一个或多个拷贝的编码来自不同细菌物种的草酸盐转运蛋白的一个或多个异源基因序列。在一个实施方案中,细菌细胞包含一个或多个、两个、三个、四个、五个或六个拷贝的编码草酸盐转运蛋白的一个或多个异源基因序列。在一个实施方案中,细菌细胞包含多个拷贝的编码草酸盐转运蛋白的一个或多个异源基因序列。
在一些实施方案中,草酸盐转运蛋白由来自细菌属或物种(包括但不限于草酸杆菌)的草酸盐转运蛋白基因编码。在一些实施方案中,草酸盐转运蛋白基因来源于产甲酸草酸杆菌物种的细菌。在一些实施方案中,转运蛋白是来自产甲酸草酸杆菌的OxlT草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白。
在其他实施方案中,草酸盐转运蛋白由选自草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白(OFA)家族的基因编码。OFA家族成员属于主要促进因子超家族,并且广泛分布于自然界中,存在于细菌、古细菌和真核生物界在(参见例如,Pao等人,Major Facilitator SuperfamilyMicrobiol.Mol.Biol.Rev.1998年3月第62卷第1期1-34)。在非限制性实例中,转运蛋白是产甲酸草酸杆菌草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白的同系物和/或直向同系物。在另一个非限制性实例中,转运蛋白是产甲酸草酸杆菌草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白(OxlT)的细菌来源同系物和/或直向同系物。本发明还包括编码草酸盐转运蛋白的功能片段或草酸盐转运蛋白的功能变体的基因。如本文所用,草酸盐转运蛋白的术语“其功能片段”或“其功能变体”涉及具有与所述片段或变体所来源的野生型草酸盐转运蛋白共有的定性生物活性的元件。例如,突变的草酸盐转运蛋白的功能片段或功能变体保留了与所述功能片段或功能变体所来源的转运蛋白基本相同的将草酸盐输入细菌细胞中的能力。在一个实施方案中,本发明的重组细菌细胞包含编码草酸盐转运蛋白功能片段的一个或多个异源基因序列。在另一个实施方案中,本发明的重组细菌细胞包含编码草酸盐转运蛋白功能变体的一个或多个异源基因序列。
用于测试草酸盐转运蛋白、草酸盐转运蛋白功能变体或草酸盐转运蛋白功能片段的活性的测定对本领域普通技术人员而言是熟知的。例如,可以通过从表达蛋白质、其功能变体或片段的重组细菌细胞中制备洗涤剂提取的蛋白脂质体并确定[14C]草酸盐摄取来评估草酸盐输入,如Abe等人,J.Biol.Chem.271:6789-93(1996)中所述,所述文献的全部内容以引用的方式整体明确并入本文。
在一个实施方案中,编码草酸盐转运蛋白的基因已经被密码子优化以用于宿主生物体。在一个实施方案中,编码草酸盐转运蛋白的基因已经被密码子优化以用于大肠埃等氏菌。
本发明涵盖编码草酸盐转运蛋白的基因,所述草酸盐转运蛋白在其序列中包含与本文所述的氨基酸序列基本相同的氨基酸。与本文所述序列基本相同的氨基酸序列包括包含保守氨基酸取代以及氨基酸缺失和/或插入的序列。
在一些实施方案中,诱变编码草酸盐转运蛋白的一个或多个基因序列;选择表现出草酸盐转运增加的突变体;并且将诱变的编码草酸盐转运蛋白的一个或多个基因序列分离并插入本发明的细菌细胞中。在一些实施方案中,诱变编码草酸盐转运蛋白的一个或多个基因序列;选择表现出草酸盐转运减少的突变体;并且将诱变的编码草酸盐转运蛋白的一个或多个基因序列分离并插入本发明的细菌细胞中。本文所述的转运蛋白修饰可以存在于质粒或染色体上。
表4列出了草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白的非限制性实例的多肽和多核苷酸序列。
表4.OxlT序列
在一个实施方案中,草酸盐输入蛋白是草酸盐:甲酸盐反向反向转运蛋白OxlT。在一个实施方案中,OxlT基因与SEQ ID NO:11具有至少约80%的同一性。因此,在一个实施方案中,OxlT基因与SEQ ID NO:11具有至少约90%的同一性。因此,在一个实施方案中,OxlT基因与SEQ ID NO:11具有至少约95%的同一性。因此,在一个实施方案中,OxlT基因与SEQID NO:11具有至少约85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。在另一个实施方案中,OxlT基因包含SEQ ID NO:11的序列。在又另一个实施方案中,OxlT基因由SEQ ID NO:11的序列组成。
在一个实施方案中,由一个或多个基因或基因盒编码并由遗传工程化细菌表达的一种或多种多肽是草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白OxlT。在一个实施方案中,多肽与SEQ IDNO:12具有至少约80%的同一性。在另一个实施方案中,由一个或多个基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽与SEQ ID NO:12具有至少约85%的同一性。在一个实施方案中,由一个或多个基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽与SEQID NO:12具有至少约90%的同一性。在一个实施方案中,由一个或多个基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽与SEQ ID NO:12具有至少约95%的同一性。在另一个实施方案中,由一个或多个基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽与SEQ ID NO:12具有至少约96%、97%、98%或99%的同一性。因此,在一个实施方案中,由一个或多个基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽与SEQ ID NO:12具有至少约80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。在另一个实施方案中,由一个或多个基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽包含SEQ ID NO:12的序列。在又另一个实施方案中,由一个或多个基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽由SEQ ID NO:12的序列组成。
在一些实施方案中,细菌细胞包含与第一启动子可操作地连接的编码至少一种草酸分解代谢酶的一个或多个异源基因序列以及编码草酸盐输入蛋白的一个或多个异源基因序列。在一些实施方案中,编码草酸盐输入蛋白的一个或多个异源基因序列与第一启动子可操作地连接。在其他实施方案中,编码草酸盐输入蛋白的一个或多个异源基因序列与第二启动子可操作地连接。在一个实施方案中,编码草酸盐输入蛋白的一个或多个基因序列直接与第二启动子可操作地连接。在另一个实施方案中,编码草酸盐输入蛋白的一个或多个基因序列间接与第二启动子可操作地连接。
在一些实施方案中,编码草酸盐输入蛋白的一个或多个基因序列的表达由与控制编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列的表达的启动子不同的启动子控制。在一些实施方案中,编码草酸盐输入蛋白的一个或多个基因序列的表达由控制一种或多种草酸分解代谢酶表达的相同启动子控制。在一些实施方案中,编码草酸盐输入蛋白和草酸分解代谢酶的一个或多个基因序列从启动子区域被差异地转录。在一些实施方案中,编码草酸盐输入蛋白的基因序列和编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列的每个基因的表达由不同的启动子控制。
在一个实施方案中,启动子不与天然编码草酸盐输入蛋白的一个或多个基因序列可操作地连接。在一些实施方案中,编码草酸盐输入蛋白的一个或多个基因序列由其天然启动子控制。在一些实施方案中,编码草酸盐输入蛋白的一个或多个基因序列由诱导型启动子控制。在一些实施方案中,编码草酸盐输入蛋白的一个或多个基因序列由比其天然启动子更强的启动子控制。在一些实施方案中,编码草酸盐输入蛋白的一个或多个基因序列由组成型启动子控制。
在另一个实施方案中,启动子是诱导型启动子。诱导型启动子在下文中有更详细的描述。
在一个实施方案中,编码草酸盐输入蛋白的一个或多个基因序列位于细菌细胞中的质粒上。在另一个实施方案中,编码草酸盐输入蛋白的一个或多个基因序列位于细菌细胞的染色体中。在又另一个实施方案中,编码草酸盐输入蛋白的一个或多个基因序列的天然拷贝位于细菌细胞的染色体中,并且编码来自不同细菌物种的草酸盐输入蛋白的一个或多个基因序列的拷贝位于细菌细胞中的质粒上。在又另一个实施方案中,编码草酸盐输入蛋白的一个或多个基因序列的天然拷贝位于细菌细胞中的质粒上,并且编码来自不同细菌物种的草酸盐输入蛋白的一个或多个基因序列的拷贝位于细菌细胞中的质粒上。在又另一个实施方案中,编码草酸盐输入蛋白的一个或多个基因序列的天然拷贝位于细菌细胞的染色体中,并且编码来自不同细菌物种的草酸盐输入蛋白的一个或多个基因序列的拷贝位于细菌细胞的染色体中。
在一些实施方案中,细菌细胞中编码草酸盐输入蛋白的至少一个天然基因未被修饰,并且天然草酸盐输入蛋白的一个或多个附加拷贝被插入基因组中。在一个实施方案中,插入基因组中的一个或多个附加拷贝的天然输入蛋白处于控制编码草酸分解代谢酶的一个或多个基因序列的表达的相同诱导型启动子(例如FNR响应性启动子)或与控制至少一种草酸分解代谢酶的表达的诱导型启动子不同的诱导型启动子、或组成型启动子的控制下。在替代性实施方案中,编码输入蛋白的至少一个天然基因未被修饰,并且来自不同细菌物种的输入蛋白的一个或多个附加拷贝被插入细菌细胞的基因组中。在一个实施方案中,插入细菌细胞基因组中的一个或多个附加拷贝的输入蛋白处于控制编码草酸分解代谢酶的一个或多个基因序列的表达的相同诱导型启动子(例如FNR响应性启动子)或与控制编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列表达的诱导型启动子不同的诱导型启动子、或组成型启动子的控制下。
在一个实施方案中,当草酸盐输入蛋白在本发明的重组细菌细胞中表达时,与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比,当输入蛋白被表达时,细菌细胞将10%更多的草酸盐输入细菌细胞中。在另一个实施方案中,当草酸盐输入蛋白在本发明的重组细菌细胞中表达时,与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比,当输入蛋白被表达时,细菌细胞将20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%更多的草酸盐输入细菌细胞中。在又另一个实施方案中,当草酸盐输入蛋白在本发明的重组细菌细胞中表达时,与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比,当输入蛋白被表达时,细菌细胞将两倍更多的草酸盐输入细胞中。在又另一个实施方案中,当草酸盐输入蛋白在本发明的重组细菌细胞中表达时,与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比,当输入蛋白被表达时,细菌细胞将3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍更多的草酸盐输入细胞中。
在一些实施方案中,细菌细胞在编码甲酸盐转运蛋白(输入蛋白)的一个或多个内源基因中包含遗传突变,其中所述遗传突变减少细菌细胞中甲酸盐的流入。不希望受理论所束缚,此类突变可以降低细胞内甲酸盐浓度并增加通过草酸分解代谢途径的流量。大肠埃希氏菌的FocA催化双向甲酸盐转运,并且可能通过通道型机制起作用(Flake等人,Unexpected oligomeric structure of the FocA formate channel of Escherichiacoli:a paradigm for the formate-nitrite transporter family of integralmembrane proteins″.FEMS microbiology letters.303(1):69-75)。FocA可能能够将其操作模式从高外部pH下的被动输出通道转换为低pH下的次级主动甲酸盐/H输入通道。在非限制性实例中,遗传工程化细菌可能在FocA中包含突变和/或缺失,使得其无功能。
甲酸盐输出蛋白
甲酸盐是许多肠道细菌厌氧发酵葡萄糖的主要代谢物。本领域已知几种类型的甲酸盐输入和输出蛋白。例如,在大肠埃希氏菌和其他肠杆菌科中,甲酸盐通过五聚体离子通道/转运蛋白FocA移位穿过细胞膜。FocA充当细胞质中产生的甲酸根阴离子的被动输出蛋白。在周质中,甲酸盐随后被甲酸脱氢酶还原成二氧化碳。另一种形式的甲酸脱氢酶和/或甲酸裂解酶也存在于大肠埃希氏菌的细胞质中。当生长培养基的pH降至6.8以下时,转运模式功能转换发生。由于周质中有充足的质子可用,细胞转换成主动输入甲酸盐,并再次使用FocA来完成这一任务。
在另一个实例中,如上文所述,已经发现厌氧细菌产甲酸草酸杆菌对草酸盐的摄取是通过草酸盐转运蛋白OxlT发生的。OxlT允许草酸盐与来源于草酸盐脱羧的细胞内甲酸盐进行交换。这些相关活动(交换和脱羧)的总体效果是产生支持膜功能的质子原动力,包括ATP合成、生长底物的积聚和废物的挤出。因此,在一些实施方案中,“甲酸盐输出蛋白”还涵盖草酸盐转运蛋白,例如,在OxlT的情况下,甲酸盐:草酸盐反向转运蛋白。
可以在细菌中表达或修饰甲酸盐输出蛋白和/或具有偶联草酸盐输入功能的甲酸盐输出蛋白,以便增强甲酸盐输出(以及在与草酸盐输入偶联时的情况下,从而增强草酸盐输入)。具体而言,在一些实施方案中,当甲酸盐输出蛋白在工程化细菌细胞中表达时,与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比,当输出蛋白被表达时细菌细胞将更多的甲酸盐输出到细胞外部。在一个实施方案中,细菌细胞包含编码甲酸盐输出蛋白的一个或多个基因序列。在一个实施方案中,细菌细胞包含编码甲酸盐输出蛋白的异源基因和编码至少一种草酸分解代谢酶的至少一个异源基因或基因盒。
因此,在一些实施方案中,本公开提供了细菌细胞,其包含与第一启动子可操作地连接的编码一种或多种草酸分解代谢酶的一个或多个基因序列以及编码甲酸盐输出蛋白的一个或多个基因序列。在一些实施方案中,编码甲酸盐输出蛋白的一个或多个基因序列与第一启动子可操作地连接。在另一个实施方案中,编码一种或多种草酸分解代谢酶的一个或多个基因序列与第一启动子可操作地连接,并且编码甲酸盐输出蛋白的一个或多个基因序列与第二启动子可操作地连接。在一个实施方案中,第一启动子和第二启动子是相同启动子的独立拷贝。在另一个实施方案中,第一启动子和第二启动子是不同的启动子。
在一个实施方案中,细菌细胞包含编码来自不同生物体(例如不同细菌物种)的甲酸盐输出蛋白的一个或多个基因序列。在一个实施方案中,细菌细胞包含编码甲酸盐输出蛋白的至少一个天然基因序列。在一些实施方案中,编码甲酸盐输出蛋白的至少一个天然基因序列没有被修饰。在另一个实施方案中,细菌细胞包含多于一个拷贝的编码甲酸盐输出蛋白的至少一个天然基因序列。在又另一个实施方案中,细菌细胞包含一个拷贝的编码天然甲酸盐输出蛋白的一个或多个基因序列、以及至少一个拷贝的编码来自不同细菌物种的甲酸盐输出蛋白的至少一个异源基因序列。在一个实施方案中,细菌细胞包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个拷贝的编码甲酸盐输出蛋白的至少一个异源基因序列。在一个实施方案中,细菌细胞包含多个拷贝的编码甲酸盐输出蛋白的一个或多个异源基因序列。
在一些实施方案中,甲酸盐输出蛋白由来源于以下细菌属或物种的甲酸盐输出蛋白基因编码,所述细菌属或物种包括但不限于双歧杆菌属、博德特菌属、慢生根瘤菌属、伯克霍尔德氏菌属、梭菌属、肠球菌属、埃希氏菌属、真细菌属、乳杆菌属、磁螺菌属、分枝杆菌属、脉孢菌属、草酸杆菌属(例如,产甲酸草酸杆菌)、罗尔斯通氏菌属、红假单胞菌属、志贺氏菌属、热原体属和需氧去氮菌,例如,动物双歧杆菌、两岐双岐杆菌、婴儿双岐杆菌、乳双歧杆菌、长双歧杆菌、支气管炎博德特菌、副百日咳博德特菌、真菌伯克霍尔德菌、Burkholderia xenovorans、大豆慢生根瘤菌、丙酮丁醇梭菌、艰难梭菌、闪烁梭菌、产孢梭菌、破伤风梭菌、粪肠球菌、大肠埃希氏菌、迟缓真杆菌、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌、加氏乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、乳酸乳球菌、向磁磁螺菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、麻风分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、结核分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、粗糙脉孢菌、产甲酸草酸杆菌、雷氏普罗威登斯菌、迟缓真杆菌、富养产碱菌、Ralstoniametallidurans、沼泽红假单胞菌、弗氏志贺氏菌、火山热原体和芳香族需氧去氮菌。
本公开还包含编码甲酸盐输出蛋白的功能片段或甲酸盐输出蛋白的功能变体的基因。如本文所用,甲酸盐输出蛋白的术语“其功能片段”或“其功能变体”涉及具有与所述片段或变体所来源的野生型甲酸盐输出蛋白共有的定性生物活性的元件。例如,突变的甲酸盐输出蛋白的功能片段或功能变体保留了与所述功能片段或功能变体所来源的输出蛋白基本相同的将甲酸盐输入细菌细胞中的能力。在一个实施方案中,工程化细菌细胞包含编码甲酸盐输出蛋白功能片段的至少一个异源基因。在另一个实施方案中,工程化细菌细胞包含编码甲酸盐输出蛋白功能变体的至少一个异源基因。
用于测试甲酸盐输出蛋白、甲酸盐输出蛋白功能变体或甲酸盐输出蛋白功能片段的活性的测定是本领域普通技术人员熟知的。例如,可以通过在缺乏内源性甲酸盐输出蛋白的工程化细菌细胞中表达所述蛋白质、其功能变体或片段,并且在蛋白质表达之后评估培养基中的甲酸盐水平来评估甲酸盐输出。测量甲酸盐输出的方法是本领域普通技术人员熟知的(参见例如,Wraight等人,Structure and mechanism of a pentameric formatechannel Nat Struct Mol Biol.2010年1月;17(1):31-37)。
在一个实施方案中,编码甲酸盐输出蛋白的基因已经被密码子优化以用于宿主生物体。在一个实施方案中,编码甲酸盐输出蛋白的基因已经被密码子优化以用于大肠埃希氏菌。
本公开涵盖编码甲酸盐输出蛋白的基因,所述甲酸盐输出蛋白在其序列中包含与本文所述的氨基酸序列基本相同的氨基酸。与本文所述序列基本相同的氨基酸序列包括包含保守氨基酸取代以及氨基酸缺失和/或插入的序列。
在一些实施方案中,诱变编码甲酸盐输出蛋白的至少一个基因;选择表现出甲酸盐转运增加的突变体;并且将诱变的编码甲酸盐输出蛋白的至少一个基因分离并插入细菌细胞中。在非限制性实例中,增加甲酸盐输出也可能允许草酸盐输入的增加。在一些实施方案中,诱变编码甲酸盐输出蛋白的至少一个基因;选择表现出甲酸盐转运减少的突变体;并且将诱变的编码甲酸盐输出蛋白的至少一个基因分离并插入细菌细胞中。本文所述的输出蛋白修饰可以存在于质粒或染色体上。
在一个实施方案中,甲酸盐输出蛋白是OxlT。在一个实施方案中,OxlT基因与SEQID NO:11具有至少约80%的同一性。因此,在一个实施方案中,OxlT基因与SEQ ID NO:11具有至少约90%的同一性。因此,在一个实施方案中,OxlT基因与SEQ ID NO:11具有至少约95%的同一性。因此,在一个实施方案中,OxlT基因与SEQ ID NO:11具有至少约85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。在另一个实施方案中,OxlT基因包含SEQ ID NO:11的序列。在又另一个实施方案中,OxlT基因由SEQ ID NO:11的序列组成。
在一个实施方案中,OxlT基因编码与SEQ ID NO:12具有至少约80%同一性的多肽。因此,在一个实施方案中,OxlT基因编码与SEQ ID NO:12具有至少约90%同一性的多肽。因此,在一个实施方案中,OxlT基因编码与SEQ ID NO:12具有至少约95%同一性的多肽。因此,在一个实施方案中,OxlT基因编码与SEQ ID NO:12具有至少约85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的多肽。在另一个实施方案中,OxlT基因编码包含SEQ ID NO:12的序列的多肽。在又另一个实施方案中,OxlT基因编码由SEQ ID NO:12的序列组成的多肽。
在一些实施方案中,细菌细胞包含与第一启动子可操作地连接的编码至少一种草酸分解代谢酶的一个或多个异源基因序列以及编码甲酸盐输出蛋白的一个或多个异源基因序列。在一些实施方案中,编码甲酸盐输出蛋白的一个或多个异源基因序列与第一启动子可操作地连接。在其他实施方案中,编码甲酸盐输出蛋白的一个或多个异源基因序列与第二启动子可操作地连接。在一个实施方案中,编码甲酸盐输出蛋白的一个或多个异源基因序列直接与第二启动子可操作地连接。在另一个实施方案中,编码甲酸盐输出蛋白的一个或多个异源基因序列间接与第二启动子可操作地连接。
在一些实施方案中,编码甲酸盐输出蛋白的一个或多个基因序列的表达由与控制编码至少一种草酸分解代谢酶的至少一个基因的表达的启动子不同的启动子控制。在一些实施方案中,编码甲酸盐输出蛋白的一个或多个基因序列的表达由控制至少一种草酸分解代谢酶表达的相同启动子控制。在一些实施方案中,编码甲酸盐输出蛋白和草酸分解代谢酶的一个或多个基因序列从启动子区域被差异地转录。在一些实施方案中,编码甲酸盐输出蛋白的一个或多个基因序列和编码至少一种草酸分解代谢酶的一个或多个基因序列的每个基因的表达由不同的启动子控制。
在一个实施方案中,启动子不与天然编码甲酸盐输出蛋白的一个或多个基因序列可操作地连接。在一些实施方案中,编码甲酸盐输出蛋白的一个或多个基因序列由其天然启动子控制。在一些实施方案中,编码甲酸盐输出蛋白的一个或多个基因序列由诱导型启动子控制。在一些实施方案中,编码甲酸盐输出蛋白的一个或多个基因序列由比其天然启动子更强的启动子控制。在一些实施方案中,编码甲酸盐输出蛋白的一个或多个基因序列由组成型启动子控制。
在另一个实施方案中,启动子是诱导型启动子。诱导型启动子在中有更详细的描述。
在一个实施方案中,编码甲酸盐输出蛋白的一个或多个基因序列位于细菌细胞中的质粒上。在另一个实施方案中,编码甲酸盐输出蛋白的一个或多个基因序列位于细菌细胞的染色体中。在另一个实施方案中,编码甲酸盐输出蛋白的一个或多个基因序列的天然拷贝位于细菌细胞的染色体中,并且编码来自不同细菌物种的甲酸盐输出蛋白的至少一个基因的拷贝位于细菌细胞中的质粒上。在又另一个实施方案中,编码甲酸盐输出蛋白的一个或多个基因序列的天然拷贝位于细菌细胞中的质粒上,并且编码来自不同细菌物种的甲酸盐输出蛋白的至少一个基因的拷贝位于细菌细胞中的质粒上。在又另一个实施方案中,编码甲酸盐输出蛋白的一个或多个基因序列的天然拷贝位于细菌细胞的染色体中,并且编码来自不同细菌物种的甲酸盐输出蛋白的一个或多个基因序列的拷贝位于细菌细胞的染色体中。
在一些实施方案中,细菌细胞中编码输出蛋白的至少一个天然基因未被修饰,并且天然输出蛋白的一个或多个附加拷贝被插入基因组中。在一个实施方案中,插入基因组中的一个或多个附加拷贝的天然输出蛋白处于控制编码草酸分解代谢酶的至少一个基因的表达的相同诱导型启动子(例如FNR响应性启动子)或与控制至少一种草酸分解代谢酶的表达的诱导型启动子不同的诱导型启动子、或组成型启动子的控制下。在替代性实施方案中,编码输出蛋白的至少一个天然基因未被修饰,并且来自不同细菌物种的输出蛋白的一个或多个附加拷贝被插入细菌细胞的基因组中。在一个实施方案中,插入细菌细胞基因组中的一个或多个附加拷贝的输出蛋白处于控制编码草酸分解代谢酶的至少一个基因的表达的相同诱导型启动子(例如FNR响应性启动子)或与控制编码至少一种草酸分解代谢酶的至少一个基因表达的诱导型启动子不同的诱导型启动子、或组成型启动子的控制下。
在一个实施方案中,当甲酸盐输出蛋白在工程化细菌细胞中表达时,与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比,当输出蛋白被表达时细菌细胞将10%更多的甲酸盐输出到细菌细胞之外。在另一个实施方案中,当甲酸盐输出蛋白在工程化细菌细胞中表达时,与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比,当输出蛋白被表达时,细菌细胞将20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%更多的甲酸盐输出到细菌细胞之外。在又另一个实施方案中,当甲酸盐输出蛋白在工程化细菌细胞中表达时,与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比,当输出蛋白被表达时细菌细胞将两倍更多的甲酸盐输出到细胞之外。在又另一个实施方案中,当甲酸盐输出蛋白在工程化细菌细胞中表达时,与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比,当输出蛋白被表达时,细菌细胞将3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍更多的甲酸盐输出到细胞之外。
在一个实施方案中,细菌细胞在草酸盐输出蛋白中包含突变或缺失,使得输出蛋白功能减弱或无功能。这种突变可能会阻止细胞内草酸盐被输出,并增加草酸盐的分解代谢。
在一些实施方案中,遗传工程化细菌还包含一种或多种内源性甲酸盐输出蛋白(例如FocA)的突变或缺失。在非限制性实例中,这种包含FocA突变的遗传工程化细菌包含编码甲酸盐:草酸盐反向转运蛋白(例如OxlT)的一个或多个基因序列。在非限制性实例中,一种或多种内源性甲酸盐输出蛋白被诱变或缺失,例如(例如FocA)以减少或阻止甲酸盐的输出,而不同时通过甲酸盐:草酸盐反向转运蛋白(例如OxlT)输入草酸盐。这样的突变可以增加细菌细胞中草酸盐的摄取和分解代谢。
在一些实施方案中,甲酸脱氢酶和/或甲酸裂解酶被突变或缺失,例如以阻止细菌细胞中甲酸盐的分解代谢。不希望受理论所束缚,此类突变可以增加细胞内甲酸盐浓度,允许通过甲酸盐草酸盐反向转运蛋白的流量增加,从而允许草酸盐摄取增加。
噬菌体缺失
在一些实施方案中,遗传工程化细菌包含一种或多种大肠埃希氏菌(E.coli)尼斯勒噬菌体,例如,噬菌体1、噬菌体2和噬菌体3。在一些实施方案中,遗传工程化细菌包含在噬菌体1、2或3中的一个或多个中的一个或多个修饰或突变。在一些实施方案中,遗传工程化细菌包含噬菌体3中的修饰或突变。此类突变或修饰的非限制性实例在2016年8月31日提交的国际专利申请PCT/US2018/038840(其内容以引用的方式整体并入本文)中有所描述。在一些实施方案中,所述突变包括缺失、插入、取代和倒位,并且位于或涵盖一个或多个噬菌体3基因。在一些实施方案中,所述一个或多个插入包括抗生素盒。在一些实施方案中,所述突变是缺失。在一个实施方案中,遗传工程化细菌包含一个或多个缺失,所述缺失位于或包含选自以下的一个或多个基因:ECOLIN_09965、ECOLIN_09970、ECOLIN_09975、ECOLIN_09980、ECOLIN_09985、ECOLIN_09990、ECOLIN_09995、ECOLIN_10000、ECOLIN_10005、ECOLIN_10010、ECOLIN_10015、ECOLIN_10020、ECOLIN_10025、ECOLIN_10030、ECOLIN_10035、ECOLIN_10040、ECOLIN_10045、ECOLIN_10050、ECOLIN_10055、ECOLIN_10065、ECOLIN_10070、ECOLIN_10075、ECOLIN_10080、ECOLIN_10085、ECOLIN_10090、ECOLIN_10095、ECOLIN_10100、ECOLIN_10105、ECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、ECOLIN_10170、ECOLIN_10175、ECOLIN_10180、ECOLIN_10185、ECOLIN_10190、ECOLIN_10195、ECOLIN_10200、ECOLIN_10205、ECOLIN_10210、ECOLIN_10220、ECOLIN_10225、ECOLIN_10230、ECOLIN_10235、ECOLIN_10240、ECOLIN_10245、ECOLIN_10250、ECOLIN_10255、ECOLIN_10260、ECOLIN_10265、ECOLIN_10270、ECOLIN_10275、ECOLIN_10280、ECOLIN_10290、ECOLIN_10295、ECOLIN_10300、ECOLIN_10305、ECOLIN_10310、ECOLIN_10315、ECOLIN_10320、ECOLIN_10325、ECOLIN_10330、ECOLIN_10335、ECOLIN_10340和ECOLIN_10345。在一个实施方案中,遗传工程化细菌包含ECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、ECOLIN_10170和ECOLIN_10175中的一个或多个的完全或部分缺失。在一个具体实施方案中,所述缺失是ECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165和ECOLIN_10170的完全缺失以及ECOLIN_10175的部分缺失。在一个实施方案中,从噬菌体3基因组中缺失了SEQ ID NO:1064的序列。在一个实施方案中,从噬菌体3基因组中缺失了包含SEQ ID NO:1064的序列。
