ES2881384T3 - Bacterias manipuladas para reducir la hiperfenilalaninemia - Google Patents

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Abstract

Bacteria manipulada genéticamente que comprende: a) uno o más genes que codifican una fenilalanina amoniaco liasa (PAL), en la que el gen o genes que codifican una PAL están unidos de manera operativa a un promotor inducible que no está asociado con el gen de PAL en la naturaleza, en la que la expresión del gen o genes que codifican PAL aumenta en presencia de un inductor de dicho promotor; y b) uno o más genes que codifican un transportador de fenilalanina capaz de transportar fenilalanina a células bacterianas, en el que el gen o genes que codifican el transportador de fenilalanina están unidos de manera operativa a un promotor inducible que no está asociado con el gen del transportador de fenilalanina en la naturaleza, en la que la expresión del gen o genes que codifican el transportador de fenilalanina aumenta en presencia de un inductor de dicho promotor.

Description

DESCRIPCIÓN
Bacterias manipuladas para reducir la hiperfenilalaninemia
[0001] La presente solicitud reivindica el beneficio de prioridad a la Solicitud de Patente Provisional de EEUU Número 62/161.137, presentada el 13 de mayo de 2015, la Solicitud de Patente Provisional de EEUU Número 62/256.052, presentada el 16 de noviembre de 2015.
[0002] Esta divulgación se refiere a composiciones y procedimientos terapéuticos para reducir la hiperfenilalaninemia. En ciertos aspectos, la divulgación se refiere a bacterias manipuladas genéticamente, que son capaces de reducir la hiperfenilalaninemia en un mamífero. En ciertos aspectos, las composiciones y los procedimientos descritos en el presente documento se pueden utilizar para tratar enfermedades asociadas con la hiperfenilalaninemia, por ejemplo, fenilcetonuria.
[0003] La fenilalanina es un aminoácido esencial, que se encuentra principalmente en proteína dietética. Típicamente, se utiliza una cantidad pequeña para la síntesis de proteínas y el resto se hidroxila con tirosina en una vía enzimática, que requiere fenilalanina hidroxilasa (PAH) y el cofactor de tetrahidrobiopterina. La hiperfenilalaninemia es un grupo de enfermedades asociadas con niveles excesivos de fenilalanina, que pueden ser tóxicos y causar daño cerebral. La hiperfenilalaninemia primaria está causada por deficiencias en la actividad PAH, que es el resultado de mutaciones en el gen PAH y/o un bloqueo en el metabolismo de cofactor.
[0004] La fenilcetonuria (PKU) es una forma severa de hiperfenilalaninemia causada por mutaciones en el gen PAH. PKU es una enfermedad genética recesiva autosómica, que se clasifica como el error congénito más común de metabolismo a nivel mundial (1 en 3000 nacimientos), y afecta a aproximadamente 13000 pacientes en Estados Unidos. Se han identificado más de 400 diferentes mutaciones genéticas de PAH (Hoeks et al., 2009). Las terapias actuales de PKU requieren dietas manipuladas de manera sustancial, que consisten en restricción de proteína. El tratamiento desde nacimiento reduce de manera general el daño cerebral y retraso mental (Hoeks et al., 2009; Sarkissian et al., 1999). Sin embargo, la dieta restrictiva en proteína se debe controlar minuciosamente, y se deben añadir en la dieta tanto los aminoácidos como las vitaminas. Es más, el acceso a alimentos bajos en proteínas es un reto, ya que son más caros que sus homólogos no modificados altos en proteínas (Vockley et al., 2014).
[0005] En niños con PKU, el retraso de crecimiento es frecuente en una dieta baja en fenilalanina (Dobbelaere et al., 2003). En la edad adulta, pueden aparecer nuevos problemas, tales como osteoporosis, PKU materno y deficiencias de vitaminas. Los niveles elevados de fenilalanina en la sangre, que puede penetrar libremente la barrera sangrecerebro, también, pueden causar deficiencia neurológica, problemas de conducta (por ejemplo, irritabilidad, fatiga) y/o síntomas físicos (por ejemplo, convulsiones, erupciones cutáneas, olor corporal rancio). Las reglas generales internacionales recomiendan restricción de fenilalanina en la dieta para toda la vida, que generalmente se considera difícil y poco realista (Sarkissian et al., 1999), y «se necesitan esfuerzos continuos para superar el reto más grande de vivir con PKU - devoción para toda la vida a la dieta baja en fenilalanina» (Macleod et al., 2010).
[0006] En un subconjunto de pacientes con actividad PAH residual, se puede utilizar la administración oral del cofactor de tetrahidrobiopterina (al que también se refiere como THB, BH4, Kuvan, o sapropterina) conjuntamente con restricción dietética para bajar los niveles de fenilalanina en sangre. Sin embargo, la terapia de cofactor es costosa y solamente es adecuada para leves formas de fenilcetonuria. El coste anual de Kuvan, por ejemplo, puede ser tanto como 57.000$ por paciente. Adicionalmente, los efectos secundarios de Kuvan pueden incluir gastritis y reacciones alérgicas graves (por ejemplo, sibilancia, mareo, nausea, enrojecimiento de la piel).
[0007] La enzima fenilalanina amonio liasa (PAL) es capaz de metabolizar fenilalanina hasta niveles no tóxicos de amoníaco y ácido transcinámico. A diferencia de PAH, Pal no requiere actividad de cofactor THB para metabolizar fenilalanina. Se han llevado a cabo los estudios de terapia enzimática por vía oral utilizando PAL, pero «los estudios en humanos e incluso en animales no se han realizado debido a que PAL no estaba disponible en cantidades suficientes a precios razonables» (Sarkissian et al., 1999). Una forma pegilada de recombinante PAL (PEG-PAL) está también en desarrollo como una forma inyectable de tratamiento. Sin embargo, la mayoría de sujetos administrados con una dosis de PEG-PAl han sufrido reacciones en el sitio de inyección y/o han desarrollado anticuerpos a esta enzima terapéutica (Longo et al., 2014). Por consiguiente, existe una necesidad no cubierta significativa de tratamiento efectivo, fiable y/o de larga duración para enfermedades asociadas con hiperfenilalaninemia, incluyendo PKU.
[0008] WO 2014/066945 y WO 2014/018832 se refieren a probióticos modificados genéticamente, que expresan PAL para tratar fenilcetonuria. Sarkissian et al. Proc Natl Acad Sci USA. 1999. 96: 2339-2344 describe el uso de PAL para degradar fenilalanina en un modelo de ratón con fenilcetonuria. Liu et al. Artificial Cells. Blood Substitutes. And Immobilization Biotechnology. 2002. 30: 243-257 describe el uso de una bacteria, que expresa PAL para tratar ratas con hiperfenilalaninemia. Christodoulou et al: Abstr 166. La terapia de sustitución enzimática para fenilcetonuria administrada por la vía oral utilizando un probiótico modificado genéticamente: prueba de principio. ",62ND ANNUAL MEETING OF THE AMERICAN SOCIETY OF HUMAN GENETICS, 6-10 NOVEMBER 2012, SAN FRANCISCO, volumen 62, 8-10 de noviembre de 2012, se refiere a administración de PAL utilizando un probiótico modificado genéticamente. Kang et al. Molecular Genetics And Metabolism, 2010, 99: 4-9 se refiere a formulaciones para la administración oral de PAL. Chen et al Chínese journal of Biotechnology, 2006, 22: 187-190 describe la expresión de PAL en Lactococcus lactis.
[0009] La L-aminoácido desaminasa (LAAD) cataliza desaminación oxidativa de fenilalanina para generar fenilpiruvato y rastrea las cantidades de amoníaco y peróxido de hidrógeno. El ácido fenilpirúvico (PPA) se usa ampliamente en las industrias farmacéuticas, alimenticias y químicas, y PPA es el material inicial para la síntesis de D-fenilalanina, un intermediario bruto en la producción de muchos fármacos quirales y aditivos alimentarios. Por lo tanto, LAAD se ha estudiado en el contexto de producción de PPA industrial (Hou et al. 2015, Appl Microbiol Biotechnol. Octubre de 2015; 99(20):8391-402; "Production of phenylpyruvic acid from L-phenylalanine using an L-amino acid deaminase from Proteus mirabilis: comparison of enzymatic and whole- cell biotransformation approaches"). Fenilpiruvato es incapaz de traspasar la barrera hematoencefálica (Steele, Fed Proc. Junio de 1986 ;45(7):2060-4, "Blood-brain barrier transport of the alpha-keto acid analogs of amino acids.") indicando que esta transformación es útil para controlar los fenotipos neurológicos de PKU.
[0010] WO 2016/210373 se refiere a microorganismos que se modifican para morir después de la expresión y/o la administración de una molécula de interés a un sitio deseado en un sujeto. WO 2013/192543 se refiere a enzimas y procedimientos de biosíntesis de estireno.
[0011] La presente divulgación se refiere de manera general a bacterias manipuladas genéticamente, que codifican y expresan una enzima, que metaboliza fenilalanina (PME). La divulgación se refiere a bacterias manipuladas genéticamente, que codifican y expresan fenilalanina amonio liasa y, opcionalmente, fenilalanina hidroxilasa y/o L-aminoácido desaminasa, y son capaces de reducir hiperfenilalaninemia.
[0012] Más particularmente, la invención proporciona una bacteria manipulada genéticamente, que comprende: a) un gen o más genes, que codifica(n) una fenilalanina amonio liasa (PAL), donde el(los) gen(es), que codifica(n) un PAL se une de manera operativa con un promotor inducible, que no se asocia con el gen PAL en la naturaleza, donde la expresión del(los) gen(es), que codifica(n) PAL se aumenta en presencia de un inductor de dicho promotor; y b) un gen o más genes, que codifica(n) un transportador de fenilalanina capaz de transportar fenilalanina en células bacterianas, donde el(los) gen(es), que codifica(n) el transportador de fenilalanina se une de manera operativa con un promotor inducible, que no se asocia con el transportador de fenilalanina en la naturaleza, donde la expresión del(los) gen(es), que codifica(n) el transportador de fenilalanina se aumenta en presencia de un inductor de dicho promotor.
[0013] La invención proporciona, también, una composición farmacéuticamente aceptable, que comprende una bacteria de la invención y un portador farmacéuticamente aceptable.
[0014] En determinadas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente son no patógenas y se pueden introducir en el intestino para reducir los niveles tóxicos de fenilalanina. En determinadas realizaciones, la fenilalanina amonio liasa y/o fenilalanina hidroxilasa y/o L-aminoácido desaminasa se produce de manera estable por las bacterias manipuladas genéticamente y/o las bacterias manipuladas genéticamente se mantienen de manera estable in vivo y/o in vitro. En la presente invención, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden, además, un gen transportador de fenilalanina para aumentar su absorción de fenilalanina. La invención proporciona, también, composiciones farmacéuticas, que comprenden las bacterias manipuladas genéticamente. También se proporciona la bacteria o composición manipulada genéticamente de la invención para su uso en un procedimiento de reducción de hiperfenilalaninemia o tratamiento de una enfermedad asociada con hiperfenilalaninemia.
Breve Descripción de las Figuras
[0015]
La Figura 1 representa una biótica sintética para tratar fenilcetonuria (PKU) y trastornos, que se caracterizan por hiperfenilalaninemia.
La Figura 2A representa un esquema de acción de fenilalanina hidroxilasa en fenilcetonuria (PKU). La Figura 2B representa un esquema de acción de fenilalanina hidroxilasa (PAH). La Figura 2C representa un esquema de acción de fenilalanina amonio liasa (PAL). La Figura 2D representa un esquema de acción de L-aminoácido desaminasa (LAAD; por ejemplo, de Proteus mirabilis).
La Figura 3 representa una biótica sintética para tratar fenilcetonuria (PKU) y trastornos, que se caracterizan por hiperfenilalaninemia.
La Figura 4 representa una biótica sintética para tratar fenilcetonuria (PKU) y trastornos, que se caracterizan por hiperfenilalaninemia.
La Figura 5 representa una biótica sintética para tratar fenilcetonuria (PKU) y trastornos, que se caracterizan por hiperfenilalaninemia.
La Figura 6 representa la organización genética de una construcción de ejemplo, que comprende un gen, que codifica PAL3 y un secuencia promotora Tet en un plásmido con alto número de copias, por ejemplo, como comprendido en SYN-PKU202, SYN-PKU303.
La Figura 7 representa la organización genética de una construcción de ejemplo, que comprende un gen, que codifica PAL3 y un secuencia promotora FNR en un plásmido con bajo número de copias, por ejemplo, como comprendido en SYN-PKU304, SYN-PKU307, SYN-PKU304, SYN- PKU306.
La Figura 8 representa la organización genética de una construcción de ejemplo, que comprende un gen, que codifica PAL3 y un secuencia promotora Tet en un plásmido con bajo número de copias, por ejemplo, SYN-PKU302, SYN-PKU201.
La Figura 9 representa la organización génica de una construcción de ejemplo, por ejemplo, comprendida en SYN-PKU401, que comprende un gen LAAD clonado bajo el control de una secuencia promotora Tet y un gen represor Tet.
La Figura 10 muestra una representación esquemática de la construcción de una cepa knock-in pheP, donde se utiliza recombinación para insertar una segunda copia de phe P en el gen Nissle lacZ.
La Figura 11 representa la organización genética de una construcción de ejemplo, que comprende un gen, que codifica PheP, un gen, que codifica TetR, y una secuencia promotora tet para inserción cromosómica, por ejemplo, como, por ejemplo, comprendida en SYN-PKU203, SYN-PKU401, SYN-PKU402, SYN-PKU302 y SYN-PKU303.
La Figura 12A representa la organización genética de una construcción de ejemplo, que comprende un gen PAL3 clonado bajo el control de una secuencia promotora FNR, sobre un plásmido de bajo número de copias, resistente a kanamicina. En condiciones anaeróbicas, PAL3 degrada fenilalanina a transcinamato no tóxico. La Figura 12B representa una copia adicional del transportador de fenilalanina con alta afinidad por E. coli endógeno, pheP, impulsado por el promotor PfnrS e insertado en el locus lacZ en el cromosoma Nissle.
Las Figuras 12A, 13B y 13C representan diagramas esquemáticos de realizaciones no limitativas de la divulgación. La Figura 13A representa componente de degradación de fenilalanina integrados en el cromosoma E. coli Nissle. En algunas realizaciones, las cepas bacterianas libres de plásmido manipuladas se utilizan para prevenir conjugación de plásmido in vivo. En algunas realizaciones, las inserciones múltiples del gen PAL dan como resultado aumentado número de copias y/o aumentada actividad de degradación de fenilalanina. En algunas realizaciones, una copia del transportador de fenilalanina con alta afinidad por E. coli endógeno, pheP, se impulsa por el promotor PfnrS y se inserta en el locus lacZ. La Figura 13B representa un diagrama esquemático de una realización no limitativa de la divulgación, donde el cromosoma E.coli Nissle se modifica para contener cuatro copias de PfnrS-PAL insertado en cuatro diferentes sitios de inserción a lo largo del genoma (malE/K, yicS/nepI, agaI/rsmI y cea), y una copia de un gen transportador de fenilalanina insertado en un sitio diferente de inserción (lacZ). En esta realización, el gen PAL es PAL3 derivado de P. luminescens, y el gen transportador de fenilalanina es pheP derivado de E. coli. En una realización, la cepa es SYN-PKU511. La Figura 13C representa un diagrama esquemático de una realización preferida de la divulgación, donde el cromosoma E. coli Nissle se modifica para contener cinco copias de PAL bajo el control de un promotor dependiente de nivel de oxígeno (por ejemplo, PfnrS-PAL3) insertado en diferentes sitios de integración en el cromosoma (malE/K, yicS/nepI, malP/T, agaI/rsmI y cea), y una copia de un gen transportador de fenilalanina bajo el control de un promotor dependiente de nivel de oxígeno (por ejemplo, PfhrS-pheP) se inserta en diferente sitio de inserción en el cromosoma (lacZ). El genoma se modifica más para incluir un auxótrofo thyA, en el que el gen thyA se elimina o se reemplaza con un gen no relacionado, así como un gen resistente a kanamicina.
La Figura 14 representa la organización genética de una construcción de ejemplo no limitativa, que comprende un gen, que codifica araC, y un gen, que codifica LAAD de Proteus mirabilis, y una secuencia promotora inducible por arabinosa (ParaBAD) para la inserción cromosómica en el operón de arabinosa endógeno para la integración cromosómica, por ejemplo, como comprendido en SYN-PKU705.
La Figura 15A representa concentraciones de fenilalanina en muestras, que comprenden bacterias, que expresan PAL1 o plásmidos de bajo número de copias (LC; SYN-PKU101) o de alto número de copias (HC; SYN-PKU102) o PAL3 sobre plásmidos de bajo número de copias (LC; SYN-PKU201) o de alto número de copias (HC; SYN-PKU202), inducidas por tetraciclina anhidra (ATC), y, a continuación, cultivadas en un medio de cultivo suplementado con 4 mM (660,000 ng/mL) de fenilalanina. Las muestras se eliminaron en 0 horas, 4 horas y 23 horas. Las concentraciones de fenilalanina se determinaron mediante espectrometría de masas. La Figura 15B representa niveles de cinamato en muestras de 4 horas y 23 horas después de inducción. En las cepas, que expresan PAL-3, el gen PAL-3 se deriva de Photorhabdus luminescens, una enterobacteria en la misma subdivisión taxonómica como Escherichia coli.
La Figura 16A representa concentraciones de fenilalanina en muestras, que comprenden bacterias, que expresan PAL1 o PAL3 sobre plásmidos de bajo número de copias (LC) o de alto número de copias (HC) o comprenden, además, una copia de pheP impulsada por el promotor Tet integrado en el cromosoma. Se indujeron las bacterias con ATC y, a continuación, se cultivaron en un medio de cultivo suplementado con 4 mM (660,000 ng/mL) de fenilalanina hasta un OD600 de 2.0. Las muestras se eliminaron en 0 horas, 2 horas y 4 horas después de inducción y se determinaron las concentraciones de fenilalanina mediante espectrometría de masas. Principalmente, la copia adicional de pheP permitió la degradación de fenilalanina (4 mM) en 4 horas. La Figura 16B representa niveles de cinamato en muestras de 4 horas y 23 horas después de inducción. En algunas realizaciones, se puede utilizar cinamato como un biomarcador alternativo para la actividad de cepa. La sobreexpresión de PheP mejora el metabolismo de fenilalanina en bacterias manipuladas. Las cepas analizadas en este conjunto de datos son SYN-PKU101, SYN-PKU102, SYN-PKU202, SYN-PKU201, SYN-PKU401, SYN-PKU402, SYN- PKU203, SYN-PKU302, SYN-PKU303.
Las Figuras 17A y 17B representan el estado de una realización no limitativa de la construcción PAL en condiciones de no inducción (Figura 17A) e inducción (Figura 17B). La Figura 17A representa relativamente baja producción de PAL y PheP bajo condiciones aeróbicas debido a oxígeno (O2), que evita la dimerización y la activación de expresión genética de PAL y/o pheP.
La Figura 17A representa producción sobre-regulada de PAL y PheP bajo condiciones anaeróbicas debido a dimerización de FNR e inducción de expresión mediada por promotor FNR de PAL y pheP (garabato encima de "PAL" y "pheP"). Las flechas adyacentes a un rectángulo único o un grupo de rectángulos representan el promotor responsable de transcripción impulsada (en la dirección de la flecha) de tal(es) gen(es). Las flechas encima de cada rectángulo representan el producto de expresión de cada gen.
La Figura 18 representa niveles de p-galactosidasa en muestras, que comprenden bacterias, que albergan plásmidos de bajo número de copias, que expresan lacZ a partir de un promotor sensible a FNR seleccionado de los promotores FNR de ejemplo, que se muestran en la Tabla 3 (Pfnr1-5). Se utilizaron diferentes promotores sensibles a FNR para crear una biblioteca de marcadores inducibles por vía anaerobia con una variedad de niveles de expresión y rangos dinámicos. Estos promotores incluían fuertes puntos de unión de ribosoma. Los cultivos de bacterias se cultivaron o bajo las condiciones aeróbicas (+O2) o anaeróbicas (-O2). Las muestras se eliminaron en 4 horas y se analizó la actividad de promotor basada en los niveles de p-galactosidasa utilizando los ensayos colorimétricos estándares de p-galactosidasa.
La Figura 19A muestra una representación esquemática del gen lacZ bajo el control de un promotor FNR de ejemplo (PfnrS). LacZ codifica la enzima de p D-galactosidasa y es un gen reportero común en bacterias. La Figura 19B muestra la actividad de promotor FNR como una función de actividad de p-galactosidasa en SYN-PKU304. SYN-PKU304, una cepa bacteriana manipulada, que alberga un gen de fusión fnrS-lacZ de bajo número de copias, se cultivó en presencia o ausencia de oxígeno. Los valores para los ensayos colorimétricos estándares de pgalactosidasa se expresan en unidades Miller (Miller, 1972). Estos datos sugieren que el promotor fnrS empieza a impulsar la expresión génica de alto nivel dentro de 1 hora bajo condiciones anaeróbicas. La Figura 19C representa el crecimiento de cultivos de células bacterianas, que expresan lacZ conforme avanza el tiempo, tanto en presencia como en ausencia de oxígeno.
Las Figuras 20A y 20B representan niveles de fenilalanina producidos bajo las condiciones aeróbicas (Figura 20A) o anaeróbicas (Figura 20B) en las muestras Nissle de tipo salvaje, las muestras de bacterias, que comprenden un plásmido de bajo número de copias, que expresa PAL3 a partir del promotor Tet o los promotores Tet de ejemplo o comprende, además, una copia de pheP impulsada por el promotor Tet e integrada en el cromosoma. Las muestras se incubaron en un medio de cultivo suplementado con ATC y 4 mM (660,000 ng/mL) de fenilalanina. Las muestras se eliminaron en 0 horas, 2 horas, 4 horas y 24 horas. Las concentraciones de fenilalanina se determinaron mediante espectrometría de masas. Estos datos sugieren que el promotor fnrS sensible a FNR es tan efectivo activando expresión PAL3 como un promotor inducible por tetraciclina bajo las condiciones anaeróbicas.
La Figura 21 representa concentraciones de fenilalanina en cultivos de cepas probióticas sintéticas con y sin una copia adicional de pheP insertado en el cromosoma. Después de 1,5 horas de crecimiento, los cultivos se colocaron en una cámara anaeróbica Coy, que suministraba 90% de N2, 5% de CO2 y 5% de H2. Después de 4 horas de inducción, las bacterias se volvieron a suspender en un tampón de ensayo, que contenía 4 mM de fenilalanina. Las alícuotas se eliminaron de ensayos celulares cada 30 minutos durante 3 horas para cuantificación de fenilalanina mediante espectrometría de masas. Los índices de degradación de fenilalanina en cepas, que comprenden una copia adicional de pheP (SYN- PKU304 y SYN-PKU305; izquierda), eran más altos que cepas, que carecían de una copia adicional de pheP (SYN-PKU308 y SYN-PKU307; derecha).
La Figura 22 representa concentraciones de transcinamato (activación PAL) para las sepas, que comprenden inserciones únicas de PAL3 en diferentes localizaciones del cromosoma.
La Figura 23 representa concentraciones de transcinamato (activación PAL) para las sepas, que comprenden inserciones múltiples de PAL3 en diferentes localizaciones del cromosoma.
La Figura 24 representa concentraciones de fenilalanina en cultivos de cepa probiótica sintética SYN-PKU511 conforme avanza el tiempo. Después de 2,5 horas de crecimiento, los cultivos se colocaron en una cámara anaeróbica Coy, que suministraba 90% de N2, 5% de CO2 y 5% de H2. Después de 3,5 horas de inducción en fenilalanina, que contiene un medio, se prepararon extractos de células enteras cada 30 minutos durante 3 horas y se cuantificó fenilalanina mediante espectrometría de masas. SYN-PKU511 comprende 5 copias integradas de un gen controlado anaerobiamente (FNR), que codifica fenilalanina amonio liasa (PAL) en 5 localizaciones cromosómicas, y un gen controlado anaerobiamente, que codifica un transportador Phe con alta afinidad integrado en el locus lacZ.
Las Figuras 25A y 25B representan concentraciones de fenilalanina en cultivos de una cepa probiótica sintética, SYN-PKU401, que comprende un plásmido-pUC57 de alto número de copias con LAAD impulsado por un promotor inducible por Tet, las células se cultivaron en matraces agitados a 37° C y se indujeron con TCA en una fase logarítmica temprana durante un período de 2 horas. Las células se centrifugaron y se volvieron a suspender en un tampón de ensayo, que contiene fenilalanina. Las células se midieron en diferentes concentraciones celulares y con diferentes niveles de oxígeno. Las células se incubaron anaeróbicamente (1 ml) en un tubo de cultivo de 14 ml, con agitación a 250 rpm. Para las condiciones microaeróbicas, las células (1 ml) se incubaron en un tubo cónico de 1,7 ml sin agitación. Las células se incubaron anaeróbicamente en una cámara anaeróbica Coy, que suministraba 90% de N2, 5% de CO2 y 5% de H2. Las alícuotas se eliminaron de ensayos celulares cada 30 minutos durante 2 horas para cuantificación de fenilalanina mediante espectrometría de masas. La Figura 25A representa concentraciones de fenilalanina bajo las condiciones aeróbicas utilizando dos densidades celulares. A y B son duplicados en las mismas condiciones experimentales. La actividad en condiciones aeróbicas es de ~50umol/hora/1e9células. La Figura 25B representa concentraciones de fenilalanina de células cultivadas aeróbicamente, microaeróbicamente y anaeróbicamente.
La Figura 26A muestra concentraciones de fenilalanina antes y después de alimentar un modelo de ratón in vivo de PKU. Al inicio del estudio, los ratones BTBR-Pahenu2 homocigotos se les dio agua suplementada con 100 microgramos/mL de ATC y 5% de sacarosa. Los ratones permanecieron en ayunas al eliminar la comida durante la noche (10 horas) y se recogieron las muestras de sangre mediante sangrado mandibular a la mañana siguiente para determinar los niveles de fenilalanina de referencia. Se les dio comida a los ratones de nuevo, alimentados por gavaje con 100 microlitros (5x109 UFC) de bacterias (SYN-PKU302 o Nissle de control) 1 hora después, y se les permitió comer durante otras 2 horas. Se determinaron las concentraciones de fenilalanina en suero 2 horas después del gavaje. La Figura 26B muestra el cambio de porcentaje (%) en concentraciones de fenilalanina en sangre y después de alimentación como un promedio en grupo macho o hembra (p < 0,01).
Las Figuras 27A y 27B representan concentraciones de fenilalanina en sangre relativas de referencia después de estimular con fenilalanina subcutáneamente en un modelo de ratón in vivo de PKU. Los ratones se alimentaron por gavaje oral con 200 pL de H2O (n=30), SYN-PKU901 (n=33) o SYN-PKU303 (n=34) 30 y 90 minutos después de la inyección de fenilalanina (0,1 mg/gramo de peso corporal de grupo medio). Las Figuras 27 A y 27B muestran concentraciones de fenilalanina en sangre 2 horas y 4 horas después de inyección de fenilalanina respectivamente. Estos datos indican que la administración oral de la cepa probiótica manipulada SYN- PKU303 reduce de manera significativa niveles de fenilalanina en sangre en ratones en comparación con ratones, a los que se les administró el tratamiento simulado (H2O) o la cepa parental (SYN-PKU901) (*, p < 0,05; ***, p < 0,001; ****, p < 0,00001). SYN-PKU303 es capaz de interceptar fenilalanina enterorecirculante.
La Figura 28 representa concentraciones de fenilalanina en sangre relativas de referencia después de impugnar fenilalanina subcutáneamente en un modelo de ratón in vivo de PKU. Los ratones se alimentaron por gavaje oral con 200 pL de H2O (n=30), SYN-PKU901 (n=34) o SYN-PKU304 (n=34) 30 y 90 minutos después de la inyección de fenilalanina (0,1 mg/gramo de peso corporal de grupo medio). Las concentraciones de fenilalanina en sangre después de inyección de fenilalanina indican que SYN- PKU304 (plásmido de bajo número de copias, que contiene fnrS-PAL) es al menos tan eficaz como SYN-PKU303 (plásmido de alto número de copias, que contiene Tet-PAL) en reducir los niveles de Phe circulante en el modelo de enterorecirculación.
Las Figuras 29A y 29B representan concentraciones de fenilalanina en sangre relativas de referencia después de estimular con fenilalanina subcutáneamente en un modelo de ratón in vivo de PKU. Los ratones se alimentaron por gavaje oral con H2O, SYN-PKU901, SYN-PKU303 o SYN-PKU304 30 y 90 minutos después de la inyección de fenilalanina (0,1 mg/gramo de peso corporal de grupo medio). Las Figuras 29 A y 29B muestran concentraciones de fenilalanina en sangre 2 horas y 4 horas después de inyección de fenilalanina respectivamente. Estos datos indican que la administración oral de las cepas probióticas manipuladas SYN-PKU303 y SYN- PKU304 reduce de manera significativa niveles de fenilalanina en sangre en ratones en comparación con ratones a los que se les administró el tratamiento simulado (H2O) o la cepa parental (SYN-PKU901) (*, p < 0,05;**, p< 0,01;***, p < 0,001;****,< 0,0001). Las Figuras 29C y 29D representan diagramas de dispersión de los datos mostrados en las Figuras 29A y 29B.
Las Figuras 30A y 30B representan concentraciones de fenilalanina en sangre relativas de referencia después de estimular con fenilalanina subcutáneamente en un modelo de ratón in vivo de PKU. Los ratones se alimentaron por gavaje oral con 200 pL de H2O (n=12), 200 pL de SYN-PKU901 (n=12) o 100, 200 o 400 pL de SYN-PKU304 (n=12 en cada grupo de dosis) 30 y 90 minutos después de la inyección de fenilalanina (0,1 mg/gramo de peso corporal de grupo medio). Las Figuras 30A y 30B muestran una disminución dependiente de dosis en los niveles de fenilalanina en sangre en ratones tratados con SYN-PKU304 en comparación con ratones a los que se les administró tratamiento simulado (H2O) o la cepa parental (SYN-PKU901) (* 30% de disminución; p < 0,05). Este experimento representa uno de ocho estudios del mismo diseño, y cada estudio muestra que SYN-PKU304 es capaz de interceptar fenilalanina eterorecirculante.
Las Figuras 31A y 31B representan un esquema de metabolitos de fenilalanina específicos de PKU y específicos de PAL. La Figura 31A representa un esquema de la conversión de fenilalanina en ácido fenilpirúvico y ácido fenil-láctico en ausencia de PAH funcional. La Figura 31B representa un esquema de la conversión de fenilalanina en ácido transcinámico mediante PAL3, que se metaboliza adicionalmente con ácido hipúrico mediante enzimas hepáticas. Se puede detectar estos metabolitos utilizando espectrometría de masas como se describe en los Ejemplos 24-26 o utilizando otros procedimientos.
Las Figuras 32A, 32B, 32C, 32D, 32E y 32F representan concentraciones de fenilalanina en sangre relativas de referencia y concentraciones de fenilalanina (Figura 32A) y valores absolutos de fenilalanina y metabolitos específicos de PKU y específicos de PAL después de estimular con fenilalanina subcutáneamente en un modelo de ratón in vivo de PKU. Los ratones se alimentaron por gavaje oral con un total de 800 pL de H2O (n= 12), SYN-PKU901 (n= 12) o 800 pL de SYN-PKU304 (n= 12) (2,9e10 ufc/ratón) 30 y 90 minutos después de inyección de fenilalanina. La Figura 32A representa concentraciones de fenilalanina en sangre relativas de referencia; actividad metabólica total para SYN-PKU304 se calculó como 81,2umol/hora y la reducción total en A Aphe fue de 45% en relación con SYN-PKU901 (P<0,05). La Figura 32B representa la concentración de fenilalanina en sangre 0 y 4 horas después de inyección de fenilalanina. La Figura 32C representa la concentración de fenilpiruvato en sangre 0 y 4 horas después de inyección de fenilalanina. La Figura 32D representa la concentración de fenil-lactato en sangre 0 y 4 horas después de inyección de fenilalanina. La Figura 32E representa la concentración de ácido t-cinámico en sangre 0 y 4 horas después de inyección de fenilalanina. La Figura 32F representa la concentración de ácido hipúrico en sangre 0 y 4 horas después de inyección de fenilalanina.
Las Figuras 33A, 33B, 33C, 33D, 33E y 33F representan concentraciones de fenilalanina en sangre relativas de referencia y concentraciones de fenilalanina (Figura 33A) y valores absolutos de fenilalanina y metabolitos específicos de PKU y específicos de PAL (Figuras33B, 33C, 33D, 33E, y 33F) después de estimular con fenilalanina subcutáneamente en un modelo de ratón in vivo de PKU. Los ratones se alimentaron por gavaje oral con un total de 800 pL de H2O (n=9), SYN-PKU801 (n=12) o 800 pL de SYN-PKU517 (n=12) (2,9e10 ufc/ratón) 30 y 90 minutos después de inyección de fenilalanina. La Figura 33A representa concentraciones de fenilalanina en sangre relativas de referencia; actividad metabólica total para SYN-PKU517 se calculó como 39,6umol/hora y la reducción total en A Aphe fue de 17% en relación con SYN-PKU801 (P<0,05). La Figura 33B representa la concentración de fenilalanina en sangre 0 y 4 horas después de inyección de fenilalanina. La Figura 33C representa la concentración de fenilpiruvato en sangre 0 y 4 horas después de inyección de fenilalanina. La Figura 33D representa la concentración de fenil-lactato en sangre 0 y 4 horas después de inyección de fenilalanina. La Figura 33E representa la concentración de ácido tcinámico en sangre 0 y 4 horas después de inyección de fenilalanina. La Figura 33F representa la concentración de ácido hipúrico en sangre 0 y 4 horas después de inyección de fenilalanina.
Las Figuras 34A, 34B, 34C, 34D, 34E y 34F representan concentraciones de fenilalanina en sangre relativas de referencia y concentraciones de fenilalanina (Figura 34A) y valores absolutos de fenilalanina y metabolitos específicos de PKU y específicos de PAL (Figuras 34B, 34C, 34D, 34E y 34F) después de estimular con fenilalanina subcutáneamente en un modelo de ratón in vivo de PKU. Los ratones se alimentaron por gavaje oral con un total de 800 pL de H2O (n=12), SYN-PKU901 (n=12) o 800 pL de SYN-PKU705 (n=12) (2,9e10 ufc/ratón) 30 y 90 minutos después de inyección de fenilalanina. La Figura 34A representa concentraciones de fenilalanina en sangre relativas de referencia; actividad metabólica total para SYN-PKU705 se calculó como 133,2 umol/hora y la reducción total en A Aphe fue de 30% en relación con SYN-PKU901 (P<0,05). La Figura 34B representa la concentración de fenilalanina en sangre 0 y 4 horas después de inyección de fenilalanina. La Figura 34C representa la concentración de fenilpiruvato en sangre 0 y 4 horas después de inyección de fenilalanina. La Figura 34D representa la concentración de fenil-lactato en sangre 0 y 4 horas después de inyección de fenilalanina. La Figura 34E representa la concentración de ácido tcinámico en sangre 0 y 4 horas después de inyección de fenilalanina. La Figura 34F representa la concentración de ácido hipúrico en sangre 0 y 4 horas después de inyección de fenilalanina.
La Figura 35 representa fenilalanina y 2 análogos tóxicos, p-fluoro-DL-fenilalanina y o-fluoro-DL- fenilalanina, que se utilizan para un ensayo sin objetivo para seleccionar enzimas PAL con actividad aumentada. P-fluoro-DL-fenilalanina y o-fluoro-DL-fenilalanina se incorporan en proteína celular en el sitio de fenilalanina, que da como resultado muerte celular. Debido a que estos compuestos se absorben fácilmente por PheP y pueden actuar como un sustrato para PAL, como se muestra a continuación, se pueden utilizar en selección y cribado genéticos para la identificación de cepas con actividad mejorada de consumo Phe. Las mutaciones, que permiten metabolismo PAL más eficiente, pueden prevenir la incorporación del análogo de fenilalanina en proteína celular, por lo tanto, permitir crecimiento en concentraciones más altas del análogo.
La Figura 36 representa un mapa de sitios de integración de ejemplo dentro del cromosomaE. coli 1917 Nissle. Estos sitios indican regiones, donde los componentes de circuito se pueden insertar en el cromosoma sin interferir con expresión génica esencial. Las barras invertidas (/) se utilizan para mostrar que la inserción ocurrirá entre genes de expresión de manera divergente o convergente. Las inserciones dentro de genes biosintéticos, tales como, thyA, pueden ser útiles para crear auxótrofos nutrientes. En algunas realizaciones, un componente de circuito individual se inserta en más de un sitio indicado.
La Figura 37 representa tres cepas de bacterias, que expresan constitutivamente proteína fluorescente roja (RFP). En las cepas 1-3, el gen rfp se ha insertado en diferentes sitios dentro del cromosoma bacteriano y ha dado como resultado diferentes grados de luminosidad bajo luz fluorescente. E. coli Nissle (cepa 4) no modificado es no fluorescente.
La Figura 38 representa un gráfico de residencia Nissle in vivo. Nissle resistente a estreptomicina se administró a un ratón por gavaje oral sin pretratamiento antibiótico. Se monitorizaron gránulos fecales de 6 ratones en total después de administración para determinar la cantidad de Nissle administrado aun residente dentro del tracto gastrointestinal de ratón. Las barras representan el número de bacterias administradas a los ratones. La línea representa el número de Nissle recuperado a partir de las muestras fecales cada día durante un período de 10 días consecutivos.
Las Figuras 39A y 39B representan concentraciones de fenilalanina en cultivos SYN-PKU302 conforme avanza el tiempo. Después de 1,5 horas de crecimiento, se añadió ATC a los cultivos SYN-PKU302 y SYN-PKU304, los cultivos se colocaron en una cámara anaeróbica Coy, que suministraba 90% de N2, 5% de CO2 y 5% de H2. Después de 4 horas de inducción, las bacterias se volvieron a suspender en un tampón de ensayo, que contenía 4 mM de fenilalanina, y con diferentes pH (pH oscila entre 7,25-2,25). Las alícuotas se eliminaron de ensayos celulares cada 30 minutos durante 2 horas para cuantificación de fenilalanina mediante espectrometría de masas. Las tasas de degradación de fenilalanina aumentaron, cuando pH del tampón de ensayo disminuyó en ambas cepas, SYN-PKU302 (Figura 39A) y SYN-PKU304 (Figura 39B).
La Figura 40 representa un esquema de ejemplo del cromosoma E. coli 1917 Nissle, que comprende múltiples mecanismos de acción (MoAs).
La Figura 41 representa la organización génica de una construcción de ejemplo, donde los genes PAL3 y pheP se transcriben conjuntamente bajo el control de un promotor FNR de ejemplo (PfnrS).
Las Figuras 42A y 42B representan la organización génica de una construcción de ejemplo, donde el gen de recombinasa Int5 se une de manera operativa con un promotor FNR de ejemplo (PfnrS), y el gen PAL3 se une de manera operativa con un promotor constitutivo fuerte. La Figura 42A representa un diagrama esquemático del gen PAL3, flanqueado por sitios Int5, en la orientación OFF (3' hacia 5'). Cuando se activa la expresión génica Int5 bajo las condiciones anaeróbicas, la vuelta recombinatoria de PAL3 hacia la orientación ON (5' hacia 3'; Figura 42B) provoca la producción de PAL3 y el metabolismo de fenilalanina. Se puede utilizar cualquier secuencia promotora constitutiva fuerte.
Las Figuras 43A, 43B y 42C representan la organización génica de una construcción de ejemplo, donde el gen de recombinasa Int5 se une de manera operativa con un promotor FNR (PfnrS), y el gen, que codifica T7 ARN polimerasa, está flanqueado por sitios de recombinasa y se une de manera operativa con un promotor constitutivo fuerte. La Figura 43A representa un diagrama esquemático del gen T7 ARN polimerasa, flanqueado por sitios Int5, en la orientación OFF. Cuando se activa la expresión del gen Int5 bajo las condiciones anaeróbicas, se da la vuelta el gen T7 RNA polimerasa hacia la orientación ON (Figura 43B). En cepas bacterianas manipuladas, que comprenden una copia de PAL3 bajo el control de un promotor impulsado por T7 (Pt7 ; Figura 43C), la expresión de T7 ARN polimerasa provoca la producción de PAL3 y el metabolismo de fenilalanina.
Las Figuras 44A y 44B representan la organización génica de una construcción de ejemplo, donde el gen de recombinasa Int5 se une de manera operativa con un promotor ParaBAD (ParaBAD ), y el gen, que codifica T7 ARN polimerasa, está flanqueado por sitios de recombinasa y se une de manera operativa con un promotor constitutivo fuerte.
La Figura 45A representa un esquema de un interruptor basado en recombinasa para activar la expresión PAL3 utilizando diferentes promotores inducibles y sitios de unión a ribosoma. La expresión de recombinasa causa el giro del gen PAL3 hacia la orientación ON, provocando la producción de PAL3 y la degradación de fenilalanina. En algunas realizaciones, los interruptores basados en recombinasa se calibran para responder a niveles específicos de un inductor. La Figura 45B representa la relación entre la concentración de un inductor y el porcentaje de construcciones, que contienen PAL3, en la orientación ON. El área sombreado muestra el rango de eficiencia pronosticado del inductor in vivo.
La Figura 46A representa una realización no limitativa más de la divulgación, donde la expresión de un gen heterólogo se activa mediante una señal ambiental exógena. En ausencia de arabinosa, el factor de transcripción AraC adopta una conformación, que reprime la transcripción. En presencia de arabinosa, el factor de transcripción AraC se somete a un cambio conformacional, que le permite unirse a y activar el promotor ParaBAD (ParaBAD), que induce la expresión del represor Tet (TetR) y una antitoxina. La antitoxina se acumula en la célula bacteriana recombinante, mientras TetR impide la expresión de una toxina (que está bajo el control de un promotor, que tiene un sitio de unión con TetR). Sin embargo, cuando arabinosa no está presente, no se expresan ni la antitoxina ni TetR. Debido a que TetR no está presente para contener la expresión de la toxina, la toxina se expresa y mata la célula. La Figura 46A representa una realización no limitativa más de la divulgación, donde la expresión de un gen esencial, que no se encuentra en las bacterias recombinantes, se activa mediante una señal ambiental exógena. En ausencia de arabinosa, el factor de transcripción AraC adopta una conformación, que reprime la transcripción del gen esencial bajo el control del promotor araBAD y la célula bacteriana no puede sobrevivir. En presencia de arabinosa, el factor de transcripción AraC se somete a un cambio conformacional, que le permite unirse a y activar el promotor araBAD, que induce la expresión del gen esencial y mantiene la viabilidad de la célula bacteriana.
La Figura 46B representa una realización no limitativa de la divulgación, donde una antitoxina se expresa a partir de un promotor constitutivo y la expresión de un gen heterólogo se activa mediante una señal ambiental exógena. En ausencia de arabinosa, el factor de transcripción AraC adopta una conformación, que reprime la transcripción. En presencia de arabinosa, el factor de transcripción AraC se somete a un cambio conformacional, que le permite unirse a y activar el promotor araBAD, que induce la expresión de TetR, por consiguiente, previniendo la expresión de una toxina. Sin embargo, cuando arabinosa no está presente, TetR no se expresa, y la toxina se expresa, finalmente supera la antitoxina y mata la célula. El promotor constitutivo, que regula la expresión de la antitoxina, debería ser un promotor más débil que el promotor, que impulsa la expresión de la toxina. En este circuito el gen araC está bajo el control de un promotor constitutivo.
La Figura 46C representa una realización no limitativa más de la divulgación, donde la expresión de un gen heterólogo se activa mediante una señal ambiental exógena. En ausencia de arabinosa, el factor de transcripción AraC adopta una conformación, que reprime la transcripción. En presencia de arabinosa, el factor de transcripción AraC se somete a un cambio conformacional, que le permite unirse a y activar el promotor araBAD, que induce la expresión del represor Tet (TetR) y una antitoxina. La antitoxina se acumula en la célula bacteriana recombinante, mientras TetR impide la expresión de una toxina (que está bajo el control de un promotor, que tiene un sitio de unión con TetR). Sin embargo, cuando arabinosa no está presente, no se expresan ni la antitoxina ni TetR. Debido a que TetR no está presente para contener la expresión de la toxina, la toxina se expresa y mata la célula. En este circuito el gen araC o está bajo el control de un promotor constitutivo o un promotor inducible (por ejemplo, promotor AraC).
La Figura 47 representa el uso de GeneGuards como un componente de seguridad modificado. Todos el ADN modificado está presente en un plásmido, que se puede destruir condicionalmente. Véanse, por ejemplo, Wright et al., 2015.
La Figura 48A representa un diagrama esquemático de una construcción clbA de tipo salvaje. La Figura 48B representa un diagrama esquemático de una construcción de bloqueo clbA.
La Figura 49 representa secuencias de ejemplo de una construcción clbA de tipo salvaje y una construcción de bloqueo clbA.
La Figura 50 representa un esquema de un sistema de secreción basado en la secreción flagelar de tipo III, donde se utiliza un flagelo modificado para secretar un péptido terapéutico de interés mediante fusión recombinante del péptido con una señal de secreción flagelar N-terminal de un componente flagelar nativo, de tal modo, que el péptido quimérico expresado de manera intracelular se puede movilizar a lo largo de las membranas internas y externas en el ambiente huésped circundante.
La Figura 51 representa un esquema de un sistema de secreción de tipo V para la producción extracelular de proteínas recombinantes, donde un péptido terapéutico (estrella) se puede fusionar con una señal de secreción N-terminal, un enlazador y el dominio beta de un autosecretor. En este sistema, la secuencia de señal N-terminal dirige la proteína a la maquinaria SecA-YEG, que mueve la proteína a lo largo de la membrana interna en el periplasma, seguida de escisión posterior de la secuencia de señal. El dominio beta se ficha para el complejo Bam, donde el dominio beta se plega y se inserta en la membrana exterior como una estructura barril beta. A continuación, el péptido terapéutico se embobina con el poro hueco de la estructura barril beta delante de la secuencia enlazadora. El péptido terapéutico se libera del sistema enlazador mediante una escisión autocatalítica o mediante dirección de una peptidasa asociada a membrana (tijeras) hacia un sitio de corte de peptidasa complementaria en el enlazador.
La Figura 52 representa un esquema de un sistema de secreción de tipo I, que transloca un péptido pasajero directamente del citoplasma al espacio extracelular utilizando HlyB (un secretor de casete de unión a ATP); HlyD (una proteína de fusión de membrana); y TolC (una proteína de membrana exterior), que forma un canal a través de ambas membranas la interior y la exterior. La porción C-terminal, que contiene señal de secreción de HlyA, se fusiona con la porción C-terminal de un péptido terapéutico (estrella) para mediar la secreción de este péptido.
La Figura 53 representa un esquema de las membranas exterior e interior de una bacteria gram negativa y tiene como objetivo a varias deleciones para generar una membrana exterior permeable o desestabilizada, facilitando, de este modo, la translocación de unos polipéptidos terapéuticos al espacio extracelular, por ejemplo, polipéptidos terapéuticos de origen eucariota, que contienen uniones de disulfuro. Las mutaciones desactivadas de uno o más genes, que codifican una proteína, que ancla la membrana exterior con el esqueleto de peptidoglicano, por ejemplo, lpp, ompC, ompA, ompF, tolA, tolB, pal y/o uno o más genes, que codifican una peptidasa periplásmica, por ejemplo, degS, degP, nlpl, genera un fenotipo permeable. Las combinaciones de mutaciones pueden potenciar sinérgicamente el fenotipo permeable.
La Figura 54 representa un esquema de procesos no limitativos para modificar y producir las bacterias manipuladas genéticamente de la presente divulgación.
Las Figuras 55A, B, C, D y E representan un esquema de procesos de producción no limitativos para la producción en dirección 5' y en dirección 3' de las bacterias manipuladas genéticamente de la presente divulgación. La Figura 55A representa los parámetros para el cultivo inicial 1 (SC1) círculo completo - suministro de glicerol, duración toda la noche, temperatura 37° C, agitación a 250 rpm. La Figura 55B representa los parámetros para el cultivo inicial 2 (SC2) disolución 1/100, duración 1,5 horas, temperatura 37° C, agitación a 250 rpm. La Figura 55C representa los parámetros para el biorreactor de producción: inóculo - SC2, temperatura 37° C, punto fijo de pH 7,00, banda muerta de pH 0,05, punto fijo de oxígeno disuelto 50%, FLO de agitación/gas en cascada de oxígeno disuelto, límites de agitación 300­ 1200 rpm, límites FLO de gas 0,5-20 litros estándares por minuto, duración 24 horas. La Figura 55D muestra los parámetros para la recogida: centrifugación con velocidad de 4000 rpm y duración de 30 minutos, lavado IX con 10% de glicerol/PBS, centrifugación, resuspensión con 10% de glicerol/PBS. La Figura 55E representa los parámetros para el relleno de vial/almacenamiento: 1-2 mL de alícuota, -80° C.
Descripción de las Realizaciones y otra Divulgación
[0016] La presente divulgación incluye bacterias manipuladas genéticamente, composiciones farmacéuticas de las mismas y su uso en modulación y tratamiento de trastornos asociados con la hiperfenilalaninemia. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden un gen, que codifica fenilalanina amono liasa (PAL) no nativa, y son capaces de procesar y reducir la fenilalanina en un mamífero. Por consiguiente, las bacterias manipuladas genéticamente y las composiciones farmacéuticas, que comprenden aquellas bacterias, se pueden utilizar para metabolizar fenilalanina en el cuerpo en moléculas no tóxicas para tratar y/o prevenir afecciones asociadas a hiperfenilalaninemia, incluyendo PKU. En ciertos aspectos, las composiciones, que comprenden bacterias manipuladas genéticamente, se pueden utilizar en los procedimientos descritos en el presente documento para tratar y/o prevenir trastornos asociados con hiperfenilalaninemia.
[0017] Para entender la divulgación más fácilmente, primero se definen ciertos términos. Estas definiciones se deben leer teniendo en cuenta la notificación de la divulgación y como se entienden por un experto en la técnica. A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por un experto en la técnica. Las definiciones adicionales se exponen en la descripción detallada.