大肠杆菌素岛(也称为pks岛)
在一些实施方案中,工程微生物(例如工程化细菌)包含经修饰的pks岛(大肠杆菌素岛)。在2021年12月31日提交的国际专利申请PCT/US202I/061579中描述了非限制性实例,所述申请的内容以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中,与合适的对照(例如,在相同菌株或亚型的未修饰细菌中的天然pks岛)相比,工程化微生物(例如工程化细菌)包含选自以下中的一种或多种的经修饰的clb序列:clbA、clbB、clbC、clbD、clbE、clbF、clbG、clbH、clbI、clbJ、clbK、clbL、clbM、clbN、clbO、clbP、clbQ、clbR和clbS基因序列。在一些实施方案中,与对照相比,经修饰的clb序列是插入、取代和/或缺失。在一些实施方案中,经修饰的clb序列是clb岛的缺失,例如clbA、clbB、clbC、clbD、clbE、clbF、clbG、clbH、clbI、clbJ、clbK、clbL、clbM、clbN,clbO、clbP,clbQ、clbR和clbS的缺失。在一个实施方案中,大肠杆菌素缺失是除clbS基因之外的整个岛,例如,clbA、clbB、clbC、clbD、clbE、clbF、clbG、clbH、clbI、clbJ、clbK、clbL、clbM、clbN、clbO、clbP、clbQ和clbR的缺失。
在一些实施方案中,经修饰的内源性大肠杆菌素岛包含一种或多种选自以下的经修饰的clb序列:clbA(SEQ ID NO:1065)、clbB(SEQ ID NO:1066)、clbC(SEQ ID NO:1067)、clbD(SEQ ID NO:1068)、clbE(SEQ ID NO:1069)、clbF(SEQ ID NO:1070)、clbG(SEQ IDNO:1071)、clbH(SEQ ID NO:1072)、clbI(SEQ ID NO:1073)、clbJ(SEQ ID NO:1074)、clbK(SEQ ID NO:1075)、clbL(SEQ ID NO:1076)、clbM(SEQ ID NO:1077)、clbN(SEQ ID NO:1078)、clbO(SEQ ID NO:1079)、clbP(SEQ ID NO:1080)、clbQ(SEQ ID NO:1081)、clbR(SEQID NO:1082)或clbS(SEQ ID NO:1803)基因。在一些实施方案中,经修饰的内源性大肠杆菌素岛包含以下的缺失:clbA(SEQ ID NO:1065)、clbB(SEQ ID NO:1066)、clbC(SEQ ID NO:1067)、clbD(SEQ ID NO:1068)、clbE(SEQ ID NO:1069)、clbF(SEQ ID NO:1070)、clbG(SEQID NO:1071)、clbH(SEQ ID NO:1072)、clbI(SEQ ID NO:1073)、clbJ(SEQ ID NO:1074)、clbK(SEQ ID NO:1075)、clbL(SEQ ID NO:1076)、clbM(SEQ ID NO:1077)、clbN(SEQ IDNO:1078)、clbO(SEQ ID NO:1079)、clbP(SEQ ID NO:1080)、clbQ(SEQ ID NO:1081)和clbR(SEQ ID NO:1082)。
诱导型启动子
在一些实施方案中,细菌细胞包含携带编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒的稳定维持的质粒或染色体,所述一种或多种草酸分解代谢酶例如选自甲酰辅酶A:草酸辅酶A转移酶(例如frc(来自产甲酸草酸杆菌)、草酰辅酶A合成酶(例如ScAAE3(来自酿酒酵母))、草酰辅酶A脱羧酶(例如选自oxc(来自产甲酸草酸杆菌))、和/或乙酰辅酶A:草酸辅酶A转移酶(例如YfdE(来自大肠埃希氏菌))基因,使得所述草酸分解代谢酶可以在宿主细胞中表达,并且所述宿主细胞能够在体外(例如在培养基中)和/或在体内(例如在肠道中)存活和/或生长。在一些实施方案中,细菌细胞包含两种或更多种不同的草酸分解代谢酶,例如甲酰辅酶A:草酸辅酶A转移酶(例如,frc(来自产甲酸草酸杆菌))、草酰辅酶A合成酶(例如,ScAAE3(来自酿酒酵母))、草酰辅酶A脱羧酶(例如,oxc(来自产甲酸草酸杆菌))、和/或乙酰辅酶A:草酸辅酶A转移酶(例如,YfdE(来自大肠埃希氏菌))基因。在一些实施方案中,遗传工程化细菌包含多个拷贝的相同草酸分解代谢酶基因和/或基因盒。在一些实施方案中,遗传工程化细菌包含多个拷贝的不同草酸分解代谢酶基因。在一些实施方案中,编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒存在于质粒上,并且与直接或间接诱导型启动子可操作地连接。在一些实施方案中,编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒存在于质粒上,并且与在低氧或厌氧条件下诱导的启动子可操作地连接。在一些实施方案中,编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒存在于染色体上,并且与直接或间接诱导型启动子可操作地连接。在一些实施方案中,编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒存在于染色体中,并且与在低氧或厌氧条件下诱导的启动子可操作地连接。在一些实施方案中,编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒存在于质粒上,并且与通过暴露于四环素或阿拉伯糖诱导的启动子可操作地连接。
在一些实施方案中,细菌细胞包含携带基因和/或基因盒的稳定维持的质粒或染色体,所述基因和/或基因盒编码一种或多种草酸盐转运蛋白(例如来自产甲酸草酸杆菌的OxlT),使得所述转运蛋白(例如来自产甲酸草酸杆菌的OxlT)可以在宿主细胞中表达,并且宿主细胞能够在体外(例如在培养基中)和/或在体内(例如在肠道中)存活和/或生长。在一些实施方案中,细菌细胞包含两个或更多个不同拷贝的编码一种或多种草酸盐转运蛋白(例如来自产甲酸草酸杆菌的OxlT)的基因和/或基因盒。在一些实施方案中,遗传工程化细菌包含多个拷贝的编码一种或多种草酸盐转运蛋白(例如来自产甲酸草酸杆菌的OxlT)的相同基因和/或基因盒。在一些实施方案中,编码一种或多种草酸盐转运蛋白(例如来自产甲酸草酸杆菌的OxlT)的至少一个基因和/或基因盒存在于质粒上,并且与直接或间接诱导型启动子可操作地连接。在一些实施方案中,编码一种或多种草酸盐转运蛋白(例如来自产甲酸草酸杆菌的OxlT)的基因和/或基因盒存在于质粒上,并且与在低氧或厌氧条件下诱导的启动子可操作地连接。在一些实施方案中,编码一种或多种草酸盐转运蛋白(例如来自产甲酸草酸杆菌的OxlT)的基因和/或基因盒存在于染色体上,并且与直接或间接诱导型启动子可操作地连接。在一些实施方案中,编码一种或多种草酸盐转运蛋白(例如来自产甲酸草酸杆菌的OxlT)的基因和/或基因盒存在于染色体中,并且与在低氧或厌氧条件下诱导的启动子可操作地连接。在一些实施方案中,编码一种或多种草酸盐转运蛋白(例如来自产甲酸草酸杆菌的OxlT)的基因和/或基因盒存在于质粒上,并且与通过暴露于四环素诱导的启动子可操作地连接。
在一些实施方案中,与编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒可操作地连接的启动子和与编码一种或多种草酸盐转运蛋白的基因和/或基因盒可操作地连接的启动子(例如来自产甲酸草酸杆菌的OxlT)被外源环境条件直接诱导。在一些实施方案中,与编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒可操作地连接的启动子和与编码一种或多种草酸盐转运蛋白的基因和/或基因盒可操作地连接的启动子(例如来自产甲酸草酸杆菌的OxlT)被外源环境条件间接诱导。在一些实施方案中,启动子由对哺乳动物肠道特异的外源环境条件直接或间接诱导。在一些实施方案中,启动子由对哺乳动物小肠特异的外源环境条件直接或间接诱导。在一些实施方案中,启动子由低氧或厌氧条件诸如哺乳动物肠道环境直接或间接诱导。在一些实施方案中,启动子由对哺乳动物肠道特异的分子或代谢物(例如丙酸盐)直接或间接诱导。在一些实施方案中,启动子由与细菌细胞共同施用的分子直接或间接诱导。
氧依赖性调节
在某些实施方案中,细菌细胞包含编码在延胡索酸和硝酸还原酶调节因子(FNR)启动子的控制下表达的一种或多种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒,所述一种或多种草酸分解代谢酶例如选自甲酰辅酶A:草酸辅酶A转移酶(例如frc(来自产甲酸草酸杆菌))、草酰辅酶A合成酶(例如ScAAE3(来自酿酒酵母))、草酰辅酶A脱羧酶(例如oxc(来自产甲酸草酸杆菌))、和/或乙酰辅酶A:草酸辅酶A转移酶(例如YfdE(来自大肠埃等氏菌))。在某些实施方案中,细菌细胞包含编码在延胡索酸和硝酸还原酶调节因子(FNR)启动子的控制下表达的一种或多种草酸盐转运蛋白(例如来自产甲酸草酸杆菌的OxlT)的基因和/或基因盒。在大肠埃希氏菌中,FNR是控制有氧代谢向无氧代谢转换的主要转录激活因子(Unden等人,1997)。在厌氧状态下,FNR二聚化为活性DNA结合蛋白,其激活数百个负责适应厌氧生长的基因。在有氧状态下,FNR被氧气阻止二聚化并且是无活性的。
FNR响应性启动子包括但不限于下表中列出的FNR响应性启动子。加下划线的序列是预测的核糖体结合位点,并且粗体的序列是用于克隆的限制性位点。
表5.FNR响应性启动子
FNR响应性启动子 | SEQ ID NO |
SEQ ID NO:13 | |
SEQ ID NO:14 | |
SEQ ID NO:15 | |
SEQ ID NO:16 | |
SEQ ID NO:17 |
在一个实施方案中,FNR响应性启动子包含SEQ ID NO:13。在一个实施方案中,FNR响应性启动子包含SEQ ID NO:14。在另一个实施方案中,FNR响应性启动子包含SEQ ID NO:15。在另一个实施方案中,FNR响应性启动子包含SEQ ID NO:16。在另一个实施方案中,FNR响应性启动子包含SEQ ID NO:17。附加FNR响应性启动子如下表6所示。
表6.FNR启动子序列
在一个实施方案中,FNR响应性启动子包含SEQ ID NO:18。在一个实施方案中,FNR响应性启动子包含SEQ ID NO:19。在另一个实施方案中,FNR响应性启动子包含SEQ ID NO:20。在另一个实施方案中,FNR响应性启动子包含SEQ ID NO:21。在另一个实施方案中,FNR响应性启动子包含SEQ ID NO:22。在一个实施方案中,FNR响应性启动子包含SEQ ID NO:23。在一个实施方案中,FNR响应性启动子包含SEQ ID NO:24。在另一个实施方案中,FNR响应性启动子包含SEQ ID NO:25。在另一个实施方案中,FNR响应性启动子包含SEQ ID NO:26。在另一个实施方案中,FNR响应性启动子包含SEQ ID NO:27。在另一个实施方案中,FNR响应性启动子包含SEQ ID NO:28。在另一个实施方案中,FNR响应性启动子包含SEQ ID NO:29。
在一些实施方案中,多个不同的FNR核酸序列被插入遗传工程化细菌中。在替代性实施方案中,遗传工程化细菌包含编码在替代性氧水平依赖性启动子(例如,DNR(Trunk等人,2010)或ANR(Ray等人,1997))的控制下表达的一种或多种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒,所述一种或多种草酸分解代谢酶例如选自甲酰辅酶A:草酸辅酶A转移酶(例如Frc(来自产甲酸草酸杆菌))、草酰辅酶A合成酶(例如ScAAE3(来自酿酒酵母))、草酰辅酶A脱羧酶(例如oxc(来自产甲酸草酸杆菌))、和/或乙酰辅酶A:草酸辅酶A转移酶(例如YfdE(来自大肠埃希氏菌))或本文公开的其他酶。在替代性实施方案中,遗传工程化细菌包含在替代性氧水平依赖性启动子(例如,DNR(Trunk等人,2010)或ANR(Ray等人,1997))的控制下表达的编码一种或多种草酸盐转运蛋白(例如来自产甲酸草酸杆菌的OxlT)的基因和/或基因盒。在这些实施方案中,草酸盐和/或其代谢物的分解代谢特别在低氧或厌氧环境中(例如在肠道中)被激活。在一些实施方案中,通过本领域已知的方法(例如,通过优化核糖体结合位点和/或增加mRNA稳定性)进一步优化基因表达。在一个实施方案中,哺乳动物肠道是人类哺乳动物肠道。
在一些实施方案中,细菌细胞包含氧水平依赖性转录调节因子(例如FNR、ANR或DNR)、以及来自不同细菌物种的相应启动子。与相同条件下细菌中的天然基因和启动子相比,异源氧水平依赖性转录调节因子和启动子在低氧或厌氧环境中增加与所述启动子可操作地连接的基因(例如,编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒和/或编码一种或多种草酸盐转运蛋白(例如来自产甲酸草酸杆菌的OxlT))的基因和/或基因盒的转录。在某些实施方案中,非天然氧水平依赖性转录调节因子是来自淋病奈瑟氏菌(N.gonorrhoeae)的FNR蛋白(参见例如,Isabella等人,2011)。在一些实施方案中,相应的野生型转录调节因子保持完整,并且保留了野生型活性。在替代性实施方案中,相应的野生型转录调节因子被缺失或突变,以降低或消除野生型活性。
在一些实施方案中,遗传工程化细菌包含野生型氧水平依赖性转录调节因子(例如FNR、ANR或DNR)以及相对于来自相同亚型的细菌的野生型启动子而言发生突变的相应启动子。与相同条件下的野生型启动子相比,突变的启动子增强了与野生型转录调节因子的结合,并且增加了与所述启动子可操作地连接的基因(例如,编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒和/或编码一种或多种草酸盐转运蛋白(例如来自产甲酸草酸杆菌的OxlT)的基因和/或基因盒)的转录。在一些实施方案中,遗传工程化细菌包含野生型氧水平依赖性启动子(例如,FNR、ANR或DNR启动子)以及相对于来自相同亚型的细菌的野生型转录调节因子而言发生突变的相应转录调节因子。与相同条件下的野生型转录调节因子相比,突变的转录调节因子增强了与野生型启动子的结合,并且增加了与所述启动子可操作地连接的基因(例如,编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒和/或编码一种或多种草酸盐转运蛋白(例如来自产甲酸草酸杆菌的OxlT)的基因和/或基因盒)的转录。在某些实施方案中,突变体氧水平依赖性转录调节因子是包含增强二聚化和FNR活性的氨基酸取代的FNR蛋白(参见例如,Moore等人,2006)。
在一些实施方案中,本文公开的细菌细胞包含多个拷贝的编码感知氧水平的转录调节因子的内源基因,例如FNR基因。在一些实施方案中,编码感知氧水平的转录调节因子的基因存在于质粒上。在一些实施方案中,编码感知氧水平的转录调节因子的基因和编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒存在于不同的质粒上。在一些实施方案中,编码感知氧水平的转录调节因子的基因和编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒和/或编码草酸盐转运蛋白的基因存在于不同的质粒上。在一些实施方案中,编码感知氧水平的转录调节因子的基因和编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒和/或编码一种或多种草酸盐转运蛋白的基因和/或基因盒存在于同一质粒上。
在一些实施方案中,编码感知氧水平的转录调节因子的基因存在于染色体上。在一些实施方案中,编码感知氧水平的转录调节因子的基因和编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒和/或编码一种或多种草酸盐转运蛋白的基因和/或基因盒存在于不同的染色体上。在一些实施方案中,编码感知氧水平的转录调节因子的基因和编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒和/或编码一种或多种草酸盐转运蛋白的基因和/或基因盒存在于同一染色体上。在一些情况下,在诱导型启动子的控制下表达感知氧水平的转录调节因子以增强表达稳定性可能是有利的。在一些实施方案中,转录调节因子的表达由与控制编码一种或多种草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白的基因和/或基因盒表达的启动子不同的启动子控制。在一些实施方案中,转录调节因子的表达由控制草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白表达的相同启动子控制。在一些实施方案中,转录调节因子和草酸分解代谢酶从启动子区域差异地转录。
RNS依赖性调节
在一些实施方案中,遗传工程化细菌包含编码在诱导型启动子的控制下表达的一种或多种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒。在一些实施方案中,表达一种或多种草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白的遗传工程化细菌处于由炎症条件激活的启动子的控制下。在一个实施方案中,用于产生草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白的基因和/或基因盒在炎症环境中被激活的炎症依赖性启动子(例如活性氮物质或RNS启动子)的控制下表达。
如本文所用,“活性氮物质”和“RNS”可互换使用,指衍生自分子氮的高活性分子、离子和/或自由基。RNS可以导致有害的细胞效应,诸如硝化应激(nitrosative stress)。RNS包括但不限于一氧化氮(NO·)、过氧亚硝酸盐或过氧亚硝酸根阴离子(ONOO-)、二氧化氮(·NO2)、三氧化二氮(N2O3)、过氧亚硝酸(ONOOH)和硝基过氧碳酸盐(ONOOCO2-)(未配对电子表示为·)。细菌已经进化出能够感知RNS水平的转录因子。不同的RNS信号传导途径由不同的RNS水平触发,并且以不同的动力学发生。
感知RNS的转录因子及其相应的RNS响应性基因、启动子和/或调节区的实例包括但不限于表7中所示的那些。
表7.感知RNS的转录因子和RNS响应性基因的实例
在一些实施方案中,本发明的遗传工程化细菌包含由能够感知至少一种活性氮物质的转录因子直接或间接控制的可调的调节区。可调的调节区与能够直接或间接驱动一种或多种草酸分解代谢酶、草酸盐转运蛋白表达的基因和/或基因盒可操作地连接,从而相对于RNS水平控制草酸分解代谢酶、草酸盐转运蛋白的表达。例如,可调的调节区是RNS诱导调节区,并且有效负载是一种或多种草酸分解代谢酶、草酸盐转运蛋白,诸如本文提供的任何草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白;当RNS存在于例如炎症组织中时,感知RNS的转录因子结合和/或激活调节区,并且驱动草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白基因或基因盒的表达。随后,当炎症得到缓解时,RNS水平降低,并且草酸分解代谢酶和草酸盐转运蛋白的产生减少或消除。
ROS依赖性调节
在一些实施方案中,遗传工程化细菌包含在诱导型启动子的控制下表达的用于产生一种或多种草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白的基因和/或基因盒。在一些实施方案中,表达一种或多种草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白的遗传工程化细菌处于由细胞损伤条件激活的启动子的控制下。在一个实施方案中,用于产生一种或多种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒在存在细胞或组织损伤的环境中被激活的细胞损伤依赖性启动子(例如活性氧物质或ROS启动子)的控制下表达。
如本文所用,“活性氧物质”和“ROS”可互换使用,是指衍生自分子氧的高活性分子、离子和/或自由基。ROS可以作为有氧呼吸或金属催化氧化的副产物产生,并且可能引起有害的细胞效应,诸如氧化损伤。ROS包括但不限于过氧化氢(H2O2)、有机过氧化物(ROOH)、羟基离子(OH-)、羟基自由基(·OH)、超氧化物或超氧阴离子(·O2-)、单线态氧(1O2)、臭氧(O3)、碳酸根、过氧化物或过氧自由基(·O2-2)、次氯酸(HOCl)、次氯酸根离子(OCl-)、次氯酸钠(NaOCl)、一氧化氮(NO·)和过氧亚硝酸根或过氧亚硝酸根阴离子(ONOO-)(未配对电子表示为·)。细菌已经进化出能够感知ROS水平的转录因子。不同的ROS信号传导途径由不同的ROS水平触发,并且以不同的动力学发生(Marinho等人,2014)。
如本文所用,“ROS诱导调节区”是指一种或多种感知ROS的转录因子能够结合的核酸序列,其中相应转录因子的结合和/或激活会激活下游基因表达;在ROS的存在下,转录因子结合和/或激活调节区。在一些实施方案中,ROS诱导调节区包含启动子序列。在一些实施方案中,转录因子感知ROS并随后与ROS诱导调节区结合,从而激活下游基因表达。在替代性实施方案中,在不存在ROS的情况下,转录因子与ROS诱导调节区结合;在ROS的存在下,转录因子经历构象变化,从而激活下游基因表达。ROS诱导调节区可以与一个或多个基因序列(例如编码一种或多种草酸分解代谢酶的一个或多个序列)可操作地连接。例如,在ROS的存在下,转录因子(例如OxyR)感知ROS并激活相应的ROS诱导调节区,从而驱动可操作地连接的一个或多个基因序列的表达。因此,ROS诱导基因或基因盒的表达。
感知ROS的转录因子及其相应的ROS响应性基因、启动子和/或调节区的实例包括但不限于表8中所示的那些。
表8.感知ROS的转录因子和ROS响应性基因的实例
在一些实施方案中,遗传工程化细菌包含由能够感知至少一种活性氧物质的转录因子直接或间接控制的可调的调节区。可调的调节区与能够直接或间接驱动草酸分解代谢酶的表达的基因和/或基因盒可操作地连接,从而相对于ROS水平控制草酸分解代谢酶的表达。例如,可调的调节区是ROS诱导调节区,并且分子是草酸分解代谢酶;当ROS存在于例如炎症组织中时,感知ROS的转录因子结合和/或激活调节区并驱动一种或多种草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白的基因序列和/或基因盒序列的表达,从而产生草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白。随后,当炎症得到缓解时,ROS水平降低,并且草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白的产生减少或消除。
几个示例性OxyR调节性调节区的核酸序列如表5中所示。OxyR结合位点以下划线和粗体表示。在一些实施方案中,遗传工程化细菌包含与SEQ ID NO:46、47、48或49的DNA序列或其功能片段至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或至少约99%同源的核酸序列。
表9.示例性OxyR调节性调节区的核苷酸序列
调节序列 | SEQ ID NO |
katG | SEQ ID NO:30 |
dps | SEQ ID NO:31 |
ahpC | SEQ ID NO:32 |
oxyS | SEQ ID NO:33 |
在一些实施方案中,本发明的遗传工程化细菌包含编码感知ROS的转录因子的基因(例如oxyR基因),其由其天然启动子、诱导型启动子、比天然启动子更强的启动子(例如GlnRS启动子或P(Bla)启动子)或组成型启动子控制。在一些情况下,在诱导型启动子的控制下表达感知ROS的转录因子以增强表达稳定性可能是有利的。在一些实施方案中,感知ROS的转录因子的表达由与控制治疗性分子表达的启动子不同的启动子控制。在一些实施方案中,感知ROS的转录因子的表达由控制治疗性分子表达的同一启动子控制。在一些实施方案中,感知ROS的转录因子和治疗性分子从启动子区差异地转录。
温度依赖性调节
在一些情况下,温度调节器可能是有利的,因为无需使用外部化学物质或专门的培养基就能进行强转录控制。使用突变体cI857阻遏物和pL和/或pR噬菌体λ启动子进行的温度调节蛋白表达已被用于使重组细菌菌株工程化。例如,克隆在λ启动子下游的感兴趣基因可以通过噬菌体λ的突变体不耐热cI857阻遏物有效地调节。在低于37℃的温度下,cI857与pR启动子的oL或oR区域结合,并且抑制通过RNA聚合酶的转录。在更高的温度下,功能性cI857二聚体不稳定,消除与oL或oR DNA序列的结合,并且启动mRNA转录。在某些情况下,降低、减少或停止一种或多种感兴趣蛋白质的产生可能是有利的。这可以在温度调节系统中通过在温度调节系统没有最佳活性的温度下使细菌菌株生长来实现。然后,可以根据需要通过将温度改变为所述系统更具活性或具有最佳活性的温度来诱导温度调节的表达。
例如,温度调节启动子可以在培养物中被诱导,例如在烧瓶、发酵罐或其他合适的培养容器中生长,例如在细胞生长、细胞扩增、发酵、回收、纯化、配制和/或生产期间使用。包含间接或直接与温度敏感性系统或启动子可操作地连接的基因序列或基因盒的细菌可以例如被37℃和42℃之间的温度诱导。在一些情况下,培养物可以在有氧条件下生长。可替代地,培养物在厌氧条件下生长。
在一些实施方案中,本文所述的细菌包含直接或间接与温度调节启动子可操作地连接的一个或多个基因序列或基因盒。在一些实施方案中,在体内施用之前在菌株的生长、制备或制造期间在体外诱导所述基因序列或基因盒。在一些实施方案中,基因序列在体内施用时或期间被诱导。在一些实施方案中,基因序列在体内施用之前以及在体内施用之时或期间在菌株的体外生长、制备或制造期间被诱导。在一些实施方案中,遗传工程化细菌还包含编码能够结合温度敏感性启动子的转录因子的基因序列。在一些实施方案中,转录因子是转录的阻遏物。
在一个实施方案中,温度调节启动子可操作地连接到构建体上,所述构建体具有编码一种或多种感兴趣的蛋白质的基因序列或基因盒以及第二启动子(例如,第二组成型或诱导型启动子)。在一些实施方案中,两个启动子定位于构建体附近并驱动其表达,其中温度调节启动子在第一组外源条件下被诱导,并且第二个启动子在第二组外源条件下被诱导。在非限制性实例中,所述第一和第二条件可以是两个连续的培养条件(即,在烧瓶、发酵罐或其他合适的培养容器中制备培养物期间,例如,温度调节和阿拉伯糖或IPTG)。在另一个非限制性实例中,第一诱导条件可以是培养条件,例如,许可温度,并且第二诱导条件可以是体内条件。此类体内条件包括低氧、微需氧或厌氧条件,存在肠道代谢物,和/或与细菌菌株联合施用的代谢物。在一些实施方案中,一种或多种温度调节启动子与驱动相同基因序列表达的氧调节启动子(例如FNR)组合驱动一种或多种感兴趣的蛋白质的表达。
在一些实施方案中,温度调节启动子驱动一种或多种感兴趣的蛋白质从本文所述的低拷贝质粒或高拷贝质粒或生物安全系统质粒中表达。在一些实施方案中,温度调节启动子驱动一种或多种感兴趣的蛋白质从整合到细菌染色体中的构建体的表达。本文描述了示例性的插入位点。
在一些实施方案中,遗传工程化细菌包含与SEQ ID NO:209的任何序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%,96%、97%、98%或99%同一性的一个或多个基因序列。在一些实施方案中,遗传工程化细菌包含与SEQ ID NO:213的任何序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%,96%、97%、98%或99%同一性的一个或多个基因序列。在一些实施方案中,遗传工程化细菌包含与SEQ ID NO:216的任何序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%,96%、97%、98%或99%同一性的一个或多个基因序列。在一些实施方案中,温度调节构建体还包含编码突变体cI857阻遏物的基因,其从与一种或多种一种或多种感兴趣的蛋白质相同的启动子差异地转录。在一些实施方案中,遗传工程化细菌包含与SEQID NO:210的任何序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%,96%、97%、98%或99%同一性的一个或多个基因序列。在一些实施方案中,遗传工程化细菌包含一个或多个编码多肽的基因序列,所述多肽与由SEQ ID NO:212的任何序列编码的多肽具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%,96%、97%、98%或99%的同一性。在一些实施方案中,温度调节构建体还包含编码突变体cI38阻遏物的基因,其从与一种或多种一种或多种感兴趣的蛋白质相同的启动子差异地转录。在一些实施方案中,遗传工程化细菌包含与SEQ ID NO:214的任何序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%,96%、97%、98%或99%同一性的一种或多种基因序列。在一些实施方案中,遗传工程化细菌包含一个或多个编码多肽的基因序列,所述多肽与由SEQ ID NO:215的任何序列编码的多肽具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%,96%、97%、98%或99%的同一性。
SEQ ID NO:209、210和212—16如表10所示。
表10:诱导型启动子构建体序列和相关元件
必需基因和营养缺陷型