[0018] "Hiperfenilalaninemia," "hiperfenilalaninémico" y "exceso de fenilalanina" se utilizan indistintamente en el presente documento para hacer referencia a concentraciones aumentadas o excepcionalmente altas de fenilalanina en el cuerpo. Una señal diagnóstica de hiperfenilalaninemia puede ser un nivel de fenilalanina en sangre de al menos 2 mg/dL, al menos 4 mg/dL, al menos 6 mg/dL, al menos 8 mg/dL, al menos 10 mg/dL, al menos 12 mg/dL, al menos 14 mg/dL, al menos 16 mg/dL, al menos 18 mg/dL, al menos 20 mg/dL o al menos 25 mg/dL.Tal como se usa en el presente documento, las enfermedades asociadas a hiperfenilalaninemia incluyen, pero no se limitan a, fenilcetonuria, fenilcetonuria clásica o típica, fenilcetonuria atípica, hiperfenilalaninemia leve permanente, hiperfenilalaninemia no fenilcetonúrica, deficiencia de fenilalanina hidroxilasa, deficiencia de cofactor, deficiencia de dihidropteridina reductasa, deficiencia de tetrahidropterina sintasa y enfermedad de Segawa. Los individuos afectados pueden sufrir déficits neurológicos progresivos e irreversibles, retraso mental, encefalopatía, epilepsia, eczema, crecimiento reducido, microcefalia, temblor, espasticidad de extremidades y/o hipopigmentación (Leonard 2006). Hiperfenilalaninemia también puede ser secundaria en otras condiciones, por ejemplo, enfermedades de hígado.
[0019] "Fenilalanina amonio liasa" y "PAL" se utilizan para hacer referencia a enzima, que metaboliza fenilalanina (PME), que convierte o procesa fenilalanina a ácido transcinámico y amonio. El ácido transcinámico tiene baja toxicidad y se convierte utilizando enzimas de hígado en mamíferos a ácido hipúrico, que se secreta en la orina. Se puede sustituir PAL por la enzima PAH para metabolizar el exceso de fenilalanina. La actividad de enzima PAL no necesita la activad de cofactor THB. En algunas realizaciones, PAL se codifica por un gen PAL derivado de una especie procariota. En realizaciones alternativas, PAL se codifica por un gen pAl derivado de una especie eucariota. En algunas realizaciones, PAL se codifica por un gen PAL derivado de una especie bacteriana, que incluye, pero no se limita a, Achromobacter xylosoxidans, Pseudomonas aeruginosa, Photorhabdus luminescens, Anabaena variabilis, and Agrobacterium tumefaciens. En algunas realizaciones, PAL se codifica por un gen PAL derivado de Anabaena variabilis y se llama «PALI» en el presente documento (Moffitt et al., 2007). En algunas realizaciones, PAL se codifica por un gen PAL derivado de Photorhabdus luminescens y se llama « PAL3» en el presente documento (Williams et al., 2005). En algunas realizaciones, PAL se codifica por un gen PAL derivado de una especie hongo, por ejemplo, Rhodosporidium toruloides (Gilbert et al., 1985). En algunas realizaciones, PAL se codifica por un gen PAL derivado de una especie de planta, por ejemplo, Arabidopsis thaliana (Wanner et al., 1995). Se puede utilizar cualquier secuencia de nucleótidos y aminoácidos adecuada de PAL o fragmentos de La misma.
[0020] "Fenilalanina hidroxilasa" y "PAH" se utilizan para hacer referencia a una enzima, que cataliza la hidroxilación de la cadena lateral aromática de fenilalanina para crear tirosina en el cuerpo humano conjuntamente con la tetrahidrobiopterina de cofactor. El gen humano, que codifica PAH, está situado en el brazo (q) largo de cromosoma 12 entre posiciones 22 y 22,4. La secuencia de aminoácidos de PAH se conserva altamente entre mamíferos. Las secuencias de aminoácidos para PAH humana y de mamíferos son bien conocidas y están ampliamente disponibles. Se informó de la secuencia de ADNc humano de longitud completa para PAH en 1985 (Kwok et al. 1985). Los fragmentos activos de PAH también son bien conocidos (por ejemplo, Kobe et al. 1997).
[0021] "L-Aminoácido desaminasa" y "LAAD" se utilizan para hacer referencia a una enzima, que cataliza la desaminación oxidativa estereoespecífica de L-aminoácidos para generar sus cetoácidos respectivos, amonio y peróxido de hidrógeno. Por ejemplo, la LAAD cataliza la conversión de fenilalanina a fenilpiruvato. Las enzimas LAAD múltiples son conocidas en la técnica, muchas de las cuales se derivan de bacterias, tales como, Proteus, Providencia y Morganella o veneno. La LAAD se caracteriza por velocidad rápida de reacción de degradación de fenilalanina (Hou et al., Appl Microbiol Technol. octubre de 2015; 99(20):8391-402; "Production of phenylpyruvic acid from L-phenylalanine using an L-amino acid deaminase from Proteus mirabilis: comparison of enzymatic and whole-cell biotransformation approaches"). La mayoría de las L-aminoácido desaminasas eucariotas y procariotas son extracelulares; sin embargo, LAAD de especie Proteus se localiza en la membrana de plasma (membrana interior), con orientación hacia el exterior en el espacio periplásmico, donde se encuentra la actividad enzimática. Como consecuencia de esta localización, no se requiere el transporte de fenilalanina a través de la membrana interior en el citoplasma para LAAD de Proteus mediado por degradación de fenilalanina. La fenilalanina se absorbe fácilmente a través de la membrana exterior en el periplasma sin un transportador, eliminando la necesidad de un transportador para mejorar la disponibilidad de sustrato.
[0022] En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden un gen de LAAD derivado de una especie bacteriana, que incluye, pero no se limita a, bacterias Proteus, Providencia y Morganella. En algunas realizaciones, la especie bacteriana es Proteus mirabilis. En algunas realizaciones, la especie bacteriana es Proteus vulgaris. En algunas realizaciones, la LAAD, codificada por las bacterias manipuladas genéticamente, se ubica en la membrana plasmática, orientada hacia el espacio periplásmico y con la actividad catalítica que tiene lugar en el espacio periplásmico.
[0023] "Enzima, que metaboliza fenilalanina" o "PME" se utilizan para hacer referencia a una enzima, que es capaz de degradar fenilalanina. Cualquier enzima, que metaboliza fenilalanina, conocida en la técnica puede codificarse utilizando las bacterias manipuladas genéticamente. Las PME incluyen, pero no se limitan a, fenilalanina hidroxilasa (PAH), fenilalanina amonio liasa (PAL), aminotransferasa, L-aminoácido desaminasa (L-AAD) y fenilalanina deshidrogenasas.
[0024] Las reacciones con fenilalanina hidroxilasas, fenilalanina deshidrogenasas o aminotransferasas requieren cofactores, mientras L-AAD y PAL no requieren ningún cofactor adicional. En algunas realizaciones, la PME codificada por las bacterias manipuladas genéticamente requiere un cofactor. En algunas realizaciones, este cofactor se proporciona simultáneamente o secuencialmente con la administración de las bacterias manipuladas genéticamente. En otras realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente pueden producir el cofactor. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente codifican una fenilalanina hidroxilasa. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente codifican una fenilalanina deshidrogenasa. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente codifican una aminotransferasa. En algunas realizaciones, la PME codificada por las bacterias manipuladas genéticamente no requiere un cofactor. Aunque no se desea ceñirse a la teoría, la falta de necesidad de un cofactor significa que la velocidad de degradación de fenilalanina por la enzima depende de la disponibilidad del sustrato y no se limita por la disponibilidad del cofactor. Las bacterias manipuladas genéticamente de la invención codifican PAL. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente de la invención también codifican L-AAD. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente codifican combinaciones de PMEs.
[0025] En algunas realizaciones, la actividad catalítica de PME depende de los niveles de oxígeno. En algunas realizaciones, la PME es activa de manera catalítica en condiciones microaeróbicas. Como un ejemplo no limitativo, la actividad catalítica de LAAD depende de oxígeno. En algunas realizaciones, la LAAD es activa en condiciones de oxígeno bajo, tales como, condiciones microaeróbicas. En algunas realizaciones de la invención, la PME funciona con los niveles muy bajos de oxígeno o en ausencia de oxígeno, por ejemplo, como los hallados en el colon. Como un ejemplo no limitativo, la actividad de PAL no depende de la presencia de oxígeno.
[0026] Las PME nuevas o mejoradas se pueden identificar según los procedimientos conocidos en la técnica o descritos en el presente documento, y se pueden codificar utilizando las bacterias manipuladas genéticamente. En algunas realizaciones, la enzima, que es codificada por las bacterias manipuladas genéticamente, es una enzima de tipo salvaje aislada de un organismo vírico, procariota o eucariota. En algunas realizaciones, la secuencia enzimática se ha modificado o mutado adicionalmente para aumentar una o más propiedades específicas de la enzima, tales como, estabilidad o actividad catalítica.
[0027] "Metabolito de fenilalanina" se refiere a un metabolito, que se genera como el resultado de la degradación de fenilalanina. El metabolito se puede generar directamente de fenilalanina, mediante la enzima utilizando fenilalanina como un sustrato, o indirectamente mediante una enzima diferente en dirección 3' en la secuencia metabólica, que actúa en un sustrato metabólico de fenilalanina. Los metabolitos de fenilalanina se pueden producir utilizando las bacterias manipuladas genéticamente, que codifican una PME.
[0028] En algunas realizaciones, el metabolito de fenilalanina es el resultado directo o indirecto de activad PAH, por ejemplo, de PAH producido por las bacterias manipuladas genéticamente. En algunas realizaciones, el metabolito es tirosina. En algunas realizaciones, el metabolito de fenilalanina se acumula en la sangre o en la orina de un paciente con PKU debido a la actividad PAH defectuosa. Los ejemplos no limitativos de tales metabolitos de PKU son ácido fenilpirúvico y ácido fenil-láctico. Otros ejemplos incluyen fenilacetato, feniletilamina y fenilacetilglutamina.
[0029] En algunas realizaciones, el metabolito de fenilalanina es el resultado directo o indirecto de acción PAL, por ejemplo, de PAL producido por las bacterias manipuladas genéticamente. Los ejemplos no limitativos de tales metabolitos de PAL son ácido transcinámico y ácido hipúrico. En algunas realizaciones, el metabolito de fenilalanina es el resultado directo o indirecto de acción LAAD, por ejemplo, de LAAD producido por las bacterias manipuladas genéticamente. Los ejemplos de tales metabolitos LAAD son fenilpiruvato y ácido fenil-láctico.
[0030] "Transportador de fenilalanina" se utiliza para hacer referencia a una proteína transportadora de membrana, que es capaz de transportar fenilalanina en células bacterianas (ver, por ejemplo, Pi et al., 1991). En Escherichia coli, el gen pheP codifica una permeasa específica de fenilalanina de alta afinidad responsable de transporte de fenilalanina (Pi et al., 1998). En algunas realizaciones, el transportador de fenilalanina se codifica por un gen pheP derivado de una especie bacteriana, que incluyen, pero no se limita a, Acinetobacter calcoaceticus, Salmonella entérica, and Escherichia coli. Otros transportadores de fenilalanina incluyen permeasa de aminoácido general, codificada por el gen aroP, que transporta tres aminoácidos aromáticos, que incluyen fenilalanina, con alta afinidad, y se cree que, conjuntamente con PheP, es responsable de una parte importante de importar fenilalanina. Adicionalmente, se ha detectado un nivel bajo de transporte de fenilalanina con la actividad del sistema LIV-I/LS, que es un transportador de aminoácidos de cadena ramificada, que consiste en dos proteínas de unión periplásmicas, la proteína de unión LIV (sistema LIV-I) y la proteína de unión LS (sistema LS), y componentes de membrana, LivHMGF. En algunas realizaciones, el transportador de fenilalanina se codifica mediante un gen aroP derivado de una especie bacteriana. En algunas realizaciones, el transportador de fenilalanina se codifica mediante la proteína de unión LIV y la proteína de unión LS y los genes LivHMGF derivados de una especie bacteriana. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden más de un tipo de transportador de fenilalanina, seleccionado de pheP, aroP y el sistema LIV-I/LS.
[0031] "Fenilalanina" y "Phe" se utilizan para hacer referencia a un aminoácido con la fórmula C6HsCH2CH(NH2) COOH.Fenilalanina es un precursor de tirosina, dopamina, norepinefrina y epinefrina. L-fenilalanina es un aminoácido esencial y la forma de fenilalanina se encuentra principalmente en proteína dietética; el estereoisómero D-fenilalanina se encuentra en cantidades bajas en proteína dietética; DL-fenilalanina es una combinación de ambas formas. Fenilalanina puede hacer referencia a una o más de L-fenilalanina, D-fenilalanina y DL-fenilalanina.
[0032] "Unido de manera operativa" se refiere a una secuencia de ácido nucleico, por ejemplo, un gen, que codifica PAL, que se une a una secuencia de región regulatoria de un modo que permite la expresión de la secuencia de ácido nucleico, por ejemplo, actúa en cis. Una región regulatoria es un ácido nucleico que puede dirigir la transcripción de una gen de interés y puede comprender secuencias promotoras, secuencias potenciadoras, elementos de respuesta, sitios de reconocimiento de proteína, elementos inducibles, elementos de control de promotor, secuencias de unión a proteína, regiones no traducidas 5' y 3', sitios de inicio transcripcional, secuencias de terminación, secuencias poliadenilación e intrones.
[0033] Un "promotor inducible" se refiere a una región reguladora, que se une de manera operativa a uno o más genes, donde la expresión del (los) gen(es) se aumenta en presencia de un inductor de dicha región reguladora.
[0034] Un "promotor inducible directamente" se refiere a una región reguladora, donde la región reguladora se une de manera operativa a un gen, que codifica una enzima, que metaboliza fenilalanina, por ejemplo, PAL; en presencia de un inductor de dicha región reguladora, la enzima, que metaboliza fenilalanina se expresa. Un «promotor inducible indirectamente» se refiere a un sistema regulador, que comprende dos o más regiones reguladoras, por ejemplo, una primera región reguladora, que se une de manera operativa a un gen, que codifica una primera molécula, por ejemplo, un regulador transcripcional, que es capaz de regular una segunda región reguladora, que se une de manera operativa con un gen, que codifica una enzima, que metaboliza fenilalanina. En presencia de un inductor de la primera región reguladora, se puede activar o reprimir la segunda región reguladora, activando o reprimiendo así la expresión de la enzima, que metaboliza fenilalanina. Ambos, un promotor inducible directamente y un promotor inducible indirectamente se abarcan por un «promotor inducible».
[0035] Las «condiciones ambientales exógenas» se refieren a configuraciones o circunstancias bajo las cuales el promotor descrito anteriormente se induce directamente o indirectamente. En algunas realizaciones, las condiciones ambientales exógenas son específicas de los intestinos de un mamífero. En algunas realizaciones, las condiciones ambientales exógenas son específicas del tracto gastrointestinal superior de un mamífero. En algunas realizaciones, las condiciones ambientales exógenas son específicas del tracto gastrointestinal inferior de un mamífero. En algunas realizaciones, las condiciones ambientales exógenas son específicas del intestino delgado de un mamífero. En algunas realizaciones, las condiciones ambientales exógenas se refieren a la presencia de moléculas o metabolitos, que son específicos de los intestinos de mamífero en estado saludable o patológico, por ejemplo, propionato. En algunas realizaciones, las condiciones ambientales exógenas son condiciones con oxígeno bajo, microaeróbicas o anaeróbicas, tales como, el ambiente de los intestinos de mamífero.
[0036] La(s) «condición(es) ambiental(es) exógena(s)» se refiere(n) a configuración(es) o circunstancia(s) bajo la(s) cual(es) el promotor descrito en el presente documento se induce. La frase «condiciones ambientales exógenas» pretende referirse a las condiciones ambientales externas del microorganismo modificado, pero endógenas o nativas del ambiente de sujeto huésped. Por consiguiente, «exógeno» y «endógeno» se pueden utilizar indistintamente para hacer referencia a condiciones ambientales, donde las condiciones ambientales son endógenas para un cuerpo de mamífero, pero externas o exógenas para una célula de microorganismo intacto. En algunas realizaciones, las condiciones ambientales exógenas son específicas de los intestinos de un mamífero. En algunas realizaciones, las condiciones ambientales exógenas son específicas del tracto gastrointestinal superior de un mamífero. En algunas realizaciones, las condiciones ambientales exógenas son específicas del tracto gastrointestinal inferior de un mamífero. En algunas realizaciones, las condiciones ambientales exógenas son específicas del intestino delgado de un mamífero. En algunas realizaciones, las condiciones ambientales exógenas son condiciones con oxígeno bajo, microaeróbicas o anaeróbicas, tales como, el ambiente de los intestinos de mamífero. En algunas realizaciones, las condiciones ambientales exógenas son moléculas o metabolitos, que son específicos de los intestinos de mamífero, por ejemplo, propionato. En algunas realizaciones, la condición ambiental exógena es un metabolito o molécula(s) de tejido específico o enfermedad específica. En algunas realizaciones, la condición ambiental exógena es un ambiente bajo en pH. En algunas realizaciones, el microorganismo modificado genéticamente de la divulgación comprende un promotor dependiente de pH. En algunas realizaciones, el microorganismo modificado genéticamente de la divulgación comprende un promotor dependiente de niveles de oxígeno. En algunos aspectos, las bacterias han implicado factores de transcripción, que son capaces de sentir niveles de oxígeno. Se pueden desencadenar diferentes secuencias de señalización utilizando diferentes niveles de oxígeno y ocurrir con diferentes cinéticas.
[0037] Un "promotor dependiente de nivel de oxígeno" o una «región reguladora dependiente de nivel de oxígeno» se refiere a una secuencia de ácido nucleico con la que uno o más factores de transcripción sensibles a nivel de oxígeno es capaz de unirse, donde la unión y/o activación del factor correspondiente de transcripción activa la expresión génica en dirección 3'.
[0038] Los ejemplos de factores de transcripción dependiente de nivel de oxígeno incluyen, pero no se limitan a, FNR, ANR y DNR.Los promotores correspondientes sensibles a FNR, promotores sensibles a ARN y promotores sensibles a DNR son conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Castiglione et al., 2009; Figlmeier et al., 1989; Galimand et al., 1991; Hasegawa et al., 1998; Hoeren et al., 1993; Salmon et al., 2003). Los ejemplos no limitativos se muestran en la Tabla 1.
[0039] En un ejemplo no limitativo, un promotor (PfnrS) se derivó del gen S de fumarato y nitrato reductasa de E. coli Nissle (fnrS), que es conocido por la expresión alta en condiciones de bajo o ningún oxígeno ambiental (Durand y Storz, 2010; Boysen et al, 2010). El promotor PfnrS se activa bajo las condiciones anaeróbicas mediante el regulador FNR transcripcional global, que se encuentra de forma natural en Nissle. Bajo las condiciones anaeróbicas, FNR forma un dímero y se une a secuencias específicas en los promotores de genes específicos bajo su control, activando, de este modo, su expresión. Sin embargo, bajo las condiciones anaeróbicas, el oxígeno reacciona con grupos de hierro-azufre en dímeros FNR y los convierte en una forma inactiva. De este modo, el promotor inducible por PfnrS se adopta para modular la expresión de proteínas o ARN. PfnrS se utiliza indistintamente en esta solicitud como promotor FNRS, fnrS, FNR, P-FNRS y otras tales designaciones relacionadas para indicar el promotor PfnrS.
Tabla 1. Ejemplos de factores de transcripción y genes sensibles y regiones reguladoras
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[0040] Tal como se utiliza en el presente documento, una secuencia de ácido nucleico «no nativa» se refiere a una secuencia de ácido nucleico normalmente no presente en una bacteria, por ejemplo, una copia extra de una secuencia endógena o una secuencia heteróloga, tal como una secuencia de una especie, cepa o subcepa de bacteria diferente o una secuencia, que se modifica y/o muta en comparación con la secuencia no manipulada de bacterias del mismo subtipo. En algunas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico no nativa es una secuencia de origen no natural (ver, por ejemplo, Purcell et al., 2013). La secuencia de ácido nucleico no nativa puede ser una región reguladora, un promotor, un gen y/o uno o más genes en un casete génico. En algunas realizaciones, «no nativo» hace referencia a dos o más secuencias de ácido nucleico, que no se encuentran en la misma relación entre sí en la naturaleza. La secuencia de ácido nucleico no nativa puede estar presente sobre un plásmido o un cromosoma. Adicionalmente, las múltiples copias de cualquier región reguladora, promotor, gen o casete génico pueden estar presentes en la bacteria, donde una o más copias de la región reguladora, promotor, gen y/o casete génico se pueden mutar o alterar de otro modo como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente se modifican para comprender varias copias de la misma región reguladora, promotor, gen y/o casete génico de la misma región reguladora, promotor, gen y/o casete génico para potenciar el número de copias o para comprender múltiples componentes diferentes de un casete génico, que desarrolla múltiples funciones diferentes. Se describen en el presente documento las bacterias manipuladas genéticamente, que comprenden un gen, que codifica una enzima, que metaboliza fenilalanina, que se une de manera operativa a un promotor inducible directamente o indirectamente, que no se asocia con dicho gen en la naturaleza, por ejemplo, un promotor FNR unido de manera operativa a un gen, que codifica PAL, o un promotor ParaBAD unido de manera operativa a LAAD. Las bacterias manipuladas genéticamente de la invención codifican un PAL, que se une de manera operativa a un promotor inducible, que no se asocia con el gen PAL en la naturaleza.
[0041] "Promotor constitutivo" se refiere a un promotor, que es capad de facilitar transcripción continua de una secuencia o un gen codificador bajo su control y/o al que se une de manera operativa. Los promotores y variantes constitutivos son bien conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, BBa_J23100, un promotor as de Escherichia coli (por ejemplo, un promotor osmY (International Genetically Engineered Machine (íg Em ) Registry of Standard Biological Parts Name BBa_J45992; BBa_J45993)), un promotor a32 constitutivo de Escherichia coli (por ejemplo, promotor de choque térmico (BBa_J45504)), un promotor a70 constitutivo de Escherichia coli (por ejemplo, promotor lacq (BBa_J54200; BBa_J560l5), promotor de operón sensible a fosfato CreABCD de E. coli (BBa_j6495l), promotor GlnRs (BBa_K088007), promotor lacZ (BBa_K119000; BBa_K119001); promotor de gen I M13K07 (BBa_M13101); promotor de gen II M13K07 (BBa_M13102), promotor de gen III M13K07 (BBa_M13103), promotor de gen IV M13K07 (BBa_M13104), promotor de gen V M13K07 (BBa_M13105), promotor de gen VI M13K07 (BBa_M13106), promotor de gen VII M13K07 (BBa_M13108), M13110 (BBa_M13110)), un promotor aA constitutivo de Bacillus subtilis (por ejemplo, promotor veg (BBa_K1430l3), promotor 43 (BBa_K143013), PliaG (BBa_K823000), PlepA (BBa_K823002), Pveg (BBa_K823003)), un promotor aB constitutivo de Bacillus subtilis (por ejemplo, promotor ctc (BBa_K143010), promotor gsiB (BBa_Kl43011)), un promotor Salmonella (por ejemplo, Pspv2 de Salmonella (BBa_K112706), Pspv de Salmonella (BBa_K112707)), un promotor de bacteriófago T7 (por ejemplo, T7 promotor (BBa_I712074; BBa_I719005; BBa_J34814; BBa_J64997; BBa_K113010; BBa_K113011; BBa_K113012; BBa_R0085; BBa_R0180; BBa_R0181; BBa_R0182; BBa_R0183; BBa_Z0251; BBa_Z0252; BBa_Z0253)), un promotor de bacteriófago SP6 (por ejemplo, promotor SP6 (BBa_J64998)) y fragmentos funcionales de los mismos.
[0042] "Intestinos" hace referencia a los órganos, glándulas, tractos y sistemas, que son responsables de la transferencia y la digestión de alimentos, la absorción de nutrientes y la excreción de desechos. En humanos, los intestinos comprenden el tracto gastrointestinal (GI), que empieza en la boca y acaba en el ano, y, adicionalmente, comprende el esófago, el estómago, el intestino delgado y el intestino grueso. Los intestinos comprenden, también, los órganos y las glándulas accesorias, tales como el bazo, el hígado, la vesícula billar y el páncreas. El tracto gastrointestinal superior comprende el esófago, el estómago y el duodeno del intestino delgado. El tracto gastrointestinal inferior comprende el resto del intestino delgado, es decir, el yeyuno y el íleon y todo el intestino grueso, es decir, el intestino ciego, el colon, el recto y el canal anal. Se puede encontrar a las bacterias a lo largo de los intestinos, es decir, el tracto gastrointestinal y, en particular, en los intestinos.
[0043] Tal como se usa en el presente documento, el término "secuencia génica" pretende hacer referencia a una secuencia génica, por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico. La secuencia génica o la secuencia genética pretenden incluir una secuencia génica completa o una secuencia génica parcial. La secuencia génica o la secuencia genética pretende incluir secuencia, que codifica una proteína o un polipéptido y, también, pretende incluir secuencia genética, que no codifica una proteína o un polipéptido, por ejemplo, una secuencia reguladora, secuencia líder, secuencia de señal o secuencia, que codifica no proteína.
[0044] "Microorganismo" se refiere a un organismo o un microbio de tamaño microscópico, submicroscópico o ultramicroscópico, que consiste típicamente en una célula única. Los ejemplos de microorganismos incluyen bacterias, virus, parásitos, hongos, determinadas algas y protozoario. En algunos aspectos, los microorganismos se modifican («organismo modificado») para producir una o más moléculas o proteínas terapéuticas de interés. En ciertos aspectos, el microorganismo se modifica para absorber y catabolizar ciertos metabolitos u otros compuestos de su ambiente, por ejemplo, los intestinos. En ciertos aspectos, el microorganismo se modifica para sintetizar ciertos metabolitos u otros componentes beneficiosos (sintéticos o de origen natural) y liberarlos en su ambiente. En la presente invención, el microorganismo modificado es una bacteria manipulada. En otros aspectos descritos en el presente documento, el microorganismo modificado es un virus modificado.
[0045] "Bacteria no patogénica" se refiere a una bacteria que no es capaz de causar enfermedad o respuesta dañina en un huésped. En algunas realizaciones, las bacterias no patogénicas son bacterias Gram negativas. En algunas realizaciones, las bacterias no patogénicas son bacterias Gram positivas. En algunas realizaciones, las bacterias no patogénicas son bacterias comensales, que están presentes en la microbiota de los intestinos. Los ejemplos de bacterias no patogénicas incluyen, pero no se limitan a, Bacillus, Bacteroides, Bifidobacterium, Brevibacteria, Clostridium, Enterococcus, Escherichia, Lactobacillus,Lactococcus, Saccharomyces, and Staphylococcus, e.g., Bacillus coagulans, Bacillus subtilis, Bacteroides fragilis, Bacteroides subtilis, Bacteroides thetaiotaomicron, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium longum, Clostridium butyricum, Enterococcus faecium, Escherichia coli, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus casei, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus, Lactococcus lactis, and Saccharomyces boulardii (Sonnenborn et al., 2009; Dinleyici et al., 2014; Patente de EEUU Número 6.835.376; Patente de EEUU Número 6.203.797; Patente de EEUU Número 5.589.168; Patente de EEUU Número 7.731.976). Las bacterias patogénicas naturales se pueden modificar genéticamente para proporcionar reducción o eliminación de patogenicidad.
[0046] "Probiótico" se utiliza para hacer referencia a microorganismos vivos, no patogénicos, por ejemplo, bacterias, que pueden otorgar beneficios a un organismo huésped, que contiene una cantidad apropiada del microorganismo. En algunas realizaciones, el organismo huésped es un mamífero. En algunas realizaciones, el organismo huésped es un humano. Algunas especies, cepas y/o subtipos de bacterias no patogénicas se reconocen actualmente como probióticos. Los ejemplos de bacterias probióticas incluyen, pero no se limitan a, Bifidobacteria, Escherichia, Lactobacillus y Saccharomyces, por ejemplo, Bifidobacterium bifidum, Enterococcus faecium, Escherichia coli, cepa Nissle de Escherichia coli, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus plantarum y Saccharomyces boulardii (Dinleyici et al., 2014; Patente de EEUU Número 5.589.168; Patente de EEUU Número 6.203.797; Patente de EEUU 6.835.376). El probiótico puede ser una variante o una cepa mutante de bacteria (Arthur et al., 2012; Cuevas-Ramos et al., 2010; Olier et al., 2012; Nougayrede et al., 2006). Las bacterias no patogénicas pueden modificarse genéticamente para potenciar o mejorar propiedades biológicas deseadas, por ejemplo, capacidad de supervivencia. Las bacterias no patogénicas se pueden modificar genéticamente para proporcionar propiedades probióticas. Las bacterias probióticas se pueden modificar genéticamente para potenciar o mejorar propiedades probióticas.
[0047] Tal como se usa en el presente documento, bacteria «mantenido de manera estable» o "estable" se utiliza para hacer referencia a una célula huésped bacteriana, que lleva material genético no nativo, por ejemplo, un gen PAL, que se incorpora en el genoma huésped o se reproduce sobre un plásmido de autorreplicación extracromosómico, de tal modo que el material genético no nativo se retiene, se expresa y/o se propaga. La bacteria estable es capaz de sobrevivir y/o crecer in vitro, por ejemplo, en medio y/o in vivo, por ejemplo, en los intestinos. Por ejemplo, la bacteria estable puede ser una bacteria manipulada genéticamente, que comprende un gen PAL, donde el plásmido o el cromosoma, que lleva el gen PAL se mantiene estable en la célula huésped, de tal modo que PAL puede expresarse en la célula huésped, y la célula huésped es capaz de sobrevivir y/o crecer in vitro y/o in vivo. En algunas realizaciones, el número de copias afecta a la estabilidad de expresión de material genético no nativo, por ejemplo, un gen PAL o un gen PAH. En algunas realizaciones, el número de copias afecta al nivel de expresión de material genético no nativo, por ejemplo, un gen PAL o un gen PAH.
[0048] Tal como se usa en el presente documento, los términos «modular» y «tratar» y similares se refieren a una mejora de una enfermedad, un trastorno y/o una afección o al menos de un síntoma distinguible del mismo. En otra realización, «modular» y «tratar» se refieren a una mejora de al menos un parámetro físico medible, pero no necesariamente distinguible por el paciente. En otra realización, «modular» y «tratar» se refieren a la inhibición de la progresión de una enfermedad, un trastorno y/o una afección, ya sea físicamente (por ejemplo, estabilización de un síntoma discernible), fisiológicamente (por ejemplo, estabilización de un parámetro físico) o ambos. En otra realización, «modular» y «tratar» se refieren a la ralentización de la progresión o la reversión de la progresión de una enfermedad, un trastorno y/o una afección. Como se utiliza en el presente documento, «prevenir» y similares hacen referencia a la demora de la aparición o la reducción del riesgo de adquirir un síntoma asociado con tal enfermedad, trastorno y/o síntoma.
[0049] Aquellos, que necesitan tratamiento, pueden incluir individuos, que ya tienen una enfermedad médica particular, así como aquellos, que están en riesgo de tener, o quienes pueden adquirir la enfermedad finalmente. La necesidad de tratamiento se evalúa, por ejemplo, mediante la presencia de uno o más factores de riesgo asociados con el desarrollo de una enfermedad, la presencia o la progresión de una enfermedad o la receptividad probable de tratamiento de un sujeto, que tiene la enfermedad. Principalmente hiperfenilalaninemia, por ejemplo, PKU se causa por mutaciones genéticas congénitas, de las cuales no existen curas conocidas. Hiperfenilalaninemia, también, puede ser secundaria en otras condiciones, por ejemplo, enfermedades de hígado. Tratar hiperfenilalaninemia puede abarcar reducir o eliminar el exceso de fenilalanina y/o síntomas asociados y no necesariamente abarcar la eliminación de la enfermedad subyacente.
[0050] Tal como se utiliza en el presente documento una «composición farmacéutica» hace referencia a una preparación de bacterias manipuladas genéticamente de la invención con otros componentes, tales como un portador y/o un excipiente fisiológicamente adecuado.
[0051] Las frases "portador fisiológicamente aceptable" y "portador farmacéuticamente aceptable", que se pueden utilizar indistintamente para hacer referencia a un portador o un diluyente, que no causa irritación significativa a un organismo y que no deroga la actividad biológica y las propiedades del compuesto bacteriano administrado. Un adyuvante se incluye en estas frases.
[0052] El término "excipiente" se refiere a una sustancia inerte añadida a una composición farmacéutica para facilitar aun más la administración de un ingrediente activo. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, bicarbonato de calcio, fosfato de calcio, varios azucares y tipos de almidón, derivados de celulosa, gelatina, aceites vegetales, polietilenglicoles y tensioactivos, que incluyen, por ejemplo, polisorbato.
[0053] Los términos "dosis terapéuticamente eficaz" y "cantidad terapéuticamente eficaz" se utilizan para hacer referencia a una cantidad de un compuesto que da como resultado la prevención, la demora de aparición de síntomas o la mejora de síntomas de una afección, por ejemplo, hiperfenilalaninemia. Una cantidad terapéuticamente eficaz, por ejemplo, puede ser suficiente para tratar, prevenir, reducir la severidad, la demora de la aparición y/o la reducción del riesgo de aparición de uno o más síntomas de una enfermedad o una afección asociados con el exceso de niveles de fenilalanina. Una cantidad terapéuticamente eficaz, así como también, una frecuencia terapéuticamente eficaz de administración se puede determinar utilizando los procedimientos conocidos en la técnica y descritos a continuación.
[0054] Tal como se utiliza en el presente documento, el término "polipéptido" incluye "polipéptido", así como también, "polipéptidos" y se refiere a una molécula compuesta de monómeros de aminoácido unidos de manera lineal por enlaces amida (es decir, enlaces de péptido). El término «polipéptido» se refiere a cualquier cadena o cadenas de dos o más aminoácidos y no se refiere a una longitud específica del producto. Por lo tanto, «péptidos», «dipéptidos», «tripéptidos», «oligopéptidos», «proteína», «cadena de aminoácido» o cualquier otro término utilizado para hacer referencia a una cadena o cadenas de dos o más aminoácidos se incluyen en la definición de «polipéptido» y se puede utilizar el término «polipéptido» en vez de o indistintamente con cualquier otro término. El término «dipéptido» se refiere a un péptido de dos aminoácidos unidos. El término «tripéptido» se refiere a un péptido de tres aminoácidos unidos. El término «polipéptido» pretende hacer referencia a los productos de modificaciones postexpresión del polipéptido, que incluyen, pero no se limitan a, glicosilación, acetilación, fosforilación, amidación, derivatización, cribado proteolítico o modificación mediante aminoácidos de origen no natural. Un polipéptido se puede derivar de una fuente biológica natural o producir utilizando tecnología recombinante. El polipéptido se puede producir utilizando las bacterias manipuladas genéticamente de la actual invención. El polipéptido puede tener un tamaño de aproximadamente 3 o más, 5 o más, 10 o más, 20 o más, 25 o más, 50 o más, 75 o más, 100 o más, 200 o más, 500 o más, 1000 o más, o 2000 o más aminoácidos. Los polipéptidos pueden tener una estructura tridimensional definida, aunque no necesariamente tienen tal estructura. Se hace referencia a los polipéptidos con una estructura tridimensional definida como plegados, y se refiere a los polipéptidos, que no poseen una estructura tridimensional definida, pero, más bien, pueden adoptar un gran número de conformaciones diferentes, como no plegados. El término «péptido» o «polipéptido» puede hacer referencia a una secuencia de aminoácido, que corresponde a una proteína o una porción de una proteína o puede hacer referencia a una secuencia de aminoácido, que corresponde con una secuencia de no proteína, por ejemplo, una secuencia seleccionada de una secuencia de péptido reguladora, secuencia de péptido líder, secuencia de péptido señal, secuencia de péptido de enlace y otras secuencia de péptido.
[0055] Un polipéptido "aislado" o un fragmento, variante o derivado del mismo se refiere a un polipéptido, que no está en su ambiente natural. No se requiere ningún nivel particular de purificación. Los polipéptidos y las proteínas producidas de manera recombinante expresados en células huésped, que incluyen, pero no se limitan a, células bacterianas o de mamífero, se consideran aislados con fines de la invención, ya que son polipéptidos nativos o recombinantes, que se han separado, fraccionado o purificado parcialmente o sustancialmente utilizando cualquier técnica adecuada. Los péptidos, los polipéptidos o las proteínas recombinantes se refieren a péptidos, polipéptidos o proteínas producidas utilizando las técnicas de ADN recombinante, es decir, producidos a partir de células, microbianas o de mamíferos, transformadas mediante una construcción de expresión de ADN recombinante exógeno, que codifica el polipéptido. Las proteínas o los polipéptidos expresados en la mayoría de cultivos bacterianos serán típicamente libres de glicano. Los fragmentos, los derivados, los análogos o las variantes de los polipéptidos anteriores y cualquier combinación de los mismos, también, se incluyen como polipéptidos. Los términos «fragmento», «variante», «derivado» y «análogo» incluyen polipéptidos, que tienen una secuencia de aminoácidos suficientemente similar a la secuencia de aminoácidos del péptido original, e incluyen cualquier polipéptido, que retiene al menos una o más propiedades del polipéptido original correspondiente. Los fragmentos de polipéptidos descritos en el presente documento incluyen fragmentos proteolíticos, así como también, fragmentos de deleción. Los fragmentos incluyen también anticuerpo específico o fragmentos bioactivos o fragmentos activos inmunológicamente derivados de cualquier polipéptido descrito en el presente documento. Las variantes pueden ser de origen natural o de origen no natural. Las variantes de origen no natural se pueden producir utilizando los procedimientos de mutagénesis conocidos en la técnica. Las variantes de polipéptidos pueden comprender sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácido conservativas o no conservativas.
[0056] Los polipéptidos incluyen, también, proteínas de fusión. Como se usa en el presente documento, el término «variante» incluye una proteína de fusión, que comprende una secuencia del péptido original o suficientemente similar al péptido original. Como se usa en el presente documento, el término «proteína de fusión» hace referencia a una proteína quimérica, que comprende secuencias de aminoácidos de dos o más proteínas. Típicamente, las proteínas de fusión son el resultado de técnicas de recombinación in vitro bien conocidas. Las proteínas de fusión pueden tener una función estructural similar (pero no necesariamente en la misma medida) y/o función regulatoria similar (pero no necesariamente en la misma medida), y/o función bioquímica similar (pero no necesariamente en la misma medida), y/o función inmunológica (pero no necesariamente en la misma medida) como las proteínas originales individuales, que son los componentes de las proteínas de fusión. Los «derivados» incluyen, pero no se limitan a, péptidos, que contienen uno o más derivados de aminoácido de origen natural de los veinte aminoácidos estándares. La «similitud» entre dos péptidos se determina mediante la comparación de secuencia de aminoácidos de un péptido con la secuencia de un segundo péptido. Un aminoácido de un péptido es similar al aminoácido correspondiente de un segundo péptido, si es una sustitución de aminoácido idéntica o conservativa. Las sustituciones conservativas incluyen aquellas descritas en Dayhoff, M. O., edición, The Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C. (1978), y en Argos, EMBO J. 8 (1989), 779-785. Por ejemplo, los aminoácidos, que pertenecen a uno de los siguientes grupos, representan cambios o sustituciones conservativos: -Ala, Pro, Gly, Gln, Asn, Ser, Thr; -Cys, Ser, Tyr, Thr; -Val, Ile, Leu, Met, Ala, Phe; -Lys, Arg, His; -Phe, Tyr, Trp, His; and -Asp, Glu.
[0057] Tal como se usa en el presente documento, el término «suficientemente similar» se refiere a una secuencia de aminoácidos, que contiene un número suficiente o mínimo de residuos de aminoácidos idénticos o equivalentes relativos a una segunda secuencia de aminoácidos, de tal modo que la primera y la segunda secuencia de aminoácidos tienen un dominio estructural común y/o actividad funcional común. Por ejemplo, las secuencias de aminoácidos, que comprenden un dominio estructural común, que es de al menos aproximadamente 45%, de al menos aproximadamente 50%, de al menos aproximadamente 55%, de al menos aproximadamente 60%, de al menos aproximadamente 65%, de al menos aproximadamente 70%, de al menos aproximadamente 75%, de al menos aproximadamente 80%, de al menos aproximadamente 85%, de al menos aproximadamente 90%, de al menos aproximadamente 91%, de al menos aproximadamente 92%, de al menos aproximadamente 93%, de al menos aproximadamente 94%, de al menos aproximadamente 95%, de al menos aproximadamente 96%, de al menos aproximadamente 97%, de al menos aproximadamente 98%, de al menos aproximadamente 99% o de al menos aproximadamente 100% idéntica como se define en el presente documento como suficientemente similar. Preferiblemente, las variantes serán suficientemente similares a la secuencia de aminoácidos de los péptidos descritos en el presente documento. Tales variantes retienen generalmente la actividad funcional de los péptidos descritos en el presente documento. Las variantes incluyen péptidos, que se difieren en secuencia de aminoácidos del péptido nativo y de peso, respectivamente, vía deleción(es), adición(es) y/o sustitución(es) de uno o más aminoácidos. Estas pueden ser variantes de origen natural, así como, también, variantes manipuladas artificialmente.
[0058] Tal como se usa en el presente documento, el término "enlazador", "péptido de enlace" o "enlaces de péptido" o "enlazador" se refiere a secuencias de aminoácidos sintéticas o no naturales o de origen no natural, que conectan o enlazan dos secuencias de polipéptidos, por ejemplo, que enlazan dos dominios de polipéptidos. Como se usa en el presente documento, el término «sintético» se refiere a secuencias de aminoácidos, que son de origen no natural. Los enlazadores de ejemplo se describen en el presente documento. Los enlazadores de ejemplo adicionales se proporcionan en US 20140079701.
[0059] Tal como se usa en el presente documento, el término «secuencia de codones optimizados» se refiere a una secuencia, que se modificó a partir de una secuencia codificadora existente o manipulada, por ejemplo, para mejorar la traducción en una célula o un organismo huésped de expresión de una molécula de ARN de transcripción, transcrita a partir de la secuencia codificadora, o para mejorar la transcripción de una secuencia codificadora. La optimización de codones incluye, pero no se limita a, procesos, que incluyen la selección de codones para la secuencia codificadora para adaptar la preferencia de codones del organismo huésped de expresión.
[0060] Muchos organismos muestran una inclinación o una preferencia para el uso de codones particulares a codificar para inserción de un aminoácido particular en una cadena de polipéptido creciente. La preferencia de codones o la inclinación de codones, las diferencias en el uso de codones entre organismos, se permite utilizando la degeneración del código genético, y está bien documentada entre muchos organismos. A menudo la inclinación de codones tiene relación con la eficiencia de traducción de ARN mensajero (ARNm), que a su vez, se cree depender de, interalia, las propiedades de los codones, que se traducen y la disponibilidad de moléculas de ARN de transferencia particular (ARNt). La predominancia de ARNs seleccionados en una célula es, generalmente, un reflejo de los codones utilizados con la mayor frecuencia en el síntesis de péptidos. Por consiguiente, los genes se pueden personalizar para la expresión génica óptima en un organismo dado basándose en optimización de codones.
[0061] Tal como se usa en el presente documento, los términos «sistema de secreción» o «proteína de secreción» se refieren a un mecanismo de secreción nativo o no nativo capaz de secretar o exportar la(s) proteína(s) de interés o proteína(s) terapéutica(s) del microbiano, por ejemplo, citoplasma bacteriano. El sistema de secreción puede comprender una única proteína o puede comprender dos o más proteínas reunidas en un complejo, por ejemplo, HlyBD. Los ejemplos no limitativos de sistemas de secreción para las bacterias gram negativas incluyen sistemas de secreción flagelar de tipo III, tipo I (por ejemplo, sistema de secreción de hemolisina), tipo II, tipo IV, tipo V, tipo VI y tipo VII, bombas de eflujo multifármaco, diferentes sistemas de secreción de membrana única. Los ejemplos no limitativos de sistemas de secreción para bacterias gram positivas incluyen sistemas de secreción Sec y TAT. En algunas realizaciones, las proteínas de interés incluyen una «etiqueta de secreción» o de ARN o de origen peptídico para dirigir la(s) proteína(s) de interés o proteína(s) terapéutica(s) para sistemas de secreción específicos. En algunas realizaciones, el sistema de secreción es capaz de eliminar esta etiqueta antes del cribado de la(s) proteína(s) de interés a partir de las bacterias manipuladas. Por ejemplo, en la secreción mediada por autosecreción de Tipo V la etiqueta de secreción de péptido N-terminal se elimina tras la translocación del péptido «pasajero» del citoplasma en el compartimento periplásmico mediante el sistema Sec nativo. Además, cuando el autosecretor se transloca sobre la membrana exterior, se puede eliminar la etiqueta de secreción C-terminal utilizando un cribado autocatalítico o catalizado por proteasa, por ejemplo, OmpT, liberando de este modo la(s) proteína(s) de interés en el ambiente extracelular.]]
[0062] Tal como se usa en el presente documento, el término "transportador" pretende hacer referencia a un mecanismo, por ejemplo, proteína o proteínas, para importar una molécula, por ejemplo, aminoácido, toxina, metabolito, sustrato, etc. en el microorganismo del ambiente extracelular.
[0063] Los artículos "uno" y "una", como se utilizan en el presente documento, deberían entenderse como «al menos uno», al menos que se indica claramente lo contrario.
[0064] La frase "y/o", cuando se utiliza entre elementos en una lista, pretende significar o (1) que solamente un único elemento mencionado está presente o (2) que más de un elemento de la lista está presente. Por ejemplo, "A, B, y/o C» indica que la selección puede ser solamente A; solamente B; solamente C; A y B; A y C; B y C; o A, B y C. La frase «y/o» se puede utilizar indistintamente con «al menos uno de» o «uno o más de» los elementos en una lista.
Bacterias
[0065] Las bacterias manipuladas genéticamente de la invención son capaces de reducir el exceso de fenilalanina. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente son bacterias no patogénicas. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente son bacterias comensales. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente son bacterias probióticas. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente son bacterias patogénicas naturales, que se modifican o mutan para reducir o eliminar patogenicidad. En algunas realizaciones, las bacterias no patogénicas son bacterias Gram negativas. En algunas realizaciones, las bacterias no patogénicas son bacterias Gram positivas. Las bacterias de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, Bacillus, Bacteroides, Bifidobacterium, Brevibacteria, Clostridium, Enterococcus, Escherichia coli, 35 Lactobacillus, Lactococcus, Saccharomyces y Staphylococcus, por ejemplo, Bacillus coagulans, Bacillus subtilis, Bacteroides fragilis, Bacteroides subtilis, Bacteroides thetaiotaomicron, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium longum, Clostridium butyricum, Enterococcus faecium, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus casei, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus, Lactococcus lactis y Saccharomyces boulardii. En determinadas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente se seleccionan del grupo, que consiste en Bacteroides fragilis, Bacteroides thetaiotaomicron, Bacteroides subtilis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium lactis, Clostridium butyricum, Escherichia coli Nissle, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus reuteri y Lactococcus lactis.
[0066] En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente son Escherichia coli de cepa Nissle 1917 (E. coli Nissle), una bacteria Gram negativa de la familiaEnterobacteriaceae, que ha evolucionado en uno de los probióticos mejor caracterizados (Ukena et al., 2007). La cepa se caracteriza por su completa inocuidad (Schultz, 2008) y tiene estatus GRAS (generalmente reconocido como seguro) (Reister et al., 2014, importancia añadida). La secuenciación genómica confirmó que E. coli Nissle carece de factores de virulencia prominente (por ejemplo, E. coli Gf-hemolisina, adhesinas P-fimbriales) (Schultz, 2008). Adicionalmente, se ha demostrado que E. coli Nissle no lleva los factores de adhesión patogénicos, no produce ninguna enterotoxina o citotoxina, no es invasiva y no es uropatógena (Sonnenborn et al., 2009). Desde que en 1917 E. coli Nissle se empaquetó en cápsulas medicinales, llamadas Mutaflor, para el uso terapéutico. Se acepta de manera común que la eficacia y la inocuidad terapéutica de E. coli Nissle se ha probado de forma convincente (Ukena et al., 2007).
[0067] Un experto en la técnica apreciaría que las modificaciones genéticas descritas en el presente documento se puedan adaptar a otras especies, cepas y subtipos de bacterias. Además, los genes de una o más especies diferentes se pueden introducir uno en el otro, por ejemplo, el gen PAL de Rhodosporidium toruloides puede expresarse en Escherichia coli (Sarkissian et al., 1999), y se conoce que las fenilalanina amonio liasas eucarióticas comparten secuencia homóloga (Xiang y Moore, 2005).
[0068] E. coli Nissle no modificado y las bacterias manipuladas genéticamente de la invención se pueden destruir, por ejemplo, utilizando factores de defensa en los intestinos o el suero sanguíneo (Sonnenborn et al., 2009) o mediante activación de un interruptor de la matanza, varias horas o días después de la administración. Por lo tanto, las bacterias manipuladas genéticamente pueden requerir administración continua. En algunas realizaciones, el tiempo de residencia se calcula para un sujeto humano. El tiempo de residencia in vivo se puede calcular para las bacterias manipuladas genéticamente de la invención (véanse, por ejemplo, Figura 38).
[0069] Las bacterias manipuladas genéticamente de la invención comprenden un gen, que codifica PAL, donde el gen PAL se une de manera operativa con un promotor inducible directamente o indirectamente. En algunas realizaciones, las bacterias comprenden un gen PAL no nativo. En algunas realizaciones, las bacterias comprenden copias adicionales de un gen PAL nativo. En la presente invención, el promotor no se asocia con el gen PAL en la naturaleza. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente de la invención comprenden un gen, que codifica PAH, donde el gen PAH se une de manera operativa con un promotor inducible directamente o indirectamente. En algunas realizaciones, las bacterias comprenden un gen PAH no nativo. En algunas realizaciones, las bacterias comprenden copias adicionales de un gen PAH nativo. En algunas realizaciones, el promotor no se asocia con el gen PAH en la naturaleza.
[0070] Las bacterias manipuladas genéticamente comprenden, además, un gen, que codifica un transportador de fenilalanina (PheP). En algunas realizaciones, las bacterias comprenden copias adicionales de un gen nativo, que codifica un transportador de fenilalanina, donde gen de transportador de fenilalanina se une de manera operativa con un promotor inducible directamente o indirectamente. En algunas realizaciones, las bacterias comprenden un gen, que codifica un transportador de fenilalanina no nativo, donde el gen de transportador de fenilalanina se une de manera operativa con un promotor inducible directamente o indirectamente. Ambas realizaciones se abarcan por el término transportador de fenilalanina «no nativo». En la presente invención, el promotor no se asocia con el gen pheP en la naturaleza. En algunas realizaciones, el mismo promotor controla la expresión de PheP y PAL o PAH.
[0071] En algunas realizaciones, el promotor, que se une de manera operativa con PAL, PAH y/o pheP se induce directamente o indirectamente utilizando las condiciones ambientales exógenas. En algunas realizaciones, el promotor se induce directamente o indirectamente utilizando las condiciones ambientales exógenas específicas para los intestinos de un mamífero. En algunas realizaciones, el promotor se induce directamente o indirectamente utilizando las condiciones ambientales exógenas para el intestino delgado de un mamífero. En algunas realizaciones, el promotor se induce directamente o indirectamente mediante las condiciones de oxígeno bajo o anaeróbicas, tales como el ambiente de los intestinos de mamífero. En algunas realizaciones, el promotor se induce directamente o indirectamente mediante la presencia de moléculas o metabolitos, que son específicos para los intestinos de un mamífero, por ejemplo, propionato. En algunas realizaciones, el promotor se induce directamente o indirectamente debido a la exposición a tetraciclina. En algunas realizaciones, el promotor se induce directamente o indirectamente utilizando una molécula, que se administra conjuntamente con las bacterias manipuladas genéticamente de la invención.
Reducción de hiperfenilalaninemia
[0072] Las bacterias manipuladas genéticamente descritas en el presente documento comprenden un gen, que codifica una enzima, que metaboliza fenilalanina (PME), y es capaz de reducir hiperfenilalaninemia.
[0073] Los ejemplos de enzimas, que metabolizan fenilalanina, incluyen, pero no se limitan a, fenilalanina hidroxilasa (PAH), fenilalanina amonio liasa (PAL), aminotransferasas, L-aminoácido desaminasa (L-AAD) y fenilalanina deshidrogenasas. Las reacciones con fenilalanina hidroxilasas, fenilalanina deshidrogenasas o aminotransferasas requieren cofactores, mientras que L-AAD y PAL no requieren ningún cofactor adicional. Aunque no se desea ceñirse a la teoría, la falta de necesidad de un cofactor significa que la degradación de fenilalanina utilizando la enzima codificada por las bacterias manipuladas genéticamente, depende de la disponibilidad del sustrato y no se limita por la disponibilidad del cofactor.
[0074] Fenilalanina amonio liasa (PAL; EC 4.3.1.24) es una enzima, que cataliza una reacción, que convierte L-fenilalanina en amonio y ácido transcinámico. La fenilalanina amonio liasa es específica para L-Phe y en grado menor, para L-Tirosina. La reacción catalizada por PAL es la desaminación espontanea no oxidativa de L-fenilalanina para producir ácido transcinámico y amonio. A diferencia de la enzima de mamíferos (PAH), PAL es un monómero y no requiere ningún cofactor (MacDonald et al., Biochem Cell Biol 2007;85:273-82. A modern view of phenylalanine ammonia lyase). En los microorganismos, tiene un papel catabólico, permitiendo utilizar L-fenilalanina (L-Phe) como una única fuente de carbono y nitrógeno. Las bacterias manipuladas genéticamente de la invención comprenden un gen PAL. PAL es capaz de modificar fenilalanina a niveles no tóxicos de ácido transcinámico y amonio. El ácido transcinámico (TCA) se puede modificar más a ácidos benzoicos e hipúricos de metabolitos TCA (Sarkissian et al., J Mass Spectrom. Junio de 2007;42(6):811-7; Quantitation of phenylalanine and its trans-cinnamic, benzoic and hippuric acid metabolites in biological fluids in a single GC-MS analysis). La actividad de enzima PAL no necesita la activad de cofactor THB.
[0075] En algunas realizaciones, PAL se codifica por un gen PAL derivado de una especie bacteriana, que incluye, pero no se limita a, Achromobacter xylosoxidans, Pseudomonas aeruginosa, Photorhabdus luminescens, Anabaena variabilis y Agrobacterium tumefaciens. En algunas realizaciones, la especie bacteriana es Photorhabdus luminescens. En algunas realizaciones, la especie bacteriana es Anabaena variabilis. En algunas realizaciones, PAL se codifica por un gen PAL derivado de una especie eucariota, por ejemplo, una especie de levadura, una especie de planta. Las proteínas PAL distintas múltiples se conocen en la técnica. Las bacterias manipuladas genéticamente modifican más fenilalanina, cuando se expresa el gen PAL que las bacterias no manipuladas del mismo subtipo bacteriano bajo las mismas condiciones. Por consiguiente, las bacterias manipuladas genéticamente, que comprenden PAL se pueden utilizar para metabolizar fenilalanina en el cuerpo en moléculas no tóxicas para tratar afecciones asociadas a hiperfenilalaninemia, incluyendo PKU. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente expresan Anabaena variabilis PAL ("PALI"). En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente expresan Photorhabdus luminescens PAL ("PAL3"). Los ejemplos no limitativos de secuencias PAL de interés se muestran en la Tabla 2.
[0076] LAAD cataliza el oxidante estereoespecífico, es decir, que consume oxígeno, desaminación de L-aminoácidos a a-cetoácidos junto con la producción de amonio y peróxido de hidrógeno vía un intermediario de iminoácido. L-AAD se encuentran en venenos de serpiente y en muchas bacterias (Bifulco et al. 2013), especialmente en las citomembranas de las bacterias Proteus, Providencia y Morganella. L-AAD (EC 1.4.3.2) son flavoenzimas con una estructura dimérica. Cada subunidad contiene un flavín adenín dinucleótido unido de manera no covalente ((FAD) cofactor) y no requiere ningún cofactor externo. Proteus mirabilis contiene dos tipos de L-AAD (Duerre y Chakrabarty 1975). Uno tiene amplia especificidad de sustrato y cataliza la oxidación de L-aminoácidos alifáticos y aromáticos a cetoácidos, típicamente L-fenilalanina (GenBank: U35383.1) (Baek et al., Journal of Basic Microbiology 2011, 51, 129­ 135; "Expression and characterization of a second L-amino acid deaminase isolated from Proteus mirabilis in Escherichia coli"). El otro tipo funciona principalmente con L-aminoácidos básicos (GenBank: EU669819.1). LAAD de fuentes bacterianas, fúngicas y de plantas parecen estar implicadas en la utilización de L-aminoácidos (es decir, amonio producido mediante la actividad enzimática) como una fuente de nitrógeno. La mayoría de L-aminoácidos desaminasas eucariotas y procariotas se secretan de manera extracelular, con la excepción de LAAD de especie Proteus, que están unidos con membrana. En Proteus mirabilis, se ha informado que L-AAD se localizan en la membrana plasmática, en dirección del espacio periplasmático, donde reside la actividad enzimática (Pelmont J et al., (1972) "L-amino acid oxidases of Proteus mirabilis: general properties" Biochimie 54: 1359-1374).
[0077] En una realización, las bacterias manipuladas genéticamente de la invención comprenden un gen LAAD. LAAD es capaz de modificar fenilalanina a niveles no tóxicas de fenilpiruvato, que, también, se puede degradar más, por ejemplo, utilizando enzimas de hígado, a fenil-lactato. Fenilpiruvato no puede atravesar la barrera hematoencefálica, que permite LAAD reducir los niveles de fenilalanina en el cerebro sin acumulación de otro metabolito potencialmente tóxico. En algunas realizaciones, LAAD se codifica por un gen LAAD derivado de una especie bacteriana, que incluye, pero no se limita a, bacterias Proteus, Providencia y Morganella. En algunas realizaciones, la especie bacteriana es Proteus mirabilis. En algunas realizaciones, la especie bacteriana es Proteus vulgaris. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente expresan enzima LAAD de Proteus mirabilis GenBank: U35383.1. Los ejemplos no limitativos de secuencias LAAD de interés se muestran en la Tabla 2. En algunas realizaciones, la enzima LAAD se deriva de veneno de serpiente. Las bacterias manipuladas genéticamente modifican más fenilalanina, cuando se expresa el gen LAAD que las bacterias no manipuladas del mismo subtipo bacteriano bajo las mismas condiciones. Por consiguiente, las bacterias manipuladas genéticamente, que comprenden LAAD, se pueden utilizar para metabolizar fenilalanina en el cuerpo en moléculas no tóxicas para tratar afecciones asociadas a hiperfenilalaninemia, incluyendo PKU.
[0078] En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente codifican una enzima de tipo salvaje, como ocurre en la naturaleza. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente codifican una enzima, que comprende mutaciones relativas a la secuencia de tipo salvaje. En algunas realizaciones, las mutaciones aumentan estabilidad de la enzima. En algunas realizaciones, las mutaciones aumentan la actividad catalítica de la enzima. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden un gen, que codifica una o más proteínas mencionadas en la Tabla 2. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden secuencia(s) genética(s), que codifican uno o más polipéptidos, que comprenden secuencia de cualquiera de SEQ ID Números: 1-8. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden secuencia(s) genética(s), que codifican un polipéptido, que tiene al menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%,96%, 97%, 98% o 99% de identidad con cualquiera de las secuencias de SEQ ID Números: 1-8. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente codifican una o más enzimas de la Tabla 2, que comprende una mutación. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden un gen, que codifica PAH de tipo salvaje. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente codifican un PAH mutado con estabilidad y/o actividad aumentada. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden un gen, que codifica PAL de tipo salvaje. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente codifican un PAL mutado con estabilidad y/o actividad aumentada. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden un gen, que codifica LAAD de tipo salvaje. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente codifican un LAAD mutado con estabilidad y/o actividad aumentada. Los procedimientos de cribado de enzimas con propiedades deseadas se conocen en la técnica y se describen en el presente documento.
Tabla 2. Secuencias de enzimas metabolizadoras de fenilalanina
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[0079] El gen de PME, por ejemplo, PAL, LAAD o PAH, puede estar presente sobre un plásmido o una cromosoma en las bacterias manipuladas genéticamente. En algunas realizaciones, un gen de PME se expresa bajo el control de un promotor constitutivo. En la presente invención, uno o más gen(es), que codifica(n) PAL se une de manera operativa a un promotor inducible, que no se asocia con el gen PAL en la naturaleza. En algunas realizaciones, el gen de PME se expresa bajo el control de un promotor, que se induce directamente o indirectamente bajo las condiciones ambientales exógenas, como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, el gen de PME se expresa bajo el control de un promotor, que se induce directamente o indirectamente bajo las condiciones ambientales exógenas, tales como, en presencia de moléculas o metabolitos específicos de los intestinos de un mamífero. En una realización, el gen de PME se expresa bajo el control de un promotor, que se expresa directamente o indirectamente en las condiciones de oxígeno bajo o anaeróbicas, donde la expresión del gen de PME, por ejemplo, el gen PAL, se activa en las condiciones de oxígeno bajo o anaeróbicas, tales como el ambiente de los intestinos de mamífero.
[0080] En una realización, las bacterias manipuladas genéticamente codifican un gen PAL, que se induce directamente o indirectamente en las condiciones de oxígeno bajo o anaeróbicas, tales como, los intestinos de mamífero. En una realización, las bacterias manipuladas genéticamente codifican un gen LAAD, que se induce directamente o indirectamente en condiciones de oxigenación, oxígeno bajo o microaeróbicas, tales como, las condiciones, que se encuentran en el intestino proximal, que incluyen, pero no se limitan a, el estómago, el duodeno y el íleon. En una realización, las bacterias manipuladas genéticamente codifican un gen de PME, que se induce directamente o indirectamente utilizando un factor ambiental, que está presente de manera natural en los intestinos de mamífero. En otras realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente codifican un gen de PME, que se induce directamente o indirectamente utilizando un factor ambiental, que no está presente de manera natural en los intestinos de mamífero, por ejemplo, arabinosa. En una realización, las bacterias manipuladas genéticamente codifican un gen de PME, que se induce directamente o indirectamente utilizando un factor ambiental, que está presente de manera natural en los intestinos de mamífero en afecciones inflamatorias.
[0081] Las bacterias han implicado factores de transcripción, que son capaces de sentir niveles de oxígeno. Se pueden desencadenar diferentes secuencias de señalización utilizando diferentes niveles de oxígeno y ocurrir con diferentes cinéticas. Un promotor dependiente de nivel de oxígeno es una secuencia de ácido nucleico con la que uno o más factores de transcripción sensibles a nivel de oxígeno es capaz de unirse, donde la unión y/o activación del factor correspondiente de transcripción activa la expresión génica en dirección 3'. En una realización, el gen de PME se expresa bajo el control de un promotor dependiente de nivel de oxígeno. En un aspecto más específico, el gen PAL está bajo el control de un promotor dependiente de nivel de oxígeno, que se activa en condiciones de oxígeno bajo o anaeróbicas, tales como, el ambiente de los intestinos de mamífero.
[0082] En determinadas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden una PME, por ejemplo, PAL, que se expresa bajo el control del promotor regulador de fumarato y nitrato reductasa (FNR). En E. coli, FNR es un activador mayor de transcripción, que controla el interruptor de metabolismo aeróbico a anaeróbico (Unden et al., 1997). En el estado anaeróbico, FNR se dimeriza en una proteína activa de unión con ADN, que activa cientos de genes responsables de adaptación al crecimiento anaeróbico. En el estado aeróbico, FNR evita la dimerización mediante oxígeno y es inactivo. En algunas realizaciones, las secuencias de ácido nucleico de FNR diferente múltiple se insertan en las bacterias manipuladas genéticamente. En realizaciones alternativas, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden una PME, por ejemplo, PAL, que se expresa bajo el control de un promotor alternativo dependiente de nivel de oxígeno, por ejemplo, un promotor ANR (Ray et al., 1997), un promotor DNR (Trunk et al., 2010). En algunas realizaciones, el metabolismo de fenilalanina se activa particularmente en un ambiente de oxígeno bajo o anaeróbico, tal como, en los intestinos.
[0083] En P. aeruginosa, se «necesita» la regulación anaeróbica de del regulador transcripcional de reducción de arginina deiminasa y nitrato (ANR) «para la expresión de funciones fisiológicas, que son inducibles bajo las condiciones de limitación de oxígeno o anaeróbicas» (Winteler et al., 1996; Sawers 1991). ANR de P. aeruginosa es homólogo con FNR de E. coli, y "el sitio de FNR de consenso (TTGAT ATCAA) se reconoció de manera eficiente por ANR y FNR" (Winteler et al., 1996). Como FNR en el estado anaeróbico, ANR activa numerosos genes responsables de la adaptación al crecimiento anaeróbico. En el estado aeróbico, ANR es inactivo. Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Pseudomonas syringae y Pseudomonas mendocina todos tienen análogos funcionales de ANR (Zimmermann et al., 1991). Los promotores, que se regulan por ANR, se conocen en la técnica, por ejemplo, el promotor del operón arcDABC (ver, por ejemplo, Hasegawa et al., 1998).
[0084] La familia FNR incluye, también, el regulador de respiración de nitrato disimulado (DNR) (Arai et al., 1995), un regulador transcripcional, que se necesita conjuntamente con ANR para "respiración de nitrato anaeróbica de Pseudomonas aeruginosa" (Hasegawa et al., 1998). Para determinados genes, los motivos de unión de FNR «se reconocen probablemente solamente por DNR» (Hasegawa et al., 1998). Se puede utilizar cualquier regulador transcripcional adecuado, que se controla mediante las condiciones ambientales exógenas y corresponde a la región reguladora. Los ejemplos no limitativos incluyen ArcA/B, ResD/E, NreA/B/C y AirSR y se conocen otros en la técnica.
[0085] Se conocen las secuencias de promotor FNR en la técnica y se puede utilizar cualquier secuencia de promotor FNR adecuado en las bacterias manipuladas genéticamente de la invención. Se puede combinar cualquier promotor FNR adecuado con cualquier PAL adecuado. Las secuencias de promotores FNR no limitativas se proporcionan en la Tabla 3 y las secuencias PAL no limitativas, también, se proporcionan en el presente documento. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente de la invención comprenden uno o más de: SEC ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, promotor nirB1 (SEQ ID NO: 11), promotor nirB2 (SEQ ID NO: 12), promotor nirB3 (SEQ ID NO: 13), promotor ydfZ (SEQ ID NO: 14), promotor nirB fusionado con un sitio de unión a ribosoma fuerte (SEQ ID NO: 15), promotor ydfZ fusionado con un sitio de unión a ribosoma fuerte (SEQ ID NO: 16), fnrS, un gen ARN pequeño inducido anaeróbicamente (promotor fnrS1 SEQ ID NO: 9 o promotor fnrS2 SEQ ID NO: 17), promotor nirB fusionado con un sitio de unión crp (SEQ ID NO: 18) y promotor fnrS fusionado con un sitio de unión crp (SEQ ID NO: 19).
[0086] En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden una secuencia de ácido nucleico, que es al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente95% o al menos aproximadamente 99% homóloga a la secuencia de ADN de SEQ ID NO: 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 o un fragmento funcional de la misma.
Tabla 3. Secuencias de FNR
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[0087] En otras realizaciones, una PME, por ejemplo, PAL, se expresa bajo el control de un promotor dependiente de nivel de oxígeno fusionado con un sitio de unión para un activador transcripcional, por ejemplo, CRP. c Rp (activador de proteína o catabolito de receptor AMP cíclico de proteína o CAP) juega un papel regulador mayor en bacterias utilizando represión de genes responsables de la absorción, el metabolismo y la asimilación de fuentes de carbono menos favorables, cuando están presentes los carbohidratos metabolizables rápidamente (Wu et al., 2015). Esta preferencia para glucosa se ha denominado represión de glucosa, así como también, represión de catabolito de carbono (Deutscher, 2008; Gorke and Stülke, 2008). En algunas realizaciones, PME, por ejemplo, expresión PAL se controla mediante un promotor dependiente de nivel de oxígeno fusionado con un sitio de unión CRP. En algunas realizaciones, la expresión PAL se controla mediante un promotor FNR fusionado con un sitio de unión CRP. En estas realizaciones, AMP cíclico se une con CRP, cuando no hay glucosa en el ambiente. Esta unión causa un cambio conformacional en CRP y permite a CRP unirse fuertemente con su sitio de unión. A continuación, la unión CRP activa la transcripción del gen de PME, por ejemplo, gen PAL, empleando polimerasa de ARN para el promotor FNR mediante interacciones directas de proteína-proteína. Con presencia de glucosa, AMP cíclico no se une con CRP y una PME, por ejemplo, PAL, reprime la transcripción génica. En algunas realizaciones, un promotor dependiente de nivel de oxígeno (por ejemplo, un promotor f Nr ) se fusiona con un sitio de unión, donde se usa un activador transcripcional para asegurar, que una p Me , por ejemplo, PAL, no se expresa bajo las condiciones anaeróbicas, cuando hay cantidad suficiente de glucosa, por ejemplo, añadiendo glucosa al medio de crecimiento in vitro.
[0088] En otra realización, una PME, por ejemplo, LAAD, se expresa bajo el control de un promotor inducible fusionado con un sitio de unión para un activador transcripcional, por ejemplo, CRP, de tal modo, que se reprime la expresión en presencia de glucosa.
[0089] En algunas realizaciones, LAAD no está bajo el control de un promotor FNR. LAAD requiere oxígeno para catalizar la degradación de fenilalanina a fenilpiruvato. Por lo tanto, no sería deseable incluir la expresión LAAD bajo las condiciones estrictamente anaeróbicas, donde funcionaría mínimamente (Figura 25).
[0090] En algunas realizaciones, una PME, por ejemplo, PAL o LAAD, se expresa bajo el control de un promotor inducible, que es responsable de moléculas o metabolitos específicos en el ambiente, por ejemplo, los intestinos de mamífero. Por ejemplo, el propionato de ácidos grasos de cadena corta es un gran metabolito de fermentación microbiana ubicado en los intestinos (Hosseini et al., 2011). En una realización, la expresión de gen PAL está bajo el control de un promotor inducible por propionato. En una realización más específica, la expresión génica de PME está bajo el control de un promotor inducible por propionato, que se activa mediante la presencia de propionato en los intestinos de mamífero. Cualquier molécula o metabolito, que se encuentra en los intestinos de mamífero, en estado saludable y/o patológico, se puede utilizar para inducir la expresión génica de PME. Los ejemplos no limitativos incluyen propionato, bilirrubina, aspartato aminotransferasa, alanina aminotransferasa, factores de coagulación de sangre II, VII, IX y X, fosfatasa alcalina, gamma glutamil transferasa, antígenos y anticuerpos de hepatitis, alfa fetoproteína, antimitocondrial, musculo liso y anticuerpos antinucleares, hierro, transferrina, ferritina, cobre, ceruloplasmina, amonio y manganeso. En las realizaciones alternativas, la expresión génica de PME, por ejemplo, PAL y/o LAAD, está bajo el control de un promotor ParaBAD, que se activa en presencia de la arabinosa de azúcar. En una realización, la expresión de LAAD está bajo el control del promotor ParaBAD. En una realización, la expresión de LAAD se produce bajo las condiciones aeróbicas o microaeróbicas.
[0091] En algunas realizaciones, el gen PAL se expresa bajo el control de un promotor, que se induce mediante la exposición a tetraciclina. En algunas realizaciones, la expresión génica se optimiza más utilizando los procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, optimizando los sitios de unión con ribosoma, manipulando reguladores transcripcionales y/o aumentando estabilidad de ARNm.
[0092] En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden un plásmido o un cromosoma mantenido de manera estable, que lleva el gen PAL, de tal modo que PAL se puede expresar en la célula huésped, y la célula huésped es capaz de sobrevivir y/o crecer in vitro, por ejemplo, en un medio, y/o in vivo, por ejemplo, en los intestinos. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden dos o más genes PAL diferentes. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden múltiples copias del mismo gen PAL. En algunas realizaciones, el gen PAL está presente sobre un plásmido y se une de manera operativa con un promotor inducible directamente o indirectamente. En algunas realizaciones, el gen PAL está presente sobre un plásmido y se une de manera operativa con un promotor inducible en condiciones de oxígeno bajo o anaeróbicas. En algunas realizaciones, el gen PAL está presente sobre un cromosoma y se une de manera operativa con un promotor inducible directamente o indirectamente. En algunas realizaciones, el gen PAL está presente sobre el cromosoma y se une de manera operativa con un promotor, que se induce en condiciones de oxígeno bajo o anaeróbicas. En algunas realizaciones, el gen PAL está presente sobre un plásmido y se une de manera operativa con un promotor, que se induce mediante la exposición a tetraciclina.
[0093] En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden un plásmido o un cromosoma mantenido de manera estable, que lleva el gen LAAD, de tal modo que LAAD se puede expresar en la célula huésped, y la célula huésped es capaz de sobrevivir y/o crecer in vitro, por ejemplo, en un medio, y/o in vivo, por ejemplo, en los intestinos. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden dos o más genes LAAD diferentes. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden múltiples copias del mismo gen LAAD. En algunas realizaciones, el gen LAAD está presente sobre un plásmido y se une de manera operativa con un promotor inducible directamente o indirectamente. En algunas realizaciones, el gen LAAD está presente sobre un plásmido y se une de manera operativa con un promotor, que se induce, por ejemplo, utilizando arabinosa o tetraciclina. En algunas realizaciones, el gen LAAD está presente sobre un cromosoma y se une de manera operativa con un promotor inducible directamente o indirectamente. En algunas realizaciones, el gen LAAD está presente sobre el cromosoma y se une de manera operativa con un promotor, que se induce, por ejemplo, utilizando arabinosa. En algunas realizaciones, el gen LAAD está presente sobre un plásmido y se une de manera operativa con un promotor, que se induce mediante la exposición a tetraciclina.
[0094] En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden un regulador transcripcional dependiente de nivel de oxígeno, por ejemplo, FNR, ANR o DNR, y un promotor correspondiente de una especie bacteriana diferente. El regulador transcripcional dependiente de nivel de oxígeno no nativo y el promotor aumentan la transcripción de genes unidos de manera operativa con dicho promotor, por ejemplo, PAL, en un ambiente de oxígeno bajo o anaeróbico, en comparación con el regulador transcripcional nativo y promotor en las bacterias bajo las mismas condiciones. En determinadas realizaciones, el regulador transcripcional dependiente de nivel de oxígeno es una proteína FNR de N. gonorrhoeae (ver, por ejemplo, Isabella et al., 2011). En algunas realizaciones, el correspondiente regulador transcripcional de tipo salvaje se deja intacto y retiene la actividad de tipo salvaje. En realizaciones alternativas, el correspondiente regulador transcripcional de tipo salvaje se elimina o muta para reducir o eliminar la actividad de tipo salvaje.
[0095] En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden un regulador transcripcional dependiente de nivel de oxígeno de tipo salvaje, por ejemplo, FNR, ANR o DNR, y promotor correspondiente, que muta en comparación con el promotor de tipo salvaje de las bacterias del mismo subtipo. El promotor mutado mejora la unión con el regulador transcripcional de tipo salvaje y aumenta la transcripción de genes unidos de manera operativa con dicho promotor, por ejemplo, PAL, en un ambiente de oxígeno bajo o anaeróbico, en comparación con el promotor de tipo salvaje bajo las mismas condiciones. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden un promotor dependiente de nivel de oxígeno de tipo salvaje, por ejemplo, promotor FNR, ANR o DNR, y regulador transcripcional correspondiente, que muta en comparación con el regulador transcripcional de tipo salvaje de las bacterias del mismo subtipo. El regulador transcripcional mutado mejora la unión con el promotor de tipo salvaje y aumenta la transcripción de genes unidos de manera operativa con dicho promotor, por ejemplo, PAL, en un ambiente de oxígeno bajo o anaeróbico, en comparación con el regulador transcripcional de tipo salvaje bajo las mismas condiciones. En determinadas realizaciones, el regulador transcripcional dependiente de nivel de oxígeno mutado es una proteína FNR, que comprende sustituciones de aminoácido, que mejora la dimerización y la actividad FNR (ver, por ejemplo, Moore et al., 2006).
[0096] En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente de la invención comprenden múltiples copias del gen endógeno, que codifica el regulador transcripcional sensible a niveles de oxígeno, por ejemplo, el gen f Nr . En algunas realizaciones, el gen, que codifica el regulador transcripcional sensible a nivel de oxígeno está presente sobre un plásmido. En algunas realizaciones, el gen, que codifica el regulador transcripcional sensible a nivel de oxígeno, y el gen, que codifica PAL, están presentes sobre plásmidos diferentes. En algunas realizaciones, el gen, que codifica el regulador transcripcional sensible a nivel de oxígeno, y el gen, que codifica PAL, están presentes sobre el mismo plásmido. En algunas realizaciones, el gen, que codifica el regulador transcripcional sensible a nivel de oxígeno está presente sobre un cromosoma. En algunas realizaciones, el gen, que codifica el regulador transcripcional sensible a nivel de oxígeno, y el gen, que codifica PAL, están presentes sobre cromosomas diferentes. En algunas realizaciones, el gen, que codifica el regulador transcripcional sensible a nivel de oxígeno, y el gen, que codifica PAL, están presentes sobre el mismo cromosoma. En algunos ejemplos, puede ser ventajoso expresar el regulador transcripcional sensible a nivel de oxígeno bajo el control de un promotor inducible para mejorar la estabilidad de expresión. En algunas realizaciones, la expresión del regulador transcripcional se controla utilizando un promotor diferente al promotor, que controla la expresión del gen, que codifica la enzima, que metaboliza fenilalanina. En algunas realizaciones, la expresión del regulador transcripcional se controla utilizando el mismo promotor, que controla la expresión de la enzima, que metaboliza fenilalanina. En algunas realizaciones, el regulador transcripcional y la enzima, que metaboliza fenilalanina, se transcriben de manera divergente a partir de una región promotora.
[0097] En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente de la invención producen PAL bajo las condiciones ambientales exógenas, tales como, el ambiente con oxígeno bajo de los intestinos de mamífero, para reducir fenilalanina en sangre por lo menos aproximadamente 1,5 veces, por lo menos aproximadamente 2 veces, por lo menos aproximadamente 3 veces, por lo menos aproximadamente 4 veces, por lo menos aproximadamente 5 veces, por lo menos aproximadamente 6 veces, por lo menos aproximadamente 7 veces, por lo menos aproximadamente 8 veces, por lo menos aproximadamente 9 veces, por lo menos aproximadamente 10 veces, por lo menos aproximadamente 15 veces, por lo menos aproximadamente 20 veces, por lo menos aproximadamente 30 veces, por lo menos aproximadamente 40 veces, por lo menos aproximadamente 50 veces en comparación con las bacterias no manipuladas del mismo subtipo bajo las mismas condiciones. Determinadas bacterias no manipuladas no tendrán niveles apreciables de procesamiento de fenilalanina. En las realizaciones, que utilizan formas manipuladas genéticamente de estas bacterias, el procesamiento mediado por PAL de fenilalanina se apreciará bajo las condiciones ambientales exógenas. Se puede medir fenilalanina utilizando los procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, muestra sanguínea y espectrometría de masas. Se puede medir cinamato utilizando los procedimientos conocidos en la técnica para evaluar la actividad PAL. La producción de cinamato tiene relación directa con degradación de fenilalanina, y en algunas realizaciones, aquel cinamato se puede utilizar como un biomarcador alternativo para actividad de cepa (Figura 16B). Se puede degradar cinamato más hasta ácido hipúrico utilizando enzimas de hígado; se puede medir ambos como se describe en los Ejemplos 24-26. Se puede medir la expresión PAL utilizando los procedimientos conocidos en la técnica para evaluar la actividad PAL.
[0098] En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente de la invención producen LAAD para reducir fenilalanina en sangre por lo menos aproximadamente 1,5 veces, por lo menos aproximadamente 2 veces, por lo menos aproximadamente 3 veces, por lo menos aproximadamente 4 veces, por lo menos aproximadamente 5 veces, por lo menos aproximadamente 6 veces, por lo menos aproximadamente 7 veces, por lo menos aproximadamente 8 veces, por lo menos aproximadamente 9 veces, por lo menos aproximadamente 10 veces, por lo menos aproximadamente 15 veces, por lo menos aproximadamente 20 veces, por lo menos aproximadamente 30 veces, por lo menos aproximadamente 40 veces, por lo menos aproximadamente 50 veces en comparación con las bacterias no manipuladas del mismo subtipo bajo las mismas condiciones. Determinadas bacterias no manipuladas no tendrán niveles apreciables de procesamiento de fenilalanina. En las realizaciones, que utilizan formas manipuladas genéticamente de estas bacterias, el procesamiento mediado por LAAD de fenilalanina se apreciará bajo las condiciones ambientales exógenas. Se puede medir fenilalanina utilizando los procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, muestra sanguínea y espectrometría de masas. Ácido pirúvico y fenilpiruvato, los productos de degradación generada por LAAD se pueden medir utilizando espectrometría de masas, como se describe en los Ejemplos 24-26, y se pueden utilizar como una lectura adicional de la actividad LAAD.
[0099] En algunas realizaciones, la PME, por ejemplo, PAL, LAAD, y/o PAH, se expresa sobre un plásmido de bajo número de copias. En algunas realizaciones, el plásmido de bajo número de copias puede ser útil para aumentar la estabilidad de expresión. En algunas realizaciones, el plásmido de bajo número de copias puede ser útil para disminuir la expresión permeable bajo las condiciones de no inducción. En algunas realizaciones, la PME, por ejemplo, PAL, LAAD, y/o pAh , se expresa sobre un plásmido de alto número de copias. En algunas realizaciones, el plásmido de alto número de copias puede ser útil para aumentar la expresión de PME, por ejemplo, PAL, LAAD y/o PAH, aumentando, de este modo, el metabolismo de fenilalanina y reduciendo hiperfenilalaninemia. En algunas realizaciones, una bacteria manipulada genéticamente comprende la PME, por ejemplo, PAL, LAAD y/o PAH, expresada sobre un plásmido de alto número de copias, no aumenta el metabolismo de fenilalanina o disminuye los niveles de fenilalanina en comparación con una bacteria manipulada genéticamente, que comprende el mismo PME, por ejemplo, PAL, LAAD y/o PAH, expresado sobre un plásmido de bajo número de copias en ausencia de pheP heterólogo y las copias adicionales de un pheP nativo. Se generaron las bacterias manipuladas genéticamente, que comprenden el mismo gen de PME, por ejemplo, gen PAL, LAAD y/o PAH, sobre plásmidos de alto y de bajo número de copias. Por ejemplo, se generaron o PAL1 o PAL3 sobre un plásmido de alto número de copias y un plásmido de bajo número de copias, y cada metabolizó y redujo fenilalanina a niveles similares (Figura 15). Por lo tanto, en algunas realizaciones, la etapa de limitación de velocidad de metabolismo de fenilalanina es la disponibilidad de fenilalanina (ver, por ejemplo, Figura 16). Puede ser ventajoso aumentar transporte de fenilalanina en la célula, mejorando, de este modo, el metabolismo de fenilalanina. Conjuntamente con pheP, incluso los plásmidos PAL de bajo número de copias son capaces de eliminar casi completamente Phe de una muestra de prueba (ver, por ejemplo, Figura 16A). Además, en algunas realizaciones, que incorporan pheP, pueden existir ventajas adicionales para utilizar un plásmido, que expresa PAL, de bajo número de copias en conjunto para mejorar la estabilidad de expresión PAL, mientras se mantiene el alto metabolismo de fenilalanina, y para reducir la presión de selección negativa sobre la bacteria transformada. En realizaciones alternativas, el transportador de fenilalanina se utiliza conjuntamente con el plásmido de alto número de copias.
[0100] La bacteria manipulada genéticamente de la invención comprende uno o más gen(es), que codifica(n) transportador de fenilalanina capaz de transportar fenilalanina en células bacterianas.
[0101] En algunas realizaciones, el gen de PME, por ejemplo, PAL, LAAD, y/o PAH, se expresa sobre un cromosoma. En algunas realizaciones, la expresión a partir del cromosoma puede ser útil para aumentar la estabilidad de expresión de la PME. En algunas realizaciones, el gen de PME, por ejemplo, PAL, LAAD, y/o PAH, se integra en el cromosoma bacteriano en uno o más sitios de integración en las bacterias manipuladas genéticamente. En algunas realizaciones, el gen(es) PME, por ejemplo, PAL, LAAD y/o PAH se inserta(n) en el genoma bacteriano en uno o más sitios de inserción siguientes en E. coli Nissle: malE/K, insB/I, araC/BAD, lacZ, agal/rsml, thyA y malP/T. Se puede utilizar cualquier sitio de inserción adecuado (véase, por ejemplo, Figura 36). El sitio de inserción puede estar en cualquier sitio en el genoma, por ejemplo, en un gen, que se necesita para la supervivencia y/o el crecimiento, tal como, thyA (para crear un auxótrofo); en una área activa del genoma, tal como, cerca del sitio de replicación genómica; y/o entre promotores divergentes para reducir el riesgo de transcripción no intencionada, tal como, entre AraB y AraC del operón de arabinosa. En algunas realizaciones, más de una copia, por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más copias del gen de PME, por ejemplo, PAL, PAH y/o LAAD, se integra en el cromosoma bacteriano en uno o más sitios de integración en las bacterias manipuladas genéticamente. Más de una copia de un gen de PME puede ser más de una copia del mismo gen de PME o más de una copia de genes de PME diferentes.
[0102] Las construcciones de ejemplo que ilustran realizaciones de la presente invención y otros casos descritos en este documento se muestran en 4-13 a continuación. La Tabla 4 muestra la secuencia de una construcción de ejemplo que comprende un gen que codifica PheP y una secuencia de promotor FNR para la inserción cromosómica (SEQ ID NO: 21), con la secuencia de pheP subrayada y la secuencia de promotor FNR en negrita. La Tabla 5 muestra la secuencia de una construcción de ejemplo que comprende un gen que codifica PAL1 y una secuencia de promotor FNR en un plásmido de alto número de copias (SEQ ID NO: 22), con la secuencia de PAL1 subrayada y la secuencia de promotor FNR en negrita. La Tabla 6 muestra la secuencia de una construcción de ejemplo que comprende un gen que codifica PAL3 y una secuencia de promotor FNR en un plásmido de alto número de copias (SEQ ID NO: 23), con la secuencia de PAL3 subrayada y la secuencia de promotor FNR en negrita. La Tabla 7 muestra la secuencia de una construcción de ejemplo que comprende un gen que codifica PAL1 y una secuencia de promotor Tet en un plásmido de alto número de copias (SEQ ID NO: 24), con la secuencia de PAL1 subrayada y la secuencia de promotor Tet en negrita. La Tabla 8 muestra la secuencia de una construcción de ejemplo que comprende un gen que codifica PAL3 y una secuencia de promotor Tet en un plásmido de alto número de copias (SEQ ID NO: 25), con la secuencia de PAL3 subrayada y la secuencia de promotorTet en negrita. La Tabla 9 muestra la secuencia de una construcción de ejemplo que comprende un gen que codifica PAL1 y una secuencia de promotor FNR en un plásmido de bajo número de copias (SEQ ID NO: 26), con la secuencia de PAL1 subrayada y la secuencia de promotor FNR en negrita. La Tabla 10 muestra la secuencia de una construcción de ejemplo que comprende un gen que codifica PAL3 y una secuencia de promotor de FNR en un plásmido de bajo número de copias (SEQ ID NO: 27), con la secuencia de PAL3 subrayada y la secuencia de promotor FNR en negrita. La Tabla 11 muestra la secuencia de una construcción de ejemplo que comprende un gen que codifica PAL1 y una secuencia de promotor Tet en un plásmido de bajo número de copias (SEQ ID NO: 28), con la secuencia de PAL1 subrayada y la secuencia de promotorTet en negrita. La Tabla 12 muestra la secuencia de una construcción de ejemplo que comprende un gen que codifica PAL3 y una secuencia de promotor Tet en un plásmido de bajo número de copias (SEQ ID NO: 29), con la secuencia de PAL3 subrayada y la secuencia de promotorTet en negrita. La Tabla 13 muestra la secuencia de una construcción de ejemplo que comprende un gen que codifica PheP, un gen que codifica TetR y una secuencia de promotor de Tet para la inserción cromosómica (SEQ ID NO: 30), con la secuencia de pheP subrayada, la secuencia de TetR enmarcada y la secuencia de promotor FNR en negrita.
Tabla 4
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(continuación)
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___________________________________________ Tabla 5_______________________________________
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Tabla 6
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Tabla 7
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Tabla 8
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Tabla 9
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(continuación)
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Tabla 10
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(Continuación)
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Tabla 11
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Tabla 12
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Tabla 13
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(continuación)
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[0103] En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente contienen una secuencia o secuencias de genes que comprenden una o más secuencias de cualquiera de las SEQ ID Nos: 21-30. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente contienen secuencia o secuencias de genes que comprenden una o más secuencias que tienen al menos 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83 %, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con cualquiera de las secuencias de SEQ ID Nos: 21-30.
Transporte de fenilalanina
[0104] Cada uno de PAL1 y PAL3 se expresó en un plásmido de alto número de copias y un plásmido de bajo número de copias en E. coli Nissle modificado genéticamente. Sorprendentemente, cada construcción metabolizó y redujo la fenilalanina a niveles similares (Fig. 15), y el paso limitante de la velocidad del metabolismo de la fenilalanina fue la disponibilidad de fenilalanina (Fig. 16). Por tanto, en algunas realizaciones, es ventajoso aumentar el transporte de fenilalanina al interior de la célula, mejorando así el metabolismo de la fenilalanina. Inesperadamente, incluso los plásmidos de PAL de bajo número de copia baja son capaces de eliminar casi por completo la Phe de una muestra de prueba cuando se expresan junto con pheP (Fig. 16A). Además, puede haber ventajas adicionales al usar un plásmido que expresa PAL de baja copia junto con pheP para mejorar la estabilidad de la expresión de PAL mientras se mantiene un alto metabolismo de la fenilalanina y para reducir la presión de selección negativa sobre la bacteria transformada. En realizaciones alternativas, el transportador de fenilalanina se usa junto con el plásmido de alto número de copias.
[0105] Las bacterias manipuladas genéticamente comprenden además un gen que codifica un transportador de fenilalanina. Los transportadores de fenilalanina pueden expresarse o modificarse en las bacterias manipuladas genéticamente de la invención para mejorar el transporte de fenilalanina al interior de la célula.
[0106] PheP es una proteína de transporte de membrana que es capaz de transportar fenilalanina al interior de células bacterianas (véase, por ejemplo, Pi et al., 1991). En algunas realizaciones, el gen de pheP nativo en las bacterias manipuladas genéticamente de la invención no está modificado. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente de la invención comprenden múltiples copias del gen pheP nativo. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente de la invención comprenden múltiples copias de un gen pheP no nativo. En el presente documento se describen bacterias manipuladas genéticamente que comprenden un gen pheP que está controlado por su promotor nativo, un promotor inducible, un promotor que es más fuerte que el promotor nativo, por ejemplo, el promotor GlnRS o el promotor P(Bla), o un promotor constitutivo. Las bacterias manipuladas genéticamente de la presente invención comprenden uno o más genes que codifican un transportador de fenilalanina, en el que el gen o los genes están unidos de manera operativa a un promotor inducible que no está asociado con el transportador de fenilalanina en la naturaleza. En algunas realizaciones, la expresión del gen pheP está controlada por un promotor diferente al promotor que controla la expresión del gen que codifica la enzima metabolizadora de fenilalanina y/o el regulador transcripcional. En algunas realizaciones, la expresión del gen pheP está controlada por el mismo promotor que controla la expresión de la enzima metabolizadora de fenilalanina y/o el regulador transcripcional. En algunas realizaciones, el gen pheP y la enzima metabolizadora de fenilalanina y/o el regulador transcripcional se transcriben de forma divergente a partir de una región promotora. En algunas realizaciones, la expresión de cada uno de los genes que codifican PheP, la enzima metabolizadora de fenilalanina y el regulador transcripcional está controlada por un promotor diferente. En algunas realizaciones, la expresión de los genes que codifican PheP, la enzima metabolizadora de fenilalanina y el regulador transcripcional está controlada por el mismo promotor.
[0107] En algunas realizaciones, el gen pheP nativo en las bacterias manipuladas genéticamente no está modificado, y se insertan uno o más copias adicionales del gen pheP nativo en el genoma bajo el control del mismo promotor inducible que controla la expresión de PAL, por ejemplo, el promotor FNR, o un promotor inducible diferente al que controla la expresión de PAL. En realizaciones alternativas, el gen pheP nativo no está modificado y una copia de un gen pheP no nativo de una especie bacteriana diferente se inserta en el genoma bajo el control del mismo promotor inducible que controla la expresión de PAL, por ejemplo, el promotor FNR, o un promotor inducible diferente al que controla la expresión de PAL.
[0108] En algunas realizaciones, el gen pheP nativo en las bacterias manipuladas genéticamente no está modificado, y una o más copias del gen pheP nativo están presentes en las bacterias en un plásmido y bajo el control del mismo promotor inducible que controla la expresión de PAL, por ejemplo, el promotor FNR, o un promotor inducible diferente al que controla la expresión de PME.
[0109] En realizaciones alternativas, el gen pheP nativo no está modificado, y una copia de un gen pheP no nativo de una especie diferente de bacterias está presente en las bacterias en un plásmido y bajo el control del mismo promotor inducible que controla la expresión de PAL, por ejemplo, el promotor FNR, o un promotor inducible diferente al que controla la expresión de PAL.
[0110] En algunas realizaciones, el gen pheP nativo está mutagenizado, se seleccionan mutantes que exhiben un aumento del transporte fenilalanina y el gen pheP mutagenizado se aísla y se inserta en las bacterias manipuladas genéticamente (véase, por ejemplo, Pi et al, 1996;. Pi et al., 1998). Las modificaciones del transportador de fenilalanina descritas en el presente documento pueden estar presentes en un plásmido o cromosoma.
[0111] En algunas realizaciones, la bacteria manipulada genéticamente es E. coli Nissle, y el gen pheP nativo en E. coli Nissle no está modificado; una o más copias adicionales de los genes pheP nativos de E. coli Nissle se insertan en el genoma de E. coli Nissle bajo el control del mismo promotor inducible que controla la expresión de PAL, por ejemplo, el promotor FNR, o un promotor inducible diferente al que controla la expresión de PAL. En una realización alternativa, el gen pheP nativo en E. coli Nissle no está modificado y una copia de un gen pheP no nativo de una bacteria diferente se inserta en el genoma de E. coli Nissle bajo el control del mismo promotor inducible que controla la expresión de PAL, por ejemplo, el promotor FNR, o un promotor inducible diferente al que controla la expresión de PAL.
[0112] En algunas realizaciones, la bacteria manipulada genéticamente es E. coli Nissle, y el gen pheP nativo en E. coli Nissle no está modificado; una o más copias adicionales de los genes pheP nativos de E. coli Nissle están presentes en la bacteria en un plásmido y bajo el control del mismo promotor inducible que controla la expresión de PAL, por ejemplo, el promotor FNR, o un promotor inducible diferente al que controla la expresión de PAL. En una realización alternativa, el gen pheP nativo en E. coli Nissle no está modificado, y una copia de un gen pheP no nativo de una bacteria diferente está presente en la bacteria en un plásmido y bajo el control del mismo promotor inducible. que controla la expresión de PAL, por ejemplo, el promotor FNR, o un promotor inducible diferente al que controla la expresión de PAL.
[0113] Se ha informado que Escherichia coli tiene cinco sistemas de transporte distintos (AroP, Mtr, PheP, TnaB y TyrP) para la acumulación de aminoácidos aromáticos. Una aminoácido permeasa general, codificada por el gen aroP, transporta tres aminoácidos aromáticos, incluida la fenilalanina, con alta afinidad y se cree que, junto con PheP, es responsable de la mayor parte de la importación de fenilalanina. Además, se observó un bajo nivel de acumulación de fenilalanina en una cepa de E. coli deficiente en transportadores de aminoácidos aromáticos (AaroP ApheP Amtr Atna AtyrP), y se atribuyó a la actividad del sistema LIV-I/LS, que es un transportador de aminoácidos de cadena ramificada que consiste en dos proteínas de unión periplásmicas, la proteína de unión a LIV (sistema LIV-I) y la proteína de unión a LS (sistema LS), y componentes de la membrana, LivHMGF (Koyanagi et al., y referencias en las mismas; Identification of the LIV-I/LS System as the Third Phenylalanine Transporter in Escherichica coli K-12).
[0114] En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden un gen Arop. En algunas realizaciones, la bacteria manipulada manipulada genéticamente es E. coli Nissle, y el gen aroP nativo en E. coli Nissle no está modificado; una o más copias adicionales de los genes aroP nativos de E. coli Nissle están presentes en la bacteria en un plásmido o en el cromosoma y bajo el control del mismo promotor inducible que controla la expresión de la PME, por ejemplo, el promotor FNR, o el promotor araBAD, un promotor inducible diferente al que controla la expresión de la PME.
[0115] En una realización alternativa, el gen aroP nativo en E. coli Nissle no está modificado, y una copia de un gen Arop no nativo de una bacteria diferente está presente en la bacteria en un plásmido o en el cromosoma y bajo el control del mismo promotor inducible que controla la expresión de PME, por ejemplo, el promotor FNR o el promotor AraBAD, o un promotor inducible diferente al que controla la expresión de PME
[0116] En otras realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden Arop y PheP, bajo el control de los mismos o diferentes promotores inducibles.
[0117] En algunas realizaciones, el gen pheP se expresa en un cromosoma. En algunas realizaciones, la expresión del cromosoma puede ser útil para aumentar la estabilidad de la expresión de pheP. En algunas realizaciones, el gen pheP se integra en el cromosoma bacteriano en uno o más sitios de integración en las bacterias manipuladas genéticamente. En algunas realizaciones, el gen pheP se inserta en el genoma bacteriano en uno o más de los siguientes sitios de inserción en E. coli Nissle: malE/K, insB/I, araC/BAD, lacZ, agal/rsml, thyA y malP/T. Puede usarse cualquier sitio de inserción adecuado (ver, por ejemplo, la Fig.36). El sitio de inserción puede estar en cualquier parte del genoma, por ejemplo, en un gen requerido para la supervivencia y/o el crecimiento, tal como thyA (para crear un auxótrofo); en un área activa del genoma, tal como cerca del sitio de replicación del genoma; y/o entre promotores divergentes a efectos de reudcir el riesgo de transcripción n intencionada, tal como entre AraB y AraC del operón de arabinosa.
[0118] En algunas realizaciones, la bacteria manipulada genéticamente comprende múltiples mecanismos de acción y/o uno o más auxotrofías. En determinadas realizaciones, las bacterias se modifican genéticamente para comprender cinco copias de PAL bajo el control de un promotor dependiente del nivel de oxígeno (por ejemplo, Pn s -PAL3) insertado en diferentes sitios de integración en el cromosoma (por ejemplo, MalE/K, yicS/nepI, malP/T, agaI/rsmI y cea) y una copia de un gen transportador de fenilalanina bajo el control de un promotor dependiente del nivel de oxígeno (por ejemplo., Pfnrs-pheP) insertado en un sitio de integración diferente en el cromosoma (por ejemplo, lacZ). En un aspecto más específico, las bacterias se manipulan genéticamente para incluir además un gen de resistencia a la kanamicina y una auxotrofia de thyA, en las que el gen thyA se elimina y/o se reemplaza por un gen no relacionado.
Múltiples mecanismos de acción
[0119] En algunas realizaciones, las bacterias se modifican genéticamente para incluir múltiples mecanismos de acción (MoA), por ejemplo, circuitos que producen múltiples copias del mismo producto (por ejemplo, para aumentar el número de copias) o circuitos que realizan múltiples funciones diferentes. Los ejemplos de sitios de inserción incluyen, pero sin limiación, malE/K, yicS/nepI, insB/I, araC/BAD, lacZ, agal/rsml, thyA, malP/T, dapA y cea, y otros que se muestran en la Fig.36. Por ejemplo, las bacterias manipuladas genéticamente pueden incluir cuatro copias de PAL insertadas en cuatro sitios de inserción diferentes, por ejemplo, malE/K, insB/I, araC/BAD y lacZ. Las bacterias manipuladas genéticamente también pueden incluir cuatro copias de PAL insertadas en cuatro sitios de inserción diferentes, por ejemplo, malE/K, yicS/nepI, agaI/rsmI y cea, y una copia de un gen transportador de fenilalanina insertado en un sitio de inserción diferente, por ejemplo, lacZ (Fig. 13B). Alternativamente, las bacterias manipuladas genéticamente pueden incluir tres copias de PAL insertadas en tres sitios de inserción diferentes, por ejemplo, MalE/K, insB/I y lacZ, y tres copias de un gen transportador de fenilalanina insertado en tres sitios de inserción diferentes, por ejemplo, DapA, cea y araC/BAD.