如本文所用,术语“必需基因”是指细胞生长和/或存活所必需的基因。细菌必需基因是本领域普通技术人员熟知的,并且可以通过基因的定向缺失和/或随机诱变和筛选来鉴定(参见例如,Zhang和Lin,2009,DEG 5.0,a database of essential genes in bothprokaryotes and eukaryotes,Nucl.Acids Res.,37:D455-D458;以及Gerdes等人,Essential genes on metabolic maps,Curr.Opin.Biotechnol.,17(5):448-456,其中每一篇参考文献的全部内容以引用的方式明确地并入本文)。
“必需基因”可能依赖于有机体生活的场景和环境。例如,必需基因的突变、修饰或切除可能导致本公开的重组细菌变成营养缺陷型。营养缺陷型修饰旨在导致细菌在没有外源添加的生存或生长所必需的营养素的情况下死亡,因为它们缺乏产生所述必需营养素所必需的基因。
营养缺陷型修饰旨在导致细菌在没有外源添加的生存或生长所必需的营养素的情况下死亡,因为它们缺乏产生所述必需营养素所必需的基因。在一些实施方案中,本文所述的任何遗传工程化细菌还包含细胞存活和/或生长所必需的一个或多个基因中的缺失或突变。
在一些实施方案中,细菌细胞在编码草酸生物合成基因的一个或多个内源基因中包含遗传突变,其中所述遗传突变减少细菌细胞中草酸盐的生物合成。
在一个实施方案中,必需基因是寡核苷酸合成基因,例如thyA。在另一个实施方案中,必需基因是细胞壁合成基因,例如dapA。在又另一个实施方案中,必需基因是氨基酸基因,例如serA或MetA。可以靶向细胞存活和/或生长所必需的任何基因,包括但不限于cysE、glnA、ilvD、leuB、lysA、serA、metA、glyA、hisB、ilvA、pheA、proA、thrC、trpC、tyrA、thyA、uraA、dapA、dapB、dapD、dapE、dapF、flhD、metB、metC、proAB和thil,只要相应的野生型基因产物不在细菌中产生即可。
表11列出了可以被破坏或缺失以产生营养缺陷型菌株的示例性细菌基因。这些包括但不限于寡核苷酸合成、氨基酸合成和细胞壁合成所必需的基因。
表11.可用于产生营养缺陷型的细菌基因的非限制性实例
表12显示了各种氨基酸营养缺陷型在小鼠肠道中的存活,如管饲后24小时和48小时所检测的。这些营养缺陷型是使用大肠埃希氏菌非尼氏菌株BW25113产生的。
表12.氨基酸营养缺陷型在小鼠肠道中的存活
例如,胸腺嘧啶是细菌细胞生长所必需的核酸;没有它时,细菌会经历细胞死亡。thyA基因编码胸苷酸合成酶,其是通过将dUMP转化为dTMP来催化胸腺嘧啶合成的第一步的酶(Sat等人,2003)。在一些实施方案中,本公开的细菌细胞是thyA营养缺陷型,其中thyA基因被缺失和/或被不相关的基因替代。thyA营养缺陷型仅在存在足够量的胸腺嘧啶时(例如,通过在体外将胸腺嘧啶添加到生长培养基中,或者在体内人类肠道中天然存在高水平胸腺嘧啶的情况下)才能够生长。在一些实施方案中,本公开的细菌细胞是当细菌存在于哺乳动物肠道中时得到补充的基因的营养缺陷型。在没有足够量的胸腺嘧啶时,thyA营养缺陷型就会死亡。在一些实施方案中,将营养缺陷型修饰用于确保细菌细胞在不存在营养缺陷型基因产物的情况下(例如,在肠道外部)不能存活。
二氨基庚二酸(DAP)是在赖氨酸生物合成途径中合成的氨基酸,并且是细菌细胞壁生长所必需的(Meadow等人,1959;Clarkson等人,1971)。在一些实施方案中,本文所述的任何遗传工程化细菌都是dapD营养缺陷型,其中dapD被缺失和/或被不相关的基因替代。只有当存在足够量的DAP时,例如通过在体外将DAP添加到生长培养基中,dapD营养缺陷型才能够生长。在没有足够量的DAP时,dapD营养缺陷型就会死亡。在一些实施方案中,将营养缺陷型修饰用于确保细菌细胞在不存在营养缺陷型基因产物的情况下(例如,在肠道外部)不能存活。
在其他实施方案中,本公开的遗传工程化细菌是uraA营养缺陷型,其中uraA被缺失和/或被不相关的基因替代。uraA基因编码UraA,一种促进嘧啶尿嘧啶的摄取和随后的分解代谢的膜结合转运蛋白(Andersen等人,1995)。只有当存在足够量的尿嘧啶时,例如通过在体外将尿嘧啶添加到生长培养基中,uraA营养缺陷型才能够生长。在没有足够量的尿嘧啶时,uraA营养缺陷型就会死亡。在一些实施方案中,将营养缺陷型修饰用于确保细菌在不存在营养缺陷型基因产物的情况下(例如,在肠道外部)不能存活。
在复杂的群落中,细菌共享DNA是可能的。在非常罕见的场景中,营养缺陷型细菌菌株可能从非营养缺陷型菌株得到DNA,其修复基因组缺失并永久拯救营养缺陷型。因此,工程化具有多于一种营养缺陷型的细菌菌株可以大大降低DNA转移发生足够多的次数以拯救营养缺陷型的可能性。在一些实施方案中,遗传工程化细菌包含细胞存活和/或生长所必需的两个或更多个基因的缺失或突变。
必需基因的其他实例包括但不限于yhbV、yagG、hemB、secD、secF、ribD、ribE、thiL、dxs、ispA、dnaX、adk、hemH、lpxH、cysS、fold、rplT、infC、thrS、nadE、gapA、yeaZ、aspS、argS、pgsA、yefM、metG、folE、yejM,gyrA、nrdA、nrdB、fo,C、accD、fabB、gltX,,igA、zipA、dapE、dapA、der、hisS、ispG、suhB、tadA、acpS、era、rnc、tsB、eno、pyrG、chpR、lgt、fbaA、pgk、yqgD、metK、yqgF、plsC、ygiT、pare、ribB、cca、ygjD、tdcF、yraL、yihA、ftsN、murI、murB、birA、secE、nusG、rplJ、rplL、rpoB、rpoC、ubiA、plsB、lexA、dnaB、ssb、alsK、groS、psd、orn、yjeE、rpsR、chpS、Ppa、valS、yjgP、yjgQ、dnaC、ribF、lspA、ispH、dapB、folA、imp、yabQ、ftsL、ftsI、murE、murF、mraY、murD、ftsW、murG、murC、ftsQ,ftsA、ftsZ、lpxC、secM、secA、can、folK、hemL、yadR、dapD、map、rpsB、infB,nusA、ftsH、obgE、rpmA、rplU、ispB、murA、yrbB、yrbK、yhbN、rpsI、rplM、degS、mmreD、mreC、mreB、accB、accC、yrdC、def、fmt、rplQ、rpoA、rpsD、rpsK、rpsM、entD、mrdB、mrdA、nadD、hlepB、rpoE、pssA、yfiO、rplS、trmD、fpsP、ffh、grpE、yfjB、csrA、ispF、ispD、rplW、rplD、rplC、rpsJ、fusA、rpsG、rpsL、trpS、yrfF、asd、rpoH、tsX、ftsE、ftsT、frr、dxr、ispU、rfaK、kdtA、coaD、rpmB、dfp、dut、gmk、spot、gyrB、dnaN、dnaA、rpmH、rnpA、yidC、tnaB、glmS、glnU、wzyE、hemD、hemC、yigP、ubiB、ubiD、hemG、secY、rplO、rpmD、rpsE、rplR、rplF、rpsH、rpsN、rplE、rplX、rplN、rpsQ、rpmC、rplP、rpsC、rplV、rpsS、rplB、cdsA、yaeL、yaeT、lpxD、fabZ、lpxA、lpxB、dnaE、accA、tilS、proS、yafF、tsf、pyrH、olA、rlpB、leuS、lnt、glnS、fldA、cydA、infA、cydC、ftsK、lolA、serS、rpsA、msbA、lpxK、kdsB、mukF、mukE、mukB、asnS、fabA、mviN、rne、yceQ、向bD、向bG、acpP、tmk、holB、lolC、lolD、lolE、purB、ymfK、minE、mind、pth、rsA、ispE、lolB、hemA、prfA、prmC、kdsA、topA、ribbA、fabI、racR、dicA、ydfB、tyrS、ribC、ydiL、pheT、pheS、yhhQ、bcsB、glyQ、yibJ、和gpsA。其他必需基因是本领域普通技术人员已知的。
在一些实施方案中,本公开的遗传工程化细菌是合成的配体依赖性必需基因(SLiDE)细菌细胞。SLiDE细菌细胞是在一个或多个必需基因中具有突变的合成营养缺陷型,其仅在特定配体的存在下生长(参见Lopez和Anderson“Synthetic Auxotrophs withLigand-Dependent Essential Genes for a BL21(DE3 Biosafety Strain,”ACSSynthetic Biology(2015)DOI:10.1021/acssynbio.5b00085,所述文献的全部内容以引用的方式明确并入本文)。
在一些实施方案中,SLiDE细菌细胞包含必需基因中的突变。在一些实施方案中,必需基因选自由以下组成的组:pheS、dnaN、tyrS、metG和adk。在一些实施方案中,必需基因是包含以下突变中的一个或多个的dnaN:H191N、R240C、I317S、F319V、L340T、V347I和S345C。在一些实施方案中,必需基因是包含突变H191N、R240C、I317S、F319V、L340T、V347I和S345C的dnaN。在一些实施方案中,必需基因是包含以下突变中的一个或多个的pheS:F125G、P183T、P184A、R186A和I188L。在一些实施方案中,必需基因是包含突变F125G、P183T、P184A、R186A和1188L的pheS。在一些实施方案中,必需基因是包含以下突变中的一个或多个的tyrS:L36V、C38A和F40G。在一些实施方案中,必需基因是包含突变L36V、C38A和F40G的tyrS。在一些实施方案中,必需基因是包含以下突变中的一个或多个的metG:E45Q、N47R、I49G和A51C。在一些实施方案中,必需基因是包含突变E45Q、N47R、I49G和A51C的metG。在一些实施方案中,必需基因是包含以下突变中的一个或多个的adk:I4L、L5I和L6G。在一些实施方案中,必需基因是包含突变I4L、L5I和L6G的adk。
在一些实施方案中,遗传工程化细菌由配体补充。在一些实施方案中,配体选自由以下组成的组:苯并噻唑、吲哚、2-氨基苯并噻唑、吲哚-3-丁酸、吲哚-3-乙酸和L-组氨酸甲酯。例如,在metG中包含突变(E45Q、N47R、I49G和A51C)的细菌细胞由苯并噻唑、吲哚、2-氨基苯并噻唑、吲哚-3-丁酸、吲哚-3-乙酸或L-组氨酸甲酯补充。在dnaN中包含突变(H191N、R240C、I317S、F319V、L340T、V347I和S345C)的细菌细胞由苯并噻唑、吲哚或2-氨基苯并噻唑补充。在pheS中包含突变(F125G、P183T、P184A、R186A和I188L)的细菌细胞由苯并噻唑或2-氨基苯并噻唑补充。在tyrS中包含突变(L36V、C38A和F40G)的细菌细胞由苯并噻唑或2-氨基苯并噻唑补充。在adk中包含突变(I4L、L5I和L6G)的细菌细胞由苯并噻唑或吲哚补充。
在一些实施方案中,遗传工程化细菌包含使其成为配体的营养缺陷型的多于一个突变的必需基因。在一些实施方案中,细菌细胞在两个必需基因中包含突变。例如,在一些实施方案中,细菌细胞在tyrS(L36V、C38A和F40G)和metG(E45Q、N47R、I49G和A51C)中包含突变。在其他实施方案中,细菌细胞在三个必需基因中包含突变。例如,在一些实施方案中,细菌细胞在tyrS(L36V、C38A和F40G)、metG(E45Q、N47R、I49G和A51C)和pheS(F125G、P183T、P184A、R186A和I188L)中包含突变。
在一些实施方案中,遗传工程化细菌是条件营养缺陷型,其必需基因使用本文所述的阿拉伯糖系统替代。
在一些实施方案中,本公开的遗传工程化细菌是营养缺陷型的,并且还包含杀灭开关回路,诸如本文所述的任何杀灭开关组分和系统。例如,重组细菌可以包含细胞存活和/或生长所必需的必需基因的缺失或突变,所述必需基因例如DNA合成基因(例如thyA)、细胞壁合成基因(例如dapA)和/或氨基酸基因(例如serA或MetA或ilvC),并且还可以包含由响应于环境条件和/或信号而表达的一种或多种转录激活因子(诸如所述的阿拉伯糖系统)调节或者由在感知外源环境条件和/或信号时表达的一种或多种重组酶(诸如本文所述的重组酶系统)调节的毒素基因。其他实施方案描述于Wright等人,“GeneGuard:A ModularPlasmid System Designed for Biosafety,”ACS Synthetic Biology(2015)4:307-16,所述文献的全部内容以引用的方式明确并入本文。在一些实施方案中,本公开的遗传工程化细菌是营养缺陷型,并且还包含杀灭开关回路(诸如本文所述的任何杀灭开关组分和系统)以及另一种生物安全系统(诸如条件性复制起点)(参见Wright等人,同上)。
分离的质粒
在其他实施方案中,本公开提供了分离的质粒,其包含与第一诱导型启动子可操作地连接的编码第一有效负载的第一核酸、以及与第二诱导型启动子可操作地连接的编码第二有效负载的第二核酸。在其他实施方案中,本公开提供了分离的质粒,其还包含与第三诱导型启动子可操作地连接的编码第三有效负载的第三核酸。在其他实施方案中,本公开提供了包含与诱导型启动子可操作地连接的编码四个、五个、六个或更多个有效负载的四个、五个、六个或更多个核酸的质粒。在这里描述的任何实施方案中,第一、第二、第三、第四、第五、第六等“有效负载”可以是草酸分解代谢酶、草酸盐转运蛋白或本文所述的其他序列。在一个实施方案中,编码第一有效负载的核酸和编码第二有效负载的核酸与第一诱导型启动子可操作地连接。在一个实施方案中,编码第一有效负载的核酸与第一诱导型启动子可操作地连接,并且编码第二有效负载的核酸与第二诱导型启动子可操作地连接。在一个实施方案中,第一诱导型启动子和第二诱导型启动子是同一诱导型启动子的独立拷贝。在另一个实施方案中,第一诱导型启动子和第二诱导型启动子是不同的诱导型启动子。在包含第三核酸的其他实施方案中,编码第三有效负载的核酸和编码第一和第二有效负载的核酸全部都与相同的诱导型启动子可操作地连接。在其他实施方案中,编码第一有效负载的核酸与第一诱导型启动子可操作地连接,编码第二有效负载的核酸与第二诱导型启动子可操作地连接,并且编码第三有效负载的核酸与第三诱导型启动子可操作地连接。在一些实施方案中,第一、第二和第三诱导型启动子是同一诱导型启动子的独立拷贝。在其他实施方案中,第一诱导型启动子、第二诱导型启动子和第三诱导型启动子是不同的诱导型启动子。在一些实施方案中,第一启动子、第二启动子和任选的第三启动子,或者第一启动子和第二启动子和任选的第三启动子各自被低氧或厌氧条件直接或间接诱导。在其他实施方案中,第一启动子、第二启动子和任选的第三启动子,或者第一启动子和第二启动子和任选的第三启动子各自是富马酸和硝酸还原调节剂(FNR)响应性启动子。在其他实施方案中,第一启动子、第二启动子和任选的第三启动子,或者第一启动子和第二启动子和任选的第三启动子各自是ROS诱导调节区。在其他实施方案中,第一启动子、第二启动子和任选的第三启动子,或者第一启动子和第二启动子和任选的第三启动子各自是RNS诱导调节区。
在一些实施方案中,编码一种或多种草酸分解代谢酶的异源基因和/或基因盒与组成型启动子可操作地连接。在一个实施方案中,组成型启动子是lac启动子。在另一个实施方案中,组成型启动子是Tet启动子。在另一个实施方案中,组成型启动子是组成型大肠埃希氏菌σ32启动子。在另一个实施方案中,组成型启动子是组成型大肠埃希氏菌σ70启动子。在另一个实施方案中,组成型启动子是组成型枯草芽施杆菌σA启动子。在另一个实施方案中,组成型启动子是组成型枯草芽孢杆菌σB启动子。在另一个实施方案中,组成型启动子是沙门氏菌启动子。在其他实施方案中,组成型启动子是噬菌体T7启动子。在其他实施方案中,组成型启动子是噬菌体SP6启动子。在任一上述实施方案中,质粒还包含编码草酸盐转运蛋白的异源基因和/或杀灭开关构建体,其可以与组成型启动子或诱导型启动子可操作地连接。
在一些实施方案中,分离的质粒包含与第一诱导型启动子可操作地连接的至少一个异源草酸分解代谢酶基因、与ParaBAD启动子可操作地连接的编码TetR蛋白的异源基因、与ParaC启动子可操作地连接的编码AraC的异源基因、与组成型启动子可操作地连接的编码抗毒素的异源基因、以及与PTetR启动子可操作地连接的编码毒素的异源基因。在另一个实施方案中,分离的质粒包含与第一诱导型启动子可操作地连接的编码一种或多种草酸分解代谢酶的至少一个异源基因和/或基因盒;与ParaBAD启动子可操作地连接的编码TetR蛋白和抗毒素的异源基因、与ParaC启动子可操作地连接的编码AraC的异源基因、以及与PTetR启动子可操作地连接的编码毒素的异源基因。
在一些实施方案中,编码一种或多种草酸分解代谢酶的第一核酸包含甲酰辅酶A:草酸辅酶A转移酶(例如,frc)基因。在一个实施方案中,frc基因来自产甲酸草酸杆菌。在一个实施方案中,frc基因与SEQ ID NO:1具有至少约90%的同一性。在另一个实施方案中,frc基因包含SEQ ID NO:1。在其他实施方案中,编码一种或多种草酸分解代谢酶的第一核酸包含草酸辅酶A连接酶(例如ScAAE3)基因。在一个实施方案中,ScAAE3基因来自酿酒酵母。在一个实施方案中,ScAAE3基因与SEQ ID NO:3具有至少约90%的同一性。在另一个实施方案中,ScAAE3基因包含SEQ ID NO:3。在其他实施方案中,编码一种或多种草酸分解代谢酶的第一核酸包含乙酰辅酶A:草酸辅酶A转移酶(例如,YfdE)基因。在一个实施方案中,YfdE基因来自大肠埃希氏菌。在一个实施方案中,YfdE基因与SEQ ID NO:4具有至少约90%的同一性。在另一个实施方案中,YfdE基因包含SEQ ID NO:4。
在一些实施方案中,编码一种或多种草酸分解代谢酶的第一核酸包含草酰辅酶A脱羧酶(例如oxc)基因。在一些实施方案中,frc和/或ScAAE3和/或YfdE基因与草酰辅酶A脱羧酶((例如oxc)基因共表达。在一个实施方案中,oxc基因来自产甲酸草酸杆菌。在一个实施方案中,oxc基因与SEQ ID NO:2具有至少约90%的同一性。在另一个实施方案中,oxc基因包含SEQ ID NO:2。
在一些实施方案中,编码草酸盐转运蛋白的第二核酸包含OxlT。在一个实施方案中,OxlT转运蛋白来自产甲酸草酸杆菌。在另一个实施方案中,OxlT转运蛋白与SEQ ID NO:11具有至少约90%的同一性。在另一个实施方案中,OxlT转运蛋白包含SEQ ID NO:11。
在一个实施方案中,质粒是高拷贝质粒。在另一个实施方案中,质粒是低拷贝质粒。
在另一个方面,本公开提供了包含本文所述的分离质粒的重组细菌细胞。在另一个实施方案中,本公开提供了包含重组细菌细胞的药物组合物。
在一个实施方案中,细菌细胞还包含编码草酸盐输出蛋白的内源基因中的遗传突变,其中所述遗传突变减少了草酸盐从细菌细胞的输出。
在一个实施方案中,细菌细胞还包含编码草酸盐生物合成基因的内源基因中的遗传突变,其中所述遗传突变减少细菌细胞中草酸盐的生物合成。
整合
在一些实施方案中,可以在一个或多个整合位点处将本公开的任何基因或基因盒整合到细菌染色体中。可以将基因(例如,草酸分解代谢基因、草酸盐转运蛋白基因和/或草酸盐结合蛋白基因)或基因盒(例如,包含草酸分解代谢基因和/或草酸盐转运蛋白基因的基因盒)的一个或多个拷贝整合到细菌染色体中。将多个拷贝的基因或基因盒整合到染色体中允许更大量地产生有效负载,例如一种或多种草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白基因和基因盒中的其他酶,并且还允许对表达水平进行微调。可替代地,除了治疗性基因或基因盒之外,可以在一个或多个不同的整合位点处将本文所述的不同回路(诸如任何杀灭开关回路)整合到细菌染色体中,以执行多种不同的功能。
图26描绘了SYNB8802的基因型。SYNB8802是一种经修饰的活益生菌菌株(大肠埃希氏菌尼斯勒1917[EcN]),其已被修饰用于通过消耗胃肠道内的草酸盐来治疗EH。显示了SYNB8802中基因组修饰位点的位置,kbp名称表示相对于0/5.4Mb参考标记的染色体位置。复制的染色体起点显示为红线(ori)。括号中斜体的基因名称指在插入基因周围的上游和下游基因。SYNB8802是通过利用人类共生微生物产甲酸草酸杆菌(Oxalobacterformigenes)的草酸盐降解能力工程化在EcN益生菌菌株中的草酸盐降解途径而开发的。已经对EcN的基因组进行了以下修饰以增强在肠道中发现的低氧条件下的草酸盐降解,同时通过胸苷营养缺陷型扩大生物容纳:(1)插入在厌氧诱导型启动子(PfnrS)和厌氧响应性转录激活因子FNR的调节控制下的一个源自产甲酸草酸杆菌的编码草酸盐/甲酸盐反向转运蛋白(OxlT)的基因。(2)插入编码在厌氧诱导型启动子(PfnrS)和厌氧响应性转录激活因子FNR的调节控制下的三个基因的一个操纵子。第一个基因是源自酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的草酰辅酶A合成酶(ScaaE3)。第二个基因是源自产甲酸草酸杆菌的草酸盐脱羧酶(OxdC)。第三个基因(frc)是源自产甲酸草酸杆菌的甲酰辅酶A转移酶。(缺失胸苷酸合酶(thyA)基因以产生胸苷营养缺陷型。(3)缺失胸苷酸合酶(thyA)基因以产生胸苷营养缺陷型。(4)失活内源性尼斯勒噬菌体。(5)另外,pks岛中的突变。
在一些实施方案中,遗传工程化细菌包含携带用于产生草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白的基因的稳定维持的质粒或染色体,使得草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白可以在宿主细胞中表达,并且宿主细胞能够在体外(例如在培养基中和/或在体内)存活和/或生长。在一些实施方案中,细菌可以包含多个拷贝的编码一种或多种草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白的基因和/或基因盒。在一些实施方案中,编码一种或多种草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白的基因和/或基因盒以低拷贝质粒表达。在一些实施方案中,低拷贝质粒可以用于增加表达的稳定性。在一些实施方案中,低拷贝质粒可以用于减少非诱导条件下的渗漏表达。在一些实施方案中,编码一种或多种草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白的基因和/或基因盒以高拷贝质粒表达。在一些实施方案中,高拷贝质粒可以用于增加草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白的表达。在一些实施方案中,编码一种或多种草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白的基因和/或基因盒在染色体上表达。
在一些实施方案中,细菌被遗传工程化以包括多种作用机制(MOA),例和产生多个拷贝的相同产物的回路(例如,以提高拷贝数)或执行多种不同功能的回路。例如,遗传工程化细菌可以包括插入在四个不同插入位点的四个拷贝的编码一种或多种特定草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白的基因和/或基因盒。可替代地,遗传工程化细菌可以包括插入在三个不同插入位点的三个拷贝的编码特定草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白的基因、以及插入在三个不同插入位点的三个拷贝的编码不同草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白的基因。
在一些实施方案中,在表达草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白的条件下,如与相同条件下相同亚型的未修饰细菌相比,本公开的遗传工程化细菌产生至少约1.5倍、至少约2倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约50倍、至少约100倍、至少约200倍、至少约300倍、至少约400倍、至少约500倍、至少约600倍、至少约700倍、至少约800倍、至少约900倍、至少约1,000倍或至少约1,500倍更多的在操纵子中的草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白和/或基因转录物。
在一些实施方案中,定量PCR(qPCR)用于扩增、检测和/或定量草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白基因的mRNA表达水平。根据本领域已知的方法,可以设计对草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白基因特异的引物并将其用于检测样品中的mRNA。在一些实施方案中,将荧光团添加到可能含有草酸分解代谢酶mRNA的样品反应混合物中,并且使用热循环仪用特定波长的光照射样品反应混合物并检测荧光团随后的发射。将反应混合物加热并冷却至预定温度并持续预定时间段。在某些实施方案中,加热和冷却重复预定数量的循环。在一些实施方案中,将反应混合物加热并冷却至90-100℃、60-70℃和30-50℃持续预定的循环次数。在某个实施方案中,将反应混合物加热并冷却至93—97℃、55-65℃和35-45℃持续预定的循环次数。在一些实施方案中,在qPCR的每个循环之后对积累的扩增子进行定量。荧光超过阈值的循环次数是阈值循环(CT)。产生每个样品的至少一个CT结果,并且CT结果可以用于确定草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白基因的mRNA表达水平。
在一些实施方案中,定量PCR(qPCR)用于扩增、检测和/或定量草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白基因的mRNA表达水平。根据本领域已知的方法,可以设计对草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白基因特异的引物,并将其用于检测样品中的mRNA。在一些实施方案中,将荧光团添加到可能含有草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白mRNA的样品反应混合物中,并且使用热循环仪用特定波长的光照射样品反应混合物,并检测荧光团随后的发射。将反应混合物加热并冷却至预定温度并持续预定时间段。在某些实施方案中,加热和冷却重复预定数量的循环。在一些实施方案中,将反应混合物加热并冷却至90-100℃、60-70℃和30-50℃持续预定的循环次数。在某个实施方案中,将反应混合物加热并冷却至93-97℃、55-65℃和35-45℃持续预定的循环次数。在一些实施方案中,在qPCR的每个循环之后对积累的扩增子进行定量。荧光超过阈值的循环次数是阈值循环(CT)。产生每个样品的至少一个CT结果,并且CT结果可以用于确定草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白基因的mRNA表达水平。
药物组合物和制剂
包含本发明的遗传工程化微生物的药物组合物可以用于治疗、管理、改善和/或预防受试者中草酸盐有害的疾病或病症。在另一个实施方案中,草酸盐有害的病症是导致每日尿草酸盐排泄超过40mg/24小时的病症。提供了本发明的药物组合物,其包含单独或与预防剂、治疗剂和/或药学上可接受的载体组合的一种或多种遗传工程化细菌和/或一种或多种遗传工程化病毒。
在某些实施方案中,药物组合物包含一种细菌物种、菌株或亚型,所述细菌物种、菌株或亚型被工程化以包含一个或多个本文所述的遗传修饰,例如选自至少一种草酸分解代谢酶、草酸盐输入蛋白/转运蛋白和/或甲酸盐输出蛋白和/或草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白的表达、营养缺陷型、杀灭开关、敲除等。在替代性实施方案中,药物组合物包含两种或更多种细菌物种、菌株和/或亚型,它们各自被工程化以包含本文所述的遗传修饰,例如一种草酸分解代谢酶、草酸盐输入蛋白/转运蛋白和/或甲酸盐输出蛋白和/或草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白、营养缺陷型、杀灭开关、敲除等。
本公开的药物组合物可以使用一种或多种生理学上可接受的载体以常规方式配制,所述生理学上可接受的载体包括赋形剂和助剂,它们有助于将活性成分加工成用于药物用途的组合物。配制药物组合物的方法是本领域已知的(参见例如,″Remington′sPharmaceutical Sciences,″Mack Publishing Co.,Easton,PA)。在一些实施方案中,对药物组合物进行压片、冻干、直接压缩、常规混合、溶解、造粒、磨细、乳化、包封、包埋或喷雾干燥,以形成片剂、颗粒剂、纳米颗粒、纳米胶囊、微胶囊、微型片剂、丹剂或粉剂,它们可以是肠溶包衣的或未包衣的。合适的制剂取决于施用途径。
遗传工程化微生物可以被配制为呈任何合适剂型(例如,用于口服施用的液体、胶囊、小药囊、硬胶囊、软胶囊、片剂、肠溶衣片剂、悬浮粉剂、颗粒剂或基质缓释制剂)和用于任何合适施用类型(例如,口服、局部、注射、静脉内、皮下、立即释放、脉冲释放、延迟释放或持续释放)的药物组合物。遗传工程化细菌的合适剂量范围可以为约104至1012个细菌。所述组合物可以每天、每周或每月施用一次或多次。可以在膳食之前、期间或之后施用组合物。在一个实施方案中,在受试者进食膳食之前施用药物组合物。在一个实施方案中,药物组合物通常与膳食一起施用。在一个实施方案中,在受试者进食膳食之后施用药物组合物。
遗传工程化细菌或遗传工程化病毒可以被配制成药物组合物,所述药物组合物包含一种或多种药学上可接受的载体、增稠剂、稀释剂、缓冲液、缓冲剂、表面活性剂、中性或阳离子脂质、脂质复合物、脂质体、渗透促进剂、载体化合物和其他药学上可接受的载体或药剂。例如,药物组合物可以包括但不限于添加碳酸氢钙、碳酸氢钠、磷酸钙、各种糖和各种类型的淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油、聚乙二醇和表面活性剂(包括例如聚山梨醇酯20)。