[0120] En el presente documento se describen bacterias manipuladas genéticamente que comprenden una o más de (1) PAL, PAH, LAAD para la degradación de fenilalanina, en forma natural o mutada (para una mayor estabilidad o actividad metabólica) (2) transportador PheP o AroP para captación de fenilalanina, en tipo salvaje o en forma mutada (para una mayor estabilidad o actividad metabólica) (3) PAL, PAH, LAAD y/o PheP para la secreción y degradación extracelular de fenilalanina, (4) componentes de la maquinaria de secreción, tal como se describe en este documento (5) Auxotrofia, por ejemplo, deltaThyA (6) resistencia a antibióticos, que incluye, pero no se limita a, resistencia a kanamicina o cloranfenicol (7) mutaciones/deleciones en genes involucrados en el metabolismo del oxígeno, tal como se describe en este documento y (8) mutaciones/deleciones en genes de la vía de síntesis endógena de fenilalanina de Nissle (por ejemplo, delta PheA para la auxotrofia de Phe).
[0121] En una realización, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden una o más copias de PAL3 (por ejemplo, bajo el control de un promotor Pfnr) y una o más copias de PAL1 (por ejemplo, bajo el control de un promotor Pfnr). En una realización, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden una o más copias de PAL3, (por ejemplo, bajo el control de un promotor Pfnr) y una o más copias de PAL1 (por ejemplo, bajo el control de un promotor Pfnr); y además comprenden una o más copias de un transportador de fenilalanina (por ejemplo, PheP y/o AroP, por ejemplo, bajo el control de un promotor Pfnr). En una realización, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden una o más copias de PAL3 (por ejemplo, bajo el control de un promotor Pfnr) y una o más copias de LAAD (por ejemplo, bajo el control del promotor ParaBAD). En una realización, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden una o más copias de PAL3, (por ejemplo, bajo el control de un promotor Pfnr) y una o más copias de LAAD (por ejemplo, bajo el control del promotor ParaBAD); y además comprenden una o más copias de un transportador de fenilalanina (por ejemplo, PheP y/o AroP, por ejemplo, bajo el control de un promotor Pfnr). En una realización, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden una o más copias de PAL3 (por ejemplo, bajo el control de un promotor Pfnr) y una o más copias de PAH. En una realización, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden una o más copias de PAL3 (por ejemplo, bajo el control de un promotor Pfnr) y una o más copias de PAH; y además comprenden una o más copias de un transportador de fenilalanina (por ejemplo, PheP y/o AroP, por ejemplo, bajo el control de un promotor Pfnr). En una realización, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden una o más copias de PAL1, (por ejemplo, bajo el control de un promotor Pfnr) y una o más copias de LAAD (por ejemplo, bajo el control del promotor ParaBAD). En una realización, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden una o más copias de PAL1, (por ejemplo, bajo el control de un promotor Pfnr) y una o más copias de LAAD (por ejemplo, bajo el control del promotor ParaBAD); y además comprende una o más copias de un transportador de fenilalanina (por ejemplo, PheP y/o AroP, por ejemplo, bajo el control de un promotor Pfnr). En una realización, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden una o más copias de PAL1 (por ejemplo, bajo el control de un promotor Pfnr) y una o más copias de PAH. En una realización, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden una o más copias de PAL1 (por ejemplo, bajo el control de un promotor Pfnr) y una o más copias de PAH; y además comprenden una o más copias de un transportador de fenilalanina (por ejemplo, PheP y/o AroP, por ejemplo, bajo el control de un promotor Pfnr). En el presente documento se describen bacterias manipuladas genéticamente que comprenden una o más copias de PAH y una o más copias de LAAD (por ejemplo, bajo el control del promotor ParaBAD). En el presente documento se describen bacterias manipuladas genéticamente que comprenden una o más copias de PAH y una o más copias de LAAD (por ejemplo, bajo el control del promotor ParaBAD); y además comprenden una o más copias de un transportador de fenilalanina (por ejemplo, PheP y/o AroP, por ejemplo, bajo el control de un promotor Pfnr). Las PME y los transportadores pueden integrarse en cualquiera de los sitios de inserción descritos en este documento.
[0122] En una realización, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden una o más copias de PAL3, por ejemplo (por ejemplo, bajo el control de un promotor Pfnr), una o más copias de LAAD (por ejemplo, bajo el control del promotor ParaBAD) y una o más más copias de PAH. En una realización, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden una o más copias de PAL3, por ejemplo (por ejemplo, bajo el control de un promotor Pfnr), una o más copias de LAAD (por ejemplo, bajo el control del promotor ParaBAD) y una o más más copias de PAH; y además comprenden una o más copias de un transportador de fenilalanina (por ejemplo, PheP y/o AroP, por ejemplo, bajo el control de un promotor Pfnr). En una realización, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden una o más copias de PAL3, por ejemplo (por ejemplo, bajo el control de un promotor Pfnr), una o más copias de LAAD (por ejemplo, bajo el control del promotor ParaBAD) y una o más copias de PAL1 (por ejemplo, bajo el control de un promotor Pfnr). En una realización, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden una o más copias de PAL3, por ejemplo (por ejemplo, bajo el control de un promotor Pfnr), una o más copias de LAAD (por ejemplo, bajo el control del promotor ParaBAD) y una o más más copias de PAL1 (por ejemplo, bajo el control de un promotor Pfnr); y además comprenden una o más copias de un transportador de fenilalanina (por ejemplo, PheP y/o AroP, por ejemplo, bajo el control de un promotor Pfnr). En una realización, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden una o más copias de PAL3, por ejemplo, (por ejemplo, bajo el control de un promotor Pfnr), una o más copias de PAL1 (por ejemplo, bajo el control de un promotor Pfnr), y una o más más copias de PAH. En una realización, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden una o más copias de PAL3, por ejemplo (por ejemplo, bajo el control de un promotor Pfnr), una o más copias de PAL1 (por ejemplo, bajo el control de un promotor Pfnr) y una o más copias de PAH; y además comprenden una o más copias de un transportador de fenilalanina (por ejemplo, PheP y/o AroP, por ejemplo, bajo el control de un promotor Pfnr). En una realización, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden una o más copias de LAAD (por ejemplo, bajo el control del promotor ParaBAD), una o más copias de PAH y una o más copias de PAL1 (por ejemplo, bajo el control de un promotor Pfnr). En una realización, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden una o más copias de LAAD (por ejemplo, bajo el control del promotor ParaBAD), una o más copias de PAH y una o más copias de PAL1 (por ejemplo, bajo el control de un promotor Pfnr); y además comprenden una o más copias de un transportador de fenilalanina (por ejemplo, PheP y/o AroP, por ejemplo, bajo el control de un promotor Pfnr). Las PME y/o transportadores pueden integrarse en cualquiera de los sitios de inserción descritos en este documento. Alternativamente, las PME y/o los transportadores pueden estar comprendidos en plásmidos de bajo o alto número de copias. Las PME y/o transportadores pueden integrarse en cualquiera de los sitios de inserción descritos en este documento en combinación con PME y/o transportadores que están comprendidos en plásmidos de bajo o alto número de copias.
[0123] En una realización, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden una o más copias de PAL3, por ejemplo (por ejemplo, bajo el control de un promotor Pfnr), una o más copias de PAL1, por ejemplo (por ejemplo, bajo el control de un promotor Pfnr), una o más copias de LAAD (por ejemplo, bajo el control del promotor ParaBAD) y una o más copias de PAH. En una realización, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden una o más copias de PAL3, por ejemplo (por ejemplo, bajo el control de un promotor Pfnr), una o más copias de PAL1, por ejemplo (por ejemplo, bajo el control de un promotor Pfnr), una o más copias de LAAD (por ejemplo, bajo el control del promotor ParaBAD) y una o más copias de PAH; y además comprenden una o más copias de un transportador de fenilalanina (por ejemplo, PheP y/o AroP, por ejemplo, bajo el control de un promotor Pfnr). Las PME y los transportadores pueden integrarse en cualquiera de los sitios de inserción descritos en este documento. Alternativamente, las PME y/o transportadores pueden estar comprendidos en plásmidos de bajo o alto número de copias.
[0124] En una realización, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden una copia de PAL (por ejemplo, PAL1 o PAL3, por ejemplo, bajo el control de un promotor Pfnr), una copia de PheP (por ejemplo, bajo el control de un promotor Pfnr) y una copia de LAAD (por ejemplo, bajo el control del promotor ParaBAD). En una realización, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden una copia de PAL (por ejemplo, PAL1 o PAL3, por ejemplo, bajo el control de un promotor Pfnr), dos copias de PheP (por ejemplo, bajo el control de un promotor Pfnr) y una copia de LAAD (por ejemplo, bajo el control del promotor ParaBAD). En una realización, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden una copia de PAL (por ejemplo, PAL1 o PAL3, por ejemplo, bajo el control de un promotor Pfnr) una copia de PheP (por ejemplo, bajo el control de un promotor Pfnr) y dos copias de LAAD (por ejemplo, bajo el control del promotor ParaBAD). En una realización, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden una copia de PAL (por ejemplo, PAL1 o PAL3, por ejemplo, bajo el control de un promotor Pfnr), dos copias de PheP (por ejemplo, Bajo el control de un promotor Pfnr) y dos copias de LAAD (por ejemplo, bajo el control del promotor ParaBAD). Las PME y los transportadores pueden integrarse en cualquiera de los sitios de inserción descritos en este documento. Alternativamente, las PME y/o los transportadores localizados pueden estar comprendidos en plásmidos de bajo o alto número de copias.
[0125] En una realización, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden dos copias de PAL (por ejemplo, PAL1 o PAL3, por ejemplo, bajo el control de un promotor Pfnr), una copia de PheP (por ejemplo, bajo el control de un promotor Pfnr) y una copia de LAAD (por ejemplo, bajo el control del promotor ParaBAD). En una realización, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden dos copias de PAL (por ejemplo, PAL1 o PAL3, por ejemplo, bajo el control de un promotor Pfnr), dos copias de PheP (por ejemplo, bajo el control de un promotor Pfnr) y una copia de LAAD (por ejemplo, bajo el control del promotor ParaBAD). En una realización, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden dos copias de PAL (por ejemplo, PAL1 o PAL3, por ejemplo, bajo el control de un promotor Pfnr) una copia de PheP (por ejemplo, bajo el control de un promotor Pfnr) y dos copias de LAAD (por ejemplo, bajo el control del promotor ParaBAD).
[0126] En una realización, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden tres copias de PAL (por ejemplo, PAL1 o PAL3, por ejemplo, bajo el control de un promotor Pfnr), una copia de PheP (por ejemplo, bajo el control de un promotor Pfnr) y una copia de LAAD (por ejemplo, bajo el control del promotor ParaBAD). En una realización, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden tres copias de PAL (por ejemplo, PAL1 o PAL3, por ejemplo, bajo el control de un promotor Pfnr), dos copias de PheP (por ejemplo, bajo el control de un promotor Pfnr) y una copia de LAAD (por ejemplo, bajo el control del promotor ParaBAD). En una realización, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden tres copias de PAL (por ejemplo, PAL1 o PAL3, por ejemplo, bajo el control de un promotor Pfnr), una copia de PheP (por ejemplo, bajo el control de un promotor Pfnr) y dos copias de LAAD (por ejemplo, bajo el control del promotor ParaBAD). En una realización, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden tres copias de PAL (por ejemplo, PAL1 o PAL3, por ejemplo, bajo el control de un promotor Pfnr), dos copias de PheP (por ejemplo, bajo el control de un promotor Pfnr) y dos copias de LAAD (por ejemplo, bajo el control del promotor ParaBAD). En una realización, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden tres copias de PAL (por ejemplo, PAL1 o PAL3, por ejemplo, bajo el control de un promotor Pfnr), tres copias de PheP (por ejemplo, bajo el control de un promotor Pfnr) y dos copias de LAAD (por ejemplo, bajo el control del promotor ParaBAD). En una realización, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden tres copias de PAL (por ejemplo, PAL1 o PAL3, por ejemplo, bajo el control de un promotor Pfnr), tres copias de PheP (por ejemplo, bajo el control de un promotor Pfnr) y una copia de LAAD (por ejemplo, bajo el controls del promotor ParaBAD).
[0127] En una realización, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden cuatro copias de PAL (por ejemplo, PAL1 o PAL3, por ejemplo, bajo el control de un promotor Pfnr), una copia de PheP (por ejemplo, bajo el control de un promotor Pfnr) y una copia de LAAD (por ejemplo, bajo el control del promotor ParaBAD). En una realización, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden cuatro copias de PAL (por ejemplo, PAL1 o PAL3, por ejemplo, bajo el control de un promotor Pfnr), dos copias de PheP (por ejemplo, bajo el control de un promotor Pfnr) y una copia de LAAD (por ejemplo, bajo el control del promotor ParaBAD). En una realización, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden cuatro copias de PAL (por ejemplo, PAL1 o PAL3, por ejemplo, bajo el control de un promotor Pfnr), una copia de PheP (por ejemplo, bajo el control de un promotor Pfnr) y dos copias de LAAD (por ejemplo, bajo el control del promotor ParaBAD). En una realización, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden cuatro copias de PAL (por ejemplo, PAL1 o PAL3, por ejemplo, bajo el control de un promotor Pfnr), dos copias de PheP (por ejemplo, bajo el control de un promotor Pfnr) y dos copias de LAAD (por ejemplo, bajo el control del promotor ParaBAD).
[0128] En una realización, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden cinco copias de PAL (por ejemplo, PAL1 o PAL3, por ejemplo, bajo el control de un promotor Pfnr) una copia de PheP (por ejemplo, bajo el control de un promotor Pfnr) y una copia de LAAD (por ejemplo, bajo el control del promotor ParaBAD). En una realización, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden cinco copias de PAL (por ejemplo, PAL1 o PAL3, por ejemplo, bajo el control de un promotor Pfnr), dos copias de PheP (por ejemplo, bajo el control de un promotor Pfnr) y una copia de LAAD (por ejemplo, bajo el control del promotor ParaBAD). En una realización, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden cinco copias de PAL (por ejemplo, PAL1 o PAL3, por ejemplo, bajo el control de un promotor Pfnr) una copia de PheP (por ejemplo, bajo el control de un promotor Pfnr) y dos copias de LAAD (por ejemplo, bajo el control del promotor ParaBAD). En una realización, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden cinco copias de PAL (por ejemplo, PAL1 o PAL3, por ejemplo, bajo el control de un promotor Pfnr), dos copias de PheP (por ejemplo, bajo el control de un promotor Pfnr) y dos copias de LAAD (por ejemplo, bajo el control del promotor ParaBAD).
[0129] Las bacterias manipuladas genéticamente descritas en este documento pueden comprender una o más PME para metabolizar la fenilalanina en combinación con una o más PME para la secreción. Las bacterias manipuladas genéticamente descritas en el presente documento pueden comprender una o más PME para metabolizar fenilalanina y un transportador de fenilalanina en combinación con una o más PME para secreción. Las bacterias manipuladas genéticamente descritas en el presente documento pueden comprender una o más PME para metabolizar fenilalanina y un transportador de fenilalanina en combinación con una o más PME para secreción, y también incluyen una auxotrofia y/o resistencia a antibióticos. Los sistemas de secreción descritos en este documento se utilizan para secretar las PME en las bacterias manipuladas genéticamente con múltiples mecanismos de acción.
[0130] En una realización, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden dos copias adicionales de PheP (además del gen de tipo salvaje). Esto proporciona redundancia, en caso de que uno de los genes de PheP adquiera una mutación. En una realización, los genes de PheP se insertan en lacZ y agal/rsml. En una realización, las dos copias de PheP están bajo el control del promotor PfnrS. En una realización, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden tres copias de PAL3. En una realización, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden tres copias de PAL3, insertadas en malEK, malPT, yicS/nepl. En una realización, la expresión de las tres copias de PAL3 está bajo el control del promotor PfnrS. En una realización, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden una o más copias de LAAD. En una realización, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden una copia de LAAD, insertada en el operón arabinosa. En una realización, LAAD está bajo el control del promotor ParaBAD endógeno. En una realización, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden una auxotrofia, por ejemplo, deltaThyA. En una realización, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden una resistencia a los antibióticos. En una realización, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden una resistencia a antibióticos y una auxotrofia, por ejemplo, deltaThyA. En una realización, las bacterias manipuladas genéticamente no comprenden una auxotrofia, por ejemplo, deltaThyA. En una realización, las bacterias manipuladas genéticamente no comprenden una resistencia a los antibióticos. En una realización, las bacterias manipuladas manipulada genéticamente no comprenden ni una resistencia a los antibióticos ni una auxotrofia, por ejemplo, deltaThyA.
[0131] En una realización, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden tres copias de PAL, por ejemplo, PAL3, 2 copias de PheP (además de PheP endógena), y una copia de LAAD. En una realización, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden tres copias de PAL, por ejemplo, PAL3, 2 copias de PheP (además de la PheP endógena) y una copia de LAAD, y una auxotrofia, por ejemplo, delta ThyA. En una realización, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden tres copias de PAL, 2 copias de PheP (además de la PheP endógena) y una copia de LAAD, y un gen de resistencia a antibióticos. En una realización, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden tres copias de PAL, 2 copias de PheP (además de la PheP endógena) y una copia de LAAD, y un gen de resistencia a antibióticos y una auxotrofia, por ejemplo, delta ThyA.
[0132] En una realización, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden tres copias de PAL (cada una bajo el control de un promotor PfhrS), 2 copias de PheP (cada una bajo el control de un promotor PfnrS) y una copia de LAAD (bajo el control del promotor ParaBAD endógeno). En una realización, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden tres copias de PAL (cada una bajo el control de un promotor PfnrS), 2 copias de PheP (cada una bajo el control de un promotor PfnrS) y una copia de LAAD (bajo el control del promotor ParaBAD endógeno) y una resistencia a los antibióticos. En una realización, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden tres copias de PAL (cada una bajo el control de un promotor PfnrS), 2 copias de PheP (cada una bajo el control de un promotor PfnrS) y una copia de LAAD (bajo el control del promotor ParaBAD endógeno) y una auxotrofia, por ejemplo, delta ThyA. En una realización, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden tres copias de PAL (cada una bajo el control de un promotor PfnrS), 2 copias de PheP (cada una bajo el control de un promotor PfnrS) y una copia de LAAD (bajo el control del promotor ParaBAD endógeno) y una resistencia a antibióticos y una auxotrofia, por ejemplo, delta ThyA.
[0133] En una realización, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden tres copias de PAL (cada una bajo el control de un promotor PfnrS e insertada en los sitios malEK, malPT y yicS/nepl), 2 copias de PheP (cada una bajo el control de un promotor PfnrS e insertada en los sitios LacZ y agal/rsml), y una copia de LAAD (bajo el control del promotor ParaBAD endógeno e insertada en el operón arabinosa endógeno). En una realización, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden tres copias de PAL (cada una bajo el control de un promotor PfnrS e insertada en los sitios malEK, malPT y yicS/nepl), 2 copias de PheP (cada una bajo el control de un promotor PfnrS e insertada en los sitios LacZ y agal/rsml), y una copia de LAAD (bajo el control del promotor ParaBAD endógeno e insertada en el operón arabinosa endógeno), y además comprenden una resistencia a los antibióticos. En una realización, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden tres copias de PAL (cada una bajo el control de un promotor PfnrS e insertada en los sitios malEK, malPT y yicS/nepl), 2 copias de PheP (cada una bajo el control de un promotor PfnrS e insertada en los sitios LacZ y agal/rsml), y una copia de LAAD (bajo el control del promotor ParaBAD endógeno e insertada en el operón arabinosa endógeno) y además comprenden una auxotrofia, por ejemplo, deltaThyA. En una realización, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden tres copias de PAL (cada una bajo el control de un promotor PfnrS e insertada en los sitios malEK, malPT y yicS/nepl), 2 copias de PheP (cada una bajo el control de un promotor PfnrS e insertada en los sitios LacZ y agal/rsml), y una copia de LAAD (bajo el control del promotor ParaBAD endógeno e insertada en el operón arabinosa endógeno), y además comprenden una resistencia a los antibióticos y una auxotrofia, por ejemplo, deltaThyA.
[0134] En una realización, las bacterias manipuladas genéticamente son SYN-PKU705. En una realización, SYN-PKU705 comprende además una resistencia a antibióticos. En una realización, SYN-PKU705 comprende además una auxotrofia, por ejemplo, deltaThyA. En una realización, SYN-PKU705 comprende además una resistencia a antibióticos y auxotrofia, por ejemplo, deltaThyA.
[0135] La Tabla 14 contiene ejemplos no limitantes de las bacterias manipuladas genéticamente descritas en el presente documento, incluidas las bacterias de la invención, tal como se define en las reivindicaciones. Las bacterias manipuladas genéticamente de la Tabla 14 pueden contener además una PME para su secreción.
T l 14. E m l n limi n ri m ifi n i m n
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Secreción
[0136] En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden además un mecanismo de secreción nativa (por ejemplo, bacterias gram positivas) o mecanismo de secreción no nativo (por ejemplo, bacterias gram negativas) que es capaz de secretar la proteína o proteínas de interés o proteína o proteínas terapéuticas, por ejemplo, PAH, PAL o LAAD, del citoplasma bacteriano. Muchas bacterias han desarrollado sofisticados sistemas de secreción para transportar sustratos a través de la envoltura celular bacteriana. Los sustratos, tales como moléculas pequeñas, proteínas y ADN, pueden liberarse al espacio extracelular o al periplasma (tal como el lumen intestinal u otro espacio), inyectarse en una célula diana o asociarse con la membrana bacteriana.
[0137] En las bacterias gram negativas, los mecanismos de secreción pueden atravesar una o ambas membranas internas y externas. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden además un sistema de secreción no nativo que atraviesa la doble membrana. Los sistemas de secreción que atraviesan la doble membrana incluyen, pero sin limitación, el sistema de secreción de tipo I (T1SS), el sistema de secreción de tipo II (T2SS), el sistema de secreción de tipo III (T3SS), el sistema de secreción de tipo IV (T4SS), el sistema de secreción de tipo VI (T6SS) y la familia de bombas de eflujo de múltiples fármacos por división de nodulación por resistencia (RND) (Pugsley 1993; Gerlach et al., 2007; Collinson et al., 2015; Costa et al., 2015 ; Reeves et al., 2015; WO2014138324A1). En las Figuras 3-6 se muestran ejemplos de tales sistemas de secreción. Las micobacterias, que tienen una envoltura celular similar a las gramnegativas, también pueden codificar un sistema de secreción de tipo VII (T7SS) (Stanley et al., 2003). Con la excepción de T2SS, las secreciones que atraviesan la doble membrana generalmente transportan sustratos desde el citoplasma bacteriano directamente al espacio extracelular o al interior de la célula diana. Por el contrario, el T2SS y los sistemas de secreción que atraviesan solo la membrana externa pueden utilizar un mecanismo de dos pasos, en el que los sustratos se trasladan primero al periplasma mediante transportadores que atraviesan la membrana interna y a continuación se transfieren a la membrana externa o se secretan al espacio extracelular. Los sistemas de secreción que atraviesan la membrana externa incluyen, pero sin limitación, el sistema de secreción de tipo V o autotransportador (T5SS), el sistema de secreción de curli y la vía chaperona-usher para el ensamblaje de pili (Saier, 2006; Costa et al., 2015).
[0138] En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente de la invención comprenden además un sistema de secreción de tipo III o similar a tipo III (T3SS) de Shigella, Salmonella, E. coli, Bivrio, Burkholderia, Yersinia, Chlamydia o Pseudomonas. El T3SS es capaz de transportar una proteína desde el citoplasma bacteriano al citoplasma del huésped a través de un complejo de agujas. El T3SS puede modificarse para secretar la molécula del citoplasma bacteriano, pero no inyectar la molécula en el citoplasma del huésped. Por tanto, la molécula se secreta en el lumen intestinal u otro espacio extracelular. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden dicho T3SS modificado y son capaces de secretar la proteína o proteínas de interés o la proteína o proteínas terapéuticas del citoplasma bacteriano. En algunas realizaciones, la molécula secretada, tal como una proteína o péptido heterólogo, por ejemplo, la proteína de interés o proteína terapéutica, por ejemplo, PAH, PAL o LAAD, comprende una secuencia de secreción de tipo III que permite que la proteína o proteínas de interés o proteína o proteínas terapéuticas se secreten de las bacterias.
[0139] En algunas realizaciones, se usa una vía de secreción de tipo III flagelar para secretar la molécula de interés, por ejemplo, PAH, PAL o LAAD. En algunas realizaciones, se usa un flagelo incompleto para secretar un péptido terapéutico de interés, por ejemplo, PAH, PAL o LAAD, fusionándolo recombinantemente con el péptido con una señal de secreción flagelar N-terminal de un componente flagelar nativo. De esta manera, el péptido quimérico expresado intracelularmente puede movilizarse a través de las membranas interna y externa hacia el entorno del huésped circundante.
[0140] En algunas realizaciones, se usa un sistema de secreción de autotransportador de tipo V para secretar el péptido terapéutico, por ejemplo, PAH, PAL o LAAD. Debido a la simplicidad de la maquinaria y la capacidad para manipular flujos de proteínas relativamente grandes, el sistema de secreción de Tipo V es atractivo para la producción extracelular de proteínas recombinantes. Tal como se muestra en la Figura 10, un péptido terapéutico (estrella) puede fusionarse con una señal de secreción N-terminal, un enlazador y el dominio beta de un autotransportador. La secuencia señal N-terminal dirige la proteína a la maquinaria SecA-YEG que mueve la proteína a través de la membrana interna hacia el periplasma, seguida de la posterior escisión de la secuencia señal. El dominio Beta se recluta para el complejo Bam ('Maquinaria de ensamblaje de barriles Beta') donde el dominio beta se pliega y se inserta en la membrana externa como una estructura de barril beta. El péptido terapéutico, por ejemplo, PAH, pAl o LAAD, se enhebra a través del poro hueco de la estructura de barril beta por delante de la secuencia enlazadora. Una vez expuesto al entorno extracelular, el péptido terapéutico, por ejemplo, PAH, PAL o LAAD, puede liberarse del sistema enlazador mediante una escisión autocatalítica (lado izquierdo del complejo Bam) o dirigiendo una peptidasa asociada a la membrana (tijeras negras; lado derecho del complejo de Bam) a un sitio de corte de proteasa complementario en el enlazador. Por tanto, en algunas realizaciones, la molécula secretada, tal como una proteína o péptido heterólogo, por ejemplo, la proteína de interés o proteína terapéutica, comprende una señal de secreción N-terminal, un enlazador, y un dominio beta de un autotransportador para permitir que la molécula se secrete desde las bacterias.
[0141] En algunas realizaciones, se usa un sistema de secreción basado en hemolisina para secretar la molécula de interés, por ejemplo, PAH, PAL o LAAD. Los sistemas de secreción tipo I ofrecen la ventaja de trasladar su péptido pasajero directamente desde el citoplasma al espacio extracelular, obviando el proceso de dos pasos de otros tipos de secreción. La Figura 11 muestra la alfa-hemolisina (HlyA) de Escherichia coli uropatógena. Esta vía utiliza HlyB, un transportador de casete de unión a ATP; HlyD, una proteína de fusión de membranas; y TolC, una proteína de la membrana externa. El ensamblaje de estas tres proteínas forma un canal a través de las membranas interna y externa. De forma nativa, este canal se usa para secretar HlyA, sin embargo, para secretar el péptido terapéutico de la presente divulgación, la parte C-terminal que contiene la señal de secreción de HlyA se fusiona a la parte C-terminal de un péptido terapéutico (estrella) para mediar en la secreción de este péptido.
[0142] En realizaciones alternativas, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden además un sistema de secreción no nativo que atraviesa una sola membrana. Los exportadores que atraviesan una sola membrana pueden actuar como un componente de un sistema de secreción o pueden exportar sustratos de forma independiente. Dichos exportadores incluyen, pero sin limitación, translocasas de casetes de unión a ATP, translocasas relacionadas con flagelo/virulencia, translocasas relacionadas con la conjugación, el sistema secretor general (por ejemplo, el complejo SecYEG en E. coli), el sistema secretor accesorio en micobacterias y varios tipos de bacterias grampositivas (por ejemplo, Bacillus anthracis, Lactobacillus johnsonii, Corynebacterium glutamicum, Streptococcus gordonii, Staphylococcus aureus), y el sistema de translocación de arginina gemela (TAT) (Saier, 2006; Rigel y Braunstein, 2008; Al. al., 2013). Se sabe que los sistemas secretor general y TAT pueden exportar sustratos con péptidos señal N-terminales escindibles al periplasma, y se han explorado en el contexto de la producción biofarmacéutica. Sin embargo, el sistema TAT puede ofrecer ventajas particulares, ya que es capaz de transportar sustratos plegados, eliminando así la posibilidad de un plegado prematuro o incorrecto. En determinadas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden un sistema TAT o similar a TAT y son capaces de secretar la proteína o proteínas de interés o proteína o proteínas terapéuticas, por ejemplo, PAH, pAl o LAAD, del citoplasma bacteriano. Un experto en la técnica entendería que los sistemas de secreción descritos en este documento pueden modificarse para actuar en diferentes especies, cepas y subtipos de bacterias, y/o adaptarse para suministrar diferentes cargas útiles.
[0143] Con el fin de trasladar una proteína, por ejemplo, polipéptido terapéutico, por ejemplo, PAH, PAL o LAAD, al espacio extracelular, el polipéptido debe primero ser traducido intracelularmente, movilizarse a través de la membrana interna y finalmente movilizarse a través de la membrana externa. Muchas proteínas efectoras (por ejemplo, polipéptidos terapéuticos), en particular las de origen eucariota, contienen enlaces disulfuro para estabilizar las estructuras terciarias y cuaternarias. Si bien estos enlaces pueden formarse correctamente en el compartimento periplásmico oxidante con la ayuda de chaperones periplásmicos, para trasladar el polipéptido a través de la membrana externa, los enlaces disulfuro deben reducirse y la proteína debe desplegarse de nuevo.
[0144] Una forma de secretar proteínas correctamente plegadas en bacterias gramnegativas, particularmente aquellas que requieren enlaces disulfuro, es dirigir al periplasma en una bacteria con una membrana externa desestabilizada. De esta manera, la proteína se moviliza al entorno oxidante y se deja plegar adecuadamente. A diferencia de los sistemas de secreción extracelular orquestados, la proteína es capaz de escapar del espacio periplásmico en una forma correctamente plegada por fuga de la membrana. Por tanto, estos mutantes gram negativos "con fugas" son capaces de secretar polipéptidos bioactivos, debidamente unidos por enlaces disulfuro. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente tienen una membrana externa "con fugas" o desestabilizada. La desestabilización de la membrana externa bacteriana para inducir fugas se puede lograr eliminando o mutagenizando genes responsables de unir la membrana externa al esqueleto rígido de peptidoglicano, incluidos, por ejemplo, lpp, ompC, ompA, ompF, tolA, tolB, pal, degS, degP, y nlpl. Lpp es el polipéptido más abundante en la célula bacteriana que existe en aproximadamente 500.000 copias por célula y funciona como la "grapa" principal de la pared celular bacteriana al peptidoglicano. Silhavy, TJ, Kahne, D. y Walker, S. The bacterial cell envelope. Cold Spring Harb Perspect Biol 2, a000414 (2010). Los complejos TolA-PAL y OmpA funcionan de manera similar a Lpp y son otras dianas de deleción para generar un fenotipo con fugas. Además, se han observado fenotipos con fugas cuando se desactivan las proteasas periplásmicas. El periplasma está muy densamente empaquetado con proteínas y, por lo tanto, codifica varias proteínas periplásmicas para facilitar el recambio de proteínas. La eliminación de proteasas periplásmicas, tales como degS, degP o nlpI puede inducir fenotipos con fugas al promover una acumulación excesiva de proteína periplásmica. La mutación de las proteasas también puede preservar el polipéptido efector evitando la degradación dirigida por estas proteasas. Además, una combinación de estas mutaciones puede potenciar sinérgicamente el fenotipo con fugas de la célula sin sacrificios importantes en la viabilidad celular. Por tanto, en algunas realizaciones, las bacterias manipuladas tienen uno o más genes de membrana mutados o delecionados. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente tienen un gen lpp eliminado o mutado. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente tienen uno o más genes eliminados o mutados, seleccionados entre ompA, ompA, y genes ompF. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente tienen uno o más genes delecionados o mutados, seleccionados entre los genes tolA, tolB y pal. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente tienen uno o más genes de proteasa periplásmica mutados o delecionados. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas tienen uno o más genes de proteasa periplásmicos mutados o delecionados seleccionados entre degS, degP y nlpl. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas tienen uno o más genes delecionados o mutados, seleccionados entre los genes lpp, ompA, ompA, ompF, tolA, tolB, pal, degS, degP y nlpl.
[0145] Para minimizar las alteraciones de la viabilidad celular, el fenotipo con fugas se puede hacer inducible colocando uno o más genes de proteasa de membrana o periplásmico, por ejemplo, seleccionados de lpp, ompA, ompA, ompF, tolA, tolB, pal, degS, degP y nlpl, bajo el control de un promotor inducible. Por ejemplo, la expresión de lpp u otra proteína de estabilidad de la pared celular o proteasa periplásmica puede reprimirse en condiciones en las que el polipéptido terapéutico necesita ser liberado (secretado). Por ejemplo, en condiciones de inducción se puede expresar una proteína represora de la transcripción o un ARN antisentido diseñado que reduce la transcripción o traducción de una membrana diana o un gen de proteasa periplásmico. Por el contrario, la sobreexpresión de ciertos péptidos puede resultar en un fenotipo desestabilizado, por ejemplo, sobreexpresión de colicinas o el tercer dominio topológico de TolA, en donde la sobreexpresión de péptidos puede inducirse en condiciones en las que el polipéptido terapéutico necesita ser liberado (secretado). Este tipo de estrategias desacoplarían los fenotipos frágiles y con fugas de la producción de biomasa. Por tanto, en algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente tienen uno o más genes de proteasa de membrana y/o periplásmica bajo el control de un promotor inducible.
[0146] La Tabla 15 y la Tabla 16 enumeran los sistemas de secreción para bacterias Gram positivas y bacterias Gram negativas. Estas pueden usarse para secretar polipéptidos, proteínas de interés o proteína o proteínas terapéuticas de las bacterias manipuladas, que se revisan en Milton H. Saier, Jr. Microbe/Volumen 1, Número 9, 2006 "Protein Secretion Systems in Gram-Negative Bacteria Gram-negative bacteria possess many protein secretion-membrane insertion systems that apparently evolved independently”.
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[0147] En algunas realizaciones, la bacteria manipulada genéticamente comprende un sistema de secreción nativo o no nativo descrito en este documento para la secreción de una PME, por ejemplo, PAH, PAL y/o LAAD. En algunas realizaciones, el sistema de secreción se selecciona entre los sistemas de secreción flagelar tipo III modificado, tipo I (por ejemplo, sistema de secreción de hemolisina), tipo II, tipo IV, tipo V, tipo VI y tipo VII, bombas de eflujo de múltiples fármacos por división de nodulación por resistencia (RND), un sistema de secreción de membrana única, sistemas de secreción Sec y TAT.
[0148] En algunas realizaciones, las PME secretadas por las bacterias manipuladas genéticamente se modifican para aumentar la resistencia a las proteasas. Por ejemplo, en algunas realizaciones, una o más PME administradas se modifican como se describe en Sakissian et al., 2011, Mol Genet Metab. 2011 Nov; 104 (3): 249-254.
[0149] En algunas realizaciones, la PAL secretada es Av-p.C503S/p.C565S/p.F18A PAL. En algunas realizaciones, la PAL secretada es PEG-Av-p.C503S/p.C565S/p.F18A PAL.
[0150] En algunas realizaciones, la una o más PME para la secreción están bajo el control de un promotor inducible, tal como se describe en el presente documento. En un ejemplo, una o más p Me están bajo el control del promotor FNR y se producen y secretan en condiciones anaeróbicas. En algunas realizaciones, las PME para la secreción están bajo el control del promotor ParaBAD. En algunas realizaciones, las PME para la secreción están bajo el control de un promotor constitutivo. En la presente invención, PAL está unida de manera operativa a un promotor inducible.
[0151] En algunas realizaciones en las que la una o más PME son secretadas o exportados a partir del microorganismo, el microorganismo modificado comprende la secuencia o secuencias de genes que incluye una etiqueta de secreción. En algunas realizaciones, las PME incluyen una "etiqueta de secreción" de ARN o de origen peptídico para dirigir las PME a sistemas de secreción específicos. Por ejemplo, una etiqueta de secreción para el sistema de secreción de hemolisina de tipo I está codificada en los 53 aminoácidos C-terminales de la proteína alfa hemolisina (HlyA). Señal de secreción de HlyA.
[0152] HlyB se inserta en membrana interna para formar un poro, HlyD alinea HlyB con TolC (poro de la membrana externa) formando de este modo un canal a través de la membrana interna y externa. La etiqueta de secreción C-terminal puede eliminarse mediante una escisión autocatalítica o catalizada por proteasa, por ejemplo, OmpT, liberando así la PME o PMEs en el medio extracelular.
[0153] El sistema de autosecreción de tipo V utiliza una etiqueta peptídica dependiente de Sec N-terminal (membrana interna) y una etiqueta C-terminal (membrana externa). Esto usa el sistema Sec para pasar del citoplasma al periplasma. A continuación, la etiqueta C-terminal se inserta en la membrana exterior formando un poro a través del cual pasa la "proteína pasajera". Una vez que atraviesa la membrana externa, el pasajero (molécula anticancerosa) se libera de la etiqueta C-terminal incluida en la membrana mediante un mecanismo autocatalítico similar a la inteína o mediante una proteasa unida a la membrana (es decir, OmpT). El sistema Sec elimina la etiqueta N-terminal. Por tanto, en algunas realizaciones, el sistema de secreción es capaz de eliminar esta etiqueta antes de segregar la o las PME, por ejemplo, PAL, PAH y/o LAAD de las bacterias manipuladas manipulada genéticamente. En la secreción mediada por autosecreción de Tipo V, la etiqueta de secreción de péptido N-terminal se elimina tras la translocación del péptido "pasajero" del citoplasma al compartimento periplásmico por el sistema Sec nativo. Además, una vez que el auto-secretor se transloca a través de la membrana externa, la etiqueta de secreción C-terminal puede eliminarse mediante una escisión autocatalítica o catalizada por proteasa, por ejemplo, OmpT, liberando así la molécula o moléculas anticancerígenas en el medio extracelular.
[0154] En la secreción de tipo III manipulada por flagelos, la etiqueta está codificada en la región 5' no traducida del ARNm y, por lo tanto, no hay etiqueta peptídica para escindir/eliminar. Este sistema modificado no contiene la parte de "jeringa" y en su lugar utiliza el cuerpo basal de la estructura de los flagelos como el poro para translocarse a través de ambas membranas y hacia afuera a través de los flagelos en formación. Si los genes fliC/fliD (que codifican la "cola"/látigo de los flagelos) se alteran, los flagelos no pueden formarse completamente y esto promueve la secreción general. En algunas realizaciones, la parte de la cola se puede eliminar por completo. En el sistema de secreción tradicional de Tipo III, el cuerpo basal se parece mucho a los flagelos, sin embargo, en lugar de una "cola"/látigo, el T3SS tradicional tiene una jeringa para inyectar las proteínas pasajeras en las células huésped. La etiqueta de secreción está codificada por un péptido N-terminal (las longitudes varían y hay varias etiquetas diferentes, ver PCT/US 14/020972). La etiqueta N-terminal no se elimina de los polipéptidos en este sistema de secreción.
[0155] En algunas realizaciones, la PME se expresa como proteína de fusión con los 53 aminoácidos de los extremos C de la alfa-hemolisina (hlyA) de E. coli CFT073 (etiqueta secreción C terminal).
Enzimas consumidoras de oxígeno
[0156] La actividad catalítica de LAAD depende del oxígeno y, por lo tanto, puede no ser activa en entornos anaeróbicos en el intestino, por ejemplo, el colon. El oxígeno está presente en los compartimentos más proximales del tracto gastrointestinal.
[0157] La tensión de oxígeno medida en ratones sanos se muestra en la Tabla 17. He et al, Proc Natl Acad Sci USA.
13 abr 1999; 96 (8): 4586-91; "Noninvasive measurement of anatomic structure and intraluminal oxygenation in the gastrointestinal tract of living mice with spatial and spectral EPR imaging".
[0158] Un gradiente de oxígeno marcado desde el tracto GI proximal a distal. Como señalaron He et al., el gradiente de oxígeno observado a lo largo del tracto gastrointestinal puede explicarse por una combinación de procesos. Sin desear ceñirse a la teoría, los alimentos, cuando se ingieren, se equilibran inicialmente con la tensión de oxígeno del aire ambiental. Al pasar al estómago y a continuación al intestino delgado, los niveles de oxígeno pueden descender a medida que el oxígeno se difunde a través de la membrana de la mucosa. Puede ocurrir un proceso gradual de equilibrio con los niveles capilares de oxígeno (es decir, 5-10 torr; ref. 9). Al pasar al colon, con su intensa colonización bacteriana, se producen nuevas disminuciones de la oxigenación. Finalmente, el lumen del colon distal muestra una marcada hipoxia, como se esperaba, en base a la abundancia de bacterias anaeróbicas en este sitio.
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[0159] Tal como se muestra en la Fig. 25B, la actividad de LAAD se retiene en condiciones microaeróbicas, aunque a niveles más bajos que en condiciones aeróbicas (Fig. 25A y Fig 25B). Por lo tanto, la LAAD puede estar activa en las áreas más proximales del intestino, tales como el estómago, el duodeno, el yeyuno y el íleon. Se contempla como parte de esta descripción que la LAAD expresada por las bacterias manipuladas genéticamente puede ser ventajosamente activa en un compartimento diferente que PAL, que puede expresarse en el colon si está bajo el control de un promotor FNR. En una realización, las bacterias manipuladas genéticamente expresan dos enzimas, que tienen diferentes requisitos de oxígeno y/o se inducen en diferentes condiciones de oxígeno, de modo que una PME se expresa y se activa en todo el sistema gastrointestinal. Por ejemplo, la primera enzima, por ejemplo, LAAD, que es dependiente de la presencia de oxígeno, se expresa en uno o más de estómago, duodeno e íleon bajo el control de un promotor constitutivo o inducible (tal como ParaBAD), y la segunda enzima, por ejemplo, PAL, se expresa en el colon bajo el control de un promotor FNR.
[0160] Se pueden emplear varias estrategias para aumentar aún más la actividad de LAAD en condiciones de limitación de oxígeno. Por ejemplo, la actividad de otras enzimas que consumen grandes cantidades de oxígeno se puede reducir o extinguir. Una de esas enzimas es la NADH deshidrogenasa. E. coli tiene dos NADH deshidrogenasas; nuo y ndh2, y se ha demostrado que la eliminación de ambas enzimas reduce el consumo de oxígeno en un 80 %. En algunas realizaciones, se toman medidas adicionales para conservar el oxígeno limitante, es decir, para permitir que LAAD funcione en condiciones de oxígeno exógeno más bajas en las bacterias manipuladas genéticamente que expresan LAAD. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden además una mutación en uno o más genes implicados en el consumo de oxígeno. En algunas realizaciones, se eliminan una o ambas NADH deshidrogenasas de E. coli. En algunas realizaciones, la NADH deshidrogenasa inactivada es nuo. En algunas realizaciones, la NADH deshidrogenasa inactivada es ndh2. En algunas formas de realización, nuo y ndh2 se eliminan. Otras enzimas involucradas en el metabolismo del oxígeno de E. coli también pueden estar inactivas, incluidas las enzimas de la cadena respiratoria, tal como cydB (una subunidad de oxidasa terminal de alta afinidad), cydD (una enzima necesaria para producir el citocromo D) y cyoABC (subunidades de citocromo oxidasa de baja afinidad). En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente albergan una mutación/deleción de inactivación en uno más de los genes seleccionados entre cydB, cydD y cyoABC.
[0161] Una o más PME codificadas por las bacterias manipuladas genéticamente pueden expresarse y mostrar actividad en el estómago. Una o más PME codificadas por las bacterias manipuladas genéticamente pueden expresarse y mostrar actividad en el duodeno. Una o más PME codificadas por las bacterias manipuladas genéticamente pueden expresarse y mostrar actividad en el yeyuno. Una o más PME codificadas por las bacterias manipuladas genéticamente pueden expresarse y mostrar actividad en el íleon. Una o más PME codificadas por las bacterias manipuladas genéticamente pueden expresarse y mostrar actividad en el colon.
Genes esenciales y auxótrofos
[0162] Tal como se usa en el presente documento, el término "gen esencial" se refiere a un gen que es necesario para el crecimiento celular y/o supervivencia. Los genes esenciales bacterianos son bien conocidos por los expertos en la técnica, y pueden identificarse mediante la eliminación dirigida de genes y/o mutagénesis aleatoria y cribado (ver, por ejemplo, Zhang y Lin, "DEG 5.0, a databse of essential genes in both prokaryotes and eukaryotes”, Nucl Acids Res, 2009; 37: D455-D458 y Gerdes et al.,"Essential Genes on metabolic maps", Curr Opin Biotechnol, 2006; 17 (5): 448­ 456.
[0163] Un "gen esencial" puede depender de las circunstancias y el entorno en el que vive un organismo. Por ejemplo, una mutación, modificación o escisión de un gen esencial puede dar como resultado que las bacterias manipuladas genéticamente de la divulgación se conviertan en auxótrofas. Una modificación auxotrófica está destinada a hacer que las bacterias mueran en ausencia de un nutriente agregado exógenamente esencial para la supervivencia o el crecimiento porque carecen del gen o genes necesarios para producir ese nutriente esencial. En algunas realizaciones, cualquiera de las bacterias manipuladas genéticamente descritas en el presente documento también comprende una deleción o mutación en un gen requerido para la supervivencia y/o el crecimiento celular. En una realización, el gen esencial es un gen de síntesis de ADN, por ejemplo, thyA. En otra realización, el gen esencial es un gen de síntesis de la pared celular, por ejemplo, dapA. En otra realización más, el gen esencial es un gen de aminoácido, por ejemplo, serA o MetA. Cualquier gen requerido para la supervivencia y/o el crecimiento celular puede ser dirigido, incluidos, entre otros, cysE, glnA, ilvD, leuB, lysA, serA, metA, glyA, hisB, ilvA, pheA, proA, thrC, trpC, tyrA, thyA, uraA, dapA, dapB, dapD, dapE, dapF, flhD, metB, metC, proAB y th il, siempre que el producto génico de tipo salvaje correspondiente no se produzca en la bacteria. La Tabla 18 enumera genes bacterianos de ejemplo que se pueden alterar o eliminar para producir una cepa auxotrófica. Estos incluyen, pero no se limitan a, genes necesarios para la síntesis de oligonucleótidos, síntesis de aminoácidos y síntesis de la pared celular.
T l 1 . E m l n limi n n ri n il r l n r i n n x r f
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[0164] La Tabla 19 muestra la supervivencia de varios auxótrofos de aminoácidos en el intestino del ratón, detectados 24 horas y 48 horas después de la alimentación por sonda. Estos auxótrofos se generaron usando BW25113, una cepa de E. coli que no es Nissle.
Tabla 19. Su ervivencia de auxótrofos de aminoácidos en el intestino de ratón
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[0165] Por ejemplo, la timina es un ácido nucleico necesario para el crecimiento de células bacterianas; en su ausencia, las bacterias sufren la muerte celular. El gen thyA codifica la timidilato sintetasa, una enzima que cataliza el primer paso en la síntesis de timina al convertir dUMP en dTMP (Sat et al., 2003). En algunas realizaciones, la célula bacteriana de la divulgación es un auxótrofo de thyA en el que el gen thyA está eliminado y/o reemplazado por un gen no relacionado. Un auxótrofo de thyA puede crecer sólo cuando están presentes cantidades suficientes de timina, por ejemplo, añadiendo timina al medio de crecimiento in vitro, o en presencia de niveles elevados de timina que se encuentran de forma natural en el intestino humano in vivo. En algunas realizaciones, la célula bacteriana de la divulgación es auxotrófica en un gen que se complementa cuando la bacteria está presente en el intestino de los mamíferos. Sin cantidades suficientes de timina, el auxótrofo de thyA muere. En algunas realizaciones, la modificación auxotrófica se usa para asegurar que la célula bacteriana no sobreviva en ausencia del producto génico auxotrófico (por ejemplo, fuera del intestino).
[0166] El ácido diaminopimélico (DAP) es un aminoácido sintetizado dentro de la vía de biosíntesis de la lisina y es necesario para el crecimiento de la pared celular bacteriana (Meadow et al, 1959; Clarkson et al, 1971). En algunas realizaciones, cualquiera de las bacterias manipuladas genéticamente descritas en el presente documento es un auxótrofo dapD en el que dapD se elimina y/o se reemplaza con un gen no relacionado. Un auxótrofo de dapD puede crecer sólo cuando están presentes cantidades suficientes de DAP, por ejemplo, añadiendo DAP al medio de crecimiento in vitro, o en presencia de niveles elevados de DAP que se encuentran de forma natural en el intestino humano in vivo. Sin cantidades suficientes de DAP, el auxótrofo de dapD muere. En algunas realizaciones, la modificación auxotrófica se usa para asegurar que la célula bacteriana no sobreviva en ausencia del producto génico auxotrófico (por ejemplo, fuera del intestino).
[0167] En otras realizaciones, la bacteria manipulada genéticamente de la presente descripción es un auxótrofo de uraA en el que uraA se elimina y/o se reemplaza con un gen no relacionado. El gen uraA codifica UraA, un transportador unido a la membrana que facilita la captación y el posterior metabolismo de la pirimidin uracilo (Andersen et al., 1995). Un auxótrofo de uraA sólo puede crecer cuando están presentes cantidades suficientes de uracilo, por ejemplo, añadiendo uracilo al medio de crecimiento in vitro, o en presencia de niveles elevados de uracilo que se encuentran de forma natural en el intestino humano in vivo. Sin cantidades suficientes de uracilo, el auxótrofo de uraA muere. En algunas realizaciones, se utilizan modificaciones auxotróficas para asegurar que las bacterias no sobrevivan en ausencia del producto génico auxotrófico (por ejemplo, fuera del intestino).