在一些实施方案中,本发明的遗传工程化细菌可以配制在碳酸氢钠溶液(例如1摩尔碳酸氢钠溶液或本文所述的其他浓度)中(例如,以缓冲酸性细胞环境,诸如胃)。可以将遗传工程化细菌以中性或盐的形式施用和配制。药学上可接受的盐包括与阴离子形成的盐,例如衍生自盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的盐,以及与阳离子形成的盐,例如衍生自钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的盐。
遗传工程化微生物可以静脉内施用,例如通过输注或注射。
本公开的遗传工程化微生物可以鞘内施用。在一些实施方案中,本发明的遗传工程化微生物可以口服施用。可以将本文公开的遗传工程化微生物局部施用并且配制成软膏、乳膏、透皮贴剂、洗剂、凝胶、香波、喷雾剂、气雾剂、溶液、乳剂或本领域技术人员熟知的其他形式。参见例如,“Remington′s Pharmaceutical Sciences,”Mack Publishing Co.,Easton,PA。在一个实施方案中,对于不可喷雾的局部剂型,使用包含载体或一种或多种与局部应用相容的赋形剂并且具有大于水的动态粘度的粘性至半固体或固体形式。合适的制剂包括但不限于溶液、悬浮液、乳液、乳膏、软膏、粉剂、搽剂、油膏等,它们可以被灭菌或与辅助剂(例如防腐剂、稳定剂、湿润剂、缓冲剂或盐)混合用于影响各种性质(例如渗透压)。其他合适的局部剂型包括可喷雾的气溶胶制剂,其中与固体或液体惰性载体组合的活性成分被包装在与加压挥发物(例如,气体推进剂,诸如氟利昂)的混合物中或在挤压瓶中。也可以将保湿剂或湿润剂添加到药物组合物和剂型中。此类附加成分的实例是本领域熟知的。在一个实施方案中,包含本发明重组细菌的药物组合物可以被配制成卫生产品。例如,卫生产品可以是抗菌制剂或发酵产品(诸如发酵液)。卫生产品可以是例如洗发水、护发素、面霜、软膏、洗液和润唇膏。
可以将本文公开的遗传工程化微生物口服施用并且配制成片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液、悬浮液等。可以使用固体赋形剂制备用于口服使用的药物组合物,任选地研磨所得混合物并加工颗粒混合物,之后如果需要添加合适的助剂以获得片剂或糖衣丸芯。合适的赋形剂包括但不限于填充剂,诸如糖,包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇;纤维素组合物,诸如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠;和/或生理上可接受的聚合物,诸如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或聚乙二醇(PEG)。也可以添加崩解剂,诸如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、海藻酸或其盐诸如海藻酸钠。
片剂或胶囊可以通过常规手段与以下物质一起制备:药学上可接受的赋形剂,诸如粘合剂(例如,预凝胶化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素、聚乙二醇、蔗糖、葡萄糖、山梨醇、淀粉、树胶、高岭土和黄蓍胶);填充剂(例如,乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙);润滑剂(例如,钙、铝、锌、硬脂酸、聚乙二醇、十二烷基硫酸钠、淀粉、苯甲酸钠、L-亮氨酸、硬脂酸镁、滑石或二氧化硅);崩解剂(例如,淀粉、马铃薯淀粉、淀粉羟乙酸钠、糖、纤维素衍生物、二氧化硅粉末);或湿润剂(例如,十二烷基硫酸钠)。可以通过本领域熟知的方法对片剂进行包衣。可以存在包衣壳,并且常见的膜包括但不限于聚交酯、聚乙醇酸、聚酸酐、其他可生物降解的聚合物、海藻酸盐-聚赖氨酸-海藻酸盐(APA)、海藻酸盐-聚甲烯-共-胍-海藻酸盐(A-PMCG-A)、羟甲基丙烯酸酯-甲基丙烯酸甲酯(HEMA-MMA)、多层HEMA-MMA-MAA、聚丙烯腈-氯乙烯(PAN-PVC)、丙烯腈/甲代烯丙基磺酸钠(AN-69)、聚乙二醇/聚五甲基环五硅氧烷/聚二甲基硅氧烷(PEG/PD5/PDMS)、聚N,N-二甲基丙烯酰胺(PDMAAm)、含硅胶囊、硫酸纤维素/海藻酸钠/聚甲烯-共-胍(CS/A/PMCG)、醋酸邻苯二甲酸纤维素、海藻酸钙、k-角叉菜胶-刺槐豆胶凝胶珠、胶凝糖-黄原胶珠、聚(丙交酯-共-乙交酯)、角叉菜胶、淀粉聚酸酐、淀粉聚甲基丙烯酸酯、聚氨基酸和肠溶包衣聚合物。
在一些实施方案中,将遗传工程化微生物进行肠溶包衣以释放到肠道或肠道的特定区域(例如大肠)中。从胃到结肠的典型pH范围为约1-4(胃)、5.5-6(十二指肠)、7.3-8.0(回肠)和5.5—6.5(结肠)。在一些疾病中,pH范围可能会改变。在一些实施方案中,包衣在特定的pH环境中降解,以便指定释放的部位。在一些实施方案中,使用至少两层包衣。在一些实施方案中,外部包衣和内部包衣在不同的pH水平下降解。
在一些实施方案中,可以在一个或多个包衣层(例如,外部、内部和/或中间包衣层)中使用肠溶包衣材料。肠溶包衣聚合物在低pH下保持未离子化,因此保持不溶。但是随着胃肠道中pH的增加,酸性官能团能够离子化,并且聚合物膨胀或变得可溶于肠液中。
用于肠溶包衣的材料包括醋酸邻苯二甲酸纤维素(CAP)、聚(甲基丙烯酸-共-甲基丙烯酸甲酯)、醋酸偏苯三酸纤维素(CAT)、聚(醋酸邻苯二甲酸乙烯酯)(PVAP)和邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素(HPMCP)、脂肪酸、蜡、虫胶(紫胶桐酸的酯)、塑料和植物纤维。此外,还使用玉米蛋白、水玉米蛋白(不含醇的含水玉米蛋白制剂)、直链淀粉和淀粉衍生物以及糊精(例如麦芽糖糊精)。其他已知的肠溶包衣包括乙基纤维素、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、醋酸邻苯二甲酸直链淀粉、醋酸邻苯二甲酸纤维素、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素、丙烯酸乙酯和甲基丙烯酸甲酯。
包衣聚合物还可以包含以下中的一种或多种:邻苯二甲酸酯衍生物、CAT、HPMCAS、聚丙烯酸衍生物、包含丙烯酸和至少一种丙烯酸酯的共聚物、EudragitTM S(聚(甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯)1:2);Eudragit L100TM S(聚(甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯)1:1);Eudragit L30DTM(聚(甲基丙烯酸、丙烯酸乙酯)1:1);和(Eudragit L100-55)(聚(甲基丙烯酸、丙烯酸乙酯)1:1)(EudragitTM L是由甲基丙烯酸和甲基丙烯酸甲酯合成的阴离子聚合物)、与丙烯酸和丙烯酸酯共聚物共混的聚甲基丙烯酸甲酯、海藻酸、海藻酸氨、海藻酸钠、钾、镁或钙、醋酸乙烯酯共聚物、聚醋酸乙烯酯30D(30%水中分散体)、包含聚(二甲基氨基乙基丙烯酸酯)的中性甲基丙烯酸酯(“Eudragit ETM”)、甲基丙烯酸甲酯和丙烯酸乙酯与甲基丙烯酸三甲铵乙基酯氯化物的共聚物、甲基丙烯酸甲酯和丙烯酸乙酯的共聚物、玉米蛋白、虫胶、树胶或多糖或它们的组合。
包衣层也可以包括含有以下物质的聚合物:羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟丙基乙基纤维素(HPEC)、羟丙基纤维素(HPC)、羟丙基乙基纤维素(HPEC)、羟甲基丙基纤维素(HMPC)、乙基羟乙基纤维素(EHEC)(Ethulose)、羟乙基甲基纤维素(HEMC)、羟甲基乙基纤维素(HMEC)、丙基羟乙基纤维素(PHEC)、甲基羟乙基纤维素(MHEC)、疏水改性的羟乙基纤维素(NEXTON)、羧甲基羟乙基纤维素(CMHEC)、甲基纤维素、乙基纤维素、水溶性醋酸乙烯酯共聚物、树胶、多糖诸如海藻酸和海藻酸盐诸如海藻酸氨、海藻酸钠、海藻酸钾、碳水化合物的酸性邻苯二甲酸酯、醋酸邻苯二甲酸直链淀粉、醋酸邻苯二甲酸纤维素(CAP)、邻苯二甲酸纤维素酯、邻苯二甲酸纤维素醚、邻苯二甲酸羟丙基纤维素(HPCP)、邻苯二甲酸羟丙基乙基纤维素(HPECP)、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素(HPMCP)、醋酸琥珀酸羟丙基甲基纤维素(HPMCAS)。
用于口服施用的液体制剂可以采取溶液、糖浆、悬浮液或干燥产品的形式,用于在使用前用水或其他合适的媒介物复原。此类液体制剂可通过常规方式用药学上可接受的药剂制备,所述药学上可接受的药剂诸如悬浮剂(例如,山梨醇糖浆、纤维素衍生物或氢化食用脂肪);乳化剂(例如,卵磷脂或阿拉伯胶);非水媒介物(例如,扁桃仁油、油酯、乙醇或分馏植物油);以及防腐剂(例如,对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸)。所述制剂还可以包含适当的缓冲盐、调味剂、着色剂和甜味剂。用于口服施用的制剂可以适当地配制用于缓慢释放、受控释放或持续释放本文所述的遗传工程化微生物。
在一个实施方案中,可以将本公开的遗传工程化微生物配制成适合于向儿科受试者施用的组合物。如本领域熟知的,儿童在许多方面不同于成人,包括不同的胃排空率、pH、胃肠渗透性等(Ivanovska等人,Pediatrics,134(2):361-372,2014)。此外,儿科制剂接受性和偏好(诸如施用途径和味道属性)对于实现可接受的儿科依从性是至关重要的。因此,在一个实施方案中,适合于向儿科受试者施用的组合物可以包括易于吞咽或可溶解的剂型,或更可口的组合物,诸如添加了调味剂、甜味剂或味觉阻断剂的组合物。在一个实施方案中,适合于向儿科受试者施用的组合物也可以适合于向成人施用。
在一个实施方案中,适合于向儿科受试者施用的组合物可以包括溶液、糖浆、悬浮液、酏剂、重构为悬浮液或溶液的粉剂、可分散/泡腾片、咀嚼片、橡皮糖、棒棒糖、冰棒、锭剂、口香糖、口腔薄带、口腔崩解片、小药囊、软明胶胶囊、喷洒口服粉剂或颗粒剂。在一个实施方案中,组合物是橡皮糖,其由明胶基料制成,赋予糖果弹性、所必需的耐嚼稠度和更长的保存期。在一些实施方案中,橡皮糖还可以包含甜味剂或调味剂。
在一个实施方案中,适合于向儿科受试者施用的组合物可以包括调味剂。如本文所用,“调味剂”是为制剂提供独特味道和香味的物质(液体或固体)。调味剂也有助于改善制剂的适口性。调味剂包括但不限于草莓、香草、柠檬、葡萄、泡泡糖和樱桃。
在某些实施方案中,遗传工程化微生物可以例如与惰性稀释剂或可同化的可食用载体一起口服施用。所述化合物也可以被包封在硬或软壳明胶胶囊中,压制成片剂,或直接掺入受试者的饮食中。对于口服治疗性施用,可以将化合物与赋形剂混合,并以可摄取片剂、口含片、锭剂、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆、晶片等形式使用。为了通过除肠胃外施用以外的方式施用化合物,可能需要用防止其失活的材料对化合物进行包衣,或者将化合物与防止其失活的材料共同施用。
在另一个实施方案中,包含本发明重组细菌的药物组合物可以是可食用产品,例如食品。在一个实施方案中,食品是奶、浓缩奶、发酵奶(酸奶、酸乳、冷冻酸奶、乳酸菌发酵饮料)、奶粉、冰淇淋、奶油干酪、干干酪、豆浆、发酵豆浆、蔬果汁、果汁、运动饮料、糕饼、糖果、婴儿食品(诸如婴儿蛋糕)、营养食品、动物饲料或膳食补充剂。在一个实施方案中,食品是发酵食品,诸如发酵乳制品。在一个实施方案中,发酵乳制品是酸奶。在另一个实施方案中,发酵乳制品是奶酪、奶、奶油、冰淇淋、奶昔或酸乳酒。在另一个实施方案中,将本发明的重组细菌组合在含有旨在用作益生菌的其他活细菌细胞的制剂中。在另一个实施方案中,食品是饮料。在一个实施方案中,饮料是基于果汁的饮料或含有植物或草药提取物的饮料。在另一个实施方案中,食品是果冻或布丁。适合于施用本发明的重组细菌的其他食品是本领域熟知的。例如参见U.S.2015/0359894和US 2015/0238545,其各自的全部内容以引用的方式明确并入本文。在又另一个实施方案中,将本发明的药物组合物注射到食品中、喷雾到或喷洒到食品上,所述食品诸如面包、酸奶或奶酪。
在一些实施方案中,所述组合物被配制成用于肠内施用、空肠内施用、十二指肠内施用、回肠内施用、胃分流施用或结肠内施用,通过肠溶包衣或未包衣的纳米颗粒、纳米胶囊、微胶囊或微型片剂施用。也可以将药物组合物配制成直肠组合物,诸如栓剂或保留灌肠剂,使用例如常规栓剂基质,诸如可可脂或其他甘油酯。组合物可以是在油性或水性媒介物中的悬浮液、溶液或乳液,并且可以含有悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。
本文所述的遗传工程化微生物可以鼻内施用,配制成气溶胶形式、喷雾、薄雾或滴剂形式,并且使用合适的推进剂(例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体)从加压包装或喷雾器中以气溶胶喷雾的形式方便地递送。可以通过提供阀门输送计量的量来确定加压气溶胶剂量单位。可以将用于吸入器或吹入器的胶囊和药筒(例如,明胶的)配制成含有化合物和合适的粉末基质(诸如乳糖或淀粉)的粉末混合物。
遗传工程化微生物可以作为迟效制剂施用和配制。此类长效制剂可以通过植入或通过注射施用,包括静脉内注射、皮下注射、局部注射、直接注射或输注。例如,可以用合适的聚合物或疏水材料(例如,作为可接受的油中的乳液)或离子交换树脂或作为微溶衍生物(例如,作为微溶盐)来配制组合物。
在一些实施方案中,本文公开了单一剂型的药学上可接受的组合物。单一剂型可以是液体或固体形式。单一剂型可以不经修饰直接施用于患者,或者可以在施用之前稀释或重构。在某些实施方案中,可以将单一剂型以推注形式施用,例如,单次注射、单次口服剂量,包括含有多个片剂、胶囊、丸剂等的口服剂量。在替代性实施方案中,单一剂型可以在一段时间内施用,例如通过输注。
在一些实施方案中,本发明提供了药学上可接受的组合物,其不是食物或可食用产品的形式或未掺入到食物或可食用产品中。
药物组合物的单一剂型可以通过将药物组合物分成较小的等份、单剂量容器、单剂量液体形式或单剂量固体形式(诸如片剂、颗粒剂、纳米颗粒、纳米胶囊、微胶囊、微型片剂、丹剂或粉剂,它们可以是肠溶包衣的或未包衣的)来制备。固体形式的单剂量可以在向患者施用之前通过添加液体(通常是无菌水或盐水溶液)来重构。
在其他实施方案中,组合物可以在受控释放或持续释放系统中递送。在一个实施方案中,可以使用泵来实现受控释放或持续释放。在另一个实施方案中,聚合材料可以用于实现本公开的疗法的受控或持续释放(参见例如美国专利号5,989,463)。用于持续释放制剂的聚合物的实例包括但不限于聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、聚(乙烯-共-醋酸乙烯酯)、聚(甲基丙烯酸)、聚乙交酯(PLG)、聚酸酐、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚丙烯酰胺、聚(乙二醇)、聚丙交酯(PLA)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)和聚原酸酯。用于持续释放制剂的聚合物可以是惰性的、不含可浸出杂质、储存稳定、无菌和可生物降解的。在一些实施方案中,可将受控或持续释放系统置于预防或治疗靶标附近,因此仅需要全身剂量的一部分。可以使用本领域技术人员已知的任何合适的技术。
可以调整剂量方案以提供治疗反应。剂量可能取决于几个因素,包括疾病的严重程度和响应性、施用途径、疗程(几天到几个月到几年)和疾病缓解的时间。例如,可以一次施用单次推注,可以在预定的时间段内施用几个分开的剂量,或者可以根据治疗情况所指示减少或增加剂量。剂量规格由活性化合物的独特特征和要实现的特定治疗效果决定。剂量值可以随着待缓解的疾患的类型和严重程度而变化。对于任何特定受试者,可以根据个人需要和治疗临床医生的专业判断随时间调整具体的剂量方案。本文提供的化合物的毒性和治疗功效可以通过细胞培养或动物模型中的标准药学程序来确定。例如,可以确定LD50、ED50、EC50和IC50,并且可以计算毒性与治疗效果之间的剂量比(LD50/ED50)作为治疗指数。可以使用表现出毒副作用的组合物,并仔细修改以使潜在的损害最小化,从而减少副作用。最初可以从细胞培养测定和动物模型来估计剂量。从体外和体内测定以及动物研究中获得的数据可以用于配制用于人类的剂量范围。
在一个实施方案中,以约1x1011个活重组细菌、约2x1011个活重组细菌、约3x1011个活重组细菌、约4x1011个活重组细菌、约4.5x1011个活重组细菌、约5x1011个活重组细菌、约6x1011个活重组细菌、约1x1012个活重组细菌或约2x1012个活重组细菌的剂量施用重组细菌。在一个实施方案中,重组细菌以约6x1011个活重组细菌的剂量施用。在一个实施方案中,重组细菌以约1x1011个活重组细菌的剂量施用。在一个实施方案中,施用为约4.5x1011个活重组细菌。在一个实施方案中,施用为约5x1011个活重组细菌。在一个实施方案中,重组细菌以约1x1012个活重组细菌的剂量施用。在一个实施方案中,重组细菌以约2x1012个活重组细菌的剂量施用。在一个实施方案中,每天三次与膳食一起施用约5x1011个活重组细菌。在一个实施方案中,以约6x1011个活重组细菌的剂量每天三次与膳食一起施用重组细菌。在一个实施方案中,以约1x1011个活重组细菌的剂量每天三次与膳食一起施用重组细菌。在一个实施方案中,以约1x1012个活重组细菌的剂量每天三次与膳食一起施用重组细菌。在一个实施方案中,以约2x1012个活重组细菌的剂量每天三次与膳食一起施用重组细菌。在一个实施方案中,以约4.5x1012个活重组细菌的剂量每天三次与膳食一起施用重组细菌。
在一些实施方案中,受试者可能不耐受每天两次或每天三次给药,并且可以减少给药频率。
所述成分以单位剂型(例如,作为在指示活性剂的量的密封容器诸如安瓿或小药囊中的冻干粉末或无水浓缩物)分开或混合在一起提供。如果施用方式是通过注射,可以提供一安瓿无菌注射用水或生理盐水,以便在施用之前将成分混合。
可以将药物组合物包装在密封容器中,诸如指示药剂的量的安瓿或小药囊。在一个实施方案中,一种或多种药物组合物作为密封容器中的干燥无菌冻干粉末或无水浓缩物提供,并且可以被重构(例如,用水或生理盐水)至合适的浓度,用于向受试者施用。在一个实施方案中,一种或多种预防剂或治疗剂或药物组合物作为在密封容器中的干燥无菌冻干粉末提供,储存在2℃与8℃之间并在重构后1小时内、3小时内、5小时内、6小时内、12小时内、24小时内、48小时内、72小时内或一周内施用。冻干剂型中可以包含冷冻保护剂,主要是0-10%蔗糖(最佳为0.5%-1.0%)。其他合适的冷冻保护剂包括海藻糖和乳糖。其他合适的增积剂包括甘氨酸和精氨酸(其任一者的浓度可以为0-0.05%),以及聚山梨醇酯80(最佳浓度为0.005%-0.01%)。附加表面活性剂包括但不限于聚山梨醇酯20和BRIJ表面活性剂。可以将药物组合物制备成可注射溶液,并且还可以包含可用作佐剂的药剂,诸如用于增加吸收或分散的那些药剂,例如透明质酸酶。
在一些实施方案中,考虑到有效递送和克服宿主抗病毒免疫反应的需要,制备了用于递送的遗传工程化病毒。逃避抗病毒反应的方法包括施用不同的病毒血清型作为治疗方案的一部分(血清型转换)、制剂(诸如聚合物包衣以掩盖病毒免受抗体识别)、以及使用细胞作为递送媒介物。
在另一个实施方案中,可以在受控或持续释放系统中递送组合物。在一个实施方案中,可以使用泵来实现受控释放或持续释放。在另一个实施方案中,聚合材料可以用于实现本公开的疗法的受控或持续释放(参见例如美国专利号5,989,463)。用于持续释放制剂的聚合物的实例包括但不限于聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、聚(乙烯-共-醋酸乙烯酯)、聚(甲基丙烯酸)、聚乙交酯(PLG)、聚酸酐、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚丙烯酰胺、聚(乙二醇)、聚丙交酯(PLA)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)和聚原酸酯。用于持续释放制剂的聚合物可以是惰性的、不含可浸出杂质、储存稳定、无菌和可生物降解的。在一些实施方案中,可将受控或持续释放系统置于预防或治疗靶标附近,因此仅需要全身剂量的一部分。可以使用本领域技术人员已知的任何合适的技术。
可以将本发明的遗传工程化细菌以中性或盐的形式施用和配制。药学上可接受的盐包括与阴离子形成的盐,例如衍生自盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的盐,以及与阳离子形成的盐,例如衍生自钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的盐。
体内方法
可以在体内(例如,在动物模型中)评估本发明的重组细菌。可以使用草酸盐有害的疾病或疾患的任何合适的动物模型。例如,可以使用如Salido等人所述的PHI的丙氨酸乙醛酸转氨酶缺陷型(agxt-/-)小鼠模型(参见例如,Salido等人,Proc.Natl.Acad.Sci.103:18249-54(2006))。也可以使用PHII的乙醛酸还原酶/羟基丙酮酸还原酶敲除(GRHPR-/-)小鼠模型(参见例如,Knight等人,Am.J.Physiol.Renal.Physiol.302:F688-93(2012))。也可以使用发展为高草酸尿症的草酸盐转运蛋白SLC26A6缺陷型小鼠(Slc26a6-无效小鼠)(参见例如,Jiang等人Nature Gen.38:474-8(2006))。
可替代地,可以使用大鼠模型。例如,Canales等人描述了Roux-en-Y胃旁路术(RYGB)手术的大鼠模型,其中高脂肪喂养导致脂肪泻、高草酸尿症和低尿pH。正常脂肪和无草酸盐饮食的RYGB动物排泄的草酸盐是年龄匹配的假对照组的两倍;通过降低膳食脂肪和草酸盐含量,高草酸尿症是部分可逆的(Canales等人,Steatorrhea And HyperoxaluriaOccur After Gastric Bypass Surgery In Obese Rats Regardless OfDietary Fat OrOxalate;J Urol.2013年9月;190(3):1102-1109)。
本发明的重组细菌细胞可以例如通过口服管饲法施用于动物,并且例如通过测量治疗之前和之后的草酸尿水平来确定治疗功效。可以将动物处死,并且可以收集和分析组织样品。
下表13包括可以用于评估遗传工程化细菌的体内活性的附加大鼠模型。
表13.草酸钙肾结石大鼠模型
筛选方法
在本发明的一些实施方案中,任何输入蛋白、输出蛋白、反向转运蛋白和草酸分解代谢酶的功效或活性都可以通过任何这些基因的突变来改善。定向突变和筛选的方法是本领域已知的。
治辽方法
本发明的一个方面提供了治疗受试者的草酸盐有害的病症或与受试者的草酸盐有害的病症相关的症状的方法。在一个实施方案中,草酸盐有害的病症是与草酸盐水平升高相关的病症。在一个实施方案中,与草酸盐水平升高相关的病症是其中每日尿草酸盐排泄为每24小时40mg或更高水平的病症。与草酸盐水平升高相关的病症包括PHI、PHII、PHIII、继发性高草酸尿症、肠道高草酸尿症、饮食性高草酸尿症、特发性高草酸尿症、细菌过度生长综合征、克罗恩病、炎性肠病、肾移植后高草酸尿症、因肥胖进行空肠回肠旁路术后高草酸尿症、胃溃疡手术后高草酸尿症、慢性肠系膜缺血、胃旁路术、囊性纤维化、短肠综合征、胆道/胰腺疾病(例如慢性胰腺炎)、高草酸尿症伴肾功能相对保留的复发性肾结石以及高草酸尿症伴严重肾功能不全的复发性肾结石(例如,包括血液透析的患者)。在一个实施方案中,草酸盐有害的病症是PHI。在一个实施方案中,草酸盐有害的病症是PHII。在另一个实施方案中,草酸盐有害的病症是PHIII。在一个实施方案中,草酸盐有害的病症是继发性高草酸尿症。在另一个实施方案中,草酸盐有害的病症是饮食性高草酸尿症。在一个实施方案中,草酸盐有害的病症是特发性高草酸尿症。在另一个实施方案中,草酸盐有害的病症是肠道高草酸尿症。在一个实施方案中,草酸盐有害的病症是细菌过度生长综合征。在另一个实施方案中,草酸盐有害的病症是克罗恩病。在一个实施方案中,草酸盐有害的病症是炎性肠病。在另一个实施方案中,草酸盐有害的病症是肾移植后的高草酸尿症。在一个实施方案中,草酸盐有害的病症是因肥胖进行空肠回肠旁路术后的高草酸尿症。在另一个实施方案中,草酸盐有害的病症是胃溃疡手术后的高草酸尿症。在一个实施方案中,草酸盐有害的病症是慢性肠系膜缺血。在另一个实施方案中,草酸盐有害的病症是胃旁路术,例如Roux-enY胃旁路术。在另一个实施方案中,草酸盐有害的病症是囊性纤维化。在另一个实施方案中,草酸盐有害的病症是短肠综合征。在另一个实施方案中,草酸盐有害的病症是胆道/胰腺疾病。在另一个实施方案中,草酸盐有害的病症是慢性胰腺炎。在另一个实施方案中,草酸盐有害的病症是高草酸尿症伴肾功能相对保留的复发性肾结石。在另一个实施方案中,草酸盐有害的病症是高草酸尿症伴严重肾功能不全的复发性肾结石(例如,包括血液透析的患者)。
本公开令人惊讶地证明了包含本文公开的重组细菌细胞的药物组合物可以用于治疗草酸盐有害的病症,诸如PHI和PHI。
在一个实施方案中,患有PHI的受试者在AGXT基因中有突变。在另一个实施方案中,患有PHII的受试者在GRHPR基因中有突变。在一个实施方案中,患有PHIII的受试者在HOGA1基因中有突变。在另一个方面,本发明提供了通过向受试者施用包含本发明的细菌细胞的药物组合物来降低受试者的草酸盐和/或草酸的血浆水平,从而降低受试者的草酸盐和/或草酸的血浆水平的方法。在一个实施方案中,受试者患有草酸盐有害的疾病或病症。在一个实施方案中,草酸盐有害的病症是PHI。
在一个实施方案中,草酸盐有害的病症是PHII。在另一个实施方案中,草酸盐有害的病症是PHIII。在一个实施方案中,草酸盐有害的病症是继发性高草酸尿症。在另一个实施方案中,草酸盐有害的病症是饮食性高草酸尿症。在一个实施方案中,草酸盐有害的病症是特发性高草酸尿症。在另一个实施方案中,草酸盐有害的病症是肠道高草酸尿症。在一个实施方案中,草酸盐有害的病症是细菌过度生长综合征。在另一个实施方案中,草酸盐有害的病症是克罗恩病。在一个实施方案中,草酸盐有害的病症是炎性肠病。在另一个实施方案中,草酸盐有害的病症是肾移植后的高草酸尿症。在一个实施方案中,草酸盐有害的病症是因肥胖进行空肠回肠旁路术后的高草酸尿症。在另一个实施方案中,草酸盐有害的病症是胃溃疡手术后的高草酸尿症。在一个实施方案中,草酸盐有害的病症是慢性肠系膜缺血。在另一个实施方案中,草酸盐有害的病症是胃旁路术。在另一个实施方案中,草酸盐有害的病症是囊性纤维化。在另一个实施方案中,草酸盐有害的病症是短肠综合征。在另一个实施方案中,草酸盐有害的病症是胆道/胰腺疾病。在另一个实施方案中,草酸盐有害的病症是慢性胰腺炎。
在一些实施方案中,本公开提供了用于减少、改善或消除与这些疾病相关的一种或多种症状的方法,所述症状包括但不限于发热、呕吐、恶心、腹泻、肾结石、草酸盐沉着、骨病、促红细胞生成素难治性贫血、皮肤溃疡、手指坏疽、心律失常和心肌病。在一些实施方案中,所述疾病继发于其他疾患,例如肝病。
在一些实施方案中,将要通过本文所公开的方法治疗的人类患者可能满足以下实施例中所公开的一个或多个纳入和排除标准。例如,人类患者的年龄可以为≥18岁到≤74岁。在一些实施方案中,人类患者具有胃旁路手术史(在第1天之前至少12个月)或短肠综合征史。
可替代地或另外,接受本文所公开的任何治疗的人类患者可以不患有或不具有以下中的一项或多项:(1)急性或慢性医学疾病(包括COVID-19感染),(3)估计的肾小球滤过率<45mL/min/1.73m2,(4)肾结石史,(5)不能中断维生素C补充;(6)已知的原发性高草酸尿症,(7)在第1天之前的5个半衰期内施用或摄入任何类型的全身性(例如,口服或静脉内)抗生素,(8)对EcN、所有PPI或在SYNB8802或安慰剂制剂中的任何成分不耐受或有过敏反应,(9)对酒精的依赖或滥用药物,(10)目前的免疫缺陷病症,包括自身免疫性病症和未受控制的人类免疫缺陷病毒(HIV)。
在某些实施方案中,本文公开的细菌细胞能够分解代谢受试者体内的草酸盐和/或草酸,以治疗草酸盐有害的病症。在这些实施方案中,患有草酸盐有害的病症(例如PHI或PHII)的患者能够重新开始基本正常的饮食或比不含草酸盐或草酸盐含量非常低的饮食限制更少的饮食。在一些实施方案中,细菌细胞能够分解代谢来自额外来源(例如血液)的草酸盐和/或草酸,以治疗草酸盐有害的病症。
在一些实施方案中,通过提供本文所述的遗传工程化细菌来抑制草酸盐的饮食摄取。在一些实施方案中,例如在哺乳动物中通过代谢途径产生的草酸盐减少。
所述方法可以包括制备含有至少一种本文所述的遗传工程化细菌物种、菌株或亚型的药物组合物,并且将所述药物组合物以治疗有效量施用于受试者。在一些实施方案中,治疗与草酸盐升高相关的疾病或病症的方法包括向有需要的受试者施用包含编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列的工程化细菌或其药物组合物。在一些实施方案中,治疗与草酸盐升高相关的疾病或病症的方法包括向有需要的受试者施用包含编码一种或多种草酸盐转运蛋白的基因序列的工程化细菌或其药物组合物。在一些实施方案中,治疗与草酸盐升高相关的疾病或病症的方法包括向有需要的受试者施用包含编码一种或多种甲酸盐输入蛋白的基因序列的工程化细菌或其药物组合物。在一些实施方案中,治疗与草酸盐升高相关的疾病或病症的方法包括向有需要的受试者施用包含编码一种或多种草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白的基因序列的工程化细菌或其药物组合物。在一些实施方案中,治疗与草酸盐升高相关的疾病或病症的方法包括向有需要的受试者施用工程化细菌,所述工程化细菌包含编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列和编码以下中的一种或多种的基因序列:(i)一种或多种草酸盐转运蛋白;(ii)一种或多种甲酸盐输出蛋白;(iii)一种或多种草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白;和(iv)它们组合或它们的药物组合物。在一些实施方案中,治疗与草酸盐升高相关的疾病或病症的方法包括向有需要的受试者施用工程化细菌SYNB8802。在一些实施方案中,将本文公开的细菌细胞口服施用,例如在液体悬浮液中。在一些实施方案中,本文公开的细菌细胞在凝胶帽中冻干并口服施用。在一些实施方案中,本文公开的细菌细胞通过饲管或胃分流管施用。在一些实施方案中,本文公开的细菌细胞通过直肠(例如通过灌肠)施用。在一些实施方案中,将遗传工程化细菌局部、肠内、空肠内、十二指肠内、回肠内和/或结肠内施用。