[0168] En las comunidades complejas, es posible que las bacterias compartan ADN. En circunstancias muy raras, una cepa bacteriana auxotrófica puede recibir ADN de una cepa no auxotrófica, que repara la deleción genómica y rescata permanentemente al auxótrofo. Por lo tanto, diseñar una cepa bacteriana con más de un auxótrofo puede disminuir en gran medida la probabilidad de que la transferencia de ADN ocurra suficientes veces para rescatar la auxotrofia. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente de la invención comprenden una deleción o mutación en dos o más genes necesarios para la supervivencia y/o el crecimiento celular.
[0169] Otros ejemplos de genes esenciales incluyen, pero no se limitan a: yhbV, yagG, hemB, secD, secF, ribD, ribE, thiL, dxs, ispA, dnaX, adk, hemH, IpxH, cysS, fold, rpIT, infC, thrS, nadE, gapA, yeaZ, aspS, argS, pgsA, yefM, metG, folE, yejM, gyrA, nrdA, nrdB, folC, accD, fabB, gltX, ligA, zipA, dapE, dapA, der, hisS, ispG, suhB, tadA, acpS, era, rnc, ftsB, eno, pyrG, chpR, Igt, fbaA, pgk, yqgD, metK, yqgF, pIsC, ygiT, pare, ribB, cca, ygjD, tdcF, yraL, yihA, ftsN, murI, murB, birA, secE, nusG, rplJ, rplL, rpoB, rpoC, ubiA, plsB, lexA, dnaB, ssb, alsK, groS, psd, orn, yjeE, rpsR, chpS, ppa, valS, yjgP, yjgQ, dnaC, ribF, lspA, ispH, dapB, folA, imp, yabQ, ftsL, ftsI, murE, murF, mraY, murD, ftsW, murG, murC, ftsQ, ftsA, ftsZ, lpxC, secM, secA, can, folK, hemL, yadR, dapD, map, rpsB, infB ,nusA, ftsH, obgE, rpmA, rplU, ispB, murA, yrbB, yrbK, yhbN, rpsI, rplM, degS, mreD, mreC, mreB, accB, accC, yrdC, def, fmt, rplQ, rpoA, rpsD, rpsK, rpsM, entD, mrdB, mrdA, nadD, hlepB, rpoE, pssA, yfiO, rplS, trmD, rpsP, ffh, grpE, yfjB, csrA, ispF, ispD, rplW, rplD, rplC, rpsJ, fusA, rpsG, rpsL, trpS, yrjF, asd, rpoH, ftsX, ftsE, ftsY, frr, dxr, ispU, rfaK, kdtA, coaD, rpmB, dfp, dut, gmk, spot, gyrB, dnaN, dnaA, rpmH, rnpA, yidC, tnaB, glmS, glmU, wzyE, hemD, hemC, yigP, ubiB, ubiD, hemG, secY, rplO, rpmD, rpsE, rplR, rplF, rpsH, rpsN, rplE, rplX, rplN, rpsQ, rpmC, rplP, rpsC, rplV, rpsS, rplB, cdsA, yaeL, yaeT, lpxD, fabZ, lpxA, lpxB, dnaE, accA, tilS, proS, yafF, tsf, pyrH, olA, rlpB, leuS, lnt, glnS, fldA, cydA, infA, cydC, ftsK, lolA, serS, rpsA, msbA, lpxK, kdsB, mukF, mukE, mukB, asnS, fabA, mviN, rne, yceQ, fabD, fabG, acpP, tmk, holB, lolC, lolD, lolE, purB, ymjK, minE, mind, pth, rsA, ispE, lolB, hemA, prfA, prmC, kdsA, topA, ribA, fabI, racR, dicA, ydfB, tyrS, ribC, ydiL, pheT, pheS, yhhQ, bcsB, glyQ, yibJ, y gpsA. Los expertos en la técnica conocen otros genes esenciales.
[0170] En algunas realizaciones, la bacteria manipulada genéticamente de la presente descripción es una célula bacteriana sintética con gen esencial dependiente de ligando gen esencial (SLiDE). Las células bacterianas SLiDE son auxótrofos sintéticos con una mutación en uno o más genes esenciales que solo crecen en presencia de un ligando en particular (ver Lopez y Anderson, "Synthetic Auxotrophs with Ligand-Depdent Essential Genes for a BL21 (DE3) Biosafety Strain” ACS Synth Biol 2015; 4 (12): 1279-1286.
[0171] En algunas realizaciones, la célula bacteriana SLiDE comprende una mutación en un gen esencial. En algunas realizaciones, el gen esencial se selecciona del grupo que consiste en pheS, dnaN, tyrS, metG y adk. En algunas realizaciones, el gen esencial es dnaN que comprende una o más de las siguientes mutaciones: H191N, R240C, I317S, F319V, L340T, V347I y S345C. En algunas realizaciones, el gen esencial es dnaN que comprende las mutaciones H191N, R240C, I317S, F319V, L340T, V347I y S345C. En algunas realizaciones, el gen esencial es pheS que comprende una o más de las siguientes mutaciones: F125G, P183T, P184A, R186A e I188L. En algunas realizaciones, el gen esencial es pheS que comprende las mutaciones F125G, P183T, P184A, R186A e I188L. En algunas realizaciones, el gen esencial es tyrS que comprende una o más de las siguientes mutaciones: L36V, C38A y F40G. En algunas realizaciones, el gen esencial es tyrS que comprende las mutaciones L36V, C38A y F40G. En algunas realizaciones, el gen esencial es metG que comprende una o más de las siguientes mutaciones: e45Q, N47R, I49G y A51C. En algunas realizaciones, el gen esencial es metG que comprende las mutaciones E45Q, N47R, I49G y A51C. En algunas realizaciones, el gen esencial es adk que comprende una o más de las siguientes mutaciones: I4L, L5I y L6G. En algunas realizaciones, el gen esencial es adk que comprende las mutaciones I4L, L5I y L6G.
[0172] En algunas realizaciones, la bacteria manipulada genéticamente se complementa con un ligando. En algunas realizaciones, el ligando se selecciona del grupo que consiste en benzotiazol, indol, 2-aminobenzotiazol, ácido indol-3-butírico, ácido indol-3-acético y éster metílico de L-histidina. Por ejemplo, las células bacterianas que comprenden mutaciones en metG (E45Q, N47r , I49G y A51C) se complementan con benzotiazol, indol, 2-aminobenzotiazol, ácido indol-3-butírico, ácido indol-3-acético o éster metílico de L-histidina. Las células bacterianas que comprenden mutaciones en dnaN (H191N, R240C, I317S, F319V, L340T, V347I y S345C) se complementan con benzotiazol, indol o 2-aminobenzotiazol. Las células bacterianas que comprenden mutaciones en pheS (F125G, P183T, P184A, R186A e I188L) se complementan con benzotiazol o 2-aminobenzotiazol. Las células bacterianas que comprenden mutaciones en tyrS (L36V, C38A y F40G) se complementan con benzotiazol o 2-aminobenzotiazol. Las células bacterianas que comprenden mutaciones en adk (I4L, L5I y L6G) se complementan con benzotiazol o indol.
[0173] En algunas realizaciones, la bacteria manipulada genéticamente comprende más de un gen esencial mutante que hace que sea auxotrófico a un ligando. En algunas realizaciones, la célula bacteriana comprende mutaciones en dos genes esenciales. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la célula bacteriana comprende mutaciones en tyrS (L36V, C38A y F40G) y metG (E45Q, N47R, I49G y A51C). En otras realizaciones, la célula bacteriana comprende mutaciones en tres genes esenciales. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la célula bacteriana comprende mutaciones en tyrS (L36V, C38A y F40G), metG (E45Q, N47R, I49G y A51C) y pheS (F125G, P183T, P184A, R186A e I188L).
[0174] En algunas realizaciones, la bacteria manipulada genéticamente es un auxótrofo condicional cuya gen o genes esenciales se sustituyen utilizando el sistema de arabinosa que se muestra en las Figs. 43-47.
[0175] En algunas realizaciones, la bacteria manipulada genéticamente de la divulgación es un auxótrofo y también comprende circuitos de interruptores de destrucción, tales como cualquiera de los componentes y sistemas de interruptores de destrucción descritos en el presente documento. Por ejemplo, las bacterias manipuladas genéticamente pueden comprender una deleción o mutación en un gen esencial necesario para la supervivencia y/o el crecimiento celular, por ejemplo, en un gen de síntesis de ADN, por ejemplo, thyA, el gen de síntesis de la pared celular, por ejemplo, dapA y/o un gen de aminoácidos, por ejemplo, serA o MetA y también puede comprender un gen de toxina que está regulado por uno o más activadores transcripcionales que se expresan en respuesta a una condición o condiciones y/o señal o señales ambientales (tales como el sistema de arabinosa descrito) o regulado por una o más recombinasas que se expresan al detectar una condición o condiciones y/o señal o señales ambientales exógenas (tales como los sistemas de recombinasas descritos en este documento). Otras realizaciones se describen en Wright et al., "GeneGuard: A Modular Plasmid System Designed for Biosafety", ACS Synth Biol, 2015; 4 (3): 307-316).
[0176] En algunas realizaciones, la bacteria manipulada genéticamente de la descripción es un auxótrofo y comprende también un circuito interruptor de destrucción, tal como cualquiera de los componentes interruptores y sistemas de destrucción descritos en este documento, así como otro sistema de bioseguridad, tal comoun origen condicional de la replicación (Wright et al., 2015).
[0177] La adición de un Phe-auxótrofo, también, puede tener utilidad para aumentar la velocidad de degradación de fenilalanina. Por ejemplo, la deleción del gen pheA concede auxótrofo para fenilalanina. La desactivación de la producción de fenilalanina bacteriana endógena puede llevar al aumento de absorción del ambiente y, también, dar lugar a degradación aumentada de fenilalanina absorbida del ambiente.
Circuitos de Regulación Genética
[0178] En algunas realizaciones, la bacteria manipulada genéticamente comprende circuitos multicapa de regulación genética para expresar las construcciones descritas en el presente documento (véanse, por ejemplo, Solicitud Provisional de e Eu U Número 62/184.811).
[0179] Los circuitos de regulación genética son útiles para cribar las bacterias mutantes, que producen enzima, que metaboliza fenilalanina, o rescata un auxótrofo. Se describen en el presente documento los procedimientos, que se pueden utilizar para seleccionar las bacterias manipuladas genéticamente, que producen uno o más genes de interés.
[0180] Se describen en el presente documento las bacterias manipuladas genéticamente, que comprenden un gen o un casete génico para producir una enzima, que metaboliza fenilalanina (por ejemplo, PAL o PAH), y un circuito de regulación genética regulado por T7 polimerasa. Por ejemplo, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden un primer gen, que codifica una T7 polimerasa, donde el primer gen se une de manera operativa con un promotor sensible a FNR; un segundo gen o un casete génico para producir una enzima, que metaboliza fenilalanina, donde el segundo gen o el casete génico se une de manera operativa con un promotor T7, que se induce mediante la T7 polimerasa; y un tercer gen, que codifica un factor de inhibición, lysY, que es capaz de inhibir la T7 polimerasa. En presencia de oxígeno, FNR no se une con el promotor sensible a FNR, y la enzima, que metaboliza fenilalanina, no se expresa. LysY se expresa de manera constitutiva (P-lac constitutivo) y, además, inhibe la T7 polimerasa. En ausencia de oxígeno, FNR se dimeriza y se une con el promotor sensible a FNR, se expresa la T7 polimerasa en un nivel suficiente para superar la inhibición lysY y se expresa la enzima, que metaboliza fenilalanina. En algunas realizaciones, el gen lysY se une de manera operativa con un sitio de unión FNR adicional. En ausencia de oxígeno, FNR se dimeriza para activar la expresión de T7 polimerasa como se describe anteriormente y, también, inhibe la expresión lysY.
[0181] Se describen en el presente documento las bacterias manipuladas genéticamente, que comprenden un gen o un casete génico para producir una enzima, que metaboliza fenilalanina (por ejemplo, PAL o PAH), y un circuito de regulación genética regulado por proteasa. Por ejemplo, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden un primer gen, que codifica una mf-Ion proteasa, donde el primer gen se une de manera operativa con un promotor sensible a FNR; un segundo gen o un casete génico para producir una enzima, que metaboliza fenilalanina, que se une de manera operativa con una región reguladora Tet (TetO); y un tercer gen, que codifica una señal de degradación mf-Ion, que se une a un represor Tet (TetR), donde el TetR es capaz de unirse con la región reguladora Tet y reprimir la expresión del segundo gen o el casete génico. La proteasa mf-Ion es capaz de reconocer la señal de degradación mf-Ion y de degradar el TetR. En presencia de oxígeno, FNR no se une con el promotor sensible a FNR, el represor no se degrada y la enzima, que metaboliza fenilalanina, no se expresa. En ausencia de oxígeno, FNR se dimeriza y se une con el promotor sensible a FNR, induciendo, de este modo, la expresión de la proteasa mf-Ion. La proteasa mf-Ion reconoce la señal de degradación mf-Ion y degrada el TetR y se expresa la enzima, que metaboliza fenilalanina.
[0182] Se describen en el presente documento las bacterias manipuladas genéticamente, que comprenden un gen o un casete génico para producir una enzima, que metaboliza fenilalanina (por ejemplo, PAL o PAH), y un circuito de regulación genética regulado por represor. Por ejemplo, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden un primer gen, que codifica un primer represor, donde el primer gen se une de manera operativa con un promotor sensible a FNR; un segundo gen o un casete génico para producir una enzima, que metaboliza fenilalanina, que se une de manera operativa con una primera región reguladora, que comprende un promotor constitutivo; y un tercer gen, que codifica un segundo represor, donde el segundo represor es capaz de unirse con la primera región reguladora y reprimir la expresión del segundo gen o el casete génico. El tercer gen se une de manera operativa con una segunda región reguladora, que comprende un promotor constitutivo, donde el primer represor es capaz de unirse con la segunda región reguladora e inhibir la expresión del segundo represor. En presencia de oxígeno, FNR no se une con el promotor sensible a FNR, el primer represor no se expresa, el segundo represor se expresa y la enzima, que metaboliza fenilalanina, no se expresa. En ausencia de oxígeno, FNR se dimeriza y se une con el promotor sensible a FNR, se expresa el primer represor, el segundo represor no se expresa y se expresa la enzima, que metaboliza fenilalanina.
[0183] Los ejemplos de represores útiles en estas bacterias incluyen, pero no se limitan a, ArgR, TetR, ArsR, AscG, LacI, CscR, DeoR, DgoR, FruR, GalR, GatR, CI, LexA, RafR, QacR y PtxS (US20030166191).
[0184] Se describen en el presente documento las bacterias manipuladas genéticamente, que comprenden un gen o un casete génico para producir una enzima, que metaboliza fenilalanina (por ejemplo, PAL o PAH), y un circuito de regulación genética regulado por ARN regulador. Por ejemplo, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden un primer gen, que codifica un ARN regulador, donde el primer gen se une de manera operativa con un promotor sensible a FNR y un segundo gen o un casete génico para producir una enzima, que metaboliza fenilalanina. El segundo gen o el casete génico se une de manera operativa con un promotor constitutivo y, además, se une con una secuencia de nucleótidos capaz de producir una horquilla de ARNm, que inhibe la traducción de la enzima, que metaboliza fenilalanina. El ARN regulador es capaz de eliminar la horquilla de ARNm e inducir la traducción vía el sitio de unión con ribosoma. En presencia de oxígeno, FNR no se une con el promotor sensible a FNR, el ARN regulador no se expresa y la horquilla de ARNm impide que se traduzca la enzima, que metaboliza fenilalanina. En ausencia de oxígeno, FNR se dimeriza y se une con el promotor sensible a FNR, se expresa el ARN regulador, se elimina la horquilla de ARNm y se expresa la enzima, que metaboliza fenilalanina.
[0185] Se describen en el presente documento las bacterias manipuladas genéticamente, que comprenden un gen o un casete génico para producir una enzima, que metaboliza fenilalanina (por ejemplo, PAL o PAH), y un circuito de regulación genética regulado por CRISPR. Por ejemplo, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden una proteína Cas9; un primer gen, que codifica un ARN guía de CRISPR, donde el primer gen se une de manera operativa con un promotor sensible a f NR; un segundo gen o un casete génico para producir una enzima, que metaboliza fenilalanina, donde el segundo gen o el casete génico se une de manera operativa con una región reguladora, que comprende un promotor constitutivo; y un tercer gen, que codifica un represor, que se une de manera operativa con un promotor constitutivo, donde el represor es capaz de unirse con la región reguladora y reprimir la expresión del segundo gen o el casete génico. El tercer gen se une, además, con una secuencia diana CRISPR, que es capaz de unirse con el ARN guía de CRISPR, donde dicha unión con el ARN guía de CRISPR incluye la escisión mediante la proteína Cas9 e inhibe la expresión del represor. En presencia de oxígeno, FNR no se une con el promotor sensible a FNR, el ARN guía no se expresa, el represor se expresa y la enzima, que metaboliza fenilalanina, no se expresa. En ausencia de oxígeno, FNR se dimeriza y se une con el promotor sensible a FNR, se expresa el ARN guía, el represor no se expresa y se expresa la enzima, que metaboliza fenilalanina.
[0186] Se describen en el presente documento las bacterias manipuladas genéticamente, que comprenden un gen o un casete génico para producir una enzima, que metaboliza fenilalanina (por ejemplo, PAL o PAH), y un circuito de regulación genética regulado por recombinasa. Por ejemplo, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden un primer gen, que codifica una recombinasa, donde el primer gen se une de manera operativa con un promotor sensible a FNR y un segundo gen o un casete génico para producir una enzima, que metaboliza fenilalanina, que se une de manera operativa con un promotor constitutivo. El segundo gen o el casete génico se invierte en orientación (3' hacia 5') y se flanquea por los sitios de unión de recombinasa, y la recombinasa es capaz de unirse con sitios de unión de recombinasa para inducir la expresión del segundo gen o el casete génico revertiendo su orientación (5' hacia 3'). En presencia de oxígeno, FNR no se une con el promotor sensible a FNR, la recombinasa no se expresa, el gen o el casete génico permanece en la orientación 3' hacia 5' y se produce la enzima, que metaboliza fenilalanina. En ausencia de oxígeno, FNR se dimeriza y se une con el promotor sensible a FNR, la recombinasa se expresa, el gen o el casete génico revierte a la orientación 5' hacia 3' y se produce una enzima funcional, que metaboliza fenilalanina (ver, por ejemplo, Figura 42).
[0187] Se describen en el presente documento las bacterias manipuladas genéticamente, que comprenden un gen o un casete génico para producir una enzima, que metaboliza fenilalanina (por ejemplo, PAL o PAH), y un circuito de regulación genética regulado por polimerasa y recombinasa. Por ejemplo, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden un primer gen, que codifica una recombinasa, donde el primer gen se une de manera operativa con un promotor sensible a FNR; un segundo gen o un casete génico para producir una enzima, que metaboliza fenilalanina, que se une de manera operativa con un promotor T7; y un tercer gen, que codifica una T7 polimerasa, donde la T7 polimerasa es capaz de unirse con el promotor T7 e inducir la expresión de la enzima, que metaboliza fenilalanina. El tercer gen, que codifica la T7 polimerasa se invierte en orientación (3' hacia 5') y se flanquea por los sitios de unión de recombinasa, y la recombinasa es capaz de unirse con sitios de unión de recombinasa para inducir la expresión del gen T7 polimerasa revertiendo su orientación (5' hacia 3'). En presencia de oxígeno, FNR no se une con el promotor sensible a FNR, la recombinasa no se expresa, el gen T7 polimerasa permanece en la orientación 3' hacia 5' y no se expresa la enzima, que metaboliza fenilalanina. En ausencia de oxígeno, FNR se dimeriza y se une con el promotor sensible a FNR, la recombinasa se expresa, el gen T7 polimerasa revierte la orientación 5' hacia 3' y se expresa la enzima, que metaboliza fenilalanina (ver, por ejemplo, Figura 43).
[0188] Los circuitos génicos sintéticos, que se expresan sobre plásmidos, pueden funcionar bien a corto plazo, pero pierden su habilidad y/o función a largo plazo (Danino et al., 2015). En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden circuitos estables para expresar genes de interés durante periodos prolongados. En el presente documento se describen las bacterias manipuladas genéticamente capaces de producir una enzima, que metaboliza fenilalanina (por ejemplo, PAL o PAH) y comprenden, además, un sistema de toxina antitoxina, que produce simultáneamente una toxina (hok) y una antitoxina efímera (sok), donde la perdida del plásmido causa la muerte celular por la toxina longeva (Danino et al., 2015). Las bacterias manipuladas genéticamente pueden comprender, además, alp 7 de B. subtilis plásmido pL20 y producen filamentos, que son capaces de empujar los plásmidos a los polos de las células para asegurar la secreción igual durante la división celular (Danino et al., 2015).
Dependencia Mutua de Huésped-Plásmido
[0189] En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente de la invención comprenden, además, un plásmido, que se ha modificado para crear una dependencia mutua de huésped-plásmido. En determinadas realizaciones, la plataforma de huésped-plásmido dependientes mutuamente es GeneGuard (Wright et al., 2015). En algunas realizaciones, el plásmido GeneGuard comprende (i) una fuente condicional de replicación, donde el requisito de proteína iniciadora de replicación se proporciona en trans; (ii) una modificación auxótrofa, que se rescata por el huésped utilizando translocación genómica y, también, es compatible para su uso en un medio rico; y/o (iii) una secuencia de ácido nucleico, que codifica una toxina de espectro amplio. Se puede utilizar el gen de toxina para la selección contra el plásmido extendido por la producción desfavorable de ADN de plásmido en sí para cepas, que no expresan la antitoxina (por ejemplo, una bacteria de tipo salvaje). En algunas realizaciones, el plásmido GeneGuard es estable durante al menos 100 generaciones sin selección antibiótica. En algunas realizaciones, el plásmido GeneGuard no altera el crecimiento del huésped. El plásmido GeneGuard se usa para reducir enormemente la propagación involuntaria de plásmido en las bacterias manipuladas genéticamente de la invención.
[0190] La plataforma de huésped-plásmido dependientes mutuamente se puede utilizar sola o en combinación con otros mecanismos de bioseguridad, tales como descritos en el presente documento (por ejemplo, interruptores de la matanza, auxótrofos). En otras realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden un plásmido GeneGuard. En otras realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden un plásmido GeneGuard y/o uno o más interruptores de la matanza. En otras realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden un plásmido GeneGuard y/o uno o más auxótrofos. En otras realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden un plásmido GeneGuard, uno o más interruptores de la matanza y/o uno o más auxótrofos.
Interruptor de destrucción
[0191] En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente de la invención comprenden, también, un interruptor de la matanza (ver, por ejemplo, Solicitudes Provisionales de EEUU Números 62/183.935 y 62/263.329). El interruptor de la matanza sirve para matar activamente bacterias manipuladas genéticamente en respuesta a un estímulo externo. Al contrario que una mutación auxótrofa, donde bacteria muere debido a falta de un nutriente esencial para la supervivencia, el interruptor de la matanza se activa mediante un factor particular en el ambiente, que induce la producción de moléculas tóxicas dentro del microbio, que causa muerte celular.
[0192] Las bacterias, que comprenden interruptores de la matanza, se han manipulada con fines de investigación in vitro, por ejemplo, para limitar la propagación de un microorganismo, que produce biocombustible, fuera de un ambiente de laboratorio. Las bacterias manipuladas para la administración in vivo para tratar una enfermedad se pueden programar, también, para morir en un tiempo específico después de la expresión y la administración de un gen o genes heterólogo(s), por ejemplo, una enzima, que metaboliza fenilalanina, o después de que el sujeto haya experimentado el efecto terapéutico. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el interruptor de la matanza se activa para matar a la bacteria después de un periodo de tiempo después de la expresión dependiente de nivel de oxígeno de la enzima, que metaboliza fenilalanina (por ejemplo, PAL o PAH) y/o el gen transportador de fenilalanina. En algunas realizaciones, el interruptor de la matanza se activa en un modo retrasado después de la expresión dependiente de nivel de oxígeno de la enzima, que metaboliza fenilalanina, y/o el gen transportador de fenilalanina. Alternativamente, las bacterias pueden modificarse para morir después de que las bacterias se han propagado fuera de un sitio de enfermedad. Específicamente, puede ser útil para prevenir la colonización a largo plazo de sujetos por el microorganismo, la propagación del microorganismo fuera del área de interés (por ejemplo, fuera de los intestinos) dentro del sujeto, o la propagación del microorganismo fuera del sujeto en el ambiente (por ejemplo, la propagación al ambiente a través de la deposición del sujeto). Los ejemplos de tales toxinas, que se pueden utilizar en interruptores de la matanza, incluyen, pero no se limitan a, bacteriocinas, lisinas y otras moléculas, que causan muerte celular mediante lisis de membranas celulares, degradación de ADN celular u otros mecanismos. Tales toxinas se pueden utilizar individualmente o en combinación. Los interruptores, que controlan su producción pueden tener base en, por ejemplo, activación transcripcional (interruptores de conmutación; ver, por ejemplo, Gardner et al., 2000), traducción (riborreguladores), o recombinación de ADN (interruptores basados en recombinasa) y pueden detectar el estímulo ambiental, tal como anaerobiosis o especies reactivas de oxígeno. Estos interruptores se pueden activar mediante un factor ambiental único o pueden necesitar varios activadores en configuraciones lógicas AND, OR, NAND y NOR para inducir la muerte celular. Por ejemplo, un interruptor de riborregulador AND se activa mediante tetraciclina, isopropil p -D-1- tiogalactopiranósido (IPTg ) y arabinosa para la expresión de lisinas, que permeabiliza la membrana celular y mata la célula. IPTG induce la expresión de los ARNm de endolisina y holina, que se desreprimieron a continuación mediante la adición de arabinosa y tetraciclina. Todos los tres inductores tienen que estar presentes para causar la muerte celular. Los ejemplos de interruptores de la matanza se conocen en la técnica (Callura et al., 2010).
[0193] Los interruptores de la matanza se pueden modificar de tal modo que se produce una toxina en respuesta a una condición ambiental o una señal externa (por ejemplo, bacteria se mata en respuesta a una señal externa) o, alternativamente, diseñados de tal modo, que se produce una toxina, cuando ya no existe más una condición ambiental o se detiene una señal externa.
[0194] Por consiguiente, en algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente de la divulgación se programan más para morir después de detectar una señal ambiental exógena, por ejemplo, en un ambiente de oxígeno bajo. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente de la presente divulgación comprenden uno o más genes, que codifican una o más recombinasa(s), cuya expresión se induce en respuesta a una condición o señal ambiental y causa uno o más sucesos de recombinación, que básicamente lleva a la expresión de una toxina, que mata la célula. En algunas realizaciones, al menos un suceso de recombinación es la vuelta de un gen heterólogo invertido, que codifica una toxina bacteriana, que, a continuación, se expresa de manera constitutiva después del giro utilizando la primera recombinasa. En una realización, la expresión constitutiva de la toxina bacteriana mata las bacterias manipuladas genéticamente. En estos tipos de sistemas de interruptores de la matanza, cuando la célula bacteriana manipulada detecta la condición ambiental exógena y expresa el gen heterólogo de interés, la célula bacteriana recombinante ya no es viable.
[0195] En otra realización, donde la bacterias manipuladas genéticamente de la presente divulgación expresan una o más recombinasa(s) en respuesta a una condición o una señal ambiental, que causa al menos un suceso de recombinación, la bacteria manipulada genéticamente expresa, además, un gen heterólogo, que codifica una antitoxina, en respuesta a una condición o una señal ambiental exógena. En algunas realizaciones, al menos un suceso de recombinación es la vuelta de un gen heterólogo invertido, que codifica una toxina bacteriana, utilizando una primera recombinasa. En una realización, el gen heterólogo invertido, que codifica la toxina bacteriana, está ubicado entre una secuencia de reconocimiento de primera recombinasa directa y una secuencia de reconocimiento de primera recombinasa reversa. En una realización, el gen heterólogo, que codifica la toxina bacteriana, se expresa de manera constitutiva después de su giro mediante la primera recombinasa. En una realización, la antitoxina inhibe la actividad de la toxina, retrasando, de este modo, la muerte de la bacteria manipulada genéticamente. En una realización, la bacteria manipulada genéticamente se mata utilizando la toxina bacteriana, cuando el gen heterólogo, que codifica la antitoxina ya no se expresa, cuando la condición ambiental exógena ya no está presente.
[0196] En otra realización, al menos una suceso de recombinación es un giro de un gen heterólogo invertido, que codifica una segunda recombinasa, mediante una primera recombinasa, seguido del giro de un gen heterólogo invertido, que codifica una toxina bacteriana, mediante la segunda recombinasa. En una realización, el gen heterólogo invertido, que codifica la segunda recombinasa, está ubicado entre una secuencia de reconocimiento de primera recombinasa directa y una secuencia de reconocimiento de primera recombinasa reversa. En una realización, el gen heterólogo invertido, que codifica la toxina bacteriana, está ubicado entre una secuencia de reconocimiento de segunda recombinasa directa y una secuencia de reconocimiento de segunda recombinasa reversa. En una realización, el gen heterólogo, que codifica la segunda recombinasa, se expresa de manera constitutiva después de su giro mediante la primera recombinasa. En una realización, el gen heterólogo, que codifica la toxina bacteriana, se expresa de manera constitutiva después de su giro mediante la segunda recombinasa. En una realización, la bacteria manipulada genéticamente se mata utilizando la toxina bacteriana. En una realización, la bacteria manipulada genéticamente se expresa aun más un gen heterólogo, que codifica una antitoxina, en respuesta a una condición ambiental exógena. En una realización, la antitoxina inhibe la actividad de la toxina, cuando está presente la condición ambiental exógena, retrasando, de este modo, la muerte de la bacteria manipulada genéticamente. En una realización, la bacteria manipulada genéticamente se mata utilizando la toxina bacteriana, cuando el gen heterólogo, que codifica la antitoxina ya no se expresa, cuando la condición ambiental exógena ya no está presente.
[0197] En una realización, al menos una suceso de recombinación es un giro de un gen heterólogo invertido, que codifica una segunda recombinasa, mediante una primera recombinasa, seguido del giro de un gen heterólogo invertido, que codifica una tercera recombinasa, seguido del giro de un gen heterólogo invertido, que codifica una toxina bacteriana, utilizando la tercera recombinasa.
[0198] En una realización, al menos un suceso de recombinación es el giro de un gen heterólogo invertido, que codifica una primera enzima de escisión, utilizando una primera recombinasa. En una realización, el gen heterólogo invertido, que codifica la primera enzima de escisión, está ubicado entre una secuencia de reconocimiento de primera recombinasa directa y una secuencia de reconocimiento de primera recombinasa reversa. En una realización, el gen heterólogo, que codifica la primera enzima de escisión, se expresa de manera constitutiva después de su giro mediante la primera recombinasa. En una realización, la primera enzima de escisión elimina un primer gen esencial. En una realización, la célula bacteriana recombinante programada no es viable después de que se elimina el primer gen esencial.
[0199] En una realización, la primera recombinasa, además, da un giro a un gen heterólogo invertido, que codifica una segunda enzima de escisión. En una realización, el gen heterólogo invertido, que codifica la segunda enzima de escisión, está ubicado entre una secuencia de reconocimiento de segunda recombinasa directa y una secuencia de reconocimiento de segunda recombinasa reversa. En una realización, el gen heterólogo, que codifica la segunda enzima de escisión, se expresa de manera constitutiva después de su giro mediante la primera recombinasa. En una realización, la bacteria manipulada genéticamente muere o ya no es viable, cuando se eliminan ambos el primer gen esencial y el segundo gen esencial. En una realización, la bacteria manipulada genéticamente muere o ya no es viable, cuando se elimina el primer gen esencial o se elimina el segundo gen esencial utilizando la primera recombinasa.
[0200] En una realización, la bacteria manipulada genéticamente muere después de que ocurra al menos un suceso de recombinación. En otra realización, la bacteria manipulada genéticamente ya no es viable después de que ocurra al menos un suceso de recombinación.
[0201] En cualquiera de estas realizaciones, la recombinasa puede ser una recombinasa seleccionada del grupo, que consiste en: Bxbl, PhiC31, TP901, BxbI, PhiC31, TP901, HK022, HP1, R4, Int1, Int2, Int3, Int4, Int5, Int6, Int7, Int8, Int9, Int10, Int11, Int12, Int13, Int14, Int15, Int16, Int17, Int18, Int19, Int20, Int21, Int22, Int23, Int24, Int25, Int26, Int27, Int28, Int29, Int30, Int31, Int32, Int33 y Int34, o un fragmento activo biológicamente de la misma.
[0202] En los circuitos de interruptores de la matanza descritos anteriormente se produce una toxina en presencia de un factor o una señal ambiental. En otro aspecto del sistema de interruptores de la matanza, se puede reprimir una toxina en presencia de un factor ambiental (es decir, no se produce) y, a continuación, se produce, cuando la condición ambiental o la señal externa ya no está presente. Tales interruptores de la matanza se llaman interruptores de la matanza basados en represión y representan sistemas, donde las células bacterianas solamente son viables en presencia de un factor o una señal externo, tal como arabinosa u otro azúcar. Los diseños de interruptores de la matanza, donde se reprime la toxina en presencia de un factor o una señal externo (y se activa cuando se elimina la señal externa), se muestran en las Figuras 43-47. La divulgación proporciona células bacterianas, que expresan uno o más gen(es) heterólogo(s) al detectar arabinosa u otro azúcar en el ambiente exógeno. En este aspecto, las células bacterianas recombinantes contienen el gen araC, que codifica el factor de transcripción AraC, así como también, uno o más genes bajo el control del promotor araBAD (ParaBAD). En ausencia de arabinosa, el factor de transcripción AraC adopta una conformación, que reprime la transcripción de genes bajo el control del promotor araBAD. En presencia de arabinosa, el factor de transcripción AraC se somete a un cambio conformacional, que le permite unirse a y activar el promotor araBAD, que induce la expresión del gen deseado, por ejemplo TetR, que reprime la expresión de un gen de toxina. En esta realización, el gen de toxina se reprime en presencia de arabinosa u otro azúcar. En un ambiente, donde arabinosa no está presente, el gen TetR no se activa y se expresa la toxina, matando, de este modo, a las bacterias. El sistema de arabinosa se puede utilizar, también, para expresar un gen esencial, donde el gen esencial se expresa solamente en presencia de arabinosa u otro azúcar y no se expresa, cuando arabinosa u otro azúcar está ausente en el ambiente.
[0203] Por consiguiente, en algunas realizaciones, donde uno o más gen(es) se expresa(n) al detectar arabinosa en el ambiente exógeno, el uno o más genes heterólogos están directamente o indirectamente bajo el control del promotor araBAD. En algunas realizaciones, se selecciona el gen heterólogo expresado de uno o más de los siguientes: un gen terapéutico heterólogo, un gen heterólogo, que codifica una antitoxina, un gen heterólogo, que codifica una proteína o un polipéptido represor, por ejemplo, un represor TetR, un gen heterólogo, que codifica una proteína esencial, que no se encuentra en la célula bacteriana, y/o un heterólogo, que codifica una proteína o un polipéptido regulador.
[0204] Se conocen en la técnica los promotores inducibles por arabinosa, que incluyen Para, ParaB, ParaC y ParaBAD. En una realización, el promotor inducible por arabinosa es de E. coli. En algunas realizaciones, el promotor ParaC y el promotor ParaBAD funcionan como un promotor bidireccional, donde el promotor ParaBAD controla la expresión de un gen(es) heterólogo(s) en una dirección, y el ParaC (en proximidad cercana a, y en la cadena opuesta al promotor ParaBAD), controla la expresión de un gen(es) heterólogo(s) en la otra dirección. En presencia de arabinosa, se induce la transcripción de ambos genes heterólogos de ambos promotores. Sin embargo, en ausencia de arabinosa, no se induce la transcripción de ambos genes heterólogos de ambos promotores.
[0205] En una realización de ejemplo de la divulgación, las bacterias manipuladas genéticamente de la presente divulgación contienen un interruptor de la matanza, que tiene al menos las siguiente secuencias: un promotor ParaBAD unido de manera operativa con un gen heterólogo, que codifica una proteína represora de tetraciclina (TetR), un promotor ParaC, que se une de manera operativa con un gen heterólogo, que codifica el factor de transcripción AraC, y un gen heterólogo, que codifica una toxina bacteriana, que se une de manera operativa con un promotor, que se reprime mediante la proteína TetR. En presencia de arabinosa, el factor de transcripción AraC activa el promotor ParaBAD, que activa la transcripción de la proteína TetR, que, a su vez, reprime la transcripción de la toxina. Sin embargo, en ausencia de arabinosa, AraC reprime la transcripción para el promotor ParaBAD y no se expresa ninguna proteína TetR. En este caso, se activa la expresión del gen de toxina heteróloga, y se expresa la toxina. La toxina se acumula en la célula bacteriana recombinante y la célula bacteriana recombinante se muere. En una realización, el gen araC, que codifica el factor de transcripción AraC está bajo el control de un promotor constitutivo y, por lo tanto, se expresa de manera constitutiva.
[0206] En una realización de la divulgación, la bacteria manipulada genéticamente comprende, además, una antitoxina bajo el control de un promotor constitutivo. En esta situación, en presencia de arabinosa, la toxina no se expresa debido a la represión mediante proteína TetR y se acumula la proteína de antitoxina en la célula. Sin embargo, en ausencia de arabinosa, la proteína TetR no se expresa y se induce la expresión de la toxina. La toxina empieza a acumularse dentro de la célula bacteriana recombinante. La célula bacteriana recombinante ya no es viable, cuando la proteína de toxina está presente o en cantidades iguales o mayores que las de la proteína de antitoxina en la célula y la célula bacteriana recombinante morirá debido a la toxina.
[0207] En otra realización de la divulgación, la bacteria manipulada genéticamente comprende, además, una antitoxina bajo el control de un promotor ParaBAD. En esta situación, en presencia de arabinosa, TetR y la antitoxina se expresan, la antitoxina se acumula en la célula y la toxina no se expresa debido a la represión mediante proteína TetR. Sin embargo, en ausencia de arabinosa, ambos la proteína TetR y la antitoxina no se expresan y se induce la expresión de la toxina. La toxina empieza a acumularse dentro de la célula bacteriana recombinante. La célula bacteriana recombinante ya no es viable, cuando la proteína de toxina se expresa y la célula bacteriana recombinante morirá debido la toxina.
[0208] En otra realización de ejemplo de la divulgación, las bacterias manipuladas genéticamente de la presente divulgación contienen un interruptor de la matanza, que tiene al menos las siguientes secuencias: un promotor ParaBAD unido de manera operativa con un gen heterólogo, que codifica un polipéptido esencial, que no se encuentra en la célula bacteriana recombinante (y es necesario para supervivencia), y un promotor ParaC unido de manera operativa con un gen heterólogo, que codifica el factor de transcripción AraC. En presencia de arabinosa, el factor de transcripción AraC activa el promotor ParaBAD, que activa la transcripción del gen heterólogo, que codifica el polipéptido esencial, permitiendo la supervivencia de la célula bacteriana recombinante. Sin embargo, en ausencia de arabinosa, AraC reprime la transcripción para el promotor ParaBAD y la proteína esencial, necesaria para supervivencia, no se expresa. En este caso, la célula bacteriana recombinante muere en ausencia de arabinosa. En algunas realizaciones, la secuencia de promotor ParaBAD, que se une de manera operativa con un gen heterólogo, que codifica un polipéptido esencial, que no se encuentra en la célula bacteriana recombinante, puede estar presente en la célula bacteriana conjuntamente con el sistema de interruptores de la matanza TetR/toxina descrito directamente anteriormente. En algunas realizaciones, la secuencia de promotor ParaBAD, que se une de manera operativa con un gen heterólogo, que codifica un polipéptido esencial, que no se encuentra en la célula bacteriana recombinante, puede estar presente en la célula bacteriana conjuntamente con el sistema de interruptores de la matanza TetR/toxina/antitoxina descrito directamente anteriormente.
[0209] En otras realizaciones más, las bacterias pueden comprender un sistema estable de plásmido con un plásmido, que produce ambos una antitoxina efímera y una toxina longeva. En este sistema, la célula bacteriana produce cantidades iguales de toxina y antitoxina para neutralizar la toxina. Sin embargo, si/cuando la célula pierde del plásmido, la antitoxina efímera empieza a descomponerse. Cuando la antitoxina se descompone completamente, la célula muere como un resultado de que la toxina longeva la mata.
[0210] En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas de la presente divulgación comprenden, además, el(los) gen(es), que codifica(n) los componentes de cualquiera de los circuitos de interruptores de la matanza descritos anteriormente.
[0211] En cualquiera de las realizaciones descritas anteriormente, la toxina bacteriana se selecciona del grupo, que consiste en una lisina, Hok, Fst, TisB, LdrD, Kid, SymE, MazF, FlmA, Ibs, XCV2162, dinJ, CcdB, MazF, ParE, YafO, Zeta, hicB, relB, yhaV, yoeB, chpBK, hipA, microcina B, microcina B17, microcina C, microcina C7-C51, microcina J25, microcina ColV, microcina 24, microcina L, microcina D93, microcina L, microcina E492, microcina H47, microcina 147, microcina M, colicina A, colicina E1, colicina K, colicina N, colicina U, colicina B, colicina la, colicina Ib, colicina 5, colicina 10, colicina S4, colicina Y, colicina E2, colicina E7, colicina E8, colicina E9, colicina E3, colicina E4, colicina E6, colicina E5, colicina D, colicina M y cloacina DF13 o un fragmento biológicamente activo de la misma.
[0212] En cualquiera de las realizaciones descritas anteriormente, la antitoxina se selecciona del grupo, que consiste en una antilisina, Sok, RNAII, IstR, RdlD, Kis, SymR, MazE, FlmB, Sib, ptaRNA1, yafQ, CcdA, MazE, ParD, yafN, Epsilon, HicA, relE, prlF, yefM, chpBI, hipB, MccE, MccECTD, MccF, Cai, ImmE1, Cki, Cni, Cui, Cbi, Iia, Imm, Cfi, Im10, Csi, Cyi, Im2, Im7, Im8, Im9, Im3, Im4, ImmE6, proteína de inmunidad contra cloacina (Cim), ImmE5, ImmD y Cmi o un fragmento biológicamente activo de la misma.
[0213] En una realización, la toxina bacteriana es bactericida para la bacteria manipulada genéticamente. En una realización, la toxina bacteriana es bacteriostática para la bacteria manipulada genéticamente.
[0214] En algunas realizaciones, la bacteria manipulada genéticamente proporcionada en el presente documento es un auxótrofo. En una realización, la bacteria manipulada genéticamente es un auxótrofo seleccionado de un auxótrofo cysE, glnA, ilvD, leuB, lysA, serA, metA, glyA, hisB, ilvA, pheA, proA, thrC, trpC, tyrA, thyA, uraA, dapA, dapB, dapD, dapE, dapF, flhD, metB, metC, proAB y th il. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas tienen más de un auxótrofo, por ejemplo, pueden ser un auxótrofo AthyA y AdapA.
[0215] En algunas realizaciones, la bacteria manipulada genéticamente proporcionada en el presente documento comprende, además, un circuito de interruptores de la matanza, tales como, cualquiera de los circuitos de interruptores de la matanza proporcionados en el presente documento. Por ejemplo, en algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden, además, uno o más genes, que codifican una o más recombina(s) bajo el control de un promotor inducible y una secuencia de toxina invertida. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden uno o más genes, que codifican una antitoxina. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden, además, uno o más genes, que codifican una o más recombinasa(s) bajo el control de un promotor inducible y uno o más genes de escisión invertidos, donde el(los) gen(es) de escisión, codifica(n) una enzima, que elimina un gen esencial. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden uno o más genes, que codifican una antitoxina. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden, además, uno o más genes, que codifican una toxina bajo el control de un promotor, que tiene un sitio de unión con represor TetR y un gen, que codifica el TetR, bajo el control de un promotor inducible, que se induce por arabinosa, tal como, ParaBAD. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden uno o más genes, que codifican una antitoxina.
[0216] En algunas realizaciones, la bacteria manipulada genéticamente es un auxótrofo, que comprende un gen, que codifica una enzima, que metaboliza fenilalanina, y comprende, además, un circuito de interruptores de la matanza, tales como, cualquiera de los circuitos de interruptores de la matanza descritos en el presente documento.
[0217] En algunas realizaciones, de las bacterias manipuladas genéticamente descritas anteriormente, el gen o el casete génico para producir la enzima, que metaboliza fenilalanina, está presente sobre un plásmido en la bacteria y está unido de manera operativa sobre el plásmido con el promotor, que se induce en condiciones de oxígeno bajo o anaeróbicas. En otras realizaciones, el gen o el casete génico para producir la enzima, que metaboliza fenilalanina, está presente sobre en el cromosoma bacteriano y está unido de manera operativa en el cromosoma con el promotor, que se induce en condiciones de oxígeno bajo o anaeróbicas.
Composiciones y formulaciones farmacéuticas
[0218] Las composiciones farmacéuticas, que comprenden las bacterias manipuladas genéticamente de la invención, se pueden utilizar para tratar, gestionar, aliviar y/o prevenir enfermedades asociadas con hiperfenilalaninemia, por ejemplo, PKU. Se proporcionan las composiciones farmacéuticas de la invención, que comprenden una o más bacterias manipuladas, solas o en combinación con agentes profilácticos, agentes terapéuticos y/o portadores farmacéuticamente aceptables. En determinadas realizaciones, la composición farmacéutica comprende una especie, cepa o subtipo de bacterias, que se modifican para comprender las modificaciones genéticas descritas en el presente documento. En realizaciones alternativas, la composición farmacéutica comprende dos o más especies, cepas o subtipos de bacterias, donde se modifica cada uno para comprender las modificaciones genéticas descritas en el presente documento.
[0219] Las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento se pueden preparar de una manera convencional utilizando uno o más portadores fisiológicamente aceptables, que comprenden excipientes y asistentes, que facilitan el procesamiento de los ingredientes activos en las composiciones para el uso farmacéutico. Se conocen en la técnica los procedimientos de formulación de composiciones farmacéuticas (véanse, por ejemplo, "Remington's Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, PA). En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas se someten a conversión en pastillas, liofilización, compresión directa, mezcla convencional, disolución, granulación, levigación, emulsificación, encapsulación, atrapamiento o secado por spray para formar comprimidos, granulados, nanopartículas, nanocápsulas, microcápsulas, microcomprimidos, bolitas o polvos, que pueden estar totalmente recubiertos o no recubiertos. La formulación adecuada depende de la vía de administración.
[0220] Las bacterias manipuladas genéticamente descritas en el presente documento se pueden preparar en composiciones farmacéuticas en cualquier forma de administración adecuada (por ejemplo, líquidos, cápsulas, sobres, cápsulas duras, cápsulas blandas, comprimidos, comprimidos con recubrimiento entérico, polvos de suspensión, gránulos o formulaciones de liberación sostenida matrices para la administración oral) y para cualquier tipo adecuado de administración (por ejemplo, tópico, inyectable, liberación inmediata, liberación pulsátil, liberación retardada o liberación sostenida). Las cantidades de dosis adecuada para las bacterias manipuladas genéticamente pueden oscilar desde aproximadamente 105 hasta 1012 bacterias, por ejemplo, aproximadamente 105 bacterias, aproximadamente 106 bacterias, aproximadamente 107 bacterias, aproximadamente 108 bacterias, aproximadamente 109 bacterias, aproximadamente 1010 bacterias, aproximadamente 1011 bacterias o aproximadamente 1011 bacterias. Se puede administrar la composición una vez o más al día, semanalmente o mensualmente. Se puede administrar la composición antes, durante o después de una comida. En una realización, la composición farmacéutica se administra antes de que el sujeto coma una comida. En una realización, la composición farmacéutica se administra durante una comida. En una realización, la composición farmacéutica se administra después de que el sujeto coma una comida.
[0221] Las bacterias manipuladas genéticamente se pueden preparar en composiciones farmacéuticas, que comprenden uno o más portadores, espesantes, diluyentes, tampones, agentes tampón, agentes activos de superficie, lípidos neutrales o catiónicos, compuestos lipídicos, liposomas, potenciadores de penetración, compuestos portadores farmacéuticamente aceptables y otros portadores o agentes farmacéuticamente aceptables. Por ejemplo, la composición farmacéutica puede incluir, pero no se limita a, la adición de bicarbonato de calcio, bicarbonato sódico, fosfato de calcio, varios azucares y tipos de almidón, derivados de celulosa, gelatina, aceites vegetales, polietilenglicoles y tensioactivos, que incluyen, por ejemplo, polisorbato. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente de la invención se pueden preparar en una solución de bicarbonato sódico, por ejemplo, solución de 1 molar de bicarbonato sódico (para amortiguar un ambiente celular ácido, tal como, el estómago, por ejemplo). Las bacterias manipuladas genéticamente se pueden administrar y preparar como formas neutrales o saladas. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen aquellas formadas con aniones, tales como, derivados de ácidos hidroclóricos, fosfóricos, acéticos, oxálicos, tartáricos, etc. y aquellas formadas con cationes, tales como, aquellos derivados de sodio, potasio, amonio, calcio, hidróxidos férricos, isopropilamina, trietilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína, etc.