在某些实施方案中,施用本文所述的药物组合物是为了降低受试者的草酸盐和/或草酸水平。在一些实施方案中,本公开的方法将受试者的草酸盐和/或草酸水平降低至少约10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多。在另一个实施方案中,本发明的方法将受试者的草酸盐和/或草酸水平降低至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。在另一个实施方案中,本发明的方法将受试者的每日尿草酸盐排泄减少至每24小时少于40mg。在一些实施方案中,通过比较施用药物组合物之前和之后受试者的草酸盐和/或草酸水平来测量减少。在一个实施方案中,受试者肠道中的草酸盐和/或草酸水平降低。在一个实施方案中,受试者尿液中的草酸盐和/或草酸水平降低。在另一个实施方案中,受试者血液中的草酸盐和/或草酸水平降低。在另一个实施方案中,受试者血浆中的草酸盐和/或草酸水平降低。在另一个实施方案中,受试者粪便中的草酸盐和/或草酸水平降低。在另一个实施方案中,受试者脑中的草酸盐和/或草酸水平降低。测量肌酐用于校正尿浓度,即,在一些实施方案中,测量Uox:肌酐比以评估尿草酸盐水平的降低。
在一个实施方案中,施用本文所述的药物组合物是为了将受试者的草酸盐和/或草酸水平降低至正常水平。在另一个实施方案中,施用本文所述的药物组合物是为了将受试者的草酸盐和/或草酸水平降低至正常水平以下。在另一个实施方案中,施用本文所述的药物组合物是为了将受试者的每日尿草酸盐排泄减少至每24小时少于40mg。
在某些实施方案中,施用本文所述的药物组合物是为了降低受试者的草酸盐水平。在一些实施方案中,与未治疗的或对照受试者中的水平相比,本公开的方法将受试者的草酸盐水平降低至少约10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多。在另一个实施方案中,本公开的方法将受试者的草酸盐水平降低至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。在一些实施方案中,通过比较施用药物组合物之前和之后受试者的草酸盐水平来测量减少。在一个实施方案中,受试者肠道中的草酸盐水平降低。在另一个实施方案中,受试者血液中的草酸盐水平降低。在另一个实施方案中,受试者血浆中的草酸盐水平降低。在另一个实施方案中,受试者肝脏中的草酸盐水平降低。在另一个实施方案中,受试者肾脏中的草酸盐水平降低。
在一个实施方案中,施用本文所述的药物组合物是为了将受试者的草酸盐降低至正常水平。
在一些实施方案中,本文提供的方法包括监测和/或导致实施例10或下面其他实施例中描述的一个或多个终点的变化。在一些实施方案中,本文所述的方法包括测量和记录与肾结石风险增加相关的生物标记(诸如尿过饱和评分)从基线的变化。在一些实施方案中,本文提供的方法包括在筛查时监测肾结石的存在、吸收不良的程度、耐受性特征和其他患者因素。在一些实施方案中,本文所述的方法促进这些因素的改变。
在一些实施方案中,治疗草酸盐有害的病症(例如PHI或PHII)的方法允许疾患或病症的一种或多种症状改善至少约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或更多。在一些实施方案中,治疗草酸盐有害的病症(例如PHI或PHII)的方法允许疾患或病症的一种或多种症状改善至少约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。
在施用药物组合物之前、期间和之后,可以在生物样品中测量受试者的草酸盐和/或草酸水平,所述生物样品诸如血液、血清、血浆、尿、腹膜液、脑脊液、粪便、肠粘膜碎屑、从组织收集的样品和/或从以下中的一种或多种的内容物收集的样品|:胃、肾、肝、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠、直肠和肛管。在一些实施方案中,所述方法可以包括施用本文公开的组合物以降低草酸盐和/或草酸的水平。在一些实施方案中,所述方法可以包括施用本发明的组合物,以将受试者的草酸盐和/或草酸降低至不可检测的水平。在一些实施方案中,所述方法可以包括施用本发明的组合物以将草酸盐和/或草酸浓度降低至不可检测的水平,或降低至治疗前受试者的草酸盐和/或草酸水平的少于约1%、2%、5%、10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%或95%。
在一些实施方案中,与在相同条件下的相同类型的未经修饰的细菌相比,本文公开的重组细菌细胞在外源环境条件下(诸如哺乳动物肠道的低氧环境下)产生草酸分解代谢酶,以将尿液、血液或血浆中的草酸盐和/或草酸水平降低至少约1.5倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍或至少约50倍。
在一个实施方案中,本文公开的细菌将草酸盐的血浆水平降低至低于4mg/dL。在一个实施方案中,本文公开的细菌将草酸盐的血浆水平降低至低于3.9mg/dL。在一个实施方案中,本文公开的细菌将草酸盐的血浆水平降低至低于3.8mg/dL、3.7mg/dL、3.6mg/dL、3.5mg/dL、3.4mg/dL、3.3mg/dL、3.2mg/dL、3.1mg/dL、3.0mg/dL、2.9mg/dL、2.8mg/dL、2.7mg/dL、2.6mg/dL、2.5mg/dL、2.0mg/dL、1.75mg/dL、1.5mg/dL、1.0mg/dL或0.5mg/dL。
在一个实施方案中,在施用本文公开的药物组合物之前,受试者的血浆水平为至少4mg/dL草酸盐。在另一个实施方案中,在施用本文公开的药物组合物之前,受试者的血浆水平为至少4.1mg/dL、4.2mg/dL、4.3mg/dL、4.4mg/dL、4.5mg/dL、4.75mg/dL、5.O mg/dL、5.5mg/dL、6mg/dL、7mg/dL、8mg/dL、9mg/dL或10mg/dL。
某些未经修饰的细菌不具有可估量水平的草酸盐或草酰辅酶A加工。在使用这些细菌的遗传修饰形式的实施方案中,草酸盐和/或草酰辅酶A的加工在外源环境条件下将是可估量的。
草酸盐和/或草酸水平可以通过本领域已知的方法来测量。例如,可以使用Ladwig等人所述的分光光度血浆草酸盐测定来测量血浆草酸盐水平(Ladwig等人,Clin.Chem.51:2377-80(2005))。此外,可以例如通过使用草酸氧化酶比色酶测定来测量尿草酸盐水平(Kasidas和Rose,Ann.Clin.Biochem.22:412-9(1985))。在一些实施方案中,通过本领域已知的方法测量草酸分解代谢酶(例如Frc)的表达。在另一个实施方案中,通过本领域已知的方法测量草酸分解代谢酶的活性,以评估Frc活性(参见上文的草酸分解代谢酶部分)。
在某些实施方案中,重组细菌是大肠埃希氏菌菌尼斯勒。可以例如通过肠道或血液血清中的防御因子(Sonnenbom等人,2009)或通过在施用后几小时或几天激活杀灭开关来破坏重组细菌。因此,可以将包含重组细菌的药物组合物以治疗有效剂量和频率重新施用。在替代性实施方案中,重组细菌在施用后数小时或数天内不会被破坏,并且可以在肠道中繁殖和定殖。
在一个实施方案中,将本文公开的细菌细胞向受试者每天施用一次。在另一个实施方案中,将本文公开的细菌细胞向受试者每天施用两次。在另一个实施方案中,将本文公开的细菌细胞向受试者每天施用三次。在另一个实施方案中,将本文公开的细菌细胞与膳食联合施用于受试者。在另一个实施方案中,在膳食之前将本文公开的细菌细胞施用于受试者。在另一个实施方案中,在膳食之后将本文公开的细菌细胞施用于受试者。在另一个实施方案中,本发明的细菌细胞不以食物或可食用产品的形式施用或者不被掺入食物或可食用产品中。可以根据症状的严重程度和疾病的进展来选择药物组合物的剂量和施用频率。治疗临床医生可以选择适当的治疗有效剂量和/或施用频率。
在一个实施方案中,以约1x1011个活重组细菌、约2x1011个活重组细菌、约3x1011个活重组细菌、约4x1011个活重组细菌、约4.5x1011个活重组细菌、约5x1011个活重组细菌、约6x1011个活重组细菌、约1x1012个活重组细菌或约2x1012个活重组细菌的剂量施用重组细菌。在一个实施方案中,重组细菌以约6x1011个活重组细菌的剂量施用。在一个实施方案中,重组细菌以约3x1011个活重组细菌的剂量施用。在一个实施方案中,重组细菌以约1x1011个活重组细菌的剂量施用。在一个实施方案中,施用为约4.5x1011个活重组细菌。在一个实施方案中,施用为约5x1011个活重组细菌。在一个实施方案中,重组细菌以约1x1012个活重组细菌的剂量施用。在一个实施方案中,重组细菌以约2x1012个活重组细菌的剂量施用。在一个实施方案中,每天三次与膳食一起施用约5x1011个活重组细菌。在一个实施方案中,重组细菌以约1x1011个活重组细菌至约2x1012个活重组细菌的剂量施用。在一个实施方案中,重组细菌以约1x1012个活重组细菌至约2x1012个活重组细菌的剂量施用。在一个实施方案中,重组细菌以约5x1011个活重组细菌至约2x1012个活重组细菌的剂量施用。
在另一个实施方案中,向受试者施用质子泵抑制剂(PPI)。在另一个实施方案中,PPI是埃索美拉唑。在另一个实施方案中,埃索美拉唑以40mg每日施用一次。其他合适的PPI是本领域已知的,并且包括兰索拉唑、泮托拉唑、雷贝拉唑、埃索美拉唑和右兰索拉唑。在另一个实施方案中,PPI的施用是每天一次。
本文公开的方法可以包括将本文公开的组合物单独施用或与一种或多种附加疗法(例如,吡多辛、柠檬酸盐、正磷酸盐和镁、口服钙补充剂和胆汁酸螯合剂)或低脂肪和/或低草酸盐饮食联合施用。在选择一种或多种附加治疗剂时,一个重要的考虑因素是所述治疗剂应该与本文公开的细菌相容,例如所述治疗剂必须不干扰或杀灭所述细菌。在一些实施方案中,将遗传工程化细菌与低脂肪和/或低草酸盐饮食联合施用。在一些实施方案中,施用遗传工程化细菌提供了增加的耐受性,使得患者可以消耗更多的草酸盐和/或脂肪。
本文公开的方法还可以包括在施用本文公开的组合物之前从受试者中分离血浆样品,并且确定样品中的草酸盐和/或草酸水平。在一些实施方案中,本文公开的方法还可以包括在施用本文公开的组合物之后从受试者中分离血浆样品,并且确定所述样品中的草酸盐和/或草酸水平。
本发明的方法还可以包括在施用本发明的组合物之前从受试者中分离尿液样品,并且确定所述样品中的草酸盐和/或草酸水平。在一些实施方案中,本发明的方法还可以包括在施用本发明的组合物之后从受试者中分离尿液样品,并且确定所述样品中的草酸盐和/或草酸水平。
在一个实施方案中,本文公开的方法还包括将在向受试者施用本文公开的组合物之后的受试者血浆样品中的草酸盐和/或草酸水平与在向受试者施用本文公开的组合物之前的受试者血浆样品中的草酸盐和/或草酸水平进行比较。在一个实施方案中,在施用本文公开的组合物之后受试者血浆样品中的草酸盐和/或草酸水平的降低表明血浆草酸盐和/或草酸水平降低,从而治疗了受试者中的草酸盐有害的病症。在一个实施方案中,与在施用药物组合物之前的样品中的血浆水平相比,在施用药物组合物之后的样品中的血浆草酸盐和/或草酸水平降低至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。在一个实施方案中,与在施用药物组合物之前的样品中的血浆水平相比,在施用药物组合物之后的样品中的血浆草酸盐和/或草酸水平降低至少2倍、3倍、4倍或5倍。
在一个实施方案中,本发明的方法还包括将在向受试者施用本发明的组合物之后的受试者尿液样品中的草酸盐和/或草酸水平与在向受试者施用本发明的组合物之前的受试者尿液样品中的草酸盐和/或草酸水平进行比较。在一个实施方案中,在施用本发明的组合物之后受试者尿液样品中的草酸盐和/或草酸水平的降低表明尿草酸盐和/或草酸水平降低,从而治疗了受试者中的草酸盐有害的病症。在一个实施方案中,与在施用药物组合物之前的样品中的血浆水平相比,在施用药物组合物之后的样品中的尿草酸盐和/或草酸水平降低至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。在一个实施方案中,与在施用药物组合物之前的样品中的尿水平相比,在施用药物组合物之后的样品中的尿草酸盐和/或草酸水平降低至少2倍、3倍、4倍或5倍。
在一个实施方案中,本文公开的方法还包括将在施用本文公开的组合物之后的受试者血浆样品中的草酸盐/草酸水平与对照草酸盐和/或草酸水平进行比较。
在另一个实施方案中,本发明的方法还包括将在施用本发明的组合物之后的受试者尿液样品中的草酸盐/草酸水平与对照草酸盐和/或草酸水平进行比较。
实施例
通过以下实施例进一步说明本发明,这些实施例不应被理解为以任何方式进行限制。在整个本申请中引用的所有引用参考文献(包括文献参考文献、授权专利和公开的专利申请)的内容以引用的方式整体明确并入本文。还应该理解的是,其所有附图和表格的内容也以引用的方式明确并入本文。
实施例1.遗传工程化大肠埃希氏菌尼斯勒细菌菌株随着时间的推移降低草酸盐浓度。
进行了体外和体内两种实验,证明大肠埃希氏菌尼斯勒细菌菌株随着时间的推移降低草酸盐浓度。
具体而言,如图1所示进行功能性体外测定。该测定的结果证明,与野生型大肠埃希氏菌尼斯勒细菌菌株相比,遗传工程化大肠埃希氏菌尼斯勒细菌菌株随着时间的推移降低了草酸盐浓度(参见图1)。
还进行了动物体内实验。在第0天,将小鼠称重、标记并随机分成4组。从第1天开始,使用以下方案。
第1天:
T0:
-PO给药100μL(100μg)的13C-草酸盐
-PO给药200μL治疗
T1:
-PO给药300μL治疗
T6:收集尿液、粪便
以3.12e10 CFU的高剂量、1.04e10 CFU的中剂量和3.46e9 CFU的低剂量(总CFU)向动物给药。
图2A中所描绘的结果证明,与野生型菌株相比,遗传工程化大肠埃希氏菌尼斯勒菌株降低了治疗小鼠的尿液中检测到的急性13C-草酸盐水平。
图2B中所描绘的结果证明,与野生型菌株相比,遗传工程化大肠埃希氏菌尼斯勒菌株降低了治疗小鼠的尿液中检测到的慢性草酸盐水平。
表14.包含由Tet响应性启动子驱动的草酸分解代谢盒的构建体
表15列出了在lacZ基因座处的染色体整合的OxlT的构建体。
表15.包含由tet诱导型启动子驱动的OxlT(草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白)的构建体
表16.包含在FNR启动子的控制下的草酸分解代谢盒(pFNRS-ScAAE3-oxc-frc)的构建体
表17.包含在FNR启动子的控制下的OxlT(草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白)的构建体
表18.由FNRS启动子驱动的草酸分解代谢盒(oxc-frc)
表19.由FNRS启动子驱动的草酸分解代谢盒(yfdE-oxc-frc)
样品制备
在水中制备10mg/mL的草酸储备液,并将其等分到1.5mL微量离心管(100μL)中并储存在-20℃下。在水中制备标准品(1000μg/mL、500μg/mL、250μg/mL、100μg/mL、20μg/mL、4μg/mL和0.8μg/mL)。在冰上,在V形底96孔板中将20μL样品(和标准品)与180μL H2O混合以在最终溶液含有10μg/mL草酸-d2。用ClearASeal片热密封板并充分混合。
LC-MS/MS方法
使用Thermo TSQ Quantum Max三重四极杆质谱仪通过液相色谱偶联串联质谱(LC-MS/MS)来测量草酸盐。表20、表21和表22提供了LC-MS/MS方法的总结。
表20.
柱 | Synergi Hydro柱,4μm(75x4.6mm) |
流动相A | 5mM乙酸铵 |
流动相B | 甲醇 |
注射体积 | 10uL |
表21.HPLC方法:
时间(分钟) | 流速(μL/min) | A% | B% |
0.0 | 500 | 100 | 0 |
0.5 | 500 | 100 | 0 |
1.0 | 500 | 5 | 95 |
2.5 | 500 | 5 | 95 |
2.51 | 500 | 100 | 0 |
2.75 | 500 | 100 | 0 |
表22.串联质谱
离子源 | HESI-II |
极性 | 阴性 |
SRM转换 | 草酸盐:90.5/61.2 |
SRM转换 | 草酸盐-d2:92.5/62.2 |
表23.引物序列
表24.Pfnr1-lacZ构建体序列
描述 | SEQ ID NO |
Pfnr1-lacZ构建体的核苷酸序列,低拷贝 | SEQ ID NO:53 |
表25.Pfnr2-lacZ构建体序列
描述 | SEQ ID NO |
Pfnr2-lacZ构建体的核苷酸序列,低拷贝 | SEQ ID NO:54 |
表26.Pfnr3-lacZ构建体序列
描述 | SEQ ID NO |
Pfnr3-lacZ构建体的核苷酸序列,低拷贝 | SEQ ID NO:55 |
表27.Pfnr4-lacZ构建体序列
描述 | SEQ ID NO |
Pfnr4-lacZ构建体的核苷酸序列,低拷贝 | SEQ ID NO:56 |
表28.Pfnrs-lacZ构建体序列
描述 | SEQ ID NO |
Pfnrs-lacZ构建体的核苷酸序列,低拷贝 | SEQ ID NO:57 |
实施例2.其他所关注的序列
表29.prpR丙酸盐响应性启动子序列
描述 | SEQ ID NO |
Prp启动子 | SEQ ID NO:58 |
表30.野生型clbA和clbA敲除
描述 | SEQ ID NO |
野生型clbA | SEQ ID NO:59 |
clbA敲除 | SEQ ID NO:60 |
实施例3.急性小鼠模型和健康猴子中的草酸盐浓度的降低
当在胃肠道(GI)中过量吸收草酸盐时,会发生肠道高草酸尿症,这导致草酸盐在肾脏中积聚,并可导致复发性肾结石和肾衰竭。已经表明减少胃肠道中的草酸盐在临床上有益于患者。然而,目前没有可用的疗法,并且仅在美国就有超过80,0000名重症患者。这些患者可能具有复发性肾结石和肾衰竭风险。
如本文所证明的,工程化细菌菌株具有在胃、小肠和结肠中运作以降低血液中草酸盐吸收的巨大潜力(图3)。
在急性小鼠模型和健康猴子中进行的体内实验证明,大肠埃希氏菌尼斯勒细菌菌株随着时间的推移降低草酸盐浓度。具体而言,已经构建了三种工程化大肠埃希氏菌尼斯勒菌株(SYN5752、SYN7169和SYNB8802)。SYN7169衍生自SYN5752,唯一的区别是thyA和噬菌体3ko(序列包括在表36中)。基因型如下所示。
SYN5752:HA910::FNR_oxlT,HA12::FNR_scaaE3-oxcd-frc
.SYN7169:HA910::FNR_oxlT,HA12::FNR_scaaE3-oxcd-frc,ThyA::KanR,噬菌体3::CamR
SYN7169和SYNB8802具有相同的遗传修饰,但是SYN7169也具有氯霉素和卡那霉素抗性盒以帮助在选择性培养基上分离。
相关序列包括在上文所示的表格和表36中。SYNB8802(图4A)包括在厌氧诱导型启动子(pFnrs)和厌氧响应性转录激活因子FNR的调控控制下的编码源自产甲酸草酸杆菌的草酸盐反向转运蛋白(OxlT)的一个基因的插入、以及编码在厌氧诱导型启动子(pFnrs)和厌氧响应性转录激活因子FNR的调控控制下的三个基因(源自酿酒酵母的草酰辅酶A合成酶(scaae3)、源自产甲酸草酸杆菌的草酸脱羧酶(oxdc)和源自产甲酸草酸杆菌的甲酰辅酶A转移酶)的一个操纵子的插入、编码胸苷酸合酶的thyA基因的缺失以创造胸苷营养缺陷型,并且内源性尼斯勒噬菌体已经失活。相关序列包括在本文的表格中。
如上所述进行体外实验。来自该测定的结果证明,与野生型大肠埃希氏菌尼斯勒细菌菌株相比,遗传工程化大肠埃希氏菌尼斯勒细菌菌株(SYNB8802)随着时间的推移降低了草酸盐浓度(参见图4B)。
此外,与野生型大肠埃希氏菌尼斯勒细菌菌株相比,遗传工程化大肠埃希氏菌尼斯勒细菌菌株(SYNB8802)随着时间的推移增加甲酸盐浓度(图4C)。大肠埃希氏菌尼斯勒(对照)和SYNB8802在摇瓶中生长,并且随后在厌氧室中被激活,接着在基于甘油的配方缓冲液中浓缩并冷冻在≤-65℃下。在含有10mM13C-草酸盐的测定培养基中,光密度=5的活化细胞在37℃下静态孵育。在30和60分钟时取出上清液样品,以确定13C-草酸盐和13C-甲酸盐的浓度。通过液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)确定13C-草酸盐和13C-甲酸盐的浓度。
体外胃肠道模拟(IVS)
胃和结肠模拟肠液都能够在模拟的体外激活SYNHOX(图5A)。当与模拟结肠液中的草酸盐消耗相比时,模拟的胃液激活SYNHOX(SYN5752)草酸盐消耗活性超过两倍之多(图5A)。
为了表征工程化细菌菌株的存活力和代谢活性,并预测它们在体内的功能,设计了体外胃肠道模拟(IVS)模型来模拟人类胃肠道的关键方面,包括氧浓度、胃酶和胰酶以及胆汁。IVS模型由设计用于模拟胃、小肠和结肠条件的一系列96孔微量板形式的孵育构成。IVS模型的胃、小肠、结肠部分改编自Minekus等人,2014。
简而言之,细菌细胞的冷冻等分试样首先在室温下解冻,并以5.0×109个活细胞/mL重悬于0.077M碳酸氢钠缓冲液中。然后将该溶液与相等份的含有10mM草酸盐的模拟胃液(SGF;Minekus等人,2014)混合,并且在Coy微需氧室中于37℃下振荡孵育2小时。微需氧室内的气氛最初被校准为7%氧,并在2小时内逐渐降低至2%氧。SGF中的细胞密度为2.5x109个活细胞/mL。2小时后,接着将细胞以1∶1的体积与模拟肠液(SIF;Minekus等人,2014)混合,并在Coy微需氧室中在37℃下再振荡孵育2小时。SIF中的细胞密度为1.25x109个活细胞/mL。2小时后,将细胞移入厌氧室中,并与基于SGF的结肠模拟培养基(CSM;Minekus等人,2014)1:6混合。CSM具有附加的10mM草酸盐,并在37℃下孵育3小时。CSM中的细胞密度为2.08x106个活细胞/mL。
为了确定随着时间的推移的菌株活性,定期收集等分试样,并使用台式离心机以4000rpm离心5分钟。在质谱分析草酸盐浓度之前,收集无细胞上清液并储存在-80℃。
体内小鼠模型研究
对于体内小鼠研究,在第0天,将小鼠称重、标记并随机分成4组。从第1天开始,使用以下方案。
第1天:
T0:
-PO给药100μL(100μg)13C-草酸盐
-PO给药200μL治疗
T1:
-PO给药300μL治疗
T6:收集尿液、粪便
以3e10 CFU的高剂量、1e10 CFU的中剂量和3e9 CFU的低剂量(总CFU)向动物给药。
如图5B所示,在急性同位素模型中,SYN-5752菌株展现出在肠道中的尿草酸盐消耗。已经在多次急性小鼠研究中测量了13C-草酸盐消耗,并且菌株功效的范围在50%-75%之间(图5B)。在该模型中,SYN7169的行为类似于SYN5752。
在不同的实验中,C57BL/6J雄性小鼠被分组饲养并口服施用一定剂量的13C-草酸盐(100μg),接着施用一定剂量的媒介物(13.8%w/v海藻糖、68mMTris、55mMHCl、1×PBS)或SYNB8802。将小鼠立即放入代谢笼中(n=3只/笼),并在第一个剂量后1小时接受另一个剂量的媒介物或SYNB8802,每天总计4.7x108个、4.7x109个或4.7x1010个活细胞。在剂量1后6小时收集尿液,并且通过液相色谱/串联质谱(LC-MS/MS)对13C-草酸盐和肌酐水平进行定量。进行了两项研究,并将结果合并(图5C)。
体内猴子模型研究
对于体内猴子研究,将动物随机分配到2个组中,媒介物(配方缓冲液)和SYN7169(5e11个细胞)。每个组中N=6。禁食过夜后,每只动物接受相同量的菠菜奶昔(spinachsmoothie)、13C-2标记的草酸盐、碳酸氢钠(1M)和媒介物或菌株(参见表32)。通过以60gm:40mL的菠菜:水的比率将嫩菠菜叶子混合在自来水中直到光滑来制备菠菜奶昔。
具体而言,在第1天通过口服管饲法向适当的动物施用治疗。在每个剂量施用之前,将加盖的细菌管倒置3次。使用与塑料注射器连接的一次性导管通过口服管饲法施用剂量制剂。给药后,用5mL动物饮用水冲洗管饲管到动物胃中。每只动物都用干净的管饲管给药。给药的第一天被指定为第1天。
表31:实验设计
PO给药6小时后收集尿液。将动物分开,并且在给药前插入干净的收集盘以帮助在室温下进行尿液收集。在给药后6小时结束时,测量并记录尿液总量。将1mL样品的一个等分试样收集在独特标记的透明聚丙烯管中,并立即在干冰上冷冻。将大约100uL的第二等分试样收集在96深孔板中,并立即在干冰上冷冻。
使用Thermo Vanquish-TSQ Altis LC-MS/MS系统,通过液相色谱(LC)串联质谱(MS/MS)和分析物特异性裂解产物的选择性反应监测(SRM)测量猴子或非人类灵长类动物(NHP)尿液中的草酸盐、13C2-草酸盐和肌酐。用含肌酐-d5的10mM乙酸铵将尿液稀释十倍,注射2uL,并使用Waters Acquity HSS T3柱(2.1x100mm)以0.4uL/min和在50℃下在两分钟内从0%B到95%B进行分离(A:10mM乙酸铵;B:乙腈)。SRM离子跃迁如下:在电喷雾负离子模式下:草酸盐89>61,13C2-草酸盐91>62;在电喷雾阳性模式下:肌酐114>44,肌酐-d5199>49。使用绝对峰面积和在NHP尿中构建的基于基质的标准曲线计算草酸盐和13C2-草酸盐的样品浓度。使用肌酐/肌酐-d5峰面积比和基于水的标准曲线计算肌酐浓度。
如图6所示,虽然菠菜奶昔增加了治疗猴子中的尿草酸盐水平,但工程化EcN(SYN7169)显著减弱了尿草酸盐的这些增加。与媒介物相比,在5x1010、1x1011、5x1011或1x1012CFU下,SYN7169剂量依赖性地将尿草酸盐的回收分别降低了45%、37%、45%和75%(参见图7A)。SYN7169对13C-草酸盐的作用遵循相同的趋势(参见图7B)。总之,这些研究表明,SYN7169在患有急性高草酸尿症的猴子中能够消耗草酸盐。
在第二项研究中,12只雄性食蟹猴接受媒介物和SYNB8802两者。在研究的前一天晚上,动物禁食大约16-18小时。在实验的早晨,将每只猴子从其笼子中取出,并施用媒介物(水)或菠菜悬浮液(39g)、碳酸氢钠(1.8mmol)、13C-草酸盐(50mg)和媒介物(13.8%w/v海藻糖、68mM Tris、55mM HCl、1×PBS)或SYNB8802(1x1012个活细胞)。然后将动物放回其笼子,并且在每个笼子的底部放置一个干净的尿液收集盘。在给药后6小时收集尿液,并通过液相色谱/串联质谱(LC-MS/MS)对草酸盐、13C-草酸盐和肌酐的水平进行定量(图7C)。
粪便样品中的活SYNHOX
在向小鼠和非人灵长类动物(NHP)两者施用口服剂量后6小时和24小时,在粪便中回收了活的SYNHOX。在两个时间点都回收了大量的活的SYNHOX(SYN7169)和SYNB8802。
从小鼠粪便中回收了活的SYNB8802和野生型大肠埃希氏菌,并且在摄入后72小时内的多个时间点是存活的(图8A)。SYNB8802在24小时后从粪便中清除,而野生型菌株在摄入后72小时清除。简而言之,C57BL/6J小鼠被分组饲养,并且基于平均笼体重被分配到各个组(n=16)。小鼠接受单次口服剂量的治疗(1.3x1010CFU),并通过自由捕获收集新鲜粪便,并置于含有500mL PBS的预先称重的BeadBug管中,称重,然后处理以进行系列稀释铺板,以在收集后立即确定活的菌落形成单位(CFU)。将数据表示为平均细菌菌株粪便回收±平均值的标准误差。CFU=集落形成单位,SYNB8802*=抗生素抗性SYNB8802。
在一项单独的实验中,十二只雄性猴子在研究前一天晚上禁食。在研究的早晨,将每只猴子从其笼子中取出,并施用菠菜悬浮液、碳酸氢钠、13C-草酸盐和制剂缓冲液或细菌。给药后6小时和24小时收集粪便,并记录总重量。将粪便样品用磷酸盐缓冲盐水(PBS;10倍样品重量)进行同质化,并记录所添加的缓冲液的最终体积。粪便样品悬浮液在PBS中进行系列稀释,并铺板在选择性LB琼脂培养基上,以计数SYN7169或SYNB8802菌落形成单位(CFU)(图8B)。
实施例4:制剂和人类治疗
如图9-10中所示,分别测试了SYNB8802和SYN7169冻干制剂相对于冷冻液体制剂的草酸盐消耗。将雄性食蟹猴(大约2-5岁,并且平均体重3.3kg)禁食过夜。食蟹猴(n=12)接受了含有大约400mg草酸盐(包括标记的13C-草酸盐)的菠菜制剂。一个组接受SYNB8802冷冻液的5x1011个活细胞(n=6),并且另一个组接受SYNB8802冻干物质的5x1011个活细胞(n=6)。收集6小时的尿液,并且通过液相色谱/质谱测量累积的尿草酸盐和肌酐水平。在下面表32中公开了上文公开的NHP“菠菜奶昔”模型中所测试的菌株和量。活细胞测定至少如标题为“通过活细胞计数技术对遗传工程化微生物进行计数(Enumeration of GeneticallyEngineered Microorganisms by Live Cell Counting Techniques)”的PCT国际申请号PCT/US2020/030468中所描述进行计算,所述申请的全部内容以引用的方式明确并入本文。
表32.
如图11A中所示,模型预测SYNB8802在目标剂量范围内具有实现20%-50%尿草酸盐降低的潜力。建模包括在模拟条件下在不同肠道区室内的菌株活性评估、已知的饮食草酸盐消耗水平、胃肠道的草酸盐吸收水平和尿草酸盐排泄。因此,在一个实施方案中,SYNB8802的剂量为5x1011个细胞。在一个实施方案中,SYNB8802的剂量为2x1011个细胞。在一个实施方案中,SYNB8802的剂量为1x1011个细胞。
计算机模拟(ISS)将体外菌株活性知识与宿主和疾病生物学联系起来。菌株侧模型模拟了胃肠道生理学中SYNB8802对草酸盐的消耗(图11B)。宿主侧模型(整体示意图)模拟了SYNB8802的消耗对草酸盐在全身分布的影响(图11B)。所述模型假设SYNB8802与膳食一起给药,并预测肠道草酸盐的消耗及其在血液中的吸收的减少。ISS预测,在剂量大于1x1011个细胞下,SYNB8802具有使患者的尿草酸盐降低大于20%的潜力。
ISS预测尿草酸盐的剂量依赖性降低(图11C)。将数据呈现为HOX患者的饮食草酸盐吸收增加的基线假设(4x健康吸收);有界区域代表假设的范围(3x-5x健康吸收)。
实施例5:临床试验
临床试验第I部分被设计成在健康志愿者(HV)的住院、双盲、随机化、安慰剂对照的多剂量递增(MAD)研究中测试SYNB8802。SYNB8802将以多个递增剂量(例如1x1011个细胞、3x1011个细胞、4.5x1011个细胞和1x1012个细胞,优选地以6x1011个细胞和2x1012个细胞的剂量,或安慰剂)口服施用。SYNB8802的剂量优选地将不超过2x1012个细胞。将每天三次(TID)施用剂量,持续5天。在此期间,遵循高草酸盐、低钙饮食。将施用多个递增剂量以达到最终剂量浓度。第I部分中的可选群组将包括以根据每天施用三次持续5天所测试的第一群组的数据确定的剂量接受SYNB8802的健康志愿者。
临床试验第II部分被设计成在患有肠道高草酸尿症的患者的门诊、双盲、随机化、安慰剂对照的交叉研究中测试SYNB8802。任选地,肠道高草酸尿症是胃旁路手术的结果,即继发于Roux-en-Y减肥手术的肠道高草酸尿症。如果SYNB8802在本研究中表现出良好的耐受性和安全性,则将进行后续研究以评价SYNB8802在患有继发于其他胃肠道病症的EH的患者中的安全性和功效。
为了确定第1期的基线UOx水平,将在研究医药产品(IMP)第一剂量的7天内收集3天的24小时尿液样品(图12)。将IMP以1x1011、3x1011或1x1012且不超过2x1012的剂量TID施用。受试者将服用质子泵抑制剂(PPI;埃索美拉唑),在他们选择的膳食前60-90分钟每天一次,从每个周期的第一个IMP剂量前四天开始,直到每个周期的最后一个IMP剂量。受试者将在第1天随机化以接受第1部分中确定的最大耐受剂量(MTD)或以下的SYNB8802或者安慰剂,然后在第1-6天与膳食一起每天三次(TID)进行给药。四天前,将施用多个递增剂量以达到最终剂量浓度。将在第4-6天收集用于确定24小时草酸盐水平的尿液样品。在至少2周且不超过4周的清除期后,受试者将交叉并开始第二个周期。为了确定第2期的基线UOx水平,将在第2期IMP的第一个剂量的7天内收集3天的24小时尿液样品。然后,受试者将交叉给药SYNB8802或安慰剂,持续6天。将在第2期的第四天、第五天和第六天再次收集24小时草酸盐水平的尿液样品。最后一个剂量的IMP后7天将进行安全性随访就诊(或远程医疗)。受试者将在最后一个剂量的IMP后的4周内每周收集粪便样品。
表33
第2部分:SYNB8802在患有肠道高草酸尿症的受试者中的药效作用
第2部分是一项针对SYNB8802在患有肠道高草酸尿症的受试者中的双盲(主办方开放)、门诊、安慰剂对照的交叉研究。在整个本研究中的所有受试者评价和评估可以在临床场所进行,也可以由家庭保健专业人员在替代场所(例如,受试者的家、酒店)进行。受试者将在整个研究过程中保持其正常饮食,他们将在基线UOx和治疗期期间需要24小时尿液收集的那些日子使用日记记录下来。为了确定给药期1的基线UOx水平,将在开始给药期1的7天内收集3天的24小时尿液样品。受试者将在他们选择的膳食前60-90分钟服用PPI(埃索美拉唑)QD,从每个周期的第一次IMP剂量前4天开始,直到每个周期的最后一个IMP剂量。受试者将在第-7天至第-4天之间随机分配以接受等于或低于第1a部分中定义的MTD的SYNB8802或安慰剂。在给药期1期间,受试者将与一次或多次膳食一起每天给药至多3次IMP,持续至多10天。研究者认为不能进行到超越QD或BID给药的受试者可以保持QD或BID给药。以TID给药但不能耐受它的受试者可以降级至QD或BID给药。用于确定24小时草酸盐水平的尿液样品将在治疗期1的第4-6天收集。接下来将是至少2周但不超过4周的清除期。在清除期后,受试者将交叉并开始周期2。为了确定给药期2的基线UOx水平,将在开始给药期2的7天内收集3天的24小时尿液样品。然后,受试者将在给药期2期间交换以给药SYNB8802或安慰剂,至多TID,持续至多10天。将在治疗期2的第4-6天收集24小时草酸盐水平的尿液样品。在最后一个剂量的IMP后7天,将通过家庭保健专业人员或通过远程医疗进行安全性随访就诊。受试者将在基线时收集粪便样品,并在最后一个剂量的IMP后的至多4周内每周收集粪便样品。
主要结果量度为治疗突发不良事件的受试者的数量。将根据美国国家癌症研究所不良事件通用术语(National Cancer Institute Common Terminology for AdverseEvent,CTCAE0,版本5.0)对毒性进行分级。从签署知情同意书的时间到安全性随访期结束,基于临床实验室试验、生命体征、体检、心电图和其他医学指征评估报告不良事件(AE)。如果在第一个剂量的研究治疗之后发生或严重程度恶化,则AE被视为治疗突发事件(TEAE)。如果与研究药物的关系可能相关、很可能相关或肯定相关,则TEAE被认为是治疗相关的。
剂量群组和剂量递增:
根据先前测试的类似大肠埃希氏菌尼斯勒产品的临床和非临床安全性和耐受性,本研究第1a部分中SYNB8802的起始剂量为1×10^11个活细胞。每个群组的剂量递增为大约3倍和至多5倍,并且可以建立任选的剂量爬坡(dose ramp)。最大剂量将不超过2×10^12个活细胞。剂量可以向上或向下调整,并且基于正在进行的评估制定剂量爬坡。将基于耐受性(观察到的不良事件[AE])、临床观察、安全性实验室评估以及任选地基于药效学(PD)做出剂量调整决定。第1a部分的MTD被定义为正好在≥4名受试者经历IMP相关不良事件通用术语标准(CTCAE)2级或≥2名受试者经历治疗相关3级或更高级的毒性的剂量水平之前的剂量。
在进行到下一个剂量之前,必须就安全性和耐受性数据支持剂量递增达成一致。可能建议在当前剂量下扩展剂量水平,递增到下一个更高剂量,降低到更低的剂量,或宣布已达到MTD。此外,可以添加长达8天的剂量爬坡期,以提高耐受性。在剂量爬坡(如果适用)后,受试者将继续以目标剂量水平给药5天(即,总给药期可以延长至多13天)。第1b部分和第2部分中的剂量将等于或低于第1a部分中所定义的MTD。
在第1a部分中,计划招募大约90名受试者(每个群组中6名用SYNB8802治疗,3名用安慰剂治疗)。在第1b部分中,计划在第1b部分中招募至多60名受试者(第1组:16名受试者;第2组:32名受试者;和第3组:12名受试者)。在第2部分中,计划招募至多20名受试者(每名受试者将接受SYNB8802和安慰剂)。
资格标准
第I部分:纳入标准
1.年龄≥18岁至≤64岁。
2.身体质量指数(BMI)18.5至28kg/m2。
3.能够并愿意自愿完成知情同意程序。
4.可用于并同意所有研究程序,包括粪便、尿液和血液采集以及遵守饮食控制、住院监测、随访就诊和依从所有研究程序。
5.禁欲或手术绝育(输精管结扎术)的男性受试者,或在知情同意后、在整个研究过程中和在最后一个剂量的IMP后至少3个月内与女性伴侣有性活动并同意使用可接受的避孕方法(诸如含杀精剂的避孕套)结合其非怀孕女性伴侣可接受的避孕方法(如纳入标准#6所定义)的男性受试者,以及在从筛查直至施用研究药物产品后3个月的时期内不打算捐献精子的男性受试者。
6.符合以下中的1项的女性受试者:
a.具有生育能力的妇女(WOCBP)必须在筛查时和在开始IMP前的基线时具有阴性妊娠试验(人绒毛膜促性腺激素),并且必须同意
在知情同意后、在整个研究过程中和在最后一个剂量的IMP后至少3个月内使用一种或多种可接受的避孕方法,结合其男性伴侣可接受的避孕方法(如纳入标准#5所定义)。可接受的避孕方法包括激素避孕、激素或非激素宫内节育器、双侧输卵管阻塞、完全禁欲、手术后3个月有记录的无精子症的输精管结扎伴侣、含杀精剂的隔膜、含杀精剂的宫颈帽、含杀精剂的阴道海绵或含或不含杀精剂的男性或女性避孕套。
b.有以下中的至少1项的绝经前妇女:
i.有记录的子宫切除术ii.有记录的双侧输卵管切除术iii.有记录的双侧卵巢切除术iv.有记录的输卵管结扎/阻塞v.禁欲是受试者的首选或惯常生活方式
c.绝经后妇女(通过促卵泡激素[FSH]评估证实且年龄在45岁以上无其他生物学或生理学原因的12个月或以上的闭经)。
第Ⅰ部分:排除标准
1.可能增加与研究参与相关的受试者风险,损害对研究程序和要求的遵守或者可能混淆研究安全性或PD结果的解释并且根据研究者的判断会使受试者不适合入组的急性或慢性医学(包括COVID-19感染)、手术、精神病学或社会疾患或实验室异常。
2.身体质量指数(BMI)<18.5或>28kg/m2。
3.产甲酸草酸杆菌携带者。
4.怀孕(自己或伴侣)或哺乳期。
5.不能或不愿意在研究持续期间停止维生素C补充。
6.免疫缺陷病症的病史或现状,包括自身免疫性病症和人类免疫缺陷病毒(HIV)抗体阳性。
7.乙型肝炎表面抗原阳性(不排除乙型肝炎表面抗体阳性和乙型肝炎核心抗体阳性的受试者,前提是乙型肝炎表面抗原呈阴性)。
8.丙型肝炎抗体阳性,除非进行丙型肝炎病毒核糖核酸检测并且结果呈阴性。
9.在预期的第一个剂量的IMP之前30天内,有发热性疾、确诊的菌血症或研究者认为具有临床意义的其他活动性感染的病史。
10.(过去一个月内)每天稀便3次或以上的病史;其中“稀便”在布里斯托尔粪便图表(Bristol Stool Chart)上被定义为6型或7型(参见附录1:布里斯托尔粪便图表)。
11.肾结石、肾脏或胰腺疾病史。
12.可能与UOx水平升高相关的胃肠道病症(包括任何级别的炎症性或过敏性肠病以及手术切除肠段)。
13.通过一种或多种住院相关事件证实的在筛查访视前60天内有胃肠道出血的活动史或既往史或呕血或便血的医学史
14.对一般EcN、埃索美拉唑或PPI或在SYNB8802或安慰剂制剂中的任一种成分的不耐受或过敏反应。
15.可能潜在影响药物或营养素吸收的任何疾患(例如,乳糜泻、胃切除术、旁路手术、回肠造口术)、处方药或非处方药品。
16.在第1天之前的30天内直到住院监测的最后一天,当前正在服用或计划服用任何类型的全身性(例如口服或静脉内)抗生素。例外:允许局部抗生素。
17.筛查前的过去3个月内的重大手术(在颅、胸、腹或盆腔内的器官上的手术)或住院期。
18.在筛查和最后一次预期就诊之间可能需要抗生素的计划的手术、住院、牙科工作或介入研究。
19.在第-1天之前的30天内以及在参与和随访期间服用或计划服用益生菌补充剂(不包括强化营养食品)。
20.酒精依赖或药物滥用。
21.在筛查访视前30天或5个半衰期(以较长者为准)内施用或摄入研究药物;或当前正在入组一项调查研究。
22.筛查实验室参数(例如,化学参数、血液学、凝血)和ECG,它们超出基于标准范围的正常限值或如下表34所定义或被研究者判定为具有临床意义。单次重复评价是可接受的。
表34
实验室参数 | 可接受范围 |
白细胞 | 3.0-14.0×109/L |
血小板 | >100×109/L |
血红蛋白 | >10g/dL |
第I部分;纳入标准
1.年龄≥18岁至≤74岁。
2.能够并愿意自愿完成知情同意程序。
3.可用于并同意所有研究程序,包括粪便、尿液和血液采集以及遵守饮食控制、随访就诊和依从所有研究程序。
4.继发于Roux-en-Y减肥手术的肠道高草酸尿症(术后至少12个月)。
5.尿草酸盐≥70mg/24小时(筛查期间收集至少2次尿液的平均值)。
6.禁欲或手术绝育(输精管结扎术)的男性受试者,或在知情同意后、在整个研究过程中和在最后一个剂量的IMP后至少3个月内与女性伴侣有性活动并同意使用可接受的避孕方法(诸如含杀精剂的避孕套)结合其非怀孕女性伴侣可接受的避孕方法(如纳入标准#7所定义)的男性受试者,以及在从筛查直至施用研究药物产品后3个月的时期内不打算捐献精子的男性受试者。
7.符合以下中的1项的女性受试者:
a.具有生育能力的妇女(WOCBP)必须在筛查时和在开始IMP前的基线时具有阴性妊娠试验(人绒毛膜促性腺激素),并且必须同意在知情同意后、在整个研究过程中和在最后一个剂量的IMP后至少3个月内使用可接受的避孕方法,结合其男性伴侣可接受的避孕方法(如纳入标准#6所定义)可接受的避孕方法包括激素避孕、激素或非激素宫内节育器、双侧输卵管阻塞、完全禁欲、手术后3个月有记录的无精子症的输精管结扎伴侣、含杀精剂的隔膜、含杀精剂的宫颈帽、含杀精剂的阴道海绵或含或不含杀精剂的男性或女性避孕套。
b.有以下中的至少1项的绝经前妇女:
i.有记录的子宫切除术ii.有记录的双侧输卵管切除术iii.有记录的双侧卵巢切除术iv.有记录的输卵管结扎/阻塞v.禁欲是受试者的首选或惯常生活方式
c.绝经后妇女(通过FSH评估证实且年龄在45岁以上无其他生物学或生理学原因的12个月或以上的闭经)。
8.筛查实验室评价(例如,化学参数、全血细胞计数和分类、凝血酶原时间[PT]/激活部分促凝血酶原激酶时间[aPTT]、尿液分析)和心电图(ECG)必须在正常限值内,或者被研究者判定为无临床意义。
第II部分:排除标准
1.可增加与研究参与相关的受试者风险,损害对研究程序和要求的遵守或者可能混淆研究安全性或PD结果的解释并且根据研究者的判断会使受试者不适合入组的急性或慢性医学(包括COVID-19感染)、手术、精神病学或社会疾患或实验室异常。
2.急性肾衰竭或eGFR<45mL/min/1.73m2。单次重复评价是可接受的。
3.不能或不愿意在研究持续期间停止维生素C补充。
4.原发性高草酸尿症或任何其他原因的高草酸尿症的诊断。
5.产甲酸草酸杆菌携带者。
6.怀孕(自己或伴侣)或哺乳期。
7.在第1天之前的30天内直到最终安全性评估,当前正在服用或计划服用任何类型的全身性(例如口服或静脉内)抗生素。例外:允许局部抗生素。
8.筛查前的过去3个月内的重大手术(在颅、胸、腹或盆腔内的器官上的手术)或住院期。
9.在筛查和最后一次预期就诊之间计划的手术、住院、牙科工作或介入研究。
10.在第-1天之前的30天内以及在参与期间服用或计划服用益生菌补充剂(不包括强化营养食品)。
11.对一般EcN、埃索美拉唑或PPI或在SYNB8802或安慰剂制剂中的任一种成分的不耐受或过敏反应。
12.酒精依赖或药物滥用。
13.免疫缺陷病症的病史或现状,包括自身免疫性病症和HIV抗体阳性。
14.乙型肝炎表面抗原阳性(不排除乙型肝炎表面抗体阳性和乙型肝炎核心抗体阳性的受试者,前提是乙型肝炎表面抗原呈阴性)。
15.丙型肝炎抗体阳性,除非进行丙型肝炎病毒核糖核酸测试并且结果呈阴性。
16.在筛查访视前30天或5个半衰期(以较长者为准)内施用或摄入研究药物;或当前正在入组一项调查研究。
17.在预期第一个剂量的IMP前30天内的菌血症史。
18.炎性肠病的病史。
临床方案总结
第1部分(健康志愿者):
主要目标是评价SYNB8802的安全性和耐受性。次要目标是评价SYNB8802在粪便中的微生物动力学。评估在平均草酸盐低钙(AOLC)饮食之后SYNB8802对尿草酸盐(UOx)排泄的影响。
探索性目标包括(i)评估SYNB8802对尿草酸盐(UOx)排泄量的影响,并且仅在第1b部分中,比较同时施用和不同时施用质子泵抑制剂(PPI)以及使用和不使用半乳糖时的这种影响,(ii)评估SYNB8802对UOx:肌酐比的影响,(iii)评估SYNB8802对尿生物标记(钾、钙、磷、尿酸、柠檬酸盐、镁、钠、氯化物、硫酸盐、铵、尿素氮和pH)的影响,(iv)评估SYNB8802对血浆草酸盐(POx)水平的影响,和(v)评估SYNB8802对粪便草酸盐水平(仅第1a部分)的影响。
附加的探索性目标包括(i)评估SYNB8802对与肾结石风险增加相关的生物标记的影响,(ii)评估SYNB8802对粪便草酸盐水平的影响,(iii)评估SYNB8802对血浆草酸盐(POx)水平的影响,(iv)评估预测草酸盐响应的潜在因素,(v)探索耐受性的潜在生物标记。
第2部分(患有肠道高草酸尿症的患者):
主要目标是评估SYNB8802对UOx排泄量的影响。次要目标是评估SYNB8802对UOx:肌酐比的影响,评价粪便中SYNB8802的微生物动力学,以及评价SYNB8802的安全性和耐受性。
探索性目标是评估(i)SYNB8802对POx水平的影响,(ii)SYNB8802对血清磷水平的影响,以及(iii)SYNB8802对尿生物标记(钾、钙、磷、尿酸、柠檬酸盐、镁、钠、氯化物、硫酸盐、铵和pH)的影响。
表35:研究群组的概述
BID=一天两次;HV=健康志愿者;IMP=研究医药产品;MTD=最大耐受剂量;QD=每天一次;TBD=待确定的;TID=每天三次;TP=治疗期;N/A=不适用。
a对于第1a部分,治疗期包括5天的IMP给药和1天的出院前评估。
b研究者认为不能进行到超越QD或BID给药的受试者可以保持QD或BID给药。以TID给药但不能耐受它的受试者可以降级至QD或BID给药。
研究医药产品:
SYNB8802(含有或不含半乳糖),1×1011个、3×1011个或1×1012个活细胞(可以基于正在进行的评估向上或向下调整,但将不会超过2×1012个),与膳食一起口服,每天至多3次(TID)或按照剂量爬坡计划表。与SYNB8802匹配的安慰剂,与膳食一起口服,至多TID或按照剂量爬坡计划表。
治疗持续时间
计划第1a部分中受试者参与研究的最长时间为至多132天,包括:(i)筛查期:至多90天(包括4天或5天饮食准备期);(ii)治疗期:至多14天(至多10个给药日,包括任选的剂量爬坡期与在下一天从CRU出院);和(iii)安全性随访期(包括粪便评估):28天。
计划第1b部分中受试者参与研究的最长时间为156天,包括:(i)筛查期:至多90天(包括5天饮食准备期),(ii)给药期和清除期:至多52天(例如,给药期1:至多8天,包括任选的剂量爬坡期;清除期:14天(包括5天饮食准备期);给药期2:至多8天,包括任选的剂量爬坡期;清除期:14天(包括5天饮食准备期);和给药期3:至多8天,包括任选的剂量爬坡期);(iii)安全性随访期(包括粪便评估):14天。
计划第2部分中受试者参与研究的最长时间为135天,包括:(i)筛查期:至多52天(包括给药期1的基线UOx);(ii)给药期1和2、清除期和给药期2的基线UOx:至多55天(例如,给药期1:至多10天,包括任选的剂量爬坡期;清除期:≥14天,且不超过28天;给药期2的基线UOx:给药期2开始前至多7天;和给药期2:至多10天,包括任选的剂量爬坡期);和(iii)安全性随访期(包括粪便评估):28天。
研究终点
第1部分:主要终点
·SYNB8802的安全性和耐受性,如通过不良事件、临床实验室测试和生命体征测量评估的次要终点
·SYNB8802的微生物动力学,在给药后通过定量聚合酶链反应(qPCR)从粪便中测量
探索终点
·经SYNB8802治疗的受试者的24小时UOx排泄量从基线的变化:(i)相对于安慰剂(仅第1a部分);(ii)有或没有PPI(仅第1b部分);和(iii)有或没有半乳糖(仅第1b部分)
·经SYNB8802治疗的受试者的UOx:肌酐比从基线的变化:(i)相对于安慰剂(仅第1a部分);(ii)有或没有PPI(仅第1b部分);和(iii)有或没有半乳糖(仅第1b部分)
·经SYNB8802治疗的受试者的尿生物标记(钾、钙、磷、尿酸、柠檬酸盐、镁、钠、氯化物、硫酸盐、铵、尿素氮和pH)从基线的变化:(i)相对于安慰剂(仅第1a部分);(ii)有或没有PPI(仅第1b部分);(iii)有或没有半乳糖(仅第1b部分)。
·经SYNB8802治疗的受试者的POx水平从基线的变化:(i)相对于安慰剂(仅第1a部分);(ii)有或没有PPI(仅第1b部分);(iii)有或没有半乳糖(仅第1b部分)。
·相对于安慰剂(仅第1a部分),经SYNB8802治疗的受试者的粪便草酸盐水平从基线的变化。
第2部分:主要终点
·相对于安慰剂治疗,SYNB8802治疗的24小时UOx排泄量从基线的变化。
次要终点
·相对于安慰剂治疗,SYNB8802治疗的UOx:肌酐比从基线的变化;
·用qPCR从粪便中测量的SYNB8802的微生物动力学;
·SYNB8802的安全性和耐受性,如通过不良事件、临床实验室试验和生命体征测量评估的。
探索终点
·相对于安慰剂治疗,SYNB8802治疗的POx水平从基线的变化;
·相对于安慰剂治疗,SYNB8802治疗的血清磷从基线的变化;
·相对于安慰剂治疗,SYNB8802治疗的尿生物标记(钾、钙、磷、尿酸、柠檬酸盐、镁、钠、氯化物、硫酸盐、铵和pH)从基线的变化。
研究中止:本研究任何部分的招募将因以下原因被中止:(i)一名或多名受试者经历由研究者评估可能、很可能或肯定与IMP有关的SAE;(ii)一名或多名受试者经历由研究者所评估使用美国国家癌症研究所(National Cancer Institute,NCI)CTCAE≥3级可能、很可能或肯定与IMP有关的严重程度≥3级的AE。(请注意,与恶心、呕吐和腹泻有关的3级AE可能中止当前剂量的给药,但将不会中止整个研究。);(iii)确定事件或当前数据需要进一步评价。
研究停止:以下事件的发生将要求停止本研究的进一步招募:(i)如由研究者所评估,群组中有两名或更多名受试者经历可能、很可能或肯定与IMP有关的SAE,(ii)死亡发生在研究期间的任何时间,并且被研究者认为与IMP有关;(iii)通过临床培养和/或qPCR确认的在无菌空间中临床感染上SYNB8802;和(iv)确定事件或当前数据要求停止研究。
第1a部分:NMAD群组
第1a部分是HV的住院患者、安慰剂对照的MAD研究。受试者将在第-4天或第-5天向临床研究单位(CRU)报告。群组1-5的受试者将完成4天饮食准备期(第-4天至第-1天),在此期间,他们将消耗高草酸盐、低钙饮食(细节将在饮食手册中提供)。群组6-10的受试者将完成5天饮食准备期(第-5天至第-1天),在此期间,他们将消耗高草酸盐、低钙饮食(细节将在饮食手册中提供)。饮食草酸盐和钙将分布在每天3顿餐食中。在饮食准备期的第一天早上,将收集强制排空的尿液样品。然后将开始每日24小时尿液收集,以确定UOx水平。在第1天,受试者将被随机分配接受SYNB8802或安慰剂治疗(统称为“研究医药产品”[IMP])。然后,受试者将在任选的剂量爬坡和治疗期期间开始与膳食一起口服给药IMP,每天至多3次,持续总共至多13天。受试者将在给药期期间保持高草酸盐、低钙饮食,并且将在IMP给药当天收集粪便样品。受试者将在早餐前60-90分钟每天服用一次PPI(埃索美拉唑),从饮食准备期的第一天开始,直至IMP给药的最后一天。(关于细节,参见第5.3.2.1节)。在完成安全性评估后,受试者将在给药期结束后的第二天从CRU出院。最后一剂的IMP后7天将进行安全性随访就诊。受试者将在最后一剂的IMP后的4周内每周收集粪便样品。
第1b部分:质子泵抑制剂和半乳糖交叉群组
施用PPI是为了保护SYNB8802(一种活的生物治疗剂)免受胃中的酸性环境影响。D-半乳糖已被纳入SYNB8802的制剂(包括在第1a部分群组和第2部分中使用的制剂)中,以增强其细胞活性。在第1b部分(图23)中,将使用交叉设计评价PPI伴随施用和作为制剂的一部分的半乳糖对SYNB8802的PD的影响。在第一给药期之前的第-5天,受试者将被随机分配以在三个给药期期间以交叉方式以第1a部分MTD或在第1a部分中定义的SYNB8802较低耐受剂量接受一系列三种不同治疗。第1b部分中的3种治疗是:
(i)SYNB8802,含有半乳糖,有伴随PPI
(ii)SYNB8802,含有半乳糖,无PPI
(iii)SYNB8802,不含半乳糖,且有伴随PPI。