[0222] Las bacterias manipuladas genéticamente divulgadas en el presente documento se pueden administrar localmente y preparar en la forma de un ungüento, crema, parche transdérmico, loción, gel, champú, spray, aerosol, solución, emulsión u otra forma bien conocida por un experto en la técnica. Ver, por ejemplo, "Remington's Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, PA. En una realización, para formas de administración tópicas no pulverizables, se utilizan formas viscosas a semisólidas o sólidas, que comprenden un portador o uno o más excipientes compatibles con aplicación tópica y que tienen una viscosidad dinámica mayor que agua. Las formulaciones adecuadas incluyen, pero no se limitan a, soluciones, suspensiones, emulsiones, cremas, ungüentos, polvos, linimentos, pomadas, etc., que se pueden esterilizar o mezclar con agentes auxiliares (por ejemplo, conservantes, estabilizadores, agentes humidificantes, tampones o sales) para influenciar diferentes propiedades, por ejemplo, presión osmótica. Otras formas de administración tópicas adecuadas incluyen preparaciones de aerosol pulverizables, donde el ingrediente activo en combinación con un portador sólido o líquido se envasa en una mezcla con un compuesto volátil presurizado (por ejemplo, un propulsor gaseoso, tal como, freón) o en una botella a presión. Se pueden añadir, también, los hidratantes o los humidificantes a composiciones farmacéuticas y formas de administración. Los ejemplos de tales ingredientes adicionales se conocen bien en la técnica. En una realización, la composición farmacéutica, que comprende las bacterias recombinantes de la invención, se puede preparar como un producto de higiene. Por ejemplo, el producto de higiene puede ser una formulación antibacteriana o un producto de fermentación, tal como, un caldo de fermentación. Los productos de higiene pueden ser, por ejemplo, champús, acondicionadores, cremas, pastas, lociones y bálsamos labiales.
[0223] Las bacterias manipuladas genéticamente divulgadas en el presente documento se pueden administrar por la vía oral y preparar como comprimidos, pastillas, grageas, cápsulas, líquidos, geles, siropes, lechadas, suspensiones, etc. Las composiciones farmacológicas para el uso oral se pueden fabricar utilizando un excipiente sólido, opcionalmente, moliendo la mezcla resultante, y procesando la mezcla de gránulos después de añadir auxiliares adecuados, si se desea, para obtener comprimidos o núcleos de grageas. Los excipientes adecuados incluyen, pero no se limitan a, rellenos, tales como, azúcares, que incluyen lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol; composiciones de celulosa, tales como, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata, gelatina, goma tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carbometilcelulosa sódica; y/o polímeros fisiológicamente aceptables, tales como, polivinilpirrolidona (PVP) o polietilenglicol (PEG). Se puede añadir agentes desintegrantes, tales como, polivinilpirrolidona, agar, ácido algínico o una sal de los mismos, tal como, alginato de sodio.
[0224] Los comprimidos o las cápsulas se pueden preparar utilizando los procedimientos convencionales con excipientes farmacéuticamente aceptables, tales como, agentes de unión (por ejemplo, almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona, hidroxipropil metilcelulosa, carboximetilcelulosa, polietilenglicol, sacarosa, glucosa, sorbitol, almidón, goma, caolín y tragacanto); rellenos (por ejemplo, lactosa, celulosa microcristalina o fosfato hidrogenado de calcio); lubricantes (por ejemplo, calcio, aluminio, zinc, ácido esteárico, polietilenglicol, lauril sulfato de sodio, almidón, benzoato de sodio, L-leucina, estearato de magnesio, talco o sílice); desintegrantes (por ejemplo, almidón, almidón de patata, almidón de glicolato de sodio, azúcares, derivados de celulosa, polvos de sílice); o agentes humidificantes (por ejemplo, lauril sulfato de sodio). Los comprimidos se pueden recubrir utilizando los procedimientos conocidos en la técnica. Puede existir un recubrimiento de capa e incluir membranas comunes, pero no estar limitado a, polilactida, ácido poliglicólico, polianhídrido, otros polímeros biodegradables, alginato-polilisina-alginato (APA), alginato-polimetileno, co-guanidina-alginato (A-PMCG- A), hidroximetilacrilato-metilmetacrilato (HEMA-MMA), HEMA-MMA-m Aa multicapa, poliacrilonitrilovinilcloruro (PAN-PVC), metallilsulfonato de acrilonitrilo/sodio (AN-69), polietilenglicol/polipentametilciclopentasiloxano/polidimetilsiloxano (PEG/PD5/PDMS), poli N,N-dimetilacrilamida (PDMAAm), encapsulados de silíceo, sulfato de celulosa/alginato de sodio/polimetileno-co-guanidina (CS/A/PMCG), acetato ftalato de celulosa, alginato de calcio, perlas de gel de k-carragenano-goma garrofín, perlas de gellan-xantano, poli(lactida-co-glicólidos), carragenano, polianhídridos de almidón, polimetacrilatos, poliamino-ácidos y polímeros con revestimiento entérico.
[0225] En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente tienen un recubrimiento entérico para liberación en los intestinos o en una región particular de los intestinos, por ejemplo, el intestino grueso. El perfil de pH típico del estómago hasta el colon es aproximadamente 1-4 (estómago), 5,5-6 (duodeno), 7,3-8,0 (ileno) y 5,5-6,5 (colon). En algunas enfermedades, se puede modificar el perfil de pH. En algunas realizaciones, el recubrimiento se degrada en ambientes de pH específico para especificar el sitio de liberación. En algunas realizaciones, se utilizan al menos dos recubrimientos. En algunas realizaciones, el recubrimiento externo y el recubrimiento interno se degradan en distintos niveles de pH.
[0226] Las preparaciones líquidas para la administración oral pueden tener forma de soluciones, siropes, suspensiones o un producto seco para composiciones con agua u otro vehículo adecuado antes de su uso. Tales preparaciones líquidas se pueden preparar utilizando los procedimientos convencionales con agentes farmacéuticamente aceptables, tales como, agentes de suspensión (por ejemplo, sirope de sorbitol, derivados de celulosa o ácidos comestibles hidrogenados); agentes emulsionantes (por ejemplo, lecitina o acacia); vehículos no acuosos (por ejemplo, aceite de almendras, ésteres grasos, alcohol etílico o aceites vegetales fraccionados); y conservantes (por ejemplo, metil o propil-p-hidroxibenzoatos o ácido sórbico). Las preparaciones pueden contener, también, sales tampones, agentes saborizantes, colorantes y edulcorantes como correspondientes. Las preparaciones para la administración oral se pueden preparar para liberación lenta, liberación controlada o liberación sostenida de las bacterias manipuladas genéticamente descritas en el presente documento.
[0227] En una realización, las bacterias manipuladas genéticamente de la divulgación se pueden preparar en una composición adecuada para administración a sujetos de pediatría. Como se conoce bien en la técnica, niños se diferencian de adultos en muchos aspectos, incluyendo diferentes tasas de vaciamiento gástrico, pH, permeabilidad gastrointestinal, etc. (Ivanovska et al., 2014). Además, la aceptabilidad y las preferencias de formulación pediátrica, tales como, vía de administración y características de sabor, son críticas para alcanzar conformidad pediátrica aceptable. Por consiguiente, en una realización, la composición adecuada para administración a sujetos de pediatría puede incluir formas de administración fáciles de tragar o solubles, o composiciones más sabrosas, tales como, composiciones con sabores añadidos, edulcorantes o bloqueadores de sabor. En una realización, una composición adecuada para administración a sujetos de pediatría, también, puede ser adecuada para administración a adultos.
[0228] En una realización, la composición adecuada para administración a sujetos de pediatría puede incluir una solución, sirope, suspensión, elixir, polvo para reconstrucción como suspensión o solución, comprimido dispersable/efervescente, comprimido masticable, gominola, piruleta, helado, tableta, chicle, tira fina oral, comprimido, que se desintegra por vía oral, sobre, cápsulas blandas de gelatina, polvos orales espolvorear o gránulos. En una realización, la composición es una gominola, que se fabrica a partir de una base de gelatina, dando al caramelo elasticidad, consistencia de masticación deseada y vida útil más larga. En algunas realizaciones, las gominolas pueden comprender, también, edulcorantes o sabores.
[0229] En una realización, la composición adecuada para administración a sujetos de pediatría puede incluir un sabor. Como se usa en el presente documento, «sabor» es una sustancia (líquido o sólido), que proporciona un sabor y aroma distintos a la formulación. Los sabores ayudan, también, a mejorar la palatabilidad de la formulación. Los sabores incluyen, pero no se limitan a, fresa, vainilla, limón, uva, chicle y cereza.
[0230] En determinadas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente se pueden administrar por la vía oral, por ejemplo, con un diluyente inerte o un portador comestible asimilable. También, se puede envolver el compuesto en una cápsula de gelatina de capa dura o blanda, comprimir en comprimidos o incorporar directamente a la dieta de sujeto. Para la administración terapéutica oral, se pueden incorporar los compuestos con excipientes y usarlos en forma de comprimidos ingeridos, comprimidos bucales, pastillas, cápsulas, elixires, suspensiones, siropes, obleas y los similares. Para administrar un compuesto por una vía distinta a la administración parenteral, puede ser necesario recubrir el compuesto con o administrar conjuntamente el compuesto con, un material para prevenir su desactivación.
[0231] En otra realización, la composición farmacéutica, que comprende las bacterias recombinantes de la invención, puede ser un producto comestible, por ejemplo, un producto de alimentación. En una realización, el producto de alimentación es leche, leche concentrada, leche fermentada (yogur, leche agria, yogur helado, bebidas fermentadas con bacterias de ácido láctico), leche en polvo, helado, quesos cremosos, quesos secos, leche de soja, leche de soja fermentada, zumos vegetales-de frutas, zumos de frutas, bebidas deportivas, dulces, caramelos, alimentos infantiles (tales como, tartas infantiles), productos de alimentación nutritiva, alimentación animal o suplementos dietéticos. En una realización, el producto de alimentación es un alimento fermentado, tal como, producto lácteo fermentado. En una realización, el producto lácteo fermentado es yogur. En otra realización, el producto lácteo fermentado es queso, leche, nata, helado, batido de leche o kéfir. En otra realización, las bacterias recombinantes de la invención se combinan en un recubrimiento de preparación, que contiene otras células bacterianas vivas, que tienen como fin servir como probióticos. En otra realización, el producto de alimentación es una bebida. En una realización, la bebida es una bebida basada en zumo de frutas o una bebida, que contiene extractos de plantas o hierbas. En otra realización, el producto de alimentación es una gelatina o un pudín. Otros productos de alimentación adecuados para administración de las bacterias recombinantes de la invención se conocen en la técnica. Ver, por ejemplo, US 2015/0359894 y US 2015/0238545.
[0232] En otra realización adicional, la composición farmacéutica de la invención se inyecta en, se pulveriza sobre o se espolvorea sobre un producto de alimentación, tal como, pan, yogur o queso.
[0233] En algunas realizaciones, la composiciones se prepara para administración intraintestinal, administración intrayeyunal, administración intraduodenal, administración intraileal, administración con shunt gástrico o administración intracólica, por medio de nanopartículas, nanocápsulas, microcápsulas o microcomprimidos, que están recubiertos completamente o no recubiertos. Las composiciones farmacéuticas se pueden preparar, también, como composiciones rectales, tales como, supositorios o enemas de retención, utilizando, por ejemplo, bases de supositorios convencionales, tales como, manteca de cacao u otros glicéridos. Las composiciones pueden ser suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos grasos o acuosos y pueden contener agentes de suspensión, estabilización y/o dispersión.
[0234] Se puede administrar las bacterias manipuladas genéticamente descritas en el presente documento por la vía intranasal, preparadas en una forma de aerosol, spray, nebulización o en forma de gotas, y administrarlas de manera conveniente en forma de una presentación de aerosol spray de lotes comprimidos o un nebulizador, con el uso de un propulsor adecuado (por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado). Las unidades de dosificación en aerosol presurizado se pueden determinar proporcionando una válvula para administrar una cantidad dosificada. Las cápsulas y los cartuchos (por ejemplo, de gelatina) para el uso en un inhalador o un insuflador se pueden preparar con contenido de una mezcla de polvo del compuesto y una base de polvo adecuado, tal como, lactosa o almidón.
[0235] Las bacterias manipuladas genéticamente se pueden administrar y preparar como preparaciones de depósito. Tales formulaciones de acción prolongada pueden administrarse mediante implantación o mediante inyección, incluyendo inyección intravenosa, inyección subcutánea, inyección local, inyección directa o infusión. Por ejemplo, las composiciones pueden formularse con materiales poliméricos o hidrófobos adecuados (por ejemplo, como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o como derivados poco solubles (por ejemplo, como una sal poco soluble).
[0236] Por ejemplo, las composiciones se pueden preparar con materiales poliméricos o hidrofóbicos adecuados (por ejemplo, como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o como derivados moderadamente solubles (por ejemplo, como una sal moderadamente soluble).
[0236] En algunas realizaciones, se dan a conocer en el presente documento composiciones farmacéuticamente aceptables en formas de administración únicas. Las formas de administración únicas pueden ser líquidas o sólidas. Las formas de administración únicas se pueden administrar directamente a un paciente sin modificación o se pueden diluir o reconstruir antes de administración. En determinadas realizaciones, una forma de administración única se puede administrar en bolus, por ejemplo, inyección única, dosis oral única, incluyendo una dosis oral, que comprende múltiples comprimidos, cápsulas, pastillas, etc. En realizaciones alternativas, una forma de administración única se puede administrar durante un periodo de tiempo, por ejemplo, mediante infusión.
[0237] Las formas de administración únicas de la composición farmacéutica se pueden preparar dividiendo la composición farmacéutica en partes alícuota más pequeñas, envases de dosis únicas, formas líquidas de dosis únicas o formas sólidas de dosis únicas, tales como, comprimidos, granulados, nanopartículas, nanocápsulas, micropartículas, microcomprimidos, bolitas o polvos, que se pueden recubrir o no de manera entérica. Una dosis única en una forma sólida se puede reconstituir añadiendo líquido, típicamente agua estéril o solución salina, antes de administración a un paciente.
[0238] En otras realizaciones, la composición se puede administrar en un sistema de liberación controlada o liberación sostenida. En una realización, se puede utilizar una bomba para conseguir liberación controlada o sostenida. En otra realización, se puede utilizar los materiales poliméricos para conseguir liberación controlada o sostenida de las terapias de la presente divulgación (ver, por ejemplo, la Patente de EEUU Número 5.989.463). Los ejemplos de polímeros utilizados en formulaciones de liberación sostenida incluyen, pero no se limitan a, poli(2-hidroxietilo metacrilato), poli(metil metacrilato), poli(ácido acrílico), poli(etileno-co-vinil acetato), poli(ácido metacrílico), poliglicólidos (PLG), polianhídridos, poli(N- vinilpirrolidona), poli(alcohol vinílico), poliacrilamida, poli(etilenglicol), polilactidas (PLA), poli(lactida-co-glicólidos) (PLGA) y poliortoésteres. El polímero utilizado en una formulación de liberación sostenida puede ser inerte, libre de impurezas lixiviables, estable para almacenar y biodegradable. En algunas realizaciones, un sistema de liberación controlada o sostenida se puede ubicar en proximidad con la diana profiláctica o terapéutica, requiriendo, de este modo, únicamente una fracción de la dosis sistemática. Se puede utilizar cualquier técnica adecuada conocida por un experto.
[0239] Los regímenes de dosificación se pueden modificar para proporcionar una respuesta terapéutica. La dosis puede depender de varios factores, que incluyen severidad y capacidad de respuesta de la enfermedad, vía de administración, curso temporal de tratamiento (días a meses a años) y tiempo de mejora de la enfermedad. Por ejemplo, un bolus único se puede administrar a la vez, varias dosis divididas se pueden administrar durante un periodo de tiempo predeterminado o la dosis se puede reducir o incrementar como se indica por la situación terapéutica. La especificación para la dosis se dicta por las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular a conseguir. Los valores de dosis pueden variar debido al tipo y la severidad de la afección a paliar. Para cualquier sujeto particular, se pueden modificar los regímenes de dosis específicas durante un tiempo, según la necesidad individual y el juicio profesional del médico, que lo trata. La toxicidad y la eficacia terapéutica de compuestos proporcionados en el presente documento se pueden determinar utilizando los procedimientos farmacéuticos estándares en cultivo celular o modelos de animales. Por ejemplo, se pueden determinar LD50, ED50, EC50 y IC50 y se puede calcular la proporción de dosis entre efectos tóxicos y terapéuticos (LD50/ED50) como el índice terapéutico. Se pueden utilizar las composiciones, que muestran efectos secundarios, con modificaciones cuidadosas para minimizar daño potencial para reducir efectos secundarios. Se puede calcular la dosis inicialmente a partir de los ensayos de cultivos celulares y modelos de animales. Los datos obtenidos a partir de los ensayos in vitro y in vivo y estudios de animales se pueden utilizar en preparación de una variedad de dosis para su uso en humanos.
[0240] Los ingredientes se suministran por separado o mezclados en una forma de unidad de toma, por ejemplo, como un polvo liofilizado seco o un concentrado libre de agua en un envase sellado, tal como, una ampolla o un sobre indicando la cantidad de agente activo. Si el modo de administración es mediante inyección, se puede proporcionar una ampolla de agua estéril para inyección o solución salina, de tal modo, que los ingredientes se pueden mezclar antes de la administración.
[0241] Las composiciones farmacéuticas se pueden envasar en un contenedor herméticamente sellado, tal como, una ampolla o un sobre indicando la cantidad del agente. En una realización, una o más composiciones farmacéuticas se suministra(n) como un polvo liofilizado estéril o un concentrado libre de agua en un contenedor sellado herméticamente y se puede(n) reconstituir (por ejemplo, con agua o solución salina) hasta la concentración adecuada para la administración a un sujeto. En una realización, uno o más de los agentes profilácticos o terapéuticos o las composiciones farmacéuticas se proporcionan como un polvo liofilizado estéril seco en un contenedor herméticamente sellado almacenado entre 2° C y 8° C y administrado en 1 hora, en 3 horas, en 5 horas, en 6 horas, en 12 horas, en 24 horas, en 48 horas, en 72 horas o dentro de una semana después de su reconstrucción. Se pueden incluir los crioprotectores para una forma de administración liofilizada, principalmente, 0-10% de sacarosa (óptimamente 0,5-1,0%). Otros crioprotectores adecuados incluyen trehalosa y lactosa. Otros agentes volumétricos adecuados incluyen glicina y arginina, cada uno de los cuales se puede incluir con una concentración de 0-0,05% y polisorbato-80 (óptimamente incluidos con una concentración de 0,005-0,01%). Los tensioactivos adicionales incluyen, pero no se limitan a, polisorbato y tensioactivos BRIJ. La composición farmacéutica se puede preparar como una solución inyectable y puede comprender, además, un agente útil como un adyuvante, tal como, aquellos, que se utilizan para aumentar absorción o dispersión, por ejemplo, hialuronidasa.
Procedimientos de tratamiento
[0242] Otro aspecto de la invención se refiere al tratamiento de una enfermedad asociada con hiperfenilalaninemia o síntomas asociados con hiperfenilalaninemia. Por consiguiente, la invención se refiere a una bacteria manipulada genéticamente de la invención o una composición de la invención para su uso en un procedimiento de reducción de hiperfenilalaninemia o tratamiento de una enfermedad asociada con hiperfenilalaninemia. En algunas realizaciones, la enfermedad se selecciona del grupo, que consiste en: fenilcetonuria, fenilcetonuria clásica o típica, fenilcetonuria atípica, hiperfenilalaninemia leve permanente, hiperfenilalaninemia no fenilcetonúrica, deficiencia de fenilalanina hidroxilasa, deficiencia de cofactor, deficiencia de dihidropteridina reductasa, deficiencia de tetrahidropterina sintasa y enfermedad de Segawa. En algunas realizaciones, hiperfenilalaninemia es secundaria con respecto a otras afecciones, por ejemplo, enfermedades de hígado. En otras realizaciones, la invención se refiere a reducción, mejora o eliminación de uno o más síntoma(s) asociado(s) con estas enfermedades, que incluyen, pero no se limitan a, déficits neurológicos, retraso mental, encefalopatía, epilepsia, eczema, menor crecimiento, microcefalia, temblor, espasticidad de extremidades y/o hipopigmentación. En algunas realizaciones, el sujeto a tratar es un paciente humano.
[0243] En determinadas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente son capaces de metabolizar fenilalanina en la dieta para tratar una enfermedad o un trastorno asociad con hiperfenilalaninemia, por ejemplo, PKU. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente se administran simultáneamente con proteína dietética. En otras realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente no se administran simultáneamente con proteína dietética. Los estudios han demostrado que las secreciones pancreáticas y de otras glándulas en los intestinos contienen niveles altos de proteínas, enzimas y polipéptidos, y que los aminoácidos producidos como un resultado de su catabolismo se reabsorben de nuevo en la sangre en un proceso conocido como «recirculación entero» (Chang, 2007; Sarkissian et al., 1999). Por consiguiente, los altos niveles intestinales de fenilalanina pueden ser parcialmente independientes de ingesta de comida y están disponibles para descomposición mediante PAL. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente y la proteína dietética se administran después de un periodo de ayuno o una dieta restringida en fenilalanina. En estas realizaciones, un paciente, que sufra de hiperfenilalaninemia, puede ser capaz de continuar una dieta normal considerablemente o una dieta que es menos restrictiva que una dieta libre de fenilalanina. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente pueden ser capaces de metabolizar fenilalanina a partir de las fuentes adicionales, por ejemplo, la sangre, para tratar una enfermedad asociada con hiperfenilalaninemia, por ejemplo, PKU. En estas realizaciones, no es necesario administrar las bacterias manipuladas genéticamente simultáneamente con proteína dietética, y se genera un gradiente de fenilalanina, por ejemplo, de sangre a intestinos, y la bacteria manipulada genéticamente metaboliza fenilalanina y reduce fenilalanina.
[0244] El procedimiento puede comprender preparación de una composición farmacéutica con al menos una especie, cepa o subtipo de bacterias modificado genéticamente descrito en el presente documento y administración de la composición farmacéutica a un sujeto en una cantidad terapéuticamente eficaz. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente de la invención se administran por la vía oral, por ejemplo, en una suspensión líquida. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente de la invención se liofilizan en una cápsula de gelatina y se administran por la vía oral. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente de la invención se administran a través de un tubo de alimentación o un shunt gástrico. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente de la invención se administran por la vía rectal, por ejemplo, utilizando una enema. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente de la invención se administran localmente, por la vía intraintestinal, intrayeyunal, intraduodenal, intraileal y/o intracólica.
[0245] En determinadas realizaciones, la composición farmacéutica descrita en el presente documento se administra para reducir niveles de fenilalanina en un sujeto. En algunas realizaciones, los procedimientos de la presente divulgación reducen los niveles de fenilalanina en un sujeto de al menos aproximadamente 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o más en comparación con los niveles en un sujeto no tratado o controlado. En algunas realizaciones, la reducción se mide comparando el nivel de fenilalanina en un sujeto antes y después de administrar la composición farmacéutica. En algunas realizaciones, el tratamiento o la mejora de hiperfenilalaninemia permite mejorar uno o más síntomas de la afección o el trastorno en al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o más.
[0246] Antes, durante y después de la administración de la composición farmacéutica, los niveles de fenilalanina en el sujeto se pueden medir en una muestra biológica, tal como, sangre, suero, plasma, orina, fluido peritoneal, fluido cerebroespinal, materia fecal, raspaduras de mucosa intestinal, una muestra recogida de un tejido y/o una muestra recogida de los contenidos de uno o más de los siguientes: el estómago, duodeno, yeyuno, íleo, colon, recto y canal anal. En algunas realizaciones, los procedimientos pueden incluir administración de las composiciones de la invención para reducir fenilalanina. En algunas realizaciones, los procedimientos pueden incluir administración de las composiciones de la invención para reducir fenilalanina hasta niveles no detectables en un sujeto. En algunas realizaciones, los procedimientos pueden incluir administración de las composiciones de la invención para reducir concentraciones de fenilalanina hasta niveles no detectables o menos que aproximadamente 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75% o 80% de los niveles de fenilalanina en el sujeto antes del tratamiento.
[0247] En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente son E. coli Nissle. Las bacterias manipuladas genéticamente se pueden destruir, por ejemplo, utilizando factores de defensa en los intestinos o el suero sanguíneo (Sonnenborn et al., 2009) o mediante activación de un interruptor de la matanza, varias horas o días después de la administración. Por consiguiente, la composición farmacéutica, que comprende las bacterias manipuladas genéticamente, se puede volver a administrar en una dosis y frecuencia terapéuticamente eficaz. La longitud de residencia Nissle in vivo en un ratón se muestra en la Figura 38. En realizaciones alternativas, las bacterias manipuladas genéticamente no se destruyen en horas o días después de la administración y pueden propagarse y colonizar los intestinos.
[0248] La invención puede comprender administración de la composición farmacéutica sola o en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra conjuntamente con el cofactor de tetrahidrobiopterina (por ejemplo, Kuvan/sapropterina), aminoácidos neutrales largos (por ejemplo, tirosina, triptófano), glicomacropéptidos, un probiótico (por ejemplo, VSL3), una enzima (por ejemplo, PAL pegilado) y/u otros agentes utilizados en el tratamiento de fenilcetonuria (A1Hafid y Christodoulou, 2015).
[0249] En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente se administran en combinación con una o más enzimas PME producidas de manera recombinante, por ejemplo, PAL, LAAD o PAH recombinantes. En algunas realizaciones, las enzimas recombinantes se desarrollan más para mejorar la estabilidad y/o capacidad de administración. En algunas realizaciones, una o más enzimas PME administradas en combinación con las bacterias manipuladas genéticamente se pegilan. En algunas realizaciones, una o más enzimas PME administradas en combinación con las bacterias manipuladas genéticamente se administran como una proteína de fusión. Un ejemplo no limitativo de tal proteína de fusión es una fusión entre una PME y un dominio de transducción para la absorción en células. Un ejemplo no limitativo de tal dominio de transducción o péptido, que penetra en célula, es el péptido TAT. En algunas realizaciones, una o más enzimas PME administradas en combinación con las bacterias manipuladas genéticamente se preparan como una nanopartícula. Un ejemplo no limitativo de tal nanopartícula es una nanopartícula de PME de sulfato/quitosano de dextrano. En algunas realizaciones, una o más enzimas PME administradas en combinación con las bacterias manipuladas genéticamente se administran como una microesfera de PME. Un ejemplo no limitativo de tal microesfera es una microesfera de PME de alginato de bario. En algunas realizaciones, una o más enzimas PME administradas en combinación con las bacterias manipuladas genéticamente se administran como partículas PME de sílice amorfas.
[0250] En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente se administran en combinación con PAL. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente se administran en combinación con PAH. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente se administran en combinación con LAAD. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente se administran en combinación con PAL y PAH. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente se administran en combinación con PAL y LAAD. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente se administran en combinación con PAH y LAAD. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente se administran en combinación con PAL, PAH y LAAD.
[0251] En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente se administran en combinación con PAL pegilada. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente se administran en combinación con PAH pegilada. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente se administran en combinación con LAAD pegilada. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente se administran en combinación con una proteína de fusión PAL, por ejemplo, un péptido, que penetra en célula. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente se administran en combinación con una proteína de fusión PAH, por ejemplo, un péptido, que penetra en célula. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente se administran en combinación con una proteína de fusión LAAD, por ejemplo, un péptido, que penetra en célula. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente se administran en combinación con nanopartículas de PAL. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente se administran en combinación con nanopartículas de PAH. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente se administran en combinación con nanopartículas de LAAD. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente se administran en combinación con microesferas de PAL. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente se administran en combinación con microesferas de PAH. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente se administran en combinación con microesferas de LAAD. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente se administran en combinación con partículas de sílice de PAL. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente se administran en combinación con partículas de sílice de PAH. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente se administran en combinación con partículas de sílice de LAAD.
[0252] En algunas realizaciones, una terapia de reemplazamiento o terapia de sustitución de enzima recombinante, por ejemplo, PAL, PAH y/o LAAD se administra sin bacterias manipuladas genéticamente.
[0253] En algunas realizaciones, una o más de PME administrado es PAL. En algunas realizaciones, PAL se modifica como se describe en Sakissian et al., 2011, Mol Genet Metab. Noviembre de 2011; 104(3): 249-254.
[0254] En algunas realizaciones, la PAL es Av-p.C503S/p.C565S/p.F18A PAL. En algunas realizaciones, la PAL es PEG-Av-p.C503S/p.C565S/p.F18A PAL.
[0255] En algunas realizaciones, el PAL está PEGilado. En una realización, el PAL pegilado es de Anabaena variabilis.
En una realización, el PAL pegilado es de Photorhabdus luminescens. En algunas realizaciones, una o más de PME administrado es PAH. En una realización, PAH es PAH humano. En algunas realizaciones, una o más de PME administrado es LAAD. En una realización, la proteína LAAD administrada se deriva de Proteus mirabilis. En algunas realizaciones, una o más de PME se administraron en combinación con PAL y PAH. En algunas realizaciones, una o más de PME administrado es PAL y LAAD. En algunas realizaciones, una o más de PME administrado es PAH y LAAD. En algunas realizaciones, una o más de PME administrado es PAL, PAH y LAAD.
[0256] En algunas realizaciones, las enzimas recombinantes se formulan adicionalmente para mejorar la estabilidad y/o la capacidad de administración. En algunas realizaciones, la una o más de enzima PME administrada está pegilada. En algunas realizaciones, la una o más enzimas PME administradas se administran como una proteína de fusión. Un ejemplo no limitante de dicha proteína de fusión es una fusión entre una PME y un dominio de transducción para su absorción en las células. Un ejemplo no limitante de tal dominio de transducción o péptido de penetración celular es el péptido TAT. En algunas realizaciones, la enzima PME administrada se formula en una nanopartícula. Un ejemplo no limitante de una nanopartícula de este tipo es una nanopartícula de PME de sulfato de dextrano/quitosano. En algunas realizaciones, la enzima PME administrada se administra como una microesfera de PME. Un ejemplo no limitante de tal microesfera es una microesfera PME de alginato de bario. En algunas realizaciones, la enzima PME administrada se administra como partículas de PME de sílice amorfa.
[0257] En algunas realizaciones, se administra PAL pegilada. En algunas realizaciones, se administra LAAD pegilada. En algunas realizaciones, se administra LAAD pegilada de Proteus mirabilis. En algunas realizaciones, se administra PAH pegilada.
[0258] En una realización, se administra una proteína de fusión de PAL, por ejemplo, con un péptido de células penetrante. En una realización, se administra una proteína de fusión de LAAD, por ejemplo, con un péptido que penetra en las células. En una realización, se administra una proteína de fusión de PAH, por ejemplo, con un péptido que penetra en las células. En algunas realizaciones, se administran nanopartículas de PAL. En algunas realizaciones, se administran nanopartículas de PAH. En algunas realizaciones, se administran nanopartículas de LAAD. En algunas realizaciones, se administran microesferas de PAL. En algunas realizaciones, se administran microesferas de PAH. En algunas realizaciones, se administran microesferas de LAAD. En algunas realizaciones, se administran partículas de PAL-sílice. En algunas realizaciones, se administran partículas de PAH-sílice. En algunas realizaciones, se administran partículas de LAAD-sílice.
[0259] En algunas realizaciones, la PME, por ejemplo, PAH, PAL, y/o LAAD se formula con aprotinina, por ejemplo, 40 mg/ml de aprotinina.
[0260] En algunas realizaciones, las PME se suministran como terapia génica. En algunas realizaciones, se usa una tecnología CRISPR. En algunas realizaciones, se usa un vector de terapia génica para administrar una o más PME, por ejemplo, PAL, LAAD y/o PAH. Los vectores de terapia génica son conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, vectores retrovirales, vectores adenovirales, vectores virales adenoasociados. Alternativamente, se puede administrar ADN o ARN del gen de PME formulado o desnudo.
[0261] Una consideración importante en la selección de uno o más agentes terapéuticos adicionales es que el o los agentes deben ser compatibles con las bacterias manipuladas genéticamente de la invención, por ejemplo, el o los agentes no deben interferir con las bacterias ni matarlas. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra con alimentos. En realizaciones alternativas, la composición farmacéutica se administra antes o después de ingerir alimentos. La composición farmacéutica se puede administrar en combinación con una o más modificaciones dietéticas, por ejemplo, dieta baja en fenilalanina. La dosis de la composición farmacéutica y la frecuencia de administración se pueden seleccionar en función de la gravedad de los síntomas y la progresión de la enfermedad. La dosis terapéuticamente eficaz apropiada y/o la frecuencia de administración se pueden seleccionar por el médico a cargo.
[0262] También se describen en el presente documento a título informativo los kits que comprenden la composición farmacéutica descrita en el presente documento. El kit puede incluir uno o más elementos que incluyen, pero no se limitan a: instrucciones de uso; otros reactivos, por ejemplo, un marcador, un agente terapéutico adicional; dispositivos o materiales para medir niveles de fenilalanina, o niveles de otras moléculas o metabolitos asociados con hiperfenilalaninemia, en un sujeto; dispositivos u otros materiales para preparar la composición farmacéutica de la invención para su administración; y dispositivos u otros materiales para la administración a un sujeto. Las instrucciones de uso pueden incluir orientación para la aplicación terapéutica, tales como dosis sugeridas y/o modos de administración, por ejemplo, en un paciente con hiperfenilalaninemia. El kit puede contener además al menos un agente terapéutico adicional, y/o una o más cepas bacterianas manipuladas genéticamente adicionales de la invención, formuladas según sea apropiado, en una o más preparación farmacéuticas separadas.
[0263] El kit puede usarse para la administración de la composición farmacéutica a un sujeto. El kit puede usarse para la administración de la composición farmacéutica, sola o en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales, a un sujeto. El kit puede usarse para medir los niveles de fenilalanina (por ejemplo, niveles de fenilalanina en sangre) en un sujeto antes, durante o después de la administración de la composición farmacéutica al sujeto. El kit puede usarse para la administración y/o la readministración de la composición farmacéutica, sola o en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales, cuando los niveles de fenilalanina en sangre están aumentados o son anormalmente altos. Una señal de diagnóstico de hiperfenilalaninemia puede ser un nivel de fenilalanina en sangre de al menos 2 mg/dl, al menos 4 mg/dl, al menos 6 mg/dl, al menos 8 mg/dl, al menos 10 mg/dl, al menos 12 mg/dl, al menos 14 mg/dl, al menos 16 mg/dl, al menos 18 mg/dl, al menos 20 mg/dl, o al menos 25 mg/dl.
[0264] La Tabla 20 muestra ejemplos no limitantes de tasas de degradación objetivo, basados en niveles de fenilalanina en promedio en pacientes con PKU clásica.
T l 2 . T r i n iv
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[0265] En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente logran una tasa de degradación objetivo de aproximadamente 0,15 a aproximadamente 8,01 |imol/109 UFC/hr. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente logran una tasa de degradación objetivo de aproximadamente 0,15 a aproximadamente 2 mol/109 UFC/hr. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente logran una tasa de degradación objetivo de aproximadamente 0,6 a aproximadamente 8,01 mol/109 UFC/hr. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente logran una tasa de degradación objetivo de aproximadamente 0,2 a aproximadamente 2,67 mol/109 UFC/h.
[0266] En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente logran una tasa de degradación objetivo de aproximadamente 0,15 a aproximadamente 0,6 mol/109 UFC/h. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente logran una tasa de degradación objetivo de aproximadamente 0,22 a aproximadamente 0,9 mol/109 UFC/h. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente logran una tasa de degradación objetivo de aproximadamente 0,3 a aproximadamente 1,21 mol/109 UFC/h. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente logran una tasa de degradación objetivo de aproximadamente 0,54 a aproximadamente 2,16 mol/109 UFC/h. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente logran una tasa de degradación objetivo de aproximadamente 1,13 a aproximadamente 4,53 mol/109 UFC/h. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente logran una tasa de degradación objetivo de aproximadamente 1,84 a aproximadamente 7,38 mol/109 UFC/h. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente logran una tasa de degradación objetivo de aproximadamente 1,61 a aproximadamente 6,43 pmol/109 UFC/h. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente logran una tasa de degradación objetivo de aproximadamente 2 a aproximadamente 8,01 mol/109 UFC/h.
[0267] En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente logran una tasa de degradación objetivo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 1 ^mol/109 UFC/h. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente logran una tasa de degradación objetivo de aproximadamente 1 a aproximadamente 2 ^mol/109 UFC/h. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente logran una tasa de degradación objetivo de aproximadamente 2 a aproximadamente 3 pmol/109 UFC/h. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente logran una tasa de degradación objetivo de aproximadamente 3 a aproximadamente 4 pmol/109 UFC/h. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente logran una tasa de degradación objetivo de aproximadamente 4 a aproximadamente 5 pmol/109 UFC/h. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente logran una tasa de degradación objetivo de aproximadamente 5 a aproximadamente 6 pmol/109 UFC/h. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente logran una tasa de degradación objetivo de aproximadamente 6 a aproximadamente 7 mol/109 UFC/h. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente logran una tasa de degradación objetivo de aproximadamente 7 a aproximadamente 8 ^mol/109 UFC/h.
[0268] En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente logran una tasa de reducción objetivo de menos de 0,15 pmol/109 UFC/hr. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente logran una tasa de degradación objetivo mayor que 8,01 mol/109 UFC/h.
[0269] En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente logran un reducción objetivo de entre aproximadamente 178 mg y 2382 mg. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente logran una reducción objetivo de 1,08 mmol a 14,42 mmol. En algunas realizaciones, la reducción es inferior a 1,08 mmol. En algunas realizaciones, la reducción es superior a 14,42 mmol.
[0270] En algunas realizaciones, las tasas de reducción objetivo y degradación objetivo se basan en niveles clásicos de fenilalanina de PKU. En algunas realizaciones, las tasas de reducción objetivo y degradación objetivo se basan en niveles de fenilalanina observados en PKU leve. En algunas realizaciones, las tasas de reducción objetivo y degradación objetivo se basan en niveles de fenilalanina observados en hiperfenilalaninemia leve.
Tratamiento In Vivo
[0271] Las bacterias manipuladas genéticamente de la invención se pueden calcular in vivo, por ejemplo, en un modelo de animal. Se puede utilizar cualquier modelo de animal adecuado de una enfermedad o una afección asociada con hiperfenilalaninemia (ver, por ejemplo, Sarkissian et al., 1999). El modelo de animal puede ser un modelo de ratón de PKU. El modelo de ratón de PKU puede ser un ratón BRBR mutante de PAH (BTBR-Pahenu2, Jackson Laboratories). En estas ocasiones, el modelo de ratón contiene una mutación de sentido erróneo homocigota inducida químicamente por (ENU) (T835C) en exón 7 del gen Pah, que da como resultado una fenilalanina en sustitución de serina en aminoácido 263 (F263S). Este residuo se ubica en el sitio activo de la enzima PAH, como se muestra mediante estructura de cristal y da como resultado la perdida completa de actividad PAH. En dietas normales, estos ratones mutantes demuestran un aumento de 10 a 20 veces de niveles de fenilalanina en suero en comparación con controles no afectados. Las bacterias manipuladas genéticamente de la invención se pueden administrar al animal, por ejemplo, por gavaje oral, y se determina la eficacia de tratamiento, por ejemplo, midiendo fenilalanina en sangre y/o cinamato antes y después del tratamiento. En modelos de animales, se observa, que el tiempo de residencia de las bacterias manipuladas genéticamente dentro del tracto GI puede ser más corto que el tiempo de residencia en humanos. Se puede sacrificar al animal, se puede recoger y analizar las muestras de tejidos.
[0272] Los estudios farmacocinéticos y farmacodinámicos se pueden llevar a cabo en primates no humanos para determinar cualquier toxicidad potencial surgida de la administración de las bacterias manipuladas genéticamente. La farmacocinética y la farmacodinámica de las bacterias manipuladas genéticamente. Los ejemplos no limitativos de tales estudios se describen en los Ejemplos 30 y 31.
[0273] Las bacterias manipuladas genéticamente, que expresan LAAD, se pueden detectar de manera específica en las heces y se pueden diferenciar de otras cepas de E. coli. Con este objetivo se puede utilizar una Prueba de Fenilalanina Desaminasa "Phenylalanine Agar Slant". Se utiliza agar de fenilalanina para determinar si el microbio puede utilizar fenilalanina y convertirla en piruvato de fenilo. Cuando se añaden las pruebas químicas al tubo, que contiene la muestra sobre el agar de fenilalanina, fenilpiruvato se convierte en un compuesto verde, indicando una prueba positiva. E. coli de tipo salvaje no produce fenilpiruvato, ya que no codifican una enzima, que puede producir fenilpiruvato a partir de fenilalanina, permitiendo la diferenciación de otras cepas de E. coli. Las bacterias manipuladas genéticamente se pueden diferenciar de otras especies bacterianas, que son capaces de producir fenilpiruvato mediante las pruebas basadas en PCR conocidas en la técnica. Por ejemplo, se puede amplificar las secuencias específicas de especies. Por ejemplo, PCR universal, que amplifica regiones conservadas en diferentes bacterias, es ideal para detectar cualquier patógeno en el cribado de especímenes. Con tal objetivo, se puede utilizar la región conservada del gen de ARNr 16S como un gen diana para la PCR universal; el gen de ARNr 16S contiene regiones específicas de especies, mediante las cuales se puede diferenciar un gran número de especies bacterianas.
[0274] Se puede utilizar la Prueba de Fenilalanina Desaminasa para detectar las bacterias manipuladas genéticamente en una muestra fecal.
[0275] Las pruebas basadas en PCR se pueden llevar a cabo para diferenciar las bacterias manipuladas genéticamente de otras especies bacterianas.
Procedimientos de Cribado
[0276] Se puede mejorar una cepa manipulada genéticamente utilizando los procedimientos de cribado y selección, por ejemplo, para aumentar la actividad enzimática de PME o para aumentar la habilidad de una cepa de absorber fenilalanina. El cribado puede servir para generar una cepa bacteriana con actividad PME mejorada. El cribado puede servir para generar una cepa bacteriana, que tiene la habilidad de absorción de fenilalanina mejorada. El cribado puede identificar una cepa bacteriana tanto con la actividad PME mejorada como la importación mejorada de sustrato. Los ejemplos no limitativos de procedimientos de cribado, que se pueden utilizar, se describen en el presente documento.
Generación de Cepas Bacterianas con Habilidad Mejorada para Transportar Biomoléculas
[0277] Debido a su facilidad de cultivo, tiempos cortos de generación, densidades de población muy altas y genomas pequeños, microbios pueden implicarse en fenotipos únicos en tiempo asignado corto. La evolución adaptativa en laboratorio (ALE) es el proceso de pasar microbios por presión selectiva para implicar una cepa con un fenotipo preferido. Más comúnmente, esto se emplea para aumentar la utilización de fuentes de carbono/energía o la adaptación de una cepa a estreses ambientales (por ejemplo, temperatura, pH), con lo cual las cepas mutantes capaces de crecer sobre el sustrato de carbono o bajo estrés desplazará las cepas menos adaptadas en la población y llegará finalmente a dominar la población.
[0278] Este mismo proceso se puede ampliar a cualquier metabolito esencial creando un auxótrofo. Un auxótrofo es una cepa incapaz de sintetizar un metabolito esencial y, por lo tanto, debe tener el metabolito proporcionado en el medio para crecer. En este escenario, creando un auxótrofo y pasándolo sobre cantidades reducidas del metabolito, las cepas resultantes dominantes deberían ser más capaces de obtener e incorporar este metabolito esencial.
[0279] Por ejemplo, si la secuencia biosintética para producir un aminoácido se altera, se puede involucrar una cepa capaz de capturar gran afinidad de dicho aminoácido mediante ALE. Primero, la cepa crece en concentraciones diferentes del aminoácido auxótrofo hasta que se establece una concentración mínima para mantener el crecimiento. A continuación, la cepa se pasa a aquella concentración y se diluye en concentraciones disminuidas del aminoácido a intervalos regulares. Conforme avanza el tiempo, las células, que son las más competitivas para el aminoácido - en concentraciones, que limitan el crecimiento - llegarán a dominar la población. Estas cepas tendrán probablemente mutaciones en sus transportadores de aminoácido, que da como resultado la habilidad aumentada para importar el aminoácido esencial y limitativo.
[0280] De manera similar, empleando un auxótrofo, que no puede utilizar un metabolito en dirección 5' para formar un aminoácido, se puede involucrar una cepa, que no solamente puede importar de manera eficiente el metabolito en dirección 5', pero, también, convertir el metabolito en el metabolito esencial en dirección 3'. Estas cepas involucrarán, también, mutaciones para aumentar la importación del metabolito en dirección 5', pero pueden contener, también, mutaciones, que aumentan la expresión o la cinética de reacción de enzimas en dirección 3', o que reducen secuencias de utilización de sustrato competitivo.
[0281] En los ejemplos anteriores, un metabolito innato para el microbio se convirtió en esencial utilizando un auxótrofo mutacional y se aplicó una selección con suplementación, que limita el crecimiento, del metabolito endógeno. Sin embargo, los fenotipos capaces de consumir compuestos no nativos se pueden involucrar uniendo su consumo con la producción de un compuesto esencial. Por ejemplo, si se aísla un gen de un organismo diferente, que puede producir un compuesto esencial o un precursor para un compuesto esencial, se puede introducir y expresar este gen de manera recombinante en el huésped heterólogo. La nueva cepa huésped tendrá ahora la habilidad para sintetizar un nutriente esencial de un sustrato no metabolizado previamente. Por el presente, se puede emplear un proceso ALE similar creando un auxótrofo incapaz de convertir un metabolito en dirección 3' inmediato y seleccionando la enzima recombinante en cantidades, que limitan el crecimiento, del compuesto no nativo con expresión concurrente. Esto dará como resultado el transporte del sustrato no nativo, la expresión y la actividad de la enzima heteróloga y la expresión y la actividad de enzimas nativas en dirección 3'. Se debería hacer hincapié en que el requisito clave en este proceso es la habilidad de unir el consumo del metabolito no nativo con la producción de un metabolito esencial para el crecimiento.
[0282] Cuando se establece la base del mecanismo de selección y se establecen los niveles mínimos de suplementación, se puede procesar la experimentación actual de ALE. A lo largo de este proceso se debe monitorizar vigilantemente varios parámetros. Es importante que los cultivos se mantengan en una fase de crecimiento exponencial y no se permita alcanzar la fase de saturación/estacionaria. Esto significa que las tasas de crecimiento se deben verificar durante cada paso y las diluciones posteriores deben ajustarse según corresponda. Si la velocidad de crecimiento mejora hasta tal punto, que las diluciones se convierten en largas, a continuación, se debería disminuir la concentración de suplementación auxótrofa, de tal modo, que la velocidad de crecimiento se ralentiza, se aumenta la presión de selección y las diluciones no son tan severas en comparación con las subpoblaciones de fuerte inclinación durante el paso. Adicionalmente, a niveles regulares las células se deberían diluir, crecer sobre un medio sólido y los clones individuales testarse para confirmar las tasas de crecimiento de fenotipos observados en los cultivos ALE.
[0283] Pronosticando, cuando detenerse, el experimento ALE, también, necesita vigilancia. Como el éxito de dirigir la evolución está unido directamente con el número de mutaciones «cribados» a lo largo del experimento y, generalmente, las mutaciones son una función de errores durante la replicación de ADN, las divisiones celulares acumulativas (CCD) actúan como un representante para mutantes totales, que se han cribado. Los estudios anteriores han demostrado que los fenotipos beneficiosos para el crecimiento sobre diferentes fuentes de carbono se pueden aislar en aproximadamente 10112 CCD1. Se puede acelerar esta velocidad utilizando la adición de mutágenos químicos para los cultivos - tales como, A/-metil-W-nitro-W-nitrosoguanidina (NTG) - que causa el aumento de errores de replicación de ADN. Sin embargo, cuando el paso continuo se lleva a mínimo o a ninguna mejora en la velocidad de crecimiento, la población se junta con alguna adaptación máxima y se puede detener el experimento ALE.
[0284] Al finalizar el experimento ALE, las células deberían diluirse, aislarse sobre un medio sólido y valorarse para fenotipos de crecimiento, que corresponden con el matraz de cultivo. Los mejores de aquellos seleccionados se preparan, a continuación, para ADN genómico y se envían para secuenciación genómica completa. La secuenciación con mutaciones relevantes, que ocurre alrededor del genoma capaz de producir fenotipos mejorados, contendrá, también, mutaciones silenciosas (aquellas, que no proporcionan beneficio, pero no restan valor a fenotipo deseado). En cultivos involucrados con presencia de NTG u otros mutágenos químicos, existirán mutaciones significativamente más silenciosas ambientales. Si está conforme con la cepa mejor representada en su estado actual, el usuario puede proceder a la puesta en práctica de aquella cepa. De otra manera, se puede desenrollar las mutaciones contribuyentes de la cepa involucrada mediante la reintroducción de las mutaciones en la cepa parental utilizando las técnicas de modificación genómica. Ver Lee, D.-H., Feist, A. M., Barrett, C. L. & Palsson, B. 0. Cumulative Number of Cell Divisions as a Meaningful Timescale for Adaptive Laboratory Evolution of Escherichia coli. PLoS ONE 6, e26172 (2011).
[0285] En algunas ocasiones, se puede utilizar el procedimiento ALE para identificar las bacterias manipuladas genéticamente con absorción mejorada de fenilalanina.
Cribado específico para mejorar la actividad de PME
[0286] Se llevan a cabo cribados que utilizan selección genética para mejorar el consumo de fenilalanina en las bacterias manipuladas genéticamente. Los análogos de fenilalanina tóxicos ejercen su mecanismo de acción (MOA) al ser incorporados a la proteína celular, provocando la muerte celular. Estos compuestos, tales como parálogo pfluoro-DL-fenilalanina y ortólogo o-fluoro-DL-fenilalanina, tienen utilidad en un enfoque no dirigido para seleccionar enzimas PAL con mayor actividad. Suponiendo que PAL puede metabolizar estos compuestos tóxicos en un metabolito no tóxico, en lugar de incorporarse a la proteína celular, las bacterias manipuladas genéticamente que tienen una actividad de degradación de fenilalanina mejorada pueden tolerar niveles más altos de estos compuestos, y se pueden cribar y seleccionar en esta base.
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Ejemplos
[0288] Los siguientes ejemplos proporcionan realizaciones ilustrativas de la invención y las descripciones de los casos descritos en este documento.
[0289] Los ejemplos no limitan en ningún caso la divulgación.
Ejemplo 1. Construcción de plásmidos PAL
[0290] Para facilitar la producción inducible de PAL en Escherichia coli Nissle, el gen PAL de Anabaena variabilis ("PALI") o Photorhabdus luminescens ( "PAL3"), así como elementos de transcripción y traducción, se sintetizó (Gen9, Cambridge, MA) y se clonó en el vector pBR322. El gen PAL se colocó bajo el control de un promotor inducible. Se generaron plásmidos de alto y bajo número de copias para cada uno de PAL1 y PAL3 bajo el control de un promotor FNR inducible o un promotor Tet. Los promotores de FNR de ejemplo se muestran en la Tabla 3. La organización y las secuencias de nucleótidos de estas construcciones se muestran en las Figs. 6-9. Sin embargo, como se indicó anteriormente, se pueden usar otros promotores para impulsar la expresión del gen PAL, se pueden usar otros genes PAL y se pueden usar otros genes reguladores del metabolismo de la fenilalanina.
Ejemplo 2. Transformación de E. co li
[0291] Cada uno de los plásmidos descritos en este documento se transformó en E. coli Nissle para los estudios descritos en el presente documento de acuerdo con las siguientes etapas. Todos los tubos, soluciones y cubetas se enfriaron previamente a 4 °C. Un cultivo nocturno de E. coli Nissle se diluyó 1: 100 en 5 ml de caldo de lisogenia (LB) que contenía ampicilina y se cultivó hasta que alcanzó una DO600 de 0,4-0,6. A continuación, las células de E. coli se centrifugaron a 2.000 rpm durante 5 min a 4 °C, se eliminó el sobrenadante y las células se resuspendieron en 1 ml de agua a 4 °C. El E. coli se centrifugó nuevamente a 2.000 rpm durante 5 min a 4 °C, se eliminó el sobrenadante y las células se resuspendieron en 0,5 ml de agua a 4 °C. El E. coli se centrifugó nuevamente a 2.000 rpm durante 5 min a 4 °C, se eliminó el sobrenadante y finalmente se resuspendieron las células en 0,1 ml de agua a 4 °C. El electroporador se ajustó a 2,5 kV. Se añadió plásmido (0,5 |ig) a las células, se mezcló pipeteando y se pipeteó en una cubeta fría estéril. La cubeta seca se colocó en la cámara de muestra y se aplicó el pulso eléctrico. Se añadió inmediatamente un ml de medio SOC a temperatura ambiente y la mezcla se transfirió a un tubo de cultivo y se incubó a 37 °C durante 1 hora.
Ejemplo 3. Comparación del metabolismo de la fenilalanina entre plásmidos de número de copias alto y bajo que expresan pAL1 y PAL2
[0292] Las bacterias manipuladas genéticamente que comprenden el mismo gen PAL, ya sea PAL3 en un plásmido con bajo número de copias o plásmido con alto número de copias (SYN-pKU101 y SYN-PKU102) o PAL3 en un plásmido con bajo número de copias o plásmido con alto número de copias (SYN-PKU201 y SYN-PKU202), se analizaron para determinar el metabolismo de la fenilalanina in vitro.
[0293] Las bacterias manipuladas se indujeron con tetraciclina anhidra (ATC), y a continuación se cultivaron en medio de cultivo suplementado con 4 mM (660.000 ng/ml) de fenilalanina durante 2 horas. Las muestras se retiraron a las 0 horas, 4 horas y 23 horas, y las concentraciones de fenilalanina (Fig. 15A) y ácido transcinámico (TCA) (Fig. 15B) se determinaron mediante espectrometría de masas, tal como se describe en los Ejemplos 24-26.
[0294] Se encontraron cepas de plásmidos de alto número de copias y bajo número de copias para metabolizar y reducir la fenilalanina a niveles similares (Fig. 15). Se observó una mayor reducción de los niveles de fenilalanina y un aumento de los niveles de TCA en las cepas que expresan PAL3.
Ejemplo 4. Transportador de fenilalanina: integración de PheP en el cromosoma bacteriano
[0295] En algunas realizaciones, puede ser ventajoso aumentar el transporte de fenilalanina en la célula, mejorando de este modo el metabolismo de la fenilalanina. Por lo tanto, se insertó una segunda copia del transportador de fenilalanina de alta afinidad nativo, PheP, impulsado por un promotor inducible, en el genoma de Nissle mediante recombinación homóloga. La organización de la construcción se muestra en la Fig. 11. El gen pheP se colocó en dirección 3' del promotor Ptety el represor de tetraciclina, TetR, se transcribió de forma divergente (véase, por ejemplo, la Fig. 11). Esta secuencia fue sintetizada por Genewiz (Cambridge, MA). Para crear un vector capaz de integrar la construcción TetR-PheP sintetizada en el cromosoma, se utilizó primero el ensamblaje de Gibson para añadir secuencias de ADN de 1000 pb homólogas al locus lacZ de Nissle en el plásmido pKD3 de origen R6K. Éste reconoce al ADN clonado entre estos brazos de homología para que se integre en el locus lacZ en el genoma de Nissle (Fig.
10). Se usó el ensamblaje de Gibson para clonar el fragmento TetR-PheP entre estos brazos. Se utilizó PCR para amplificar la región de este plásmido que contiene la secuencia completa de los brazos de homología, así como la secuencia de pheP entre ellos. Este fragmento de PCR se utilizó para transformar Nissle-pKD46 electrocompetente, una cepa que contiene un plásmido sensible a la temperatura que codifica los genes de recombinasa roja lambda. Después de la transformación, las células se cultivaron durante 2 horas antes de sembrarlas en placas sobre cloranfenicol a 20 pg/ml a 37 °C. El crecimiento a 37 °C cura el plásmido pKD46. Los transformantes que contenían pheP inducible por tetraciclina anhidra (ATC) eran lac-menos (lac-) y resistentes al cloranfenicol.
Ejemplo 5. Efecto del transportador de fenilalanina sobre la degradación de fenilalanina
[0296] Para determinar el efecto del transportador de fenilalanina sobre la degradación de fenilalanina,
[0297] se evaluó la degradación de fenilalanina y acumulación de trans-cinamato lograda por bacterias manipuladas genéticamente que expresan o PAL3 en plásmidos con un número bajo (LC) o alto (HC) de copias en presencia o ausencia de una copia de pheP impulsada por el promotor Tet integrado en el cromosoma.
[0298] Para los estudios in vitro, todas las incubaciones se realizaron a 37 °C. Los cultivos de E. coli Nissle transformado con un plásmido que comprende el gen PAL impulsado por el promotor Tet se hicieron crecer durante la noche y a continuación se diluyeron 1:100 en LB. Las células se cultivaron con agitación (200 rpm) hasta la fase logarítmica temprana. Se añadió tetraciclina anhidra (ATC) a los cultivos a una concentración de 100 ng/ml para inducir la expresión de PAL, y las bacterias se cultivaron durante otras 2 horas. A continuación, se sedimentaron las bacterias, se lavaron y se resuspendieron en medio mínimo y se suplementaron con fenilalanina 4 mM. Se retiraron alícuotas a las 0 horas, 2 horas y 4 horas para la cuantificación de fenilalanina (Fig. 16A), y a las 2 horas y 4 horas para la cuantificación de cinamato (Fig. 16B), mediante espectrometría de masas, tal como se describe en los Ejemplos 24­ 26. Tal como se muestra en la Fig.16, la expresión de pheP junto con PAL mejora significativamente la degradación de fenilalanina en comparación con PAL solo o pheP solo. En particular, la copia adicional de pheP permitió la degradación completa de fenilalanina (4 mM) en 4 horas (Fig. 16A). La Fig. 16B representa los niveles de cinamato en muestras a las 2 horas y 4 horas después de la inducción. Dado que la producción de cinamato está directamente relacionada con la degradación de la fenilalanina, estos datos sugieren que la desaparición de la fenilalanina se debe al catabolismo de la fenilalanina y que el cinamato puede usarse como un biomarcador alternativo para la actividad de la cepa. La sobreexpresión de PheP mejora el metabolismo de la fenilalanina en bacterias manipuladas genéticamente.
[0299] En conclusión, en conjunción con pheP, incluso los plásmidos que expresan PAL con bajo número de copias son capaces de eliminar casi por completo la fenilalanina de una muestra de ensayo (Figs. 16A y 16B). Además, sin desear estar ligado a la teoría, en algunas realizaciones que incorporan pheP, puede haber ventajas adicionales al usar un plásmido que expresa PAL con bajo número de copias conjuntamente con el fin de mejorar la estabilidad de la expresión de PAL mientras se mantiene un alto metabolismo de la fenilalanina y para reducir la presión de selección negativa sobre la bacteria transformada. En realizaciones alternativas, el transportador de fenilalanina se usa junto con un plásmido que expresa PAL de alto número de copias.
Ejemplo 6. Actividad del promotor FNR
[0300] Con el fin de medir la actividad promotora de diferentes promotores FNR, el gen lacZ, así como elementos de transcripción y traducción, se sintetizaron (Gen9, Cambridge, MA) y se clonaron en el vector pBR322. El gen lacZ se colocó bajo el control de cualquiera de las secuencias promotoras de FNR de ejemplo descritas en la Tabla 3. Las secuencias de nucleótidos de estas construcciones se muestran en las Tablas 21-28 (SEQ ID NOs 31-38). Sin embargo, como se indicó anteriormente, el gen lacZ puede ser impulsado por otros promotores inducibles con el fin de analizar las actividades de esos promotores, y pueden usarse otros genes en lugar del gen lacZ como lectura de la actividad del promotor. Alternativamente, se puede usar beta-galactosidasa como indicador, los resultados de ejemplo se muestran en la Fig. 18.
[0301] La Tabla 21 muestra la secuencia de nucleótidos de una construcción de ejemplo que comprende un gen que codifica lacZ y un promotor FNR de ejemplo, Pfnri (SEQ ID NO: 3). La construcción comprende una fusión traduccional del gen nirBI de Nissle y el gen lacZ, en la que las fusiones de traducción están fusionadas en el marco al 8° codón de la región codificante de lacZ. La secuencia de Pfnri está en negrita en minúsculas y el sitio de unión al ribosoma predicho dentro del promotor está subrayado. La secuencia de lacZ está subrayada en mayúsculas. El sitio ATG está en negrita en mayúsculas y los sitios de clonación usados para sintetizar la construcción se muestran en mayúsculas normales.
[0302] La Tabla 22 muestra la secuencia de nucleótidos de una construcción de ejemplo que comprende un gen que codifica lacZ y un promotor FNR de ejemplo, Pfnr2 (SEQ ID NO: 6). La construcción comprende una fusión traduccional del gen ydfZ de Nissle y el gen lacZ, en la que las fusiones de traducción están fusionadas en el marco al 8° codón de la región codificante de lacZ. La secuencia de Pfnr2 está en negrita en minúsculas y el sitio de unión al ribosoma predicho dentro del promotor está subrayado. La secuencia de lacZ está subrayada en mayúsculas. El sitio ATG está en negrita en mayúsculas y los sitios de clonación usados para sintetizar la construcción se muestran en mayúsculas normales.
[0303] La Tabla 23 muestra la secuencia de nucleótidos de una construcción de ejemplo que comprende un gen que codifica lacZ y un promotor FNR de ejemplo, Pfnr3 (SEQ ID NO: 7). La construcción comprende una fusión traduccional del gen nirB de Nissle y el gen lacZ, en la que las fusiones de traducción usan solo la región promotora fusionada a un sitio de unión a ribosoma fuerte. La secuencia de Pfnr3 está en negrita en minúsculas y el sitio de unión al ribosoma predicho dentro del promotor está subrayado. La secuencia de lacZ está subrayada en mayúsculas. El sitio ATG está en negrita en mayúsculas y los sitios de clonación usados para sintetizar la construcción se muestran en mayúsculas normales.
[0304] La Tabla 24 muestra la secuencia de nucleótidos de una construcción de ejemplo que comprende un gen que codifica lacZ y un promotor FNR de ejemplo, Pfnr4 (SEQ ID NO: 8). La construcción comprende una fusión traduccional del gen ydfZ de Nissle y el gen lacZ. La secuencia de Pfnr4 está en negrita en minúsculas y el sitio de unión al ribosoma predicho dentro del promotor está subrayado. La secuencia de lacZ está subrayada en mayúsculas. El sitio ATG está en negrita en mayúsculas y los sitios de clonación usados para sintetizar la construcción se muestran en mayúsculas normales.
[0305] La Tabla 25 muestra la secuencia de nucleótidos de una construcción de ejemplo que comprende un gen que codifica lacZ y un promotor FNR de ejemplo, PfnrS (SEQ ID NO: 9). La construcción comprende una fusión traduccional del gen de a Rn pequeño inducido de forma anaeróbica, fnrSI, fusionado a lacZ. La secuencia de PfnrS está en negrita en minúsculas y el sitio de unión al ribosoma predicho dentro del promotor está subrayado. La secuencia de lacZ está subrayada en mayúsculas. El sitio ATG está en negrita en mayúsculas y los sitios de clonación usados para sintetizar la construcción se muestran en mayúsculas normales.
[0306] La Tabla 26 muestra la secuencia de nucleótidos de una construcción de ejemplo que comprende un gen que codifica PAL3 y un promotor FNR de ejemplo, Pfnr3 (SEQ ID NO: 7). La construcción comprende una fusión traduccional del gen nirB de Nissle y el gen PAL3, en la que las fusiones de traducción usan solo la región promotora fusionada a un sitio de unión a ribosoma fuerte. La secuencia de Pfnr3 está en negrita en minúsculas y el sitio de unión al ribosoma predicho dentro del promotor está subrayado. La secuencia de PAL3 está subrayada en mayúsculas. El sitio ATG está en negrita en mayúsculas y los sitios de clonación usados para sintetizar la construcción se muestran en mayúsculas normales.
[0307] La Tabla 27 muestra la secuencia de nucleótidos de una construcción de ejemplo que comprende un gen que codifica PAL3 y un promotor FNR de ejemplo, Pfnr4 (SEQ ID NO: 8). La construcción comprende una fusión traduccional del gen ydfZ de Nissle y el gen PAL3. La secuencia de Pfnr4 está en negrita en minúsculas y el sitio de unión al ribosoma predicho dentro del promotor está subrayado. La secuencia de PAL3 está subrayada en mayúsculas. El sitio ATG está en negrita en mayúsculas y los sitios de clonación usados para sintetizar la construcción se muestran en mayúsculas normales.
[0308] La Tabla 28 muestra la secuencia de nucleótidos de una construcción de ejemplo que comprende un gen que codifica PAL3 y un promotor FNR de ejemplo, PfnrS (SEQ ID NO: 9). La construcción comprende una fusión traduccional del gen de a Rn pequeño inducido de forma anaeróbica, fnrSI, fusionado a PAL3. La secuencia de PfnrS está en negrita en minúsculas y el sitio de unión al ribosoma predicho dentro del promotor está subrayado. La secuencia de PAL3 está subrayada en mayúsculas. El sitio ATG está en negrita en mayúsculas y los sitios de clonación usados para sintetizar la construcción se muestran en mayúsculas normales.
Tabla 21
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(continuación)
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Tabla 22
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(continuación)
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Tabla 23
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(continuación)
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Tabla 24
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(continuación)
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Tabla 25
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Tabla 26
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(continuación)
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Tabla 27
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(continuación)
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[0309] Cada uno de los plásmidos se transformó en E. coli Nissle, tal como se describe anteriormente. Los cultivos de E. coli Nissle transformado se hicieron crecer durante la noche y a continuación se diluyeron 1:200 en LB. Las células se cultivaron con agitación a 250 rpm de forma aeróbica o anaeróbica en una cámara anaeróbica Coy suministrada con 90 % de N2, 5 % de CO 2 y 5 % de H2. Después de 4-6 horas de incubación, se recogieron muestras y se analizó la actividad del promotor realizando ensayos de p-galactosidasa (Miller, 1972). Tal como se muestra en la Fig.20, las actividades de los promotores FNR mejoraron mucho en condiciones anaeróbicas en comparación con las condiciones aeróbicas.
Ejemplo 7. Medición de la actividad de un promotor FNR
[0310] Para determinar la cinética de la expresión génica impulsada por el promotor FNR, cepas de E. coli que albergan un gen de fusión fnrS-lacZ con un número bajo de copias (Fig. 19A) se cultivaron aeróbicamente con agitación a 250 rpm. Los cultivos se dividieron después de 1 hora y a continuación se incubaron aeróbicamente o anaeróbicamente en una cámara anaeróbica Coy (que suministraba 90 % de N2, 5 % de CO2 y 5 % de H2) a 37 °C. La actividad del promotor se midió en función de la actividad de la p-galactosidasa usando un ensayo colorimétrico estándar (Miller, 1972). La Fig. 19B demuestra que el promotor fnrS comienza a impulsar la expresión génica de alto nivel en 1 h. en condiciones anaeróbicas. Las curvas de crecimiento de cultivos de células bacterianas que expresan lacZ se muestran en la Fig. 19C, tanto en presencia como en ausencia de oxígeno.
Ejemplo 8. Producción de PAL a partir del promotor FNR en E. co li recombinante
[0311] Los cultivos de E. coli Nissle transformados con un plásmido que comprende el gen PAL impulsado por cualquiera de los promotores FNR de ejemplo se hicieron crecer durante la noche y a continuación se diluyeron 1:200 en LB. Las células bacterianas pueden comprender además el gen pheP impulsado por el promotor Tet e incorporado en el cromosoma. Se añadió ATC a los cultivos a una concentración de 100 ng/ml para inducir la expresión de pheP, y las células se cultivaron con agitación a 250 rpm, ya sea de forma aeróbica o anaeróbica, en una cámara anaeróbica Coy suministrada con 90 % de N2, 5 % de CO2 y 5 % H2. Después de 4 horas de incubación, las células se sedimentaron, se lavaron y se resuspendieron en medio mínimo M9 suplementado con glucosa al 0,5 % y fenilalanina 4 mM. Se recogieron alícuotas a las 0 horas, 2 horas, 4 horas y 24 horas para la cuantificación de fenilalanina (Fig.
20). Tal como se muestra en la Fig. 20B, las bacterias manipuladas genéticamente que expresan PAL3 impulsadas por el promotor FNR son más eficaces para eliminar la fenilalanina del medio de cultivo en condiciones anaeróbicas, en comparación con las condiciones aeróbicas (Fig. 20A). La expresión de pheP junto con PAL3 redujo aún más los niveles de fenilalanina.
Ejemplo 9. Degradación de fenilalanina en E. co li recombinante con y sin sobreexpresión de pheP
[0312] Las cepas SYN-PKU304 y SYN-PKU305 contienen plásmidos de bajo número de copias que albergan el gen PAL3 y una copia de pheP integrada en el locus lacZ. Las cepas SYN-PKU308 y SYN-PKU307 también contienen plásmidos de bajo número de copias que albergan el gen PAL3, pero carecen de una copia de pheP integrada en el locus lacZ. En las cuatro cepas, la expresión de PAL3 y pheP (cuando corresponda) está controlada por un promotor dependiente del nivel de oxígeno.
[0313] Para determinar las tasas de degradación de fenilalanina en E. coli Nissle manipulada con y sin pheP en el cromosoma, se diluyeron cultivos de una noche de SYN-PKU304 y SYN-PKU3071:100 en LB que contenía ampicilina, y los cultivos de una noche de SYN-PKU308 y SYN-PKU305 se diluyeron 1:100 en LB que contenía kanamicina. Todas las cepas se cultivaron durante 1,5 horas antes de colocar los cultivos en una cámara anaeróbica Coy que suministraba 90 % de N2, 5 % de CO2 y 5 % de H2. Después de 4 horas de inducción, las bacterias se sedimentaron, se lavaron en PBS y se resuspendieron en 1 ml de tampón de ensayo. El tampón de ensayo contenía medio mínimo M9 suplementado con glucosa al 0,5 %, bicarbonato de sodio al 8,4 % y fenilalanina 4 mM.
[0314] Para el ensayo de actividad, los recuentos de partida de unidades formadoras de colonias (ufc) se cuantificaron utilizando dilución en serie y emplacado. Se extrajeron alícuotas de cada ensayo celular cada 30 minutos durante 3 horas para la cuantificación de fenilalanina mediante espectrometría de masas. Específicamente, se sedimentaron 150 |jl de células bacterianas y el sobrenadante se recogió para análisis LC-MS, con medio de ensayo sin células utilizado como punto de tiempo cero. La Fig. 21 muestra la degradación de fenilalanina observada para cepas con pheP en el cromosoma (SYN-PKU304 y SYN-PKU305; izquierda), así como cepas que carecen de pheP en el cromosoma (SYN-PKU308 y SYN-PKU307; derecha). Estos datos muestran que la sobreexpresión de pheP es importante para aumentar las tasas de degradación de la fenilalanina en los probióticos sintéticos.
Ejemplo 10. Actividad de cepas con inserciones de PAL3 cromosómicas únicas y múltiples
[0315] Para evaluar el efecto del sitio de inserción y el número de inserciones en la actividad de las bacterias manipuladas genéticamente, se midió la actividad in vitro de cepas con diferentes inserciones únicas de PAL3 en diferentes localizaciones cromosómicas y con múltiples inserciones PAL3.
[0316] Las células se cultivaron durante la noche en LB y se diluyeron 1:100. Después de 1,5 horas de crecimiento, los cultivos se colocaron en una cámara anaeróbica Coy suministrando 90 % de N2, 5 % de CO2 y 5 % de H2. Después de 4 horas de inducción, las bacterias se resuspendieron en tampón de ensayo que contenía fenilalanina 50 mM. Se retiraron alícuotas de los ensayos celulares cada 20 min durante 1,5 horas para la cuantificación del trans-cinamato por absorbancia a 290 nm. Los resultados se muestran en la Fig. 22 y 23 y en la Tabla 39 y la Tabla 40. La Fig 22 representa las concentraciones de trans-cinamato (actividad PAL) para cepas que comprenden inserciones de PAL3 únicas en diversas localizaciones del cromosoma. La Fig. 23 representa las concentraciones de trans-cinamato (actividad PAL) para cepas que comprenden múltiples inserciones de PAL3 en diversas localizaciones del cromosoma.
Tabla 39. Actividad de varias cepas que comprenden inserciones cromosómicas de PAL3 únicas en varios sitios
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Tabla 40. Actividad in vitro de varias ce as ue com renden una o más inserciones cromosómicas de PAL3
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Ejemplo 11. Actividad de una cepa con cinco copias cromosómicas de PAL3
[0317] Se evaluó la actividad de una cepa SYN-PKU511, una cepa que comprende cinco copias integradas de un PAL3 controlado anaeróbicamente (FNR) y un pheP controlado anaeróbicamente integrado en el locus lacZ.
[0318] Las bacterias manipuladas genéticamente se cultivaron durante la noche, se diluyó y se dejaron crecer durante otras 2,5 horas. A continuación, los cultivos se colocaron en una cámara anaeróbica Coy que suministró 90 % de N2, 5 % de CO2 y 5 % de H2. Después de 3,5 horas de inducción en medio que contenía fenilalanina (fenilalanina 4 mM), se prepararon extractos de células completas cada 30 minutos durante 3 horas y la fenilalanina se cuantificó mediante espectrometría de masas. Los resultados se muestran en la Fig. 24. La actividad in vitro de las células fue de 8 |jmol/h/1e9 células. Los niveles de fenilalanina caen aproximadamente a la mitad de los niveles originales después de 2 horas.
Ejemplo 12. Actividad de una cepa que expresa LAAD
[0319] Para evaluar si la expresión LAAD se puede utilizar como un medio de degradación alternativo, adicional o complementario de fenilalanina a PAL3, la capacidad de la cepa manipulada genéticamente SYN-PKU401, que contiene un plásmido con alto número de copias que expresa LAAD impulsado por un promotor inducible por Tet, se midió a diversas concentraciones de células y a distintos niveles de oxígeno.
[0320] Los cultivos de una noche de SYN-PKU401 se diluyeron 1:100 y se cultivaron hasta la fase logarítmica temprana antes de la inducción con ATC (100 ng/ml) durante 2 horas. Las células se centrifugaron y se incubaron de la siguiente manera.
[0321] Las células (1 ml) se incubaron aeróbicamente en un tubo de cultivo de 14 ml, agitando a 250 rpm (Fig. 25A y B). Para condiciones microaeróbicas, las células (1 ml) se incubaron en un tubo cónico de 1,7 ml sin agitar. Las células se incubaron anaeróbicamente en una cámara anaeróbica Coy que suministraba 90 % de N2, 5 % de CO2 y 5 % de H2 (figura 25B). Se extrajeron alícuotas de los ensayos celulares cada 30 minutos durante 2 horas para la cuantificación de fenilalanina mediante espectrometría de masas, y los resultados se muestran en las Fig. 25A y 25B. La Fig. 25A muestra la actividad aeróbica dependiente de la concentración celular. La actividad en condiciones aeróbicas es ~50 umol/h/1e9 células, y se retiene algo de actividad en condiciones microaeróbicas, lo que puede permitir la actividad en ambientes con concentraciones de oxígeno menores que el aire ambiente. La actividad de SYN-PKU401 en condiciones microaeróbicas es comparable a SYN-PKU304 en condiciones anaeróbicas, aunque la actividad parece ser dependiente de la densidad celular.
[0322] La Tabla 41 y la Tabla 42 contienen construcciones de LAAD de interés. La Tabla 41 muestra la secuencia de una construcción de ejemplo que comprende un gen que codifica LAAD de Proteus mirabilis y un gen represor de Tet y una secuencia de promotor de Tet y RBS y región líder, en un plásmido de SEQ ID NO: 39, con la secuencia de LAAD subrayada la secuencia de TetR en cursiva y la secuencia de promotor de Tet en negrita y el RBS y la región líder subrayados y en cursiva. La Tabla 42 muestra la secuencia de una construcción de ejemplo que comprende un gen que codifica araC y un gen que codifica LAAD de Proteus mirabilis y una secuencia de promotor inducible por arabinosa (ParaBAD) para la inserción cromosómica en el operón de arabinosa endógeno (SEQ ID NO: 40), con la secuencia de araC subrayada y la secuencia de promotor ParaBAD en negrita y la secuencia de LAAD en cursiva y el RBS y región lífer sunrayados y en cursiva.
[0323] En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden una secuencia de ácido nucleico que es al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 %, o al menos aproximadamente 99 % homóloga a la Secuencia de ADN de SEQ ID NO: 20-42, o un fragmento funcional de la misma.
Tabla 41. LAAD impulsada por un promotor inducible por Tet en un plásmido
Secuencias de nucleótidos de construcción de plásmido TetR-LAAD (SEQ ID NO: 39)
Ttaagacccactttcacatttaagttgtttttctaatccgcatatgatcaattcaaggc cgaataagaaggctggctctgcaccttggtgatcaaataattcgatagcttgtcgtaat aatggcggcatactatcagtagtaggtgtttccctttcttctttagcgacttgatgctc ttgatcttccaatacgcaacctaaagtaaaatgccccacagcgctgagtgcatataatg cattctctagtgaaaaaccttgttggcataaaaaggctaattgattttcgagagtttca tactgtttttctgtaggccgtgtacctaaatgtacttttgctccatcgcgatgacttag taaagcacatctaaaacttttagcgttattacgtaaaaaatcttgccagctttcccctt ctaaagggcaaaagtgagtatggtgcctatctaacatctcaatggctaaggcgtcgagc aaagcccgcttattttttacatgccaatacaatgtaggctgctctacacctagcttctg ggcgagtttacgggttgttaaaccttcgattccgacctcattaagcagctctaatgcgc tgttaatcactttacttttatctaatctagacatca t t a a t t c c t a a t t t t t g t t g a c a c t c t a t c a t t g a t a g a g t t a t t t t a c c a c t c c c t a t c a g t g a t a g a g a a a a g t g a a c t c tagaaataattttgtttaactttaagaaggagatatacatatqaacatttcaaqqaqaa a g c t a c t t t t a g g t g t t g g t g c t g c g g g c g t t t t a g c a g g t g g t g c g g c t t t a g t t c c a a t g g t t c g c c g t g a c g g c a a a t t t g t g g a a g c t a a a t c a a g a g c a t c a t t t g t t g a a g g t a c g c a a g g g g c t c t t c c t a a a g a a g c a g a t g t a g t g a t t a t t g g t g c c g g t a t t c a a g g g a t c a t g a c c g c t a t t a a c c t t g c t g a a c g t g g t a t g a g t g t c a c t a t c t t a g a a a a g g g t c a g a t t g c c g g t g a g c a a t c a g g c c g t g c a t a c a g c c a a a t t a t t a g t t a c c a a a c a t c g c c a g a a a t c t t c c c a t t a c a c c a t t a t g g g a a a a t a t t a t g g c g t g g c a t g a a t g a g a a a a t t g g t g c g g a t a c c a g t t a t c g t a c t c a a g g t c g t g t a g a a g c g c t g g c a g a t g a a a a a g c a t t a g a t a a a g c t c a a g c g t g g a t c a a a a c a g c t a a a g a a g c g g c a g g t t t t g a t a c a c c a t t a a a t a c t c g c a t c a t t a a a g g t g a a g a g c t a t c a a a t c g c t t a g t c g g t g c t c a a a c g c c a t g g a c t g t t g c t g c a t t t g a a g a a g a t t c a g g c t c t g t t g a t c c t g a a a c a g g c a c a c c t g c a c t c g c t c g t t a t g c c a a a c a a a t c g g t g t g a a a a t t t a t a c c a a c t g t g c a g t a a g a g g t a t t g a a a c t g c g g g t g g t a a a a t c t c t g a t g t g g t g a g t g a g a a a g g g g c g a t t a a a a c g t c t c a a g t t g t a c t c g c t g g g g g t a t c t g g t c g c g t t t a t t t a t g g g c a a t a t g g g t a t t g a t a t c c c a a c g c t c a a t g t a t a t c t a t c a c a a c a a c g t g t c t c a g g g g t t c c t g g t g c a c c a c g t g g t a a t g t g c a t t t a c c t a a t g g t a t t c a t t t c c g c g a a c a a g c g g a t g g t a c t t a t g c c g t t g c a c c a c g t a t c t t t a c g a g t t c a a t a g t c a a a g a t a g c t t c c t g c t a g g g c c t a a a t t t a t g c a c t t a t t a g g t g g c g g a g a g t t a c c g t t g g a a t t c t c t a t t g g t g a a g a t c t a t t t a a t t c a t t t a a a a t g c c g a c c t c t t g g a a t t t a g a t g a a a a a a c a c c a t t c g a a c a a t t c c g a g t t g c c a c g g c a a c a c a a a a t a c g c a a c a c t t a g a t g c t g t t t t c c a a a g a a t g a a a a c a g a a t t c c c a g t a t t t g a a a a a t c a g a a g t t g t t g a a c g t t g g g g t g c c g t t g t g a g t c c a a c a t t t g a t g a a t t a c e t a t c a t t t c t g a g g t c a a a g a a t a c c c a g g c t t a g t g a t t a a c a c g g c a a c a g t g t g g g g t a t g a c a g a a g g c c c g g c a g c g g g t g a a g t g a c c g c t g a t a t t g t c a t g g g c a a g a a a c c t g t t a t t g a t c c a a c g c c g t t t a g t t t g g a t c g t t t t a a g a a g t a a
Tabla 42. Secuencia de LAAD impulsada por el promotor AraBAD para la Inserción en el operón Ara
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Ejemplo 13. Eficacia de bacterias que expresan PAL en un modelo de ratón de PKU
[0324] Para los estudios in vivo, se obtuvieron ratones BTBR-Pahenu2 de Jackson Laboratory y se criaron para homocigosidad para el uso como un modelo de PKU. Se cultivaron bacterias que albergaban un plásmido de origen pSC101 de bajo número de copias que expresa PAL3 del promotor Tet, así como una copia de pheP impulsada por el promotor Tet integrado en el genoma (SYN-PKU302). SYN-PKU1 fue inducido por ATC durante 2 horas antes de la administración. Las bacterias se resuspendieron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se administraron 109 bacterias SYN-PKU302 inducidas por ATC o bacterias Nissle de control a los ratones mediante sonda oral.
[0325] Al comienzo del estudio, a los ratones se les dio agua que fue suplementado con 100 microgramos/ml de ATC y 5% de sacarosa. Los ratones se mantuvieron en ayunas retirando la comida durante la noche (10 horas) y se recogieron muestras de sangre mediante sangrado mandibular a la mañana siguiente para determinar los niveles de fenilalanina basales. Se recogieron muestras de sangre en tubos heparinizados y se centrifugaron a 2G durante 20 min para producir plasma, que a continuación se extrajo y se almacenó a -80°C. Se les dio comida a los ratones de nuevo y se les administró por sonda después de 1 h. con 100 |il (5x109 UFC) de bacterias que previamente habían sido inducidas durante 2 horas con ATC. Los ratones se volvieron a poner con comida durante 2 horas. Las muestras de plasma se prepararon como se describió anteriormente.
[0326] La figura 26A muestra los niveles de fenilalanina antes y después de la alimentación, y la figura 26B muestra el cambio porcentual (%) en los niveles de fenilalanina en sangre antes y después de la alimentación como promedio del grupo de hombres o mujeres (p <0,01). Tal como se muestra en la Fig. 26, los ratones PKU tratados con SYN-PKU1 exhiben un aumento post-alimentación significativamente reducido en los niveles de fenilalanina en suero en comparación con los controles.
Ejemplo 14. Eficacia de las bacterias que expresan PAL tras la exposición subcutánea a fenilalanina
[0327] Se cultivó E. coli Nissle (SYN-PKU901) resistente a estreptomicina a partir de reservas congeladas hasta una densidad de 1010 células/ml. Se cultivaron bacterias que contenían una copia de pheP bajo el control de un promotor Tet integrado en el locus lacZ, así como un plásmido con alto número de copias que expresaba PAL3 bajo el control de un promotor Tet (SYN-PKU303) hasta una A600 de 0,25 y a continuación se indujeron por ATC (100 ng/mL) durante 4 h. Las bacterias se centrifugaron, se lavaron, y se resuspendieron en tampón de bicarbonato a una densidad de 1x1010 células/ml antes de la congelación a -80 °C.
[0328] A partir de al menos 3 días antes del estudio (es decir, días -6 a -3), se mantuvieron ratones BTBR-Pah enu2 homocigotos (aprox. 6-12 semanas de edad) con comida libre de fenilalanina y agua que se suplementó con 0,5 gramos/l de fenilalanina. El día 1, los ratones se distribuyeron aleatoriamente en grupos de tratamiento y se recogieron muestras de sangre mediante punción cutánea submandibular para determinar los niveles de fenilalanina basales. También se pesaron los ratones para determinar el peso promedio de cada grupo. A continuación, se administró a los ratones una dosis única de fenilalanina mediante inyección subcutánea a 0,1 mg por gramo de peso corporal, de acuerdo con el peso promedio del grupo. A los 30 y 90 min después de la inyección, se administraron 200 |il de H2O (n = 30), SYN-PKU901 (n = 33) o SYN-PKU303 (n = 34) a ratones mediante sonda oral. Se recogieron muestras de sangre a las 2 horas y 4 horas después de la exposición a fenilalanina, y se midieron los niveles de fenilalanina en sangre usando espectrometría de masas.
[0329] La figura 27 muestra las concentraciones en sangre de fenilalanina en relación con las concentraciones iniciales a las 2 horas (figura 27A) y 4 horas (figura 27B) después de la inyección de fenilalanina. Estos datos sugieren que la inyección subcutánea de fenilalanina causa hiperfenilalanemia en ratones enu2/enu2 homocigotos, y que la administración oral de SYN-PKU303 reduce significativamente los niveles de fenilalanina en sangre después de la exposición a fenilalanina, en comparación con los grupos de control (p <0,00001 a las 4 horas). Además, estos resultados confirman que las bacterias manipuladas genéticamente administradas por vía oral, y no la Nissle parental no manipulada, pueden afectar significativamente los niveles de fenilalanina en sangre independientemente de la exposición dietética. Por lo tanto, es posible que no sea necesario administrar un probiótico específico de PKU junto con la dieta.
Ejemplo 15. Actividad dosis-respuesta de bacterias que expresan PAL sobre fenilalanina sistémica
[0330] La E. coli Nissle (SYN-PKU901) resistente a estreptomicina se cultivó a partir de soluciones madre congeladas a una densidad de 1010 células/ml. Se cultivaron bacterias que contenían una copia de pheP bajo el control de un promotor PfnrS integrado en el locus lacZ, así como un plásmido de bajo número de copias que expresa PAL3 bajo el control de un promotor PfnrS (SYN-PKU304) hasta una A600 de 0,25 y a continuación se indujeron anaeróbicamente purgando el fermentador bacteriano con nitrógeno durante 4 horas. Las bacterias se centrifugaron, se lavaron, y se resuspendieron en tampón de bicarbonato a una densidad de 5x109 células/ml antes de la congelación a -80 °C.
[0331] A partir de al menos 3 días antes del estudio (es decir, días -6 a -3), los ratones se mantuvieron con comida libre de fenilalanina y agua que fue suplementado con 0,5 gramos/l de fenilalanina. El día 1, los ratones se distribuyeron aleatoriamente en grupos de tratamiento y se recogieron muestras de sangre mediante punción cutánea submandibular para determinar los niveles de fenilalanina basales. También se pesaron los ratones para determinar el peso promedio de cada grupo. A continuación, se administró a los ratones una dosis única de fenilalanina mediante inyección subcutánea a 0,1 mg por gramo de peso corporal, de acuerdo con el peso promedio del grupo. A los 30 y 90 min después de la inyección, se adminsitraron 200 |il de H2O (n = 12), 200 |jL de SYN-PKU901 (n = 12) o 100 |jL, 200 j L o 400 j L de SYN-PKU304 (n = 12 en cada grupo de dosis) a ratones mediante sonda oral. Se recogieron muestras de sangre a las 2 horas y 4 horas después de la exposición a fenilalanina, y se midieron los niveles de fenilalanina en sangre usando espectrometría de masas.
[0332] La figura 30 muestra las concentraciones en sangre de fenilalanina en relación con las concentraciones basales después de la inyección de fenilalanina. Estos datos demuestran una disminución dependiente de la dosis en los niveles de fenilalanina en sangre en ratones tratados con SYN-PKU304 en comparación con el tratamiento simulado (H2O) o la administración de la cepa parental (SYN-PKU901), después de la inyección subcutánea de fenilalanina (*disminución del 30% ; p <0,05).
Ejemplo 16. Actividad de degradación de fenilalanina in vivo (PAL)
[0333] Para comparar la correlación entre la actividad de fenilalanina in vivo e in vitro, el plásmido SYN-PKU304, que contiene un con bajo número de copias que expresa PAL3 con una inserción cromosómica de PfnrS-pheP en el locus LacZ, se comparó con SYN-PKU901, un control de cepa Nissle con resistencia a estreptomicina in vivo.
[0334] A partir de al menos 3 días antes del estudio (es decir, días -6 a -3), se mantuvieron ratones BTBR-Pah enu2 homocigotos (aprox. 6-12 semanas de edad) con comida libre de fenilalanina y agua que se suplementó con 0,5 gramos/l de fenilalanina. El día 1, los ratones se distribuyeron aleatoriamente en grupos de tratamiento y se recogieron muestras de sangre mediante punción cutánea submandibular para determinar los niveles de fenilalanina basales. También se pesaron los ratones para determinar el peso promedio de cada grupo. A continuación, se administró a los ratones una dosis única de fenilalanina mediante inyección subcutánea a 0,1 mg por gramo de peso corporal, de acuerdo con el peso promedio del grupo. A los 30 y 90 minutos después de la inyección, las bacterias se administraron a ratones mediante sonda oral.
[0335] Para preparar las células, las células se diluyeron 1:100 en LB (2 litros), se hicieron crecer durante 1,5 h aeróbicamente, a continuación se desplazaron a la cámara anaerobia durante 4 horas. Antes de la administración, las células se concentraron 200X y se congelaron (glicerol al 15 %, glucosa 2 g/L, en PBS). Las células se descongelaron en hielo, 4 x 10 ufc/ml y se mezclaron 9:1 en bicarbonato 1M. Cada ratón ingirió 800 ul en total, o 2,9-10 ufc/ratón.
[0336] Se recogieron muestras de sangre a las 2 horas y 4 horas después de la exposición a fenilalanina, y se midieron los niveles de fenilalanina en la sangre usando espectrometría de masas, y se calculó el cambio en la concentración de fenilalanina por hora. Los resultados se muestran en la Fig. 32. La actividad metabólica total medida fue 81,2 umol/h, y la reducción total en el cambio de fenilalanina fue del 45% (P <0,05). Estas mismas células mostraron una actividad in vitro de 2,8 umol/h/1e9 células.
[0337] Además, se midieron varios metabolitos para determinar si los metabolitos secundarios pueden usarse como un parámetro adicional para evaluar la tasa de consumo de fenilalanina de las bacterias manipuladas. Cuando la actividad de la PAH se reduce en la PKU, la fenilalanina acumulada se convierte en fenilpiruvato, metabolito específicos de la PKU, que puede convertirse en ácido feniláctico. En presencia de las bacterias manipuladas genéticamente, la PAL convierte la fenilalanina en metabolito específico de PAL, ácido transcinámico, que a continuación puede ser convertido por las enzimas hepáticas en ácido hipúrico (Fig. 32). Las muestras de sangre se analizaron en busca de fenilpiruvato, fenilactato, ácido transcinámico y ácido hipúrico, tal como se describe en el Ejemplo 24-26. Los resultados se muestran en las Fig. 32C, 32D, 32E y 32F y son consistentes con la degradación de fenilalanina mostrada en la Fig. 32A y 32B. Para SYN-PKU304, los metabolitos específicos de PAL se detectan a las 4 horas y, además, se observan niveles más bajos de metabolitos específicos de PKU en comparación con SYN-PKU901, lo que indica que la degradación de fenilalanina PAL puede provocar un cambio de los metabolitos específicos de PKU a favor o metabolitos específicos de PAL.
Ejemplo 17. Actividad de degradación de fenilalanina in vivo (PAL)
[0338] Se comparó SYN-PKU517 (que comprende 2 inserciones cromosómicas de PAL (2XfnrS-PAL (malEK, malPT)) y una inserción cromosómica de pheP (fnrS-pheP (lacZ)), auxotrofia de thyA (kan/cm)) con SYN-PKU901.
[0339] Los ratones se mantuvieron, alimentaron y fueron administrados con fenilalanina, tal como se describió anteriormente. Para preparar las células bacterianas para la alimentación por sonda, las células se diluyeron 1:100 en LB (2 litros), se cultivaron durante 1,5 h en condiciones aeróbicas y a continuación se cambiaron a la cámara anaerobia durante 4 horas. Antes de la administración, las células se concentraron 200X y se congelaron (glicerol al 15%, glucosa 2 g/L, en PBS). Las células se descongelaron en hielo y se mezclaron 4-10 ufc/ml 9:1 en bicarbonato 1M. Cada ratón fue administrado con 800 ul en total, o 3,6-10 ufc/ratón.
[0340] Tal como se describió anteriormente, se recogieron muestras de sangre, y se calculó el cambio en la concentración de fenilalanina en comparación con la línea base. Los resultados se muestran en las Fig. 33A y 33B. La actividad metabólica total medida fue de 39,6 umol/h, y la reducción total en el cambio de fenilalanina fue del 17% (P <0,05). Estas mismas células mostraron una actividad in vitro de 1,1 umol/h/1e9 células.
[0341] Los niveles absolutos de fenilalanina y de metabolitos de PKU y PAL se muestran en la Fig. 33C, 33D, 33E, y 33F y son consistentes con la degradación de fenilalanina que se muestra en la Fig. 33A y 33B. Para SYN-PKU517, se detectaron metabolitos específicos de PAL a las 4 horas y, además, se observaron niveles más bajos de metabolitos específicos de PKU en comparación con SYN-PKU901, lo que indica que la degradación de fenilalanina PAL puede provocar un cambio de los metabolitos específicos de PKU a favor o metabolitos específicos de PAL.
[0342] En algunas realizaciones, la orina se recoge en los puntos de tiempo predeterminados, y se analizó para los niveles de fenilalanina y niveles de metabolitos PAL y PKU.
Ejemplo 18. Actividad de degradación de fenilalanina in vivo (PAL)
[0343] Se comparó SYN-PKU705 (que comprende 3 inserciones cromosómicas de PAL (3XfnrS-PAL (Malek, malPT, CIJs/NEPL)), y 2 inserciones cromosómicas de pheP (2XfnrS-pheP (lacZ, agal/RSML)), y LAAD (impulsada por el promotor ParaBAD integrado dentro del operón arabinosa endógeno) con SYN-PKU901.
[0344] Los ratones se mantuvieron, alimentaron y administraron con fenilalanina, tal como se describió anteriormente. Para preparar las células bacterianas para la alimentación por sonda, las células se diluyeron 1:100 en LB (2 L), se cultivaron durante 1,5 h en condiciones aeróbicas y a continuación se cambiaron a la cámara anaerobia durante 4 horas. Antes de la administración, las células se concentraron 200X y se congelaron (glicerol al 15%, glucosa 2 g/L, en PBS). Las células se descongelaron en hielo y se mezclaron 5-10 ufc/ml 9:1 en bicarbonato 1M. A cada ratón se le administraron 800 ul en total, o 3,6-10 ufc/ratón. Nota: aunque esta cepa contiene el gen LAAD, no se indujo en este estudio.
[0345] Tal como se describió anteriormente, se recogieron muestras de sangre, y se calculó el cambio en la concentración de fenilalanina en comparación con la línea base. Los resultados se muestran en la Fig. 34A. La actividad metabólica total medida fue de 133,2 umol/h, y la reducción total en el cambio de fenilalanina fue del 30% (P <0,05). Estas mismas células mostraron una actividad in vitro de 3,7 umol/h/1e9 células.
[0346] Los niveles absolutos de fenilalanina y de los metabolitos de PKU y PAL se muestran en la Fig.34C, 34D, 34E, y 34F y son consistentes con la degradación de fenilalanina que se muestra en la Fig. 34A y 34B. Se detectaron metabolitos específicos de PAL a las 4 horas y, además, se observaron niveles más bajos de metabolitos específicos de PKU en comparación con SYN-PKU901, lo que indica que la degradación de fenilalanina de PAL puede provocar un cammbio de los metabolitos específicos de PKU a favor o de los metabolitos específicos de PAL. La actividad metabólica total medida fue mayor que la actividad metabólica total medida de la cepa SYN-PKU304 basada en plásmido PAL3 y la reducción total de fenilalanina se acercó a la de SYN-PKU304 (30% en comparación con 45%).
[0347] En algunas realizaciones, la orina se recoge en los puntos de tiempo predeterminados, y se analizó para los niveles de fenilalanina y niveles de metabolitos PAL y PKU.
Ejemplo 19. Actividad de degradación de fenilalanina in vivo (PAL) LAAD
[0348] La idoneidad de LAAD de P. proteus para la degradación de fenilalanina por las bacterias manipuladas genéticamente se evalúa adicionalmente in vivo. La cepa bacteriana SYN-PKU401 (que comprende un plásmido con un alto número de copias que comprende LAAD dirigido por un promotor inducible por Tet se compara con SYN-PKU901.
[0349] Los ratones se mantienen, alimentan y fueron administrados con fenilalanina, tal como se describió anteriormente. Para preparar las células bacterianas para la alimentación por sonda, las células se diluyen 1:100 en LB (2 litros), se cultivan durante 1,5 h en condiciones aeróbicas, a continuación se añade ATC y las células se cultivan durante otras 2 horas. Antes de la administración, las células se concentran 200X y se congelan para su almacenamiento. Las células se descongelan en hielo y se resuspenden. Las células se mezclan 9:1 en bicarbonato 1M. A cada ratón se le aplica una sonda cuatro veces con un volumen total de 800 ul, o con un total de bacterias que van desde 2 x 109 a 1 x 1010. Se recogen muestras de sangre de los ratones descritos en los ejemplos anteriores y se analizan los niveles de fenilalanina, fenilpiruvato, fenilactato, ácido transcinámico y ácido hipúrico. Se calcula la reducción total de fenilalanina y la actividad metabólica total.
Ejemplo 20. Efecto del pH sobre la degradación de fenilalanina en E. co li recombinante
[0350] Para determinar si las tasas de degradación de fenilalanina en SYN-PKU304 y SYN-PKU302 se ven afectados por un bajo pH, se diluyeron cultivos de una noche de ambas cepas 1:100 en LB y se dejaron crecer con agitación (250 rpm) a 37 °C. Después de 1,5 horas de crecimiento, se añadió ATC (100 ng/mL) a los cultivos de SYN-PKU302, y los cultivos de SYN-PKU304 se colocaron en una cámara anaeróbica Coy (suministrando 90 % N2, 5 % CO2 y 5 % H2). Después de 4 horas de inducción, las bacterias se sedimentaron, se lavaron en PBS y se resuspendieron en tampón de ensayo (medio mínimo M9 con glucosa al 0,5%, bicarbonato de sodio al 8,4% y Phe 4 mM) a una concentración de 5e9 células/ml. El tampón de ensayo se preparó con valores de pH decrecientes incrementalmente, que van desde 7,25-2,25, utilizando HCl 1M. Se retiraron alícuotas del ensayo celular cada 30 minutos durante 2 horas para la cuantificación de fenilalanina por espectrometría de masas. Tal como se muestra en la Fig. 39, las tasas de degradación de la fenilalanina disminuyeron a medida que el pH del tampón de ensayo disminuyó en ambas cepas, SYN-PKU302 (Fig. 39A) y SYN-PKU304 (Fig. 39B).
Ejemplo 21. Degradación de dipéptidos y tripéptidos
[0351] Las cepas de una noche de SYN-PKU304 y SYN-PKU705 se diluyeron 1: 100 y se cultivaron hasta log temprano antes de cambiar a condiciones anaeróbicas para la inducción de PAL y pheP. También se indujo un cultivo de SYN-PKU705 con arabinosa para inducir la proteína LAAD. El objetivo de este estudio fue determinar si las cepas de PKU podrían degradar la Phe cuando se secuestran en forma de dipéptidos y tripéptidos. Después de la inducción de la cepa, las células se centrifugaron y se resuspendieron en tampón de ensayo que contenía medio mínimo M9, glucosa al 0,5%, MOPS 50 mM y 50 mM de Phe o dipéptido o tripéptido que contenía Phe. Las muestras de sobrenadante se extrajeron cada 20 minutos durante un total de 80 minutos y el sobrenadante se analizó en un espectrofotómetro UV-Vis para medir la absorbancia a 290 nm (el pico de absorción del ácido transcinámico). Los resultados se muestran en la Tabla 43 que indicaba que las cepas de PKU eran capaces de degradar Phe rápidamente incluso en forma de dipéptidos o tripéptidos.