在需要伴随PPI施用的给药期期间,受试者将在第-5天早餐前60-90分钟开始每天服用一次埃索美拉唑,并继续直到每个给药期中的IMP给药的最后一天。受试者将在每个给药期之前完成5天饮食准备期,在此期间,他们将消耗高草酸盐低钙饮食(关于细节,参考饮食手册)。饮食草酸盐和钙将分布在每天3顿餐食中。贯穿每个给药期,受试者将保持这种饮食。在每个给药期之前的第-5天早上,将收集强制排空的尿液样品。然后将开始每日24小时尿液收集,并继续在每次住院停留持续时间进行。在每个给药期期间,受试者将接受SYNB8802(含有或不含半乳糖)治疗,每天至多3次,与膳食一起,持续至多8天,包括任选的剂量爬坡和治疗期。在完成安全性评估之后,受试者将在最后一个剂量的IMP后的第二天从CRU出院。治疗期之间将有14天的清除期。使用受试者作为其自身对照将使得能够对有或没有伴随PPI以及含有或不含半乳糖的SYNB8802的安全性、耐受性和PD进行比较评价。受试者将在最终剂量的IMP后的2周内每周收集粪便样品。
第2部分:SYNB8802在患有肠道高草酸尿症的受试者中的药效作用
第2部分(图12)是一项针对SYNB8802在患有EH的受试者中的双盲(主办方开放)、门诊、安慰剂对照的交叉研究。在整个本研究中的所有受试者评价和评估可以在临床场所进行,也可以由家庭保健专业人员在替代场所(例如,受试者的家、酒店)进行。受试者将在整个研究过程中保持其正常饮食,他们将在基线和治疗期期间需要24小时尿液收集的那些日子使用日记记录下来。为了确定给药期1的基线UOx水平,将在开始给药期1的7天内收集3天的24小时尿液样品。受试者将在他们选择的膳食前60-90分钟服用PPI(埃索美拉唑)QD,从每个给药期的第一次IMP剂量前4天开始,直到每个给药期的最后一个IMP剂量。受试者将在第-7天至第-4天之间随机分配以接受等于或低于第1a部分中定义的MTD的SYNB8802或安慰剂。受试者将在给药期1期间与一次或多次膳食一起给药IMP,每天至多3次,持续至多10天。研究者认为不能进行到超越QD或每天两次(BID)给药的受试者可以保持QD或BID给药。以TID给药但不能耐受它的受试者可以降级至QD或BID给药。将在治疗期1的第4-6天收集24小时草酸盐水平的尿液样品。接下来是至少2周且不超过4周的清除期。在清除期后,受试者将交叉并开始给药期2。为了确定给药期2的基线UOx水平,将在开始给药期2的7天内收集3天的24小时尿液样品。然后,受试者将在给药期2期间交叉与一次或多次膳食一起给药SYNB8802或安慰剂,每天至多3次,持续至多10天。将在治疗期2的第4-6天再次收集24小时草酸盐水平的尿液样品。在最后一剂的IMP后7天,将通过家庭保健专业人员或通过远程医疗进行安全性随访就诊。受试者将在基线时收集粪便样品,并在最后一个剂量的IMP后的至多4周内每周收集粪便样品。
第1a部分中的剂量和剂量递增
根据先前测试的基于EcN的遗传修饰的生物体的临床和非临床安全性和耐受性,本研究第1a部分中SYNB8802的起始剂量为1×1011个活细胞,口服,TID。每个群组的剂量递增为大约3倍和至多5倍,并且可以建立剂量爬坡。将基于耐受性(观察到的AE)、临床观察、安全性实验室评估以及任选地基于PD评估做出决定。剂量可以向上或向下调整,并且基于紧急数据建立剂量爬坡。群组之间剂量的递增将不超过5倍,并且最大剂量将不超过2×1012个活细胞。一旦群组中的最后一名受试者已经给药并且已经进行至少24小时的给药后观察,将在研究的第1a部分做出剂量递增决定。将基于耐受性(观察到的AE)、临床观察、安全性实验室评估以及任选地PD评估做出决定。在进行到下一个剂量之前,必须就安全性和耐受性数据支持剂量递增达成一致。可能建议在当前剂量水平下扩展剂量水平,递增到下一个更高的剂量水平,降低到更低的剂量水平,建立剂量爬坡,或宣布已达到MTD。第1a部分的MTD被定义为正好在≥4名受试者经历IMP相关不良事件通用术语标准(IMP-relatedCommon Terminology Criteria for Adverse Events,CTCAE)2级或≥2名受试者经历治疗相关3级或更高级别的毒性的剂量水平之前的剂量。
清除期
在研究的第1b部分中,在每个给药期之间,受试者将经历14天的清除期,在此期间,他们在交换到随后的给药期之前将不接受IMP。饮食准备期可能与清除期的最后5天重叠。应在每个清除期最后一天的2天内收集粪便样品。
表36.与SYN7169和SYNB8802相关的其他序列
实施例6:饮食性高草酸尿症机制的SYNB8802证据
用多个递增剂量的SYNB8802治疗消耗高草酸盐和低钙饮食的健康志愿者。在研究的疗效分析中,与安慰剂相比,在3e11个活细胞剂量下,从基线尿草酸盐水平的变化百分比为-28.6%(90%CI:-42.4至-11.6)。该剂量耐受性良好,并且将用于研究的第B部分。
研究的第B部分将评估SYNB8802在患有Roux-en-Y胃旁路手术后肠道高草酸尿症的患者中降低尿草酸盐的潜力。
SYNB8802 1A期研究:设计和结果
1期研究第A部分的主要结果是安全性和耐受性,其结果用于选择在试验第B部分中对肠道高草酸尿症患者进行进一步研究的剂量。对第A部分中的五个群组给药,已经完成总共45名受试者。结果包括:
健康志愿者总体上对SYNB8802的耐受性良好。没有严重的或系统性不良事件。最常见的不良事件为轻度或中度、暂时的和与胃肠道有关。在健康志愿者中成功诱导饮食性高草酸尿症。接受600mg每日饮食草酸盐(例如高草酸盐、低钙)的受试者在基线时的尿草酸盐水平为44.8mg/24小时(图13)。通常在健康志愿者中观察到尿草酸盐水平升高到>1.5X。在住院患者的基础上仔细测量饮食摄入量,包括称重志愿者消耗的膳食。
观察到尿草酸盐水平的剂量响应性变化,其中在三个剂量水平中尿草酸盐相对于安慰剂显著减少(图14A和14B)。选择每日三次与膳食一起施用的3e11个活细胞的剂量作为研究第B部分的剂量。
与安慰剂相比,该剂量具有良好的耐受性,并且导致从基线变化的尿草酸盐减少为28.6%(90%CI:-42.4至-11.6),并且与安慰剂相比尿草酸盐减少32%(分别为图15A和16)。
在给药结束时,用SYNB8802 3e11个活细胞治疗的受试者的平均24小时尿草酸盐水平为40.1mg,而相比之下安慰剂受试者为58.1mg(图15B)。正常尿草酸盐水平的上限为45mg/24小时。3e11个活细胞剂量正在前进至患者研究。
来自研究的进一步中期结果表明,在消耗高草酸盐低钙饮食、每日饮食草酸盐目标为400或600mg的健康受试者中剂量≥1×1011个活细胞SYNB8802 TID将尿草酸盐降低大约20%至40%(表37)。
来自同一研究的附加中期结果表明,在≥3×1011个活细胞SYNB8802 TID的剂量下,SYNB8802剂量响应性地降低粪便草酸盐浓度,降低>50%。
表37经安慰剂调整的尿草酸盐变化
TID:每天3次
注意:受试者为健康志愿者,消耗高草酸盐、低钙饮食。
实施例7:在代表胃肠道腔的条件下的SYNB8802活性
为了评估在代表胃肠道腔的条件下的SYNB8802活性,开发了体外模拟(IVS)系统,包括在代表人胃、小肠和结肠隔室的培养基中通过模拟腔pH和氧、胃酶和胰腺酶以及胃肠道转运时间进行的一系列孵育。在每个模拟隔室中估算草酸盐降解速率(图17)。草酸盐消耗在模拟胃液(SGF)中最高(接种后一小时和两小时分别为1.35±0.04和1.52±0.08μmol草酸盐/小时*109个细胞),并且在模拟小肠液(SIF)中孵育1小时后保持在相似的水平。在SIF中孵育2小时后,草酸盐消耗降低至0.88±0.04μmol草酸盐/小时*109个细胞。在模拟结肠液(SCF)的完全厌氧条件下,SYNB8802活性进一步降低至0.2±0.14μmol草酸盐/小时*109个细胞,其中其在48小时孵育期内保持相对稳定。这些数据表明,SYNB8802具有通过人类胃肠道代谢草酸盐的潜力。
SYNB8802的草酸盐消耗根据Michaelis-Menten动力学通过拟合来自IVS的数据来建模(图18A),同时考虑可能影响菌株功能的胃肠道内条件。具体而言,口服施用SYNB8802涉及短暂暴露于胃内的低pH。人胃pH是动态的,在餐后升高,然后在随后的几小时内降低至约2(图18B)。此外,胃肠道转运的ISS模型表明,单剂量的SYNB8802细胞群遵循胃停留时间的分布(图18B),表明一些细胞比其他细胞在胃的酸性环境中花费更多时间。为了理解环境pH对SYNB8802草酸盐消耗的影响,进行了体外模拟,其中在不同pH水平下确定随时间推移的SYNB8802草酸盐消耗(图20)。随着pH降低和暴露时间延长,消耗下降。为了解释ISS模型中的这一观察结果,指数衰减函数被拟合到每个pH水平(图20),并且这些pH效应模型被映射到计算机模拟的人胃的动态pH,使得菌株活性的降低被估算为在胃中花费的时间的函数(图4C)。当SYNB8802细胞转运通过胃肠道的其余部分时,它们然后仍然保持由于胃停留时间而引起的活性抑制(图4D)。因此,SYNB8802的肠和结肠活性由每个单独的细胞在胃中花费的时间有多长来决定。总的来说,ISS模型提供了一个数学框架,所述框架整合了SYNB8802活性和关于通过胃肠道的菌株和底物转运的信息,从而能够对体内的菌株性能进行生理学评估。
计算机模拟(ISS)
建模方法将由体外研究提供的SYNB8802活性与胃肠和循环生理学整合,以预测通过口服施用SYNB8802引起的尿草酸盐降低。采用多隔室方法,其中根据SYNB8802和草酸盐动力学对体积动力学建模。与假设静态隔室体积的典型方法形成对比,每个肠道器官内的食糜或部分消化的食物的体积被认为是隔室,而不是器官本身。血浆草酸盐动力学被建模为初始血清水平和由从肠道吸收的草酸盐量的任何变化引起的最终稳定状态。该框架允许模拟增加的肠道吸收(例如,引入高草酸盐饮食)或减少的肠道吸收(例如,引入SYNB8802)。模拟SYNB8802和草酸盐每天三次与膳食一起进入胃,并且与食糜同时前进通过胃、小肠和结肠。使用通过常微分方程(ODE)(方程式1-9)实现的物质平衡来描述控制肠道中草酸盐丰度的过程。每个ODE描述了状态变量从其初始值到模拟时间结束(48小时)时的变化速率。所有状态变量的初始值可以在表38中找到,并且参数值可以在表39中找到。胃食糜体积状态变量的初始值等于总胃排空体积(理解为典型人每天所吃食物和所喝液体的体积)(Sherwood.Human Physiology:From Cells to Systems.s.l.:Wadsworth publishingcompany第3版,1997.第590页;Sandle,G.Salt and water absorption in the humancolon:a modern appraisal.1998,Gut.;Thomas A.,Gut motility,sphincters andreflex control.2006,Anaesthesia Intens Care Med.;Southwell,BR.,Colonictransit studies:normal values for adults and children with comparison ofradiological and scintigraphic methods.2009,Pediatr Surg Int.)除以每天的膳食次数。总分泌物体积被理解为典型人每天至小肠中的血浆分泌体积除以每天的膳食次数。总的肠和结肠排空体积基于Sherwood等人报道的值和Sandle报道的那些。肠道转运时间取自一项关于食糜在肠道中转运的研究。结肠转运时间取自一项关于测量结肠转运的方法的研究。
表38.ISS状态变量的初始值
表39.ISS参数值
胃食糜体积平衡由方程式1给出,其中定义了胃食糜体积的变化速率,并且r胃排空定义了食糜从胃排空到小肠的速率。肠道食糜体积平衡由方程式2给出,其中定义了肠道食糜体积的变化速率,r分泌物定义了从血浆到小肠的液体分泌速率,rSI液体吸收定义了从小肠到血浆的液体吸收速率,和rSI排空定义了从小肠到结肠的食糜排空速率。结肠食糜体积平衡由方程式3给出,其中定义了结肠食糜体积的变化速率,r结肠液体吸收定义了从结肠到血浆的液体吸收速率,和r结肠排空定义了食糜从结肠到粪便的排空速率。所有食糜平衡中的所有项都以mL/分钟为单位定义。
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胃草酸盐平衡由方程式4给出,其中定义了胃草酸盐的变化速率,r胃草酸盐排空定义了草酸盐从胃排空到小肠的速率,并且r胃草酸盐浓度定义了胃中SYNB8802消耗草酸盐的速率。肠道草酸盐平衡由方程式5给出,其中定义了肠道草酸盐的变化速率,rSI草酸盐浓度定义了小肠中SYNB8802消耗草酸盐的速率,rSI草酸盐吸收定义了草酸盐从小肠吸收到血浆的速率,并且rSI草酸盐排空定义了草酸盐从小肠排空到结肠的速率。结肠草酸盐平衡由方程式6给出,其中定义了结肠草酸盐的变化速率,r结肠草酸盐浓度定义了结肠中SYNB8802消耗草酸盐的速率,r结肠草酸盐吸收定义了草酸盐从结肠吸收到血浆中的速率,并且r结肠草酸盐排空定义了草酸盐从结肠排空到粪便的速率。所有草酸盐平衡中的所有项都以mmol/分钟为单位定义。
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方程式7给出了胃SYNB8802平衡,其中定义了胃SYNB8802群体的变化速率,并且r胃CFU排空定义了SYNB8802从胃排空到小肠的速率。方程式8给出了肠道SYNB8802平衡,其中定义了肠道SYNB8802群体的变化速率,并且rSICFU排空定义了SYNB8802从小肠排空到结肠的速率。结肠草酸盐平衡由方程式9给出,其中定义了结肠SYNB8802群体的变化速率,并且r结肠CFU排空定义了SYNB8802从结肠排空到粪便的速率。所有SYNB8802平衡中的所有项均以细胞/分钟为单位定义。
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基于Elashoff等人的工作,根据胃体积的幂指数衰减函数对食糜从胃到小肠的转运建模(表1;Analysis of Gastric Emptying Data.Elashoff,Janet D.1982,Gastroenterology)。胃排空速率由 给出,等于总胃排空体积V总胃排空与由半胃排空时间τ1/2和形状参数β定义的幂指数的时间导数的乘积。然后修改胃排空函数,使其在由v胃给出的有限时间量内终止;为了实现这一点,胃排空在时间τ线性从幂指数转换为线性,然后从τ胃向前定义为零(方程式10)。将从血浆到小肠的液体分泌速率建模为与胃食糜排空速率和总分泌物体积V总分泌物与总胃排空体积的比率成比例(方程式11)。离开胃的第一部分食糜被假设也是第一个到达回盲瓣并从小肠排空到结肠中;因此,肠道排空开始于肠道转运时间τSI。同样,离开胃的最后一部分食糜最后从小肠排空,并且在时间τSI+τ胃标志着肠道排空窗口的结束。结肠排空的时间框架类似地被定义为τSI+τ结肠≤t<τSI+τ结肠+τ胃,其中τ结肠定义了结肠转运时间。假设肠道和结肠食糜排空在相关时间框架期间是恒定的,否则为零,其中排空速率的大小等于总肠道或结肠排空体积V总SI排空,V总结肠排空除以时间框架的长度(方程式12-13)。
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从胃、小肠和结肠的草酸盐排空被定义为每个隔室中的食糜排空率和草酸盐浓度的乘积,等于以mmol计的草酸盐丰度除以以mL计的食糜体积(方程式14-16)。SYNB8802排空也被定义为与食糜转运和SYNB8802浓度成比例,等于以细胞/分钟计的SYNB8802丰度除以以mL计的食糜体积(方程式17-19)。从小肠和结肠到血浆的液体吸收速率被建模为一级,为食糜体积与液体吸收的一级动力学速率常数kSI/结肠液体吸收的乘积(方程式20-21)。从小肠和结肠到血浆的草酸盐吸收速率也被建模为一级,为草酸盐丰度与草酸盐吸收的一级动力学速率常数kSI/结肠草酸盐吸收的乘积(方程式22-23)。
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20.rSI液体吸收=kSI液体吸收*VSI
21.r结肠液体吸收=k结肠液体吸收*V结肠
22.rSI草酸盐吸收=kSI草酸盐吸收*OxSI
23.r结肠草酸盐吸收=k结肠草酸盐吸收*Ox结肠
根据酶动力学的Michaelis-Menten模型模拟SYNB8802在每个肠道隔室中的草酸盐消耗(图18A)。该模型将消耗速率定义为最大酶速度Vmax乘以底物浓度,除以Michaelis常数KM和底物浓度之和;然后将该数量乘以每个隔室中的SYNB8802丰度。胃中的SYNB8802活性被胃pH抑制函数K胃pH抑制和胃氧抑制函数进一步修饰(方程式24)。小肠中的SYNB8802活性被肠pH抑制函数KSI pH抑制/和肠氧抑制函数修饰(方程式25)。结肠中的SYNB8802活性被结肠pH抑制函数K结肠pH抑制、结肠氧抑制函数和延长的结肠活性项K延长的结肠活性修饰(方程式26)。膳食后胃pH下降的生理函数被建模为幂指数衰减函数(图18B,深蓝色)。半衰期参数描述了总pH下降一半发生的时间,并且形状参数描述了与简单指数模型的差异程度。对SYNB8802细胞进行建模,以遵循截断至最大4小时的胃停留时间分布,其中值胃停留时间为110分钟(图18B,浅蓝色)。pH抑制函数由SGF实验提供(图18C)。指数衰减函数适合于每个pH试验,并且衰减常数被内插以模拟非整数pH值。然后将pH与活性衰减之间的关系应用于胃pH动力学的函数,以产生胃pH抑制函数(图18D)。然后将胃排空动力学模型用于构建胃停留时间的分布,所述分布与胃pH抑制函数组合用于模拟由于持续酸损伤引起的肠道和结肠SYNB8802活性的降低,从而产生肠道和结肠pH抑制函数(图4D)。在胃中花费时间较长的细胞被认为在小肠和结肠中时活性较低。在小肠和结肠中时所有细胞的模拟活性的上限为最大活性的75%,无论在胃中花费的时间如何。这是由于肠道/结肠pH为6.5,并且由一个描述瞬时而非持续pH效应的函数提供,适合于内部体外模拟。在pH为3.O、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5和7.0时,分别观察到归一化SYNB8802活性为4±0.2%、4±0.3%、24±0.7%、28±0.6%、30±0.2%、47±2%、52±2%、71±11%和100±3%。根据在21%氧气下观察到的最大菌株活性的线性下降,对所有肠道隔室中的氧抑制函数建模,适合于内部体外模拟。在0%、7%和21%氧气下,分别观察到74±5%、79±29%和100±1%的归一化SYNB8802活性。延长的结肠活性项由SCF体外模拟经由消耗速率随时间推移的直接内插来提供(图17)。
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进入血浆的总肠道吸收等于肠道和结肠吸收之和;未对胃吸收建模(方程式27)。校准方程式22和23中的一级草酸盐吸收速率常数,使得在没有SYNB8802的情况下总吸收M草酸盐吸收(没有SYNB8802)等于饮食摄入M饮食草酸盐乘以饮食吸收分数f吸收(方程式28),并且其肠道部分MSI草酸盐吸收(没有SYNB8802)等于总量乘以描述吸收部位的肠道分数fSI吸收(方程式29)。健康受试者的饮食吸收分数基于Holmes等人的工作,他们观察到饮食草酸盐摄入和尿排泄之间的关系(图19A和19B;Contribution of dietary oxalate to urinary oxalateexcretion.Holmes,R.P.,Goodman,H.O.&Assimos,D.G.2001,Kidney international,第270-276页)。十二名健康个体接受不含草酸盐的饮食五天,以建立在单独内源性产生下的尿排泄,然后转换为10至250mg/天范围内的较高草酸盐饮食。吸收的饮食草酸盐的分数被计算为含草酸盐的饮食和不含草酸盐的饮食的尿排泄量之差除以饮食的草酸盐含量。这里呈现的ISS方法将待观察到的数据拟合为指数函数,以确定作为饮食摄入的函数的健康受试者饮食吸收分数。假设EH患者的饮食吸收分数为是健康受试者的3至5倍(方程式30)(Contribution of dietary oxalate to urinary oxalate excretion.Holmes,R.P.,Goodman,H.O.&Assimos,D.G.2001,Kidney international,第270-276页;Mechanism forHyperoxaluria in Patients with Ileal Dysfunction.Chadwick等人1973,N Engl JMed.;Hyperoxaluria in Patients with Ileal Resection:An Abnormality in DietaryOxalate Absorption.Eamest等人1974,Gastroenterology;Evidence for excessiveabsorption of oxalate by the colon in enteric hyperoxaluria.R.Modigliani,D.Labayle,C.Aymes,R.Denvil.1978,Scand J Gastroent,第187-192页)。健康受试者的吸收部位由对小鼠肠道各节中的草酸盐转运的研究提供,所述研究得出了十二指肠、空肠、回肠、近端结肠和远端结肠的渗透常数。(Physiological parameters in laboratoryanimals and humans.B Davies,T Morris.1993,Pharmaceutical Research.)假设小鼠和人之间的肠道与结肠渗透性常数之比相等。EH患者的吸收部位被假设为使得所有附加的草酸盐吸收都发生在结肠;也就是说,使得肠道吸收等于健康受试者的肠道吸收(方程式31)。
27.M草酸盐吸收=MSI草酸盐吸收+M结肠草酸盐吸收
28.M草酸盐吸收(没有SYNB8802)=M饮食草酸盐*f吸收
29.MSI草酸盐吸收(没有SYNB8802)=
M草酸盐吸收(没有SYNB8802)*fSI吸收
30. 3*f吸收健康≤f吸收EH≤5*f吸收健康
31.MsI草酸盐吸收EH(没有SYNB8802)=MSI草酸盐吸收健康(没有SYNB8802)
使用通过ODE实现的物质平衡来描述血浆中草酸盐丰度的动力学,其中定义了血浆草酸盐丰度的变化速率,r血浆流入定义了草酸盐进入血浆的流入速率,并且r尿定义了草酸盐的尿排泄速率(方程式32)。进入血浆的草酸盐流入被定义为如方程式27中所计算的每顿膳食的总肠道吸收乘以每天的膳食次数N每日膳食加上草酸盐的内源性产生速率r内源(方程式33)。草酸盐的内源性产生速率基于Chadwick等人的工作计算,他们观察到EH患者在消耗几天不含草酸盐的饮食时的尿排泄(图18A-18D;Mechanism for Hyperoxaluria inPatients withIleal Dysfunction.Chadwick等人1973,N EnglJ Med.)。使用一级动力学对尿排泄建模,为血浆草酸盐丰度和尿排泄的一级动力学速率常数的乘积(方程式34)。尿排泄速率常数基于Holmes等人的工作,他们观察到健康受试者从自选饮食转变为不含草酸盐的饮食的尿草酸盐排泄动力学(图17;3.Contribution of dietary oxalate tourinary oxalateexcretion.Holmes,R.P.,Goodman,H.O.,&Assimos,D.G.2001,Kidneyinternational,第270-276页)。血浆草酸盐ODE简化为指数衰减形式,描述血浆水平Ox血浆(t)如何从初始稳定状态Ox血浆初始变为新的稳定状态Ox血浆ss(方程式35)。新的稳定状态被定义为血浆流入除以尿排泄速率常数(方程式36)。初始稳定状态同样被定义为先前的血浆流入r血浆流入初始(例如,在给药SYNB8802之前,在不同的饮食摄入下,或两者兼有)除以尿排泄速率常数(方程式37)。通过组合方程式34和35,可以表明尿排泄遵循与血浆水平相同的动力学,从初始稳定状态r血浆流入初始变为新的稳定状态r血浆流入(方程式38)。
32.
33.r血浆流入=M草酸盐吸收*N每日膳食+r内源
34.r尿=k尿*Ox血浆
35.
36.
37.
38.