Tabla 43. Tasas de de radación de di é tidos tri é tidos
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Ejemplo 22. Manipulación de cepas bacterianas usando inserciones cromosómicas
[0352] Se construyeron cepas bacterianas, en las que los genes phePy/o PAL3 se integran directamente en el genoma de E. coli Nissle bajo el control de un promotor sensiblea FNR. Los procedimientos descritos a continuación pueden usarse para manipular cepas bacterianas que comprenden inserciones cromosómicas (por ejemplo, SYN-PKU902 y/o cualquiera de las cepas integradas enumeradas en la Tabla 14.
[0353] La cepa SYN-PKU902 (lacZ::Pfn rs -PAL3-pheP) contiene una copia de PAL3 y una copia de pheP integrada en el locus lacZ, con ambos genes unidos de manera operativa a un promotor único fnrS y cotranscritos en un mensaje bicistrónico (Fig. 41). La Tabla 21 muestra la secuencia de una construcción de ejemplao en la que los genes PAL3 y pheP se cotranscriben bajo el control de un promotor FNR de ejemplo (SEQ ID NO: 31), con la secuencia del promotor FNR en negrita, la secuencia PAL3 encuadrada, la secuencia de pheP está subrayada y los sitios de unión ribosómica resaltados.
[0354] Para crear un vector capaz de integrar la secuencia de PfnrS-PAL3-pheP en el cromosoma, se utilizó el ensamble de Gibson para agregar secuencias de 1000 pb de ADN homólogo al locus lacZ de Nissle a ambos lados de un casete de resistencia a cloranfenicol (cmR) flanqueado de sitio de diana de recombinación de flipasa (FRT) en un plásmido knock-in knock-out (KIKO). A continuación, se utilizó un ensamblaje de Gibson para clonar la secuencia de ADN de PfnrS-PAL3-pheP entre estos brazos de homología, adyacente al sitio FRT-cmR-FRT. La inserción exitosa del fragmento se validó mediante secuenciación. Se utilizó PCR para amplificar toda la región lacZ::FRT-cmR-FRT::PfnrS-PAL3-pheP::lacZ. Este fragmento de PCR incorporado se usó para transformar una cepa de Nissle electrocompetente que contiene un plásmido sensible a la temperatura que codifica los genes de recombinasa roja lambda. Después de la transformación, las células se cultivaron durante 2 horas a 37°C. El crecimiento a 37 °C curó el plásmido sensible a la temperatura. Los transformantes con integración cromosómica satisfactoria del fragmento se seleccionaron en cloranfenicol a 20 pg/ml.
[0355] La cepa SYN-PKU501 (malPT::P f n r s -PAL3, lacZ::PFNRs -pheP) contiene una copia de PAL3 integrada en el locus malP/T, y una copia de pheP integrada en el locus lacZ, con ambos genes unidos de manera operativa a promotores fnrS separados (ver Tabla 28; SEQ ID NO: 38). La cepa SYN-PKU502 (malPT::P fnrS -PAL3, lacZ: Pfn rS -PAL3-pheP) contiene una copia de PAL3 integrada en el locus malP/T bajo el control de un promotor fnrS (ver Tabla 28; SEQ ID NO: 38), así como una construcción PAL3-pheP integrada en el locus lacZ, en el que ambos genes en el locus lacZ están unidos de manera operativa a un único promotor fnrS y cotranscritos en un mensaje bicistrónico (ver Tabla 21; SEQ ID NO : 31).
[0356] Para crear un vector capaz de integrar la secuencia PfnrS-PAL3 (SEQ ID NO: 38) en el cromosoma de E. coli Nissle en SYN-PKU501 y SYN-PKU502, se utilizó el ensamblaje de Gibson para agregar secuencias de 1000 pb de ADN homóloga a los loci malP y malT de Nissle a cada lado de un casete de resistencia a la kanamicina (knR) flanqueado en el sitio de FRT en un plásmido KIKO. A continuación, se utilizó el ensamblaje de Gibson para clonar la secuencia de ADN de Pns-PAL3 entre estos brazos de homología, adyacentes al sitio de FRT-knR-FRT. La inserción exitosa del fragmento se validó mediante secuenciación. Se utilizó PCR para amplificar toda la región malP::FRT-kn R -FRT::P fnrS-PAL3::malT. Este fragmento de PCR knock-in se usó para transformar una cepa de Nissle electrocompetente que ya contenía PfnrS-pheP o PfnrS -PAL3-pheP bicistrónico en el locus lacZ, y que expresaba los genes de recombinasa roja lambda. Después de la transformación, las células se cultivaron durante 2 horas a 37°C. Los transformantes con integración exitosa del fragmento se seleccionaron en kanamicina a 50 pg/ml. Estos mismos procedimientos pueden usarse para crear un vector capaz de integrar la secuencia PfnrS -PAL3 (SEQ ID NO: 38) en el sitio de inserción malE/K en SYN-PKU506 y SYN-PKU507.
[0357] En algunas realizaciones, los conmutadores basados en recombinasa se pueden usar para activar la expresión de PAL3. La cepa SYN-PKU601 (malPT::Pfnrs-Int5, rrnBUP-PAL3; lacZ::Pfnrs-pheP) contiene la recombinasa Int5 unida de manera operativa a un promotor Pfnrs, así como una copia de PAL3 bajo el control de un promotor constitutivo fuerte, integrado en el locus m al/T (Fig. 42). La Tabla 45 muestra la secuencia de una construcción Pfnrs-Int5, rrnBUP-PAL3 de ejemplo (SEQ ID NO: 42), en la que Pfnrs, Int5y PAL3 están en orientación inversa. La secuencia de Int5 está en negrita, la secuencia de Pfnrs está encuadrada, la secuencia de PAL3 está subrayada y los sitios de recombinasa están en negrita y subrayados. Los sitios de unión ribosómica están resaltados y la secuencia de promotor constitutivo rrnBUP está encuadrada. El promotor rrnBUP de E. coli que contiene el elemento UP se seleccionó para producir una alta expresión de PAL3 (Estrem et al., 1998), aunque se puede usar cualquier promotor fuerte. SYN-PKU601 también contiene una copia de pheP integrada en el locus lacZ.
[0358] Para construir la cepa SYN-PKU601, se sintetizaron las secuencias de genes de Int5 impulsada por PfnrS y de PAL3 flanqueado de sitio de recombinasa impulsada por rrnBUP por GENEWIZ (Cambridge, MA). El ensamblaje de Gibson se utilizó para añadir secuencias de ADN de 1000 pb homólogas a los loci malP y malT de Nissle a ambos lados de la secuencia de ADN de PfnrS-Int5, rrnBUP-PAL3 y para clonar esta secuencia entre los brazos de homología. La inserción exitosa del fragmento en un plásmido KIKO se validó mediante secuenciación. Se utilizó PCR para amplificar toda la región PfnrS-Int5, rrnBUP-PAL3. Este fragmento de PCR knock-in se utilizó para transformar una cepa de Nissle electrocompetente que ya contenía PfnrS-pheP en el locus lacZ, y que expresa los genes de recombinasa roja lambda. Después de la transformación, las células se cultivaron durante 2 horas a 37 °C. Los transformantes con integración exitosa del fragmento PfnrS -PAL3 en la región intergénica de malPT se seleccionaron en kanamicina a 50 pg/ml. Esta estrategia también puede usarse para construir una cepa basada en recombinasa que requiera actividad polimerasa T7 para la expresión de PAL3 (Fig.43). [La Tabla 46 muestra la secuencia de un ejemplo de construcción PfnrS-Int5, rrnBUP-T7 (SEQ ID NO: 43), en la que el gen PfnrS, Int5 y polimerasa T7 están en orientación inversa. La secuencia de Int5 está en negrita, la secuencia de Pfnrs está encuadrada, la secuencia de la polimerasa T7 está subrayada y los sitios de recombinasa están en negrita y subrayados. Los sitios de unión ribosómica están resaltados y la secuencia de promotor constitutivo rrnBUP está enmarcada. La Tabla 44 muestra la secuencia de una construcción Pt7-PAL3 de ejemplo, con la secuencia Pt7 resaltada, el sitio de unión al ribosoma subrayado y la secuencia de PAL3 en negrita.
Tabla 44
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Tabla 45
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Tabla 46
Figure imgf000107_0002
g c a t t t t g t c c a a t t g a g a c t c g t g c a a c t g g t c a g c g a a c t g g t c g t a g a a a t c a g c c a g t a c a t c a c a a g a c t c a t a t g t g t c a a c c a t a g t t t c g c g c a c t g c t t t g a a c a g g t t c g c a g c g t c a g c c g g a a t g g t a c c g a a g g a g t c g t g a a t c a g t g c a a a a g a t t c g a t t c c g t a c t t c t c g t g t g c c c a c a c t a c a g t c t t a c g a a g g t g g c t a c c g t c t t g g c t g t g t a c a a a g t t a g g a g c g a t a c c a g a c t c c t g t t t g t g t g c a t c a a t c t c g c t a t c t t t g t t g g t g t t a a t g g t a g g c t g t a a g c g g a a c t g a c c g a g g a a c a t c a g g t t c a a g c g c g t c t g a a t a g g c t t c t t g t a t t c c t g c c a c a c a g g g a a a c c a t c a g g a g t t a c c c a a t g c a c a g c g c a a c g c t t g c g a a g a a t c t c t c c a g t c t t c t t a t c t t t g a c c t c a g c a g c c a g c a g c t t a g c a g c a g a c t t a a g c c a g t t c a t t g c t t c a a c c g c a g c t a c c a c c q t c a c q c t c a c a q a t t c c c a a a t c a q c t t a q c c a t q t a t c c a g c a g c c t g a t t c g g c t g a g t g a a c a t c a g a c c c t t g c c q g a a t c a a t a g c t g g c t g a a t g g t a t c t t c c a g c a c t t g t t g a c g g a a g c c g a a c t c t t t g g a c c c g t a a g c c a g c g t c a t g a c t g a a c g c t t a g t c a c a c t g c g a g t a a c a c c g t a a g c c a q c c a t t g a c c a g c c a g t g c c t t a g t g c c c a g c t t g a c t t t c t c a g a g a t t t c a c c a g t g t t c t c a t c g g t c a c g g t a a c t a c t t c g t t a t c g g t c c c a t t g a t t g c g t c t g c t t g t a g a a t c t c g t t g a c t t t c t t a g c a a c a a t c c c q t a g a t g t c c t q a a c g q t t t c a c t a g g a a g c a a g t t a a c c g c g c g a c c a c c t a c c t c a t c t c g g a g c a t c g c g g a g a a g t g c t g g a t g c c a g a g c a a g a c c c g t c a a a c g c c a g c g g a a g g g a g c a g t t a t a g c t c a g g c c g t g g t g c t g t a c c c c a g c g t a c t c a a a g c a g a a c g c a a q g a a g c a g a a c g g a g a a t c t t g c t c a g c c c a c c a a q t q t t c t c c a q t q q a q a c t t a q c q c a a q c c a t q a t q t t c t c q t q q t t t t c c t c a a t g a a c t t g a t g c g c t c a g g g a a c g g a a c c t t a t c g a c a c c c g c a c a g t t t g c a c c g t g g a t t t t c a g c c a g t a g t a a c c t t c c t t a c c g a t t g g t t t a c c t t t c g c c a g c g t a a g c a g t c c t t t g g t c a t a t c g t t a c c t t g c g g g t t q a a c a t t g a c a c a g c q t a a a c a c g a c c g c g c c a g t c c a t g t t g t a a g g g a a c c a g a t g g c c t t a t g g t t a g c a a a c t t a t t g g c t t g c t c a a g c a t g a a c t c a a g g c t g a t a c g g c g a g a c t t g c g a g c c t t g t c c t t g c g g t a c a c a g c a g c g g c a g c a c g t t t c c a c q c g g t g a g a g c c t c a g g a t t c a t g t c g a t g t c t t c c g g t t t c a t c g g g a g t t c t t c a c g c t c a a t c g c a g g g a t g t c c t c g a c c g g a c a a t g c t t c c a c t t g g t g a t t a c g t t g g c g a c c g c t a g g a c t t t c t t g t t g a t t t t c c a t g c g g t g t t t t g c g c a a t g t t a a t c g c t t t g t a c a c c t c a g g c a t g t a a a c g t c t t c g t a g c g c a t c a g t g c t t t c t t a c t g t g a g t a c g c a c c a g c g c c a g a g g a c q a c q a c c q t t a q c c c a a t a q c c a c c a c c a q t a a t q c c a q t c c a c q q c t t a q q a q q a a c t a c q c a a q q t t q q a a c a t c q q a q a q a t q c c a q c c a q c q c a c c t q c a c q q q t t q c g a t a g c c t c a q c g t a t t c a g g t g c g a g t t c g a t a g t c t c a g a g t c t t g a c c t a c t a c g c c a g c a t t t t g q c q g t q t a a g c t a a c c a t t c c q g t t q a c t c a a t g a g c a t c t c g a t g c a g c g t a c t c c t a c a t q a a t a g a g t c t t c c t t a t q c c a c g a a g a c c a c g c c t c q c c a c c g a g t a g a c c c t t a g a g a g c a t g t c a g c c t c g a c a a c t t g c a t a a a t g c t t t c t t g t a q a c q t q c c c t a c g c q c t t g t t g a q t t q t t c c t c a a c q t t t t t c t t q a a g t q c t t a q c t t c a a g g t c a c q q a t a c g a c c g a a g c g a q c c t c q t c c t c a a t g q c c c q a c c q a t t q c q c t t g c t a c a g c c t g a a c g g t t g t a t t g t c a q c a c t g g t t a q g c a a g c c a g a g t g g t c t t a a t g g t g a t g t a c g c t a c g g c t t c c g g c t t g a t t t c t t g c a g g a a c t g g a a g g c t g t c g g g c g c t t g c c g c g c t t a g c t t t c a c t t c c t c a a a c c a g t c g t t g a t g c g t g c a a t c a t c t t a g g g a g t a g g g t a g t g a t g a g a g g c t t g g c g g c a g c g t t a t c c g c a a c c t c a c c a q c t t t a a q t t q a c q c t c a a a c a t c t t q c q q a a q c q t q c t t c a c c c a t c t c g t a a g a c t c a t g c t c a a g g g c c a a c t g t t c g c g a g c t a a a c g c t c a c c g t a a t g g t c a g c c a q a g t g t t g a a c g q q a t a g c a q c c a g t t c g a t q t c a q a q a a g t c g t t c t t a q c g a t g t t a a t c g t g t t c a t a t g t a t a t c t c c t t c t t a a a g t t a a a c á a a á t t a t t t c t a q a g c a g a t c a g g g t g c g c a a g t t g t c a a c g c t c c c a g g a g a g t t a t c g a c t t g c g
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Tabla 47
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[0359] Para construir la cepa SYN-PKU602 que comprende la construcción Para-/hí5, la construcción Pt7-PAL3 y la construcción PLa- T7 polimerasa (Fig. 44), se usó el ensamblaje de Gibson esencialmente tal como se describe anteriormente.
[0360] La Tabla 48 muestra la secuencia de una construcción PARA-/nt5 de ejemplo (SEQ ID NO: 45), para la integración en el locus Ara. La secuencia Int5 está en negrita, la secuencia Para que contiene los sitios TSS y RBS está subrayada y la secuencia AraC está en cursiva.
Tabla 48
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(co n tin u ac ió n )
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Ejemplo 23. Generación de DeltaThyA
[0361] Una mutación auxotrófica causa que las bacterias mueran en ausencia de un nutriente esencial añadido exógenamente para la supervivencia o el crecimiento porque carecen del gen o genes necesarios para producir ese nutriente esencial. Para generar bacterias manipuladas genéticamente con una modificación auxotrófica, se eliminó el thyA, un gen esencial para la síntesis de oligonucleótidos. La deleción del gen thyA en E. coli Nissle produce una cepa que no puede formar una colonia en placas LB a menos que se complementen con timidina.
[0362] Se amplificó un fragmento de PCR thyA::cam usando 3 rondas de PCR de la siguiente manera. Las secuencias de los cebadores utilizados a una concentración de 100 |jm se encuentran en la Tabla 49.
Tabla 49. Secuencias de cebadores
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[0363] Para la primera ronda de PCR, se llevaron 4x50 ul mezclas de reacción de PCR que contenían 1 ng de pKD3 como molde, 25 ul de 2xphusion, 0,2 ul de cebador SR36 y SR38, y 0, 0,2, 0,4 o 0,6 ul de DMSO hasta un volumen de 50 ul con agua libre de nucleasa y se amplicaron en las siguientes condiciones de ciclo:
Etapa 1: 98c durante 30 s
Etapa 2: 98c duranter 10 s
Etapa 3: 55c durante 15 s
Etapa 4: 72c durante 20 s
Repetir las etapas 2-4 durante 30 ciclos
Etapa 5: 72c durante 5 min
[0364] Posteriormente, 5 ul de cada reacción de PCR se procesó sobre un gel de agarosa para confirmar un producto de PCR del tamaño apropiado. El producto de PCR se purificó de la reacción de PCR restante usando un kit de recuperación de ADN en gel Zymoclean de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se eluyó en 30 ul de agua libre de nucleasas.
[0365] Para la segunda ronda de PCR, 1 ul de producto de PCR purificado de ronda 1 se utilizó como molde, en 4x50ul de mezclas de reacción de PCR como se describe anteriormente, excepto con 0,2 ul de cebadores SR33 y SR34. Las condiciones del ciclo fueron las mismas que las indicadas anteriormente para la primera reacción de PCR. El producto de PCR se procesó en un gel de agarosa para verificar la amplificación, se purificó y se eluyó en 30 ul como se describió anteriormente.
[0366] Para la tercera ronda de PCR, se usó 1 ul de producto de PCR purificado de la ronda 2 como molde en reacciones de PCR de 4x50 ul, tal como se ha descrito, excepto con los cebadores SR43 y SR44. Las condiciones del ciclo fueron las mismas que las descritas para las rondas 1 y 2. Se verificó la amplificación, se purificó el producto de PCR y se eluyó como se describió anteriormente. La concentración y la pureza se midieron usando un espectrofotómetro. El fragmento de ADN lineal resultante, que contiene 92 pb homólogo a dirección 5' de thyA, el casete de cloranfenicol flanqueado por sitios frt, y 98 pb homólogo en dirección 3' del gen thyA, se transformó en una cepa de E. coli Nissle 1917 que contenía pKD46 cultivada para recombinación. Después de la electroporación, se añadió 1 ml de medio SOC que contenía timidina 3 mM y se dejó que las células se recuperaran a 37°C durante 2 h con agitación. A continuación, las células se sedimentaron a 10.000 xg durante 1 minuto, el sobrenadante se descartó y el sedimento celular se resuspendió en 100 |jl de LB que contenía timidina 3 mM y se extendió sobre placas de agar LB que contenían thy 3 mM y 20 jg/ml de cloranfenicol. Las células se incubaron a 37 °C durante la noche. Las colonias que aparecieron en las placas LB se volvieron a sembrar. cam 20ug/ml o - thy 3mM. (Los auxótrofos thyA solo crecerán en medios complementados con thy 3 mM).
[0367] A continuación, se eliminó la resistencia a los antibióticos con transformación de pCP20. pCP20 tiene el gen Flp de recombinasa de levadura, FLP, genes resistentes a cloranfenicol y ampicilina, y replicación sensible a la temperatura. Las bacterias se cultivaron en medio LB que contenía el antibiótico de selección a 37 °C hasta una DO600 = 0,4 - 0,6. Se lavó 1 ml de células de la siguiente manera: las células se sedimentaron a 16.000 xg durante 1 minuto. Se descartó el sobrenadante y se resuspendió el sedimento en 1 ml de glicerol al 10 % enfriado con hielo. Esta etapa de lavado se repitió 3 veces. El sedimento final se resuspendió en 70 ul de glicerol al 10% enfriado con hielo. A continuación, las células se sometieron a electroporación con 1 ng de ADN plasmídico pCP20 y se añadió inmediatamente a la cubeta 1 ml de SOC suplementado con timidina 3 mM. Las células se resuspendieron y se transfirieron a un tubo de cultivo y se cultivaron a 30 °C durante 1 hora. A continuación, las células se sedimentaron a 10.000 xg durante 1 minuto, se desechó el sobrenadante y el sedimento celular se resuspendió en 100 jl de LB que contenía timidina 3 mM y se extendió sobre placas de agar LB que contenían thy 3 mM y 100 jg/ml de carbenicilina y se cultivó a 30 °C durante 16-24 horas. A continuación, los transformantes se purificaron en colonias de forma no selectiva (sin antibióticos) a 42 °C.
[0368] Para probar los transformantes de colonias purificada, se recogió una colonia de la placa de 42 °C con una punta de pipeta y se resuspendió en 10 |il de LB. Se pipetearon 3 jl de la suspensión celular en un conjunto de 3 placas: Cam, (37 °C; pruebas de presencia/ausencia del gen CamR en el genoma de la cepa huésped), Amp, (30 ° C, pruebas de presencia/ausencia de AmpR del plásmido pCP20) y LB solamente (células deseadas que han perdido el casete de cloranfenicol y el plásmido pCP20), 37 °C. Las colonias se consideraron curadas si no había crecimiento ni en la placa Cam ni en la Amp, se recogieron y se volvieron a sembrar en una placa LB para obtener colonias individuales y se cultivaron durante la noche a 37 °C.
Ejemplo 24. Cuantificación de fenilalanina (derivatización con cloruro de dansilo)
[0369] Para los ensayos in vitro e in vivo descritos en este documento, que evalúan la capacidad de las bacterias manipuladas genéticamente para degradar fenilalanina y que requieren la cuantificación de los niveles de fenilalanina en la muestra, se empleó un protocolo de derivatización de cloruro de dansilo de la siguiente manera.
Preparación de la muestra
[0370] Se prepararon patrones de fenilalanina (1000, 500, 250, 100, 20, 4 y 0,8 pg/ml en agua). En hielo, se pipetearon 10 pl de muestra en una placa de 96 pocillos de polipropileno de fondo en V y se añadieron 190 pl de acetonitrilo al 60 % con 1 ug/ml de patrón interno L-fenil-d5-alanina. La placa se selló con calor, se mezcló bien y se centrifugó a 4000 rpm durante 5 min. A continuación, se agregaron 5 jl de muestras diluidas a 95 jl de mezcla de derivatización (85 jl de NaHCO310 mM pH 9,7 y 10 ul de 10 mg/ml de cloruro de dansilo (diluido en acetonitrilo)) en una placa de polipropileno de 96 pocillos con fondo en V y la placa se selló con calor y se mezcló bien. Las muestras se incubaron a 60 °C durante 45 min para derivatizar y, a continuación, se centrifugaron a 4.000 rpm durante 5 minutos. A continuación, se añadieron 20 jl de las muestras derivatizadas a 180 jl de agua con ácido fórmico al 0,1% en una placa de 96 pocillos de fondo redondo, las placas se sellaron térmicamente y se mezclaron bien.
Procedimiento LC-MS/MS
[0371] La fenilalanina se midió mediante cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) utilizando un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo Thermo TSQ Quantum Max. Los detalles del procedimiento de HPLC se describen en la Tabla 50 y la Tabla 51. Los detalles de la espectrometría de masas en tándem se describen en la Tabla 52.
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T l 1. D ll l r imi n HPL
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Tabla 52. Detalles de la es ectrometría de masas en tándem
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Ejemplo 25 Cuantificación de ácido transcinámico (derivatización de trifluoroetilamina)
[0372] Para los ensayos in vitro e in vivo descritos en este documento, que evalúan la capacidad de las bacterias manipuladas genéticamente para degradar fenilalanina y que requieren la cuantificación de los niveles de ácido Trans­ cinámico en la muestra, se empleó un protocolo de derivatización de trifluoroetilamina de la siguiente manera.
Preparación de la muestra
[0373] Se preparó un patrón de ácido Trans-cinámico (500, 250, 100, 20, 4 y 0,8 |jg/ml en agua). En hielo, se pipetearon 10 |jl de muestra en una placa de 96 pocillos de polipropileno con fondo en V. A continuación, se añadieron 30 jl de acetonitrilo al 80 % con 2 jg/ml de patrón interno de ácido transcinámico-d7 y la placa se selló con calor, se mezcló bien y se centrifugó a 4000 rpm durante 5 minutos. A continuación, se añadieron 20 jl de muestras diluidas a 180 jl de m Es 10 mM pH 4, N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida (EDC) 20 mM, trifluoroetilamina 20 mM en una placa de polipropileno de 96 pocillos de fondo redondo. La placa se selló con calor, se mezcló bien y las muestras se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora.
Procedimiento LC-MS/MS
[0374] El ácido transcinámico se midió mediante cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) usando un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo Thermo TSQ Quantum Max. Los detalles del procedimiento de HPLC se describen en la Tabla 53 y la Tabla 54. Los detalles de la espectrometría de masas en tándem se describen en la Tabla 55.
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T l 4. D ll l r imi n HPL
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Tabla 55. Detalles de la es ectrometría de masas en tándem
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Ejemplo 26. Cuantificación de fenilalanina, ácido trans-cinámico, ácido fenilacético, ácido fenilpirúvico, ácido feniláctico, ácido hipúrico y ácido benzoico (derivatización de 2-hidrazinoquinolina)
[0375] Para los ensayos in vitro e in vivo descritos en este documento, que evalúan la capacidad de las bacterias manipuladas genéticamente para degradar fenilalanina y que requieren la cuantificación de los niveles de de fenilalanina, ácido trans-cinámico, ácido fenilacético, ácido fenilpirúvico, ácido feniláctico, ácido hipúrico y ácido benzoico en la muestra, se empleó un protocolo de derivatización de 2-hidrazinoquinolona de la siguiente manera.
Preparación de la muestra
[0376] Se prepararon soluciones patrón que contenían 250, 100, 20, 4, 0,8, 0,16 y 0,032 |jg/ml de cada patrón en agua. En hielo, se pipetearon 10 |jl de muestra en una placa de 96 pocillos de polipropileno con fondo en V y se añadieron 90 jl de la solución de derivatización que contenáin 50 mM de 2-hidrazinoquinolona (2-HQ), sulfuro de dipiridilo y trifenilfosfina en acetonitrilo con patrones internos en 1 ug/ml de L-fenil-d5-alanina, 1 ug/ml de ácido hipúricod5 y 0,25 ug/ml de ácido trans-cinámico-d7. La placa se selló con calor, se mezcló bien y las muestras se incubaron a 60°C durante 1 hora para derivatización y, a continuación, se centrifugó a 4000 rpm durante 5 minutos. En una placa de 96 pocillos de fondo redondo, se añadieron 20 jl de las muestras derivatizadas a 180 jl de agua con ácido fórmico al 0,1 %. Las placas se sellaron con calor y se mezclaron bien.
Procedimiento LC-MS/MS
[0377] Los metabolitos derivatizados mediante 2-HQ se midieron mediante cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) usando un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo Thermo TSQ Quantum Max. Los detalles del procedimiento de HPLC se describen en la Tabla 56 y la Tabla 57. Los detalles de la espectrometría de masas en tándem se describen en la Tabla 58.
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T l 7. D ll l r imi n HPL
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Tabla 58. Detalles de la es ectrometría de masas en tándem
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Ejemplo 27. Eficacia relativa de las cepas con inserción cromosómica y portadoras de plásmidos
[0378] Para comparar la tasa de degradación de fenilalanina entre las cepas bacterianas manipuladas con inserciones cromosómicas y aquellas con plásmidos, se diluyeron cultivos durante una noche 1:100 en LB y se dejaron crecer con agitación (250 rpm) a 37 °C. Después de 1,5 horas de crecimiento, los cultivos se colocaron en una cámara anaeróbica Coy que suministraba 90% de N2, 5% de CO2, 5% de H2. Después de 4 horas de inducción, las bacterias se sedimentaron, se lavaron en PBS y se resuspendieron en tampón de ensayo (medio mínimo M9 con glucosa al 0,5 %, bicarbonato de sodio al 8,4 % y Phe 4 mM). Las tasas de degradación de la fenilalanina (es decir, la desaparición de la solución de ensayo) o la acumulación de cinamato de 30 a 90 min se normalizaron a 1e9 células. La Tabla 59 muestra las tasas normalizadas para todas las cepas y describe los genotipos y las actividades de ejemplos no limitantes de cepas manipuladas que llevan plásmidos y cepas manipuladas que comprenden inserciones cromosómicas.
Tabla 59. Genotipo y actividad de cepas modificadas que llevan plásmidos y cepas modificadas que comprenden inserciones cromosómicas
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Ejemplo 28. Cribado por el consumo mejorado de Phe
[0379] Se llevan a cabo cribados que utilizan selección genética para mejorar el consumo de fenilalanina en las bacterias manipuladas genéticamente. Los análogos de fenilalanina tóxicos ejercen su mecanismo de acción (MOA) al ser incorporados a la proteína celular, provocando la muerte celular. Se evaluó la utilidad de estos compuestos en un enfoque no dirigido para seleccionar enzimas PAL con mayor actividad. Suponiendo que PAL puede metabolizar estos compuestos tóxicos en un metabolito no tóxico, en lugar de incorporarse a la proteína celular, las bacterias manipuladas genéticamente que tienen una actividad de degradación de fenilalanina mejorada pueden tolerar niveles más altos de estos compuestos, y se pueden cribar y seleccionar en esta base.
[0380] Varias cepas bacterianas manipuladas genéticamente, así como el control Nissle, se trataron con dos análogos, p-fluoro-DL-fenilalanina y o-fluoro-DL-fenilalanina (Fig. 35) a concentraciones crecientes. Se determinó la concentración inhibitoria mínima (MIC) y se determinó el número de cambio con respecto al Nissle de tipo salvaje. Los resultados se muestran en la Tabla 60.
[0381] Estos resultados indican que el para-análogo parece ser captado fácilmente por pheP y es potencialmente un sustrato de PAL, y que el ortólogo parece ser captado fácilmente por pheP y es potencialmente un sustrato de PAL. Como resultado, estos compuestos tienen utilidad para el cribado de enzimas PAL con mayor actividad.
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Ejemplo 29. Estudio farmacocinético y farmacodinámico de dosis repetidas de bacterias modificadas genéticamente después de la administración diaria de dosis pos sonda nasogástrica durante 28 días en monos Cynomolgus (no GLP)
[0382] Para evaluar cualquier toxicidad potencial que surja de la administración de bacterias manipuladas genéticamente o de E. coli Nissle sola, se estudian la farmacocinética y la farmacodinamia de las bacterias manipuladas genéticamente y una E. coli Nissle después de la administración de una dosis diaria por sonda nasogástrica (NG) durante 28 días a monos cynomolgus hembra. Los monos Cynomolgus se seleccionan porque esta especie está estrechamente relacionada, tanto filogenética como fisiológicamente, con los humanos y es una especie comúnmente utilizada para evaluaciones de toxicidad no clínicas. Las bacterias manipuladas genéticamente se administran mediante sonda gástrica nasal, de acuerdo con la ruta de administración propuesta en humanos. Se realiza un seguimiento del bienestar general de los animales (observaciones clínicas), la patología clínica del peso (química del suero, hematología y coagulación). El plasma se analiza para determinar los niveles de amoníaco, y las muestras fecales se examinan por la carga bacteriana.
[0383] La cepa manipulada genéticamente comprende una o más copias de PAL3 integrado en el cromosoma y una o más copias de pheP integrado en el cromosoma, cada uno de los cuales está bajo el control de un promotor FNRS. En algunas realizaciones, la cepa manipulada genéticamente también comprende una o más copias de LAAD, impulsadas por un promotor inducible por arabinosa, por ejemplo, ParaBAD. En algunas realizaciones, la cepa comprende además una mutación de auxotrofia, por ejemplo, deltaThyA. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden además una resistencia a antibióticos, por ejemplo, kanamicina. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente no comprenden una mutación de auxotrofia. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente no comprenden una resistencia a los antibióticos.
Materiales, animales y régimen de dosificación:
[0384] El estudio se lleva a cabo de conformidad con las Normas de Buenas Prácticas de Laboratorio de Estudios de Laboratorio no clínicas emitidas por la Administración de Alimentos y Medicamentos de los EE. UU. (Título 21 del Código de Regulaciones Federales, Parte 58; efectivo el 20 de junio de 1979) y los Principios de Buenas Prácticas de la OCDE. Práctica de laboratorio (C [97] 186/Final; en vigor desde 1997). Los animales se alojan individualmente según las recomendaciones establecidas en la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio (National Research Council 2011).
[0385] Los animales utilizados en el estudio son monos cynomolgus (Macaca fascicularis) criados a propósito no nativos, hembra, con 3 a 6 kg (en el examen físico inicial) de 3 a 8 años (en el examen físico inicial) de edad (ganado de SNBL USA, Origen: Camboya).
[0386] Durante la duración del estudio, a los animales se ofrece dieta de mono PMI LabDiet® fibra-Plus® de galletas 5049 dos veces al día. Los animales se mantienen en ayunas durante al menos 2 horas antes de la administración de la dosis y se alimentan dentro de la hora posterior a la dosis. Los animales también se mantienen en ayunas según lo requieran los procedimientos específicos (por ejemplo, antes de las extracciones de sangre para la química del suero, recolección de heces). La dieta se analiza de forma rutinaria en busca de contaminantes y se encuentran dentro de las especificaciones del fabricante. No se espera que estén presentes contaminantes a niveles que puedan interferir con el resultado del estudio. Los registros de análisis de alimentos se mantienen en los registros de las instalaciones de prueba.
[0387] Se proporciona agua potable fresca ad libitum a todos los animales. El agua se analiza de forma rutinaria en busca de contaminantes. No hay contaminantes presentes a niveles que puedan interferir con el resultado del estudio. Los animales reciben frutas, verduras, otros suplementos dietéticos y dispositivos de enriquecimiento de jaulas durante el transcurso del estudio.
[0388] Los animales previamente en cuarentena se aclimataron a la sala de estudio durante 7 días antes de la iniciación de la dosificación (día 1). La última dosificación se produce el día 28. Se utiliza un esquema de aleatorización estratificado que incorpora pesos corporales para asignar animales a los grupos de estudio. Los animales se asignan a grupos y se tratan como se indica en la Tabla 61.
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[0389] El control de Nissle y cepas bacterianas manipuladas genéticamente se preparan a 1 x 109 ufc/ml y 1 x 1011 ufc/ml en glicerol al 15% en 1X PBS con glucosa al 2,2% y timidina 3 mM y se mantienen de 86 a -60 °C (ver Tabla 61). Como vehículo de control se utiliza PBS elaborado en glicerol al 20% con bicarbonato de sodio. La concentración de carbonato es de 0,36 M y de 0,12 M para el bicarbonato de sodio (consulte la tabla 61). El día de cada dosificación, las bacterias y el control del vehículo se retiran del congelador y se ponen en hielo y se descongelan y se colocan en hielo hasta la dosificación.
[0390] Los animales se dosificaron a 0, 1 * 109 o 1 x 1012 ufc/animal. Todos los animales se dosifican mediante sonda gástrica nasal (NG) seguida de control/lavado con vehículo una vez al día durante 28 días. La concentración de bicarbonato y el volumen de cada grupo se especifican en la Tabla 61. Los viales se invierten al menos 3 veces antes de extraer la dosis en la jeringa. Se registran el lugar de la dosis y la hora de la dosis (final del tiempo de lavado).
Análisis
[0391] Estado general: las observaciones clínicas se realizan dos veces al día comenzando el segundo día de aclimatación para cada animal. La primera observación es por la mañana, antes de la limpieza de la habitación. La segunda observación es no antes de 4 horas después de la observación de la mañana. Durante la fase de dosificación, la segunda observación se realiza 4 horas (± 10 minutos) después de la administración de la dosis. Se realizan observaciones clínicas adicionales, según sea necesario.
[0392] Peso: Cada animal se pesa en el Día -6, 1, 8, 15, 22, y 29 antes de la primera alimentación y también antes de la administración de la dosis. Se toman pesos corporales adicionales según sea necesario si es necesario.
[0393] Recolección de sangre: se recolecta sangre de una vena periférica de animales conscientes restringidos. Siempre que sea posible, la sangre se recolecta mediante una sola extracción y a continuación se divide de manera apropiada. La frecuencia de recolección de muestras se resume en la Tabla 62.
Tabla 62. Frecuencia de reco ida de muestras
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| x = Número de veces que el procedimiento se realiza en la semana________________________________________ |
[0394] Hematología: se analizan aproximadamente 1,3 ml de sangre en tubos K2EDTA de 2 ml usando un analizador automático Advia. Los parámetros medidos son glóbulos blancos, glóbulos rojos, hemoglobina, hematocrito, volumen corpuscular medio, hemoglobina corpuscular media, concentración de hemoglobina corpuscular media, anchura de distribución de glóbulos rojos, plaquetas, volumen plaquetario medio, recuento diferencial de leucocitos (absoluto): neutrófilos absoluto, linfocitos absoluto, monocitos absoluto, eosinófilos absoluto, basófilos absoluto, porcentaje de Reticulocitos y Recuento Absoluto de Reticulocitos.
[0395] Coagulación: se analizan aproximadamente 1,3 ml de sangre en tubos de citrato de sodio al 3,2% de 1,8 ml. Los siguientes parámetros de coagulación se determinan utilizando un analizador automático STACompact: tiempo de tromboplastina parcial activado, fibrinógeno y tiempo de protrombina. El plasma tratado con citrato de sodio se almacena entre -60 y -86 °C antes del análisis y se desecha después del análisis.
[0396] Química del suero: Los animales se mantuvieron en ayunas durante 4 horas antes de la extracción de la muestra. Los siguientes parámetros se analizan en aproximadamente 1 ml de sangre en tubos separadores de suero de 4 ml utilizando un analizador AU680: albúmina, fosfatasa alcalina, alanina aminotransferasa aspartato aminotransferasa, bilirrubina total, calcio, colesterol total, creatina quinasa, creatinina, glucosa, fósforo inorgánico, proteína total, triglicéridos, sodio, potasio, cloruro, globulina, relación albúmina/globulina, nitrógeno ureico en sangre y gamma glutamiltransferasa.
[0397] El suero residual se almacena de -60 a -86 °C y se desecha antes de la finalización del estudio.
[0398] Muestras de plasma: Los animales se mantuvieron en ayunas durante 4 horas antes de la extracción de la muestra. Se recogen muestras de sangre de la vena femoral en los puntos de tiempo objetivo que se enumeran en la Tabla 62. Después de tomar alícuotas del volumen de sangre objetivo en el tubo de sangre, se agregan aproximadamente 0,05 ml de aceite mineral cubriendo la superficie de la sangre. Los tubos no se invierten y se colocan en una rejilla y se humedecen con hielo. Se registraron las fechas y horas de recolección de muestras de sangre. El volumen mínimo de muestra es de 1 ml de sangre recogida en un tubo de heparina de litio de 2 ml. Dentro de los 15 minutos posteriores a la recolección, las muestras se centrifugan entre 2 y 8 ° C para obtener plasma. El plasma se transfiere a un vial y se almacena entre -60 y -86 ° C. Las muestras se almacenan en hielo seco antes del análisis. El análisis de las muestras se realiza utilizando un instrumento analizador de amoníaco en sangre.
[0399] La fenilalanina, ácido trans-cinámico y ácido hipúrico se miden mediante cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) utilizando un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo Thermo TSQ Quantum Max.
[0400] Recogida de muestras fecales: Dos muestras de heces por animal se recogen en los puntos temporales objetivo enumerados en la Tabla 62. Las fechas y tiempos de recolección de muestra se registran. Se usa un tubo Falcon de 50 ml con aproximadamente 5 ml de PBS como recipiente (si las heces son líquidas, no se agrega PBS). Para obtener el peso de la muestra fecal, se tomó el peso del recipiente antes y después del muestreo. Se recogen muestras del fondo de la jaula de cada animal. Para obtener muestras frescas y no contaminadas, se retiran los restos de comida y se limpia y exprime la bandeja de la jaula para eliminar los residuos y/o el agua antes de la recolección. La muestra se coloca en hielo húmedo inmediatamente después de la recolección. Las muestras se almacenan entre -20 y -15 °C hasta su análisis. El análisis de las muestras se realiza mediante un procedimiento analítico de PCR.
Ejemplo 30. Estudio de toxicidad de 4 semanas en monos Cynomolgus con recuperación de 4 semanas (GLP)
[0401] Para evaluar cualquier toxicidad potencial derivada de la administración de las bacterias manipuladas genéticamente, se estudiaron la farmacocinética y la farmacodinámica de las bacterias manipuladas genéticamente después de la administración de dosis diaria por sonda nasogástrica (NG) durante 28 días a monos cynomolgus hembra en condiciones de GLP.
[0402] La cepa manipulada genéticamente comprende una o más copias de PAL3 integrado en el cromosoma y una o más copias de pheP integrado en el cromosoma, cada uno de los cuales están bajo el control de un promotor FNRS. En algunas realizaciones, la cepa manipulada genéticamente también comprende una o más copias de LAAD, impulsada por un promotor inducible por arabinosa, por ejemplo, ParaBAD. En algunas realizaciones, las cepas comprenden además una mutación de auxotrofia, por ejemplo, deltaThyA. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente comprenden además una resistencia a antibióticos, por ejemplo, kanamicina. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente no comprenden una mutación de auxotrofia. En algunas realizaciones, las bacterias manipuladas genéticamente no comprenden una resistencia a los antibióticos.
[0403] El estudio se lleva a cabo de conformidad con los Reglamentos de Buenas Prácticas de Laboratorio de Estudios de Laboratorio no clínicos emitidos por la Administración de Alimentos y Medicamentos de EE. UU. (Título 21 del Código de Regulaciones Federales, Parte 58; efectivo el 20 de junio de 1979) y los Principios de Buenas Prácticas de la OCDE. Práctica de laboratorio (C [97] 186/Final; en vigor desde 1997). Los animales se alojan individualmente según las recomendaciones establecidas en la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio (National Research Council 2011).
[0404] A los animales se les administra la bacteria manipulada genéticamente o el vehículo de control esencialmente como se describe en el Ejemplo 29, excepto que todos los materiales se fabrican según los normas GMP. La dosificación se tabula en la Tabla 63. Además, los animales se aclimatan durante 14 días y el período de dosificación es diario durante 28 días seguido de un período de recuperación de 28 días. Además, los animales se sacrifican al final del estudio para realizar un análisis histológico.
_____________________________ Tabla 63. Periodo y régimen de dosificación_____________________________ ACLIMATACIÓN 14 días
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aAutopsia terminal, día 29
bAutopsia recuperación, día 56
[0405] El análisis del estudio se realiza tal como se describe en la Tabla 64. Los parámetros de hematología, coagulación, química sérica y muestras de plasma son esencialmente como se describe en el ejemplo 30, y se analizan usando los procedimientos descritos en el ejemplo 30. La recolección y análisis de muestras fecales se realizan esencialmente tal como se describe en el Ejemplo 30.
Tabla 64. Análisis del estudio
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Ejemplo 31: Bacterias modificadas genéticamente con etiqueta HlyA para la secreción de PME
[0406] Las construcciones para la secreción de PME se generaron, tal como se muestra en la Tabla 65. Estas secuencias se etiquetan posteriormente, por ejemplo, con una etiqueta de HIS, por ejemplo, insertada antes de la secuencia de secreción C terminal. E. coli se transforma con las construcciones en un plásmido de bajo número de copias. Las PME secretadas se aíslan del medio usando cromatografía de afinidad (etiqueta de His). El peso molecular de PME se confirma mediante transferencia Western. La actividad de la enzima purificada se prueba en un ensayo in vitro en un tampón que contiene fenilalanina. Los metabolitos se miden a lo largo del tiempo, tal como se describe en los Ejemplos 24-26.
Tabla 65. Secuencias de secreción
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T l : ni l r ín HlB HlD
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Ejemplo 32: Bacterias modificadas genéticamente que comprenden construcciones adicionales [0407] Las construcciones para la secreción de PME se generaron tal como se muestra en la Tabla 67.
Tabla 67
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Claims (22)

REIVINDICACIONES
1. Bacteria manipulada genéticamente que comprende:
a) uno o más genes que codifican una fenilalanina amoniaco liasa (PAL), en la que el gen o genes que codifican una PAL están unidos de manera operativa a un promotor inducible que no está asociado con el gen de PAL en la naturaleza, en la que la expresión del gen o genes que codifican PAL aumenta en presencia de un inductor de dicho promotor; y
b) uno o más genes que codifican un transportador de fenilalanina capaz de transportar fenilalanina a células bacterianas, en el que el gen o genes que codifican el transportador de fenilalanina están unidos de manera operativa a un promotor inducible que no está asociado con el gen del transportador de fenilalanina en la naturaleza, en la que la expresión del gen o genes que codifican el transportador de fenilalanina aumenta en presencia de un inductor de dicho promotor.
2. Bacteria manipulada genéticamente de la reivindicación 1, que comprende además uno o más genes que codifican una L-aminoácido desaminasa (LAAD), en la que el gen o genes que codifican LAAD están unidos de manera operativa a un promotor inducible que no está asociado con el gen de LAAD en la naturaleza, en la que la expresión del gen o genes que codifican LAAD aumenta en presencia de un inductor de dicho promotor.
3. Bacteria manipulada genéticamente de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que el promotor unido de manera operativa al gen o genes que codifican una PAL y el promotor unido de manera operativa al gen o genes que codifican un transportador de fenilalanina son copias separadas del mismo promotor.
4. Bacteria manipulada genéticamente de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que el gen o genes que codifican una PAL y el gen o genes que codifican un transportador de fenilalanina están unidos de manera operativa a la misma copia del mismo promotor.
5. Bacteria manipulada genéticamente de cualquiera de las reivindicaciones 2-4, en la que el gen o genes que codifican una LAAD están unidos de manera operativa a un promotor diferente del del gen o genes que codifican una PAL y el gen o genes que codifican un transportador de fenilalanina.
6. Bacteria manipulada genéticamente de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en la que el promotor o los promotores unidos de manera operativa al gen o genes que codifican una PAL y al gen o genes que codifican un transportador de fenilalanina son inducidos en condiciones anaeróbicas o de bajo oxígeno.
7. Bacteria manipulada genéticamente de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que el promotor o los promotores unidos de manera operativa al gen o genes que codifican una PAL y al gen o genes que codifican un transportador de fenilalanina se seleccionan del grupo que consiste en:
(a) un promotor al que es capaz de unirse el regulador de fumarato y nitrato reductasa (FNR), en el que dicha unión de FNR activa la expresión génica en dirección 3',
(b) un promotor al que es capaz de unirse el regulador de arginina desiminasa y de reducción de nitrato (ANR), en el que dicha unión de ANR activa la expresión génica en dirección 3', y
(c) un promotor al que es capaz de unirse el regulador de respiración de nitrato disimilatorio (DNR), en el que dicha unión de DNR activa la expresión génica en dirección 3'.
8. Bacteria manipulada genéticamente de la reivindicación 7, en la que el promotor o los promotores unidos de manera operativa al gen o genes que codifican una PAL y al gen o genes que codifican un transportador de fenilalanina se seleccionan del grupo que consiste en:
(a) un promotor seleccionado entre fnrS, nirB, ydjZ, pdhR, focA, ndH, hlyE, narK, narX, narG, yfiD, tdcD, arcDABC, norB y norC;
(b) un promotor que comprende cualquiera de las SEQ ID Nos 9 a 19 o un fragmento de cualquiera de las mismas; o (c) un promotor que comprende una secuencia de ácido nucleico que es al menos un 80 % homóloga a cualquiera de las SEQ ID Nos 9 a 20.
9. Bacteria manipulada genéticamente de una cualquiera de las reivindicaciones 5-8, en la que el gen o genes que codifican una PAL y el gen o genes que codifican un transportador de fenilalanina están de manera operativa unidos a la misma copia del mismo promotor.
10. Bacteria manipulada genéticamente de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en la que el gen o genes que codifican un transportador de fenilalanina están ubicados en un cromosoma en la bacteria o en un plásmido de la bacteria.
11. Bacteria manipulada genéticamente de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en la que el gen o genes que codifican una PAL están ubicados en un plásmido en la bacteria o en un cromosoma en la bacteria.
12. Bacteria manipulada manipulada genéticamente de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en la que la PAL es de Anabaena variabilis (PAL1) o de Photorhabdus luminescens (PAL3).
13. Bacteria manipulada genéticamente de una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en la que el transportador de fenilalanina es PheP.
14. Bacteria manipulada genéticamente de una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en la que la bacteria manipulada comprende 1-5 copias de un gen o genes que codifican una PAL, 1-5 copias de un gen o genes que codifican un transportador de fenilalanina, y opcionalmente, de 1 a 5 copias de un gen o genes que codifican una LAAD.
15. Bacteria manipulada genéticamente de una cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en la que la bacteria es una bacteria probiótica, en la que opcionalmente la bacteria se selecciona del grupo que consiste en Bacteroides, Bifidobacterium, Clostridium, Escherichia, Lactobacillus y Lactococcus.
16. Bacteria manipulada genéticamente de la reivindicación 15, en la que la bacteria es la cepa Nissle de Escherichia coli.
17. Bacteria manipulada genéticamente de una cualquiera de las reivindicaciones 1-16, en la que la bacteria es un auxótrofo en el ácido diaminopimélico o un auxótrofo en timina.
18. Bacteria manipulada genéticamente de una cualquiera de las reivindicaciones 1-17, en la que la bacteria se modifica además para albergar un gen que codifica una sustancia tóxica para la bacteria, en la que dicho gen está bajo el control de un promotor que está inducido por una condición o factor ambiental.
19. Composición farmacéuticamente aceptable que comprende la bacteria de una cualquiera de las reivindicaciones 1-18; y un portador farmacéuticamente aceptable.
20. Composición de la reivindicación 19 formulada para administración oral.
21. Bacteria manipulada genéticamente de una cualquiera de las reivindicaciones 1-18 o la composición de la reivindicación 19 o la reivindicación 20 para su uso en un procedimiento para reducir la hiperfenilalaninemia o tratar una enfermedad asociada con la hiperfenilalaninemia.
22. Bacteria manipulada genéticamente para su uso según la reivindicación 21 o la composición para su uso según la reivindicación 21, en la que la enfermedad se selecciona del grupo que consiste en: fenilcetonuria, fenilcetonuria clásica o típica, fenilcetonuria atípica, hiperfenilalaninemia leve permanente, hiperfenilalaninemia no fenilcetonúrica, deficiencia de fenilalanina hidroxilasa, deficiencia de cofactor, deficiencia de dihidropteridina reductasa, deficiencia de tetrahidropterina sintasa, enfermedad de Segawa y enfermedad hepática.
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