软件
计算机模拟全部都是使用Jupyter版本6.0.3(jupyter.org)在Python 3.7.6中实现的。使用SciPy版本1.4.1(scipy.org)求解常微分方程。使用Prism 9.1.0(GraphPad,SanDiego,CA)进行统计分析。
IVS和体内研究
将细胞从冷冻(<-65℃)细胞库中解冻,并且在发酵培养基中生长过夜,所述发酵培养基如下制备:酵母提取物(40g/L)、K2HPO4(5g/L)、KH2PO4(3.5g/L)、(NH4)2HPO4(3.5g/L)、MgSO4*7H2O(0.5g/L)、FeCl3(1.6mg/L)、CoCl2*6H2O(0.2mg/mL)、CuCl2(0.1mg/L)、ZnCl2(0.2mg/L)、NaMoO4(0.2mg/L)、H3BO3(0.05mg/L)、止泡剂204(125μL/L)、半乳糖(30g/L)、胸苷(20mM)。使细胞在37℃下在350rpm振荡下生长。第二天,将培养物稀释回至0.18的起始OD,并且在改良的发酵培养基(酵母提取物(40g/L)、K2HPO4(5g/L)、KH2PO4(3.5g/L)、(NH4)2HPO4(3.5g/L)、MgSO4*7H2O(0.5g/L)、FeCl3(1.6mg/L)、CoCl2*6H2O(0.2mg/mL)、CuCl2(0.1mg/L)、ZnCl2(0.2mg/L)、NaM0O4(0.2mg/L)、H3BO3(0.05mg/L)、止泡剂204(125μL/L)、半乳糖(30g/L)、胸苷(20mM)、甲酸钠(.35g/L)、延胡索酸钠(6g/L))中生长,并且在完全受控的发酵罐系统中诱导活性至高细胞密度,随后洗涤,浓缩,再配制并冻干。
实施例8.包含用于降解草酸盐的基因表达系统的Δpks菌株的体外活性分布
将ΔpksEcN菌株(缺失了clbA-clbR基因和启动子序列,缺失了可操作地连接的启动子的完整的clbS基因序列)工程化以进一步包含用于降解草酸盐的表达系统,如2016年8月31日提交的PCT/US2016/049781(其内容以引用的方式整体并入本文)中所述,以评估Δpks对菌株消耗草酸盐的能力的影响。
使菌株在摇瓶中生长,随后在厌氧室中活化,随后在甘油基配方缓冲液(PBS+25%甘油)中浓缩并冷冻在≤-65℃。在含有10mM草酸盐的测定培养基中,将活化的细胞重新悬浮至OD600=5,并且在37℃下静态孵育。在30和60分钟时取出上清液样品,以确定草酸盐的浓度。通过液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)确定浓度。
使用Thermo Vanquish UHPLC-Altis TSQ MS系统通过LC-MS/MS对细菌上清液中的草酸盐进行定量。在水中以0.8至1000μg/mL制备标准品。用包含1μg/mL 13C2-草酸盐作为内标的10mM乙酸铵将样品和标准品稀释十倍。使用10mM乙酸铵(A)和甲醇(B)以0.4mL/分钟和在50℃下将10微升注射到Waters Acquity HSS T3 1.8um 100A 2.1x100mm柱上。在初始100%A保持0.5分钟后使用在1.5分钟内从0到95%B的梯度分离分析物,随后进行洗涤和平衡步骤。化合物通过在电喷雾负离子模式下具有选择反应监测的串联质谱使用以下离子对进行检测:草酸盐89/61、13C2-草酸盐91/62。对色谱图进行积分,并使用草酸盐/13C2-草酸盐(分析物/内标)峰面积比来计算未知的浓度。
实施例9.在施用至非人灵长类动物后能够分解代谢草酸盐的Δpks菌株的药效学
将工程化以进一步包含用于降解草酸盐的表达系统的Δpks EcN菌株(SYNB8802v1)的体内活性与包含用于降解草酸盐的表达系统但无Δpks缺失的菌株(SYNB8802)进行了比较。
进行了体内活性单剂量交叉研究,以评估菌株在急性高草酸尿症的非人灵长类动物模型中代谢胃肠道和饮食来源的草酸盐和13C2-草酸盐的能力。与媒介物对照相比,无论是否存在pks缺失,草酸盐和13C2-草酸盐的尿回收率均显著降低,表明这两种菌株都能够在患有急性高草酸尿症的非人灵长类动物中消耗草酸盐。结果如表40和表41所示。
表40.与媒介物对照相比尿草酸盐的变化百分比
表41.与媒介物对照相比尿13C2-草酸盐的变化百分比
实施例10.一项双盲、随机化、安慰剂对照的研究,旨在评估SYNB8802在具有胃旁路手术史或短肠综合征史的受试者中的安全性、耐受性和药效学
这是首次对SYNB8802,002的人类研究,设计为评估在具有胃旁路手术史或短肠综合征史的受试者中的安全性、耐受性和草酸盐降低。此外,本研究将探索在健康受试者中相对于基线的其他药效学(PD)效应,以及功效预测因子和在患有EH的受试者中的耐受性。
本研究的持续时间是基于在健康受试者中证明稳定状态草酸盐降低的当前正在进行的研究的数据选择的,并且预期在具有胃旁路手术史或短肠综合征史的受试者中草酸盐降低的时程类似。
研究目标
主要目标包括评价SYNB8802的安全性和耐受性。次要目标包括评估在平均草酸盐低钙(AOLC)饮食之后SYNB8802对尿草酸盐(UOx)排泄的影响。探索性目标包括(i)评估SYNB8802对与肾结石风险增加相关的生物标记的影响。(ii)评估SYNB8802对粪便草酸盐水平的影响。(iii)评估SYNB8802对血浆草酸盐(POx)水平的影响。(iv)评估预测草酸盐响应的潜在因素。(v)探索耐受性的潜在生物标记。
方法学
这是一项双盲、随机化(3:2)、安慰剂对照的住院患者研究,其评价SYNB8802在具有胃旁路手术史或短肠综合征史的患者中的安全性和耐受性。研究包括以下周期:(1)筛查(27天);(2)饮食准备期(3天);(3)给药期(12天);(4)安全性随访(28天)。住院的最长持续时间为17天(第-4天至第13天)。
受试者将在第-4天向临床研究单位(CRU)报告,并将完成3天的饮食准备期(第-3天至第-1天),在此期间,他们将消耗AOLC饮食。饮食草酸盐和钙将分布在每天3顿膳食中,并且受试者将保持这种饮食直到给药期结束。质子泵抑制剂(PPI,埃索美拉唑)将在早餐前60-90分钟每天施用一次(QD),从饮食准备期开始直到给药期结束。如果受试者已经定期服用不同的PPI,则可以继续所述剂,或者如果由于过敏或药物相互作用而需要,可以给予不同的PPI。
在第1天,受试者将被随机分配接受SYNB8802或安慰剂治疗(统称为研究医药产品[IMP])。给药期包括12天,按照剂量递增计划,从1x10^11个细胞QD至3x10^11个细胞每天3次(TID);每个剂量水平的给药期包括2天的剂量爬坡和3天的稳定状态期。根据给药时间表,IMP将与膳食一起口服施用。如果受试者不能耐受BID或TID给药,可以减少给药频率。
在饮食准备期的第一天(第-3天)的早上,将收集强制排空的尿液样品以完全排空膀胱。然后将开始24小时尿液收集,并在整个住院期间将继续。此外,还将收集每日24小时粪便样品。
受试者将在第13天(最后一剂的IMP后的第二天)完成安全性评估后从CRU出院。将每7(±2)天进行一次安全性随访就诊(访问),直到最后一剂的IMP后28天。
受试者将在整个住院期间消耗AOLC饮食(每天300mg草酸盐和400mg钙,关于细节,参考饮食手册),具有固定的卡路里和根据稳定体重调整的液体体积。他们将消耗提供给他们的所有膳食,并且将记录从每次饮食准备期开始到IMP给药结束的所有饮食摄入。将允许并还要求批准的符合热量平衡要求的零食。
研究期间不允许使用全身性(口服或静脉内)抗生素(允许局部抗生素)。
研究纳入和排除标准
纳入标准
(1)年龄≥18岁至≤74岁。
(2)能够并愿意自愿完成知情同意程序。
(3)可用于并同意所有研究程序,包括固定饮食、粪便、尿液和血液采集、随访就诊和遵守所有研究程序。
(4)胃旁路手术史(至少在第1天之前12个月)或短肠综合征史。
(5)如果服用益生菌补充剂(不包括强化食品),在第1天之前至少2周服用了稳定且耐受性良好的剂量。
(6)有生育能力的妇女必须在筛查时和在开始IMP前的基线时具有阴性妊娠试验(人绒毛膜促性腺激素)。
(7)筛查实验室评价(例如,化学参数、全血细胞计数和分类、凝血酶原时间、尿液分析)和心电图(ECG)必须在正常限值内,或者被研究者判定为无临床意义。在已知患有糖尿病的受试者中,异常的葡萄糖值是可接受的。单次重复评价是可接受的。
(8)同意在住院期期间戒除烟/尼古丁使用。
排除标准
(1)可能增加与研究参与相关的受试者风险,损害对研究程序和要求的遵守或者可能混淆结果的解释并且根据研究者的判断会使受试者不适合入组的急性或慢性医学(包括COVID-19感染)、手术、精神病学或社会疾患或实验室异常(可以由吸收不良解释的那些除外)。
(2)估计肾小球滤过率<45mL/min/1.73m2。
(3)肾结石史。
(4)不能或不愿意在研究持续期间停止维生素C补充。
(5)已知的原发性高草酸尿症。
(6)怀孕或哺乳期。
(7)在药剂的5个半衰期内—在第1天之前,施用或摄入任何类型的全身性(例如,口服或静脉内)抗生素。例外:局部抗生素是允许的。
(8)可能需要抗生素使用或在给药期期间中断控制饮食的任何共病情况。
(9)对大肠埃希氏菌尼斯勒1917(EcN)、所有PPI或在SYNB8802或安慰剂制剂中的任何成分的不耐受或过敏反应。
(10)酒精依赖或药物滥用。
(11)当前免疫缺陷病症,包括自身免疫性病症和未控制的人类免疫缺陷病毒(HIV)。可以包括接受疗法的HIV阳性且CD4计数正常的受试者。
(12)在筛查访视前30天或剂的5个半衰期(以较长者为准)内施用或摄入研究药物;或当前正在入组一项调查研究。
(13)炎性肠病史。
研究医药产品:
根据给药时间表,与膳食一起口服施用1×10^11个或3×10^11个活细胞的SYNB8802。
与根据给药时间表与膳食一起口服施用的SYNB8802相匹配的安慰剂。
治疗持续时间
计划受试者参与研究的最长时间为至多70天:
筛查期:至多27天。
饮食准备期:3天。
给药期:12天。将在最后一次IMP施用后的第二天从CRU出院。
安全性随访期:28天。
研究终点
主要终点:SYNB8802的安全性和耐受性,如通过不良事件(AE)、临床实验室试验和生命体征测量评估的。
次要终点:在经SYNB8802治疗的受试者对比用安慰剂治疗的受试者中的24小时UOx排泄量从基线的变化。
探索终点:
(1)与用安慰剂治疗的受试者相比,在用SYNB8802治疗的受试者中与肾结石风险增加相关的生物标记(诸如尿过饱和评分)从基线的变化。
(2)与用安慰剂治疗的受试者相比,在用SYNB8802治疗的受试者中粪便草酸盐水平从基线的变化。
(3)与用安慰剂治疗的受试者相比,在SYNB8802治疗的受试者中POx水平从基线的变化。
(4)UOx从基线的变化与其他基线和研究因素的相关性,诸如筛查时是否存在肾结石、吸收不良的程度、耐受性特征和其他患者因素。
(5)耐受性数据与探索性生物标记(诸如葛瑞林、CRP和IL-6)的相关性。
(6)功效与探索性生物标记(诸如粪便微生物组)的相关性。
取消肖IMP治疗和撤回同意书
中断IMP的原因可能包括以下几点:
(1)受试者撤回同意书。
(2)研究者或主办方注意到严重不服从方案程序。
(3)受试者出现不可耐受的毒性,包括但不限于研究者评估为与IMP有关的≥3级AE或严重不良事件(SAE)。
(4)受试者需要全身性抗生素治疗。
(5)研究者确定受试者因医学原因必须停止进一步的研究给药。
(6)受试者可能出于任何原因随时撤回其同意书,而不影响其医生或其医疗机构对其未来的医疗护理。分析中将包括截止至同意书撤回之日收集的受试者数据。
药效学分析
尿液、血液和粪便样品将在筛查时收集,然后在整个饮食准备期和给药期中每天收集。将执行以下评估来评价SYNB8802的初步PD:
24小时UOx。
尿过饱和指数,包括体积和肌酐。
血浆和24小时粪便草酸盐。
功效、耐受性和药效学的探索性生物标记。
生命体征和身体检查:将按照表42中所规定的收集静息生命体征(收缩压、舒张压、脉搏和体温)。要求受试者在获得生命体征之前保持坐姿至少5分钟。
将由训练有素的医务人员根据表42中所规定的进行针对症状的身体检查。如果有正当理由,可以根据研究者的判定,在不定期的时间进行症状导向的PE。PPI开始后观察到的异常结果应记录为AE。
临床实验室测量
将在表42中所规定的时间点进行表43中列出的临床实验室试验。筛查结果将由研究者评估,以便将受试者纳入本研究。另外,根据研究者的判定,在研究期间的任何时间均可以获得不定期的临床实验室测试。与任何有临床意义的异常对应的诊断必须记录为AE。
表43临床实验室试验
缩写:BUN=血尿素氮;CBC=全血细胞计数;CRP=C反应蛋白;
eGFR=估计的肾小球滤过率;HIV=人类免疫缺陷病毒;WOCBP=有生育能力的妇女。
a仅在筛查时进行。
b筛查时进行血清妊娠;在所有其他时间点进行尿液妊娠。
c不被视为临床安全性实验室试验。
心电图:仰卧单次12导联ECG将作为筛查的一部分进行。待评价的ECG参数包括RR、QT、QRS和PR间期。另外,Fridericia的公式应用于计算校正心率后的QT间期(QTcF)。要求受试者在获得ECG之前保持仰卧位至少5分钟。
探索性微生物组样品:将按照表42中详述获得一份每24小时粪便样品的等分试样,其将被送去进行探索性微生物组分析。这些样品的分析可能有条件地基于该临床研究或其他临床研究的结果,并且可以基于PD响应来选择样品。这些分析的结果可以与主要临床研究报告分开报告。
探索性耐受性样品:应在第-1天早餐后3小时收集探索性生物标记的基线血液样品。在给药期期间,在任何一天IMP给药后受试者应经历胃肠道症状(例如,恶心、呕吐、腹泻、腹部绞痛等),在受试者经历症状时应收集一份血学样品。除非症状改变,否则不需要在接下来的几天重复取样。这些样品可以在稍后的日子进行分析,并且结果将作为附录添加到研究报告中。如果在最初研究报告后的一年内未进行分析,样品将被丢弃。
安全性随访评估:所有受试者,无论他们完成治疗还是提前中止,都将在最后一剂的IMP后的28(±2)天内每7(±2)天完成一次安全性随访就诊,如表42中详述的。可以通过远程医疗进行安全性随访就诊。
表44.大肠杆菌素核苷酸序列
表45.大肠杆菌素氨基酸序列
SEQ ID NO: | 描述 |
SEQ ID NO:1084 | clbA |
SEQ ID NO:1085 | clbB |
SEQ ID NO:1086 | clbC |
SEQ ID NO:1087 | clbD |
SEQ ID NO:1088 | clbE |
SEQ ID NO:1089 | clbF |
SEQ ID NO:1090 | clbG |
SEQ ID NO:1091 | clbH |
SEQ ID NO:1092 | clbI |
SEQ ID NO:1093 | clbJ |
SEQ ID NO:1094 | elbK |
SEQ ID NO:1095 | clbL |
SEQ ID NO:1096 | clbM |
SEQ ID NO:1097 | clbN |
SEQ ID NO:1098 | clbO |
SEQ ID NO:1099 | clbP |
SEQ ID NO:1100 | clbQ |
SEQ ID NO:1101 | clbR |
SEQ ID NO:1102 | clbS |
表46:示例性序列
等效方案
本领域技术人员仅仅使用常规试验将认识到或者能够确定本文所述的具体实施方案和方法的很多等效方案。此类等效方案旨在被以下权利要求的范围所涵盖。
Claims (55)
1.一种用于降低受试者的草酸盐水平的方法,所述方法包括向所述受试者施用包含重组细菌的药物组合物,所述重组细菌包含:
编码一种或多种草酸分解代谢酶的一个或多个基因序列,所述一个或多个基因序列直接地或间接地与第一启动子可操作地连接,所述第一启动子在自然界不与所述草酸分解代谢酶基因相关,其中所述一个或多个基因序列包含scaaE3基因、frc基因和oxdC基因,其中所述scaaE3基因包含与SEQ ID NO:3具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列,包含SEQ ID NO:3或由SEQ ID NO:3组成,其中所述frc基因包含与SEQ ID NO:1具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列,包含SEQ ID NO:1或由SEQ ID NO:1组成,并且其中所述oxdC基因包含与SEQID NO:2具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列,包含SEQ ID NO:2或由SEQ ID NO:2组成,
编码草酸盐输入蛋白的基因,其中编码所述草酸盐输入者蛋白的所述基因是oxlT基因,并且其中所述oxlT基因包含与SEQ ID NO:11具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列,包含SEQ ID NO:11或由SEQ ID NO:11组成,
ΔthyA营养缺陷型;
内源噬菌体中的缺失;
经修饰的内源性大肠杆菌素岛,
从而降低所述受试者的草酸盐水平。
2.如权利要求1所述的方法,其中所述内源噬菌体包含与SEQ ID NO:63具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列,包含SEQ ID NO:63,或由SEQ ID NO:63组成。
3.如权利要求1或权利要求2所述的方法,其中所述经修饰的内源大肠杆菌素岛包含一种或多种选自由以下组成的组的经修饰的clb序列:clbA(SEQ ID NO:1065)、clbB(SEQ IDNO:1066)、clbC(SEQ ID NO:1067)、clbD(SEQ ID NO:1068)、clbE(SEQ ID NO:1069)、clbF(SEQ ID NO:1070)、clbG(SEQ ID NO:1071)、clbH(SEQ ID NO:1072)、clbI(SEQ ID NO:1073)、clbJ(SEQ ID NO:1074)、clbK(SEQ ID NO:1075)、clbL(SEQ ID NO:1076)、clbM(SEQID NO:1077)、clbN(SEQ ID NO:1078)、clbO(SEQ ID NO:1079)、clbP(SEQ ID NO:1080)、clbQ(SEQ ID NO:1081)、clbR(SEQ ID NO:1082)和clbS(SEQ ID NO:1803)。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法,其中所述经修饰的内源性大肠杆菌素岛包含以下的缺失:clbA(SEQ ID NO:1065)、clbB(SEQ ID NO:1066)、clbC(SEQ ID NO:1067)、clbD(SEQ ID NO:1068)、clbE(SEQ ID NO:1069)、clbF(SEQ ID NO:1070)、clbG(SEQ IDNO:1071)、clbH(SEQ ID NO:1072)、clbI(SEQ ID NO:1073)、clbJ(SEQ ID NO:1074)、clbK(SEQ ID NO:1075)、clbL(SEQ ID NO:1076)、clbM(SEQ ID NO:1077)、clbN(SEQ ID NO:1078)、clbO(SEQ ID NO:1079)、clbP(SEQ ID NO:1080)、clbQ(SEQ ID NO:1081)和clbR(SEQ ID NO:1082)。
5.如前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述重组细菌不包含编码抗生素抗性的基因。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法,其中所述重组细菌具有至少约1μmol/1x109个细胞的草酸盐消耗活性。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法,其中所述重组细菌在厌氧条件下具有约50至约600mg/天的草酸盐消耗活性。
8.如权利要求7所述的方法,其中所述重组细菌在厌氧条件下具有约211mg/天的草酸盐消耗活性。
9.如前述权利要求中任一项所述的方法,其中当向所述受试者每天施用三次时,所述重组细菌在厌氧条件下具有约211mg/天的草酸盐消耗活性。
10.如权利要求7-9中任一项所述的方法,其中所述厌氧条件是所述受试者的肠和/或结肠中的条件。
11.如前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述方法将所述受试者的急性草酸盐水平降低约两倍。
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法,其中所述方法将所述受试者的急性草酸盐水平降低约三倍。
13.如权利要求1-11中任一项所述的方法,其中所述方法将所述受试者的慢性草酸盐水平降低约两倍。
14.如权利要求1-11或13中任一项所述的方法,其中所述方法将所述受试者的慢性草酸盐水平降低约三倍。
15.如权利要求1-10中任一项所述的方法,其中所述方法将所述受试者的急性草酸盐水平降低至约25mg/天、约30mg/天、约40mg/天、约50mg/天、约60mg/天、约70mg/天、约80mg/天、约90mg/天或约100mg/天。
16.如权利要求1-10中任一项所述的方法,其中所述方法将所述受试者的慢性草酸盐水平降低至约25mg/天、约30mg/天、约40mg/天、约50mg/天、约60mg/天、约70mg/天、约80mg/天、约90mg/天或约100mg/天。
17.如前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述重组细菌属于属埃希氏菌属。
18.如权利要求17所述的方法,其中所述重组细菌属于大肠埃希氏菌菌株尼斯勒。
19.如前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述药物组合物是口服施用的。
20.如前述权利要求中任一项所述的方法,其中在施用所述药物组合物的一小时内给所述受试者喂食膳食。
21.如权利要求1-19中任一项所述的方法,其中在施用所述药物组合物的同时给所述受试者喂食膳食。
22.如前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述受试者为人类受试者。
23.如前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述第一启动子为诱导型启动子,任选地当所述诱导型启动子为FNR启动子时,任选地其中所述FNR启动子包含与SEQ ID NO:13-29中的任一者具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列,包含SEQ ID NO:13-29中的任一者,或由SEQ ID NO:13-29中的任一者组成。
24.如权利要求1-23中任一项所述的方法,其中所述重组细菌是SYNB8802v1。
25.如前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述受试者患有高草酸尿症。
26.如权利要求25所述的方法,其中所述高草酸尿症是原发性高草酸尿症、饮食性高草酸尿症或肠道高草酸尿症。
27.如权利要求25或权利要求26所述的方法,其中所述受试者患有短肠综合征、慢性胰腺炎、炎性肠病(IBD)、囊性纤维化、肾病和/或Roux-en-Y胃旁路术。
28.如权利要求27所述的方法,其中所述受试者患有短肠综合征和/或Roux-en-Y胃旁路术。
29.如前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述受试者在所述施用之前具有至少70mg/天的尿草酸盐(Uox)水平。
30.如前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述受试者在所述施用之后显示Uox水平降低至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%或80%。
31.如前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述受试者在所述施用之前具有eGFR<30mL/min/1.73m2,需要血液透析,或具有全身性草酸盐沉着。
32.如前述权利要求中任一项所述的方法,其中将所述重组细菌以约1x1011个活重组细菌、约3x1011个活重组细菌、约4.5x1011个活重组细菌、约5x1011个活重组细菌、约6x1011个活重组细菌、约1x1012个活重组细菌或约2x1012个活重组细菌的剂量施用。
33.如前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述重组细菌每天施用一次、每天施用两次或每天施用三次。
34.如前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述施用为每天三次与膳食一起施用约5x1011个活重组细菌。
35.如前述权利要求中任一项所述的方法,所述方法还包括向所述受试者施用质子泵抑制剂(PPI)。
36.如权利要求35所述的方法,其中所述PPI是埃索美拉唑。
37.如权利要求35或权利要求36所述的方法,其中所述PPI的施用是每天一次。
38.如前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述药物组合物还包含半乳糖。
39.如权利要求38所述的方法,其中半乳糖是D-半乳糖。
40.一种重组细菌,所述重组细菌包含:
编码一种或多种草酸分解代谢酶的一个或多个基因序列,所述一个或多个基因序列直接地或间接地与第一启动子可操作地连接,所述第一启动子在自然界不与所述草酸分解代谢酶基因相关,其中所述一个或多个基因序列包含scaaE3基因、frc基因和oxdC基因,其中所述scaaE3基因包含与SEQ ID NO:3具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列,包含SEQ ID NO:3或由SEQ ID NO:3组成,其中所述frc基因包含与SEQ ID NO:1具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列,包含SEQ ID NO:1或由SEQ ID NO:1组成,并且其中所述oxdC基因包含与SEQID NO:2具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列,包含SEQ ID NO:2或由SEQ ID NO:2组成;
编码草酸盐输入蛋白的基因,其中编码所述草酸盐输入者蛋白的所述基因是oxlT基因,并且其中所述oxlT基因包含与SEQ ID NO:11具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列,包含SEQ ID NO:11,或由SEQ ID NO:11组成;
ΔthyA营养缺陷型;
内源噬菌体中的缺失;
经修饰的内源性大肠杆菌素岛。
41.如权利要求40所述的重组细菌,其中所述内源噬菌体包含与SEQ ID NO:63具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列,包含SEQ IDNO:63,或由SEQ ID NO:63组成。
42.如权利要求40或权利要求41所述的重组细菌,其中所述经修饰的内源大肠杆菌素岛包含一种或多种选自由以下组成的组的经修饰的clb序列:clbA(SEQ ID NO:1065)、clbB(SEQ ID NO:1066)、clbC(SEQ ID NO:1067)、clbD(SEQ ID NO:1068)、clbE(SEQ ID NO:1069)、clbF(SEQ ID NO:1070)、clbG(SEQ ID NO:1071)、clbH(SEQ ID NO:1072)、clbI(SEQID NO:1073)、clbJ(SEQ ID NO:1074)、clbK(SEQ ID NO:1075)、clbL(SEQ ID NO:1076)、clbM(SEQ ID NO:1077)、clbN(SEQ ID NO:1078)、clbO(SEQ ID NO:1079)、clbP(SEQ IDNO:1080)、clbQ(SEQ ID NO:1081)、clbR(SEQ ID NO:1082)和clbS(SEQ ID NO:1803)。
43.如权利要求40-42中任一项所述的重组细菌,其中所述经修饰的内源性大肠杆菌素岛包含以下的缺失:clbA(SEQ ID NO:1065)、clbB(SEQ ID NO:1066)、clbC(SEQ ID NO:1067)、clbD(SEQ ID NO:1068)、clbE(SEQ ID NO:1069)、clbF(SEQ ID NO:1070)、clbG(SEQID NO:1071)、clbH(SEQ ID NO:1072)、clbI(SEQ ID NO:1073)、clbJ(SEQ ID NO:1074)、clbK(SEQ ID NO:1075)、clbL(SEQ ID NO:1076)、clbM(SEQ ID NO:1077)、clbN(SEQ IDNO:1078)、clbO(SEQ ID NO:1079)、clbP(SEQ ID NO:1080)、clbQ(SEQ ID NO:1081)和clbR(SEQ ID NO:1082)。
44.如权利要求40-43中任一项所述的重组细菌,其中所述重组细菌不包含编码抗生素抗性的基因。
45.如权利要求40-44中任一项所述的重组细菌,其中所述第一启动子为诱导型启动子,任选地当所述诱导型启动子为FNR启动子时,任选地其中所述FNR启动子包含与SEQ IDNO:13-29中的任一者具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列,包含SEQ ID NO:13-29中的任一者,或由SEQ ID NO:13-29中的任一者组成。
46.如权利要求40-45中任一项所述的重组细菌,其中所述重组细菌具有至少约1μmol/1x109个细胞的草酸盐消耗活性。
47.如权利要求40-46中任一项所述的重组细菌,其中所述重组细菌在厌氧条件下具有约50-600mg/天的草酸盐消耗活性。
48.如权利要求40-47中任一项所述的重组细菌,其中所述重组细菌是SYNB8802v1。
49.如权利要求48所述的重组细菌,其中所述重组细菌是SYNB8802。
50.如权利要求40-49中任一项所述的重组细菌,其中所述重组细菌在厌氧条件下具有约0.2微摩尔/小时至约1.6微摩尔/小时、约0.5微摩尔/小时至约1.5微摩尔/小时、或约1.0微摩尔/小时至约1.5微摩尔/小时的草酸盐消耗活性。
51.如权利要求50所述的重组细菌,其中所述重组细菌在厌氧条件下具有约0.5微摩尔/小时至约1.5微摩尔/小时的草酸盐消耗活性。
52.如权利要求1-39中任一项所述的方法,其中所述重组细菌在厌氧条件下具有约0.2微摩尔/小时至约1.6微摩尔/小时、约0.5微摩尔/小时至约1.5微摩尔/小时、或约1.0微摩尔/小时至约1.5微摩尔/小时的草酸盐消耗活性。
53.如权利要求52所述的方法,其中所述重组细菌在厌氧条件下具有约0.5微摩尔/小时至约1.5微摩尔/小时的草酸盐消耗活性。
54.如权利要求1-39中任一项所述的方法,其中所述重组细菌能够将施用后所述受试者中的尿草酸盐降低至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%或至少45%。
55.如权利要求1-39中任一项所述的方法,其中所述重组细菌能够将施用后所述受试者的粪便草酸盐减低至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少85%。
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PB01 | Publication | ||
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